RS61510B1 - Anti pd-1 i anti-lag3 antitela za lečenje kancera - Google Patents

Anti pd-1 i anti-lag3 antitela za lečenje kancera

Info

Publication number
RS61510B1
RS61510B1 RS20210218A RSP20210218A RS61510B1 RS 61510 B1 RS61510 B1 RS 61510B1 RS 20210218 A RS20210218 A RS 20210218A RS P20210218 A RSP20210218 A RS P20210218A RS 61510 B1 RS61510 B1 RS 61510B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
amino acid
acid sequence
antibody molecule
lag3
Prior art date
Application number
RS20210218A
Other languages
English (en)
Inventor
Markus Zettl
Ivo Lorenz
Otmar Schaaf
Melanie Wurm
Jean-François Fortin
Scott Brodeur
Keith A Canada
Lukasz Chlewicki
Pankaj Gupta
Priyanka Gupta
Rocio K Perez
Jr Joseph Robert Woska
Haiguang Xiao
Danlin Yang
Walter Carroll Davidson
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Int
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim Int filed Critical Boehringer Ingelheim Int
Publication of RS61510B1 publication Critical patent/RS61510B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

OBLAST PRONALASKA
Ovaj pronalazak se odnosi na nove molekule anti-PD1 i anti-LAG3 antitela. Pronalazak se takođe odnosi na nukleinske kiseline koje kodiraju takve molekule antitela; na metode za pripremu takvih molekula antitela; na ćelije domaćina koje eksprimiraju ili su sposobne da eksprimiraju takve molekule antitela; na kompozicije koje sadrže takve molekule antitela; i na upotrebu takvih molekula antitela ili takvih kompozicija, posebno u terapeutske svrhe u polju bolesti karcinoma.
Dole navedena detaljna tehnička otkrića mogu u nekim aspektima prevazići otkrivanje pronalaska samo po sebi, a takođe mogu pružiti tehničku podlogu za srodna tehnička dostignuća. Razumeće se da namena dodatne tehničke podloge nije da definiše pronalazak po sebi (koji je definisan isključivo priloženim zahtevima), već da ga stavi u širi tehnički kontekst. Shodno tome, treba imati na umu da izrazi „realizacije“, „aspekti“, „predmet“ odražavaju određene detalje otkrivanja, ali ukoliko se odnose na deo dodatne tehničke pozadine, nije namera da se definišu kao deo predmeta pronalaska koji ne spada u obim pridodatih zahteva.
STANJE TEHNIKE
Kancer je bolest koju karakteriše abnormalni lokalizovani rast ćelija sa potencijalom širenja po celom telu. U razvijenom svetu je drugi najčešći uzrok smrti. Najčešći tipovi karcinoma kod muškaraca su rak pluća, rak prostate, kolorektalni karcinom i rak želuca, a kod žena su najčešći karcinomi dojke, kolorektalni karcinom, rak pluća i rak grlića materice. Iako šanse za preživljavanje uglavnom zavise od vrste karcinoma i stadijuma pri identifikaciji, kod karcinoma pluća ukupna desetogodišnja stopa preživljavanja je oko 5%.
U prošlosti su najčešći načini za lečenje tumorskih karcinoma (nazvani "onkologija") bili hirurška intervencija, lečenje zračenjem ili upotreba hemoterapeutskih lekova. Međutim, poslednjih godina imunoterapija kacinoma se pokazala više obećavajuća kao modalitet lečenja za onkologiju.
Imunoterapija karcinoma je grana onkologije u kojoj se imuni sistem koristi za lečenje karcinoma, što je u potpunoj suprotnosti sa postojećim uobičajenim metodama lečenja u kojima se karcinom direktno uklanja ili leči. Ovaj terapijski koncept zasnovan je na identifikaciji određenog broja proteina na površini T-ćelija koji deluju tako da inhibiraju imunološku funkciju ovih ćelija. Među ove proteine je naveden PD1.
PD1 (Programirana ćelijska smrt 1) je protein receptor na ćelijskoj površini koji je eksprimiran na T-ćelijama. Protein funkcioniše kao inhibitor „imune kontrolne tačke“, tj. deluje tako što modulira aktivnosti ćelija u imunom sistemu kako bi regulisao i ograničio autoimune bolesti. Nedavno je shvaćeno da se mnogi karcinomi mogu zaštititi od imunskog sistema uz pomoć modifikovanja inhibitora „imune kontrolne tačke“ i tako izbeći otkrivanje.
U odnosu na PD1, ovaj protein ima dva liganda, PD-L1 i PD-L2, koji stupaju u interakciju sa receptorima na ćelijskoj površini. Nakon vezivanja, PD-1 indukuje intracelularni signal koji negativno reguliše odgovor T-ćelija.
Kao što je gore detaljno opisano, PD1 je ključni regulator aktivnosti T-ćelija. Nedavno je u nizu različitih postavki karcinoma pokazano da se antagonistički molekuli PD-1 antitela nivolumab i pembrolizumab mogu koristiti za stimulisanje imunog sistema i na taj način za lečenje karcinoma.
Gen-3 za aktivaciju limfocita (LAG3; CD223) je transmembranski protein tipa I koji se uglavnom eksprimira na ćelijskoj površini aktiviranih T ćelija, ali se takođe nalazi u podskupovima NK i dendritičnih ćelija. LAG3 je usko povezan sa CD4, koji je ko-receptor za aktivaciju T pomoćnih ćelija. Oba molekula imaju četiri ekstracelularna Ig-slična domena i zahtevaju vezivanje za svoj ligand, glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC) klase II, za svoje funkcionalne aktivnosti. Nakon vezivanja za MHC-II, LAG3 indukuje intracelularni signal koji negativno reguliše odgovor T-ćelija. Nedavne studije su otkrile da se LAG3 i PD1 koeksprimiraju na limfocitima koji se infiltriraju u tumor (TIL), što sugeriše da mogu da doprinesu tumorom posredovanoj imunološkoj supresiji. Smatra se da hronična izloženost antigenima dovodi do progresivne inaktivacije T ćelija kroz proces nazvan „iscrpljenost“. Iscrpljene T ćelije često zajednički eksprimiraju negativne regulatorne receptore kao što su PD1 i LAG3.
I pored ohrabrujućih kliničkih rezultata PD1 antagonističkih monoklonskih antitela nivolumab i pembrolizumab, do 70% lečenih pacijenata ne reaguje na tretman.
Pretklinički podaci sa T ćelijama dobijenih od pacijenta kao i od modela singenih tumorskih miševa pokazali su da T ćelije dobijene iz tumora često eksprimiraju i druge inhibitorske receptore pored PD1. Kombinovana neutralizacija PD1 i LAG3 korišćenjem antagonističkih molekula monoklonskih antitela povećala je reaktivaciju T ćelija i poboljšala odbacivanje tumora u poređenju samo sa PD1 neutralizacijom, u in vitro i in vivo modelima. Na osnovu ovih rezultata, očekuje se da će neutralizacija LAG3 povećati efikasnost antagonističkih PD1 mAb.
(Agencija za hranu I lekove Sjedinjenih država nagašava informacije o propisivanju -OPDIVO -. ID Reference: 3677021, https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/ label/2014/125554lbl.pdf) opisuje OPDIVO (nivolumab) koji je indikovan za lečenje pacijenata sa neresektabilnim ili metastatskim melanomom i progresijom bolesti nakon ipilimumaba i, ako je pozitivna mutacija BRAF V600, inhibitor BRAF-a.
Međutim, postojeći molekuli anti-PD1 antitela pate od problema povezanih sa neuspehom kod velikog dela pacijenata u vezi njihovog odgovora na tretman. Zbog toga postoji potreba za identifikovanjem efikasnijih PD1 antagonističkih monoklonskih antitela sa upravljivim profilima neželjenih efekata u poređenju sa postojećim lekovima iz stanja tehnike kada se koriste sami ili u kombinaciji sa drugim terapijskim molekulima, posebno dodatnim antagonističkim molekulima za dalje inhibitore kontrolne tačke T-ćelija.
Iz ovog stanja tehnike, pronalazači su pokušali da generišu dodatna anti-PD1 i anti-LAG3 antitela koja imaju poboljšani terapeutski profil u odnosu na poznate molekule.
KRATAK OPIS PRONALASKA
Pronalazak je definisan u priloženim zahtevima. Ukratko, on se odnosi na nove molekule anti-PD1 antitela. Kao što je ovde dalje opisano, molekuli anti-PD1 antitela iz predmetnog pronalaska imaju iznenađujuća i povoljnija svojstva u odnosu na druga anti-PD1 antitela. Posebno, oni pokazuju poboljšanu aktivaciju T ćelija i duži terminalni poluživot u odnosu na referentne molekule anti-PD1 antitela. Kao što će se ceniti, takva svojstva su poželjna za molekule anti-PD1 antitela za upotrebu u lečenju karcinoma.
Takođe su obezbeđeni molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju molekule anti-PD1 antitela, ekspresioni vektori, ćelije domaćina i postupci za dobijanje molekula anti-PD1 antitela iz pronalaska. Takođe su obezbeđene farmaceutske kompozicije koje sadrže molekule anti-PD1 antitela prema pronalasku. Ovde otkriveni molekuli anti-PD-1 antitela mogu se koristiti za lečenje kancerogenih poremećaja, uključujući čvrste tumore i tumore mekog tkiva.
Tačnije, neki molekul anti-PD1antitela iz pronalaska sadrži: (a) CDR-ove teškog lanca koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 1 (hcCDR1), SEK ID BR: 2 (hcCDR2) i SEK ID BR: 3 ( hcCDR3) i ima CDR-ove lakog lanca koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 4 (lcCDR1), SEK ID BR: 5 (lcCDR2) i SEK ID BR: 6 (lcCDR3); ili, b) CDR-ove teškog lanca koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 7 (hcCDR1), SEK ID BR: 8 (hcCDR2) i SEK ID BR: 9 (hcCDR3) i sadrži CDR-ove lakog lanca koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 10 (lcCDR1), SEK ID BR: 11 (lcCDR2) i SEK ID BR: 12 (lcCDR3); ili (c) CDR-ove teškog lanca koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 13 (hcCDR1), SEK ID BR: 14 (hcCDR2) i SEK ID BR: 15 (hcCDR3) i sadrži CDR-ove lakog lanca koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 16 (lcCDR1), SEK ID BR: 17 (lcCDR2) i SEK ID BR: 18 (lcCDR3).
Štaviše, aktivacija T ćelija se poboljšava kada se ovde otkrivena anti-LAG3 antitela, koja se ovde opisuju, koriste u kombinaciji sa molekulima anti-PD1 antitela iz prikazanog pronalaska u odnosu na referentne molekule anti-PD1 antitela i molekule anti-LAG3 antitela. Kao što će se ceniti, takva svojstva su poželjna za molekule anti-LAG3 antitela za upotrebu u lečenju. Shodno tome, pronalazak razmatra farmaceutske kompozicije koje sadrže PD-1 antitela prema pronalasku i anti-LAG3 antitela, kao i njihovu kombinaciju za upotrebu u lečenju karcinoma, posebno NSCLC.
Prema poželjnom aspektu, neki molekul anti-LAG3 antitela iz otkrića vezuje epitop humanog LAG3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu LLRRAGVT (SEK ID BR: 111) i / ili YRAAVHLRDRA (SEK ID BR: 112). Ovde su obezbeđeni postupci određivanja epitopa za koji se antitelo veže.
Prema poželjnom aspektu, neki molekul anti-LAG3 antitela iz pronalaska sadrži (a) CDRove teškog lanca koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 39 (hcCDR1), SEK ID BR: 40 (hcCDR2) i SEK ID BR: 41 (hcCDR3) i ima CDR-ove lakog lanca koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42 (lcCDR1), SEK ID BR: 43 (lcCDR2) i SEK ID BR: 44 (lcCDR3); ili (b) CDR-ove teškog lanca koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 45 (hcCDR1), SEK ID BR: 46 (hcCDR2) i SEK ID BR: 47 (hcCDR3) i sadrži CDR-ove lakog lanca koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 48 (lcCDR1), SEK ID BR: 49 (lcCDR2) i SEK ID BR: 50 (lcCDR3).
Prema daljem aspektu pronalaska, takođe su obezbeđene metode za lečenje karcinoma u kojima se molekuli anti-PD1 antitela prema pronalasku mogu koristiti u kombinaciji sa molekulima anti-LAG3 antitela iz ovog pronalaska, koji se mogu davati konkurentno, uzastopno, alternativno ili odvojeno, sa molekulima anti-PD1 antitela.
Legende slika
Slika 1: Aminokiselinske sekvence varijabilnog domena molekula anti-PD1 antitela. 77E11 je naziv za mišje progenitorno antitelo. PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 i PD1-5 su anti-PD1 antitela kako je ovde definisano. CDR sekvence su podvučene. VK 77E11 (SEK ID BR: 113); VK PD1-1 (SEK ID BR: 20); VK PD1-2; (SEK ID BR: 22); VK PD1-3 (SEK ID BR: 24); VK PD1-4, (SEK ID BR: 26); VK PD1-5 (SEK ID BR: 28); VH 77E11 (SEK ID BR: 114); VH PD1-1 (SEK ID BR: 19); VH PD1-2; (SEK ID BR: 21); VH PD1-3 (SEK ID BR: 23); VH PD1-4, (SEK ID BR: 25); VH PD1-5 (SEK ID BR: 27).
Slika 2: Inhibicija vezivanja humanog PD1-L1/L2 za PD1 uz pomoć molekula anti-PD1 antitela. (A) Prikazuje anti-PD1 antitela iz pronalaska koja su indukovala blokadu vezivanja PD-L1 za humani PD-1 eksprimiran na površini CHO ćelija. (B) Prikazuje anti-PD1 antitela iz pronalaska indukuju blokadu vezivanja PD-L2 za humani PD-1 eksprimiran na površini CHO ćelija.
Slika 3: Stimulacija antigen-specifičnog odgovora T ćelija uz pomoć molekula anti-PD1 antitela. Pokazuje sposobnost anti-PD1 antitela prema pronalasku da stimulišu proizvodnju interferon-gama (IFN-gama) iz tetanusnih specifičnih CD4 memorijskih T ćelija iz četiri pojedinačna davaoca. Za ovaj test, T ćelije iz PBMC-a izvedene iz zdravih davalaca proširene su u prisustvu tetanusnog toksoida i kokultivisane sa autolognim zrelim dendritičnim ćelijama (DC) napunjenim tetanusnim toksoidom tokom 2 dana. Korak ko-kultivisanja ponovljen je drugi put na sličan način u prisustvu PD1-1 i PD1-3. Na kraju drugog koraka ko-kultivisanja u supernatantima su procenjeni nivoi IFN-gama pomoću ELISA.
Slika 4: In vivo efikasnost molekula anti-PD1 antitela u hPD-1 knock-in modelu miša. Prikazuju se pojedinačne krive rasta tumora iz ćelijskih linija karcinoma debelog creva (MC38) koji nose miševi. Miševi su tretirani sa (A) PBS q3or4d, (B) izotipom q3or4d, (C) PD1-3 q3or4d ili (D) PD1-3 kao pojedinačnom dozom. PD1-3 i izotip su dozirani sa po 10 mg/kg.
Slika 5: Pretklinička farmakokinetika molekula anti-PD1 antitela Farmakokinetički parametri PD1 antitela nakon intravenskog doziranja nacrtani u odnosu na doze davane majmunima Cinomolgus. (A) Površina ispod krive (AUC), (B) maksimalna koncentracija u plazmi (cmaks), (C) klirens u plazmi (CL), (D) poluvreme eliminacije u terminalnoj fazi (t1/2,z).
Slika 6: Aminokiselinske sekvence varijabilnog domena molekula anti- LAG3 antitela. 496G6 je naziv za mišje progenitorno antitelo. LAG3-1, LAG3-2, LAG3-3, LAG3-4 i LAG3-5 su anti-LAG3 antitela kako je ovde definisano. VK 496G6 (SEK ID BR: 117); VK LAG3-1 (SEK ID BR: 52); VK LAG3-2; (SEK ID BR: 54); VK LAG3-3 (SEK ID BR: 56); VK LAG3-4, (SEK ID BR: 58); VK LAG3-5 (SEK ID BR: 60); VH 496G6 (SEK ID BR: 118); VH LAG3-1 (SEK ID BR: 51); VH LAG3-2; (SEK ID BR: 53); VH LAG3-3 (SEK ID BR: 55); VH LAG3-4, (SEK ID BR: 57); VH LAG3-5 (SEK ID BR: 59).
Slika 7: Inhibicija vezivanja humanog LAG3 za MHCII uz pomoć molekula anti-LAG3 antitela. Prikazuje snagu naznačenih LAG3 mAb i kontrolnog mAb da blokiraju vezivanje rekombinantnog LAG3 za MHCII eksprimiranog na površini Raji ćelija.
Slika 8: Stimulacija antigen-specifičnog odgovora T ćelija uz pomoć molekula anti-PD1 i anti-LAG3 antitela. (A) Prikazuje u % povećanje kombinacije PD1/LAG3 mAb u odnosu na zasićene količine pembrolizumaba (Keytruda(R)). Fiksne koncentracije PD1-3 i nivolumaba (Opdivo®) od 100 nM kombinovane su sa sve većom količinom LAG3 mAb (LAG3-1 prikazan kao crna linija ili referentni molekul antitela koji ima istu aminokiselinsku sekvencu kao BMS-986016 prikazan tačkastom linijom, antagonističko LAG3 antitelo). (B) Pokazuje u % povećanje PD1/LAG3 molekula mAb prema pronalasku u odnosu na aktivnost pembrolizumaba (Keytruda(R)). Nivo kombinovane mAb aktivnosti procenjen je pri 100nM za PD1 i 200nM za LAG3 mAb-ove. Statističko ispitivanje je izvršeno pomoću Graph Pad Prism jednosmernim ANOVA praćenim Tukei post hoc testom.
Slika 9: In vivo efikasnost kombinovane terapije PD1 i LAG3 antitela u singeničkim modelima tumora. Prikazane su pojedinačne krive rasta miševa koji nose tumore i koji su tretirani antitelima dva puta nedeljno u dozi od 10 mg/kg. (A) Miševi koji su nosili karcinom debelog creva (MC38) lečeni su sa PBS, anti-LAG3, anti-PD1 ili kombinacijom anti-PD1 i anti-LAG3. Miševi koji nose melanom (B16-F10) (B), karcinom pluća (LL / 2) (C), karcinom debelog creva (Colon-26) (D) ili rak dojke (4T1) (E) tumori su lečeni sa PD1 izotipom, sa anti-PD1 ili kombinacijom anti-PD1 i anti-LAG3.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
DEFINICIJE
Gornji i drugi aspekti i realizacije pronalaska postaće jasni iz daljeg opisa ovde.
Ukoliko nije drugačije naznačeno ili definisano, svi upotrebljeni termini imaju svoje uobičajeno značenje u tehnici, što će biti jasno stručnjaku. Na primer, upućuju se na standardne priručnike, kao što su Sambrook i saradnici, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd Ed.), VoIs.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, New York, (1990), and Roitt et al., "Immunology" (2<nd>Ed.), Gower Medical Publishing, London, New York (1989), kao i na opštestanje tehnike ovde navedene. Dalje, ukoliko nije drugačije naznačeno, svi postupci, koraci, tehnike i manipulacije koji nisu posebno detaljno opisani mogu se izvoditi i izvođene su na način poznat sam po sebi, što će stručnjaku biti jasno. Na primer, ponovo se upućuje na standardne priručnike, na opšte stanje tehnike koja je prethodno pomenuta i na dalje reference koje su tamo citirane.
Kako su ovde korišćeni, članci "a" i "an" odnose se na jedan ili na više od jedan (na pr. na najmanje jedan) gramatički objekat članka.
Termin "ili" ovde se koristi da znači i koristi se naizmenično sa terminom "i/ili", osim ako kontekst jasno ne ukazuje drugačije.
„Otprilike“ i „približno“ generalno znače prihvatljiv stepen greške za izmerenu količinu s obzirom na prirodu ili preciznost merenja. Primeri stepena greške su unutar 20 procenata (%), obično u okviru 10%, i tipičnije, unutar 5% od date vrednosti ili opsega vrednosti.
„Molekuli antitela“ ili „antitela“ (ovde se sinonimno koriste) su proteini gama globulina koji se mogu naći u krvi ili drugim telesnim tečnostima kičmenjaka, a imuni sistem ih koristi za identifikaciju i neutralisanje stranih predmeta, poput bakterija i virusa. Tipično su napravljeni od osnovnih strukturnih celina - svaka sa dva velika teška lanca i dva mala laka lanca - da bi formirala, na primer, monomere sa jednom jedinicom, dimere sa dve jedinice ili pentamere sa pet jedinica. Molekuli antitela mogu se vezati nekovalentnom interakcijom za druge molekule ili strukture poznate kao antigeni. Ovo vezivanje je specifično u smislu da će se molekul antitela vezati samo za određenu strukturu sa visokim afinitetom. Jedinstveni deo antigena koji prepoznaje molekul antitela naziva se epitop, odnosno antigena determinanta. Deo molekula antitela koji se vezuje za epitop ponekad se naziva paratopom i nalazi se u takozvanom varijabilnom domenu ili varijabilnom regionu (Fv) antitela. Varijabilni domen se sastoji od tri takozvana komplementarno određujuća regiona (CDR-a) razmaknuta okvirnim regionima (FR-ovima).
U kontekstu ovog pronalaska, referenca za CDR zasniva se na definiciji Chothia (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol.1987, 196: 901–917), zajedno sa Kabat-om (E.A. Kabat, T.T. Wu, H. Bilofsky, M. Reid-Miller and H. Perry, Sequence of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda (1983)).
U nekim aspektima, molekul antitela ima konstantan region teškog lanca koji je odabran između, na primer, konstantnih regiona teškog lanca IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD i IgE; naročito koji je izabran između, na primer, (na pr. humanog) konstantnog regiona teškog lanca IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. U još jednom izvođenju, molekul antitela ima konstantni region lakog lanca koji je izabran između, na primer, (na pr. humanog) konstantnog regiona lakog lanca kapa ili lambda. Konstantni region može se promeniti, na pr. mutirati, da bi se modifikovale osobine antitela (na pr. da bi se povećalo ili smanjilo jedno ili više od: Fc receptor vezivanja, glikozilacija antitela, broja ostataka cisteina, funkcije efektorske ćelije i/ili funkcija komplementa). U nekim realizacijama antitelo ima efektorsku funkciju i može da fiksira komplement. U drugim realizacijama antitelo ne regrutuje efektorske ćelije niti fiksira komplement. U određenim realizacijama, antitelo ima smanjenu ili nikakvu sposobnost da veže neki Fc receptor. Na primer, to može biti izotip ili podtip, fragment ili drugi mutant, koji ne podržava vezivanje za Fc receptor, na pr. ima mutirani ili izbrisani region za vezivanje Fc receptora.
Konstantni region antitela je izmenjen u nekim realizacijama. Postupci za izmenu konstantnog regiona antitela poznati su u struci. Antitela sa izmenjenom funkcijom, na pr. izmenjeni afinitet za efektorski ligand, kao što je FcR na ćeliji, ili C1 komponenta komplementa, može se proizvesti zamenom najmanje jednog aminokiselinskog ostatka u konstantnom delu antitela drugim ostatkom (videti na pr. EP 388, 151 A1, US patent br.
5,624,821 i US patent 5,648,260, čiji je sadržaj ovde uključen referencom). Takođe se razmatraju mutacije aminokiselina koje stabilizuju strukturu antitela, kao što je S228P (EU nomenklatura, S241P u Kabat nomenklaturi) u humanom IgG4. Mogle bi se opisati slične vrste promena koje bi, ako se primene na mišje ili druge vrste imunoglobulina, smanjile ili eliminisale ove funkcije.
Termin „varijabilni domen“, kako se ovde koristi, označava region molekula antitela koji se u osnovi sastoji od četiri „okvirna regiona“, koji su u struci navedeni, a ovde dalje kao „okvirni region 1“ ili „FR1“; kao „okvirni region 2“ ili "FR2"; kao "okvirni region 3" ili "FR3"; i kao "okvirni region 4", odnosno "FR4" respektivno; čiji su okvirni regioni isprekidani sa tri "regiona koji određuju komplementarnost" ili "CDR", koji su u struci i ovde u daljem tekstu označeni kao "region 1 koji određuje komplementarnost" ili "CDR1"; kao "region 2 koji određuje komplementarnost" ili "CDR2"; i kao "region 3 koji određuje komplementarnost" ili "CDR3", respektivno. Tako da opšta struktura ili sekvenca varijabilnog domena imunoglobulina može se naznačiti na sledeći način: FR1 - CDR1 -FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. Upravo varijabilni domen(i) imunoglobulina dodeljuju specifičnost antitelu za antigen noseći antigen-vezujuće mesto.
Termini „varijabilni teški (ili VH)“ i „varijabilni laki (ili VL)“ odnose se na varijabilne domene iz teškog ili lakog lanca molekula antitela.
Struka je dalje razvila molekule antitela i učinila ih svestranim alatima u medicini i tehnologiji. Prema tome, u kontekstu ovog pronalaska, izrazi „molekul antitela“ ili „antitelo“ ne uključuju samo antitela kako se mogu naći u prirodi, uključujući na pr. dva laka lanca i dva ili teška lanca, već pored toga obuhvata sve molekule koji sadrže najmanje jedan paratop sa specifičnošću vezivanja za antigen i sa strukturnom sličnošću sa varijabilnim domenom molekula antitela.
Dakle, molekul antitela prema pronalasku uključuje monoklonsko antitelo, humano antitelo, humanizovano antitelo, himerno antitelo, fragment antitela, naročito fragment Fv, Fab, Fab' ili F(ab')2, jednolančano antitelo, posebno jednolančani varijabilni fragment (scFv), mali modularni imunofarmaceutik (SMIP), antitelo domena, nanotelo, dijatelo.
Monoklonska antitela (mAb) su monospecifična antitela koja su identična u sekvenci aminokiselina. Mogu se proizvesti uz pomoć tehnologije hibridoma iz hibridne ćelijske linije (koja se naziva hibridom) koja predstavlja klon fuzije specifične B ćelije koja proizvodi antitela sa ćelijom mijeloma (karcinom B ćelije) (Kohler G, Milstein C.
Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 1975;256:495-7.). Alternativno, monoklonska antitela mogu se proizvesti uz pomoć rekombinantne ekspresije u ćelijama domaćina (Norderhaug L, Olafsen T, Michaelsen TE, Sandlie I. (May 1997). "Versatile vectors for transient and stable expression of recombinant antibody molecules in mammalian cells.". J Immunol Methods 204 (1): 77– 87.
1
Za primenu kod čoveka, često je poželjno smanjiti imunogenost antitela koja su prvobitno izvedena iz drugih vrsta, poput miša. To se može postići konstrukcijom himernih antitela ili postupkom koji se naziva „humanizacija“. U ovom kontekstu, pod „himernim antitelom“ podrazumeva se antitelo koje sadrži deo sekvence (na pr. varijabilni domen) izveden iz jedne vrste (na pr. miša) spojen sa delom sekvence (na pr. konstantni domeni) koji je izveden iz druge vrste (na pr. humani). „Humanizovano antitelo“ je antitelo koje sadrži varijabilni domen koji je izvorno izveden iz ne-humane vrste, pri čemu su određene aminokiseline mutirane kako bi ukupna sekvenca tog varijabilnog domena više ličila na sekvencu humanog varijabilnog domena. Metode himerizacije i humanizacije antitela su dobro poznate u struci (Billetta R, Lobuglio AF. “Chimeric antibodies”. Int Rev Immunol.1993;10(2-3):165-76; Riechmann L, Clark M, Waldmann H, Winter G (1988). "Reshaping human antibodies for therapy". Nature: 332:323.).
Dalje, razvijene su tehnologije za stvaranje antitela na osnovu sekvenci izvedenih iz humanog genoma, na primer uz pomoć prikaza faga ili upotrebom transgenih životinja (WO 90/05144; D. Marks, H.R. Hoogenboom, T.P. Bonnert, J. McCafferty, A.D. Griffiths and G. Winter (1991) "By-passing immunisation. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage." J.Mol.Biol., 222, 581-597; Knappik et al., J. Mol. Biol.296: 57-86, 2000; S. Carmen and L. Jermutus, "Concepts in antibody phage display". Briefings in Functional Genomics and Proteomics 20021(2):189-203; Lonberg N, Huszar D. "Human antibodies from transgenic mice". Int Rev Immunol.1995;13(1):65-93.; Brćggemann M, Taussig MJ. "Production of human antibody repertoires in transgenic mice”. Curr Opin Biotechnol.1997 Aug;8(4):455-8.). Takva antitela su „humana antitela“ u kontekstu ovog pronalaska.
Molekuli antitela prema predmetnom pronalasku takođe uključuju fragmente molekula koji zadržavaju svojstva vezivanja antigena, poput fragmenata Fab, Fab’ ili F (ab’)2. Takvi fragmenti se mogu dobiti fragmentacijom molekula antitela, na pr. proteolitičkom digestijom ili rekombinantnom ekspresijom takvih fragmenata. Na primer, digestija molekula antitela može se postići uz pomoć rutinskih tehnika, na pr. korišćenjem papaina ili pepsina (WO 94/29348). Digestijom antitela uz pomoć papaina obično se dobijaju dva identična fragmenta koji vezuju antigen, takozvani Fab fragmenti, svaki sa jednim vezivnim mestom za antigen i rezidualni Fc fragment. Tretman pepsinom daje F(ab')2. U Fab molekulima, svaki od varijabilnih domena je fuzionisan sa konstantnim domenom imunoglobulina, poželjno humanog porekla. Tako, varijabilni domen teškog lanca može se spojiti sa domenom CH1 (takozvani Fd fragment), a varijabilni domen lakog lanca može se spojiti sa domenom CL. Fab molekuli mogu se dobiti rekombinantnom ekspresijom odgovarajućih nukleinskih kiselina u ćelijama domaćina, videti dole.
Razvijene su brojne tehnologije za smeštanje varijabilnih domena molekula antitela ili molekula izvedenih iz takvih varijabilnih domena u drugačiji molekularni kontekst. Njih takođe treba smatrati „antitelima“ u skladu sa ovim pronalaskom. Generalno, ovi molekuli antitela su manje veličine u poređenju sa molekulima prirodnih antitela i mogu sadržati jedan aminokiselinski lanac ili nekoliko aminokiselinskih lanaca. Na primer, jednolančani varijabilnih fragment (scFv) je spoj varijabilnih regiona teškog i lakog lanca molekula antitela, povezanih zajedno sa kratkim veznikom, obično serinom (S) ili glicinom (G) (WO 88/01649; WO 91/17271; Huston et al; International Reviews of Immunology, Volume 10, 1993, 195 - 217). “Single domain antibodies” or “nanobodies” harbour an antigen-binding site in a single Ig-like domain (WO 94/04678; WO 03/050531, Ward et al., Nature.1989 Oct 12;341(6242):544-6; Revets et al., Expert Opin Biol Ther.5(1):111-24, 2005). Jedno ili više antitela sa jednim domenom sa specifičnošću vezivanja za isti ili drugi antigen mogu biti povezani zajedno. Dijatela su bivalentni molekuli antitela koji se sastoje od dva lanca aminokiselina koji se sastoje od dva varijabilna domena (WO 94/13804, Holliger et al., Proc Natl Acad Sci U.S A.1993, 15. jul; 90 (14): 6444-8). Ostali primeri molekula sličnih antitelima su antitela super porodice imunoglobulina (IgSF; Srinivasan i Roeske, Current Protein Pept. Sci.2005, 6 (2): 185-96). Drugačiji koncept dovodi do takozvanog malog modularnog imunofarmaceutika (SMIP) koji sadrži Fv domen povezan sa jednolančanim šarkama i efektorskim domenima lišenim konstantnog domena CH1 (WO 02/056910).
Molekul antitela može biti fuzionisan (kao fuzijski protein) ili na drugi način povezan (kovalentnim ili nekovalentnim vezama) sa drugim molekularnim entitetima koji imaju željeni uticaj na svojstva molekula antitela. Na primer, može biti poželjno poboljšati farmakokinetička svojstva molekula antitela, stabilnost na pr. u telesnim tečnostima kao što je krv, posebno u slučaju jednolančanih antitela ili antitela domena. S tim u vezi razvijen je niz tehnologija, posebno da bi se produžilo vreme poluraspada takvih molekula antitela u cirkulaciji, poput pegilacije (WO 98/25971; WO 98/48837; WO 2004081026), spojilo ili na bilo koji drugi način kovalentno vezao molekul antitela za drugi molekul antitela koji ima afinitet prema serumskom proteinu poput albumina (WO 2004041865; WO 2004003019) ili ekspresija molekula antitela kao fuzijskog proteina sa celim ili delom serumskog proteina poput albumina ili transferina (WO 01/79258) .
Izrazi „epitop“ i „antigena determinanta“, koji se mogu koristiti naizmenično, odnose se na deo makromolekula, kao što je polipeptid, koji se prepoznaju uz pomoć molekula koji vezuju antigen, kao što su molekuli antitela prema pronalasku, i još specifičnije, uz pomoć mesta vezivanja antigena pomenutih molekula. Epitopi definišu minimalno mesto vezivanja za molekul antitela i na taj način predstavljaju cilj specifičnosti molekula antitela.
Molekul antitela koji se može „vezati“, „vezati za“, „specifično vezati“ ili „specifično vezati za“, koji „ima afinitet za“ i/ili koji „ima specifičnost za“ određeni epitop, antigen ili protein (ili za najmanje jedan njegov deo, fragment ili epitop) kaže se da je "protiv" ili "usmeren protiv" navedenog epitopa, antigena ili proteina ili je "vezujući" molekul u odnosu na takav epitop, antigen ili protein.
Generalno, izraz "specifičnost" odnosi se na brojne različite vrste antigena ili epitopa za koje se određeni antigen-vezujući molekul ili antigen-vezujući protein (kao što je imunoglobulin, antitelo, neki imunoglobulin pojedinačni varijabilni domen) može vezati. Specifičnost antigen-vezujućeg proteina može se odrediti na osnovu njegovog afiniteta i/ili avidnosti. Afinitet, predstavljen konstantom ravnoteže za disocijaciju antigena sa antigen-vezujućim proteinom (KD), je mera za snagu vezivanja između epitopa i antigenvezujućeg mesta na antigen-vezujućem proteinu: što je manja vrednost KD, to je jača vezana snaga između epitopa i antigen-vezujućeg molekula (alternativno, afinitet se takođe može izraziti kao konstanta afiniteta (KA), koja je 1/KD). Kao što će stručnjaku biti jasno (na primer na osnovu daljeg otkrića ovde), afinitet se može odrediti na način poznat sam po sebi, u zavisnosti od specifičnog antigena od interesa. Avidnost je mera jačine vezivanja između antigen-vezujućeg molekula (kao što je antitelo prema pronalasku) i odgovarajućeg antigena. Avidnost je povezana kako sa afinitetom između epitopa i njegovog antigen-vezujućeg mesta na antigen-vezujućem molekulu, tako i sa brojem odgovarajućih mesta vezivanja koja su prisutna na antigen-vezujućem molekulu.
Tipično, antigen-vezujući proteini (kao što su molekuli antitela prema pronalasku) će se vezati sa konstantom disocijacije (KD) od 10E-5 do 10E-14 mol/litar (M) ili manje, i poželjno 10E-7 do 10E- 14 mol/litar (M) ili manje, još poželjnije 10E-8 do 10E-14 mol/litar, a još poželjnije 10E-11 do 10E-13 (kao što je izmereno na pr. u Kineksa testu; poznato u struci), i/ili sa konstantom asocijacije (KA) od najmanje 10E7 ME-1, poželjno najmanje 10E8 ME-1, još poželjnije najmanje 10E9 ME-1, kao što je najmanje 10E11 ME-1.
Generalno se smatra da svaka vrednost KDveća od 10E-4 M ukazuje na nespecifično vezivanje. Poželjno je da se antitelo prema pronalasku veže za željeni antigen sa KD
1
manjim od 500 nM, poželjno manjim od 200 nM, poželjnije manjim od 10 nM, kao što je manje od 500 pM. Specifično vezivanje antigen-vezujućeg proteina za antigen ili epitop može se odrediti na bilo koji pogodan način poznat sam po sebi, uključujući, na primer, ovde opisane testove, Scatchard analizu i/ili kompetitivne testove vezivanja, kao što su radioimunoeseji (RIA), testovi enzimskih imunoloških analiza (EIA) i sendvič kompetetivne analize i njihove različite varijante poznate same po sebi u struci.
Afinitet vezivanja molekula antitela može se pojačati postupkom poznatim kao sazrevanje afiniteta (Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783; Barbas, et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813; Shier et al., 1995, Gene 169:147-155). Stoga su u ovom pronalasku obuhvaćena i afinitetno sazrela antitela.
Termini "takmičiti" ili "unakrsna konkurencija" ovde se koriste naizmenično da bi se odnosili na sposobnost nekog molekula antitela da ometa vezivanje molekula antitela, na primer, anti-PD1 ili LAG3 molekula antitela prema pronalasku, za ciljani na pr. humani PD1 ili LAG3. Ometanje vezivanja može biti direktno ili indirektno (na pr. alosteričnom modulacijom molekula antitela ili mete). Obim u kome je molekul antitela u stanju da ometa vezivanje drugog molekula antitela za metu, pa prema tome da li se može reći da se takmiči, može se utvrditi pomoću testa kompetitivnog vezivanja, na primer, FACS test, ELISA ili BIACORE test. U nekim realizacijama, test konkurentnog vezivanja je kvantitativni test takmičenja. U nekim realizacijama, za prvi anti-PD1 ili LAG3 molekul antitela se kaže da se takmiči za vezivanje za metu sa drugim anti-PD1 ili LAG3 molekulom antitela kada je vezivanje prvog molekula antitela za metu smanjeno za 10% ili više na pr.20% ili više, 30% ili više, 40% ili više, 50% ili više, 55% ili više, 60% ili više, 65% ili više, 70% ili više, 75% ili više, 80% ili više, 85% ili više, 90% ili više, 95% ili više, 98% ili više, 99% ili više u testu kompetitivnog vezivanja (na pr. ovde opisan test kompeticije).
Kompozicije i postupci koji su ovde otkriveni obuhvataju polipeptide i nukleinske kiseline koji imaju navedene sekvence ili sekvence koje su u osnovi identične ili slične, na pr. sekvence najmanje 85%, 90%, 95% identične ili više navedenim sekvencama. U kontekstu aminokiselinske sekvence, termin "suštinski identičan" ovde se koristi tako da se odnosi na prvu aminokiselinu koja sadrži dovoljan ili minimalan broj aminokiselinskih ostataka koji su i) identični sa ili ii) konzervativne supstitucije poravnatih aminokiselinskih ostataka u drugoj aminokiselinskoj sekvenci, tako da prva i druga aminokiselinska sekvenca mogu imati zajednički strukturni domen i / ili zajedničku funkcionalnu aktivnost. Na primer, sekvence aminokiselina koje sadrže zajednički strukturni domen koji ima najmanje oko 85%, 90%.91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta referentnoj sekvenci, na pr. sekvenci koja je ovde data. U kontekstu nukleotidne sekvence, termin "suštinski identičan" ovde se koristi tako da se odnosi na prvu sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži dovoljan ili minimalan broj nukleotida koji su identični poravnatim nukleotidima u drugoj sekvenci nukleinske kiseline, tako da prva i druga nukleotidna sekvenca kodiraju polipeptid koji ima zajedničku funkcionalnu aktivnost ili kodiraju zajednički strukturni polipeptidni domen ili zajedničku funkcionalnu polipeptidnu aktivnost. Na primer, nukleotidne sekvence koje imaju najmanje oko 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identiteta referentne sekvence.
Termini „identičan“ ili „procenat identiteta“, u kontekstu dve ili više nukleinskih kiselina ili polipeptidnih sekvenci, odnose se na dve ili više sekvenci ili podsekvenci koje su iste ili imaju određeni procenat nukleotida ili aminokiselinskih ostataka koji su isti, kada se uporede i poravnaju za maksimalnu korespondenciju. Da bi se utvrdio procenat identiteta, sekvence se poravnavaju u svrhe optimalnog poređenja (na pr. praznine se mogu uvesti u sekvencu prve aminokiseline ili sekvencu nukleinske kiseline radi optimalnog poravnanja sa sekvencom druge amino ili sekvencom nukleinske kiseline). Zatim se upoređuju aminokiselinski ostaci ili nukleotidi na odgovarajućim položajima aminokiselina ili nukleotidnim položajima. Kada je položaj u prvoj sekvenci zauzet istim aminokiselinskim ostatkom ili nukleotidom kao odgovarajući položaj u drugoj sekvenci, tada su molekuli identični na tom položaju. Procenat identiteta između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija koje dele sekvence (tj. % Identiteta = # identičnih pozicija/ukupan broj pozicija (na pr. preklapajuće pozicije) x100). U nekim realizacijama, dve sekvence koje se upoređuju su iste dužine nakon uvođenja praznina unutar sekvenci, kako je prikladno (na primer, izuzimajući dodatnu sekvencu koja se proteže dalje od sekvenci koje se upoređuju). Na primer, kada se upoređuju sekvence varijabilnog regiona, ne uzimaju se u obzir vodeće i/ili sekvence konstantnog domena. Za upoređivanje sekvenci između dve sekvence, "odgovarajući" CDR se odnosi na CDR na istoj lokaciji u obe sekvence (na pr. CDR-H1 svake sekvence).
Određivanje procenta identiteta ili procentualne sličnosti između dve sekvence može se izvršiti uz pomoć korišćenja matematičkog algoritma. Poželjni, neograničavajući primer matematičkog algoritma koji se koristi za upoređivanje dve sekvence je algoritam Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, modifikovan kao u Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Takav algoritam je ugrađen u programe NBLAST i XBLAST od Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol.215:403-410. Pretrage BLAST nukleotida mogu se izvršiti pomoću programa NBLAST, skor=100,
1
dužina znakova = 12, da bi se dobile nukleotidne sekvence homologne nukleinskoj kiselini koja kodira protein od interesa. Pretrage proteina BLAST mogu se izvršiti pomoću programa XBLAST, skor= 50, dužina znakova = 3, da bi se dobile aminokiselinske sekvence homologne proteinu od interesa. Da bi se postigla poravnanja sa prazninama za svrhe poređenja, Gapped BLAST se može koristiti kako je opisano u Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res.25:3389-3402. Alternativno, PSI-Blast se može koristiti za ponavljanje pretrage koja otkriva udaljene veze između molekula (Id.). Kada se koriste programi BLAST, Gapped BLAST i PSI-Blast, mogu se koristiti zadani parametri odgovarajućih programa (na pr. XBLAST i NBLAST). Još jedan poželjni, neograničavajući primer matematičkog algoritma koji se koristi za upoređivanje sekvenci je algoritam koji su dali Myers and Miller, CABIOS (1989). Takav algoritam je ugrađen u program ALIGN (verzija 2.0) koji je deo softverskog paketa za poravnanje GCG sekvence. Kada se koristi program ALIGN za upoređivanje aminokiselinskih sekvenci, može se koristiti tabela PAM120 ostataka težine, dužine praznina penala od 12 i praznina penala od 4. Dodatni algoritmi za analizu sekvenci poznati su u struci i uključuju ADVANCE i ADAM kako je opisano u Torellis i Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci.10: 3-5; i FASTA koja je opisana u Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 85: 2444-8. Unutar FASTA-e, ktup je kontrolna opcija koja podešava osetljivost i brzinu pretrage. Ako je ktup = 2, slični regioni u dve sekvence koje se upoređuju nalaze se gledanjem parova poravnatih ostataka; ako je ktup = 1, ispituju se jednostruko poravnate aminokiseline. ktup se može postaviti na 2 ili 1 za sekvence proteina ili na 1 do 6 za sekvence DNK. Podrazumevano za slučaj ako ktup nije naveden je 2 za proteine i 6 za DNK. Alternativno, poravnanje sekvence proteina može se izvršiti korišćenjem algoritma CLUSTAL W, kako je opisano od strane Higgins et al., 1996, Methods Enzimol.266: 383-402.
Ostaci aminokiselina biće naznačeni u skladu sa standardnim kodom od tri slova ili jednim slovom aminokiseline, kako je opšte poznato i dogovoreno u struci. Kada se upoređuju dve aminokiselinske sekvence, termin „aminokiselinska razlika“ odnosi se na insercije, delecije ili supstitucije naznačenog broja aminokiselinskih ostataka na položaju referentne sekvence, u poređenju sa drugom sekvencom. U slučaju supstitucije(a), takva supstitucija(e) će po mogućnosti biti konzervativna supstitucija(e) aminokiseline, što znači da se aminokiselinski ostatak zamenjuje drugim aminokiselinskim ostatkom slične hemijske strukture i koji ima mali ili suštinski nikakav uticaj na funkciju, aktivnost ili druga biološka svojstva polipeptida. Takve konzervativne supstitucije aminokiselina su dobro poznate u struci, na primer iz W01998/49185, gde su konzervativne supstitucije aminokiselina poželjno supstitucije u kojima je jedna aminokiselina u sledećim grupama
1
(i) - (v) supstituisana drugim aminokiselinskim ostatkom u okviru iste grupe: (i) mali alifatični, nepolarni ili blago polarni ostaci: Ala, Ser, Thr, Pro i Gly; (ii) polarni, negativno naelektrisani ostaci i njihovi (nenaelektrisani) amidi: Asp, Asn, Glu i Gin; (iii) polarni, pozitivno naelektrisani ostaci: His, Arg i Lys; (iv) veliki alifatski, nepolarni ostaci: Met, Leu, lie, Val i Cys; i (v) aromatični ostaci: Phe, Tyr i Trp. Naročito poželjne konzervativne zamene aminokiselina su sledeće: Ala u Gly ili u Ser; Arg u Lys; Asn u Gln ili u His; Asp u Glu; Cys u Ser; Gln u Asn; Glu u Asp; Gly u Ala ili u Pro; His u Asn ili u Gln; lle u Leu ili u Val; Leu u lle ili u Val; Lys u Arg, u Gln ili u Glu; Met u Leu, u Tyr ili u lle; Phe u Met, u Leu ili u Tyr; Ser u Thr; Thr u Ser; Trp u Tyr; Tyr u Trp ili u Phe; Val u Ile ili u Leu.
Termini "polipeptid", "peptid" i "protein" (ako su jednolančani) ovde se koriste naizmenično.
Termini „nukleinska kiselina“, „sekvenca nukleinske kiseline“, „nukleotidna sekvenca“ ili „polinukleotidna sekvenca“ i „polinukleotid“ koriste se naizmenično.
Termin "izolovan", kako se ovde koristi, odnosi se na materijal koji je uklonjen iz svog originalnog ili izvornog okruženja (na pr. prirodnog okruženja ukoliko se on prirodno javlja). Na primer, prirodni polinukleotid ili polipeptid prisutan u živoj životinji nije izolovan, ali je isti polinukleotid ili polipeptid, odvojen ljudskom intervencijom od nekih ili svih postojećih materijala u prirodnom sistemu, izolovan. Takvi polinukleotidi mogu biti deo vektora i/ili takvi polinukleotidi ili polipeptidi mogu biti deo kompozicije, i dalje biti izolovani po tome što takav vektor ili kompozicija nisu deo okoline u kojoj se nalaze u prirodi.
Poželjno je da nukleinska kiselina bude deo ekspresijskog vektora, pri čemu je pomenuti molekul nukleinske kiseline operativno povezan sa najmanje jednom regulatornom sekvencom, pri čemu takva regulatorna sekvenca može biti promotor, pojačivač ili terminatorska sekvenca, a najpoželjnije heterologni promotor, pojačivač ili terminatorska sekvenca.
ANTI-PD1 ANTITELA
Kao što je gore detaljno opisano, PD1 igra važnu ulogu u regulisanju aktivnosti T-ćelija, a time i aktivnosti imunog sistema. U nizu različitih postavki karcinoma je pokazano da antagonistički molekuli anti-PD1 antitela mogu povećati aktivnost T-ćelija, aktivirajući tako imuni sistem da napada tumore i tako leči karcinom.
1
Međutim, postojeći anti-PD1 molekuli antitela pate od problema povezanih sa neželjenim efektima, kao i neuspeha velikog dela pacijenata da odgovori na tretman. Stoga postoji potreba za identifikovanjem alternativnih molekula anti-PD1 antitela koji imaju poboljšani terapeutski indeks u poređenju sa stanjem tehnike. Takvi molekuli se mogu koristiti u monoterapiji, a takođe i u kombinaciji sa dodatnim terapijskim agensima, posebno sa drugim modulatorima aktivnosti T-ćelija.
U tom kontekstu, pronalazači su pokušali da generišu dodatna anti-PD1 antitela.
Polazeći od progenitornog mišjeg antitela do PD1 (nazvanog 77E11), oni su pripremili 5 humanizovanih derivata, koji su predmetni molekuli anti-PD1 antitela ovog pronalaska. molekuli anti-PD1 antitela iz ovog pronalaska nazivaju se PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 i PD1-5.
Koristeći in vitro test aktivacije T-ćelija (dalje opisan u Primeru 4), ispitivali su funkcionalne karakteristike reprezentativnih anti-PD1 antitela iz predmetnog pronalaska. Kao što se može videti u Primeru 12 i na Slici 8, testirana antitela su bila u stanju da indukuju aktivaciju T-ćelija na viši nivo kada se kombinuju sa anti-LAG3 antitelima u poređenju sa referentnom kombinacijom anti-PD1/LAG3, što sugeriše da imaju poželjnija terapijska aktivnost od referentnih anti-PD1 antitela.
Kao što se može ceniti, ova iznenađujuća sposobnost anti-PD1 antitela iz predmetnog pronalaska da efikasnije indukuju aktivaciju T-ćelija od referentnih anti-PD1 antitela iz stanja tehnike sugeriše da bi mogla da se koriste za lečenje karcinoma na nižim nivoima doziranja od referentnog anti-PD1 antitela iz stanja tehnike, što može omogućiti terapijsku primenu sa manje neželjenih sporednih efekata.
Podstaknuti podacima, pronalazači su dalje istraživali razne druge funkcionalne karakteristike molekula anti-PD1 antitela iz predmetnog pronalaska. U ovu procenu bilo je uključeno određivanje farmakokinetičkih svojstava in vivo. Kao što je prikazano u Primeru 7 i prikazano na Slici 5, mereno kod majmuna Cinomolgus, krajnje poluvreme eliminacije primećeno na primer kod anti-PD1 antitela iz ovog pronalaska pri intravenskoj dozi od 1 mg/kg bilo je 1,5 do 2 -struko veće od referentnih anti-PD1 antitela iz stanja tehnike.
Nasuprot anti-PD1 antitelima poznatim u struci, ovo sugeriše da anti-PD1 antitela iz pronalaska imaju serumsko poluvreme od 11 dana. Ovo je u kontrastu sa poznatim referentnim molekulima anti-PD1 antitela koji tipično imaju poluživot od 4 do 6 dana u
1
opsegu doza 0,3-3 mg/kg, kao što se može videti iz pratećih primera. Ova iznenađujuća karakteristika molekula antitela iz zahteva može omogućiti pacijentu da se leči antitelima iz pronalaskas sa manjom frekvencijom u poređenju sa onima u stanju tehnike, što može dovesti do smanjenja količine antitela koja se mora dostaviti bilo u oblik smanjene Xčestalosti primene ili u smanjenoj količini antitela koja će se koristiti. S obzirom na to da molekuli anti-PD1 antitela mogu da indukuju neželjene sporedne efekte kod pacijenata, kao što je prethodno diskutovano, tada anti-PD1 antitela iz pronalaska mogu imati značajnu i iznenađujuću kliničku prednost u odnosu na stanje tehnike.
Prema tome, prvi aspekt iz pronalaska obezbeđuje molekul anti-PD1antitela, koji sadrži:
(a) CDR-ove teškog lanca koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 1 (hcCDR1), SEK ID BR: 2 (hcCDR2) i SEK ID BR: 3 (hcCDR3) i sadrži CDR-ove lakog lanca koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 4 (lcCDR1), SEK ID BR: 5 (lcCDR2) i SEK ID BR: 6 (lcCDR3); ili,
(b) CDR-ove teškog lanca koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 7 (hcCDR1), SEK ID BR: 8 (hcCDR2) i SEK ID BR: 9 (hcCDR3) i sadrži CDR-ove lakog lanca koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 10 (lcCDR1), SEK ID BR: 11 (lcCDR2) i SEK ID BR: 12 (lcCDR3); ili,
(c) CDR-ove teškog lanca koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 13 (hcCDR1), SEK ID BR: 14 (hcCDR2) i SEK ID BR: 15 (hcCDR3) i ima CDR-ove lakog lanca koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 16 (lcCDR1), SEK ID BR: 17 (lcCDR2) i SEK ID BR: 18 (lcCDR3).
Kao što je gore navedeno, molekuli anti-PD1 antitela iz ovog pronalaska nazivaju se PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 i PD1-5. Ovde je data tabela sekvenci koja lako omogućava identifikaciju pojedinačnih aminokiselinskih sekvenci do specifičnih anti-PD1 molekula antitela iz prikazanog pronalaska. Rezime je dat u Tabeli 1 u Primeru 2.
Pored CDR sekvenci kako su ovde izložene, molekuli antitela prema pronalasku uključuju sekvence okvirnog područja (FR) imunoglobulina. Ove sekvence poželjno nisu imunogene za ljude, pa su prema tome humane ili humanizovane FR sekvence.
Pogodne humane ili humanizovane FR sekvence su poznate u tehnici. Naročito poželjne FR sekvence mogu se preuzeti iz ovde prikazanih primena, otkrivajući kompletne molekule antitela i time CDR sekvence kao i FR sekvence.
1
Postupci za pripremu molekula antitela iz prvog aspekta pronalaska dobro su poznati u struci, a stručnjak bi lako mogao da pripremi molekul antitela koji ima karakteristike prvog aspekta pronalaska. Primeri takvih metoda dati su u nastavku.
Za proizvodnju antitela koja se sastoje od dva kompletna teška i dva kompletna laka lanca, poput onih tipa IgG1 ili IgG4, videti Norderhaug et al., J Immunol Methods 1997, 204 (1): 77–87; Kipriyanow and Le Gall, Molecular Biotechnology 26: 39- 60, 2004;
Shukla et al., 2007, J. Chromatography B, 848(1): 28-39.
Procesi za proizvodnju scFv antitela rekombinantnom ekspresijom nukleinskih kiselina koje kodiraju scFv konstrukte u ćelijama domaćina (poput E. coli, Pichia pastoris ili ćelijskih linija sisara, npr. CHO ili NS0), dajući funkcionalne scFv molekule, takođe su poznati (Rippmann et al., Applied and Environmental Microbiology 1998, 64(12): 4862-4869; Yamawaki et al., J. Biosci. Bioeng.2007, 104(5): 403-407; Sonoda et al., Protein Expr. Purif.2010, 70(2): 248-253).
Da bi se izbegla sumnja, svaka od dole navedenih specifičnih realizacija za prvi aspekt pronalaska takođe se može smatrati nezavisnim aspektima pronalaska.
Poželjna realizacija prvog aspekta pronalaska je gde je pomenuti molekul antitela humanizovani molekul antitela.
Dalja poželjna realizacija prvog aspekta pronalaska je gde je pomenuti molekul antitela monoklonsko antitelo, Fab, F(ab ́)2, Fv ili scFv.
Termini „humanizovani“, „Fab“, „F(ab ́)2“, „Fv“ i „scFv“ dobro su poznati u tehnici i dalje su ovde razmotreni u odeljku Definicije ovog opisa.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela ima konstantan region teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA i IgE konstantnih regiona. Poželjno je da je konstantni region teškog lanca IgG4 sa mutacijom S241P.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela ima konstantni region lakog lanca koji je kapa ili lambda.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela ima varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 85% identičnu bilo kojoj od SEK ID BR:
2
19, 21, 23, 25 i 27. Poželjno je da pomenuti molekul antitela ima varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEK ID BR: 19, 21, 23, 25 i 27.
U poželjnom rešenju, molekuli anti-PD1 antitela imaju varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 85% identičnu bilo kojoj od SEK ID BR: 20, 22, 24, 26 i 28. Poželjno je da pomenuti molekul antitela ima laki lanac varijabilnog domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 20, 22, 24, 26 i 28.
Metode izračunavanja identiteta aminokiselinskih sekvenci dobro su poznate u tehnici i dalje su ovde diskutovane u odeljku Definicije ovog opisa.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela ima varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 19.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela ima teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 29.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela ima varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 21.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela ima teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 31.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela ima varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 23.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela ima teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 33.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela ima varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 25.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela ima teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 35.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela ima varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 27.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela ima teški lanac koji sadrži
aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 37.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela ima varijabilni domen lakog lanca koji
sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 20.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela ima laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 30.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela ima varijabilni domen lakog lanca koji
sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 22.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela ima laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 32.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela ima varijabilni domen lakog lanca koji
sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 24.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela ima laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 34.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela ima varijabilni domen lakog lanca koji
sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 26.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela ima laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 36.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela ima varijabilni domen lakog lanca koji
sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 28.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela ima laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 38.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela ima varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 19 i varijabilni domen lakog lanca koji
sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 20.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela ima varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 21 i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 22.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela ima varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 23 i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 24.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela ima varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 25 i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 26.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela ima varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 27 i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 28.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela ima teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 29 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 30.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela ima teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 31 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 32.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela ima teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 33 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 34.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela ima teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 35 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 36.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela ima teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 37 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 38.
2
Za sve gornje realizacije će se razumeti da se, upotrebom izraza "sadrži", podrazumeva da se takođe uključi i realizacija u kojoj se odgovarajući domen ili molekul "sastoji" od aminokiselinske sekvence kako je naznačeno.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela je sposoban da se veže za humani PD1 sa konstantom disocijacije (KD) manjom od 10 nM.
U nekim realizacijama, molekul anti-PD1 antitela je sposoban da se veže za humani PD1 i PD1 iz cinomolgus majmuna sa visokim afinitetom. U nekim realizacijama, visoki afinitet odnosi se na KDmanji od 10nM, na pr.9, 8, 7, 6 ili niže, mereno uz pomoć SPR. U pratećim primerima dat je protokol za određivanje KDuz pomoć SPR.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela se ne vezuje za mišiji PD1.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela je sposoban da smanji vezivanje humanog PD-L1/L2 za humani PD1. Analiza za određivanje vezivanja humanog PD-L1/L2 sa humanim PD1 data je u pratećim primerima.
U nekim realizacijama, molekul anti-PD1 antitela je sposoban da inhibira vezivanje liganda PD-L1 i PD-L2 za PD1 sa IC90manjim od 10 nM, 9, 8, 7, 6, 5 ili 4 nM ili nižim. Protokol za određivanje IC90dat je u pratećim primerima.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-PD1 antitela je sposoban da pojača antigen-specifični odgovor T ćelija. Analiza za određivanje antigen-specifičnog odgovora T ćelija je data u Primeru 4.
Sledeći aspekt ovog pronalaska obezbeđuje izolovane molekule nukleinske kiseline koji kodiraju varijabilni domen teškog lanca i/ili varijabilni domen lakog lanca nekog molekula anti-PD1 antitela iz bilo kog od prvih aspekata pronalaska.
Poželjno molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu SEK ID BR: 71, 73, 75, 77 ili 79, koje respektivno kodiraju varijabilni domen teškog lanca SEK ID BR 19, 21, 23, 25 ili 27. Poželjno molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu SEK ID BR: 72, 74, 76, 78 ili 80, koje respektivno kodiraju varijabilni domen lakog lanca SEK ID BR 20, 22, 24, 26 ili 28.
Sledeći aspekt pronalaska obezbeđuje ekspresioni vektor koji sadrži molekul DNK koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira varijabilni domen teškog lanca i/ili varijabilni domen lakog lanca molekul iz molekula anti-PD1 antitela iz pronalaska. Poželjno je da ekspresijski vektor sadrži molekul DNK koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEK ID BR: 71 i/ili SEK ID BR: 72, ili koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEK ID BR: 73 i/ili SEK ID BR: 74, ili koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEK ID BR: 75 i/ili SEK ID BR: 76, ili koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEK ID BR: 77 i/ili SEK ID BR: 78 ili koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEK ID BR: 79 i/ili SEK ID BR: 80.
Poželjno, ekspresioni vektor sadrži, pored toga, molekul nukleinske kiseline, poželjno molekul DNK, koji kodira konstantne domene teškog lanca i/ili konstantni domen lakog lanca, koje su respektivno povezane sa molekulom nukleinske kiseline, poželjno sa DNK molekulom koji kodira varijabilni domen teškog lanca i/ili varijabilni domen lakog lanca, respektivno.
U posebno poželjnoj realizaciji mogu se koristiti dva ekspresiona vektora, jedan za ekspresiju teškog lanca, drugi za ekspresiju lakog lanca, koja dva ekspresiona vektora mogu zatim biti transfektovana u ćeliju domaćina za ekspresiju rekombinantnih proteina.
Poželjno je da ekspresioni vektor bude vektor koji sadrži pomenuti molekul ili molekule nukleinske kiseline, operativno vezan za najmanje jednu regulatornu sekvencu, pri čemu takva regulatorna sekvenca može biti promotor, pojačivač ili terminatorska sekvenca, a najpoželjnije heterologni promotor, pojačivač ili terminatorska sekvenca.
Nukleinske kiseline prema pronalasku mogu se pripremiti ili dobiti na način poznat sam po sebi (na pr. automatskom sintezom DNK i/ili tehnologija rekombinantne DNK), na osnovu informacija o aminokiselinskim sekvencama za antitela iz pronalaska koja su ovde data.
U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na ćeliju domaćina koja ima ekspresioni vektor koji kodira teški lanac molekula anti-PD1 antitela iz pronalaska i ekspresioni vektor koji kodira laki lanac molekula anti-PD1 antitela iz pronalaska.
Prema posebno poželjnoj realizaciji, pomenute ćelije domaćina su eukariotske ćelije kao što su ćelije sisara. U još jednoj realizaciji, takve ćelije domaćina su bakterijske ćelije. Ostale korisne ćelije su ćelije kvasca ili ćelije drugih gljivica.
2
Pogodne ćelije sisara uključuju, na primer, CHO ćelije, BHK ćelije, HeLa ćelije, COS ćelije i slično. Međutim, mogu se koristiti i ćelije vodozemaca, ćelije insekata, biljne ćelije i bilo koje druge ćelije koje se u struci koriste za ekspresiju heterolognih proteina.
ANTI-LAG3 ANTITELA
Kao što je gore detaljno opisano, PD1 igra važnu ulogu u regulisanju aktivnosti T-ćelija, a time I u aktivnosti imunog sistema. U nizu različitih postavki karcinoma je pokazano da antagonistički molekuli anti-PD1 antitela mogu povećati aktivnost T-ćelija, aktivirajući tako imuni sistem da napada tumore i tako leči karcinom.
Takođe je pokazano da kombinacije antagonističkih anti-PD1 antitela sa molekulima antitela koja ciljaju dalje inhibitore kontrolnih tačaka imunih ćelija mogu pojačati antikancerogena svojstva antagonističkih anti-PD1 antitela. Jedan takav inhibitor kontrolne tačke naziva se LAG3.
Kao i kod PD1, izgleda da LAG3 igra ulogu u posredovanju aktivnosti T-ćelija. Štaviše, u struci je poznato da je dvostruka blokada PD1 puta i LAG3 efikasnija za antitumorski imunitet od blokiranja bilo kog molekula pojedinačno.
U skladu sa ovim stanjem tehnike, pronalazači su pokušali da generišu dalje molekule anti-LAG3 antitela koji bi mogli da se koriste ili sami ili u kombinaciji sa molekulima anti-PD1 antitela iz ovog pronalaska. Polazeći od progenitorskog mišjeg antitela do LAG3 (nazvanog 496G6), oni su pripremili pet humanizovanih derivata, koji se nazivaju LAG3-1, LAG3-2, LAG3-3, LAG3-4 i LAG3-5.
Koristeći in vitro test aktivacije T-ćelija (dalje prikazan u Primeru 12), ispitali su funkcionalne karakteristike reprezentativnih molekula anti-LAG3 antitela iz ovog otkrića. Kao što se može videti u Primeru 12 i Slici 8, kombinacija molekula anti-LAG3 antitela iz ovog pronalaska sa molekulima anti-PD1 antitela iz ovog pronalaska je iznenađujuće superiorna u odnosu na referentne kombinacije anti-PD1/LAG3 antitela koje su poznate u tehnici.
Kao što se može ceniti, ova superiornost kombinacije molekula anti-LAG3 antitela iz ovog pronalaska sa molekulima anti-PD1 antitela iz ovog pronalaska sugeriše da bi oni mogli da se koriste za lečenje karcinoma sa nižim nivoima doziranja od terapija
2
antitelima iz stanja tehnike, koja može omogućiti terapijsku primenu sa manje neželjenih sporednih efekata.
S obzirom na to da molekuli anti-PD1 i anti-LAG3 antitela mogu da indukuju neželjene sporedne efekte kod pacijenata, kao što je gore pomenuto, tada anti-PD1 antitela i anti-LAG3 antitela iz ovog otkrića mogu imati značajnu i iznenađujuću kliničku prednost u odnosu na stanje tehnike korišćenjem nižih doza i/ili manje frekventnih režima primene.
Podstaknuti podacima, pronalazači su dalje istraživali razne druge funkcionalne karakteristike molekula anti-LAG3 antitela iz ovog otkrića. U ovu procenu je uključeno određivanje epitopa vezanog uz pomoć primera molekula anti-LAG3 antitela iz ovog otkrića. Kao što se može videti u Primeru 11, pronalazači su utvrdili da se molekuli anti-LAG3 antitela iz ovog otkrića mogu vezati za dva različita regiona humanog LAG-3, LLRRAGVT (SEK ID BR: 111) i/ili YRAAVHLRDRA (SEK ID BR: 112 ).
Prema najboljem saznanju pronalazača, nijedno poznato stanje tehnike sa anti-LAG3 antitelom nema isti profil vezivanja za epitop kao molekuli anti-LAG3 antitela iz otkrića. Iako ne žele da budu vezani za bilo koju određenu teoriju, pronalazači pretpostavljaju da je iznenađujuće poboljšana efikasnost kombinacije ovih molekula anti-LAG3 antitela iz ovog otkrića sa anti-PD1 antitelima iz ovog pronalaska, u poređenju sa molekulima iz stanja tehnike, se može pripisati profilu vezivanja molekula anti-LAG3 antitela iz ovog otkrića za epitop.
Prema tome, dalji aspekt otkrića obezbeđuje izolovani molekul anti-LAG3 antitela, pri čemu se pomenuti molekul anti-LAG3 antitela vezuje za epitop humanog LAG3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu LLRRAGVT (SEK ID BR: 111) i/ili YRAAVHLRDRA (SEK ID BR : 112). Takvi molekuli su ovde nazvani „molekuli anti-LAG3 antitela iz ovog otkrića“
Postupci za pripremu molekula anti-LAG3 antitela koji imaju takve karakteristike vezivanja za epitop dobro su poznati u struci.
Postupci za generisanje antitela i fragmenata antitela su dobro poznati u tehnici. Na primer, antitela se mogu generisati bilo kojim od nekoliko postupaka koji koriste indukciju in vivo proizvodnje molekula antitela, skrining biblioteka imunoglobulina (Orlandi et al, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.86:3833-3837; Winter et al 1991 , Nature 349:293-299) ili generisanje molekula monoklonskih antitela uz pomoć ćelijskih linija u kulturi. Oni
2
uključuju, ali nisu ograničeni na, tehniku hibridoma, tehniku hibridoma humanih B-ćelija i tehniku hibridoma Epstein-Barr virusa (EBV) (Kohler et al 1975. Nature 256:4950497; Kozbor et al 1985. J. Immunol. Methods 81 :31 -42; Cote et al 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030; Cole et al 1984. Mol. Cell. Biol.62:109-120).
Korišćenjem ovih metoda bilo bi uobičajeno da stručnjak u ovoj oblasti pripremi antitela koja imaju mesto vezivanja sa potrebnom specifičnošću za LAG3. Kandidatni molekuli antitela se zatim mogu pregledati pomoću mapiranja epitopa da bi se utvrdilo da li se vezuju za iste sekvence epitopa kako se zahteva od anti-LAG3 antitela iz ovog otkrića. Takve metode mapiranja epitopa dobro su poznate i rutinske u struci i stručna osoba ih može lako prihvatiti. Dalje, primer takve metodologije je dat u Primeru 11 u ovoj specifikaciji.
Navedeni molekul anti-LAG3 antitela obuhvata:
(a) CDR-ove teškog lanca koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 39 (hcCDR1), SEK ID BR: 40 (hcCDR2) i SEK ID BR: 41 (hcCDR3) i sadrži CDR-ove lakog lanca koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42 (lcCDR1), SEK ID BR: 43 (lcCDR2) i SEK ID BR: 44 (lcCDR3); ili,
(b) CDR-ove teškog lanca koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 45 (hcCDR1), SEK ID BR: 46 (hcCDR2) i SEK ID BR: 47 (hcCDR3) i ima CDR-ove lakog lanca koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 48 (lcCDR1), SEK ID BR: 49 (lcCDR2) i SEK ID BR: 50 (lcCDR3).
Kao što je gore opisano, molekuli anti-LAG3 antitela iz ovog otkrića nazivaju se LAG3-1, LAG3-2, LAG3-3, LAG3-4 i LAG3-5. Ovde je data tabela sekvenci koja lako omogućava identifikaciju pojedinačnih aminokiselinskih sekvenci za specifične molekule anti-LAG3 antitela iz ovog otkrića. Rezime je dat u Tabeli 6 u Primeru 9.
Postupci za pripremu molekula anti-LAG3 antitela iz ovog otkrića dobro su poznati u stanju tehnike, a stručnjak bi lako mogao da pripremi molekul antitela. Primeri takvih metoda su dati gore u odnosu na anti-PD1 antitela.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-LAG3 antitela ima varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 85% identična sa bilo kojom od SEK ID BR: 51, 53, 55, 57 i 59. Poželjno je da pomenuti molekul antitela ima varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEK ID BR: 51, 53, 55, 57 i 59.
2
U poželjnoj realizaciji molekul anti-LAG3 antitela ima varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 85% identična sa bilo kojom od SEK ID BR: 52, 54, 56, 58 i 60. Poželjno pomenuti molekul antitela ima varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 52, 54, 56, 58 i 60.
Metode izračunavanja identiteta aminokiselinskih sekvenci dobro su poznate u tehnici i dalje su ovde diskutovane u odeljku Definicije ovog opisa.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-LAG3 antitela ima varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 51.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-LAG3 antitela ima teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 61.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-LAG3 antitela ima varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 53.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-LAG3 antitela ima teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 63.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-LAG3 antitela ima varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 55.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-LAG3 antitela ima teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 65.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-LAG3 antitela ima varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 57.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-LAG3 antitela ima teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 67.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-LAG3 antitela ima varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 59.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-LAG3 antitela ima teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 69.
2
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-LAG3 antitela ima varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 52.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-LAG3 antitela ima laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 62.
U poželjnoj realizaciji, anti-LAG3 antitelo ima varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 54.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-LAG3 antitela ima laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 64.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-LAG3 antitela ima varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 56.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-LAG3 antitela ima laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 66.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-LAG3 antitela ima varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 58.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-LAG3 antitela ima laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 68.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-LAG3 antitela ima varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 60.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-LAG3 antitela ima laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 70.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-LAG3 antitela ima varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 51 i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 52.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-LAG3 antitela ima varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 53 i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 54.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-LAG3 antitela ima varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 55 i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 56.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-LAG3 antitela ima varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 57 i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 58.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-LAG3 antitela ima varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 59 i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 60.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-LAG3 antitela ima teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 61 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 62.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-LAG3 antitela ima teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 63 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 64.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-LAG3 antitela ima teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 65 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 66.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-LAG3 antitela ima teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 67 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 68.
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-LAG3 antitela ima teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 69 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 70.
Za sve gore navedene realizacije podrazumeva se da se upotrebom izraza "sadrži" namerava da uključi i realizacija u kojoj se dotični molekul ili domen "sastoji" od aminokiselinske sekvence kao što je naznačeno.
1
U poželjnoj realizaciji, molekul anti-LAG3 antitela je sposoban je da se veže za humani LAG3 sa konstantom disocijacije (KD) manjom od 1 nM.
U nekim realizacijama, molekul anti-LAG3 antitela je sposoban da se veže za humani LAG3 i LAG3 iz majmuna cinomolgus sa velikim afinitetom. U nekim realizacijama, visoki afinitet odnosi se na KDmanji od 0,5 nM, napr.0,4, 0,3, 0,2, 0,1, 0,09, 0,08, 0,07 ili niže, mereno uz pomoć SPR. U pratećim primerima dat je protokol za određivanje KDuz pomoć SPR.
U daljoj realizaciji, molekuli anti-LAG3 antitela se ne vezuju za mišji LAG3.
U daljoj realizaciji, molekul anti-LAG3 antitela sposoban je za jedno ili više od sledećih svojstava: (i) vezivanje za LAG3 iz majmuna cinomolgus; (ii) nedostatak vezivanja za mišji LAG3; (iii) inhibira vezivanje LAG3 za MHC II; i (iv) stimuliše imuni odgovor.
Sledeći aspekt obezbeđuje molekul anti-LAG3 antitela iz otkrića za upotrebu u medicini.
Sledeći aspekt obezbeđuje izolovane molekule nukleinske kiseline koji kodiraju varijabilni domen teškog lanca i/ili varijabilni domen lakog lanca molekula anti-LAG3 antitela iz otkrića. Poželjno, molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu SEK ID BR: 91, 93, 95, 97 ili 99, koje respektivno kodiraju varijabilni domen teškog lanca SEK ID BR: 51, 53, 55, 57 ili 59. Poželjno, molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu SEK ID BR: 92, 94, 96, 98 ili 100, koje respektivno kodiraju varijabilni domen lakog lanca SEK ID BR: 52, 54, 56, 58 ili 60.
Sledeći aspekt obezbeđuje ekspresioni vektor koji sadrži molekul DNK koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira teški lanac i/ili laki lanac molekula anti-LAG3 antitela iz otkrića. Poželjno je da ekspresioni vektor sadrži molekul DNK koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEK ID BR: 101 i/ili SEK ID BR: 102, ili koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEK ID BR: 103 i/ili SEK ID BR: 104, ili koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEK ID BR: 105 i/ili SEK ID BR: 106, ili koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEK ID BR: 107 i/ili SEK ID BR: 108 ili koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEK ID BR: 109 i/ili SEK ID BR: 110.
U posebno poželjnoj realizaciji mogu se koristiti dva ekspresiona vektora, jedan od njih za ekspresiju teškog lanca, drugi za ekspresiju lakog lanca, koja dva ekspresiona vektora mogu zatim oba biti transfektovana u ćeliju domaćina za ekspresiju rekombinantnih proteina.
2
Poželjno je da ekspresioni vektor bude vektor koji sadrži pomenuti molekul ili molekule nukleinske kiseline, operativno vezan za najmanje jednu regulatornu sekvencu, pri čemu takva regulatorna sekvenca može biti promotor, pojačivač ili terminatorska sekvenca, a najpoželjnije je heterologni promotor, pojačivač, ili terminatorska sekvenca.
Nukleinske kiseline se mogu pripremiti ili dobiti na način poznat sam po sebi (na pr. uz pomoć automatske sinteze DNK i/ili rekombinantnom DNK tehnologijom), na osnovu informacija o aminokiselinskim sekvencama za antitela koja su ovde data, kao što je dalje opisano gore u odnosu na anti-PD1 antitela iz ovog pronalaska.
U drugom aspektu, otkriće se odnosi na ćeliju domaćina koja ima ekspresioni vektor koji kodira teški lanac molekula anti-LAG3 antitela iz otkrića i ekspresioni vektor koji kodira laki lanac molekula anti-LAG3 antitela iz otkrića.
Prema posebno poželjnom rešenju, pomenute ćelije domaćina su eukariotske ćelije kao što su ćelije sisara, na pr. onih koji su već gore navedeni u vezi sa realizacijom anti-PD1 antitela. U još jednoj realizaciji, takve ćelije domaćina su bakterijske ćelije. Ostale korisne ćelije su ćelije kvasca ili ćelije drugih gljivica.
KOMBINACIJA ANTI-PD1 i ANTI-LAG3 ANTITELA
Sledeći aspekt pronalaska obezbeđuje komplet delova koji sadrže neki molekul anti-PD1 antitela iz pronalaska i neki molekul anti-LAG3 antitela. Poželjno je da je neki molekul anti-LAG3 antitela molekul anti-LAG3 antitela iz otkrića.
Sledeći aspekt otkrića pruža komplet delova koji sadrži molekul anti-LAG3 antitela iz pronalaska i molekul anti-PD1 antitela. Poželjno molekul anti-PD1 antitela je molekul anti-PD1 antitela iz pronalaska. Alternativno, još neko anti-PD1 antitelo, kao što je pembrolizumab ili nivolumab, može se koristiti u takvom kompletu delova.
Sledeći aspekt pronalaska pruža farmaceutsku kompoziciju koja sadrži molekul anti-PD1 antitela iz pronalaska. Jedna realizacija pronalaska je gde farmaceutska kompozicija dalje sadrži molekul anti-LAG3 antitela. Poželjno molekul anti-LAG3 antitela je molekul anti-LAG3 antitela ovde opisan.
Sledeći aspekt otkrića obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži molekul anti-LAG3 antitela iz pronalaska. U jednom aspektu, farmaceutska kompozicija dalje sadrži molekul anti-PD1 antitela. Poželjno molekul anti-PD1 antitela je molekul anti-PD1 antitela iz pronalaska. Alternativno, drugo anti-PD1 antitelo, kao što je pembrolizumab ili nivolumab, može se koristiti u takvoj farmaceutskoj kompoziciji.
Stručnjaku će biti jasno da su na osnovu gore navedenog ovde takođe otkriveni farmaceutske kompozicije za lečenje bolesti (kako je detaljnije navedeno u nastavku) koristeći gore pomenute molekule antitela, kao i postupci za lečenje bolesti (kako je detaljnije detaljnije opisano u nastavku) korišćenjem takvih farmaceutskih kompozicija ili molekula antitela prema pronalasku.
Kada se molekul anti-PD1 antitela iz pronalaska i molekula anti-LAG3 antitela iz otkrića treba istovremeno primenjivati istim putem davanja, oni se mogu primenjivati kao različite farmaceutske formulacije ili smeše ili kao deo kombinovane farmaceutske formulacije ili smeše. Takođe, kada se molekul anti-PD1 antitela prema pronalasku i molekul anti-LAG3 antitela iz ovog otkrića koriste kao deo kombinovanog režima lečenja, svako od antitela može se primenjivati u istoj količini i prema istom režimu kao što se koristi kada se jedno od antitela koristi samostalno, a takva kombinovana upotreba može ili ne mora dovesti do sinergijskog efekta. Međutim, kada kombinovana upotreba antitela dovodi do sinergijskog efekta, takođe može biti moguće smanjiti količinu jednog ili oba antitela, a istovremeno postići željeno terapijsko delovanje. Ovo može, na primer, biti korisno za izbegavanje, ograničavanje ili smanjenje bilo kojih neželjenih sporednih efekata koji su povezani sa upotrebom jednog ili oba antitela kada se koriste u uobičajenim količinama, a istovremeno se postiže željeni farmakološki ili terapeutski efekat.
FARMACEUTSKE KOMPOZICIJE I NJIHOVA UPOTREBA
Pronalazak se dalje odnosi na farmaceutske kompozicije koje sadrže najmanje jedan molekul antitela prema pronalasku.
Molekuli antitela prema pronalasku i/ili kompozicije koje se sastoje od istih mogu se primeniti pacijentu kome je to potrebno na bilo koji pogodan način, u zavisnosti od specifične farmaceutske formulacije ili kompozicije koja će se koristiti. Prema tome, molekuli antitela iz pronalaska i/ili kompozicije koje ih sadrže mogu se, na primer, primenjivati intravenozno (i.v.), subkutano (s.c.), intramuskularno (i.m.), intraperitonealno (i.p.), transdermalno, oralno, sublingvalno (na pr. u obliku sublingvalne tablete, spreja ili kapi koji se stavljaju pod jezik i adsorbuju kroz mukuzne membrane u kapilarnu mrežu
4
ispod jezika), (intra-)nazalno (na pr. u obliku nazalnog spreja i/ili kao aerosol), topikalno, pomoću supozitorija, pomoću inhalacije ili na bilo koji drugi pogodan način u efikasnoj količini ili dozi.
Molekuli antitela iz pronalaska i/ili kompozicije koje ih sadrže daju se prema režimu lečenja koji je pogodan za lečenje i/ili ublažavanja bolesti, poremećaja ili stanja koje treba lečiti ili ublažiti. Kliničar će generalno biti u mogućnosti da odredi pogodan režim lečenja, u zavisnosti od faktora kao što su bolest, poremećaj ili stanje koje treba lečiti ili ublažiti, težinu bolesti, težinu njihovih simptoma, specifični molekuli antitela prema pronalasku koji će se koristiti, specifični način primene i farmaceutska formulacija ili sastav koji će se koristiti, starost, pol, težina, dijeta, opšte stanje pacijenta i slični faktori dobro poznati kliničaru. Generalno, režim lečenja obuhvataće primenu jednog ili više molekula antitela prema pronalasku ili jedne ili više kompozicija koje se sastoje od istog, u terapeutski efikasnim količinama ili dozama.
Generalno, za lečenje i/ili ublažavanje ovde pomenutih bolesti, poremećaja i stanja i u zavisnosti od specifične bolesti, poremećaja ili stanja koje treba lečiti, jačina specifičnog molekula antitela iz pronalaska koji se koristi, specifični put primene i korišćene specifične farmaceutske formulacije ili kompozicije, molekuli antitela prema pronalasku će se generalno primenjivati u količini između 0,005 i 20,0 mg po kilogramu telesne težine i doze, poželjno između 0,05 i 10,0 mg/kg/dozi, i još poželjnije između 0,5 i 10 mg/kg/dozi, kontinuirano (na pr. pomoću infuzije) ili još poželjnije kao pojedinačne doze (kao što su na pr. dva puta nedeljno, nedeljne ili mesečne doze; sf. dole), ali mogu značajno da variraju, posebno u zavisnosti od prethodno pomenutih parametara. Prema tome, u nekim slučajevima može biti dovoljno koristiti manju dozu od prethodno date minimalne doze, dok će u drugim slučajevima gornja granica možda biti prekoračena. Kada se daju velike količine, bilo bi uputno podeliti ih na nekoliko manjih doza raspoređenih tokom dana.
U zavisnosti od specifičnog molekula antitela prema pronalasku i njegovih specifičnih farmakokinetičkih i drugih svojstava, može se davati svakodnevno, svaki drugi, treći, četvrti, peti ili šesti dan, nedeljno, mesečno i slično. Režim primene mogao bi da uključuje dugotrajno nedeljno lečenje. Pod „dugoročnim“ podrazumevaju se najmanje dve nedelje, a poželjno meseci ili godine trajanja.
Efikasnost molekula antitela prema pronalasku i kompozicija koje ih sadrže mogu se testirati korišćenjem bilo kog odgovarajućeg in vitro testa, testa zasnovanog na ćelijama, in vivo testa i/ili životinjskog modela poznatog per se, ili bilo koje njihove kombinacije, u zavisnosti od određene bolesti koja je uključena. Pogodni testovi i životinjski modeli biće jasni stručnjaku, a na primer uključuju testove i životinjske modele koji se koriste u primerima dole.
Za farmaceutsku upotrebu, molekuli antitela prema pronalasku mogu se formulisati kao farmaceutski preparat koji sadrži (i) najmanje jedno antitelo prema pronalasku (tj. anti-PD1 antitelo iz pronalaska ili anti-LAG3 antitelo iz pronalaska ili obe vrste antitela prema pronalasku zajedno) i (ii) najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač, pomoćnu supstancu, i/ili stabilizator i (iii) opciono jedan ili više drugih farmakološki aktivnih polipeptida i/ili jedinjenja. Pod „farmaceutski prihvatljivim“ podrazumeva se da odgovarajući materijal ne pokazuje bilo kakve biološke ili na drugi način neželjene efekte kada se daje pojedincu i ne deluje štetno u interakciji sa bilo kojom drugom komponentom farmaceutske kompozicije (kao što je na pr. farmaceutski aktivna sastojak) u kome je sadržan. Konkretni primeri mogu se naći u standardnim priručnicima, kao što je na pr. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18<th>Ed., Mack Publishing Company, USA (1990). Na primer, antitela prema pronalasku mogu se formulisati i primenjivati na bilo koji način koji je sam po sebi poznat za konvencionalna antitela i fragmente antitela i druge farmaceutski aktivne proteine. Prema tome, prema daljoj realizaciji, pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju ili preparat koji sadrži najmanje jedno antitelo prema pronalasku i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač, pomoćnu supstancu, adjuvans i/ili stabilizator, i opciono jednu ili više od farmakološki aktivnih supstanci.
Farmaceutski preparati za parenteralnu primenu, poput intravenske, intramuskularne, potkožne injekcije ili intravenske infuzije, mogu biti, na primer, sterilni rastvori, suspenzije, disperzije, emulzije ili praškovi koji sadrže aktivni sastojak i koji su pogodni, opciono nakon daljeg koraka rastvaranja ili razblaživanja, za infuziju ili injekciju. Pogodni nosači ili razblaživači za takve preparate, na primer, uključuju, bez ograničenja, sterilnu vodu i farmaceutski prihvatljive vodene pufere i rastvore kao što su fiziološki fiziološki puferisan fosfatom, Ringerovi rastvori, rastvor dekstroze i Hankov rastvor; vodena ulja; glicerol; etanol; glikoli kao što je propilen glikol, kao i mineralna ulja, životinjska ulja i biljna ulja, na primer ulje kikirikija, sojino ulje, kao i njihove odgovarajuće smeše.
Rastvori molekula antitela prema pronalasku mogu takođe da sadrže konzervans za sprečavanje rasta mikroorganizama, kao što su antibakterijska i antifungalna sredstva, na primer, p-hidroksibenzoati, parabeni, hlorobutanol, fenol, sorbinska kiselina, tiomersal, (soli alkalnih metala) etilendiamin tetraacetatna kiselina i slično. U mnogim slučajevima bi bilo poželjno uključiti izotonične agense, na primer, šećere, pufere ili natrijum hlorid. Po želji se mogu koristiti emulgatori i/ili disperzanti. Odgovarajuća fluidnost se može održavati, na primer, formiranjem lipozoma, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija ili upotrebom površinski aktivnih sredstava. Takođe se mogu dodati i druga sredstva koja odlažu apsorpciju, na primer aluminijum monostearat i želatin. Rastvori se mogu puniti u bočice za injekcije, ampule, bočice za infuziju i slično.
U svim slučajevima, krajnji oblik doziranja mora biti sterilni, tečan i stabilan pod uslovima proizvodnje i skladištenja. Sterilni rastvori za injekcije se pripremaju uključivanjem aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa raznim ostalim gore navedenim sastojcima, po potrebi, nakon čega sledi sterilizacija filterom. U slučaju sterilnih prahova za pripremu sterilnih rastvora za injekcije, poželjni postupci pripreme su vakuumsko sušenje i tehnike sušenja zamrzavanjem, što daje prah aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak prisutan u prethodno sterilno filtriranim rastvorima.
Obično se preferišu vodeni rastvori ili suspenzije. Generalno, pogodne formulacije za terapijske proteine kao što su antitela prema pronalasku su puferisani rastvor proteina, kao što su rastvori koji uključuju protein u pogodnoj koncentraciji (kao što je od 0,001 do 400 mg/ml, poželjno od 0,005 do 200 mg/ml, još poželjnije 0,01 do 200 mg/ml, i još poželjnije 1,0 - 100 mg/ml, kao što je 1,0 mg/ml (i.v. primena) ili 100 mg/ml (s.c. primena) i vodeni pufer kao što je:
- slani rastvor u puferu sa fosfatom, pH 7,4,
- ostali fosfatni puferi, pH 6,2 do 8,2,
- acetatni puferi, pH 3,2 do 7,5, poželjno pH 4,8 do 5,5
- histidinski puferi, pH 5,5 do 7,0,
- sukcinatni puferi, pH 3,2 do 6,6, i
- citratni puferi, pH 2,1 do 6,2,
i, opciono, soli (na pr. NaCl) i/ili šećeri (kao što su na pr. saharoza i trehaloza) i/ili drugi polialkoholi (kao što su na pr. manitol i glicerol) za obezbeđivanje izotoničnosti rastvora.
Poželjni puferski rastvori proteina su rastvori koji uključuju oko 0,05 mg/ml antitela iz pronalaska rastvorenog u 25 mM fosfatnom puferu, pH 6,5, podešenog na izotoničnost dodavanjem 220 mM trehaloze. Pored toga, druga sredstva kao što je deterdžent, na pr.
0,02% Tween-20 ili Tween-80, mogu biti uključena u takve rastvore. Formulacije za subkutanu primenu mogu da uključuju značajno veće koncentracije antitela prema pronalasku, kao što su do 100 mg/ml ili čak iznad 100 mg/ml. Međutim, stručnjaku u ovoj oblasti biće jasno da sastojci i njihove količine, kao što je gore dato, predstavljaju samo jednu, poželjnu opciju. Njihove alternative i njihove varijacije biće odmah očigledne stručnjaku ili se lako mogu zamisliti polazeći od gore navedenog otkrića.
Primena antitela može podrazumevati upotrebu uređaja, kao što su špric, injektorska olovka, mikropumpa ili drugi uređaj.
TERAPIJSKA UPOTREBA
Sledeći aspekt pronalaska obezbeđuje postupak lečenja karcinoma koji uključuje davanje pacijentu kome je to potrebno terapeutski efektivne količine molekula anti-PD1 antitela iz pronalaska. U poželjnoj realizaciji, postupak dalje uključuje davanje takvom pacijentu molekul anti-LAG3 antitela. Poželjno je da je molekul anti-LAG3 antitela molekul anti-LAG3 antitela iz otkrića.
Sledeći aspekt pronalaska obezbeđuje molekul anti-PD1 antitela iz pronalaska za upotrebu u metodi lečenja karcinoma. U poželjnoj realizaciji aspekt dalje uključuje dodatnu upotrebu molekula anti-LAG3 antitela. Poželjno molekul anti-LAG3 antitela je molekul anti-LAG3 antitela iz otkrića.
Sledeći aspekt pronalaska je upotreba molekula anti-PD1 antitela iz pronalaska za pripremu farmaceutske kompozicije za lečenje karcinoma. U poželjnoj realizaciji aspekt dalje uključuje dodatnu upotrebu molekula anti-LAG3 antitela. Poželjno molekul anti-LAG3 antitela je molekul anti-LAG3 antitela iz otkrića.
U jednoj realizaciji molekul anti-PD1 antitela treba da se daje simultano, konkurentno, uzastopno, sukcesivno, alternativno ili odvojeno, sa molekulom anti-LAG3 antitela.
Takođe je otkriven postupak lečenja karcinoma, koji uključuje davanje pacijentu kome je to potrebno terapeutski efektivne količine molekule anti-LAG3 antitela prema pronalasku. U poželjnoj realizaciji, postupak dalje uključuje davanje takvom pacijentu molekula anti-PD1 antitela i poželjno molekula anti-PD1 antitela iz pronalaska.
Sledeći aspekt pronalaska pruža molekul anti-LAG3 antitela iz otkrića za upotrebu u metodi lečenja karcinoma. U poželjnoj realizaciji aspekt dalje uključuje dodatnu upotrebu molekula anti-PD1 antitela. Poželjno molekul anti-PD1 antitela je molekul anti-PD1 antitela prema pronalasku.
Sledeći aspekt pronalaska je upotreba molekule anti-LAG3 antitela iz otkrića za pripremu farmaceutske kompozicije za lečenje karcinoma. U poželjnoj realizaciji aspekt dalje uključuje dodatnu upotrebu molekula anti-PD1 antitela. Poželjno je da je molekul anti-PD1 antitela molekul anti-PD1 antitela iz pronalaska.
U jednoj realizaciji molekul anti-LAG3 antitela treba da se daje simultano, konkurentno, uzastopno, sukcesivno, alternativno ili odvojeno, sa molekulom anti-PD1 antitela.
Da bi se izbegla sumnja, aspekti medicinske upotrebe mogu sadržati bilo koji od specifičnih molekula anti-PD1 antitela iz pronalaska i/ili molekul anti-LAG3 antitela iz otkrića kako je gore opisano.
Zbog svojih bioloških svojstava, ova antitela su pogodna za lečenje bolesti koje karakteriše prekomerna ili abnormalna proliferacija ćelija, poput kancera.
Kako se ovde koristi, termin "kancer" podrazumeva sve vrste kancerogenih izraslina ili onkogenih procesa, metastatska tkiva ili maligno transformisane ćelije, tkiva ili organe, bez obzira na histopatološki tip ili stadijum invazivnosti. Primeri kancerogenih poremećaja uključuju, ali nisu ograničeni na, solidne tumore, hematološke karcinome, tumore mekih tkiva i metastatske lezije. Primeri solidnih tumora uključuju maligne bolesti, na pr., sarkomi i karcinomi (uključujući adenokarcinome i karcinome skvamoznih ćelija) različitih organskih sistema, poput onih koji pogađaju jetru, pluća, dojke, limfoidne, gastrointestinalne (na pr. debelo crevo), genitourinarni trakt (na pr. bubrežne, urotelijalne ćelije), prostatu i ždrelo. Adenokarcinomi uključuju maligne bolesti poput većine karcinoma debelog creva, karcinoma rektuma, karcinoma bubrežnih ćelija, karcinoma jetre, karcinoma ne-malih ćelija pluća, karcinoma tankog creva i raka jednjaka.
Skvamozni ćelijski karcinomi uključuju maligne bolesti, na pr. u plućima, jednjaku, koži, predelu glave i vrata, usne šupljine, anusa i grlića materice. U jednoj realizaciji, kancer je melanom, na pr. melanom u poodmakloj fazi. Metastatske lezije gore pomenutih karcinoma mogu se takođe lečiti ili sprečiti upotrebom ovde opisanih metoda i kompozicija.
Primeri karcinoma čiji rast se može inhibirati korišćenjem ovde otkrivenih molekula antitela uključuju karcinome koji obično reaguju na imunoterapiju.
Na primer, sledeći karcinomi, tumori i druge proliferativne bolesti mogu se lečiti antitelima prema pronalasku, bez ograničenja na njih:
Kancer glave i vrata; Rak pluća, kao što je na pr. rak pluća ne-malih ćelija (NSCLC) i rak pluća malih ćelija (SCLC); Neoplazme medijastinuma, kao što je na pr. neurogeni tumori i mezenhimalni tumori; Karcinomi gastrointestinalnog (GI) trakta, kao što je na pr. karcinomi jednjaka, želuca (rak želuca), pankreasa, jetre i žučnog stabla (uključujući na pr. hepatocelularni karcinom (HCC)) i tankog i debelog creva (uključujući na pr. rak debelog creva); Rak prostate; Rak testisa; Ginekološki karcinomi, kao što je na pr. karcinomi jajnika; Rak dojke, kao što je na pr. karcinom dojke, rak dojke pozitivan na hormonske receptore, Her2 pozitivni rak dojke i trostruko negativni rak dojke; Rak endokrinog sistema; Sarkomi mekih tkiva, kao što su na pr. fibrosarkom, rabdomiosarkom, angiosarkom, Kaposijev sarkom; Sarkomi kostiju, kao što su na pr. mijelom, osteosarkom, Evingov tumor, fibrosarkom, osteohondrom, osteoblastom i hondroblastom; Mezoteliomi; Rak kože, kao što je na pr. karcinom bazalnih ćelija, skvamozni karcinom, Merkelov karcinom ćelija i melanom; Neoplazme centralnog nervnog sistema i mozga, kao što su na pr. astrocitom, glioblastom, neuroblastomi glioma i retinoblastomi; Limfomi i leukemije poput na pr. B-ćelijski ne-Hodgkin-ovi limfomi (NHL), T-ćelijski ne-Hodgkin-ovi limfomi, hronična B-ćelijska limfocitna leukemija (B-CLL), hronična T-ćelijska limfocitna leukemija (T-CLL), Hodgkinova bolest (HD), velika zrnasta limfocitna leukemija (LGL), hronična mijelogena leukemija (CML), akutna mijelogena/mijeloična leukemija (AML), akutna limfatična/limfoblastna leukemija (ALL), multipli mijelom (MM), plazmocitom i mijelodisplastični sindromi (MDS); i karcinomi nepoznatog primarnog mesta.
U poželjnoj realizaciji pronalaska kancer je rak pluća, poželjno rak pluća ne-malih ćelija (NSCLC).
Svi gore pomenuti karcinomi, tumori, neoplazme itd., koji se odlikuju specifičnom lokalizacijom/poreklom u telu, trebalo bi da uključuju i primarne tumore i metastatske tumore izvedene iz njih.
Moguće je da je verovatnije da će pacijent odgovoriti na lečenje molekulom antitela prema pronalasku (kao što je ovde opisano) ako taj pacijent ima kancer koji se karakteriše time da ima visoku ekspresiju PD-L1, i/ili gde je rak infiltriran sa antitumorskim imunološkim ćelijama, na pr limfociti koji se infiltriraju u tumor. Posebno,
4
pacijent koji se leči može imati rkancer koji se karakteriše time da ima visoku ekspresiju PD-L1 i/ili gde je kancer infiltriran antitumorskim imunološkim ćelijama.
Dalje, moguće je da je verovatnije da će pacijent odgovoriti na lečenje molekulom antitela prema pronalasku (kao što je ovde opisano) ako taj pacijent ima kancer koji se odlikuje visokim mutacijskim opterećenjem. Primeri kako se visoka mutacijska opterećenja mogu da procene uključuju utvrđivanje da li se kancer karakteriše mikrosatelitskom nestabilnošću ili lošom efikasnošću popravke DNK neusklađenosti. Smatra se da su takvi karcinomi imunogeniji i da je stoga veća verovatnoća da će odgovoriti na lečenje imunomodulatornim terapijskim režimima, kao što je molekul antitela prema pronalasku. Posebno, pacijent koji se leči može imati karcinom koji se odlikuje visokim mutacijskim opterećenjem.
Molekuli antitela prema pronalasku mogu se koristiti u terapijskim režimima u kontekstu prve linije, druge linije ili bilo kog daljeg tretmana.
Ovde opisani molekuli antitela mogu se koristiti za prevenciju, kratkotrajni ili dugotrajni tretman gore pomenutih bolesti, opciono takođe i u kombinaciji sa radioterapijom i/ili hirurgijom.
Naravno, gore navedeno takođe uključuje upotrebu ovde opisanih molekula antitela u različitim metodama lečenja gore navedenih bolesti davanjem terapijski efektivne doze pacijentu kome je to potrebno, kao i upotrebu ovih molekula antitela za proizvodnju lekova za lečenje takvih bolesti, kao i farmaceutske kompozicije koje uključuju ovde opisane molekule antitela, kao i pripremu i/ili proizvodnju lekova koji uključuju takva antitela.
Molekul antitela prema pronalasku ili kombinacija anti-PD1 antitela iz pronalaska i anti-LAG3 antitela iz otkrića može se koristiti samostalno ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutskih sredstava, posebno izabranih od hemoterapeutskih agenasa poput agenasa koji oštećuju DNK ili terapeutski aktivna jedinjenja koja inhibiraju angiogenezu, puteve transdukcije signala ili mitotičke kontrolne tačke u ćelijama karcinoma.
Dodatno terapeutsko sredstvo može se primenjivati istovremeno sa, opciono kao komponenta istog farmaceutskog preparata, ili pre ili posle primene molekula antitela.
U određenim realizacijama, dodatno terapijsko sredstvo može biti, bez ograničenja, jedan ili više inhibitora izabranih iz grupe inhibitora EGFR, VEGFR, HER2-neu, Her3, AuroraA, AuroraB, PLK i PI3 kinaze, FGFR, PDGFR, Raf, Ras, KSP, PDK1, PTK2, IGF R ili IR.
Dalji primeri dodatnih terapijskih sredstava su inhibitori CDK, Akt, src/bcr abl, cKit, cMet/HGF, c-Myc, Flt3, HSP90, ježni antagonisti, inhibitori JAK/STAT, Mek, mTor, NFkappaB, proteazoma, Rho, inhibitor wnt signalizacije ili inhibitor puta ubikvitinacije ili drugi inhibitor Notch signalnog puta.
Primeri za inhibitore Aurore su, bez ograničenja, PHA-739358, AZD-1152, AT 9283, CYC-116, R-763, VX-680, VX-667, MLN-8045, PF-3814735.
Jedan primer za PLK inhibitor je GSK-461364.
Primeri za raf inhibitore su BAY-73-4506 (takođe VEGFR inhibitor), PLX 4032, RAF-265 (takođe pored toga VEGFR inhibitor), sorafenib (takođe pored toga VEGFR inhibitor), i XL 281.
Primeri za KSP inhibitore su ispinesib, ARRY-520, AZD-4877, CK-1122697,
GSK 246053A, GSK-923295, MK-0731, i SB-743921.
Primeri za src i/ili bcr-abl inhibitore su dasatinib, AZD-0530, bosutinib, XL 228 (takođe neki IGF-1R inhibitor), nilotinib (takođe i PDGFR i cKit inhibitor), imatinib (takođe i cKit inhibitor), i NS-187.
Jedan primer za PDK1 inhibitor je BX-517.
Jedan primer za Rho inhibitor je BA-210.
Primeri za PI3 kinase inhibitore su PX-866, BEZ-235 (takođe neki mTor inhibitor), XL 418 (takođe neki Akt inhibitor), XL-147, i XL 765 (takođe neki mTor inhibitor).
Primeri za inhibitore za cMet ili HGF su XL-184 (takođe neki inhibitor za VEGFR, cKit, Flt3), PF-2341066, MK-2461, XL-880 (takođe neki inhibitor za VEGFR), MGCD-265 (takođe neki inhibitor za VEGFR, Ron, Tie2), SU-11274, PHA-665752, AMG-102, i AV-299.
Jedan primer za c-Myc inhibitor je CX-3543.
Primeri za Flt3 inhibitore su AC-220 (takođe neki inhibitor za cKit i PDGFR), KW 2449, lestaurtinib (takođe neki inhibitor za VEGFR, PDGFR, PKC), TG-101348 (takođe neki inhibitor za JAK2), XL-999 (takođe neki inhibitor za cKit, FGFR, PDGFR and VEGFR), sunitinib (takođe neki inhibitor za PDGFR, VEGFR and cKit), i tandutinib (takođe neki inhibitor za PDGFR, i cKit).
Primeri za HSP90 inhibitore su tanespimicin, alvespimicin, IPI-504 i CNF 2024.
Primeri za JAK/STAT inhibitore su CYT-997 (takođe u interakciji sa tubulin), TG 101348 (takođe neki inhibitor za Flt3), i XL-019.
Primeri za Mek inhibitore su ARRY-142886, PD-325901, AZD-8330, i XL 518.
Primeri za mTor inhibitore su temsirolimus, AP-23573 (koji takođe deluje kao VEGF inhibitor), everolimus (VEGF inhibitor pored toga). XL-765 (takođe i PI3 kinaza inhibitor), i BEZ-235 (takođe i PI3 kinaza inhibitor).
Primeri za Akt inhibitore su perifosine, GSK-690693, RX-0201, i triciribine.
Primeri za cKit inhibitore su AB-1010, OSI-930 (koji takođe deluje kao VEGFR inhibitor), AC-220 (takođe neki inhibitor za Flt3 i PDGFR), tandutinib (takođe neki inhibitor za Flt3 i PDGFR), aksitinib (takođe neki inhibitor za VEGFR i PDGFR), XL-999 (takođe neki inhibitor za Flt3, PDGFR, VEGFR, FGFR), sunitinib (takođe neki inhibitor za Flt3, PDGFR, VEGFR), i XL-820 (koji takođe deluje kao VEGFR- i PDGFR inhibitor), imatinib (takođe i bcr-abl inhibitor), nilotinib (takođe neki inhibitor za bcr-abl i PDGFR).
Primeri za ježne antagoniste su IPI-609 i CUR-61414.
Primeri za CDK inhibitore su seliciclib, AT-7519, P-276, ZK-CDK (takođe inhibiraju i VEGFR2 i PDGFR), PD-332991, R-547, SNS-032, PHA-690509, i AG 024322.
Primeri za inhibitore proteazoma su bortezomib, carfilzomib, i NPI-0052 (takođe neki inhibitor za NFkappaB).
Jedan primer za neki NFkappaB pathway inhibitor je NPI-0052.
4
Jedan primer za neki inhibitor puta ubikvitinacije je HBX-41108.
U poželjnim realizacijama, dodatno terapeutsko sredstvo je anti-angiogeno sredstvo.
Primeri za anti-angiogene agense su inhibitore za FGFR, PDGFR i VEGFR ili odgovarajući ligandi (na pr. VEGF inhibitori ka pegao što je ptanib ili anti-VEGF antitelo bevacizumab), i talidomidi, kao što su agensi koji se biraju od, bez ograničenja, nintedanib, bevacizumab, motesanib, CDP-791, SU-14813, telatinib, KRN-951, ZK-CDK (takođe neki inhibitor za CDK), ABT-869, BMS-690514, RAF-265, IMC-KDR, IMC-18F1, IMiDs (imunomodulatorni lekovi), derivate talidomida CC-4047, lenalidomide, ENMD 0995, IMC-D11, Ki 23057, brivanib, cediranib, XL-999 (takođe neki inhibitor za cKit i Flt3), 1B3, CP 868596, IMC 3G3, R-1530 (takođe neki inhibitor za Flt3), sunitinib (takođe neki inhibitor za cKit i Flt3), aksitinib (takođe neki inhibitor za cKit), lestaurtinib (takođe neki inhibitor za Flt3 i PKC), vatalanib, tandutinib (takođe neki inhibitor za Flt3 i cKit), pazopanib, GW 786034, PF-337210, IMC-1121B, AVE-0005, AG-13736, E-7080, CHIR 258, sorafenib tozilat (takođe neki inhibitor za Raf), RAF-265 (takođe neki inhibitor za Raf), vandetanib, CP-547632, OSI-930, AEE-788 (takođe neki inhibitor za EGFR i Her2), BAY-57-9352 (takođe neki inhibitor za Raf), BAY-73-4506 (takođe neki inhibitor za Raf), XL 880 (takođe neki inhibitor za cMet), XL-647 (takođe neki inhibitor za EGFR i EphB4), XL 820 (takođe neki inhibitor za cKit), i nilotinib (takođe neki inhibitor za cKit i brc-abl).
Dodatni terapeutski agens takođe može biti izabran od inhibitora EGFR, može biti inhibitor EGFR malog molekula ili anti-EGFR antitelo. Primeri za anti-EGFR antitela, bez ograničenja, su cetuksimab, panitumumab, matuzumab; primeri za inhibitor EGFR malog molekula, bez ograničenja, su gefitinib, afatinib, osimertinib i olmutinib. Još jedan primer za EGFR modulator je EGF fuzijski toksin.
Među inhibitorima EGFR i Her2 korisnim za kombinaciju sa molekulom antitela iz pronalaska su lapatinib, gefitinib, erlotinib, cetuksimab, trastuzumab, nimotuzumab, zalutumumab, vandetanib (takođe neki inhibitor za VEGFR), pertuzumab, XL-647, HKI-272, BMS-599626 ARRY-334543, AV 412, mAB-806, BMS-690514, JNJ-26483327, AEE-788 (takođe neki inhibitor za VEGFR), ARRY-333786, IMC-11F8, Zemab.
Ostali agensi koji se mogu povoljno kombinovati u terapiji sa molekulima antitela prema pronalasku su tositumumab i ibritumomab tiuksetan (dva radio-obeležena anti-CD20 antitela), alemtuzumab (neko anti-CD52 antitelo), denosumab (inhibitor ligand faktora diferencijacije osteoklasta) , galiksimab (CD80 antagonist), ofatumumab (CD20 inhibitor), zanolimumab (CD4 antagonist), SGN40 (CD40 ligandni receptorski modulator), rituksimab (CD20 inhibitor) ili mapatumumab (TRAIL-1 receptorski agonist).
Ostali hemoterapeutski lekovi koji se mogu koristiti u kombinaciji sa molekulima antitela iz ovog pronalaska odabrani su, ali nisu ograničeni na hormone, hormonske analoge i antihormonske (na pr. tamoksifen, toremifen, raloksifen, fulvestrant, megestrol acetat, flutamid, nilutamid, bikalutamid, ciproterone acetat, finasterid, buserelin acetat, fludrokortizon, fluoksimestron, medroksiprogesteron, oktreotid, arzoksifen, pasireotid, vapreotid), inhibitore aromataze (na pr. anastrozol, letrozol, liarozol, eksemestan, atamestan, formestan), agoniste i antagoniste LHRH (na pr. goserelin acetat, leuprolid, abareliks, cetroreliks, deslorelin, histrelin, triptorelin), antimetabolite (na pr. antifolati poput metotreksata, pemetrekseda, analogi pirimidina poput 5 fluorouracila, kapecitabin, decitabin, nelarabin i gemcitabin, analozi purina i adenozina kao što su merkaptopurin tioguanin, kladribin i pentostatin, citarabin, fludarabin); antitumorske antibiotike (na pr. antraciklini poput doksorubicina, daunorubicina, epirubicina i idarubicina, mitomicin-C, bleomicin daktinomicin, plikamicin, mitoksantron, piksantron, streptozocin); derivati platine (na pr. cisplatin, oksaliplatin, karboplatin, lobaplatin, satraplatin); agense za alkilovanje (na pr. estramustin, mekloretamin, melfalan, hlorambucil, busulfan, dakarbazin, ciklofosfamid, ifosfamid, hidroksiurea, temozolomid, nitrosoureje kao što su karmustin i lomustin, tiotepa); antimitotička sredstva (na pr. vinka alkaloidi poput vinblastina, vindesin, vinorelbin, vinflunin i vinkristin; i taksani poput paklitaksela, docetaksela i njihovih formulacija, larotaksel; simotaksel i epotiloni poput iksabepilona, patupilona, ZK EPO); inhibitori topoizomeraze (na pr. epipodofilotoksini poput etopozida i etopofosa, tenipozida, amsakrina, topotekana, irinotekana) i razni drugi hemoterapeutici kao što su amifostin, anagrelid, interferon alfa, prokarbazin, mitotan i porfimer, beksaroten, celecoksib.
U određenim realizacijama, dodatno terapeutsko sredstvo može biti dalje imunoterapijsko sredstvo, kao što su modulatori sledećih inhibitora kontrolne tačke: TIM3, PD-L1 (na pr. atezolizumab, avelumab ili durvalumab), PD-L2, CTLA-4, VISTA, BTLA, TIGIT, CD160, LAIR1, 2B4, CEACAM.
U drugim realizacijama imunoterapijsko sredstvo može biti vakcina protiv raka.
Kada se dve ili više supstanci ili principa koriste kao deo kombinovanog režima lečenja, mogu se primenjivati istim putem davanja ili različitim načinima primene, u suštini u isto
4
vreme (tj. simultano, konkurentno) ili u različito vreme (na pr. sekvencijalno, sukcesivno, naizmenično, uzastopno ili prema bilo kojoj drugoj vrsti naizmeničnog režima).
Kada supstance ili principi treba da se daju istovremeno istim putem davanja, mogu se primenjivati kao različite farmaceutske formulacije ili smeše ili kao deo kombinovane farmaceutske formulacije ili smeše. Takođe, kada se dve ili više aktivnih supstanci ili principa koriste kao deo kombinovanog režima lečenja, svaka od supstanci ili principa može se primenjivati u istoj količini i prema istom režimu koji se koristi kada se koristi jedinjenje ili princip samostalno, a takva kombinovana upotreba može ili ne mora dovesti do sinergijskog efekta. Međutim, kada kombinovana upotreba dve ili više aktivnih supstanci ili principa dovodi do sinergijskog efekta, takođe može biti moguće smanjiti količinu jedne, više ili svih supstanci ili principa koji će se primenjivati, a istovremeno postići željeno terapijsko dejstvo. Ovo na primer može biti korisno za izbegavanje, ograničavanje ili smanjenje neželjenih sporednih efekata koji su povezani sa upotrebom jedne ili više supstanci ili principa kada se koriste u uobičajenim količinama, a istovremeno se postiže željeni farmakološki ili terapeutski efekat .
Naravno, gore navedeno uključuje pripremu i metode pripreme antitela prema pronalasku za kombinovanu upotrebu sa gore navedenim kombinacionim partnerima. Takođe su obuhvaćeni priprema i postupci pripreme, gore pomenutih kombinacionih partnera za kombinovanu upotrebu sa antitelima iz pronalaska.
Molekuli antitela prema pronalasku mogu se koristiti sami ili u kombinaciji sa drugim režimima lečenja, na primer hirurškim i/ili terapijom zračenjem.
KOMPLETI
Pronalazak takođe obuhvata komplete koji sadrže najmanje jedno antitelo prema pronalasku i jednu ili više drugih komponenti odabranih iz grupe koja se sastoji od drugih lekova koji se koriste za lečenje bolesti i poremećaja kako je gore opisano.
U jednoj realizaciji, komplet uključuje kompoziciju koja sadrži efektivnu količinu molekula anti-PD1 antitela iz otkrića u obliku jedinične doze. U još jednoj realizaciji, komplet uključuje kompoziciju koja sadrži efikasnu količinu molekula anti-LAG3 antitela iz otkrića u obliku jedinične doze. U daljoj realizaciji, komplet uključuje i kompoziciju koja sadrži efektivnu količinu molekula anti-PD1 antitela iz pronalaska u jediničnom doznom obliku i
4
kompoziciju koja sadrži efektivnu količinu molekula anti-LAG3 antitela iz otkrića u jediničnoj doznoj formi.
U nekim realizacijama, komplet se sastoji od sterilne posude koja sadrži takvu kompoziciju; takvi kontejneri mogu biti kutije, ampule, bočice, bočice, epruvete, kese, kesice, blister pakovanja ili drugi pogodni oblici kontejnera poznati u struci. Takvi kontejneri mogu biti izrađeni od plastike, stakla, laminiranog papira, metalne folije ili drugih materijala pogodnih za držanje lekova.
Ako se želi, molekul antitela prema pronalasku ili kombinacija obe vrste antitela iz pronalaska i otkrića su dati zajedno sa uputstvima za davanje antitela/antitela subjektu koji ima rak. Uputstva će obično sadržati informacije o upotrebi kompozicije za lečenje ili prevenciju raka. U drugim realizacijama, uputstva uključuju najmanje jedno od sledećeg: opis terapijskog sredstva; raspored doziranja i primena za lečenje ili prevenciju raka ili njegovih simptoma; mere predostrožnosti; upozorenja; indikacije; kontraindikacije; informacije o predoziranju; neželjene reakcije; farmakologija životinja; kliničke studije; i/ili reference. Uputstva se mogu odštampati direktno na kontejneru (kada postoje) ili kao etiketa nalepljena na kontejner ili kao zaseban list, brošura, kartica ili fascikla koja se isporučuju u ili sa kontejnerom.
PROIZVODNJA I PREýIŠûAVANJE
Takođe su obezbeđene metode za proizvodnju molekula antitela prema pronalasku ili otkriću, takve metode obično sadrže korake:
- kultivisanje ćelija domaćina koje sadrže ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira molekul antitela pod uslovima koji omogućavaju stvaranje antitela i,
- izdvajanje molekula antitela koji je eksprimiran uz pomoć ćelija domaćina iz kulture; i
- opciono dalje prečišćavanje i/ili modifikovanje i/ili formulisanje molekula antitela.
Nukleinska kiselina pogodna za ovu svrhu može na pr. biti molekul DNK koji sadrži kodirajuće sekvence, kao i regulatorne sekvence i opciono prirodne ili veštačke introne, ili može biti molekul cDNK. Može imati originalne kodone ili optimizovanu upotrebu kodona koja je posebno prilagođena za ekspresiju u predviđenoj ćeliji domaćinu ili organizmu domaćina. Poželjno je da je nukleinska kiselina iz pronalaska u suštinski
4
izolovanom obliku, kako je gore definisano.
Nukleinska kiselina će obično biti ugrađena u ekspresioni vektor, tj. vektor koji može da obezbedi ekspresiju polipeptida kada se transfektuje u odgovarajuću ćeliju domaćina ili drugi ekspresioni sistem.
Za proizvodnju antitela, stručnjak može da bira između velikog broja ekspresionih sistema dobro poznatih u tehnici, na pr. one koje su dati u pregledu Kipriyanow and Le Gall, 2004.
Ekspresioni vektori uključuju plazmide, retroviruse, kosmide, epizome izvedene iz EBV i slično. Ekspresioni vektori i sekvence kontrole ekspresije su odabrani da budu kompatibilni sa ćelijom domaćina. Gen lakog lanca antitela i gen teškog lanca antitela mogu se umetnuti u odvojene vektore. U određenim realizacijama, obe sekvence DNK umetnute su u isti ekspresioni vektor.
Prikladni vektori su oni koji kodiraju funkcionalno potpunu sekvencu imunoglobulina CH (konstantni teški) ili CL (konstantni laki), sa odgovarajućim restrikcionim mestima projektovanim tako da bilo koja VH (varijabilna teška) ili VL (varijabilna laka) sekvenca može lako da se ubaci i eksprimira, kao što je gore opisano. Za teški lanac antitela to može biti, bez ograničenja, bilo koji IgG izotip (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) ili drugi imunoglobulini, uključujući alelne varijante.
Rekombinantni ekspresioni vektor takođe može kodirati signalni peptid koji olakšava izlučivanje lanca antitela iz ćelije domaćina. DNK koja kodira lanac antitela može se klonirati u vektor tako da je signalni peptid povezan unutar okvira za amino terminus zrelog DNK lanca antitela. Signalni peptid može biti imunoglobulinski signalni peptid ili heterologni peptid iz neimunoglobulinskog proteina. Alternativno, sekvenca DNK koja kodira lanac antitela već može sadržati signalnu peptidnu sekvencu.
Pored DNK sekvenci lanca antitela, rekombinantni ekspresioni vektori tipično nose regulatorne sekvence, opciono heterologne regulatorne sekvence, uključujući promotore, pojačivače, signale terminacije i poliadenilacije i druge elemente kontrole ekspresije koji kontrolišu ekspresiju lanaca antitela u ćeliji domaćina. Primeri za promotorske sekvence (primeri za ekspresiju u ćelijama sisara) su promoteri i/ili pojačivači izvedeni iz CMV (kao što je promoter/pojačivač CMV Simian Virus 40 (SV40)), adenovirus (na pr. glavni kasni promotor adenovirusa (AdMLP) ), polioma i jakih promotera sisara kao što su nativni
4
imunoglobulin i promoteri aktina. Primeri za poliadenilacione signale su BGH poliA, SV40 kasni ili rani poliA; alternativno se mogu koristiti 3 ́UTR gena imunoglobulina itd.
Vektori rekombinantne ekspresije mogu takođe da nose sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćelijama domaćina (na pr. poreklo replikacije) i selektivne marker gene. Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju teški lanac ili njegov deo koji se vezuje za antigen i/ili laki lanac ili njegov deo koji se vezuje za antigen antitela prema pronalasku, i vektori koji sadrže ove molekule DNK mogu se uvesti u ćelije domaćina, na pr. bakterijske ćelije ili u više eukariotske ćelije, na pr. ćelije sisara, prema metodama transfekcije dobro poznatim u tehnici, uključujući transfekciju posredovanu lipozomima, transfekciju posredovanu polikacijom, fuziju protoplasta, mikroinjektiranje, taloženje kalcijum-fosfatom, elektroporaciju ili prenos virusnim vektorima.
Poželjno je da su molekuli DNK koji kodiraju teški lanac i laki lanac prisutni na dva ekspresiona vektora koji su ko-transfektovani u ćeliju domaćina, poželjno ćeliju sisara.
ûelijske linije sisara dostupne kao domaćini za ekspresiju dobro su poznate u tehnici i uključuju, između ostalog, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), ćelije NS0, SP2/0, HeLa ćelije, ćelije bubrega beba hrčka (BHK), ćelije bubrega majmuna ( COS), ćelije humanog karcinoma (na pr. ćelije Hep G2 i A-549), 3T3 ćelije ili derivate/potomke bilo koje takve ćelijske linije. Ostale ćelije sisara, uključujući, ali ne ograničavajući se na, ćelijske linije čoveka, miševa, pacova, majmuna i glodara, ili druge eukariotske ćelije, uključujući, ali ne ograničavajući se na ćelije kvasca, insekata i biljaka, ili prokariotske ćelije poput bakterija, mogu se koristiti.
Molekuli antitela se proizvode kultivisanjem ćelija domaćina tokom vremenskog perioda koji je dovoljan da omogući ekspresiju molekula antitela u ćelijama domaćina. Poželjno je da se molekuli antitela dobiju iz medijuma za kultivaciju kao sekretirani polipeptid ili se mogu izdvojiti iz lizata ćelija domaćina ako se, na primer, ekspresuju bez sekretornog signala. Neophodno je da se prečiste molekuli antitela koristeći standardne metode prečišćavanja proteina koje se koriste za rekombinantne proteine i proteine ćelija domaćina na način da se dobijaju u osnovi homogeni preparati antitela. Kao primer, najsavremenije metode prečišćavanja korisne za dobijanje molekula antitela prema pronalasku uključuju, kao prvi korak, uklanjanje ćelija i/ili čestica ćelijskih ostataka iz medijuma za kultivaciju ili iz lizata. Zatim se antitelo prečišćava od kontaminanta rastvorljivih proteina, polipeptida i nukleinskih kiselina, na primer, frakcionisanjem na imunoafinitetnim ili jonoizmenjivačkim kolonama, taloženjem etanolom, HPLC reverzne
4
faze, hromatografijom Sephadek, hromatografijom na silicijum dioksidu ili na kationskoj izmenjivačkoj smoli. Kao završni korak u procesu dobijanja preparata molekula antitela, prečišćeni molekul antitela može se osušiti, na pr. biti liofilizovan, kako je dole opisano za terapijske primene.
PRIMERI
Primer 1: Generisanje mišjih antitela koja se vezuju za PD1 i koji blokiraju vezivanje PDL-1 za PD1.
Ekstracelularni domen (ECD) humanog proteina PD1 (aminokiseline 21-170 iz GenBank pristupnog broja AAO63583.1) sintetizovan je i pripremljen kao imunogen. Miševi su zatim imunizovani, a zatim ojačani humanim PD1 ECD proteinom prateći standardne laboratorijske tehnike imunizacije.
Zatim je prikupljena plazma od imunizovanih miševa i pregledana kako bi se identifikovale individue sa dovoljnim titrom anti-PD1 imunoglobulina. Sledeći standardne laboratorijske metode, limfociti od odabranih miševa su sakupljeni i sjedinjeni sa ćelijama mijeloma miševa da bi se stvorili hibridomi. Ovi hibridomi su naknadno pregledani kako bi se identifikovale hibridomske linije koje su proizvele molekule antitela koja su pokazivala vezivanje u niskom nM opsegu afiniteta za humani PD1 (ECD), a takođe su blokirali vezivanje humanog PD-L1 za PD1, koristeći ovde opisane testove.
Odabrano je nekoliko hibridoma koji su proizveli antitela koja su se vezala za humani PD1 i blokirala vezivanje za humani PD-L1, varijabilni domeni antitela su izolovani i klonirani pomoću standardnih PCR setova prajmera.
Iz ove studije identifikovana je mišja hibridomska linija, nazvana 77E11, koja je proizvela monoklonska antitela koja su pokazala vezivanje za humani PD1 (ECD) u niskom nM opsegu afiniteta i takođe su blokirala vezivanje PD-L1 za PD1.
Sekvenca aminokiselina varijabilnog domena monoklonskih antitela proizvedenih od 77E11 prikazana je na Slici 1
Primer 2: Generisanje humanizovanih anti-PD1 antitela
V-geni mišje hibridomske ćelijske linije 77E11 identifikovani su nakon PCR i protokola sekvenciranja dobro poznatih u tehnici. V-geni su zatim sjedinjeni sa najbližim genima humanih zametnih linija, koristeći standardne tehnike molekularne biologije. U slučaju 77E11, ovo je rezultiralo himernim molekulima mišjeg/humanog antitela koji imaju mišje Vk i Vh aminokiselinske ostatke fuzionisane sa humanim Ck i Ch1 aminokiselinskim ostacima.
Jednom pripremljeno, himerno mišje/humano antitelo je podvrgnuto protokolima „humanizacije“. Ovde su pripremljene mutirane aminokiselinske biblioteke himernih 77E11 Fab klonova. Takođe su pripremljeni dodatni položaji u biblioteci kako bi se uklonile podložnost u sekvencama (tj. aminokiselinski ostaci za koje je poznato da su imunogeni ili da bi stvorili potencijalne proizvodne probleme). Ove mutirane biblioteke obično imaju 5 do 10 binarnih (mišijih u odnosu na humane) položaja po V-regionu. Nekoliko manjih biblioteka može se izgraditi za adresiranje specifičnih podložnosti u složenijim V-regionima. Takve biblioteke su pripremljene korišćenjem standardnih postupaka u struci, a stručna osoba ih može lako koristiti.
Po završetku ove faze, pripremljeni su brojni različiti „humanizovani“ Fabs izvedeni iz originalne mišje 77E11 Fab sekvence. Ovi humanizovani Fabs su testirani na njihovu sposobnost da vežu humani PD1 i blokiraju interakciju PD-L1 sa PD1. Naknadno su izabrani genetski inženjerski proizvedeni Fabs koji imaju jednak ili bolji rezultat od odgovarajućeg himernog Fab-a. Njihova aminokiselinska sekvenca je analizirana na procenat humane sekvence, verovatnu imunogenost i uklonjene su podložne sekvence.
Nakon odabira najpovoljnijih humanizovanih Fabs, oni su zatim stavljeni u humani IgG4 (Pro) ili IgG1KO imunoglobulinski format. IgG4 (Pro) se razlikuje od kanonske sekvence humanog IgG4 po tome što je serin 241 izmenjen u prolin, a ova promena je pokazana kako bi se minimalizovala dinamička Fab razmena grana između molekula IgG4.
IgG1KO se razlikuje od kanonske sekvence humanog IgG1 po dve aminokiselinske zamene (L234A, L235A) za koje je poznato da minimiziraju efektorsku funkciju molekula antitela.
Po završetku ove studije, pripremljeno je 5 različitih humanizovanih verzija originalnog himernog mišjeg/humanog 77E11 Fab. Oni se nazivaju: PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 i PD1-5.
1
Aminokiselinske sekvence CDR-ova za PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 i PD1-5, VH i VL sekvenci i pune HC i LC sekvence predstavljene su u tabeli na kraju ove aplikacije. Da bi se izbegla sumnja, korelacija između antitela i njihovih SEK, ID broj takođe je predstavljen u donjoj tabeli:
TABELA 1: SEK ID BR za anti-PD1 antitela prema pronalasku
Primer 3: Vezivanje antitela na humani PD1 i blokiranje interakcije PD1 liganda
Utvrđeno je vezivanje reprezentativnih humanizovanih anti-PD1 antitela izvedenih iz mišjeg 77E11 hibridoma (kako je opisano u Primeru 2) za humani PD1.
Afiniteti vezivanja za rekombinantni monomerni humani PD1 mereni su pomoću SPR koristeći ProteOn XPR36 instrument. PD1-1, PD1-2 i PD1-3 antitela su zarobljena na proteinskim A/G površinama koje su aminski spojene sa površinom. Humani PD1 ECD je injektiran preko zarobljenih antitela tokom 600 sekundi pri protoku od 30 Pl/min i disocijaciji tokom 1200 sekundi. Koncentracije humanog PD1 ECD su bile 0 nM, 6,25 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM i 100 nM. Pozadina je oduzeta od neobrađenih podataka, a senzorski dijagrami su zatim globalno fitovani 1:1 Langmuirovom vezivanju kako bi se obezbedile vrednosti afiniteta (KD).
Korišćenjem tog protokola utvrđeno je da se antitela PD1-1, PD1-2 i PD1-3 vezuju za humani PD1 kako je prikazano u donjoj tabeli.
2
TABELA 2: Vezivanje za rekombinantni humani PD1 (KD, nM)
PD1 antitela prema pronalasku su zatim testirana na sposobnost blokiranja vezivanja humanog PD-L1/2 za humani PD1 eksprimiran na površinskim CHO ćelijama. CHO ćelije koji eksprimiraju PD1 inkubirane su sa fiksnom koncentracijom rekombinantnog biotina označenog sa PD-L1 ili PD-L2 u prisustvu anti-PD1 antitela prema pronalasku (PD1- do PD1-5). Smeša je inkubirana 1 sat na 37 stepeni Celzijusa. ûelijski vezan PD-L1/L2 detektovan je pomoću evropijumom obeleženog streptavidina i fluorescencija je izmerena uz pomoć Perkin Elmer Victor X4 čitača ploče. Podaci su prikazani kao procenat inhibicije. Inhibicija od 0% definisana je kao vrednost fluorescencije ćelija inkubiranih sa ligandom bez antitela, a 100% inhibicija definisana je kao signal dobijen samo sa ćelijama bez obeleženih liganda i antitela. Procenat vrednosti inhibicije izračunat je u programu Excel, a fitovanje krive je izvršeno sa GraphPad Prism. Tačke podataka na krivoj su srednje vrednosti trostrukih merenja.
Krive inhibicije i koncentracije mAb potrebne za postizanje 90% inhibicije (IC90) blokade liganda prikazane su na Slici 2 i u Tabeli 3.
TABELA 3: Aktivnosti blokiranja liganda iz PD1 mAbs
Iz ove analize je jasno da humanizovana PD1 antitela prema pronalasku pokazuju moćna svojstva vezivanja za PD1, a takođe efikasno inhibiraju interakciju PD-1 sa PD-L1 i PD-L2.
Primer 4: Stimulacija antigen-specifičnog odgovora T ćelija uz pomoć anti-PD1 antitela
Humanizovana anti-PD1 antitela pripremljena prema gore opisanim metodama su naknadno testirana na njihovu sposobnost da stimulišu proizvodnju citokina u tetanus specifičnim CD4 memorijskim T ćelijama.
Za ovaj test, T ćelije iz PBMC-a izvedene od zdravih davalaca proširene su u prisustvu tetanusnog toksoida i ko-kultivisane sa autolognim zrelim dendritičnim ćelijama (DC) napunjenim tetanusnim toksoidom tokom 2 dana. Korak ko-kultivisanja ponovljen je drugi put na sličan način u prisustvu reprezentativnih anti-PD1 antitela prema pronalasku. Na kraju drugog koraka ko-kultivisanja, supernatanti su analizirani na IFN-gama uz pomoć ELISA i rezultati su prikazani na Slici 3.
Sva PD1 antitela prema pronalasku pokazuju jasno vrlo moćnu aktivaciju T ćelija zavisnu od doze, mereno oslobađanjem IFN-gama. Kada se PD1 antitela prema pronalasku kombinuju sa anti-LAG3 antitelima, može se uočiti superiorna aktivnost u poređenju sa referentnim anti-PD1 kombinacijama antitela iz prethodnog stanja tehnike (videti Primer 12 i Slika 8).
Primer 5: Mapiranje epitopa humanizovanih anti-PD1 monoklonskih antitela.
Epitop reprezentativnog anti-PD1 antitela iz pronalaska i referentni molekul antitela iz stanja tehnike koji imaju istu aminokiselinsku sekvencu kao nivolumab analizirani su eksperimentima razmene vodonik-deuterijum (HDX), koji otkrivaju razlike u epitopima na pojedinačnom nivou aminokiselina u epitopima antitela.
HDX analiza je pokazala da se anti-PD1 antitelo iz pronalaska i referentni molekul antitela iz stanja tehnike vezuju za slične i preklapajuće regione humanog PD1. Međutim, epitopi nisu identični, sa reprezentativnim PD1 antitelom iz pronalaska koje se vezuje za dodatni element sekvence kao što je detaljno opisano u Tabeli 4.
Tabela 4: Mapiranje epitopa molekula anti-PD1 antitela uz pomoć razmene vodonikdeuterijum masene spektrometrije
4
* PD1 korišćen za numerisanje: GenBank AAO63583.1
** Aminokiseline uključene u vezivanje prikazane su podebljanim slovima, razlike su podvučene
Primer 6: In vivo efikasnost molekula anti-PD1 antitela iz pronalaska u hPD-1 knock u mišjem modelu
Svrha studije bila je da se izmeri efikasnost molekula anti-PD1 antitela prema pronalasku koristeći potpuno imuno kompetentnog miša koji prikuplja genetsku modifikaciju koja zamenjuje ekstracelularni domen mišjeg PD1 sa odgovarajućim regionom humanog PD1. Mišiji C57BL/6NTac-PDCD1<tm(PDCD1)Arte>koji se koristi za ovaj eksperiment obezbeđen je uz pomoć ISIS INNOVATION LIMITED, Oxford, England i od sada se naziva „hPD1 knock u mišu“.
MC-38 ćelije su subkutano ubrizgane u bok hPD1 knock u mišu i tretman je započet 6. dana nakon injektiranja ćelija. Miševi su primili PBS, izotipsku kontrolu ili molekul anti-PD1 antitela iz pronalaska u dozi od 10 mg/kg dva puta nedeljno (q3or4d) ili su PD1-3 dati samo jednom.
Slika 4 prikazuje zapreminu tumora tokom vremena za pojedinačne miševe sa hPD1 knock-u mišu implantiranim MC38 i Tabela 5 rezimira inhibiciju rasta tumora (TGI) 23. dana nakon injektiranja ćelija i kompletne odgovore uočene na kraju studije.
Kompletni odgovor (CR) definiše se kada (i) je veličina tumora ista ili manja u poređenju sa prvim merenjima i (ii) vizuelnim pregledom zaostalog materijala nosača (matrigel) ne pokazuje tumorsko tkivo. Može se pokazati da je režim pojedinačnog doziranja PD1-3 pokazivao snažne i antitumorske efekte (TGI = 90%; sa 2 miša koji pokazuju CR) ekvivalentno u poređenju sa režimom doziranja dva puta nedeljno. Ova studija pokazuje da je čak i jedna doza molekula anti-PD1 antitela prema pronalasku dovoljna za postizanje efikasnosti, što bi moglo biti posledica dužeg poluživota.
Tabela 5: TGI za PD1
Primer 7: Pretklinička farmakokinetika molekula anti-PD1 antitela prema pronalasku.
Farmakokinetička (PK) svojstva molekula anti-PD1 antitela prema pronalasku određena su u jednoj dozi i.v. PK studija na majmunima Cinomolgus.
Molekul anti-PD1 antitela prema pronalasku primenjen u dozi od 1 mg/kg i.v. prikazuje srednji klirens iz plazme (CL) od 0,28 ml/h/kg. Srednja zapremina raspodele (Vss) za PD1-3 bila je 58 ml/kg. Srednji terminalni poluživot za PD1-3 bio je 11 d.
AUC i cmaksza PD1-3 pri 1 mg/kg kod majmuna Cinomolgus gotovo su identični odgovarajućim parametrima za IgG4Pro PD-1 antitela nivolumab (BMS-936558, objavljeno u Wang, C. et al., Cancer Immunol. Res.2:846-856, 2014) i pembrolizumab (MK-3475, objavljenog u FDA BLA document 125514Orig1s000 Pharmacology Review, 2014) u uporedivom opsegu doza.
Iznenađujuće i neočekivano, terminalni poluživot zabeležen za PD1-3 bio je 1,5-2 puta veći nego za nivolumab kao što je prikazano na slici 5. To sugeriše da anti-PD1 antitela iz pronalaska imaju serumski poluživot od 11 dana. Ovo je u suprotnosti sa poznatim referentnim molekulima anti-PD1 antitela koji obično imaju poluživot od 4 do 6 dana u rasponu doza 0,3-3 mg/kg. Ova iznenađujuća karakteristika molekula antitela prema pronalasku može omogućiti pacijentu da se leči molekulima antitela prema pronalasku sa manjom frekvencijom od onih u stanju tehnike, što može dovesti do smanjenja količine antitela koje treba dostaviti, bilo u obliku smanjene učestalosti primene ili u smanjenoj količini antitela koja će se koristiti. S obzirom na to da molekul anti-PD1 antitela mogu da izazovu neželjene sporedne efekte kod pacijenata, kao što je gore diskutovano, tada anti-PD1 antitela iz pronalaska mogu imati značajnu i iznenađujuću kliničku prednost u odnosu na stanje tehnike.
Primer 8: Identifikacija mišjih antitela koja se vezuju za LAG3
Ekstracelularni domen (ECD) humanog proteina LAG3 (aminokiseline 23-450 GenBank pristupnog broja NP_002277) sintetizovan je i pripremljen kao imunogen. Miševi su zatim imunizovani, a zatim pojačani sa humanim LAG3 ECD proteinom prateći standardne laboratorijske tehnike imunizacije.
Zatim je uzeta plazma od imunizovanih miševa i pregledana kako bi se identifikovale individue sa dovoljnim titrom anti-LAG3 imunoglobulina. Sledeći standardne laboratorijske metode, limfociti od izabranih miševa su sakupljeni i sjedinjeni sa mišjim ćelijama mijeloma da bi se stvorili hibridomi.
Odabrano je nekoliko hibridoma koji su proizveli antitela koja su se specifično vezala za humani LAG3, varijabilni domeni antitela su izolovani i klonirani pomoću standardnih PCR setova prajmera.
Iz ove studije identifikovana je mišja hibridomska linija, nazvana 496G6, koja je proizvela monoklonska antitela koja pokazuju niske nM afinitete vezivanja za humani LAG3 (ECD) i izabrana za dalja ispitivanja.
Aminokiselinska sekvenca varijabilnog domena monoklonskih antitela proizvedenih uz pomoć 496G6 prikazana je na Slici 6.
Primer 9: Generisanje humanizovanih anti-LAG3 antitela
U ovom primeru su obezbeđeni postupci i rezultati za razvoj humanizovanih derivata monoklonskih antitela proizvedenih od mišje hibridomske linije 496G6, opisanih u Primeru 8.
V-geni mišje hibridomske ćelijske linije 496G6 identifikovani su nakon PCR i protokola sekvenciranja dobro poznatih u tehnici. V-geni su zatim sjedinjeni sa najbližim genima humanih zametnih linija, koristeći standardne tehnike molekularne biologije. U slučaju 496G6, ovo je rezultiralo himernim molekulima mišjeg/humanog antitela koji imaju mišje Vk i Vh aminokiselinske ostatke fuzionisane sa humanim Ck i Ch1 aminokiselinskim ostacima.
Jednom pripremljeno, himerno mišje/humano antitelo je podvrgnuto protokolima „humanizacije“. Ovim postupkom su pripremljene mutirane aminokiselinske biblioteke himernih 496G6 Fab klonova. Takođe su pripremljeni dodatni položaji u biblioteci kako bi se uklonile podložnost u sekvencama (tj. aminokiselinski ostaci za koje je poznato da su imunogeni ili da bi stvorili potencijalne proizvodne probleme). Ove mutirane biblioteke obično imaju 5 do 10 binarnih (mišijih u odnosu na humane) položaja po V-regionu. Nekoliko manjih biblioteka može se izgraditi za adresiranje specifičnih podložnosti u složenijim V-regionima. Takve biblioteke su pripremljene korišćenjem standardnih postupaka u struci, a stručna osoba ih može lako koristiti.
Po završetku ove faze, pripremljeni su brojni različiti „humanizovani“ Fabs izvedeni iz originalne mišje 496G6 Fab sekvence. Ovi humanizovani Fabs su testirani na njihovu sposobnost da vežu humani LAG3 i blokiraju interakciju MHCII sa LAG3. Naknadno su izabrani genetski inženjerski proizvedeni Fabs koji imaju jednak ili bolji rezultat od odgovarajućeg himernog Fab-a. Njihova aminokiselinska sekvenca je analizirana na procenat humane sekvence, verovatnu imunogenost i uklonjene su podložne sekvence.
Nakon odabira najpovoljnijih humanizovanih Fabs, oni su zatim stavljeni u humani IgG4 (Pro) imunoglobulinski format. IgG4 (Pro) se razlikuje od kanonske sekvence humanog IgG4 po tome što je serin 241 izmenjen u prolin, a ova promena je pokazana kako bi se minimalizovala dinamička Fab razmena grana između molekula IgG4.
Po završetku ove studije, pripremljeno je 5 različitih humanizovanih verzija originalnog himernog mišjeg/humanog 496G6 Fab. Oni se nazivaju: LAG3-1, LAG3-2, LAG3-3, LAG3-4 i LAG3-5.
Aminokiselinske sekvence CDR-ova za LAG3-1, LAG3-2, LAG3-3, LAG3-4, LAG3-5, VH i VL sekvenci i pune HC i LC sekvence predstavljene su u tabeli na kraju ove aplikacije. Da bi se izbegla sumnja, korelacija između antitela i njihovih SEK, ID broj takođe je predstavljen u donjoj tabeli:
TABELA 6: SEK ID BR za anti-LAG3 antitela iz pronalaska
Primer 10: Vezivanje antitela na humani LAG3 i blokiranje interakcije LAG3 liganda
Afiniteti vezivanja za rekombinantni monomerni humani LAG3 izmereni su korišćenjem SPR.
LAG3-1, LAG3-2, LAG3-3, LAG3-4 i LAG3-5 antitela su zarobljena na proteinskim A/G površinama. Humani LAG3 ECD-Fc je injektiran preko zarobljenih antitela tokom 300 sekundi pri protoku od 30 Pl/min i disocijaciji tokom 1800 sekundi. Koncentracije humanog LAG3 ECD su bile 0 nM, 0.625 nM, 1.25 nM, 2.5 nM, i 5 nM. Pozadina je oduzeta od neobrađenih podataka, a senzorski dijagrami su zatim globalno fitovani do 1:1 Langmuirovom vezivanju kako bi se obezbedile vrednosti afiniteta (KD).
Korišćenjem tog protokola utvrđeno je da se antitela LAG3-1, LAG3-2, LAG3-3, LAG3-4 i LAG-3-5 vezuju za humani LAG-3 sa visokim afinitetom, kako je prikazano u donjoj tabeli.
TABELA 7: Vezivanje za rekombinantni humani LAG3 (KD, nM)
LAG3 antitela prema pronalasku su zatim testirana na sposobnost blokiranja vezivanja rekombinantnog humanog LAG3 proteina za Raji ćelije koje eksprimiraju njegov ligand MHC II korišćenjem FACS. Recombinant human LAG3 extracellular domain fused to human Rekombinantni humani LAG3 ekstracelularni domen koji je spojen sa humanim Fc (hLAG3-hIgFc) je inkubiran sa LAG3 antitelima LAG3-1, LAG3-2, LAG3-3, LAG3-4 i LAG3-5 tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi (RT) pre dodavanja Raji ćelijama, nakon čega sledi dalja inkubacija tokom 30 minuta na 4°C. ûelije su isprane 3 puta. Vezivanje HLAG3-mIgFc za Raji ćelije otkriveno je korišćenjem PE obeleženog anti-humanog IgG. Analiza vezivanja HLAG3-mIgFc izvedena je pomoću FACS Canto I (BD Bioscience). Rezultati su sumirani na slici 7 i pokazuju da su sva LAG3 antitela iz pronalaska testirana selektivno i efikasno inhibiraju vezivanje LAG3 za MHC II.
PRIMER 11: Mapiranje epitopa humanizovanih anti- LAG3 monoklonskih antitela
Epitop reprezentativnog anti- LAG3 antitela iz pronalaska i referentni molekul antitela iz stanja tehnike koji ima istu aminokiselinsku sekvencu kao BMS-986016 (referentni molekul anti-LAG3 antitela iz stanja tehnike) analizirani su korišćenjem tehnike “kompetitivnog vezivanja”. Rezultati nisu pokazali konkurenciju za vezivanje za LAG3, što pokazuje da se anti-LAG3 antitelo iz pronalaska vezuje za drugačiji epitop od referentnog molekula anti-LAG3 antitela iz stanja tehnike.
Epitop reprezentativnog anti-LAG3 antitela iz pronalaska je dalje oplemenjen eksperimentima razmene vodonik-deuterijum (HDX), koji otkrivaju razlike u epitopima na pojedinačnom nivou aminokiselina u epitopima antitela.
HDX analiza je pokazala da se reprezentativno anti-LAG3 antitelo prema pronalasku vezuje za dva različita regiona humanog LAG3 kao što je detaljno opisano u Tabeli 8.
Tabela 8: Mapiranje epitopa anti-LAG3 mAbs uz pomoć razmene vodonik-deuterijum masene spektrometrije
*LAG-3 korišćen za numerisanje: GenBank NP_002277
PRIMER 12: Stimulacija antigen-specifičnog odgovora T ćelija uz pomoć anti-PD1 i anti-LAG3 antitela.
Pojedinačna anti-PD1 i anti-LAG3 antitela prema pronalasku, kao i kombinacije ovih antitela, testirani su na njihovu sposobnost da stimulišu proizvodnju citokina kod Tetanus specifičnih CD4 memorijskih T ćelija pomoću ELISA i upoređeni su sa anti-PD1 i anti-LAG3 antitelima iz stanja tehnike.
Za ovaj test, T ćelije iz PBMC-a izvedene od zdravih davalaca proširene su u prisustvu tetanusnog toksoida i ko-kultivisane sa autolognim zrelim dendritičnim ćelijama (DC) napunjenim tetanusnim toksoidom tokom 2 dana. Korak ko-kultivisanja ponovljen je drugi put na sličan način u prisustvu molekula anti-PD1, anti-LAG3 I kombinacije anti-PD1 i anti-LAG3 antitela korišćenjem fiksne količine anti-PD1 mAb (200nM) sa rastućom količinom anti-LAG3 antitela. Na kraju drugog koraka ko-kultivisanja supernatanti su analizirani na sekreciju IFN-gama.
Koristeći ovaj test, kombinacija anti-PD1 i anti-LAG3 antitela prema pronalasku je upoređena sa nivolumabom (Opdivo (R)) (PD1 mAb) plus antitelo koje ima istu aminokiselinsku sekvencu kao BMS-986016 (LAG3 mAb) u 4 različita donora. Povećane količine anti-LAG3 antitela su korišćene u kombinaciji sa fiksnom dozom anti-PD1 mAb. Prikazani podaci su normalizovani na anti-PD1 antitelo korišćenjem u koncentraciji zasićenja naznačenoj kao 100%, a rezultati su prikazani na slici 8.
Ovi podaci pokazuju da kombinacija anti-PD1 i anti-LAG3 antitela prema pronalasku dovodi do 1,5 - 2 puta povećanja proizvodnje IFN-gama u poređenju sa samo anti-PD1 mAb. Iznenađujuće je kombinacija anti-PD1 i anti-LAG3 antitela prema pronalasku superiornija od one iz stanja tehnike za anti-PD1 i anti-LAG3 antitela.
Dalje, podaci pokazuju da je kod 3 od 4 donora anti-PD1-3 (predstavnik PD1 antitela prema pronalasku) superiorniji od nivolumaba (Opdivo (R)) što se vidi kod viših nivoa sekrecije IFN-gama pri vrlo niskim nivoima anti-LAG3 mAB (Slika 8).
Kao što se može proceniti, ova superiornost kombinacije molekula anti-LAG3 antitela iz ovog pronalaska sa molekulom anti-PD1 antitela iz ovog pronalaska sugeriše da bi oni mogli da se koriste za lečenje karcinoma na nižem nivou doziranja od terapeutskih antitela iz stanja tehnike, što može omogućiti terapijsku primenu sa manje neželjenih sporednih efekata.
1
S obzirom na to da molekuli anti-PD1 i anti-LAG3 antitela mogu da indukuju neželjene sporedne efekte kod pacijenata, kao što je prethodno diskutovano, tada bi anti-PD1 antitela i anti-LAG3 antitela iz ovog pronalaska mogla da imaju značajnu i iznenađujuću kliničku prednost u odnosu na stanje tehnike korišćenjem niže doze i/ili manje frekventne režime primene.
PRIMER 13: kombinovane terapije anti-PD1 i anti-LAG3 antitela u modelima singenih tumora
Da bi se testiralo da li kombinovani tretman anti-PD1 i anti-LAG3 antitela prema pronalasku rezultira superiornom efikasnošću in vivo, nekoliko pretkliničkih tumorskih modela na miševima je tretirano sa anti-PD1 I anti-LAG3 mAbs. Sve tumorske ćelijske linije miša (MC38, Colon-26 colon-, B16F10 melanom, LL/2 (LLC1) Lewis Lung- i 4T1 rak dojke) injektirane su potkožno bilo u C57BL/6 ili BALB/c, u zavisnosti od porekla tumorskih ćelijskih linija miša. Trećeg dana nakon ubrizgavanja ćelija, miševi su tretirani intraperitonealno (ip) što je praćeno doziranjem dva puta nedeljno. Sva antitela su dozirana sa 10 mg/kg, a kombinacija anti-LAG3 i anti-PD1 antitela prema pronalasku je dozirana sa po 10 mg/kg. Sva antitela korišćena u ovoj studiji su dobijena od BioXCell, West Lebanon, NH, USA. Kontrolna grupa je tretirana antitelom IgG2a pacova (klon 2A3), korišćeno anti-PD1 antitelo ima pacovski IgG2a Fc deo (klon RMP1-14), a anti-LAG3 korišćen u studiji je bio na delu IgG1 pacova (klon C9B7V). Veličina tumora izmerena je najmanje tri puta nedeljno u dve dimenzije (dužina x širina) i izračunate su zapremine tumora. Životinje su eutanazirane kada je zapremina tumora dostigla 1500 mm<3>ili ako su tumori bili ulcerisani.
Rezultati za TGI i CR sumirani u Tabeli 9 i na Slici 9 pokazuju zapreminu tumora tokom vremena za pojedine miševe. U zaključku, studija pokazuje da tretman samo sa nekim anti-PD1 pokazuje efikasnost u MC 38, ali ne i u ostalim testiranim modelima. Međutim, sa izuzetkom modela LL/2, kombinovani tretman anti-PD1 i anti-LAG3 antitela prema pronalasku značajno je poboljšao efikasnost anti-PD1 monoterapije i kod nekoliko miševa nije bilo tumora na kraju studije u MC-38, Colon-26 i 4T1 modelima. Posebno treba napomenuti da u modelu 4T1 rezistentnom na PD1 kombinacija pokazuje superiorni efekat na rast tumora i da je 3 od 5 miševa bilo potpuno bez tumora.
2
Tabela 9: Rezime inhibicije rasta tumora u svim testiranim singenim modelima
Primer 14: Farmaceutska formulacija za s.c. primenu
Bilo koji od gore navedenih molekula antitela prema pronalasku može se odabrati za proizvodnju farmaceutske formulacije za subkutanu primenu koja ima sastav kako sledi:
Lekovita supstanca: 100 mg/ml (1 do 3 nmol/ml)
Acetatni pufer: 25 mM
Trehaloza: 220 mM
Tween-20: 0.02 %
Lekovita supstanca je formulisana u rastvoru gore navedenog sastava, sterilisana i čuvana na 2 do 8 °C.
Primer 15: Farmaceutska formulacija za i.v. primenu
Bilo koji od gore navedenih molekula antitela prema pronalasku može se odabrati za proizvodnju farmaceutske formulacije za i.v. primenu. Primer osnovne farmaceutske formulacije za antitela prema pronalasku je kako sledi.
Bočica od 20 ml sadrži 20 mg/ml anti-PD1 antitela prema pronalasku, u puferu koji se sastoji od 21,5 mM natrijum acetata, 3,5 mM sirćetne kiseline, 240 mM trehaloze, 0,67 mM L-metionina, 0,04% m/v polisorbata 20, i voda za injekcije (WFI).
Bočica od 20 ml sadrži 20 mg/ml anti-LAG3 antitela prema pronalasku u puferu koji se sastoji od 25 mM acetata, 240 mM trehaloze, 0,67 mM metionina, 0,04% (m/v) polisorbata 20, pH 5,5 i voda za injekciju (WFI).
Primer 16: Farmaceutska upotreba kod ljudi
Rastvori navedeni u Primeru 15 gore primenjuju se kod pacijenta kome je to potrebno, kao što je ljudsko biće koje pati od karcinoma, intravenskom infuzijom (doza od 100 do 200 mg) svake dve do četiri nedelje.
SEKVENCE
4
1
2
4
1
2
4

Claims (15)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Molekul anti-PD1 antitela koji sadrži:
(a) varijabilni domen teškog lanca koji ima tri CDR-a koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 1 (hcCDR1), SEK ID BR: 2 (hcCDR2) i SEK ID BR: 3 (hcCDR3) i varijabilni domen lakog lanca koji ima tri laka lanca CDR-a koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 4 (lcCDR1), SEK ID BR: 5 (lcCDR2) i SEK ID BR: 6 (lcCDR3); ili, (b) varijabilni domen teškog lanca koji ima tri CDR-a koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 7 (hcCDR1), SEK ID BR: 8 (hcCDR2) i SEK ID BR: 9 (hcCDR3) i varijabilni domen lakog lanca koji ima tri laka lanca CDR-a koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR:10 (lcCDR1), SEK ID BR:11 (lcCDR2) and SEK ID BR:12 (lcCDR3); ili,
(c) varijabilni domen teškog lanca koji ima tri CDR-a koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 13 (hcCDR1), SEK ID BR: 14 (hcCDR2) i SEK ID BR: 15 (hcCDR3) i varijabilni domen lakog lanca koji ima tri laka lanca CDR-a koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 16 (lcCDR1), SEK ID BR: 17 (lcCDR2) i SEK ID BR: 18 (lcCDR3).
2. Molekul anti-PD1 antitela prema zahtevu 1, u kome navedeni molekul antitela ima varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 19 i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 20, ili varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 21 i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 22, ili varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 23 i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 24, ili varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 25 i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 26, ili varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 27 i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 28.
3. Molekul anti-PD1 antitela prema bilo kom od prethodnih zahteva, u kojima pomenuti molekul antitela ima teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 29 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 30 ili teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 31 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 32, ili teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 33 i laki lanac koji sadrži aminokiselinu sekvenca SEK ID BR: 34, ili teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 35 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 36, ili teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 37 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 38.
4. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira teški lanac molekula antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 3, i laki lanac molekula antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 3.
5. Ekspresioni vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira teški lanac molekula antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 3, i laki lanac molekula antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 3.
6. ûelija domaćin koja ima ekspresioni vektor koji kodira teški lanac molekula antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 3, i ekspresioni vektor koji kodira laki lanac molekula antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 3.
7. Molekul anti-PD1 antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 3 za upotrebu u medicini, poželjno za upotrebu u postupku lečenja karcinoma.
8. Molekul anti-PD1 antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 3, za korišćenje u metodi lečenja karcinoma, pri čemu upotreba dalje uključuje primenu molekula anti-LAG3 antitela.
9. Farmaceutska kompozicija koja sadrži anti-PD1 antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 3 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
10. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 9, koja dalje sadrži molekul anti-LAG3 antitela.
11. Komplet delova koji sadrži anti-PD1 antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 3 i molekul anti-LAG3 antitela.
12. Molekul anti-PD1 antitela za upotrebu prema zahtevu 8, kompozicija prema zahtevu 10 ili komplet prema zahtevu 11, gde se navedeni molekul anti-LAG3 antitela vezuje za epitop humanog LAG3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu LLRRAGVT (SEK ID BR: 111) i/ili YRAAVHLRDRA (SEK ID BR: 112).
13. Molekul anti-PD1 antitela za upotrebu prema zahtevu 12, ili kompozicija ili komplet prema zahtevu 12, gde navedeni molekul anti-LAG3 antitela sadrži:
(a) teški lanac CDR-a koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 39 (hcCDR1), SEK ID BR: 40 (hcCDR2) i SEK ID BR: 41 (hcCDR3) i ima laki lanac CDR-a koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 42 (lcCDR1), SEK ID BR: 43 (lcCDR2) i SEK ID BR: 44 (lcCDR3); ili,
(b) teški lanac CDR-a koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR:45 (hcCDR1), SEK ID BR:46 (hcCDR2) i SEK ID BR:47 (hcCDR3) i ima laki lanac CDR-a koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 48 (lcCDR1), SEK ID BR: 49 (lcCDR2) i SEK ID BR: 50 (lcCDR3).
14. Molekul anti-PD1 antitela za upotrebu u skladu sa bilo kojim od zahteva 8, 12 ili 13, gde molekul anti-PD1 antitela treba da se daje istovremeno, konkurentno, uzastopno, sukcesivno, alternativno ili odvojeno, sa molekulom anti-LAG3 antitela.
15. Farmaceutska kombinacija prema bilo kom od zahteva 10, 12 ili 13, gde molekul anti-PD1 antitela je izabran iz grupe koja se sastoji od molekula anti-PD1 antitela PD1-1, PD1-2, PD1-3, PD1-4 i PD1 -5, a molekul anti-LAG3 antitela je izabran iz grupe koja se sastoji od molekula anti-LAG3 antitela LAG3-1, LAG3-2, LAG3-3, LAG3-4 i LAG3-5.
RS20210218A 2016-05-18 2017-05-17 Anti pd-1 i anti-lag3 antitela za lečenje kancera RS61510B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16170174 2016-05-18
PCT/EP2017/061901 WO2017198741A1 (en) 2016-05-18 2017-05-17 Anti pd-1 and anti-lag3 antibodies for cancer treatment
EP17726862.0A EP3458478B1 (en) 2016-05-18 2017-05-17 Anti pd-1 and anti-lag3 antibodies for cancer treatment

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61510B1 true RS61510B1 (sr) 2021-03-31

Family

ID=56014918

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210218A RS61510B1 (sr) 2016-05-18 2017-05-17 Anti pd-1 i anti-lag3 antitela za lečenje kancera

Country Status (30)

Country Link
US (3) US11028169B2 (sr)
EP (2) EP3848393A1 (sr)
JP (3) JP6585860B2 (sr)
KR (2) KR20220103806A (sr)
CN (2) CN115340608A (sr)
AR (1) AR108516A1 (sr)
AU (1) AU2017266298B2 (sr)
CA (1) CA3020649A1 (sr)
CL (2) CL2018003153A1 (sr)
CO (1) CO2018012374A2 (sr)
CY (1) CY1123977T1 (sr)
DK (1) DK3458478T3 (sr)
EA (1) EA201892616A1 (sr)
ES (1) ES2857813T3 (sr)
HU (1) HUE053452T2 (sr)
IL (1) IL262892B2 (sr)
LT (1) LT3458478T (sr)
MA (2) MA45029B1 (sr)
MX (2) MX393609B (sr)
MY (1) MY193112A (sr)
PE (1) PE20190108A1 (sr)
PH (1) PH12018502429A1 (sr)
PL (1) PL3458478T3 (sr)
RS (1) RS61510B1 (sr)
SA (1) SA518400424B1 (sr)
SG (1) SG11201809627QA (sr)
SI (1) SI3458478T1 (sr)
TW (2) TWI762484B (sr)
UA (1) UA127200C2 (sr)
WO (1) WO2017198741A1 (sr)

Families Citing this family (126)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA117466C2 (uk) 2012-12-13 2018-08-10 Мерк Шарп Енд Доме Корп. СТАБІЛЬНИЙ СКЛАД У ВИГЛЯДІ РОЗЧИНУ АНТИТІЛА ДО IL-23p19
CN114591433A (zh) 2015-07-13 2022-06-07 西托姆克斯治疗公司 抗pd-1抗体、可活化抗pd-1抗体及其使用方法
US12030942B2 (en) 2015-10-02 2024-07-09 Les Laboratoires Servier Anti-PD-1 antibodies and compositions
TWI756187B (zh) 2015-10-09 2022-03-01 美商再生元醫藥公司 抗ｌａｇ３抗體及其用途
SG11201804178YA (en) 2015-11-18 2018-06-28 Merck Sharp & Dohme Pd1 and/or lag3 binders
EP3848393A1 (en) 2016-05-18 2021-07-14 Boehringer Ingelheim International GmbH Antibody molecules for cancer treatment
EP3458485B1 (en) 2016-05-19 2021-12-29 The General Hospital Corporation Tethered interleukin-2 to its receptor il-2rbeta, a platform to enhance natural killer and regulatory t cell activity
TW202436356A (zh) 2016-10-11 2024-09-16 美商艾吉納斯公司 抗ｌａｇ－３抗體及其使用方法
PE20190911A1 (es) 2016-10-13 2019-06-26 Symphogen As Composiciones y anticuerpos anti-lag-3
EP3541841B1 (en) 2016-11-18 2024-09-11 Les Laboratoires Servier Anti-pd-1 antibodies and compositions
EP3360898A1 (en) 2017-02-14 2018-08-15 Boehringer Ingelheim International GmbH Bispecific anti-tnf-related apoptosis-inducing ligand receptor 2 and anti-cadherin 17 binding molecules for the treatment of cancer
AU2018219909B2 (en) 2017-02-10 2025-02-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Radiolabeled anti-LAG3 antibodies for immuno-PET imaging
BR112019021032A2 (pt) * 2017-04-05 2020-05-05 Boehringer Ingelheim International Gmbh terapia combinada anticâncer
CA3185303A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Symphogen A/S Combination therapies targeting pd-a, tim-3, and lag-3
JOP20190260A1 (ar) 2017-05-02 2019-10-31 Merck Sharp & Dohme صيغ ثابتة لأجسام مضادة لمستقبل الموت المبرمج 1 (pd-1) وطرق استخدامها
AU2018263868A1 (en) 2017-05-02 2019-12-12 Merck Sharp & Dohme Llc Formulations of anti-LAG3 antibodies and co-formulations of anti-LAG3 antibodies and anti-PD-1 antibodies
US20210340250A1 (en) 2017-05-30 2021-11-04 Bristol-Myers Squibb Company Compositions comprising a combination of an anti-lag-3 antibody, a pd-1 pathway inhibitor, and an immunotherapeutic agent
KR102713203B1 (ko) 2017-05-30 2024-10-10 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Lag-3 양성 종양의 치료
KR20240155979A (ko) 2017-05-30 2024-10-29 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 항-lag-3 항체 또는 항-lag-3 항체 및 항-pd-1 또는 항-pd-l1 항체를 포함하는 조성물
CA3061053A1 (en) * 2017-06-02 2018-12-06 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-cancer combination therapy
WO2019025545A1 (en) 2017-08-04 2019-02-07 Genmab A/S BINDING AGENTS BINDING TO PD-L1 AND CD137 AND THEIR USE
WO2019120269A1 (zh) * 2017-12-22 2019-06-27 江苏恒瑞医药股份有限公司 Lag-3抗体药物组合物及其用途
CN109970856B (zh) * 2017-12-27 2022-08-23 信达生物制药(苏州)有限公司 抗lag-3抗体及其用途
CN111699200B (zh) 2018-01-15 2023-05-26 南京传奇生物科技有限公司 针对pd-1的单域抗体和其变体
WO2019152574A1 (en) * 2018-02-01 2019-08-08 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods for treating cancer or infection using a combination of an anti-pd-1 antibody, an anti-lag3 antibody, and an anti-tigit antibody
WO2019165195A1 (en) * 2018-02-22 2019-08-29 Srivastava Satish Combination therapy for the treatment of cancer
FR3078536A1 (fr) * 2018-03-05 2019-09-06 Peptinov Sas Composition vaccinale anti-pd-1
TWI841554B (zh) 2018-03-21 2024-05-11 丹麥商珍美寶股份有限公司 以鉑為主之劑與抗組織因子抗體－藥物共軛物的組合治療癌症之方法
KR102825164B1 (ko) 2018-03-27 2025-06-26 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 자외선 신호를 사용한 단백질 농도의 실시간 모니터링
CA3099547A1 (en) 2018-05-07 2019-11-14 Reshma Abdulla RANGWALA Methods of treating cancer with a combination of an anti-pd-1 antibody and an anti-tissue factor antibody-drug conjugate
SG11202009986QA (en) 2018-05-07 2020-11-27 Genmab As Methods of treating cancer with a combination of an anti-pd-1 antibody and an anti-tissue factor antibody-drug conjugate
EP3569618A1 (en) 2018-05-19 2019-11-20 Boehringer Ingelheim International GmbH Antagonizing cd73 antibody
TWI848953B (zh) 2018-06-09 2024-07-21 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 針對癌症治療之多特異性結合蛋白
JP2021527082A (ja) * 2018-06-11 2021-10-11 イェール ユニバーシティーＹａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ 新規な免疫チェックポイント阻害剤
SG11202100693UA (en) * 2018-07-26 2021-02-25 Bristol Myers Squibb Co Lag-3 combination therapy for the treatment of cancer
JP7467438B2 (ja) 2018-10-18 2024-04-15 メルク・シャープ・アンド・ドーム・エルエルシー 抗ｒｓｖ抗体の製剤及びその使用方法
CA3117016A1 (en) 2018-10-19 2020-04-23 Bristol-Myers Squibb Company Combination therapy for melanoma
TWI844571B (zh) 2018-10-30 2024-06-11 丹麥商珍美寶股份有限公司 使用抗血管內皮生長因子（ｖｅｇｆ）抗體與抗組織因子（ｔｆ）抗體－藥物共軛體之組合以治療癌症之方法
CN113015748B (zh) 2018-10-31 2025-12-12 默沙东有限责任公司 抗人pd-1抗体晶体及其使用方法
AU2019374748A1 (en) * 2018-11-05 2021-05-27 Merck Sharp & Dohme Llc Dosing regimen of anti-LAG3 antibody and combination therapy with anti-PD-1 antibody for treating cancer
CN113316458B (zh) * 2018-11-07 2024-08-02 默沙东有限责任公司 抗lag3抗体和抗pd-1抗体的共制剂
WO2020097141A1 (en) 2018-11-07 2020-05-14 Merck Sharp & Dohme Corp. Stable formulations of programmed death receptor 1 (pd-1) antibodies and methods of use thereof
TWI894135B (zh) 2019-01-25 2025-08-21 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 編碼ccl21之重組棒狀病毒
WO2020172658A1 (en) 2019-02-24 2020-08-27 Bristol-Myers Squibb Company Methods of isolating a protein
JP2022526166A (ja) * 2019-03-29 2022-05-23 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 抗癌併用療法
EP3947455A1 (en) * 2019-03-29 2022-02-09 Boehringer Ingelheim International GmbH Anticancer combination therapy
US20200318200A1 (en) 2019-04-02 2020-10-08 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Methods for Identifying Progression of a Primary Melanoma
EP3969040A1 (en) * 2019-05-13 2022-03-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Combination of pd-1 inhibitors and lag-3 inhibitors for enhanced efficacy in treating cancer
US20220220430A1 (en) 2019-05-23 2022-07-14 Bristol-Myers Squibb Company Methods of monitoring cell culture media
WO2020243563A1 (en) 2019-05-30 2020-12-03 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signatures for suitability to immuno-oncology therapy
WO2020243568A1 (en) 2019-05-30 2020-12-03 Bristol-Myers Squibb Company Methods of identifying a subject suitable for an immuno-oncology (i-o) therapy
CN114174537A (zh) 2019-05-30 2022-03-11 百时美施贵宝公司 细胞定位特征和组合疗法
CN114008080B (zh) * 2019-06-12 2023-06-09 南京金斯瑞生物科技有限公司 抗pd-l1/抗lag-3多抗原结合蛋白及其使用方法
CN112121169B (zh) * 2019-06-24 2023-10-24 广州再极医药科技有限公司 用于治疗具有高间质压力的肿瘤受试者的癌症的小分子抑制剂
EP3998081A4 (en) 2019-07-05 2023-07-12 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. TREATMENT OF BLOOD CANCER WITH PD-1/CD3 DUAL SPECIFICITY PROTEIN
WO2021005546A1 (en) 2019-07-09 2021-01-14 Cadila Healthcare Limited Antibodies to human programmed death receptor pd-1
WO2021024020A1 (en) 2019-08-06 2021-02-11 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 and immune checkpoint inhibitors for treatment of cancer
JP7771749B2 (ja) 2019-08-08 2025-11-18 小野薬品工業株式会社 二重特異性タンパク質
CN111420049A (zh) * 2019-08-22 2020-07-17 Biocad股份公司 抗-pd1抗体prolgolimab的水性药物组合物及其应用
AU2020345655A1 (en) * 2019-09-11 2022-02-24 Boehringer Ingelheim Io Canada, Inc. Methods of treating cancer by the use of PD-1 axis inhibitors and anti-periostin antibodies
WO2021055994A1 (en) 2019-09-22 2021-03-25 Bristol-Myers Squibb Company Quantitative spatial profiling for lag-3 antagonist therapy
TWI878355B (zh) * 2019-10-02 2025-04-01 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 用於癌症治療之多重專一性結合蛋白
WO2021092221A1 (en) 2019-11-06 2021-05-14 Bristol-Myers Squibb Company Methods of identifying a subject with a tumor suitable for a checkpoint inhibitor therapy
WO2021092220A1 (en) 2019-11-06 2021-05-14 Bristol-Myers Squibb Company Methods of identifying a subject with a tumor suitable for a checkpoint inhibitor therapy
CN115942973A (zh) 2019-11-08 2023-04-07 百时美施贵宝公司 用于黑色素瘤的lag-3拮抗剂疗法
CN110950966B (zh) * 2019-12-13 2020-12-11 启辰生生物科技(珠海)有限公司 融合蛋白、编码核酸和细胞及用途
EP4100426A1 (en) 2020-02-06 2022-12-14 Bristol-Myers Squibb Company Il-10 and uses thereof
JP7565384B2 (ja) 2020-06-03 2024-10-10 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質をコードするリコンビナントラブドウイルス
CN111808192B (zh) * 2020-06-05 2022-02-15 北京天广实生物技术股份有限公司 结合lag3的抗体及其用途
US20250262293A1 (en) 2020-07-07 2025-08-21 BioNTech SE Therapeutic rna for hpv-positive cancer
EP4204095A1 (en) 2020-08-28 2023-07-05 Bristol-Myers Squibb Company Lag-3 antagonist therapy for hepatocellular carcinoma
IL300916A (en) 2020-08-31 2023-04-01 Bristol Myers Squibb Co Cell localization signature and immunotherapy
MX2023003414A (es) 2020-09-24 2023-04-14 Merck Sharp & Dohme Llc Formulaciones estables de anticuerpos programados del receptor de muerte 1 (pd-1) y variantes de hialuronidasa y fragmentos de las mismas y metodos de uso de las mismas.
US20230374064A1 (en) 2020-10-05 2023-11-23 Bristol-Myers Squibb Company Methods for concentrating proteins
AU2021364837A1 (en) 2020-10-23 2023-05-25 Bristol-Myers Squibb Company Lag-3 antagonist therapy for lung cancer
CN117580859A (zh) 2020-11-17 2024-02-20 思进股份有限公司 用图卡替尼和抗pd-1/抗pd-l1抗体的组合治疗癌症的方法
WO2022120179A1 (en) 2020-12-03 2022-06-09 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signatures and uses thereof
WO2022135667A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Therapeutic rna for treating cancer
TW202245808A (zh) 2020-12-21 2022-12-01 德商拜恩迪克公司 用於治療癌症之治療性ｒｎａ
WO2022135666A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Treatment schedule for cytokine proteins
WO2022146947A1 (en) 2020-12-28 2022-07-07 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
MX2023007650A (es) 2020-12-28 2023-09-11 Bristol Myers Squibb Co Metodos de tratamiento de tumores.
CA3210196A1 (en) 2021-01-29 2022-08-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods of treating cancer with kinase inhibitors
US20240181052A1 (en) 2021-03-29 2024-06-06 Juno Therapeutics, Inc. Methods for dosing and treatment with a combination of a checkpoint inhibitor therapy and a car t cell therapy
WO2022216979A1 (en) 2021-04-08 2022-10-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Compounds and methods for theranostic targeting of parp activity
WO2022240741A1 (en) 2021-05-12 2022-11-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Lag3 and gal3 inhibitory agents, xbp1, cs1, and cd138 peptides, and methods of use thereof
AR126161A1 (es) 2021-06-17 2023-09-27 Boehringer Lngelheim Int Gmbh Moléculas de fijación triespecíficas novedosas
MX2024000674A (es) 2021-07-13 2024-02-07 BioNTech SE Agentes de union multiespecificos contra cd40 y cd137 en terapia de combinacion.
US20250002600A1 (en) 2021-10-06 2025-01-02 Genmab A/S Multispecific binding agents against pd-l1 and cd137 in combination therapy
TW202333802A (zh) 2021-10-11 2023-09-01 德商拜恩迪克公司 用於肺癌之治療性rna(二)
CN118176214A (zh) 2021-10-29 2024-06-11 百时美施贵宝公司 血液癌症的lag-3拮抗剂疗法
WO2023083439A1 (en) 2021-11-09 2023-05-19 BioNTech SE Tlr7 agonist and combinations for cancer treatment
MX2024008831A (es) 2022-01-26 2024-07-25 Bristol Myers Squibb Co Terapia combinada para carcinoma hepatocelular.
MX2024010310A (es) 2022-02-25 2024-08-28 Bristol Myers Squibb Co Terapia de combinacion para carcinoma colorrectal.
WO2023168404A1 (en) 2022-03-04 2023-09-07 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating a tumor
CA3254481A1 (en) 2022-03-08 2023-09-14 Alentis Therapeutics Ag USE OF ANTI-CLAUDIN-1 ANTIBODIES TO INCREASE T LYMPHOCYTE AVAILABILITY
JP2025509274A (ja) 2022-03-09 2025-04-11 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 治療用タンパク質の一過性発現
JP2025509749A (ja) 2022-03-18 2025-04-11 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー ポリペプチドの単離方法
WO2023183317A2 (en) * 2022-03-21 2023-09-28 Ab Therapeutics, Inc. Multispecific antibodies and uses thereof
AU2023269545A1 (en) 2022-05-12 2024-11-14 BioNTech SE Binding agents capable of binding to cd27 in combination therapy
EP4531916A1 (en) 2022-06-02 2025-04-09 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
EP4554677A1 (en) 2022-07-15 2025-05-21 Boehringer Ingelheim International GmbH Binding molecules for the treatment of cancer
EP4626446A1 (en) 2022-12-01 2025-10-08 BioNTech SE Multispecific antibody against cd40 and cd137 in combination therapy with anti-pd1 ab and chemotherapy
AU2023403103A1 (en) 2022-12-01 2025-07-10 Medimmune Limited Combination therapy for treatment of cancer comprising anti-pd-l1 and anti-cd73 antibodies
IL321098A (en) 2022-12-14 2025-07-01 Astellas Pharma Europe Bv Combination therapy including bispecific binding agents that bind to CLDN18.2- and CD3- and immune checkpoint inhibitors
IL321575A (en) 2022-12-21 2025-08-01 Bristol Myers Squibb Co Combination therapy for lung cancer
CN121002071A (zh) 2023-01-20 2025-11-21 勃林格殷格翰国际有限公司 IL-12 Fc融合蛋白
US20240299601A1 (en) 2023-02-17 2024-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Radiolabeled anti-lag3 antibodies for immuno-pet imaging
CN115960834B (zh) * 2023-03-07 2023-06-09 浙江省肿瘤医院 一种pd-1/ptx联合pd-1耐药模型建立的方法
WO2024196952A1 (en) 2023-03-20 2024-09-26 Bristol-Myers Squibb Company Tumor subtype assessment for cancer therapy
WO2024209072A1 (en) 2023-04-06 2024-10-10 Genmab A/S Multispecific binding agents against pd-l1 and cd137 for treating cancer
TW202509071A (zh) 2023-05-12 2025-03-01 丹麥商珍美寶股份有限公司 能夠與ｏｘ４０結合之抗體、其變異體及其用途
CN121712571A (zh) 2023-08-15 2026-03-20 百时美施贵宝公司 陶瓷羟基磷灰石色谱流通法
TW202535926A (zh) 2023-10-30 2025-09-16 美商再生元醫藥公司 穩定抗體配製物
TW202540189A (zh) 2023-11-30 2025-10-16 德商生物新技術公司 在組合療法中能夠結合ｏｘ４０之抗體
WO2025120866A1 (en) 2023-12-08 2025-06-12 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving bispecific binding agents binding to cldn18.2 and cd3 and agents stabilizing or increasing expression of cldn18.2
WO2026033885A1 (en) 2024-08-08 2026-02-12 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving bispecific binding agents binding to cldn18.2 and cd3 and agents stabilizing or increasing expression of cldn18.2
TW202541837A (zh) 2023-12-08 2025-11-01 日商安斯泰來製藥公司 含有結合至cldn18.2和cd3之雙特異性結合劑和穩定或增加cldn18.2表現之藥劑之組合療法
WO2025120867A1 (en) 2023-12-08 2025-06-12 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving bispecific binding agents binding to cldn18.2 and cd3 and anti-vegfr2 antibodies
WO2025132695A1 (en) 2023-12-19 2025-06-26 Boehringer Ingelheim International Gmbh Recombinant rhabdovirus encoding for a gasdermin
US20250215087A1 (en) 2023-12-29 2025-07-03 Bristol-Myers Squibb Company Combination therapy of kras inhibitor and treg depleting agent
WO2025184208A1 (en) 2024-02-27 2025-09-04 Bristol-Myers Squibb Company Anti-ceacam5 antibodies and uses thereof
US12521446B2 (en) 2024-02-27 2026-01-13 Bristol-Myers Squibb Company Anti-CEACAM5 antibody drug conjugates
WO2025202213A1 (en) 2024-03-26 2025-10-02 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Lipid nanoparticle loaded with antitumoral agent and functionnalized to target immosuppressive cells
WO2025226695A1 (en) 2024-04-23 2025-10-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Stable antibody formulation
WO2025245489A1 (en) 2024-05-24 2025-11-27 Bristol-Myers Squibb Company Treatment of tumors in subjects having fgl-1 positive samples

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1988001649A1 (en) 1986-09-02 1988-03-10 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
FI903489A0 (fi) 1988-11-11 1990-07-10 Medical Res Council Ligander med en enda sektion, receptorer innehaollande naemnda ligander, foerfaranden foer deras framstaellning samt anvaendning av liganderna och receptorerna.
GB8905669D0 (en) 1989-03-13 1989-04-26 Celltech Ltd Modified antibodies
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
EP1498427B1 (en) 1992-08-21 2009-12-16 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
DK0672142T3 (da) 1992-12-04 2001-06-18 Medical Res Council Multivalente og multispecifikke bindingsproteiner samt fremstilling og anvendelse af disse
ATE183513T1 (de) 1993-06-03 1999-09-15 Therapeutic Antibodies Inc Herstellung von antikörperfragmenten
GB9625640D0 (en) 1996-12-10 1997-01-29 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
US6329516B1 (en) 1997-04-28 2001-12-11 Fmc Corporation Lepidopteran GABA-gated chloride channels
JP2002505574A (ja) 1997-04-30 2002-02-19 エンゾン，インコーポレイテッド ポリアルキレンオキシド修飾された単鎖ポリペプチド
JP2003530838A (ja) 2000-04-12 2003-10-21 ヒューマン ゲノム サイエンシズ インコーポレイテッド アルブミン融合タンパク質
CA2433877C (en) 2001-01-17 2014-11-18 Aptevo Research And Development Llc Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
AU2002351896A1 (en) 2001-12-11 2003-06-23 Ablynx N.V. Method for displaying loops from immunoglobulin domains in different contexts
EP1517921B1 (en) 2002-06-28 2006-06-07 Domantis Limited Dual specific ligands with increased serum half-life
WO2004041862A2 (en) 2002-11-08 2004-05-21 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against tumour necrosis factor-alpha and uses therefor
CN1753912B (zh) 2002-12-23 2011-11-02 惠氏公司 抗pd-1抗体及其用途
SI1639011T1 (sl) 2003-06-30 2009-04-30 Domantis Ltd Pegilirana protitelesa z enojno domeno (dAb)
AR072999A1 (es) * 2008-08-11 2010-10-06 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos
TW201134488A (en) * 2010-03-11 2011-10-16 Ucb Pharma Sa PD-1 antibodies
CN104603149B (zh) * 2012-05-24 2017-06-30 万机集团有限公司 与预防和治疗狂犬病感染相关的组合物和方法
UY34887A (es) * 2012-07-02 2013-12-31 Bristol Myers Squibb Company Una Corporacion Del Estado De Delaware Optimización de anticuerpos que se fijan al gen de activación de linfocitos 3 (lag-3) y sus usos
HRP20201113T1 (hr) * 2013-03-15 2020-10-30 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Vežući proteini protiv lag-3
KR102243062B1 (ko) 2013-05-02 2021-04-21 아납티스바이오, 아이엔씨. 예정된 사멸-1에 대한 항체
SI3508502T1 (sl) * 2013-09-20 2023-07-31 Bristol-Myers Squibb Company Kombinacija anti-lag-3 protiteles in anti-pd-1 protiteles za zdravljenje tumorjev
CN105744950A (zh) * 2013-11-05 2016-07-06 巴法里安诺迪克有限公司 用于使用表达肿瘤抗原的痘病毒和免疫检查点抑制剂的拮抗剂和/或激动剂治疗癌症的组合疗法
ES2746805T3 (es) 2013-12-12 2020-03-06 Shanghai hengrui pharmaceutical co ltd Anticuerpo de PD-1, fragmento de unión a antígeno del mismo y aplicación médica del mismo
TWI777174B (zh) * 2014-03-14 2022-09-11 瑞士商諾華公司 針對lag-3之抗體分子及其用途
ES2743809T3 (es) * 2014-07-31 2020-02-20 Amgen Res Munich Gmbh Constructos de anticuerpo monocatenarios biespecificos específicos de especies cruzadas optimizados
JO3663B1 (ar) * 2014-08-19 2020-08-27 Merck Sharp & Dohme الأجسام المضادة لمضاد lag3 وأجزاء ربط الأنتيجين
MA41044A (fr) 2014-10-08 2017-08-15 Novartis Ag Compositions et procédés d'utilisation pour une réponse immunitaire accrue et traitement contre le cancer
UY36351A (es) 2014-10-14 2016-06-01 Novartis Ag Moléculas de anticuerpo que se unen a pd-l1 y usos de las mismas
TWI595006B (zh) 2014-12-09 2017-08-11 禮納特神經系統科學公司 抗ｐｄ－１抗體類和使用彼等之方法
SG11201708223QA (en) 2015-04-17 2017-11-29 Bristol Myers Squibb Co Compositions comprising a combination of an anti-pd-1 antibody and another antibody
TWI773646B (zh) 2015-06-08 2022-08-11 美商宏觀基因股份有限公司 結合lag-3的分子和其使用方法
TWI756187B (zh) 2015-10-09 2022-03-01 美商再生元醫藥公司 抗ｌａｇ３抗體及其用途
EP3848393A1 (en) 2016-05-18 2021-07-14 Boehringer Ingelheim International GmbH Antibody molecules for cancer treatment

Also Published As

Publication number Publication date
EP3848393A1 (en) 2021-07-14
KR20190006177A (ko) 2019-01-17
US11795219B2 (en) 2023-10-24
JP6585860B2 (ja) 2019-10-02
DK3458478T3 (da) 2021-03-22
JP2019050804A (ja) 2019-04-04
MX2018014102A (es) 2019-04-29
CL2021002094A1 (es) 2022-04-08
US20170334995A1 (en) 2017-11-23
ES2857813T3 (es) 2021-09-29
CN109415439B (zh) 2022-10-04
UA127200C2 (uk) 2023-06-07
KR20220103806A (ko) 2022-07-22
BR112018072986A2 (pt) 2019-03-06
MY193112A (en) 2022-09-26
MA45029A (fr) 2019-03-27
TWI762484B (zh) 2022-05-01
AU2017266298A1 (en) 2018-10-25
CA3020649A1 (en) 2017-11-23
CN109415439A (zh) 2019-03-01
TW202307002A (zh) 2023-02-16
JP2019522460A (ja) 2019-08-15
HUE053452T2 (hu) 2021-07-28
AU2017266298B2 (en) 2024-01-04
IL262892B1 (en) 2023-12-01
IL262892B2 (en) 2024-04-01
NZ746845A (en) 2025-02-28
SG11201809627QA (en) 2018-12-28
EA201892616A1 (ru) 2019-05-31
EP3458478B1 (en) 2021-01-06
AR108516A1 (es) 2018-08-29
CO2018012374A2 (es) 2018-11-30
EP3458478A1 (en) 2019-03-27
MA55697A (fr) 2022-02-23
TW201806974A (zh) 2018-03-01
PE20190108A1 (es) 2019-01-15
PL3458478T3 (pl) 2021-06-28
CL2018003153A1 (es) 2019-01-18
MX2022008184A (es) 2022-08-02
CN115340608A (zh) 2022-11-15
US20240124581A1 (en) 2024-04-18
MX393609B (es) 2025-03-24
US11028169B2 (en) 2021-06-08
US20210095020A1 (en) 2021-04-01
LT3458478T (lt) 2021-02-10
JP6585801B2 (ja) 2019-10-02
CY1123977T1 (el) 2022-05-27
IL262892A (en) 2018-12-31
KR102419412B1 (ko) 2022-07-12
SI3458478T1 (sl) 2021-04-30
PH12018502429A1 (en) 2019-09-30
WO2017198741A1 (en) 2017-11-23
SA518400424B1 (ar) 2022-08-17
MA45029B1 (fr) 2021-03-31
JP2020007340A (ja) 2020-01-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240124581A1 (en) Antibody molecules for cancer treatment
US11312785B2 (en) Antagonizing CD73 antibody
AU2017384687A1 (en) Bispecific anti-TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor 2 and anti-cadherin 17 binding molecules for the treatment of cancer
US20240052065A1 (en) Binding molecules for the treatment of cancer
HK40049379A (en) Antibody molecules for cancer treatment
HK1262595A1 (en) Anti pd-1 and anti-lag3 antibodies for cancer treatment
HK1262595B (en) Anti pd-1 and anti-lag3 antibodies for cancer treatment
BR112018072986B1 (pt) Anticorpo anti-pd-1, seu método de fabricação, vetor de expressão, célula hospedeira, composição farmacêutica, kit de partes e seus usos no tratamento de câncer
EA042707B1 (ru) Антитело к pd1, способы его получения и применения для лечения злокачественного новообразования