JP7565384B2 - ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質をコードするリコンビナントラブドウイルス - Google Patents

ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質をコードするリコンビナントラブドウイルス Download PDF

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Description

発明の分野
本発明は、腫瘍溶解性ウイルスの分野に関し、特に、そのゲノム中でＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質をコードするリコンビナントラブドウイルスに関する。本発明は、更に、ガンの処置におけるリコンビナントラブドウイルスの使用、また、このようなウイルスを製造するための方法に係るものである。
発明の背景
腫瘍溶解性ウイルスは、ガン細胞において選択的に複製し、ガン細胞を殺傷し、腫瘍内に拡散可能な新興クラスの生物学的製剤である。腫瘍溶解性ウイルスの治療可能性を増大させるように更に改善する努力により、いわゆる武装化ウイルスの開発がもたらされた。武装化ウイルスは、腫瘍処置におけるそれらの有効性を改善するために、そのゲノム中で腫瘍抗原又は免疫モデュラトリー導入遺伝子をコードする。
多くの場合、腫瘍中のＴ細胞は不足しており、そのため、「免疫砂漠」－免疫系のＴ細胞が腫瘍に浸透して、制御不能に増殖する細胞を殺傷することができないか又は浸透しない腫瘍微小環境－として公知になったものが存在する。免疫監視を回避するために、腫瘍は、骨髄由来のサプレッサー細胞をリクルートし又はＴＧＦβを含む因子を分泌することにより免疫サプレッション微小環境を作り出し、これは、細胞外マトリックス遺伝子の発現を誘引し、腫瘍へのＴ細胞浸潤を促進するのに必要なケモカイン及びサイトカインの発現をサプレッションする二重の役割を果たすと仮定されてきた（Pickup M, Novitskiy S, Moses HL. The roles of TGFbeta in the tumour microenvironment. Nat Rev Cancer 2013;13:788-99）。更に、研究から、免疫サプレッション微小環境に対応する遺伝子の高い発現を示す腫瘍は、卵巣ガン及び結腸直腸ガンを含む多くのタイプのガンにわたって不良なアウトカムに関連することが見出された（Calon A, Lonardo E, Berenguer-Llergo A, Espinet E, Hernando-Momblona X, Iglesias M, et al. Stromal gene expression defines poor-prognosis subtypes in colorectal cancer. Nat Genet 2015;47:320-9；Ryner L, Guan Y, Firestein R, Xiao Y, Choi Y, Rabe C, et al. Upregulation of periostin and reactive stroma is associated with primary chemoresistance and predicts clinical outcomes in epithelial ovarian cancer. Clin Cancer Res 2015;21:2941-51；Tothill RW, Tinker AV, George J, Brown R, Fox SB, Lade S, et al. Novel molecular subtypes of serous and endometrioid ovarian cancer have been linked to clinical outcome. Clin Cancer Res 2008;14:5198-208）。適応免疫応答の特徴は、特異性及び記憶である。細胞応答は、Ｔ細胞により媒介される。Ｔ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子との複合体状にあるペプチド抗原を認識する細胞表面Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）を発現する。しかしながら、同族ＴＣＲとＭＨＣ－ペプチド複合体単独との相互作用（シグナル１）は、最適なＴ細胞活性化を誘発しない。シグナル１に加えて、それらの同族リガンドへの正及び負の共刺激レセプターの結合は、Ｔ細胞活性化をモデュレーションする。この複雑なシグナル伝達ネットワークは、一方では、最適なＴ細胞活性化を提供するが、他方では、生理学的条件下でのＴ細胞の異常な活性化が防止される。ＣＤ２８（シグナル２）は、Ｔ細胞上の主な正の共刺激レセプターである。シグナル２（Ｂ７．１（ＣＤ８０）又はＢ７．２（ＣＤ８６）とのＣＤ２８の相互作用）が、例えば、ＴＡＡ提示腫瘍細胞上で欠如している場合、ＴＡＡ特異的Ｔ細胞との慢性相互作用は、後者を非応答性（アネルギー性）にする：Ｔ細胞は、ＴＣＲがＴＡＡと相互作用する場合でさえも、シグナルに対して不応性になる。この状況は、ガン患者において、特に、進行した疾患の慢性状況において説明されている。一方、強力なＴ細胞共刺激により、後期転移ガン患者においてＴＡＡ特異的Ｔ細胞が再活性化される場合がある。
１つの近年のアプローチから、そのゲノム中でカーゴとしてＩＦＮ－βタンパク質をコードする腫瘍溶解性ウイルスが予見される。更なるアプローチにおいて、腫瘍抗原ＭＡＧＥ－Ａ３の発現が、臨床において探索されている。適切かつ有効なカーゴを特定するのに加えて、ウイルス骨格からの更なるカーゴの発現は、常に、抗腫瘍効力だけでなく、抗ウイルス免疫も増強するであろうリスクを有する。カーゴは、治療用カーゴの発現により得られる利益が腫瘍溶解能の喪失により打ち消される程度まで、ウイルスの腫瘍溶解能を制限しないように注意しなければならない。このため、当技術分野において、有効なガン処置に使用することができる、更に改善された武装化腫瘍溶解性ウイルスが必要とされている。当技術分野において、免疫サプレッション腫瘍微小環境へのＴ細胞及び／又は樹状細胞の浸潤を選択的に改善することが、更に必要とされている。
発明の概要
本発明は、そのゲノム中でＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質又はその機能的変異体、好ましくは、ヒトＣＤ８０細胞外ドメインをコードするリコンビナントラブドウイルス、例えば、水疱性口内炎ウイルスを提供することにより、上記必要性に対処する。
また、特定の態様に関する任意の実施態様をその特定の態様に関する別の実施態様と組み合わせることもでき、複数の層においても、その特定の態様に対する幾つかの実施態様を含む組み合わせであることができると理解されたい。
第１の態様では、本発明は、そのゲノム中で少なくとも１種のＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質又はその機能的変異体をコードするリコンビナントラブドウイルスであって、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質は、ＣＤ８０の細胞外ドメインを含み、ＩｇＧのＦｃドメインを更に含む、リコンビナントラブドウイルスに関する。
第１の態様に関する一実施態様では、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質又はその機能的変異体は、（ｉ）ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＣＤ８０細胞外ドメインを含む、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、（ｉｉ）ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＣＤ８０細胞外ドメインを含む、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質であって、ＣＤ８０細胞外ドメインが配列番号：１を含むか若しくはこれからなるか又は配列番号：１と少なくとも８０％の同一性を有する、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、（ｉｉｉ）ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＣＤ８０細胞外ドメインを含む、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質であって、Ｆｃドメインが配列番号：２を含むか若しくはこれからなるか又は配列番号：２と少なくとも８０％の同一性を有する、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、（ｉｖ）ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＣＤ８０細胞外ドメインを含む、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質であって、ＣＤ８０細胞外ドメインが配列番号：１を含むか若しくはこれからなるか又は配列番号：１と少なくとも８０％の同一性を有し、Ｆｃドメインが配列番号：２を含むか若しくはこれからなるか又は配列番号：２と少なくとも８０％の同一性を有する、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、（ｖ）ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＣＤ８０細胞外ドメインを含む、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質であって、ＣＤ８０細胞外ドメインが配列番号：４のアミノ酸１～２０７からなるか又は配列番号：４のアミノ酸１～２０７と少なくとも８０％の同一性を有し、Ｆｃドメインが配列番号：４のアミノ酸２０８～４３３からなるか又は配列番号：４のアミノ酸２０８～４３３と少なくとも８０％の同一性を有する、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、（ｖｉ）シグナルペプチド配列を更に含む、（ｉ）～（ｖ）のいずれかに記載のＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、及び（ｖｉｉ）配列番号：３を含むか又は配列番号：３と少なくとも８０％の同一性を有する、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、を含む群から選択される。
第１の態様に関する一実施態様では、リコンビナントラブドウイルスは、ベシクロウイルスである。
第１の態様に関する一実施態様では、ベシクロウイルスは、水疱性口内炎アラゴアウイルス（ＶＳＡＶ）、カラハスウイルス（ＣＪＳＶ）、シャンジプラウイルス（ＣＨＰＶ）、コカルウイルス（ＣＯＣＶ）、水疱性口内炎インディアナウイルス（ＶＳＩＶ）、イスファハンウイルス（ＩＳＦＶ）、マラバウイルス（ＭＡＲＡＶ）、水疱性口内炎ニュージャージーウイルス（ＶＳＮＪＶ）又はピリウイルス（ＰＩＲＹＶ）、好ましくは、水疱性口内炎インディアナウイルス（ＶＳＩＶ）又は好ましくは、水疱性口内炎ニュージャージーウイルス（ＶＳＮＪＶ）を含む群から選択される。
第１の態様に関する一実施態様では、リコンビナントラブドウイルスは、複製可能である。
第１の態様に関する一実施態様では、ＣＤ８０細胞外ドメインは、ヒトＣＤ８０細胞外ドメインである。
第１の態様に関する一実施態様では、リコンビナントラブドウイルスは、糖タンパク質Ｇをコードする機能的遺伝子を欠いており、かつ／若しくは、機能的糖タンパク質Ｇを欠いている、又は、糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子は、別のウイルスの糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子により置き換えられており、かつ／若しくは、糖タンパク質Ｇは、別のウイルスの糖タンパク質ＧＰにより置き換えられている、又は、糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子は、アレナウイルスの糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子により置き換えられており、かつ／若しくは、糖タンパク質Ｇは、アレナウイルスの糖タンパク質ＧＰにより置き換えられている。更に好ましい実施態様では、糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子は、ダンデノングウイルス若しくはモペイアウイルスの糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子により置き換えられており、かつ／又は、糖タンパク質Ｇは、ダンデノングウイルス若しくはモペイアウイルスの糖タンパク質ＧＰにより置き換えられている。糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子が、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子により置き換えられており、かつ／又は、糖タンパク質Ｇが、ＬＣＭＶの糖タンパク質ＧＰにより置き換えられているのが更により好ましい。
第１の態様に関する好ましい実施態様では、本発明は、そのゲノム中で少なくとも１種のＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質又はその機能的変異体をコードするリコンビナント水疱性口内炎ウイルスであって、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質がＣＤ８０の細胞外ドメインを含み、ＩｇＧのＦｃドメインを更に含む、リコンビナント水疱性口内炎ウイルスを提供する。関連する実施態様では、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質は、（ｉ）ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＣＤ８０細胞外ドメインを含む、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、（ｉｉ）ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＣＤ８０細胞外ドメインを含む、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質であって、ＣＤ８０細胞外ドメインが配列番号：１を含むか若しくはこれからなるか又は配列番号：１と少なくとも８０％の同一性を有する、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、（ｉｉｉ）ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＣＤ８０細胞外ドメインを含む、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質であって、Ｆｃドメインが配列番号：２を含むか若しくはこれからなるか又は配列番号：２と少なくとも８０％の同一性を有する、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、（ｉｖ）ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＣＤ８０細胞外ドメインを含む、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質であって、ＣＤ８０細胞外ドメインが配列番号：１を含むか若しくはこれからなるか又は配列番号：１と少なくとも８０％の同一性を有し、Ｆｃドメインが配列番号：２を含むか若しくはこれからなるか又は配列番号：２と少なくとも８０％の同一性を有する、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、（ｖ）ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＣＤ８０細胞外ドメインを含む、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質であって、ＣＤ８０細胞外ドメインが配列番号：４のアミノ酸１～２０７からなるか又は配列番号：４のアミノ酸１～２０７と少なくとも８０％の同一性を有し、Ｆｃドメインが配列番号：４のアミノ酸２０８～４３３からなるか又は配列番号：４のアミノ酸２０８～４３３と少なくとも８０％の同一性を有する、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、（ｖｉ）シグナルペプチド配列を更に含む、（ｉ）～（ｖ）のいずれかに記載のＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、又は（ｖｉｉ）配列番号：３を含むか又は配列番号：３と少なくとも８０％の同一性を有する、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、を含む群から選択され、ここで、リコンビナント水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子は、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子により置き換えられており、かつ／又は、糖タンパク質Ｇは、ＬＣＭＶの糖タンパク質ＧＰにより置き換えられている。
第２の態様では、本発明は、そのゲノム中で少なくとも水疱性口内炎ウイルスの核タンパク質（Ｎ）、大型タンパク質（Ｌ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）及び少なくとも１種のＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質又はその機能的変異体をコードするリコンビナント水疱性口内炎ウイルスであって、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質は、ＣＤ８０の細胞外ドメインを含み、ＩｇＧのＦｃドメインを更に含む、リコンビナント水疱性口内炎ウイルスに関する。
第２の態様に関する一実施態様では、核タンパク質（Ｎ）は、配列番号：７に記載されたアミノ酸配列、又は配列番号：７と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の機能的変異体を含む。
第２の態様に関する一実施態様では、リンタンパク質（Ｐ）は、配列番号：８に記載されたアミノ酸配列、又は配列番号：８と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の機能的変異体を含む。
第２の態様に関する一実施態様では、大型タンパク質（Ｌ）は、配列番号：９に記載されたアミノ酸配列、又は配列番号：９と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の機能的変異体を含む。
第２の態様に関する一実施態様では、マトリックスタンパク質（Ｍ）は、配列番号：１０に記載されたアミノ酸配列、又は配列番号：１０と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の機能的変異体を含む。
第２の態様に関する好ましい実施態様では、核タンパク質（Ｎ）は、配列番号：７に記載されたアミノ酸配列、又は配列番号：７と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の機能的変異体を含み、リンタンパク質（Ｐ）は、配列番号：８に記載されたアミノ酸配列、又は配列番号：８と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の機能的変異体を含み、大型タンパク質（Ｌ）は、配列番号：９に記載されたアミノ酸配列、又は配列番号：９と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の機能的変異体を含み、マトリックスタンパク質（Ｍ）は、配列番号：１０に記載されたアミノ酸配列、又は配列番号：１０と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の機能的変異体を含む。
第２の態様に関する一実施態様では、リコンビナント水疱性口内炎ウイルスは、複製可能である。
第２の態様に関する一実施態様では、リコンビナント水疱性口内炎ウイルスは、糖タンパク質Ｇをコードする機能的遺伝子を欠いており、かつ／若しくは、機能的糖タンパク質Ｇを欠いている、又は、糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子は、別のウイルスの糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子により置き換えられており、かつ／若しくは、糖タンパク質Ｇは、別のウイルスの糖タンパク質ＧＰにより置き換えられている、又は、糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子は、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子により置き換えられており、かつ／若しくは、糖タンパク質Ｇは、ＬＣＭＶの糖タンパク質ＧＰにより置き換えられている。
第２の態様に関する一実施態様では、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質は、（ｉ）ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＣＤ８０細胞外ドメインを含む、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、（ｉｉ）ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＣＤ８０細胞外ドメインを含む、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質であって、ＣＤ８０細胞外ドメインが配列番号：１を含むか若しくはこれからなるか又は配列番号：１と少なくとも８０％の同一性を有する、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、（ｉｉｉ）ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＣＤ８０細胞外ドメインを含む、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質であって、Ｆｃドメインが配列番号：２を含むか若しくはこれからなるか又は配列番号：２と少なくとも８０％の同一性を有する、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、（ｉｖ）ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＣＤ８０細胞外ドメインを含む、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質であって、ＣＤ８０細胞外ドメインが配列番号：１を含むか若しくはこれからなるか又は配列番号：１と少なくとも８０％の同一性を有し、Ｆｃドメインが配列番号：２を含むか若しくはこれからなるか又は配列番号：２と少なくとも８０％の同一性を有する、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、（ｖ）ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＣＤ８０細胞外ドメインを含む、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質であって、ＣＤ８０細胞外ドメインが配列番号：４のアミノ酸１～２０７からなるか又は配列番号：４のアミノ酸１～２０７と少なくとも８０％の同一性を有し、Ｆｃドメインが配列番号：４のアミノ酸２０８～４３３からなるか又は配列番号：４のアミノ酸２０８～４３３と少なくとも８０％の同一性を有する、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、（ｖｉ）シグナルペプチド配列を更に含む、（ｉ）～（ｖ）のいずれかに記載のＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、又は（ｖｉｉ）配列番号：３を含むか又は配列番号：３と少なくとも８０％の同一性を有する、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、を含む群から選択される。
第２の態様に関する好ましい実施態様では、本発明は、そのゲノム中で水疱性口内炎ウイルスの核タンパク質（Ｎ）、大型タンパク質（Ｌ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）及び少なくとも１種のＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質又はその機能的変異体をコードするリコンビナント水疱性口内炎ウイルスであって、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質は、ＣＤ８０の細胞外ドメインを含み、ＩｇＧのＦｃドメインを更に含み、（ｉ）ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＣＤ８０細胞外ドメインを含む、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、（ｉｉ）ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＣＤ８０細胞外ドメインを含む、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質であって、ＣＤ８０細胞外ドメインが配列番号：１を含むか若しくはこれからなるか又は配列番号：１と少なくとも８０％の同一性を有する、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、（ｉｉｉ）ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＣＤ８０細胞外ドメインを含む、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質であって、Ｆｃドメインが配列番号：２を含むか若しくはこれからなるか又は配列番号：２と少なくとも８０％の同一性を有する、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、（ｉｖ）ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＣＤ８０細胞外ドメインを含む、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質であって、ＣＤ８０細胞外ドメインが配列番号：１を含むか若しくはこれからなるか又は配列番号：１と少なくとも８０％の同一性を有し、Ｆｃドメインが配列番号：２を含むか若しくはこれからなるか又は配列番号：２と少なくとも８０％の同一性を有する、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、（ｖ）ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＣＤ８０細胞外ドメインを含む、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質であって、ＣＤ８０細胞外ドメインが配列番号：４のアミノ酸１～２０７からなるか又は配列番号：４のアミノ酸１～２０７と少なくとも８０％の同一性を有し、Ｆｃドメインが配列番号：４のアミノ酸２０８～４３３からなるか又は配列番号：４のアミノ酸２０８～４３３と少なくとも８０％の同一性を有する、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、（ｖｉ）シグナルペプチド配列を更に含む、（ｉ）～（ｖ）のいずれかに記載のＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、又は（ｖｉｉ）配列番号：３を含むか又は配列番号：３と少なくとも８０％の同一性を有する、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質を含む群から選択され、ここで、水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子は、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子により置き換えられており、かつ／又は、糖タンパク質Ｇは、ＬＣＭＶの糖タンパク質ＧＰにより置き換えられており、ここで、核タンパク質（Ｎ）は、配列番号：７に記載されたアミノ酸、又は配列番号：７と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の機能的変異体を含み、リンタンパク質（Ｐ）は、配列番号：８に記載されたアミノ酸、又は配列番号：８と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の機能的変異体を含み、大型タンパク質（Ｌ）は、配列番号：９に記載されたアミノ酸、又は配列番号：９と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の機能的変異体を含み、マトリックスタンパク質（Ｍ）は、配列番号：１０に記載されたアミノ酸、又は配列番号：１０と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の機能的変異体を含む。
第３の態様では、本発明は、第１の態様のリコンビナントラブドウイルス若しくはその実施態様のいずれか又は第２の態様のリコンビナント水疱性口内炎ウイルス若しくはその実施態様のいずれかを含むことを特徴とする、医薬組成物を提供する。
第４の態様では、本発明は、医薬として使用するための、第１の態様のリコンビナントラブドウイルス若しくはその実施態様のいずれか又は第２の態様のリコンビナント水疱性口内炎ウイルス若しくはその実施態様のいずれか又は第３の態様の医薬組成物若しくはその実施態様のいずれかを提供する。
第４の態様に関する一実施態様では、本発明は、ガン、好ましくは、固形ガンの処置に使用するための、リコンビナントラブドウイルス、リコンビナント水疱性口内炎ウイルス又は医薬組成物を提供する。好ましい実施態様では、固形ガンは、生殖器腫瘍、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、精巣腫瘍、内分泌腫瘍、胃腸腫瘍、肝臓腫瘍、腎臓腫瘍、結腸腫瘍、結腸直腸腫瘍、膀胱腫瘍、前立腺腫瘍、皮膚腫瘍、メラノーマ、呼吸器腫瘍、肺腫瘍、乳房腫瘍、頭頸部腫瘍、頭頸部扁平上皮ガン（ＨＮＳＣＣ）及び骨腫瘍を含むリストから選択される。
第４の態様に関する一実施態様では、リコンビナントラブドウイルス、リコンビナント水疱性口内炎ウイルス又は医薬組成物は、腫瘍内又は静脈内に投与されるべきものである。別の関連する実施態様では、リコンビナントラブドウイルス、リコンビナント水疱性口内炎ウイルス又は医薬組成物は、少なくとも１回腫瘍内に投与され、その後、静脈内に投与されるべきものである。更に関連する実施態様では、リコンビナントラブドウイルス、リコンビナント水疱性口内炎ウイルス又は医薬組成物後続の静脈内投与は、最初の腫瘍内投与後１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日又は３１日で与えられる。
第５の態様では、本発明は、第１の態様のリコンビナントラブドウイルス若しくはその実施態様のいずれか又は第２の態様のリコンビナント水疱性口内炎ウイルス若しくはその実施態様のいずれかを含み、阻害剤を更に含み、ここで、該阻害剤がＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣ模倣物である、組成物を提供する。
第５の態様に関する一実施態様では、ＰＤ－１経路阻害剤は、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１に対するアンタゴニスト抗体である。更に関連する実施態様では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２からの化合物１～２６又はこれらの化合物のうちの１つの薬学的に許容され得る塩のいずれかからなる群より選択される。別の関連する実施態様では、ＰＤ－１経路阻害剤は、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ＰＤＲ－００１、ＰＤ１－１、ＰＤ１－２、ＰＤ１－３、ＰＤ１－４及びＰＤ１－５（表１に示す）からなる群より選択されるアンタゴニストである。最も好ましい実施態様では、ＰＤ－１経路阻害剤は、ＢＩ－７５４０９１である。
第６の態様では、本発明は、第１～第３の態様のいずれかで定義されたリコンビナントラブドウイルス、リコンビナント水疱性口内炎ウイルス若しくは医薬組成物又はそれらの実施態様のいずれかと、第５の態様に関する実施態様のいずれかで定義されたＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣ模倣物と、を含む、パーツキットを提供する。
第７の態様では、本発明は、ａ）第１の態様のリコンビナントラブドウイルス若しくはその実施態様のいずれか又は第２の態様のリコンビナント水疱性口内炎ウイルス若しくはその実施態様のいずれか又は第３の態様の医薬組成物若しくはその実施態様のいずれかと、ｂ）ＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣ模倣物とを含む、併用処置を提供する。第７の態様に関する一実施態様では、（ａ）と（ｂ）とを同時に、連続的に又は交互に投与することができる。関連する実施態様では、ａ）とｂ）とは、異なる投与経路を介して投与される。更に関連する実施態様では、ａ）は、腫瘍内に投与され、ｂ）は、静脈内に投与される。
第７の態様に関する一実施態様では、ＰＤ－１経路阻害剤は、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１に対するアンタゴニスト抗体である。関連する実施態様では、ＰＤ－１経路阻害剤は、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ＰＤＲ－００１、ＰＤ１－１、ＰＤ１－２、ＰＤ１－３、ＰＤ１－４及びＰＤ１－５（表１を参照のこと）からなる群より選択される。更に関連する実施態様では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２の化合物１～２６又はこれらの化合物のうちの１つの薬学的に許容され得る塩のいずれか１つからなる群より選択される。
第８の態様では、本発明は、第１の態様のリコンビナントラブドウイルス若しくはその実施態様のいずれか又は第２の態様のリコンビナント水疱性口内炎ウイルス若しくはその実施態様のいずれかを製造することを特徴とする、ウイルス産生細胞を提供する。
第８の態様に関する一実施態様では、ウイルス産生細胞は、ベロ細胞、ＨＥＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞である。
第９の態様では、本発明は、細胞培養物中でリコンビナントラブドウイルスを製造する方法であって、
（ｉ）ホスト細胞をリコンビナントラブドウイルス、好ましくは、水疱性口内炎ウイルスに感染させ、
（ｉｉ）リコンビナントラブドウイルスの複製を可能にする条件下で、ホスト細胞を培養し、
（ｉｉｉ）リコンビナントラブドウイルスを細胞培養物から収集し、
（ｉｖ）場合により、ウイルス収集物を酵素、好ましくは、ベンゾナーゼで処理し、
（ｖ）カチオン交換モノリス膜吸着材又は樹脂にロードすることにより、ウイルス収集物を捕捉し、続けて、溶出し、
（ｖｉ）工程（ｖ）の溶出液をサイズ排除、多峰性サイズ排除／イオン交換又は接線流ろ過に供することにより、ラブドウイルスを洗練し、
（ｖｉｉ）洗練されたラブドウイルスを限外ろ過／透析ろ過により、バッファー交換し、
（ｖｉｉｉ）ラブドウイルスを無菌ろ過する、方法を提供する。
第９の態様に関する一実施態様では、ホスト細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。
第９の態様に関する一実施態様では、ホスト細胞が、懸濁液中で培養される。
第９の態様に関する一実施態様では、リコンビナントラブドウイルスが、医薬組成物に製剤化される。好ましい実施態様では、第１の態様のリコンビナントラブドウイルス若しくはその実施態様のいずれか又は第２の態様のリコンビナント水疱性口内炎ウイルス若しくはその実施態様のいずれかが、医薬組成物に製剤化される。
図１：抗原提示細胞（ＡＰＣ）とＴ細胞との間の免疫学的シナプス及び成分の摸試気図。ＣＤ８０は、Ｔ細胞活性化中の重要な共刺激分子である。効率的なＴ細胞刺激には、免疫学的シナプス内で２つの収束分子シグナルが必要である。シグナル１：抗原特異的（ＴＣＲ：ＭＨＣ／ペプチド）及びシグナル２：抗原非依存性（ＣＤ２８：ＣＤ８０）。 図２：ＣＤ８０細胞外ドメイン（ＥＣＤ）Ｆｃ融合タンパク質（二価）のカートン。融合タンパク質は、ウイルス感染後にトランスダクションされた腫瘍細胞中で発現される。２つのＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合単量体同士は、各単量体中のシステイン残基間に形成されるジスルフィド結合により共有結合し、それにより、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質二量体を形成する。 図３Ａ～図３Ｂ：親ウイルスＶＳＶ－ＧＰに対するＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃの複製（Ａ）及び生存率（Ｂ）を比較した。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞をＶＳＶ－ＧＰ又はＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃのいずれかに感染させた。Ｙ軸は、％ 細胞生存率又は１ml当たりのゲノムコピー数を示す。細胞生存率及び複製の両方を感染後４８時間までモニターした（ｘ軸：感染後の時間）。 図４：ＶＳＶ－ＧＰ又はＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃに、それぞれ１の多重感染度（ＭＯＩ １）で感染させたＨＥＫ２９３細胞からの組織培養上清中のＥＬＩＳＡによる可溶性ＣＤ８０－Ｆｃ検出。ＣＤ８０－Ｆｃ発現（ｙ軸 μg/ml）を感染後の異なる時点で４８時間まで（ｘ軸）測定した。 図５Ａ～図５Ｂ：ＣＴ２６．ＣＬ２５－ＩＦＮＡＲＫＯ腫瘍モデル（ｉ．ｖ．）を使用して親ウイルスＶＳＶ－ＧＰと比較した、ＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃで処置されたマウスのｉｎ ｖｉｖｏでの有効性（Ａ）及び体重経過（Ｂ）。（Ａ）マウスを０日目及び３日目に、２×１０７ ＴＣＩＤ５０の低ウイルス用量で処置した。Ｘ軸は、時間（日）を示し、ｙ軸は、生存したマウスの割合を示す。 （Ｂ）図６Ａに示されたのと同じ処置マウスの体重経過を示す。Ｘ軸は、時間（日）を示し、ｙ軸は、体重（ｇ）を示す。 図６Ａ～図６Ｃ：Ｂ１６－Ｆ１－ＯＶＡ腫瘍モデル（ｉ．ｔ．）を使用して、０日目及び３日目に１０８ ＴＣＩＤ５０のＶＳＶ－ＧＰ（Ｂ）のウイルス用量、同じウイルス用量のＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃ（Ｃ）又はＰＢＳ（Ａ）で処置されたマウスにおける、親ウイルスＶＳＶ－ＧＰと比較したＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃのｉｎ ｖｉｖｏでの有効性。Ｘ軸は、処置後の日数（日）を示し、ｙ軸は、腫瘍体積（cm3）を示す。 図７Ａ～図７Ｂ：ＥＭＴ－６腫瘍モデル（ｉ．ｔ．）を使用して、０日目及び３日目に２×１０７ＴＣＩＤ５０の低ウイルス用量で処置されたマウス（Ｂ）における、親ウイルスＶＳＶ－ＧＰ（Ａ）と比較したＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃのｉｎ ｖｉｖｏでの有効性。Ｘ軸は、置後の日数（日）を示し、ｙ軸は、腫瘍体積（cm3）を示す。点線は、媒体で処置されたマウスを表わし、実線は、ウイルスで処置されたマウスを表わす。 図８：感染後３日目及び７日目にｑＰＣＲを使用したウイルスゲノムコピー定量化により決定された、処置マウスから収集された感染ＣＴ２６．ＣＬ２５－ＩＦＮＡＲＫＯ腫瘍内のＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃ複製。マウスをＰＢＳ又は１０８ＴＣＩＤ５０のＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃのいずれかで処置し、腫瘍当たりのウイルスゲノムコピー数（ｙ軸）を３日後又は７日間後のぞれぞれで決定した。 図９：処置マウスから収集された対照、ＶＳＶ－ＧＰ又はＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃ感染ＬＬＣ－ＩＦＮＡＲＫＯ腫瘍におけるＶＳＶ－ＧＰ Ｎタンパク質及びＣＤ８０－Ｆｃ転写物のNanoStringベースの測定。マウスを対照として使用するか又は１０８ＴＣＩＤ５０のＶＳＶ－ＧＰ若しくはＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃで処置するかのいずれかをし、ウイルスＮタンパク質又はＣＤ８０－Ｆｃの相対発現（ｙ軸）を３日間後に決定した。 図１０：処置マウスから収集された対照、ＶＳＶ－ＧＰ又はＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃ感染ＬＬＣ－ＩＦＮＡＲＫＯ腫瘍におけるＶＳＶ－ＧＰ Ｎタンパク質及びＣＤ８０－Ｆｃカーゴ（タンパク質）のＩＨＣベースの検出。マウスを図９におけるように処置し、ＩＨＣを、処置後３日目に標準的なプロトコールを使用して行った。 図１１Ａ～図１１Ｃ：腫瘍におけるＣＤ８０－Ｆｃ作用様式（ＭｏＡ）を示すカートン。効率的なＴ細胞共刺激を提供する成熟した活性化ＤＣを伴う炎症性腫瘍（Ａ）。 ＤＣを欠きかつ／又は未成熟寛容原性ＤＣサブセットが優勢な非炎症性腫瘍（Ｂ）。 ＤＣ又は未成熟寛容原性ＤＣサブセットの非存在により、不良なＴ細胞免疫、クローン性アネルギー、Ｔ細胞機能不全及び細胞死がもたらされる。強力なＴ細胞共刺激の欠如を補償することにより非炎症性腫瘍を炎症性腫瘍に変換するＣＤ８０－Ｆｃ（Ｃ）。 図１２：リコンビナントＣＤ８０－ＦｃによるＴ細胞共刺激を評価するために、ヒト混合白血球培養物（２名の遺伝的に異なる個体由来のＴ細胞及び未成熟樹状細胞を共培養し、同種異系Ｔ細胞刺激をもたらす）を使用した。この目的で、培養物を、ＩＦＮγ分泌を読み取りとして使用して、漸増量のリコンビナントＣＤ８０－Ｆｃタンパク質で刺激した。 図１３Ａ～図１３Ｄ：ヒト混合白血球培養物（２名の遺伝的に異なる個体由来のＴ細胞及び単球を共培養する）を、ＩＦＮγ分泌を読み取りとして使用して、ＦｃγＲ遮断剤を添加して又は添加せずに（かつヒト血清の非存在下で）、コンビナントＣＤ８０－Ｆｃタンパク質（１０μg/ml）で刺激した。種々の部分図（Ａ～Ｄ）に、異なるドナーペアを示す。 種々の部分図（Ａ～Ｄ）に、異なるドナーペアを示す。 種々の部分図（Ａ～Ｄ）に、異なるドナーペアを示す。 種々の部分図（Ａ～Ｄ）に、異なるドナーペアを示す。 図１４Ａ～図１４Ｆ：ヒトＰＢＭＣ培養物を、低用量の抗ＣＤ３の有無及び漸増濃度のリコンビナントＣＤ８０－Ｆｃタンパク質（Ｆ（ａｂ）２（Ａ、Ｄ）、Ｆｃ＝ＩｇＧ４（Ｂ、Ｅ）又はＦｃ＝ＩｇＧ１（Ｃ、Ｆ））により刺激し、読み取りとしてＩＦＮγ（Ａ～Ｃ）又はＩＬ２（Ｄ～Ｆ）分泌を測定した。読み取りを上清の標準的なＥＬＩＳＡにより検出した。 図１５：感染後７日目の対照又はＶＳＶ－ＧＰ感染ＬＬＣ１－ＩＦＮＡＲＫＯ腫瘍におけるＦｃγＲのNanoStringベースの測定。マウスを未処置のまま又は１０８ ＴＣＩＤ５０のＶＳＶ－ＧＰのウイルス用量で感染させるかのいずれかをした。Ｘ軸は、異なるＦｃγＲ（１、２ｂ、３又は４）についての測定値を示し、Ｙ軸は、７日後の相対発現を示す。 図１６Ａ～図１６Ｃ：ＶＳＶ－ＧＰ－ｍＣＤ８０－Ｆｃ対ＶＳＶ－ＧＰによる腫瘍特異的Ｔ細胞誘引の改善を、ＥＬＩＳＰＯＴ及び四量体染色を使用して、ＣＴ２６．ＣＬ２５－ＩＦＮＡＲＫＯ腫瘍保有マウスにおいて決定した。ｇｐ７０特異的α－腫瘍－Ｔ細胞は、ＶＳＶ－ＧＰ－ｍＣＤ８０－Ｆｃ対ＶＳＶ－ＧＰ処置マウスの脾臓において増加する。白の記号は、ｉ．ｖ．処置を表わす。黒の記号は、ｉ．ｖ．／ｉ．ｔ．処置を表わす。（Ａ）ＥＬＩＳＰＯＴによる脾臓からの又は（Ｂ）Dextramerによる血液からのｇｐ７０特異的Ｔ細胞の検出。 （Ｃ）実験概要。 図１７：発光に基づく読み出し：共培養Ｊｕｒｋａｔ ＰＤ－１レポーター細胞及びＣＨＯ－Ｋ１－α－ＣＤ３／－ＰＤＬ１。抗ＰＤＬ１抗体アベルマブとは対照的に、ＣＤ８０－Ｆｃは、Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞系統のＰＤ１：ＰＤＬ１媒介性サプレッションを妨げることができない。 図１８Ａ～図１８Ｂ：レポーター細胞アッセイ：ＴＨＰ－１－ＰＤＬ１細胞（ＦｃγＲを発現する）と共培養されたＪｕｒｋａｔ－ＰＤ１（ルシフェラーゼレポーター細胞）。Ｔ細胞活性化をこの系においてCD33×CD3 BiTE（１０nM）により誘発する。（Ａ）示された濃度での示された試薬（抗ＰＤ１＝ペンブロリズマブ；抗Ｄｉｇ＝アイソタイプ対照及びリコンビナントＣＤ８０－Ｆｃ）による処理。（Ｂ）抗ＰＤ１（１０nM）及び漸増濃度のリコンビナントＣＤ８０－Ｆｃにより、個々の化合物の活性を超えてＪｕｒｋａｔＴ細胞活性化が改善される。 図１９Ａ～図１９Ｃ：ＣＴ２６．ＣＬ２５－ＩＦＮＡＲＫＯ腫瘍モデル（ｉ．ｖ．）を使用して、ＶＳＶ－ＧＰ－ｍｕＣＤ８０－Ｆｃ、親ウイルスＶＳＶ－ＧＰ及びリコンビナントマウスＣＤ８０－Ｆｃで処置されたマウスのｉｎ ｖｉｖｏでの有効性（Ａ）、腫瘍成長曲線（Ｂ）及び体重変化（Ｃ）。（Ａ）マウスを０日目及び３日目に１×１０８ＴＣＩＤ５０のウイルス用量と、０日目、３日目及び６日目に１mg/kg リコンビナントマウスＣＤ８０－Ｆｃとのぞれぞれで処置した。ｘ軸は、時間（日）を示し、ｙ軸は、生存したマウスの割合を示す。（Ｂ）図１９Ａにおけるのと同じ処置マウスの経時的な平均腫瘍体積を示す。ｘ軸は、時間（処置開始後の日数）を示し、ｙ軸は、腫瘍体積（mm3）を示す。データは、群の大きさの７０％に達する（７０％ ＬＯＣＦ）まで、最後の観察が繰り越された群の平均を示す。（Ｃ）図１９Ａにおけるのと同じ処置マウスの体重変化を示す。ｘ軸は、時間（治療開始後の日数）を示し、ｙ軸は、処置開始時の初期体重と比較した体重変化（％）を示す。
発明の詳細な説明
下記詳細な説明では、本発明の完全な理解を提供するために、多数の具体的な詳細が記載される。ただし、主題の技術をこれらの具体的な詳細のうちの幾つかがなくても実施することができることは、当業者には明らかであろう。他の例では、本発明を不明瞭にしないように、周知の構造及び技術は詳細に示されていない。見出しは、読解を助けるために単に便宜上含まれており、本発明を特定の態様又は実施態様に限定すると理解されるべきではない。
ラブドウイルス
ラブドウイルス科は、約１０～１６kbのネガティブセンス一本鎖ＲＮＡゲノムを有する１８属及び１３４種を含む（Walke et al., ICTV Virus Taxonomy Profile: Rhabdoviridae, Journal of General Virology, 99:447-448 (2018)）。
ラブドウイルス科のメンバーの特徴的な特徴は、下記の１つ以上を含む。マトリックス層及び脂質エンベロープにより取り囲まれた螺旋ヌクレオカプシドから構成される、長さ１００～４３０nm及び直径４５～１００nmの弾丸形状又は桿状粒子である。ここで、一部のラブドウイルスは、非エンベロープ繊維状ウイルスを有する。１０．８～１６．１kbのネガティブセンスの一本鎖ＲＮＡは、ほとんどがセグメント化されていない。構造タンパク質である核タンパク質（Ｎ）、大型タンパク質（Ｌ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）及び糖タンパク質（Ｇ）をコードする少なくとも５つの遺伝子をコードするゲノム。
本明細書で使用する場合、ラブドウイルスは、アルメンドラウイルス（ａｌｍｅｎｄｒａｖｉｒｕｓ）、キュリオウイルス（ｃｕｒｉｏｖｉｒｕｓ）、サイトラブドウイルス、ジコールハウイルス（ｄｉｃｈｏｒｈａｖｉｒｕｓ）、エフェメロウイルス、ハパウイルス（Ｈａｐａｖｉｒｕｓ）、レダンテウイルス（ｌｅｄａｎｔｅｖｉｒｕｓ）、リッサウイルス、ノビラドウイルス、ヌクレオラブドウイルス、ペラブドウイルス（ｐｅｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）、シグマウイルス、スプリビウイルス、スリプウイルス（ｓｒｉｐｕｖｉｒｕｓ）、チブロウイルス、ツパウイルス（ｔｕｐａｖｉｒｕｓ）、バリコサウイルス又はベシクロウイルスの属に属する場合がある。
本明細書で言及された属の中で、ラブドウイルスは、列記された種のいずれかに属する場合がある。アルメンドラウイルスの属は、アルボレタムアルメンドラウイルス、バルサアルメンドラウイルス、クーツベイ（Ｃｏｏｔ Ｂａｙ）アルメンドラウイルス、プエルトアルメンドラスアルメンドラウイルス、リオチコアルメンドラウイルスを含む。キュリオウイルスの属は、クイリノポリスキュリオウイルス、イリリキュリオウイルス、イタカイウナスキュリオウイルス、ロシャンボーキュリオウイルスを含む。サイトラブドウイルスの属は、アルファルファ萎縮サイトラブドウイルス、オオムギ黄変萎縮モザイクサイトラブドウイルス、ブロッコリー壊死性黄変サイトラブドウイルス、コロカシアボボーン病（ｂｏｂｏｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ）関連サイトラブドウイルス、Ｆｅｓｔｕｃａ葉条斑サイトラブドウイルス、レタス壊死性黄変サイトラブドウイルス、レタス黄変斑サイトラブドウイルス、北地ムギモザイクサイトラブドウイルス、ノゲシサイトラブドウイルス１、イチゴクリンクルサイトラブドウイルス、アメリカコムギ縞モザイクサイトラブドウイルスを含む。ジコールハウイルスの属は、コーヒーリングスポットジコールハウイルス、ラン壊疽斑紋ジコールハウイルスを含む。エフェメロウイルスの属は、アドレードリバーエフェメロウイルス、ベリーマエフェメロウイルス、ウシ流行熱エフェメロウイルス、キンベリーエフェメロウイルス、クールピニャエフェメロウイルス、コトンカンエフェメロウイルス、オボジアンエフェメロウイルス、ヤタエフェメロウイルスを含む。ハパウイルスの属は、フランダースハパウイルス、グレイロッジハパウイルス、ハートパークハパウイルス、ジョインジャカカハパウイルス、カメセハパウイルス、ラジョヤハパウイルス、ランドジアハパウイルス、マニトバハパウイルス、マルコハパウイルス、モスケイロハパウイルス、モスリルハパウイルス、Ｎｇａｉｎｇａｎハパウイルス、オルドリバーハパウイルス、パリークリークハパウイルス、ウォンガベルハパウイルスを含む。レダンテウイルスの属は、バウアーダンテウイルス、フィキリニレダンテウイルス、フクオカレダンテウイルス、Ｋａｎｙａｗａｒａレダンテウイルス、カーンキャニオンレダンテウイルス、Ｋｅｕｒａｌｉｂａレダンテウイルス、コレンテレダンテウイルス、クマシレダンテウイルス、ルダンテクレダンテウイルス、マウントエルゴンバットレダンテウイルス、ニシムロレダンテウイルス、Ｎｋｏｌｂｉｓｓｏｎレダンテウイルス、オイタレダンテウイルス、ウハンレダンテウイルス、ヨンジアレダンテウイルスを含む。リッサウイルスの属は、アラバンリッサウイルス、オーストラリアバットリッサウイルス、Ｂｏｋｅｌｏｈバットリッサウイルス、Ｄｕｖｅｎｈａｇｅリッサウイルス、ヨーロッパバット１リッサウイルス、ヨーロッパバット２リッサウイルス、ガンノルワバットリッサウイルス、イコマリッサウイルス、イルクートリッサウイルス、ホジェンドリッサウイルス、ラゴスバットリッサウイルス、リエイダバットリッサウイルス、モコラリッサウイルス、狂犬病リッサウイルス、シモニバットリッサウイルス、ウエストカフカスバットリッサウイルスを含む。ノビラブドウイルスの属は、ヒラメノビラブドウイルス、魚ノビラブドウイルス、サケノビラブドウイルス、ライギョノビラブドウイルスを含む。ヌクレオラブドウイルスの属は、ダツラ葉脈黄変ヌクレオラブドウイルス、ナス斑萎縮ヌクレオラブドウイルス、トウモロコシ条斑ヌクレオラブドウイルス、イラントウモロコシモザイクヌクレオラブドウイルス、トウモロコシモザイクヌクレオラブドウイルス、ジャガイモ黄変萎縮ヌクレオラブドウイルス、コメ黄変萎縮ヌクレオラブドウイルス、ノゲシ網状黄変ヌクレオラブドウイルス、ケシアザミ葉脈黄変ヌクレオラブドウイルス、タロイモ葉脈白化ヌクレオラブドウイルスを含む。ペラブドウイルスの属は、ウナギペラブドウイルス、パーチペラブドウイルス、マスペラブドウイルスを含む。シグマウイルスの属は、Drosophila affinisシグマウイルス、Drosophila ananassaeシグマウイルス、Drosophila immigransシグマウイルス、Drosophila melanogasterシグマウイルス、Drosophila obscuraシグマウイルス、Drosophila tristisシグマウイルス、Muscina stabulansシグマウイルスを含む。スプリビウイルスの属は、コイスプリビウイルス、パイク幼魚スプリビウイルスを含む。スリプウイルスの属は、アルンピバースリプウイルス、チャコスリプウイルス、Ｎｉａｋｈａスリプウイルス、セナマドレイラスリプウイルス、Ｓｒｉｐｕｒスリプウイルスを含む。チブロウイルスの属は、中央コンゴチブロウイルス、ベアトリスヒルチブロウイルス、沿岸平地チブロウイルス、Ｅｋｐｏｍａ１チブロウイルス、Ｅｋｐｏｍａ２チブロウイルス、スウィートウォーターブランチチブロウイルス、チブローガーガンチブロウイルスを含む。ツパウイルスの属は、ダラムツパウイルス、クラマスツパウイルス、ツパイツパウイルスを含む。バリコサウイルスの属は、レタスビッグべイン関連バリコサウイルスを含む。ベシクロウイルスの属は、アラゴアスベシクロウイルス、アメリカバットベシクロウイルス、カラジャスベシクロウイルス、カンディプーラベシクロウイルス、球菌ベシクロウイルス、インディアナベシクロウイルス、イスファハンベシクロウイルス、Ｊｕｒｏｎａベシクロウイルス、マルパイススプリングベシクロウイルス、マラバベシクロウイルス、モートンベシクロウイルス、ニュージャージーベシクロウイルス、ペリネットベシクロウイルス、ピリベシクロウイルス、ラーディベシクロウイルス、Ｙｕｇ Ｂｏｇｄａｎｏｖａｃベシクロウイルス又はムサウイルスを含む。
好ましくは、本発明のリコンビナントラブドウイルスは、腫瘍溶解性ラブドウイルスである。この点において、腫瘍溶解性は、当技術分野において公知のその通常の意味を有し、ガン細胞に感染し、ガン細胞を溶解する（分解する）が、正常細胞には感染しない（何ら著しく広がらない）ラブドウイルスの能力を指す。好ましくは、腫瘍溶解性ラブドウイルスは、ガン細胞内で複製可能である。腫瘍溶解活性を当業者に公知の種々のアッセイ系において試験することができる（例示的なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイが、Muik et al., Cancer Res., 74(13), 3567-78, 2014に記載されている）。腫瘍溶解性ラブドウイルスは、特定のタイプのガン細胞のみに感染し、これを溶解することができると理解されたい。また、腫瘍溶解性作用は、ガン細胞のタイプに応じて変化する場合もある。
好ましい実施態様では、ラブドウイルスは、ベシクロウイルスの属に属する。ベシクロウイルス種は、主に、ゲノムの系統発生分析と組み合わせた血清学的手段により定義されている。生物学的特徴、例えば、ホストの範囲及び伝播のメカニズムも、この属内のウイルス種を区別するのに使用される。このように、ベシクロウイルスの属は、完全なＬ配列から推測される最尤樹により十分に支持される、別個の単系統群を形成する。
ベシクロウイルス属内の異なる種に割り当てられたウイルスは、下記特徴のうちの１つ以上を有する場合がある。Ａ）Ｌにおける２０％の最小アミノ酸配列多様性；Ｂ）Ｎにおける１０％の最小アミノ酸配列多様性；Ｃ）Ｇにおける１５％の最小アミノ酸配列多様性；Ｄ）血清学的試験において区別することができること及びＥ）ホスト及び／又は節足動物ベクターにおける差異により証明されるように、異なる生態学的ニッチを占めること。
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、特に、ＶＳＶ－ＧＰ（ＬＣＭＶのＧＰによりリコンビナントである）が好ましい。ＶＳＶ－ＧＰの有利な特性は、下記のうちの１つ以上を含む：非常に強力で速い殺傷性を有すること（８時間以内）；腫瘍溶解性ウイルス；全身への適用可能；向神経性／神経毒性が低いこと；溶解的に再現すること及び免疫原性細胞の死を誘引すること；インターフェロン（ＩＦＮ）応答のために健康なヒト細胞において複製しないこと；自然免疫の強力な活性化；免疫モデュラトリーカーゴ及び抗原のための約３kbの空き；リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）由来のアレナウイルス糖タンパク質によりリコンビナントであること；野生型ＶＳＶ（ＶＳＶ－Ｇ）と比較して、神経毒性の低下並びに中和抗体応答及び補体破壊に対する感受性が低いという点で好ましい安全性特徴；抗ウイルス自然免疫応答（例えば、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達）を開始し、応答する能力を失った腫瘍細胞において特異的に複製すること；「健康な細胞」では複製できず、そのため、正常な組織から速やかに排除されること；腫瘍細胞におけるウイルス複製により免疫原性細胞死が誘引され、腫瘍関連抗原が放出され、局所炎症が引き起こされ、抗腫瘍免疫が誘引されること。
本発明は、そのゲノム中で少なくとも水疱性口内炎ウイルスの核タンパク質（Ｎ）、大型タンパク質（Ｌ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）及び少なくとも１種のＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質又はその機能的変異体（好ましくは、ヒトＣＤ８０細胞外ドメインを含む）をコードするリコンビナント水疱性口内炎ウイルスにより更に具体化される。
好ましい実施態様では、リコンビナント水疱性口内炎ウイルスは、そのゲノム中で少なくとも、配列番号：７に記載されたアミノ酸配列又は配列番号：７と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の機能的変異体を含む水疱性口内炎ウイルスの核タンパク質（Ｎ）、配列番号：８に記載されたアミノ酸配列又は配列番号：８と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の機能的変異体を含むリンタンパク質（Ｐ）、配列番号：９に記載されたアミノ酸配列又は配列番号：９と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の機能的変異体を含む大型タンパク質（Ｌ）及び配列番号：１０に記載されたアミノ酸配列又は配列番号：１０と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の機能的変異体を含むマトリックスタンパク質（Ｍ）をコードする。
水疱性口内炎ウイルスの核タンパク質（Ｎ）、大型タンパク質（Ｌ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）又は糖タンパク質（Ｇ）の配列に対する修飾を、これらのタンパク質の基本的な機能を失うことなく行うことができることが当業者により理解される。本明細書で使用する場合、このような機能的変異体は、それらの基本的な機能又は活性の全部又は一部を保持する。タンパク質Ｌは、例えば、ポリメラーゼであり、ウイルスの転写及び複製中に必須の機能を有する。その機能的変異体は、この能力の少なくとも一部を保持しなければならない。基本的な機能性又は活性の保持についての良好な指標は、依然として複製可能でありかつ腫瘍細胞に感染可能であるこれらの機能的変異体を含むウイルスの産生の成功である。ウイルスの産生並びに腫瘍細胞への感染及び腫瘍細胞における複製についての試験を当業者に公知の種々のアッセイ系において試験することができる（例示的なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイが、Muik et al., Cancer Res., 74(13), 3567-78, 2014に記載されている）。
好ましい実施態様では、リコンビナント水疱性口内炎ウイルスは、そのゲノム中で少なくとも水疱性口内炎ウイルスの核タンパク質（Ｎ）、大型タンパク質（Ｌ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）及び少なくとも１種のＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質又はその機能的変異体をコードし、ここで、大型タンパク質（Ｌ）は、配列番号：９の８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
好ましい実施態様では、リコンビナント水疱性口内炎ウイルスは、そのゲノム中で少なくとも水疱性口内炎ウイルスの核タンパク質（Ｎ）、大型タンパク質（Ｌ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）及び少なくとも１種のＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質又はその機能的変異体をコードし、ここで、核タンパク質（Ｎ）は、配列番号：７の９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
更に好ましい実施態様では、リコンビナント水疱性口内炎ウイルスは、そのゲノム中で少なくとも水疱性口内炎ウイルスの核タンパク質（Ｎ）、大型タンパク質（Ｌ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）及び少なくとも１種のＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質又はその機能的変異体をコードし、ここで、大型タンパク質（Ｌ）は、配列番号：９の８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、核タンパク質（Ｎ）は、配列番号：７の９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明の好ましい実施態様では、本発明のリコンビナントラブドウイルスのＲＮＡゲノムは、配列番号：２４に示された配列を含むか又はこれからなる。更に、本発明のリコンビナントラブドウイルスのＲＮＡゲノムは、ＲＮＡゲノムの核酸が各アミノ酸配列の変更をもたらすことなく、遺伝コードの変性に従って交換されたような配列からなるか又はそのような配列を含むこともできる。更に好ましい実施態様では、本発明のリコンビナントラブドウイルスのＲＮＡゲノムは、配列番号：２４と同一又は少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のコード配列を含むか又はこれからなる。
本発明のリコンビナントラブドウイルスは、そのゲノム中で更なるカーゴ、例えば、腫瘍抗原、更なるケモカイン、サイトカイン又は他の免疫モデュラトリーエレメントをコードすることができると理解されたい。
更なる実施態様では、本発明のリコンビナントラブドウイルスは、そのゲノム中でヨウ化ナトリウム共輸送体タンパク質（ＮＩＳ）を更にコードする。ＮＩＳの発現及び例えば、１２５Ｉとの共インキュベーションにより、撮像レポーターとしてのＮＩＳの使用が可能となる（Carlson et al., Current Gene Therapy, 12, 33-47, 2012）。
リコンビナントラブドウイルス
ある種の野生型ラブドウイルス系統、例えば、野生型ＶＳＶ系統は、神経毒性であると考えられることが公知である。また、感染した個体は、主に糖、タンパク質に対する高い抗体力価で、強力な体液性応答を速やかに開始することが可能であることも報告されている。一般的にはラブドウイルス及び具体的にはＶＳＶの糖タンパク質Ｇをターゲットとする中和抗体は、ウイルス拡散を制限し、それにより、ウイルス再感染からの個体の防御を媒介することが可能である。しかしながら、ウイルス中和のために、ガン患者へのラブドウイルスの反復適用が制限される。
これらの欠点を排除するために、ラブドウイルスの野生型糖タンパク質Ｇを別のウイルス由来の糖タンパク質により置き換えることができる。この点において、糖タンパク質を置き換えることは、（ｉ）野生型糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子を別のウイルスの糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子により置き換えること及び／又は（ｉｉ）野生型糖タンパク質Ｇを別のウイルスの糖タンパク質ＧＰにより置き換えることを指す。
好ましい実施態様では、ラブドウイルスの糖タンパク質Ｇは、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰ、好ましくは、ＷＥ－ＨＰＩ系統により置き換えられている。更により好ましい実施態様では、ラブドウイルスは、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰ、好ましくは、ＷＥ－ＨＰＩ系統を有する水疱性口内炎ウイルスである。このようなＶＳＶは、例えば、国際公開第２０１０／０４０５２６号に記載されており、ＶＳＶ－ＧＰと名付けられている。提供される利点は、（ｉ）ＶＳＶ－Ｇ媒介性神経毒性が無くなること及び（ｉｉ）抗体によるベクター中和が無くなること（マウスで示されている）である。
リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰは、ＧＰ１又はＧＰ２であることができる。本発明は、種々のＬＣＭＶ系統由来の糖タンパク質を含む。特に、ＬＣＭＶ－ＧＰは、ＬＣＭＶ野生型又はＬＣＭＶ系統ＬＣＭＶ－ＷＥ、ＬＣＭＶ－ＷＥ－ＨＰＩ、ＬＣＭＶ－ＷＥ－ＨＰｌ ｏｐｔに由来することができる。好ましい実施態様では、ＬＣＭＶの糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子は、配列番号：１１に示されるアミノ酸配列又は配列番号：１１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、一方、配列番号：１１に示されるアミノ酸配列をコードする糖タンパク質ＧＰを含むリコンビナントラブドウイルスの機能的特性は維持される。
別の実施態様では、リコンビナントラブドウイルスの糖タンパク質Ｇは、ダンデノングウイルス（ＤＡＮＤＶ）又はモペイア（ＭＯＰＶ）ウイルスの糖タンパク質ＧＰにより置き換えられている。より好ましい実施態様では、リコンビナントラブドウイルスは、糖タンパク質Ｇがダンデノングウイルス（ＤＡＮＤＶ）又はモペイア（ＭＯＰＶ）ウイルスの糖タンパク質ＧＰにより置き換えられている水疱性口内炎ウイルスである。提供される利点は、（ｉ）ＶＳＶ－Ｇ媒介性神経毒性が無くなること及び（ｉｉ）抗体によるベクター中和が無くなること（マウスで示されている）である。
ダンデノングウイルス（ＤＡＮＤＶ）は、旧世界のアレナウイルスである。今日では、糖タンパク質ＧＰを含み、本発明のリコンビナントラブドウイルスに含まれる糖タンパク質ＧＰのドナーとして本発明内で利用することができる、当業者に公知の単一の系統のみが存在する。本発明のリコンビナントラブドウイルスに含まれるＤＡＮＤＶの糖タンパク質ＧＰは、７つ以上のグリコシル化部位、特に、７つのグリコシル化部位を有する。例示的な好ましい糖タンパク質ＧＰは、Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＥＵ１３６０３８でアクセス可能なＤＡＮＤＶに含まれるものである。一実施態様では、ＤＡＮＤＶの糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子は、配列番号：１２に示されるアミノ酸配列又は配列番号：１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する配列をコードし、一方、配列番号：１２に示されるアミノ酸配列をコードする糖タンパク質ＧＰを含むリコンビナントラブドウイルスの機能的特性は維持される。
モペイアウイルス（ＭＯＰＶ）は、旧世界のアレナウイルスである。糖タンパク質ＧＰを含み、本発明のリコンビナントラブドウイルスに含まれる糖タンパク質ＧＰのドナーとして本発明内で利用することができる、当業者に公知の複数の系統が存在する。本発明のリコンビナントラブドウイルスに含まれるＭＯＰＶの糖タンパク質ＧＰは、７つ以上のグリコシル化部位、特に、７つのグリコシル化部位を有する。例示的な好ましい糖タンパク質ＧＰは、Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＡＹ７７２１７０でアクセス可能なモペイアウイルスに含まれるものである。一実施態様では、ＭＯＰＶの糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子は、配列番号：１３に示されるアミノ酸配列又は配列番号：１３のアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する配列をコードし、一方、配列番号：１３に示されるアミノ酸配列をコードする糖タンパク質ＧＰを含むリコンビナントラブドウイルスの機能的特性は維持される。
ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質
Ｂ７－１としても公知のＣＤ８０は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する６０kDの一本鎖Ｉ型糖タンパク質である。ＣＤ８０は、活性化／成熟抗原提示細胞、例えば、樹状細胞上で発現される。ＣＤ８０は、ＣＤ２８及びＣＤ１５２（ＣＴＬＡ－４）に結合する。ＣＤ８６（Ｂ７－２）と共に、ＣＤ８０は、Ｔ細胞活性化のレギュレーションにおいて重要な役割を果たす。ＣＤ８０とＣＤ２８との相互作用により、ＴＣＲ結合の複合体におけるＴ細胞活性化のための共刺激シグナルが提供される。そのＣＴＬＡ－４との相互作用（例えば、レギュラトリーＴ細胞上で発現される）は、ＣＤ２８よりＣＤ８０に対して高い親和性を有し、サプレッションシグナル伝達レセプターとして機能するのではなく、ＣＤ８０に対するデコイレセプターとして作用し、Ｔ細胞から重要な共刺激性ＣＤ２８シグナルを奪う。
過去において、腫瘍溶解性ウイルス、特に、ＶＳＶ－ＧＰは、腫瘍微小環境における免疫原性細胞死及び自然免疫細胞の刺激と組み合わせて、腫瘍細胞溶解を誘引することができることが提案された。免疫モデュラトリータンパク質を腫瘍溶解性ウイルスのゲノムにコードすることができること及び前記免疫モデュラトリータンパク質の発現が、局所免疫刺激活性によるウイルスの腫瘍溶解効果を支持することができることが更に提案された。
ウイルス骨格からの免疫促進分子、例えば、ケモカイン及び／又はサイトカインを発現させる課題の１つは、抗腫瘍免疫の増強が達成されなければならないだけでなく、同時に、免疫促進分子による抗ウイルス免疫応答が回避されるべきであることである。追加の免疫促進分子は、治療用カーゴの発現により得られる潜在的な利益が腫瘍溶解能の喪失により覆される程度まで、ウイルスの腫瘍溶解能を制限しないことに注意しなければならない。
本発明者らは、一方で、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質がＴ細胞レセプター結合との関連で効率的なＴ細胞共刺激を提供することができ、他方で、早期段階でウイルス複製及び／又は持続を制限するであろうナチュラルキラー細胞（例えば、ＩＬ２、ＩＬ１５、ＣＤ１３７により活性化される）を活性化しないであろうと仮定した。ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質は、抗原特異的Ｔ細胞のプライミング及び再活性化において活性であり、強力な共刺激分子である。この刺激は、Ｔ細胞共刺激シグナルが多くの場合、腫瘍において過少発現され、これにより、クローン性Ｔ細胞アネルギー、エフェクター機能の喪失及びＴ細胞死がもたらされるために重要である。
本発明のリコンビナントラブドウイルスを提供することにより、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質の腫瘍制限複製によって、Ｔ細胞共刺激融合タンパク質の局所発現をもたらすことができ、これにより、ＦｃγＲ依存的な様式でＴ細胞レセプター結合（例えば、腫瘍細胞認識）との関連でＴ細胞に活性化シグナルを提供することによって、抗腫瘍Ｔ細胞免疫が更に増強される。
本発明者らは、驚くべきことに、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質をコードする本発明のリコンビナントラブドウイルスが腫瘍微小環境における免疫原性細胞死及び自然免疫細胞の刺激と組み合わせて、腫瘍細胞溶解を誘引可能であることを見出した。更に、長期生存率は、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質で武装化されたこのようなリコンビナントラブドウイルスで処置された、確立されたマウス腫瘍モデルにおいて観察された。
予想外に、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質をコードする本発明のリコンビナントラブドウイルスによる感染により、感染腫瘍内でのＦｃγＲ発現の強力な増加がもたらされる。本発明者らは、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質の最適な生体活性がＦｃγＲに強く依存することを示した。
理論に拘束されることを望むものではないが、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質をコードする本発明のリコンビナントラブドウイルスにより得られる強力な抗腫瘍効果は、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質のＦｃγＲ依存性活性に少なくとも部分的に基づいており、この活性は、本発明のリコンビナントラブドウイルスによる感染後の感染腫瘍におけるＦｃγＲの発現の増加により増強されると考えられる。
代替的には、この文脈において、ＣＤ８６（Ｂ７－２）融合タンパク質、すなわち、ＣＤ８６細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質をコードするリコンビナントラブドウイルス、特に、ＣＤ８６細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質をコードするＶＳＶ－ＧＰの提供も企図され、ここで、リコンビナント水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子は、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子により置き換えられておりかつ／又は糖タンパク質Ｇは、ＬＣＭＶの糖タンパク質ＧＰにより置き換えられている。
本明細書で使用する場合、「ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質」は、ＩｇＧのＦｃドメインに融合されるＣＤ８０細胞外ドメインを含むか又はそれからなる融合タンパク質又はその機能的変異体を指す。
「ＣＤ８０細胞外ドメイン」は、天然のポリペプチド、例えば、種々のアイソフォーム及びその機能的変異体、好ましくは、ヒトＣＤ８０細胞外ドメインを含むか又はそれらからなる。
一態様では、そのゲノム中で少なくとも１種のＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質又はその機能的変異体をコードするリコンビナントラブドウイルスは、腫瘍環境へのＴ細胞及び樹状細胞のリクルートを増強可能である。
別の態様では、リコンビナントラブドウイルスのゲノムからの少なくとも１種のＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質又はその機能的変異体の発現により、非炎症性腫瘍を有する患者のための治療選択肢が提供され、低免疫原性腫瘍に対するＴ細胞媒介性抗腫瘍Ｔ細胞応答を増強するための低い突然変異負荷が提供される。
別の態様では、リコンビナントラブドウイルスのゲノムからの少なくとも１種のＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質又はその機能的変異体の発現により、（親ＶＳＶ－ＧＰウイルスの効果を超えて）更なるナチュラルキラー細胞が誘引されず、抗原特異的Ｔ細胞が選択的に活性化される。
別の態様では、リコンビナントラブドウイルスのゲノムからの少なくとも１種のＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質又はその機能的変異体の発現により、スーパーアゴニズムが誘引されない。
別の態様では、リコンビナントラブドウイルスのゲノムからの少なくとも１種のＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質又はその機能的変異体の発現により、リコンビナントラブドウイルスに対する初期抗ウイルス免疫が増大しない。
更に別の態様では、その溶解性に起因する腫瘍における局所発現に加えて、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質は、腫瘍流入リンパ管（例えば、リンパ節）に到達する場合もある。
ヒトＣＤ８０タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－３３６８１｜ＣＤ８０＿ＨＵＭＡＮ Ｔリンパ球活性化抗原ＣＤ８０）は、全部で２８８個のアミノ酸を含むか又はこれからなり、シグナルペプチド、細胞外ドメイン及び膜貫通／トポロジードメインを含有する。
Figure 0007565384000001
一実施態様では、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質のＣＤ８０細胞外ドメインは、配列番号：６のアミノ酸１～２４２を含むか若しくはこれからなるか又は配列番号：６のアミノ酸１～２４２と少なくとも７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する。
別の実施態様では、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質のＣＤ８０細胞外ドメインは、下記配列：
Figure 0007565384000002
又は配列番号：１と少なくとも７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含むか又はこれからなる。
一実施態様では、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質は、シグナルペプチド配列を含む。別の実施態様では、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合体は、シグナルペプチド配列を含まない。
「シグナルペプチド」又は「シグナルペプチド配列」という用語は、通常、長さが１０～３０個のアミノ酸であり、新たに合成された分泌ポリペプチド又は膜ポリペプチドのＮ末端に存在し、ポリペプチドを、細胞の細胞膜（原核生物における原形質膜及び真核生物の小胞体膜）を横切らせ又はその中に方向付けるペプチド配列を説明する。それは、通常、その後除去される。特に、シグナルペプチドは、ポリペプチドを細胞の分泌経路に方向付けることが可能である場合がある。
本発明について、他の（すなわち、野生型以外の）シグナルペプチド配列をＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質と共に使用することができると理解されたい。このような他のシグナルペプチド配列で、元の野生型シグナルペプチド配列を置き換えることができる。シグナルペプチドは、リボソーム中の新たに合成されたタンパク質をＥＲに、更に、ゴルジ複合体に向かわせ、原形質膜へ又は細胞外へ輸送するペプチドを含む。それらは、一般的には、一連の疎水性アミノ酸を含み、免疫グロブリンリーダー配列及び当業者に公知の他の配列を含む。シグナルペプチドは、特に、小胞体の槽面に位置する特定のプロテアーゼであるシグナルペプチダーゼにより作用され得るペプチドを含む。シグナルペプチドは、当業者に十分理解されており、任意の公知のシグナルペプチドを含むことができる。シグナルペプチドは、タンパク質のＮ末端に組み込まれ、シグナルペプチダーゼによるＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質のプロセシングにより、活性な生物学的形態を生じる。
一実施態様では、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質は、野生型ＣＤ８０シグナルペプチド配列を含む。好ましい実施態様では、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質は、配列番号：６のアミノ酸１～３４である野生型ヒトＣＤ８０シグナルペプチド配列又は配列番号：６のアミノ酸１～３４と少なくとも７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む。
別の実施態様では、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質は、下記配列：
MGWSCIILFLVATATGVHS（配列番号：５）
を有するシグナルペプチド配列又は配列番号：５と少なくとも７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するシグナルペプチド配列を含む。
関連する実施態様では、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質のＣＤ８０細胞外ドメインは、配列番号：１又は配列番号：１と少なくとも７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含むか又はこれからなり、配列番号：５のシグナルペプチド配列又は配列番号：５と少なくとも７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するシグナルペプチド配列を更に含む。
また、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質は、切断型シグナルペプチド配列を有する融合タンパク質を含むこともできる。この文脈において、切断型は、元のシグナルペプチド配列より短いが、シグナルペプチドとして作用するその機能の少なくとも一部を依然として保持するシグナルペプチド配列を指す。例えば、ヒトＣＤ８０シグナルペプチド配列は、配列番号：６のアミノ酸１～３４を含むか又はこれからなる。切断型シグナルペプチド配列を有するＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質は、配列番号：６のアミノ酸１～３４のうちの３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１個を有することができる。更なる例では、シグナルペプチドは、配列番号：５に示される配列を含むか又はこれからなることができる。切断型シグナルペプチド配列を有するＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質は、配列番号：５のアミノ酸１～１８のうちの１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１個を有することができる。
また、切断型シグナルペプチド配列を有するＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質は、配列番号：１又は配列番号：１と少なくとも７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含むタンパク質であることもでき、加えて、元のシグナルペプチド配列より短いシグナルペプチド配列であることもできる。再度、例として、シグナルペプチド配列は、配列番号：６のアミノ酸１～３４のうちの３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２若しくは１個を有することができ又は更なる例において、シグナルペプチドは、配列番号：５に示される配列を含むか又はこれからなることができる。切断型シグナルペプチド配列を有するＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質は、配列番号：５のアミノ酸１～１８のうちの１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１個を有することができる。
ＣＤ８０細胞外ドメインは、マウス及びラット由来を含む任意の起源のものであることができる。好ましくは、ＣＤ８０細胞外ドメインタンパク質は、ヒト起源のものである。
ＩｇＧのＦｃドメインは、ＣＤ８０細胞外ドメインのＮ末端若しくはＣ末端部分に又は内部の位置で共有結合的に融合していることができる。一部の実施態様では、ＩｇＧ分子のＦｃドメインは、リンカーペプチド、例えば、ＧＳリンカーを介して、ＣＤ８０細胞外ドメインに融合していることができる。好ましくは、Ｆｃドメインは、ＣＤ８０細胞外ドメインのＣ末端部分に融合している。
一部の実施態様では、Ｆｃドメインは、野生型配列を有する。他の実施態様では、Ｆｃドメインは、天然又は操作された変異体のいずれかである。一部の実施態様では、Ｆｃドメインは、その野生型配列と比較して、１つ以上の突然変異、置換及び／又は欠失を含む。一部の実施態様では、Ｆｃと１種以上のＦｃガンマレセプター（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ）との相互作用が変化したＦｃドメインが選択される。好ましくは、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来する。より好ましくは、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１に由来する。
好ましい実施態様では、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質のＦｃドメインは、下記配列：
Figure 0007565384000003
又は配列番号：２と少なくとも７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含むか又はこれからなる。
好ましい実施態様では、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質は、下記配列：
Figure 0007565384000004
又は配列番号：４と少なくとも７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含むか又はこれからなる。
更に好ましい実施態様では、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質は、ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＣＤ８０細胞外ドメインを含むか又はこれからなり、ここで、ＣＤ８０細胞外ドメインは、配列番号：４のアミノ酸１～２０７を含むか若しくはこれからなるか又は配列番号：４のアミノ酸１～２０７と少なくとも７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有し、Ｆｃドメインは、配列番号：４のアミノ酸２０８～４３３を含むか若しくはこれからなるか又は配列番号：４のアミノ酸２０８～４３３と少なくとも７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する。
更に好ましい実施態様では、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質は、下記配列：
Figure 0007565384000005
又は配列番号：３と少なくとも７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含むか又はこれからなる。
本明細書で使用する場合、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈における「同一」又は「％ 同一性」という用語は、最大の対応について比較し、アライメントさせた場合、同じであるか又は特定の割合の同じヌクレオチド若しくはアミノ酸残基を有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。％ 同一性を決定するために、配列を最適な比較目的でアラインメントする（例えば、ギャップを、第２のアミノ酸又は核酸配列との最適なアラインメントのために、第１のアミノ酸又は核酸配列の配列に導入することができる）。ついで、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドにより占められる場合には、それらの分子は、その位置で同一である。２つの配列間の％ 同一性は、配列により共有される同一位置の数の関数である（すなわち、％ 同一性＝同一位置の数／位置の総数（例えば、重複する位置）×１００）。一部の実施態様では、比較される２つの配列は、必要に応じて、ギャップを配列内に導入した後、同じ長さである（例えば、比較される配列を超えて伸長する更なる配列を除く）。
２つの配列間の％ 同一性又は％ 類似性の決定を、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましいが非限定的な例は、Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877において修正されたKarlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索をＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２により行って、目的のタンパク質をコードする核酸に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索をＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３により行って、目的のタンパク質に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップ付きアラインメントを得るために、ギャップ付きＢＬＡＳＴをAltschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載されるように利用することができる。代替的には、ＰＳＩ－Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の遠い関係（Ｉｄ．）を検出する反復検索を行うことができる。ＢＬＡＳＴ、ギャップ付きＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ－Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、Myers and Miller, CABIOS(1989)のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するために、ＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティー１２及びギャップペナルティー４を使用することができる。配列分析のための更なるアルゴリズムは、当技術分野において公知であり、Torellis and Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5に記載されているＡＤＶＡＮＣＥ及びＡＤＡＭ並びにPearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8に記載されているＦＡＳＴＡを含む。ＦＡＳＴＡ内では、ｋｔｕｐは、検索の感度及び速度を設定する制御オプションである。ｋｔｕｐ＝２の場合、比較される２つの配列中の類似領域は、アライメントさせた残基のペアを見ることにより見出される。ｋｔｕｐ＝１の場合、単一のアライメントさせたアミノ酸を調べる。ｋｔｕｐをタンパク質配列については２若しくは１に設定することができ又はＤＮＡ配列については１～６に設定することができる。ｋｔｕｐが指定されていない場合のデフォルトは、タンパク質については２であり、ＤＮＡについては６である。代替的には、タンパク質配列アラインメントを、Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402に記載されているＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズムを使用して行うことができる。
ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質の機能的変異体は、前述のＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質の生体活性変異体及び生体活性フラグメントを含む。機能的変異体は、ＣＤ８０細胞外ドメイン、Ｆｃドメインのいずれか及び／又は両方のドメインに変異を有することができる。例として、幾つかのＣＤ８０細胞外ドメイン機能的変異体は、国際公開第２０１７／１８１１５２号に記載されている。別の例では、Ｆｃドメインの機能的変異体は、国際公開第１７／０７９１１７号に記載されており、例えば、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ及び／又はＰ３３１Ｓのアミノ酸置換を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む。
例えば、変異体は、具体的に記載されたＣＤ８０細胞外ドメイン又はＦｃドメインタンパク質の位置に１つ以上の異なるアミノ酸を有することができる。変異体は、このようなＣＤ８０細胞外ドメイン又はＦｃドメインと少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上のアミノ酸同一性を共有することができる。フラグメントは、所定の具体的に記載されたＣＤ８０細胞外ドメイン又はＦｃドメインタンパク質と同じアミノ酸を有するが、ＣＤ８０細胞外ドメイン又はＦｃドメインタンパク質の特定の部分又は領域を欠いている場合がある。
ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質の機能的変異体は、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質の生体活性変異体及びフラグメントのみを含む。本発明について、リコンビナントラブドウイルスのゲノム中でコードされるＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質変異体又はＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質フラグメントの生体活性は、各細胞又は腫瘍細胞中でのその発現後に決定される。これは、生体活性が、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質変異体又はＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質フラグメントをコードするリコンビナントラブドウイルスの文脈において（例えば、トランスウェルアッセイ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍モデルにおいて）決定されることを意味する。好ましくは、生体活性が、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質変異体又はＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質フラグメントをコードするベシクロウイルスについて決定される。より好ましくは、生体活性が、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質変異体又はＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質フラグメントをコードするＶＳＶ－ＧＰについて決定される。
生体活性は、下記能力：化学誘引活性、抗腫瘍活性、サイトカイン発現のモデュレーション、例えば、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、抗原提示細胞及び腫瘍細胞を含む同系ほ乳類細胞の集団におけるインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－ガンマ）ポリペプチドの発現の増加又は形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦベータ）ポリペプチドの発現の減少のうちの１つ以上を含むことができる。生体活性の試験を例えば、実施例に示されるプロトコールに従って行うことができるが、これに限定されない。本発明の目的で、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質の機能的変異体又はフラグメントは、同じアッセイ及び同じ条件下で試験された場合に、配列番号：３又は４に示される配列（それぞれ、シグナルペプチド配列有り又は無し）を有するＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質の活性の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％を示す場合、生体活性である。
ラブドウイルスは、その遺伝物質（ゲノム）として、ネガティブセンス一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を有する。ネガティブセンスｓｓＲＮＡウイルスは、ポジティブセンスＲＮＡを形成するために、ＲＮＡポリメラーゼを必要とする。ポジティブセンスＲＮＡは、ウイルスｍＲＮＡとして作用する。ウイルスｍＲＮＡは、新たなウイルス材料の産生のためにタンパク質に翻訳される。新たに形成されたウイルスでは、より多くのネガティブセンスＲＮＡ分子が産生される。
典型的なラブドウイルスゲノムは、少なくとも５つの構造タンパク質を３’－Ｎ－Ｐ－Ｍ－Ｇ－Ｌ－５’の順序でコードする。ゲノムは、構造タンパク質間に更に短い遺伝子間領域又は追加の遺伝子を含有する場合があり、したがって、長さ及び組織が変化する場合がある。
本発明によれば、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質遺伝子をラブドウイルスゲノムの任意の位置に導入することができる。挿入部位に応じて、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質遺伝子の転写効率が影響を受ける場合がある。一般的には、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質遺伝子の転写効率は、３’挿入から５’プライム挿入に向かって低下する。ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質遺伝子を下記ゲノム位置：３’－ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質－Ｎ－Ｐ－Ｍ－Ｇ－Ｌ－５’、３’－ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質－Ｐ－Ｍ－Ｇ－Ｌ－５’、３’－Ｎ－Ｐ－ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質－Ｍ－Ｇ－Ｌ－５’、３’－Ｎ－Ｐ－Ｍ－ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質－Ｇ－Ｌ－５’、３’－Ｎ－Ｐ－Ｍ－Ｇ－ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質－Ｌ－５’又は３’－Ｎ－Ｐ－Ｍ－Ｇ－Ｌ－ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質－５’に挿入することができる。好ましい実施態様では、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質遺伝子は、Ｇタンパク質とＬタンパク質との間に挿入される。
腫瘍細胞の感染後、リコンビナントラブドウイルスのゲノム中でコードされるＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質遺伝子は、ポジティブセンスＲＮＡに転写され、ついで、腫瘍細胞によりＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質に翻訳される。「コードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」又は「コードする（ｃｏｄｉｎｇ）」という用語は、定義された配列のヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ分子）又はアミノ酸及びそれから得られる生物学的特性を有する生物学的プロセスにおける他のポリマー及び高分子の合成のためのテンプレートとして働く、核酸中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指す。したがって、遺伝子は、所望のタンパク質がｍＲＮＡの転写及び後続の翻訳により細胞又は別の生物学的系において産生される場合、タンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であるコード鎖と非コード鎖との両方が、遺伝子の転写のためのテンプレートとして機能することができ、その遺伝子のタンパク質又は他の産物をコードすると称することができる。タンパク質をコードする核酸及びヌクレオチド配列は、イントロンを含む場合がある。
ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質遺伝子の転写は、好ましくは、それ自体のプロモーターの制御下になく、ウイルス複製に厳密に結び付けられているだけであり、それにより、ウイルス複製及び拡散の位置（腫瘍）へのＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質のターゲット発現が確実となる。このため、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質遺伝子の転写は、追加のエレメント、例えば、プロモーター又は誘引性遺伝子発現エレメントにより制御されない。
翻訳されたＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質は、典型的には、２つの同一の単量体成熟ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質を含む二量体融合タンパク質として溶液中に存在する。この場合、各単量体ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質は、そのＣ末端でＩｇＧ ＦｃドメインのＮ末端に融合したＣＤ８０細胞外ドメインを含む。２つのＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合単量体同士は、各単量体中のシステイン残基間に形成されるジスルフィド結合により共有結合され、それにより、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質二量体を形成する。
コードされたポリペプチドの一次配列を変化させて又は変化させることなく、核酸配列変化させることができると理解されるであろう。タンパク質をコードする核酸は、異なるヌクレオチド配列を有するが、遺伝子コードの縮重のために、タンパク質の同じアミノ酸配列をコードする任意の核酸を含む。ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、特に、本明細書に開示された任意の具体的なＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質の発現をもたらすであろう核酸配列を選択することは、当業者の知識の範囲内である。ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸分子は、当技術分野において公知の各種の方法により調製される。これらの方法は、天然供給源からの単離又はオリゴヌクレオチド媒介性（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発及び予め調製されたＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質のカセット突然変異誘発による調製を含むが、これらに限定されない。
医薬組成物
実際の薬学的有効量又は治療用量は、当然、当業者に公知の要因、例えば、患者の年齢及び体重、投与経路並びに疾患の重症度により決まる。いずれの場合も、リコンビナントラブドウイルスは、患者の固有の状態に基づいて、薬学的有効量を送達することが可能となる投与量及び様式で投与されるであろう。
一般的には、本明細書で言及された疾患、障害及び状態の治療及び／又は緩和のために、処置される特定の疾患、障害又は状態、使用される本発明の特定のリコンビナントラブドウイルスの有効性、特定の投与経路及び使用される特定の医薬製剤又は組成物に応じて、本発明のリコンビナントラブドウイルスは、一般的には、例えば、週２回、週１回又は月１回の用量で投与されるであろうが、特に、前述のパラメータに応じて相当変動させることができる。このため、場合によっては、上記与えられた最小用量より少なく使用することで十分である場合があり、一方、他の場合では、上限を超えなければならない場合がある。大量に投与する場合、それらを１日にわたって分散される多数のより少ない用量に分割することが推奨される場合がある。
治療に使用するために、本発明のリコンビナントラブドウイルスは、動物又はヒトへの投与を容易にするのに適した医薬組成物に製剤化される。典型的な製剤を水溶液又は水性若しくは非水性懸濁液の形態で、リコンビナントウイルスを生理学的に許容され得る担体、賦形剤又は安定剤と混合することにより調製することができる。担体、賦形剤、修飾剤又は安定剤は、利用される用量及び濃度で無毒である。それらは、バッファー系、例えば、ホスファート、シトラート、アセタート並びに他の無機酸又は有機酸及びそれらの塩；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存剤、例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコール若しくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルパラベン若しくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール及びｍ－クレゾール；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン若しくはリシン；グルコース、マンノース、スクロース、トレハロース、デキストリン若しくはデキストランを含む単糖類、二糖類、オリゴ糖類若しくは多糖類及び他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖アルコール、例えば、マンニトール又はソルビトール；塩形成カウンターイオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；並びに／又はイオン性若しくは非イオン性界面活性剤、例えば、TWEEN（商標）（ポリソルベート）、PLURONICS（商標）若しくは脂肪酸エステル、脂肪酸エーテル若しくは糖エステルを含む。また、賦形剤は、放出修飾又は吸収修飾機能も有することができる。
一実施態様では、本発明のリコンビナントラブドウイルスは、トリス、アルギニン及び場合により、シトラートを含む医薬組成物に製剤化される。トリスは、好ましくは、約１mM～約１００mMの濃度で使用される。アルギニンは、好ましくは、約１mM～約１００mMの濃度で使用される。シトラートは、最大１００mMの濃度で存在することができる。好ましい製剤は、約５０mM トリス及び５０mM アルギニンを含む。
医薬組成物を液体、凍結液体又は凍結乾燥形態として提供することができる。凍結液体を－７０℃～－８５℃及び約－１５℃、－１６℃、－１７℃、－１８℃、－１９℃、－２０℃、－２１℃、－２２℃、－２３℃、－２４℃又は約－２５℃の温度を含む約０℃～約－８５℃の温度で保存することができる。
本発明のリコンビナントラブドウイルス又は医薬組成物は、必要ではないが、場合により、目的の障害を予防し又は治療するのに現在使用されている１種以上の薬剤と共に製剤化される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在するリコンビナント抗体の量、障害又は処置の種類及び上記検討された他の要因により決まる。これらは、一般的には、本明細書に記載されたのと同じ投与量及び投与経路で又は本明細書に記載された投与量の約１～９９％で又は経験的／臨床的に適切であると決定される任意の投与量及び任意の経路で使用される。
疾患の予防又は治療のために、本発明のリコンビナントラブドウイルス又は医薬組成物の適切な投与量（単独で又は１種以上の他の追加の治療剤と組み合わせて使用される場合）は、処置される疾患の種類、リコンビナントラブドウイルスのタイプ、疾患の重症度及び経過、リコンビナントラブドウイルスが予防又は治療目的で投与されるかどうか、以前の治療、患者の臨床歴及びリコンビナントラブドウイルスに対する応答並びに主治医の裁量により決まるであろう。本発明のリコンビナントラブドウイルス又は医薬組成物は、１回又は一連の処置にわたって患者に適切に投与される。
疾患の種類及び重症度に応じて、リコンビナントラブドウイルスのＴＣＩＤ５０により測定された約１０８～１０１３個の感染性粒子が、例えば、１回以上の別々の投与によるか又は持続注入によるかにかかわらず、患者への投与のための最初の候補投与量であることができる。状態に応じて、数日又はそれ以上にわたる反復投与の場合、処置は、一般的には、疾患症状の所望のサプレッションが生じるまで持続されるであろう。リコンビナントラブドウイルスの１つの例示的な投与量は、ＴＣＩＤ５０により測定された約１０８～１０１３個の範囲の感染性粒子であろう。このため、ＴＣＩＤ５０により測定される約１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２又は１０１３個の感染性粒子（又はその任意の組み合わせ）の１回以上の用量を患者に投与することができる。このような用量を断続的に、例えば、毎週又は３週間毎に（例えば、患者が、約２～約２０回又は例えば、約６回の用量のリコンビナントラブドウイルスを受けるように）投与することができる。初回のより高い負荷用量、続けて、１回以上のより低い用量又はその逆を投与することができる。ただし、他の投与計画が有用である場合がある。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイにより容易にモニターされる。
本発明のリコンビナントラブドウイルス及びそれを含む組成物の有効性を関与する特定の疾患に応じて、それ自体公知の任意の適切なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞ベースのアッセイ、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ及び／若しくは動物モデル又はそれらの任意の組み合わせを使用して試験することができる。適切なアッセイ及び動物モデルは、当業者には明らかであろうし、例えば、以下の実施例で使用されるアッセイ及び動物モデルを含む。
実際の薬学的有効量又は治療用量は、当然、当業者に公知の要因、例えば、患者の年齢及び体重、投与経路及び疾患の重症度により決まる。いずれの場合も、本発明のリコンビナントラブドウイルスは、患者の固有の状態に基づいて薬学的有効量を送達することが可能となる投与量及び様式で投与されるであろう。
代替的には、本発明のリコンビナントラブドウイルス又は医薬組成物を処置される領域のサイズ、使用されるウイルス力価、投与経路及び方法の所望の効果に応じて、範囲内の全ての数を含む約５０μl～約１００mlの容量で送達することができる。
腫瘍内投与では、容量は、好ましくは、約１００μl、２００μl、３００μl、４００μl、５００μl、６００μl、７００μl、８００μl、９００μl、１０００μl、１１００μl、１２００μl、１３００μl、１４００μl、１５００μl、１６００μl、１７００μl、１８００μl、１９００μl、２０００μl、２５００μl、３０００μl、３５００μl、４０００μl又は約４５００μlの容量を含む約５０μl～約５mlである。好ましい実施態様では、容量は、約１０００μlである。
例えば、リコンビナントラブドウイルスの注入による全身投与では、容量は、当然、より多くてもよい。代替的には、リコンビナントラブドウイルスの濃縮溶液を注入の直前に、より大量の注入溶液で希釈することができる。
特に、静脈内投与では、容量は、好ましくは、約２ml、３ml、４ml、５ml、６ml、７ml、８ml、９ml、１０ml、１１ml、１２ml、１３ml、１４ml、１５ml、１６ml、１７ml、１８ml、１９ml、２０ml、２５ml、３０ml、３５ml、４０ml、４５ml、５０ml、５５ml、６０ml、７０ml、７５ml、８０ml、８５ml、９０ml、９５ml又は約１００mlの容量を含む１ml～１００mlである。好ましい実施態様では、容量は、約５ml～１５mlであり、より好ましくは、容量は、約６ml、７ml、８ml、９ml、１０ml、１１ml、１２ml、１３ml又は約１４mlである。
好ましくは、同じ製剤が、腫瘍内投与及び静脈内投与に使用される。腫瘍内投与と静脈内投与との間の用量及び／又は容量比は、約１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９又は約１：２０であることができる。例えば、１：１の用量及び／又は容量比は、同じ用量及び／又は容量が腫瘍内及び静脈内に投与されることを意味し、一方、例えば、約１：２０の用量及び／又は容量比は、腫瘍内投与の用量及び／又は容量より２０倍高い静脈内投与の用量及び／又は容量を意味する。好ましくは、腫瘍内投与と静脈内投与との間の用量及び／又は容量比は、約１：９である。
リコンビナントラブドウイルスの有効濃度は、望ましくは、１ミリリットル当たりに約１０８～１０１４ベクターゲノム（vg/ml）の範囲である。感染単位をMcLaughlin et al., J Virol.;62(6):1963-73 (1988)記載されているように測定することができる。好ましくは、濃度は、約１．５×１０９～約１．５×１０１３であり、より好ましくは、約１．５×１０９～約１．５×１０１１である。一実施態様では、有効濃度は、約１．５×１０９である。別の実施態様では、有効濃度は、約１．５×１０１０である。別の実施態様では、有効濃度は、約１．５×１０１１である。更に別の実施態様では、有効濃度は、約１．５×１０１２である。別の実施態様では、有効濃度は、約１．５×１０１３である。別の実施態様では、有効濃度は、約１．５×１０１４である。望ましくない影響のリスクを低減するために、最も低い有効濃度を使用するのが望ましい場合がある。これらの範囲における更に他の投与量を主治医により、処置される対象、好ましくは、ヒトの身体状態、対象の年齢、特定の種類のガン及びガンが進行性である場合、そのガンが進行している程度を考慮して選択することができる。
リコンビナントラブドウイルスの有効ターゲット濃度をＴＣＩＤ５０により表現することができる。ＴＣＩＤ５０は、例えば、Ｓｐｅａｒｍａｎ－Ｋａｒｂｅｒ法を使用することにより決定することができる。望ましくは、範囲は、１×１０８/ml～１×１０１４/ml ＴＣＩＤ５０の有効ターゲット濃度を含む。好ましくは、有効ターゲット濃度は、約１×１０９～１×１０１２/ml、より好ましくは、約１×１０９～１×１０１１/mlである。一実施態様では、有効ターゲット濃度は、約１×１０１０/mlである。好ましい実施態様では、ターゲット濃度は、約５×１０１０/mlである。別の実施態様では、有効ターゲット濃度は、約１．５×１０１１/mlである。一実施態様では、有効ターゲット濃度は、約１×１０１２/mlである。別の実施態様では、有効ターゲット濃度は、約１．５×１０１３/mlである。
リコンビナントラブドウイルスの有効ターゲット用量もＴＣＩＤ５０により表現することができる。望ましくは、範囲は、１×１０８～１×１０１４ＴＣＩＤ５０のターゲット用量を含む。好ましくは、ターゲット用量は、約１×１０９～１×１０１３、より好ましくは、約１×１０９～１×１０１２である。一実施態様では、有効濃度は、約１×１０１０である。好ましい実施態様では、有効濃度は、約１×１０１１である。一実施態様では、有効濃度は、約１×１０１２である。別の実施態様では、有効濃度は、約１×１０１３である。
別の態様では、本明細書に記載された障害の治療、予防及び／又は診断に有用な材料を含有する、キット又はパーツキットが提供される。キット又はパーツキットは、容器と、容器上又は容器に付随するラベル又は添付文書とを含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグ等を含む。容器を各種の材料、例えば、ガラス又はプラスチックで形成することができる。容器は組成物を、それ自体のみ又は障害を治療し、予防しかつ／又は診断するのに有効な別の組成物と組み合わせて保持し、滅菌アクセスポートを有することができる（例えば、容器は、皮下注射針により穿孔可能な栓を有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであることができる）。組成物中の少なくとも１種の活性薬剤は、本発明のリコンビナントラブドウイルス又は医薬組成物である。ラベル又は添付文書は、該組成物が選択される状態を処置するのに使用されることを示す。
更に、キット又はパーツキットは、（ａ）その中に収容された組成物を含む第１の容器であって、該組成物が本発明のリコンビナントラブドウイルス又は医薬組成物を含む第１の容器と、（ｂ）その中に収容された組成物を含む第２の容器であって、該組成物が更なる細胞傷害性剤又は他の治療剤、例えば、ＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣ模倣物を含む第２の容器とを含むことができる。本発明のこの実施態様におけるキット又はパーツキットは、組成物を特定の状態、特に、ガンを処置するのに使用することができることを示す添付文書を更に含むことができる。代替的に又は付加的に、キット又はパーツキットは、薬学的に許容され得るバッファー、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液又はデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器を更に含むことができる。他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、商業的及び使用者の観点から望ましい他の材料を更に含むことができる。
更なる態様では、本発明のリコンビナントラブドウイルスは、リコンビナントラブドウイルスの投与に有用な装置、例えば、シリンジ、注射ペン、マイクロポンプ又は他の装置と組み合わせて使用される。好ましくは、本発明のリコンビナントラブドウイルスは、例えば、リコンビナントラブドウイルスを使用するための説明書を伴う添付文書も含む、パーツキットに含まれる。
医療用途
本発明の更なる態様は、医薬に使用するための、そのゲノム中に少なくとも１種のＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質又はその機能的変異体をコードするリコンビナントラブドウイルスを提供する。
本発明のリコンビナントラブドウイルスにより、腫瘍微小環境において、免疫原性細胞死及び自然免疫細胞の刺激と組み合わせて、腫瘍細胞溶解が効率的に誘引される。したがって、本発明のリコンビナントラブドウイルスは、ガンの治療及び／又は予防に有用である。
更なる態様では、本発明のリコンビナントラブドウイルスを、ガンを患う個体に治療上有効量のリコンビナントラブドウイルスを投与し、それにより、ガンの１つ以上の症状を改善することを含む、ガンを治療しかつ／又は予防するための方法において使用することができる。
更なる態様では、本発明は、ガンの治療及び／又は予防のための医薬の製造のための、本発明のリコンビナントラブドウイルスの使用を更に提供する。
更なる態様では、本発明のリコンビナントラブドウイルスを、胃腸ガン、肺ガン又は頭頸部ガンを患っている個体に治療上有効量のリコンビナントラブドウイルスを投与し、それにより、胃腸ガン、肺ガン又は頭頸部ガンの１つ以上の症状を改善することを含む、胃腸ガン、肺ガン又は頭頸部ガンを治療しかつ／又は予防するための方法において使用することができる。
疾患の予防又は治療のために、リコンビナントラブドウイルスの適切な投与量は、上記定義された各種の要因、例えば、処置される疾患の種類、疾患の重症度及び経過、リコンビナントラブドウイルスが予防又は治療目的で投与されるかどうか、以前の治療、患者の臨床歴及びリコンビナントラブドウイルスに対する応答並びに主治医の裁量により決まる。リコンビナントラブドウイルスは、１回又は一連の処置にわたって患者に適切に投与される。
一態様では、ガンは、固形ガンである。固形ガンは、脳ガン、子宮内膜ガン、膣ガン、肛門ガン、結腸直腸ガン、中咽頭扁平上皮ガン、胃ガン、胃食道接合部腺ガン、食道ガン、肝細胞ガン、膵臓腺ガン、胆管ガン、膀胱尿路上皮ガン、転移性メラノーマ、前立腺ガン、乳ガン、卵巣ガン、頭頸部扁平上皮ガン（ＨＮＳＣＣ）、神経膠芽腫、非小細胞肺ガン、脳腫瘍又は小細胞肺ガンである場合がある。胃腸ガン、肺ガン及び頭頸部ガンの処置が好ましい。
リコンビナントラブドウイルスは、経口、非経口、皮下、腫瘍内、静脈内、皮内、腹腔内、肺内及び鼻腔内を含む、任意の適切な手段により投与される。非経口注入は、筋内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与を含む。加えて、リコンビナントラブドウイルスは、パルス注入により適切に投与される。一態様では、投与が短期であるか又は慢性であるかに部分的に依存して、投与は、注射、最も好ましくは、静脈内又は皮下注射により与えられる。
本発明の特定のリコンビナントラブドウイルス並びにその特定の薬物動態及び他の特性に応じて、毎日、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回又は６日に１回、毎週、毎月等で投与することができる。投与計画は、長期の週１回の処置を含むことができる。「長期」は、少なくとも２週間、好ましくは、数ヶ月又は数年の期間を意味する。
処置スケジュールは、種々の計画を含むことができ、典型的には、１、２、３又は４週間の期間にわたって患者に投与される複数回の用量を必要とし、場合により、１回以上の更なる処置ラウンドを続ける。一態様では、本発明のリコンビナントラブドウイルスは、所定の期間内に最大１、２、３、４、５、又は６回の用量で患者に投与される。好ましくは、第１の処置ラウンドは、３週間以内に終了する。３週間の処置の過程の間、リコンビナントラブドウイルスを下記スキームに記載されるように患者に投与することができる：（ｉ）０日目に１回；（ｉｉ）０日目及び３日目に１回；（ｉｉｉ）０日目、３日目及び６日目に１回；（ｉｖ）０日目、３日目、６日目及び９日目に１回；（ｖ）０日目及び５日目に１回；（ｖｉ）０日目、５日目及び１０日目に１回；（ｖｉ）０日目、５日目、１０日目及び１５日目に１回。これらの計画を繰り返すことができ、第１の処置ラウンドのアウトカムに応じて、第２又は第３の処置ラウンドが必要とされる場合がある。第１の処置ラウンドに基づいて計算すると、第２の処置ラウンドは、好ましくは、２１日目、４２日目及び６３日目の更なる処置を含む。好ましい実施態様では、本発明のリコンビナントラブドウイルスは、下記スキームに従って患者に投与される：０日目、３日目、２１日目、４２日目及び６３日目。
「サプレッション」という用語は、本明細書において、疾患の１つ以上の特徴を軽減し又は減少させるのを意味するために、「改善」及び「緩和」と同じ文脈で使用される。本発明のリコンビナントラブドウイルス又は医薬組成物は、良好な医療行為と一致する様式で製剤化され、投薬され、投与される。この文脈において考慮すべき要因は、処置される特定の障害、処置される特定のほ乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール及び医師に公知の他の要因を含む。投与されるリコンビナントラブドウイルスの「治療上有効量」は、このような考慮事項により決定されうであろうし、ガンの臨床症状を予防し、改善し又は治療するのに必要な最少量、特に、これらの障害に有効な最少量である。
別の態様では、本発明のリコンビナントラブドウイルスを複数回及び数回の用量で投与することができる。一態様では、リコンビナントラブドウイルスの第１の用量腫は、瘍内に投与され、リコンビナントラブドウイルスの後続の用量は、静脈内に投与される。更なる態様では、リコンビナントラブドウイルスの第１の用量及び少なくとも１回以上の後続の用量は、腫瘍内に投与され、リコンビナントラブドウイルスの後続の用量は、静脈内に投与される。後続の用量を最初の腫瘍内投与後１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日又は３１日で投与することができる。
別の態様では、リコンビナントラブドウイルスの第１の用量は、静脈内に投与され、リコンビナントラブドウイルスの後続の用量は、腫瘍内に投与される。後続の用量を最初の静脈内投与後１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日又は３１日で投与することができる。
別の態様では、リコンビナントラブドウイルスは、静脈内に投与され、リコンビナントラブドウイルスの後続の用量は、腫瘍内に投与される。
別の態様では、リコンビナントラブドウイルスは、各時点で静脈内及び腫瘍内に投与される。
上記されたように、本発明のリコンビナントラブドウイルスは、ガン細胞に対する免疫応答を刺激するために多くの有用性を有する。強力な免疫活性化能は、腫瘍微小環境に限定されることが観察された。このため、好ましい態様では、本発明のリコンビナントラブドウイルスを患者に全身投与することができる。全身適用性は、重要な属性である。多くのガンは、高度に転移し、アクセスが困難かつアクセス可能でない腫瘍性病変の処置が可能となるであろうためである。この固有の免疫刺激特性により、本発明のリコンビナントラブドウイルスは、転移性腫瘍の処置に特に有用である。
一部の患者は、チェックポイント阻害剤療法に対する抵抗性を発症し、このような患者は、ＩＦＮ経路に突然変異を蓄積すると見られることが観察された。したがって、一態様では、本発明のリコンビナントラブドウイルス、特に、本発明のリコンビナント水疱性口内炎ウイルスは、チェックポイント阻害剤療法に対する抵抗性を発症した患者の処置に有用である。本発明のリコンビナントラブドウイルス、特に、リコンビナント水疱性口内炎ウイルスの固有の免疫促進特性のために、このような処置された患者は、チェックポイント阻害剤療法の継続に適格となることができる。
好ましい実施態様では、本発明のリコンビナントラブドウイルス、特に、本発明のリコンビナント水疱性口内炎ウイルスは、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１阻害剤、例えば、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１に対するアンタゴニスト抗体のいずれかによるチェックポイント阻害剤療法を完了した非小細胞肺ガンを有する患者の処置に有用である。
上記医薬製剤又は治療方法のいずれかを、本発明のリコンビナントラブドウイルス又は医薬組成物のいずれか１つを使用して行うことができると理解される。
併用
また、本発明は、現在使用されている及び／又は先行技術において公知の処置／方法と比較して、特定の利点を提供する併用処置／方法を提供する。これらの利点は、ｉｎ ｖｉｖｏでの有効性（例えば、改善された臨床応答、応答の延長、応答速度の向上、応答の持続時間、疾患安定化速度、安定化の持続時間、疾患進行までの時間、無増悪生存（ＰＦＳ）及び／又は全生存（ＯＳ）、抵抗性の発生の遅延等）、安全かつ十分に耐容される投与並びに有害事象の頻度及び重症度の低下を含むことができる。
本発明のリコンビナントラブドウイルスを他の薬理学的に活性な成分、例えば、最新技術又は標準治療化合物、例えば、細胞増殖抑制性物質又は細胞傷害性物質、細胞増殖阻害剤、抗血管新生物質、ステロイド、免疫モジュレーター／チェックポイント阻害剤等と組み合わせて使用することができる。本発明のリコンビナントラブドウイルスを放射線療法と組み合わせて使用することもできる。
本発明のリコンビナントラブドウイルスと組み合わせて投与することができる細胞増殖抑制性物質及び／又は細胞傷害活性物質は、ホルモン、ホルモン類似体及び抗ホルモン、アロマターゼ阻害剤、ＬＨＲＨアゴニスト及びアンタゴニスト、成長因子（成長因子、例えば、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ヒト上皮成長因子（ＨＥＲ、例えば、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４）及び肝細胞成長因子（ＨＧＦ）等）の阻害剤、例えば、（抗）成長因子抗体、（抗）成長因子レセプター抗体及びチロシンキナーゼ阻害剤、例えば、セツキシマブ、ゲフィチニブ、アファチニブ、ニンテダニブ、イマチニブ、ラパチニブ、ボスチニブ及びトラスツズマブ等；代謝拮抗剤（例えば、抗葉酸剤、例えば、メトトレキサート、ラルチトレキセド、ピリミジン類似体、例えば、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、ゲムシタビン、イリノテカン、ドキソルビシン、ＴＡＳ－１０２、カペシタビン及びゲムシタビン、プリン及びアデノシン類似体、例えば、メルカプトプリン、チオグアニン、クラドリビン及びペントスタチン、シタラビン（ａｒａ Ｃ）、フルダラビン）；抗腫瘍抗生物質（例えば、アントラサイクリン）；白金誘導体（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン）；アルキル化剤（例えば、エストラムスチン、メロレタミン、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ダカルバジン、シクロホスファミド、イホスファミド、テモゾロミド、ニトロソウレア、例えば、カルムスチン及びロムスチン、チオテパ等）；抗有糸分裂剤（例えば、ビンカアルカロイド、例えば、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン及びビンクリスチン等；並びにタキサン、例えば、パクリタキセル、ドセタキセル）；ベバシズマブ、ラムシムマブ及びアフリベルセプトを含む血管新生阻害剤、チューブリン阻害剤；ＤＮＡ合成阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エピポドフィロトキシン、例えば、エトポシド及びエトポフォス、テニポシド、アムサクリン、トポテカン、イリノテカン、ミトキサントロン等）、セリン／スレオニンキナーゼ阻害剤（例えば、ＰＤＫ１阻害剤、Ｒａｆ阻害剤、Ａ－Ｒａｆ阻害剤、Ｂ－Ｒａｆ阻害剤、Ｃ－Ｒａｆ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ｍＴＯＲＣ１／２阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＰＩ３Ｋα阻害剤、二重ｍＴＯＲ／ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＳＴＫ３３阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、ＰＬＫ１阻害剤（例えば、ボラセルチブ）、ＣＤＫ９阻害剤を含むＣＤＫ阻害剤、オーロラキナーゼ阻害剤）、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、ＰＴＫ２／ＦＡＫ阻害剤）、タンパク質タンパク質相互作用阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、ＦＬＴ３阻害剤、ＢＲＤ４阻害剤、ＩＧＦ－１Ｒ阻害剤、Ｂｃｌ－ｘＬ阻害剤、Ｂｃｌ－２阻害剤、Ｂｃｌ－２／Ｂｃｌ－ｘＬ阻害剤、ＥｒｂＢレセプター阻害剤、ＢＣＲ－ＡＢＬ阻害剤、ＡＢＬ阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、ラパマイシン類似体（例えば、エベロリムス、テムシロリムス、リダホロリムス、シロリムス）、アンドロゲン合成阻害剤、アンドロゲンレセプター阻害剤、ＤＮＭＴ阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＡＮＧ１／２阻害剤、ＣＹＰ１７阻害剤、放射線医薬、免疫療法剤、例えば、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３及びＴＩＭ３結合分子／免疫グロブリン、例えば、イピリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ）及び種々の化学療法剤、例えば、アミホスチン、アナグレリッド、クロドロナト、フィルグラスチン、インターフェロン、インターフェロンアルファ、ロイコボリン、リツキシマブ、プロカルバジン、レバミソール、メスナ、ミトタン、パミドロナート及びポルフィマー；プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）；Ｓｍａｃ及びＢＨ３模倣物；ｍｄｍ２－ｐ５３アンタゴニストを含むｐ５３機能性を回復させる薬剤；Ｗｎｔ／ベータ－カテニンシグナル伝達経路の阻害剤；Ｆｌｔ３Ｌ及びＦｌｔ３刺激抗体又はリガンド模倣物；ＳＩＲＰアルファ及びＣＤ４７遮断治療剤並びに／又はサイクリン依存性キナーゼ９阻害剤を含むが、これらに限定されない。
更に、免疫学的「非炎症性」の「炎症性」腫瘍への潜在的変換、ＣＤ８０－Ｆｃ媒介性Ｔ細胞活性化と組み合わせた骨髄／樹状細胞活性化は、Ｔ細胞エンゲージャー等の治療法と更に好ましく相互作用する。このため、一実施態様では、本発明のリコンビナントラブドウイルスをＴ細胞エンゲージャー、例えば、Ｔ細胞レセプター刺激を提供するが、共刺激を提供しない二重特異性ＤＬＬ３／ＣＤ３バインダー等との併用処置に使用することができる。更に、潜在的な臨床的併用パートナーは、腫瘍血管系モデュレーション剤を含むこともできる。このため、別の実施態様では、本発明のリコンビナントラブドウイルスを腫瘍血管モデュレーション剤、例えば、二重特異性ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２バインダー等との併用処置に使用することができる。
本発明のリコンビナントラブドウイルスをＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣｍ／ＩＡＰアンタゴニストのいずれかとの併用処置に使用することができる。このような併用処置を物質の非固定の（例えば、自由な）併用として又はパーツキットを含む固定された併用の形態で与えることができる。
この文脈において、本発明の意味における「併用」又は「併用された」は、２つ以上の活性剤の混合又は併用により生じる生成物を含み、固定及び非固定の（例えば、自由な）併用（キットを含む）及び使用、例えば、成分又は薬剤の同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）、同時（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ）、連続（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ）、連続（ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅ）、交互又は別個の使用の両方を含むが、これらに限定されない。「固定された併用」という用語は、活性薬剤が両方とも、単一の実体又は剤型の形態で同時に患者に投与されることを意味する。「非固定の併用」という用語は、活性薬剤が同時に、同時に又は特定の時間制限なしに連続してのいずれかで、別個の実体として患者に投与されることを意味する。ここで、このような投与は、患者の体内の２つの化合物の治療上有効レベルを提供する。後者は、カクテル療法、例えば、３種以上の活性薬剤の投与にも適用される。
本発明は、本明細書に記載されたガンの処置、好ましくは、固形ガンの処置に使用するための、ＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣｍ／ＩＡＰアンタゴニストと組み合わせたリコンビナントラブドウイルスを提供する。
また、本発明は、本明細書に記載されたガンの治療及び／又は予防、好ましくは、固形ガンの処置のための医薬の製造のための、ＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣｍ／ＩＡＰアンタゴニストと組み合わせたリコンビナントラブドウイルスの使用も提供する。
本発明は、ガンを治療しかつ／又は予防するための方法であって、治療上有効量の本発明のリコンビナントラブドウイルスと、ＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣｍ／ＩＡＰアンタゴニストとを、ガンを患っている個体に投与し、それにより、ガンの１つ以上の症状を改善することを含む、方法を更に提供する。本発明のリコンビナントラブドウイルス及びＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣｍ／ＩＡＰアンタゴニストを同時に、連続的に又は交互に投与することができる。
本発明のリコンビナントラブドウイルス及びＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣｍ／ＩＡＰアンタゴニストを同じ投与経路により又は異なる投与経路を介して投与することができる。好ましくは、ＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣｍ／ＩＡＰアンタゴニストは、静脈内に投与され、本発明のリコンビナントラブドウイルスは、腫瘍内に投与される。別の実施態様では、ＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣｍ／ＩＡＰアンタゴニストは、静脈内に投与し、本発明のリコンビナントラブドウイルスは、少なくとも１回腫瘍内に投与され、リコンビナントラブドウイルスの後続の用量は、静脈内に投与される。後続の用量を最初の腫瘍内投与後１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日又は３１日で投与することができる。好ましい実施態様では、ＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣｍ／ＩＡＰアンタゴニストは、最初の腫瘍内投与後２１日で投与される。
（ｉ）ＳＭＡＣ模倣物（ＳＭＡＣｍ）／ＩＡＰアンタゴニスト、
（ｉｉ）抗ＰＤ－１及び抗ＰＤ－Ｌ１剤を含む免疫療法剤並びに抗ＬＡＧ３剤、例えば、ペンブロリズマブ及びニボルマブ及び国際公開第２０１７／１９８７４１号に開示されている抗体
と組み合わせた本発明のリコンビナントラブドウイルスによる処置が特に好ましい。
本明細書で提供される組み合わせは、（ｉ）本発明のリコンビナントラブドウイルスと、（ｉｉａ）ＰＤ－１経路阻害剤、好ましくは、ＰＤ－１若しくはＰＤ－Ｌ１に対するアンタゴニスト抗体又は（ｉｉｂ）ＳＭＡＣｍ／ＩＡＰアンタゴニストとを含む。本明細書に記載されたガンの処置のための、（ｉ）及び（ｉｉａ）又は（ｉ）及び（ｉｉｂ）を含むこのような組み合わせの使用が更に提供される。
別の態様では、（ｉ）本発明のリコンビナントラブドウイルス及び（ｉｉａ）ＰＤ－１経路阻害剤又は（ｉｉｂ）ＳＭＡＣｍ／ＩＡＰアンタゴニストの使用を含む、併用処置が提供される。このような併用処置において、本発明のリコンビナントラブドウイルスをＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣｍ／ＩＡＰアンタゴニストと同時に、連続的に又は交互に投与することができる。
例えば、「同時」投与は、同じ一般的な期間内に、例えば、同じ日に、ただし、必ずしも同時にではなく、活性薬剤を投与することを含む。交互の投与は、ある期間、例えば、数日又は１週間にわたって、１つの薬剤を投与し、続けて、後続の期間、例えば、数日又は１週間にわたって他の薬剤を投与し、ついで、１回以上のサイクルにわたってこのパターンを繰り返すことを含む。連続又は連続投与は、１つ以上の用量を使用する第１の期間（例えば、数日又は１週間にわたる）に１つの薬剤を投与し、続けて、１つ以上の用量を使用する第２の期間（例えば、数日又は１週間にわたる）に他の薬剤を投与することを含む。必ずしも規則的な順序に従う必要がない、処置期間にわたって異なる日に活性薬剤を投与することを含む、重複するスケジュールも利用することができる。例えば、使用される薬剤及び対象の状態に従って、これらの一般的なガイドラインの変形例も利用することができる。
連続的な処置スケジュールには、本発明のリコンビナントラブドウイルスの投与、続けて、ＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣｍ／ＩＡＰアンタゴニストの投与を含む。また、連続的な処置スケジュールは、ＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣｍ／ＩＡＰアンタゴニストの投与、続けて、本発明のリコンビナントラブドウイルスの投与も含む。連続的な処置スケジュールは、互いの後１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日又は３１日での投与を含むことができる。
本発明及びその全ての実施態様の意味の範囲内のＰＤ－１経路阻害剤は、ＰＤ－１とそのレセプターとの相互作用を阻害する化合物である。ＰＤ－１経路阻害剤は、好ましくは、ＰＤ－１レセプターにより媒介されるＰＤ－１経路シグナル伝達を損わせることが可能である。ＰＤ－１阻害剤は、ＰＤ－１経路シグナル伝達を拮抗可能な、ＰＤ－１経路の任意のメンバーに対する任意の阻害剤であることができる。阻害剤は、ＰＤ－１経路の任意のメンバーをターゲットとする、好ましくは、ＰＤ－１レセプター、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２に対するアンタゴニスト抗体であることができる。また、ＰＤ－１経路阻害剤は、ＰＤ－１レセプターのフラグメント又はＰＤ１リガンドの活性を遮断するＰＤ－１レセプターであることができる。
ＰＤ－１アンタゴニストは、当技術分野において周知であり、例えば、Li et al., Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 1151（参照により本明細書に組み入れられる）にレビューされている。任意のＰＤ－１アンタゴニスト、特に、Li et al.に開示されているような抗体及び本明細書において以下に開示される更なる抗体を本発明に従って使用することができる。好ましくは、本発明のＰＤ－１アンタゴニスト及びその全ての実施態様は、下記抗体：
・ペンブロリズマブ（抗ＰＤ－１抗体）；
・ニボルマブ（抗ＰＤ－１抗体）；
・ピジリズマブ（抗ＰＤ－１抗体）；
・ＰＤＲ－００１（抗ＰＤ－１抗体）；
・本明細書において以下に開示されるＰＤ１－１、ＰＤ１－２、ＰＤ１－３、ＰＤ１－４及びＰＤ１－５（抗ＰＤ－１抗体）
・アテゾリズマブ（抗ＰＤ－Ｌ１抗体）；
・アベルマブ（抗ＰＤ－Ｌ１抗体）；
・デュルバルマブ（抗ＰＤ－Ｌ１抗体）
からなる群より選択される。
例えば、Hamid, O. et al. (2013) New England Journal of Medicine 369(2):134-44に開示されているペンブロリズマブ（以前は、ランブロリズマブとしても公知；商品名Keytruda；ＭＫ－３４７５としても公知）は、ＰＤ－１に結合するヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体であり、Ｆｃ媒介性細胞傷害を防止するように設計されたＣ２２８Ｐでの突然変異を含有する。例えば、ペンブロリズマブは、米国特許第８，３５４，５０９号明細書及び国際公開第２００９／１１４３３５号に開示されている。ペンブロリズマブは、切除不能又は転移性メラノーマを患っている患者及び転移性ＮＳＣＬＣを有する患者の処置のために、ＦＤＡにより認可されている。
ニボルマブ（ＣＡＳ登録番号：９４６４１４－９４－４； ＢＭＳ－９３６５５８又はＭＤＸ１１０６ｂ）は、検出可能な抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を欠き、ＰＤ－１を特異的に遮断する完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ニボルマブは、例えば、米国特許第８，００８，４４９号明細書及び国際公開第２００６／１２１１６８号に開示されている。ニボルマブは、切除不能又は転移性メラノーマ、転移性ＮＳＣＬＣ及び進行性腎細胞ガンを患っている患者の処置のために、ＦＤＡにより認可されている。
ピジリズマブ（ＣＴ－０１１；Cure Tech）は、ＰＤ－１に結合するヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体である。例えば、ピジリズマブは、例えば、国際公開第２００９／１０１６１１号に開示されている。
ＰＤＲ－００１又はＰＤＲ００１は、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２のＰＤ－１への結合を遮断する高親和性リガンド遮断ヒト化抗ＰＤ－１ ＩｇＧ４抗体である。ＰＤＲ－００１は、国際公開第２０１５／１１２９００号及び同第２０１７／０１９８９６号に開示されている。
抗体ＰＤ１－１～ＰＤ１－５は、表１に示される配列により定義される抗体分子である。表中、ＨＣは、（全長）重鎖を示し、ＬＣは、（全長）軽鎖を示す。
Figure 0007565384000006
Figure 0007565384000007
具体的には、本明細書において上記された抗ＰＤ－１抗体分子は、
（ＰＤ１－１：）配列番号：１４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号：１５のアミノ酸配列を含む軽鎖；又は
（ＰＤ１－２：）配列番号：１６のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号：１７のアミノ酸配列を含む軽鎖；又は
（ＰＤ１－３：）配列番号：１８のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号：１９のアミノ酸配列を含む軽鎖；又は
（ＰＤ１－４：）配列番号：２０のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号：２１のアミノ酸配列を含む軽鎖；又は
（ＰＤ１－５：）配列番号：２２のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号：２３のアミノ酸配列を含む軽鎖
を有する。
アテゾリズマブ（Tecentriq、ＭＰＤＬ３２８０Ａとしても公知）は、ＰＤ－Ｌ１をターゲットとするファージ由来ヒトＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体であり、例えば、Deng et al. mAbs 2016;8:593-603に記載されている。アテゾリズマブは、尿路上皮ガンを患っている患者の処置のために、ＦＤＡにより認可されている。
アベルマブは、完全ヒト抗ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧ１モノクローナル抗体であり、Boyerinas et al. Cancer Immunol. Res. 2015;3:1148-1157に記載されている。
デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）は、ＰＤ－Ｌ１に高い特異性を有するヒトＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体であり、例えば、Stewart et al. Cancer Immunol. Res. 2015;3:1052-1062又はIbrahim et al. Semin. Oncol. 2015;42:474-483に記載されている。
Li et al.（上記）に開示されているか又は臨床試験中であることが公知の更なるＰＤ－１アンタゴニスト、例えば、ＡＭＰ－２２４、ＭＥＤＩ６８０（ＡＭＰ－５１４）、ＲＥＧＮ２８１０、ＢＭＳ－９３６５５９、ＪＳ００１－ＰＤ－１、ＳＨＲ－１２１０、ＢＭＳ－９３６５５９、ＴＳＲ－０４２、ＪＮＪ－６３７２３２８３、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＰＤＬ３２８０Ａ及びＭＳＢ００１０７１８Ｃを上記言及されたアンタゴニストに代えて又は加えて使用することができる。
本明細書で使用する場合、ＩＮＮは、起源抗体と同じか又は実質的に同じアミノ酸配列を有する全ての生体類似抗体を包含することも意味する。生体類似抗体は、米国において４２ ＵＳＣ §２６２サブセクション（ｋ）及び他の管轄における同等の規制の下で認可されたような生体類似抗体を含むが、これらに限定されない。
上記列記されたＰＤ－１アンタゴニストは、それらの製造、治療用途及び特性それぞれについて、当技術分野において公知である。
一実施態様では、ＰＤ－１アンタゴニストは、ペンブロリズマブである。
別の実施態様では、ＰＤ－１アンタゴニストは、ニボルマブである。
別の実施態様では、ＰＤ－１アンタゴニストは、ピジリズマブである。
別の実施態様では、ＰＤ－１アンタゴニストは、アテゾリズマブである。
別の実施態様では、ＰＤ－１アンタゴニストは、アベルマブである。
別の実施態様では、ＰＤ－１アンタゴニストは、デュルバルマブである。
別の実施態様では、ＰＤ－１アンタゴニストは、ＰＤＲ－００１である。
別の実施態様では、ＰＤ－１アンタゴニストは、ＰＤ１－１である。
別の実施態様では、ＰＤ－１アンタゴニストは、ＰＤ１－２である。
別の実施態様では、ＰＤ－１アンタゴニストは、ＰＤ１－３である。
別の実施態様では、ＰＤ－１アンタゴニストは、ＰＤ１－４である。
別の実施態様では、ＰＤ－１アンタゴニストは、ＰＤ１－５である。
本発明及びその全ての実施態様の意味の範囲内のＳＭＡＣ模倣物は、ＩＡＰタンパク質に結合し、その分解を誘引する化合物である。好ましくは、本発明及びその全ての実施態様内のＳＭＡＣ模倣物は、下記（Ａ０）：
・国際公開第２０１３／１２７７２９号に（一般的に及び／又は具体的に）開示されているＳＭＡＣ模倣物（すなわち、化合物）又はその薬学的に許容され得る塩；
・国際公開第２０１５／０２５０１８号に（一般的に及び／又は具体的に）開示されているＳＭＡＣ模倣物（すなわち、化合物）又はその薬学的に許容され得る塩；
・国際公開第２０１５／０２５０１９号に（一般的に及び／又は具体的に）開示されているＳＭＡＣ模倣物（すなわち、化合物）又はその薬学的に許容され得る塩；
・国際公開第２０１６／０２３８５８号に（一般的に及び／又は具体的に）開示されているＳＭＡＣ模倣物（すなわち、化合物）又はその薬学的に許容され得る塩；
・国際公開第２００８／００１６８９３号に（一般的に及び／又は具体的に）開示されているＳＭＡＣ模倣物（すなわち、化合物）又はその薬学的に許容され得る塩；
・ＬＣＬ１６１、すなわち、国際公開第２００８／０１６８９３号（２８／２９頁；［１２２］）の実施例１における化合物Ａ又はその薬学的に許容され得る塩；
・Ｄｅｂｉｏ－１１４３として公知のＳＭＡＣ模倣物又はその薬学的に許容され得る塩；
・ビリナパントとして公知のＳＭＡＣ模倣物又はその医薬的に許容され得る塩；
・ＡＳＴＸ－６６０として公知のＳＭＡＣ模倣物又はその薬学的に許容され得る塩；
・ＣＵＤＣ－４２７として公知のＳＭＡＣ模倣物又はその薬学的に許容され得る塩
・表２におけるＳＭＡＣ模倣物１～２６のいずれか１つ又はその薬学的に許容され得る塩
からなる群より選択される。
Figure 0007565384000008
Figure 0007565384000009

Figure 0007565384000010

Figure 0007565384000011

Figure 0007565384000012
表２における例示的な化合物１～１０は、国際公開第２０１３／１２７７２９号に開示されている。表２における例示的な化合物１１～２６は、国際公開第２０１６／０２３８５８号に開示されている。
本明細書で使用する場合、「ＳＭＡＣ模倣物／ＩＡＰアンタゴニスト」という用語は、互変異性体、薬学的に許容され得る塩、水和物又は溶媒和物（薬学的に許容され得る塩の水和物又は溶媒和物を含む）の形態にある、上記列記されたＳＭＡＣ模倣物も含む。また、この用語は、その全ての固体、好ましくは、結晶形態並びにその薬学的に許容され得る塩、水和物及び溶媒和物（薬学的に許容され得る塩の水和物及び溶媒和物を含む）の全ての結晶形態にあるＳＭＡＣ模倣物も含む。
上記列記された全てのＳＭＡＣ模倣物は、合成及び特性それぞれについて、当技術分野において公知である。上記言及された全ての特許出願は、その全体が参照により組み入れられる。
一実施態様では、ＳＭＡＣ模倣物は、ＬＣＬ１６１又はその薬学的に許容され得る塩である（Ａ１）。
別の実施態様では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２中の化合物１又はその薬学的に許容され得る塩である（Ａ２）。
別の実施態様では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２中の化合物２又はその薬学的に許容され得る塩である（Ａ３）。
別の実施態様では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２中の化合物３又はその薬学的に許容され得る塩である（Ａ４）。
別の実施態様では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２中の化合物４又はその薬学的に許容され得る塩である（Ａ５）。
別の実施態様では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２中の化合物５又はその薬学的に許容され得る塩である（Ａ６）。
別の実施態様では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２中の化合物６又はその薬学的に許容され得る塩である（Ａ７）。
別の実施態様では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２中の化合物７又はその薬学的に許容され得る塩である（Ａ８）。
別の実施態様では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２中の化合物８又はその薬学的に許容され得る塩である（Ａ９）。
別の実施態様では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２中の化合物９又はその薬学的に許容され得る塩である（Ａ１０）。
別の実施態様では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２中の化合物１０又はその薬学的に許容され得る塩である（Ａ１１）。
別の実施態様では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２中の化合物１１又はその薬学的に許容され得る塩である（Ａ１２）。
別の実施態様では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２中の化合物１２又はその薬学的に許容され得る塩である（Ａ１３）。
別の実施態様では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２中の化合物１３又はその薬学的に許容され得る塩である（Ａ１４）。
別の実施態様では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２中の化合物１４又はその薬学的に許容され得る塩である（Ａ１５）。
別の実施態様では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２中の化合物１５又はその薬学的に許容され得る塩である（Ａ１６）。
別の実施態様では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２中の化合物１６又はその薬学的に許容され得る塩である（Ａ１７）。
別の実施態様では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２中の化合物１７又はその薬学的に許容され得る塩である（Ａ１８）。
別の実施態様では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２中の化合物１８又はその薬学的に許容され得る塩である（Ａ１９）。
別の実施態様では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２中の化合物１９又はその薬学的に許容され得る塩である（Ａ２０）。
別の実施態様では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２中の化合物２０又はその薬学的に許容され得る塩である（Ａ２１）。
別の実施態様では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２中の化合物２１又はその薬学的に許容され得る塩である（Ａ２２）。
別の実施態様では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２中の化合物２２又はその薬学的に許容され得る塩である（Ａ２３）。
別の実施態様では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２中の化合物２３又はその薬学的に許容され得る塩である（Ａ２４）。
別の実施態様では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２中の化合物２４又はその薬学的に許容され得る塩である（Ａ２５）。
別の実施態様では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２中の化合物２５又はその薬学的に許容され得る塩である（Ａ２６）。
別の実施態様では、ＳＭＡＣ模倣物は、表２中の化合物２６又はその薬学的に許容され得る塩である（Ａ２７）。
全ての実施態様（Ａ１）～（Ａ２７）は、ＳＭＡＣ模倣物の性質に関して、実施態様（Ａ０）の好ましい実施態様である。
併用処置に関する好ましい実施態様では、リコンビナントラブドウイルスは、そのゲノム中で少なくとも１種のＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質又はその機能的変異体、好ましくは、（ｉ）ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＣＤ８０細胞外ドメインを含むＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、（ｉｉ）ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＣＤ８０細胞外ドメインを含み、ここで、ＣＤ８０細胞外ドメインが配列番号：１を含むか若しくはこれからなるか又は配列番号：１と少なくとも８０％の同一性を有するＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、（ｉｉｉ）ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＣＤ８０細胞外ドメインを含み、ここで、Ｆｃドメインが配列番号：２を含むか若しくはこれからなるか又は配列番号：２と少なくとも８０％の同一性を有するＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、（ｉｖ）ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＣＤ８０細胞外ドメインを含み、ここで、ＣＤ８０細胞外ドメインが配列番号：１を含むか若しくはこれからなるか又は配列番号：１と少なくとも８０％の同一性を有し、Ｆｃドメインが配列番号：２を含むか若しくはこれからなるか又は配列番号：２と少なくとも８０％の同一性を有するＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、（ｖ）ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＣＤ８０細胞外ドメインを含み、ここで、ＣＤ８０細胞外ドメインが配列番号：４のアミノ酸１～２０７からなるか又は配列番号：４のアミノ酸１～２０７と少なくとも８０％の同一性を有し、Ｆｃドメインが配列番号：４のアミノ酸２０８～４３３からなるか又は配列番号：４のアミノ酸２０８～４３３と少なくとも８０％の同一性を有するＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、（ｖｉ）シグナルペプチド配列を更に含む（ｉ）～（ｖ）のいずれかに記載のＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質又は（ｖｉｉ）配列番号：３を含むか又は配列番号：３と少なくとも８０％の同一性を有するＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質を含む群から選択されるヒトＣＤ８０細胞外ドメインをコードするリコンビナント水疱性口内炎ウイルスであり、ここで、リコンビナント水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子は、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子により置き換えられておりかつ／又は糖タンパク質Ｇは、ＬＣＭＶの糖タンパク質ＧＰにより置き換えられている。
併用処置に関する更に好ましい実施態様では、リコンビナントラブドウイルスは、そのゲノム中で水疱性口内炎ウイルスの核タンパク質（Ｎ）、大型タンパク質（Ｌ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）及び少なくとも１種のＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質又はその機能的変異体、好ましくは、ヒトＣＤ８０細胞外ドメインをコードするリコンビナント水疱性口内炎ウイルスであり、ここで、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質又はその機能的変異体は、（ｉ）ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＣＤ８０細胞外ドメインを含むＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、（ｉｉ）ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＣＤ８０細胞外ドメインを含み、ここで、ＣＤ８０細胞外ドメインが配列番号：１を含むか若しくはこれからなるか又は配列番号：１と少なくとも８０％の同一性を有するＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、（ｉｉｉ）ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＣＤ８０細胞外ドメインを含み、ここで、Ｆｃドメインが配列番号：２を含むか若しくはこれからなるか又は配列番号：２と少なくとも８０％の同一性を有するＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、（ｉｖ）ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＣＤ８０細胞外ドメインを含み、ここで、ＣＤ８０細胞外ドメインが配列番号：１を含むか若しくはこれからなるか又は配列番号：１と少なくとも８０％の同一性を有し、Ｆｃドメインが配列番号：２を含むか若しくはこれからなるか又は配列番号：２と少なくとも８０％の同一性を有するＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、（ｖ）ＩｇＧ１のＦｃドメインに融合したＣＤ８０細胞外ドメインを含み、ここで、ＣＤ８０細胞外ドメインが配列番号：４のアミノ酸１～２０７からなるか又は配列番号：４のアミノ酸１～２０７と少なくとも８０％の同一性を有し、Ｆｃドメインが配列番号：４のアミノ酸２０８～４３３からなるか又は配列番号：４のアミノ酸２０８～４３３と少なくとも８０％の同一性を有するＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、（ｖｉ）シグナルペプチド配列を更に含む（ｉ）～（ｖ）のいずれかに記載のＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質又は（ｖｉｉ）配列番号：３を含むか又は配列番号：３と少なくとも８０％の同一性を有するＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質を含む群から選択され、ここで、水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子は、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子により置き換えられておりかつ／又は糖タンパク質Ｇは、ＬＣＭＶの糖タンパク質ＧＰにより置き換えられており、ここで、核タンパク質（Ｎ）は、配列番号：７に記載されたアミノ酸又は配列番号：７と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の機能的変異体を含み、リンタンパク質（Ｐ）は、配列番号：８に記載されたアミノ酸又は配列番号：８と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の機能的変異体を含み、大型タンパク質（Ｌ）は、配列番号：９に記載されたアミノ酸又は配列番号：９と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の機能的変異体を含み、マトリックスタンパク質（Ｍ）は、配列番号：１０に記載されたアミノ酸又は配列番号：１０と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の機能的変異体を含む。
併用処置に関するより好ましい実施態様では、リコンビナントラブドウイルスは、そのゲノム中で少なくとも１種のＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質又はその機能的変異体、好ましくは、ヒトＣＤ８０細胞外ドメインをコードするリコンビナント水疱性口内炎ウイルスであり、ここで、ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質又はその機能的変異体は、配列番号：３を含むか若しくはこれからなるか又は配列番号：３と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有し、ここで、リコンビナント水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子は、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子により置き換えられておりかつ／又は糖タンパク質Ｇは、ＬＣＭＶの糖タンパク質ＧＰにより置き換えられている。
ウイルス生成、産生及びウイルス産生細胞
また、本発明は、本発明のリコンビナントラブドウイルス又はリコンビナント水疱性口内炎ウイルスを産生することを特徴とする、ウイルス産生細胞を提供する。
細胞は、任意の起源のものであることができ、単離された細胞として又は細胞集団に含まれる細胞として存在することができる。リコンビナントラブドウイルス又はリコンビナント水疱性口内炎ウイルスを産生する細胞は、ほ乳類細胞であるのが好ましい。より好ましい実施態様では、本発明のウイルス産生細胞は、ほ乳類細胞が多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）、神経幹細胞（ＮＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ細胞、任意のＨＥＫ２９３細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｆ又はＨＥＫ２９３Ｔ）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞若しくはベロ細胞又は骨髄由来腫瘍浸潤細胞（ＢＭ－ＴＩＣ）であることを特徴とする。
代替的には、ウイルス産生細胞は、ヒト細胞、サル細胞、マウス細胞又はハムスター細胞であることができる。当業者であれば、所定の細胞がウイルスを産生するかどうか、このため、特定の細胞が本発明の範囲内に入るかどうかを試験する際に使用するのに適した方法を知っている。この点において、本発明の細胞により産生されるウイルスの量は、特に限定されない。好ましいウイルス力価は、更に下流の処理を行うことなく、感染後の所定の培養細胞物の粗上清中に、１×１０７以上 ＴＣＩＤ５０/ml又は１×１０８以上 ゲノムコピー数/mlである。
特定の実施態様では、本発明のウイルス産生細胞は、細胞がＶＳＶのタンパク質Ｎ、Ｌ、Ｐ及びＭをコードする遺伝子ｎ、ｌ、ｐ及びｍからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子並びにＬＣＭＶ－ＧＰ、ダンデノング－ＧＰ又はモペイア－ＧＰ糖タンパク質をコードする遺伝子ｇｐの発現のための１つ以上の発現カセットを含むことを特徴とする。
本発明の意味におけるウイルス産生細胞は、複製不能なベクターからのリコンビナントラブドウイルスの産生のための古典的なパッケージング細胞及び複製可能なベクターからのリコンビナントラブドウイルスの産生のための産生細胞を含む。パッケージング細胞は、通常、パッケージングされる各ベクターに欠けておりかつ／又はウイルスの産生に必要な必須遺伝子の発現のための１種以上のプラスミドを含む。このような細胞は、所望の目的に適した適切な細胞系統を選択することができる当業者に公知である。
本発明のリコンビナントラブドウイルスを当業者に公知の方法に従って産生することができ、（１）細胞にトランスフェクションされたｃＤＮＡ又は（２）ヘルパー細胞にトランスフェクションされたｃＤＮＡの組み合わせ又は（３）感染性若しくは非感染性のリコンビナントラブドウイルスのいずれかを産生するのに必要な残りの成分又は活性をトランスに提供するヘルパー／ミニウイルスに更に感染させた細胞にトランスフェクションされたｃＤＮＡの使用を含むが、これらに限定されない。これらの方法のいずれか（例えば、ヘルパー／ミニウイルス、ヘルパー細胞系統又はｃＤＮＡトランスフェクションのみ）を使用するのに必要とされる最小成分は、（１）ラブドウイルスのＮタンパク質、Ｐタンパク質及びＬタンパク質によるゲノム（又はアンチゲノム）ＲＮＡのカプシド形成並びに（２）ゲノム又はアンチゲノム（複製中間体）ＲＮＡ等価物の複製のためのシス作用シグナルを含有するＤＮＡ分子である。
複製エレメント又はレプリコンは、ラブドウイルスのリーダー配列及びトレーラー配列を５’端及び３’端に最小限に含むＲＮＡの鎖である。ゲノムの意味では、リーダーは、３’端にあり、トレーラーは、５’端にある。これらの２つの複製シグナル間に配置された任意のＲＮＡが、次に複製されるであろう。リーダー領域及びトレーラー領域は、Ｎタンパク質によるカプシド形成の目的でかつ転写及び複製を開始するのに必要なポリメラーゼ結合のために、最小のシス作用エレメントを更に含有する必要がある。リコンビナントラブドウイルスを調製するために、Ｇ遺伝子を含有するミニウイルスは、リーダー領域、トレーラー領域及びＧタンパク質のｍＲＮＡを産生するのに適した開始及び終止シグナルを有するＧ遺伝子も含有するであろう。ミニウイルスが、Ｍ遺伝子を更に含む場合、Ｍタンパク質のｍＲＮＡを産生するのに適した開始及び終止シグナルも存在する必要がある。
リコンビナントラブドウイルスゲノム内に含まれる任意の遺伝子について、その遺伝子は、それらの遺伝子の発現及びタンパク質産物の産生を可能にするであろう適切な転写開始及び終止シグナルに隣接するであろう（Schnell et al., Journal of Virology, p.2318-2323, 1996）。「非感染性」リコンビナントラブドウイルスを産生するために、リコンビナントラブドウイルスは、最小レプリコンエレメント並びにＮ、Ｐ及びＬタンパク質を有する必要があり、Ｍ遺伝子を含有する必要がある。これにより、細胞から発芽するが、非感染性粒子であるウイルス粒子が産生される。「感染性」粒子を産生するために、ウイルス粒子は、例えば、付着タンパク質又はレセプターリガンドの使用により、ウイルス粒子の結合及び融合を媒介することができるタンパク質を更に含む必要がある。ラブドウイルスのネイティブなレセプターリガンドは、Ｇタンパク質である。
リコンビナントラブドウイルスのアセンブリを可能にするであろう任意の細胞を使用することができる。感染性ウイルス粒子を調製するための１つの方法は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ又は他の適切なバクテリオファージポリメラーゼ、例えば、Ｔ３若しくはＳＰ６ポリメラーゼをコードするプラスミドに適切な細胞系統を感染させることを含む。ついで、細胞をＧ、Ｎ、Ｐ、Ｌ及びＭラブドウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含有する個々のｃＤＮＡでトランスフェクションすることができる。これらのｃＤＮＡにより、リコンビナントラブドウイルス粒子を構築するためのタンパク質が提供されるであろう。細胞を当技術分野において公知の任意の方法によりトランスフェクションすることができる。
また、ラブドウイルスゲノムＲＮＡ等価物を含有する「ポリシストロン性ｃＤＮＡ」も細胞系統にトランスフェクションされる。感染性リコンビナントラブドウイルス粒子が、感染細胞において溶解性であることが意図される場合には、Ｎ、Ｐ、Ｍ及びＬタンパク質をコードする遺伝子は、任意の異種核酸セグメントと同様に存在する必要がある。感染性のリコンビナントラブドウイルス粒子が、溶解性であることが意図されない場合には、Ｍタンパク質をコードする遺伝子は、ポリシストロン性ＤＮＡに含まれない。「ポリシストロン性ｃＤＮＡ」は、Ｎ、Ｐ及びＬタンパク質をコードする遺伝子を含有する少なくとも転写単位を含むｃＤＮＡを意味する。また、リコンビナントラブドウイルスのポリシストロン性ＤＮＡは、タンパク質変異体若しくはそのポリペプチドフラグメント又は治療用核酸若しくはタンパク質をコードする遺伝子を含有することもできる。代替的には、最初に産生されたウイルス粒子と最初に会合する任意のタンパク質又はそのフラグメントをトランスで供給することができる。
ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質をコードする遺伝子を含むポリシストロン性ｃＤＮＡも企図される。企図されるポリシストロン性ｃＤＮＡは、タンパク質変異体をコードする遺伝子、レポーターをコードする遺伝子、治療用核酸及び／又はＮ－Ｐ－Ｌ遺伝子若しくはＮ－Ｐ－Ｌ－Ｍ遺伝子のいずれかを含有することができる。リコンビナントラブドウイルスを生成する第１の工程は、ｃＤＮＡからのゲノム又はアンチゲノム等価物であるＲＮＡの発現である。ついで、そのＲＮＡは、Ｎタンパク質によりパッケージングされ、ついで、Ｐ／Ｌタンパク質により複製される。このようにして産生されたリコンビナントウイルスを回収することができる。Ｇタンパク質が、リコンビナントＲＮＡゲノムに存在しない場合には、それは、典型的には、トランスで供給される。Ｇ及びＭタンパク質の両方が存在しない場合には、両方ともトランスで供給される。「非感染性ラブドウイルス」粒子を調製するために、細胞にトランスフェクションされたポリシストロン性ｃＤＮＡがラブドウイルスのＮ、Ｐ及びＬ遺伝子のみを含有するであろうことを除いて、手順は、上記と同じであることができる。非感染性ラブドウイルス粒子のポリシストロン性ｃＤＮＡは、タンパク質をコードする遺伝子を更に含有することができる。
トランスフェクションされた細胞は、通常、所望の温度、通常、約３７度で少なくとも２４時間インキュベーションされる。非感染性ウイルス粒子については、上清を回収し、ウイルス粒子を単離する。感染性ウイルス粒子については、ウイルスを含有する上清を回収し、新鮮な細胞に移す。新鮮な細胞を約４８時間インキュベーションし、上清を回収する。
本発明の他の特徴及び利点は、以下のより詳細な実施例から明らかになるであろう。実施例は、本発明の原理を例として例示する。
実施例１
ＶＳＶ－ＧＰ－ｈｕＣＤ８０－Ｆｃ（ＩｇＧ１）の生成－ウイルスレスキュー
腫瘍溶解性ウイルスＶＳＶ－ＧＰのゲノムを、ＣＤ８０－Ｆｃ遺伝子をコードするように操作して、ウイルス複製中に腫瘍部位でＣＤ８０－Ｆｃ融合タンパク質を局所的に発現させた。複製可能なＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃウイルス変異体を、ＶＳＶ－ＧＰ及びヒトＣＤ８０－Ｆｃの完全なウイルスゲノムのためのｃＤＮＡを含有する細菌プラスミドから、逆遺伝学（目的の遺伝子（ＧＯＩ）のクローニング、ウイルスレスキュー及び反復プラーク精製）により生成した。ｐＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃプラスミドは、Ｔ７プロモーターの制御下でＶＳＶインディアナ血清型の完全なｃＤＮＡゲノムを含有するプラスミドｐＶＳＶ－ＸＮ１（Schnell et al.）に基づいた。ｐＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃ変異体を生成するために、ＶＳＶ Ｇエンベロープタンパク質のための全配列をリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ、ＷＥ－ＨＰＩ系統）由来のＧＰエンベロープタンパク質のコドン最適化配列により置換した。更に、ＣＤ８０－Ｆｃ遺伝子をコードする合成核酸をＧｉｂｓｏｎアセンブリにより、糖タンパク質ＧＰとウイルスポリメラーゼＬとの間に挿入した。ウイルス感染との関連でのＣＤ８０－Ｆｃ遺伝子の転写は、ＣＤ８０－Ｆｃオープンリーディングフレームの３’端での追加のＶＳＶ開始シグナル配列及び５’端での追加の停止シグナル配列により確実となる。
感染性ウイルスを標準的なトランスフェクション法（例えば、ＣａＰＯ４沈殿、リポソームＤＮＡ送達）によるＨＥＫ２９３Ｔ又は任意の他のＶＳＶ許容性細胞系統のトランスフェクションにより、プラスミドｃＤＮＡから回収（又はレスキュー）した。簡潔に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＶＳＶタンパク質Ｎ、Ｐ及びＬ並びにコドン最適化Ｔ７－ポリメラーゼをコードするｐＳＦ－ＣＡＧ－ａｍｐベースの発現プラスミドでトランスフェクションした。更に、ＶＳＶ－ＧＰ、ＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃ又はその変異体のウイルスゲノムｃＤＮＡをコードするプラスミドを同時トランスフェクションした。レスキュープロセスの第１の工程において、Ｔ７ポリメラーゼにより、プラスミドコード化ウイルスｃＤＮＡからウイルスＲＮＡゲノムが転写される。第２の工程において、同時トランスフェクションされたプラスミドから外因的に発現されるＶＳＶ－Ｌ及びＰタンパク質により、ウイルスＲＮＡゲノムが更に増幅される。ウイルスＲＮＡゲノムをＶＳＶ－Ｎタンパク質により同時転写的にカプセル化する。更に、Ｐ／Ｌポリメラーゼ複合体により、ウイルス遺伝子産物であるＮ、Ｐ、Ｍ、ＧＰ及びＬ並びに挿入されたＣＤ８０－Ｆｃ変異体の完全なセットの転写が可能となる。続けて、ウイルスＲＮＡゲノムを、リボ核タンパク質、マトリックスタンパク質及びウイルスエンベロープＧＰを含有する感染性ＶＳＶ粒子中にパッケージングする。ウイルス粒子は、発芽により細胞から放出される。
レスキューされたウイルスを、許容細胞系統、例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ等で最初に継代した。数ラウンドのプラーク精製を標準的な方法により、ウイルスシードストックの生成前に行った。簡潔に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をレスキューされたプレシードの系列１０倍希釈物に感染させた。約２時間後、細胞単層を２回洗浄し、０．８％ 低融点アガロースを含有する培地で覆った。感染後２４時間～４８時間で、プラークを採取し、ウイルスを追加ラウンドのプラーク精製に使用するか又はウイルスシードストックを生成した。
実施例２
ウイルス適応度の検証－ＴＣＩＤ５０／細胞殺傷
図３Ａ～図３Ｂ
懸濁培地（Freestyle（商標）２９３発現培地（ThermoFisher Scientific））中で増殖させたＨＥＫ２９３Ｆ細胞を低ＭＯＩ（０．０００５）のＶＳＶ－ＧＰ又はＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃのいずれかに感染させた。感染の日に、細胞は６０～７０％コンフルエントを有した。１つのウェルを計数し（CountessTM細胞カウンター、Invitrogen）、その後、他のウェルをウイルス構築物ＶＳＶ－ＧＰ（ＧＰ）又はＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃのうちの一方の０．００５ ＭＯＩに感染させた。培養上清（総容量３mL）を回収し、サンプルをウイルス複製及び細胞殺傷について、感染後８時間、１６時間、２４時間、３２時間、４０時間及び４８時間で分析した。ウイルス複製を、示された時点での培養物の上清中のｑＰＣＲによるウイルスゲノムの検出を使用して評価した（図３Ａ）。ウイルス誘引性細胞殺傷を、示された時点での培養サンプル中の生存細胞を計数することにより評価した（図３Ｂ）。両方のウイルスは、同じように挙動する。これは、ヒトＣＤ８０－Ｆｃ導入遺伝子の追加は、ウイルス適応度に影響を及ぼさないことを示す。
実施例３
カーゴ発現－ＥＬＩＳＡ
図４
ＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃ感染ＨＥＫ２９３細胞からの上清を、ＥＬＩＳＡを使用して、ウイルス感染後の種々の時点で分析した。感染したほ乳類細胞によるウイルス性にコードされるＣＤ８０－Ｆｃ融合タンパク質の発現を、ＨＥＫ２９３細胞を親ウイルスＶＳＶ－ＧＰ又はＣＤ８０－Ｆｃをコードする新たなウイルスＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃ（両方ともＭＯＩ１）に感染させることにより確認した。組織培養上清中のＥＬＩＳＡにより測定されたＣＤ８０－Ｆｃ導入遺伝子の発現は、細胞の感染後２４、３１及び４８時間で容易に検出可能であった。
実施例４
ＶＳＶ－ＧＰ－ｈｕＣＤ８０－Ｆｃ（ｉｎ ｖｉｖｏ）－ＣＴ２６．ＣＬ２５－ＩＦＮＡＲＫＯ腫瘍モデル（カーゴ高発現）
図５Ａ～図５Ｂ
インターフェロンアルファレセプター（ＩＦＮＡＲ）を欠くように操作されたＣＴ２６．ＣＬ２５－ＩＦＡＲＫＯ腫瘍モデルを使用して、ヒト患者の状況をより良く反映し、マウス系におけるウイルス複製及びカーゴ発現の改善を可能にするために、親ウイルスＶＳＶ－ＧＰ及びＣＤ８０－Ｆｃをコードする新たなウイルスＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃを引き続きに比較した。この目的で、２種のウイルスを、確立された腫瘍を有するマウスにおいて、０日目及び３日目に、２×１０７ＴＣＩＤ５０の用量で静脈内（ｉ．ｖ．）に投与した（生存グラフ）。パネル（Ａ）に示されたように、親ウイルスＶＳＶ－ＧＰでは、この低ウイルス用量で腫瘍保有動物の明らかに改善された生存が実証されなかった。一方、カーゴ武装化された新たなウイルスであるＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃによる処置により、対照動物及びＶＳＶ－ＧＰ処置動物と比較して、顕著な生存利益がもたらされた。更に、ＣＤ８０－Ｆｃをコードするウイルスによる処置では、対照動物及びＶＳＶ－ＧＰ処置動物と比較して、体重減少は増加しなかった（Ｂ）。これは、この新規なウイルスの安全性を主張している。
実施例５
ＶＳＶ－ＧＰ－ｈｕＣＤ８０－Ｆｃ（ｉｎ ｖｉｖｏ）－Ｂ１６－Ｆ１－ＯＶＡ及びＥＭＴ－６腫瘍モデル（カーゴ低発現）
図６Ａ～図６Ｃ及び図７Ａ～図７Ｂ
最小限のウイルス複製、したがって、カーゴ（ＣＤ８０－Ｆｃ）発現のみが可能な低許容腫瘍モデルＢ１６－Ｆ１－ＯＶＡ（図６Ａ～図６Ｃ）及びＥＭＴ－６（図７Ａ～図７Ｂ）を、０日目及び３日目に、親ウイルスＶＳＶ－ＧＰ又はＣＤ８０－Ｆｃをコードする新たなウイルスＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃの２回の腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射で処置した。十分に確立された腫瘍を有するマウスのみを注射に使用した。Ｂ１６－Ｆ１－ＯＶＡ腫瘍モデルをＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃで処置すると、対照及びＶＳＶ－ＧＰと比較して、腫瘍増殖遅延が改善された。ＥＭＴ－６腫瘍モデルにおいて、ＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃで処置すると、対照（処置動物の０％）及びＶＳＶ－ＧＰ（処置動物の８％）処置マウスと比較して、腫瘍排除率が改善された（処置動物の３３％）。これらの結果は、低レベルのウイルス複製及びカーゴ発現を有する腫瘍においてさえも、親ウイルスＶＳＶ－ＧＰを上回るカーゴ武装化された新規なウイルスであるＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃのプラス面の可能性を主張している。これは、ウイルスの複製能力に密接に関連する。
実施例６
ｉｎ ｖｉｖｏでのウイルスの持続性及び複製並びにカーゴ発現
図８～図１０
確立されたＣＴ２６．ＣＬ２５－ＩＦＮＡＲＫＯ（インターフェロンアルファレセプターを欠失したＣＴ２６．ＣＬ２５腫瘍細胞）腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスを対照として使用し又は１×１０８ＴＣＩＤ５０のＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃの単回ｉ．ｖ．注射により処置した。処置後３日及び７日で、腫瘍を切除した。全ＲＮＡを抽出し、ＶＳＶ ｎ遺伝子に特異的なｑＰＣＲプライマーを使用して分析した（図８）。確立されたＬＬＣ１－ＩＦＮＡＲＫＯ（インターフェロンアルファレセプターを欠失したＬＬＣ１腫瘍細胞）腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを対照として使用し又は１×１０８ＴＣＩＤ５０のＶＳＶ－ＧＰ若しくはＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃの単回ｉ．ｖ．注射により処置した。処置後３日で、腫瘍を切除し、ＲＮＡを製造業者の指示に従って、ウイルスとカーゴ特異的プローブ（スパイクイン）とを組み合わせて、NanoString製の「Pan Cancer Immune Profiling Panel」を使用して分析した（図９）。まとめると、結果から、処置された動物におけるＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃの活発な複製及び腫瘍におけるカーゴのｍＲＮＡ発現が示される。ピーク複製は、３日目頃に観察された。また、ウイルスは、７日目まで持続する。確立されたＬＬＣ１－ＩＦＮＡＲＫＯ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを対照として使用し又は１×１０８ＴＣＩＤ５０のＶＳＶ－ＧＰ若しくはＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃの単回ｉ．ｖ．注射により処置した。処置後３日で、腫瘍を切除し、ホルマリン固定し、パラフィン包埋した。薄切片を、ＶＳＶ－Ｎタンパク質又はヒトＣＤ８０タンパク質に対する特異的抗体で染色した（図１０）。Ｎタンパク質染色は、ＶＳＶ－ＧＰ及びＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃの両方について同様であったが、ヒトＣＤ８０は、後者についてのみ特異的に検出された。
実施例７
ＣＤ８０－Ｆｃにより、ヒト混合白血球培養においてＴ細胞共刺激が提供される。ＦｃγＲ遮断により、Ｆｃの必須の役割であるＴ細胞活性化が低下する。
図１２及び図１３Ａ～図１３Ｄ
ヒト混合白血球培養物（２つの遺伝的に異なる個体から選択された白血球集団を共培養し、同種異系Ｔ細胞刺激をもたらす）を使用して、リコンビナントＣＤ８０－ＦｃのＴ細胞共刺激能（図１２及び図１３）及びＴ細胞共刺激に対する野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃの寄与（図１３）を評価した。この目的で、図１２の培養物を、ＩＦＮγを読み出しとして使用して、漸増量のリコンビナントＣＤ８０－Ｆｃで刺激した。ＩＦＮγ分泌は、培養物へのＣＤ８０－Ｆｃの添加により、そのＴ細胞共刺激能を検証する用量依存的様式で強力に改善された。これらのデータに基づいて、ＣＤ８０－Ｆｃ融合タンパク質ヒト混合白血球培養物におけるＦｃの寄与を解明することを目的として、再度、ＦｃγＲ遮断の追加の有無において（ヒト血清の非存在下で）、ＩＦＮγを読み出しとして使用して、リコンビナントＣＤ８０－Ｆｃタンパク質（１０μg/ml）で刺激した（図１３）。種々の部分図（Ａ～Ｄ）に、種々のドナーペアを示す。ＣＤ８０－Ｆｃ媒介性Ｔ細胞刺激は、ＦｃγＲ遮断の追加により強力に減少した。これは、ＦｃγＲ相互作用及びＦｃγＲ媒介性クラスタリングがＣＤ８０－Ｆｃの活性に重要であることを示す。
実施例８
ＣＤ３活性化ＰＢＭＣ（Ｆ（ａｂ）２及びＩｇＧ４）におけるＣＤ８０－ＦｃによるＴ細胞活性化のＦｃγＲ依存性
図１４Ａ～図１４Ｆ
ヒトＰＢＭＣ培養物を、低用量の抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３；１０ng/ml）の有無及び漸増濃度のリコンビナントＣＤ８０－Ｆｃタンパク質で、ＩＦＮγ（図１４Ａ～図１４Ｃ）又はＩＬ２（図１４Ｄ～図１４Ｆ）を読み出しとして使用して刺激した。これらの読み出しを標準的なＥＬＩＳＡにより検出した。リコンビナントＣＤ８０－ＦｃのＴ細胞共刺激能及びＴ細胞共刺激に対する野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃの寄与を確認し、Ｆｃ選択を検証するために、下記リコンビナントＣＤ８０－Ｆｃ変異体を引き続き比較した：ＣＤ８０－Ｆｃ（野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃを有するウイルスカーゴのリコンビナントバージョン、図１４Ｃ及び図１４Ｆ）；ＣＤ８０ ＦＡＢ（ＣＤ８０－ＦｃのＦ（ａｂ）２変異体、Ｆｃを欠いているが二価性を保持している、図１４Ａ及び図１４Ｄ）及びＣＤ８０ ＩｇＧ４（ＣＤ８０－Ｆｃと同様であるが、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃを有する、図１４Ｂ及び図１４Ｅ）。ＣＤ８０－Ｆｃ自体は、ＰＢＭＣを顕著には刺激しないが、ＣＤ８０－Ｆｃと刺激性抗ＣＤ３抗体との併用により、ＩＦＮγ及びＩＬ２分泌により証明されるように、Ｔ細胞刺激の用量依存的増加がもたらされた（図１４Ｃ及び図１４Ｆ）。反対に、ＣＤ８０－ＦｃのＦｃ欠損Ｆ（ａｂ）２変異体は活性ではなく、単独でも又は抗ＣＤ３刺激との組み合わせでも、Ｔ細胞刺激の改善がもたらされなかった（図１４Ａ及び図１４Ｄ）。ＩｇＧ４ベースのＣＤ８０融合体（図１４Ｂ及び図１４Ｅ）は、Ｔ細胞共刺激能を示したが、新規なウイルスＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃに操作されたウイルスカーゴに類似するＩｇＧ１ベースのＣＤ８０融合体構築物（図１４Ｂ及び図１４Ｆ）よりはるかに低い程度であった。これらの結果から、再度、ＣＤ８０－ＦｃのＦｃγＲ依存性及びヒトＩｇＧ１ Ｆｃの選択が確認される。更に、同時ＴＣＲ刺激を伴わないＣＤ８０－Ｆｃ活性の欠如は、その好ましい安全性プロファイルを主張している。
実施例９
ＶＳＶ－ＧＰにより、ＣＤ８０－Ｆｃ ＭｏＡを支持する感染腫瘍内のＦｃγＲの局所的増加が誘引される。
図１５
Ｔ細胞共刺激に対するウイルスＣＤ８０－ＦｃカーゴのＦｃγＲ依存性を考慮して、腫瘍におけるＦｃγＲ発現に対するＶＳＶ－ＧＰ感染の影響を調査した。この目的で、対照又はＶＳＶ－ＧＰ感染ＬＬＣ１－ＩＦＮＡＲＫＯ腫瘍におけるＦｃγＲ発現のNanoStringベースの測定を感染後７日で行った。マウスを未処置のままにするか又は１０８ ＴＣＩＤ５０のＶＳＶ－ＧＰのウイルス用量で感染させた。Ｘ軸は、異なるＦｃγＲ（１、２ｂ、３又は４）についての測定値を示し、Ｙ軸は、相対発現を示す。データから明らかに実証されているように、ＶＳＶ－ＧＰ感染腫瘍は、予想外に、４つ全ての分析されたＦｃγＲについて発現の強力なアップレギュレーションを示す。これらのデータから、腫瘍溶解性ウイルスＶＳＶ－ＧＰ及びＦｃγＲ依存性の、ウイルス性にコードされるカーゴＣＤ８０－Ｆｃの好ましい治療的相互作用のための機構的基礎が提供され、感染腫瘍内でのウイルス媒介性ＦｃγＲアップレギュレーションを形成する利益がもたらされる。
実施例１０
ＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃにより、親ウイルスＶＳＶ－ＧＰと比較して、優れた腫瘍特異的Ｔ細胞免疫が誘引される。
図１６Ａ～図１６Ｃ
腫瘍抗原特異的Ｔ細胞免疫に対するウイルス性にコードされるＣＤ８０－Ｆｃカーゴの影響を、親ウイルスＶＳＶ－ＧＰ又は新たなウイルスＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃのいずれかにより処置されたＣＴ２６．ＣＬ２５－ＩＦＮＡＲＫＯ腫瘍モデルを使用して解明した。Ｇｐ７０／腫瘍特異的Ｔ細胞を図１６Ｃに示されるように処置されたマウスの脾臓及び血液において、それぞれＥＬＩＳＰＯＴ（図１６Ａ）及びＦＡＣＳベースのDextramer染色（図１６Ｂ）により検出した。ＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃ群対ＶＳＶ－ＧＰ群における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の頻度の顕著な増加から、新規なカーゴ武装化ウイルス対親ウイルスのプラス面の可能性が示され、更に、新規な腫瘍溶解性ウイルスＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－Ｆｃの改善された抗腫瘍活性のための免疫学的／機構的基礎が提供される。
実施例１１
ＣＤ８０－Ｆｃは、ＰＤ－Ｌ１と相互作用しない。
図１７
ＣＤ８０は、プログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）と直接相互作用することが可能であり、それにより、活性化Ｔ細胞上のＰＤ－Ｌ１とそのレセプターであるプログラム細胞死１（ＰＤ－１）との阻害相互作用を遮断することができると主張されている。ＶＳＶ－ＧＰ－ＣＤ８０－ＦｃでコードされるＣＤ８０－Ｆｃ融合タンパク質が、ＰＤ－Ｌ１と直接相互作用するかどうかを決定するために、ヒトＰＤ－Ｌ１で安定にトランスフェクションされたＣＨＯ－Ｋ１細胞について、結合研究を行った。ＰＤ－Ｌ１特異的抗体であるアベルマブを陽性対照として使用した。アベルマブは、ＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ－Ｌ１細胞の表面上のＰＤ－Ｌ１に容易に結合したが、リコンビナントＣＤ８０－Ｆｃタンパク質は、試験した全ての用量レベルでＰＤ－Ｌ１に結合しなかった。したがって、ＣＤ８０－Ｆｃは、ＰＤ－Ｌ１に直接結合しないと結論付けられた。
実施例１２
α－ＰＤ－１及びＣＤ８０－Ｆｃにより、相加的にＴ細胞刺激が改善される。
図１８Ａ～図１８Ｂ
抗体媒介性ＰＤ－１阻害と組み合わせたＣＤ８０－Ｆｃ媒介性Ｔ細胞共刺激が、単独療法処置に対して更なる利益を提供することが可能であるかどうかという疑問に対処するために、Ｔ細胞レポーター系を利用した。この場合、安定してＰＤ－１を発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、生化学的に検出可能であるルシフェラーゼ活性をアップレギュレーションすることにより、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）刺激に応答する。ここでは、Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１レポーター細胞をＦｃγＲ陽性ＴＨＰ１－ＰＤ－Ｌ１細胞（ＦｃγＲ陰性ＣＨＯ－Ｋ１細胞とは対照的に）と共培養し、ＰＤ－Ｌ１を安定に発現させた。ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との相互作用により、ガン患者において観察されるＴ細胞阻害に匹敵する、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞活性化の阻害がもたらされる。ＴＣＲ刺激は、ＴＨＰ１細胞上のＣＤ３３とＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞上のＣＤ３とを連結する二重特異性ＢｉＴＥ分子の添加により達成される。図１８Ａから分かるように、ＰＤ－１遮断抗体ペンブロリズマブは、阻害性ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断することにより、ＣＤ３×ＣＤ３３ ＢｉＴＥ媒介性Ｔ細胞刺激を用量依存的に回復させることが可能である。同時にかつ全く予想外なことに、ＣＤ８０－Ｆｃ自体が、阻害性ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１相互作用にもかかわらず、用量依存的にＴ細胞共刺激を提供し、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞活性化を改善することが可能である。ジギトニン（Ｄｉｇ）特異的抗体をアイソタイプ対照として使用した。図１８Ｂにおいて、固定された抗ＰＤ－１濃度（１０nM、飽和状態）を、漸増濃度のリコンビナントＣＤ８０－Ｆｃと組み合わせた。抗ＰＤ－１抗体の上にＣＤ８０－Ｆｃを添加すると、優れたＴ細胞活性化がもたらされる。これは、これらの補完的な作用様式により駆動される、これらの異なる治療様式の好ましい相互作用の明確な証拠を提供する。
実施例１３
ＶＳＶ－ＧＰ－ｍｕＣＤ８０－Ｆｃ（ｉｎ ｖｉｖｏ）－ＣＴ２６．ＣＬ２５－ＩＦＮＡＲＫＯ腫瘍モデル（カーゴ高発現）
図１９Ａ～図１９Ｃ
再度、ＣＴ２６．ＣＬ２５－ＩＦＮＡＲＫＯ腫瘍モデルを使用して、この研究では、リコンビナントマウスＣＤ８０Ｆｃ、ＶＳＶ－ＧＰ又はＶＳＶ－ＧＰ－ｍｕＣＤ８０Ｆｃのｉｎ ｖｉｖｏ有効性を比較する。この目的で、樹立された腫瘍を有するマウスを０日目及び３日目に、１×１０８ＴＣＩＤ５０のウイルス用量並びに０日目、３日目及び６日目に、１mg/kg リコンビナントマウスＣＤ８０－Ｆｃそれぞれでｉ．ｖ．処置した。
図１９のパネル（Ａ）に示されたように、生存曲線から、ＶＳＶ－ＧＰ－ｍｕＣＤ８０Ｆｃ処置群において治療アウトカムの改善が示された。リコンビナントＣＤ８０Ｆｃタンパク質又はＶＳＶ－ＧＰを上回る有意な生存利益を１×１０８ＴＣＩＤ５０のＶＳＶ－ＧＰ－ｍｕＣＤ８０Ｆｃ（Ｌｏｇ－ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定；Ｐ値０．０３９４）により示すことができた。
図１９（Ｂ）に示された平均腫瘍サイズを単一腫瘍増殖曲線にまとめる。これは、ＶＳＶ－ＧＰ－ｍｕＣＤ８０Ｆｃ（用量１×１０８ＴＣＩＤ５０）による処置後の強力な腫瘍増殖抑制を反映している。これは、ＶＳＶ－ＧＰ及び１mg/kg リコンビナントＣＤ８０Ｆｃタンパク質をはるかに上回った。
体重の減少が、両方のウイルスの最初の注射後に観察された（図１９のパネル（Ｃ））が、直ちに回復が起こり、物質のその後の注射により影響されず、親ウイルス（ＶＳＶ－ＧＰ）とｍｕＣＤ８０－Ｆｃをコードするウイルス（ＶＳＶ－ＧＰ－ｍｕＣＤ８０Ｆｃ）との間で著しく異なることはなかった。
まとめると、この研究では、特に、リコンビナントマウスＣＤ８０Ｆｃ又はＶＳＶ－ＧＰのｉｎ ｖｉｖｏ効果を、ＶＳＶ－ＧＰ－ｍｕＣＤ８０Ｆｃと比較した。ウイルス骨格にｍｕＣＤ８０Ｆｃを導入することにより、腫瘍増殖及び全生存に対する相乗効果が達成されることが示された。

Claims (32)

  1. そのゲノム中で少なくとも１種のＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質をコードするリコンビナント水疱性口内炎ウイルスであって、
    ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質は、ＣＤ８０の細胞外ドメインを含み、ＩｇＧのＦｃドメインを更に含み、そして、（ｉ）配列番号：４を含むＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、（ｉｉ）シグナルペプチド配列を更に含む（ｉ）に記載のＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、及び（ｉｉｉ）配列番号：３を含むＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質を含む群から選択され、
    リコンビナント水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子が、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子により置き換えられており、かつ／又は、糖タンパク質Ｇは、ＬＣＭＶの糖タンパク質ＧＰにより置き換えられている、
    リコンビナント水疱性口内炎ウイルス。
  2. 前記ゲノムが、配列番号：３を含むＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質をコードする、請求項１記載のリコンビナント水疱性口内炎ウイルス。
  3. そのゲノム中で少なくとも水疱性口内炎ウイルスの核タンパク質（Ｎ）、大型タンパク質（Ｌ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）及び少なくとも１種のＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質をコードする、請求項１記載のリコンビナント水疱性口内炎ウイルスであって、
    ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質は、ＣＤ８０の細胞外ドメインを含み、ＩｇＧのＦｃドメインを更に含み、そして、（ｉ）配列番号：４を含むＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、（ｉｉ）シグナルペプチド配列を更に含む（ｉ）に記載のＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、及び（ｉｉｉ）配列番号：３を含むＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質を含む群から選択され、
    リコンビナント水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子が、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子により置き換えられており、かつ／又は、糖タンパク質Ｇは、ＬＣＭＶの糖タンパク質ＧＰにより置き換えられている、
    リコンビナント水疱性口内炎ウイルス。
  4. 核タンパク質（Ｎ）が、配列番号：７に記載されたアミノ酸配列、又は配列番号：７と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の機能的変異体を含む、請求項３記載のリコンビナント水疱性口内炎ウイルス。
  5. リンタンパク質（Ｐ）が、配列番号：８に記載されたアミノ酸配列、又は配列番号：８と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の機能的変異体を含む、請求項３又は４記載のリコンビナント水疱性口内炎ウイルス。
  6. 大型タンパク質（Ｌ）が、配列番号：９に記載されたアミノ酸配列、又は配列番号：９と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の機能的変異体を含む、請求項３～５のいずれか一項記載のリコンビナント水疱性口内炎ウイルス。
  7. マトリックスタンパク質（Ｍ）が、配列番号：１０に記載されたアミノ酸配列、又は配列番号：１０と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の機能的変異体を含む、請求項３～６のいずれか一項記載のリコンビナント水疱性口内炎ウイルス。
  8. － 核タンパク質（Ｎ）が、配列番号：７に記載されたアミノ酸配列、又は配列番号：７と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の機能的変異体を含み、
    － リンタンパク質（Ｐ）が、配列番号：８に記載されたアミノ酸配列、又は配列番号：８と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の機能的変異体を含み、
    － 大型タンパク質（Ｌ）が、配列番号：９に記載されたアミノ酸配列、又は配列番号：９と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の機能的変異体を含み、
    － マトリックスタンパク質（Ｍ）が、配列番号：１０に記載されたアミノ酸配列、又は配列番号：１０と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の機能的変異体を含む、
    請求項３～７のいずれか一項記載のリコンビナント水疱性口内炎ウイルス。
  9. 複製可能である、請求項１～８のいずれか一項記載のリコンビナント水疱性口内炎ウイルス。
  10. そのゲノム中で水疱性口内炎ウイルスの核タンパク質（Ｎ）、大型タンパク質（Ｌ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）及び少なくとも１種のＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質をコードする、請求項１記載のリコンビナント水疱性口内炎ウイルスであって、
    ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質は、
    ＣＤ８０の細胞外ドメインを含み、ＩｇＧのＦｃドメインを更に含み、そして、
    （ｉ）配列番号：４を含むＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、
    （ｉｉ）シグナルペプチド配列を更に含む（ｉ）に記載のＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質、及び
    （ｉｉｉ）配列番号：３を含むＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質
    を含む群から選択され、
    水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子は、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子により置き換えられており、かつ／又は、糖タンパク質Ｇは、ＬＣＭＶの糖タンパク質ＧＰにより置き換えられており、
    － 核タンパク質（Ｎ）は、配列番号：７に記載されたアミノ酸、又は配列番号：７と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の機能的変異体を含み、
    － リンタンパク質（Ｐ）は、配列番号：８に記載されたアミノ酸、又は配列番号：８と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の機能的変異体を含み、
    － 大型タンパク質（Ｌ）は、配列番号：９に記載されたアミノ酸、又は配列番号：９と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の機能的変異体を含み、
    － マトリックスタンパク質（Ｍ）は、配列番号：１０に記載されたアミノ酸、又は配列番号：１０と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の機能的変異体を含む、
    リコンビナント水疱性口内炎ウイルス。
  11. 請求項１～１０のいずれか一項記載のリコンビナント水疱性口内炎ウイルスを含む、医薬組成物。
  12. 医薬として使用するための、請求項１～１０のいずれか一項記載のリコンビナント水疱性口内炎ウイルス又は請求項１１記載の医薬組成物。
  13. ガンの処置に使用するための、請求項１～１０のいずれか一項記載のリコンビナント水疱性口内炎ウイルス又は請求項１１記載の医薬組成物。
  14. ガンが、固形ガンである、請求項１３記載のリコンビナント水疱性口内炎ウイルス又は医薬組成物。
  15. 固形ガンが、脳ガン、子宮内膜ガン、膣ガン、肛門ガン、中咽頭扁平上皮ガン、胃ガン、胃食道接合部腺ガン、食道ガン、肝細胞ガン、膵臓腺ガン、胆管ガン、膀胱尿路上皮ガン、転移性メラノーマ、前立腺ガン、乳ガン、卵巣ガン、頭頸部扁平上皮ガン（ＨＮＳＣＣ）、神経膠芽腫、非小細胞肺ガン、脳腫瘍、小細胞肺ガン、生殖器腫瘍、卵巣腫瘍、精巣腫瘍、内分泌腫瘍、胃腸腫瘍、膵臓腫瘍、肝臓腫瘍、腎臓腫瘍、結腸腫瘍、結腸直腸腫瘍、膀胱腫瘍、前立腺腫瘍、皮膚腫瘍、メラノーマ、呼吸器腫瘍、肺腫瘍、乳房腫瘍、頭頸部腫瘍、頭頸部扁平上皮ガン（ＨＮＳＣＣ）及び骨腫瘍を含むリストから選択される、請求項１４記載のリコンビナント水疱性口内炎ウイルス又は医薬組成物。
  16. リコンビナント水疱性口内炎ウイルス又は医薬組成物が、腫瘍内又は静脈内に投与されるべきものである、請求項１２～１５のいずれか一項記載のリコンビナント水疱性口内炎ウイルス又は医薬組成物。
  17. リコンビナント水疱性口内炎ウイルス又は医薬組成物が、少なくとも１回腫瘍内に投与され、その後、静脈内に投与されるべきものである、請求項１２～１６のいずれか一項記載のリコンビナント水疱性口内炎ウイルス又は医薬組成物。
  18. 後続の静脈内投与が、最初の腫瘍内投与後１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日又は３１日で与えられる、請求項１７記載のリコンビナント水疱性口内炎ウイルス又は医薬組成物。
  19. 請求項１～１０のいずれか一項記載のリコンビナント水疱性口内炎ウイルスを含み、ＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣ模倣物を更に含む、組成物。
  20. ＰＤ－１経路阻害剤が、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１に対するアンタゴニスト抗体である、請求項１９記載の組成物。
  21. ＳＭＡＣ模倣物が、化合物１～２６：
    Figure 0007565384000013
    Figure 0007565384000014

    Figure 0007565384000015

    Figure 0007565384000016

    Figure 0007565384000017

    及びこれらの化合物の薬学的に許容され得る塩
    からなる群より選択される、請求項１９記載の組成物。
  22. ＰＤ－１経路阻害剤が、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ＰＤＲ－００１、ＰＤ１－１、ＰＤ１－２、ＰＤ１－３、ＰＤ１－４及びＰＤ１－５からなる群より選択されるアンタゴニストである、請求項１９記載の組成物。
  23. ａ）請求項１～１８のいずれか一項で定義されたリコンビナント水疱性口内炎ウイルス又は医薬組成物と、
    ｂ）請求項１９～２２のいずれか一項で定義されたＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣ模倣物と
    を含む、パーツキット。
  24. ＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣ模倣物と組み合わせた、請求項１２～１５のいずれか一項記載のリコンビナント水疱性口内炎ウイルス又は医薬組成物。
  25. リコンビナント水疱性口内炎ウイルス又は医薬組成物が、ＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣ模倣物と同時に、連続的に又は交互に投与される、請求項２４記載のリコンビナント水疱性口内炎ウイルス又は医薬組成物。
  26. ＳＭＡＣ模倣物が、請求項２１記載の化合物１～２６及びこれらの化合物の薬学的に許容され得る塩からなる群より選択される、請求項２４又は２５記載のリコンビナント水疱性口内炎ウイルス又は医薬組成物。
  27. ＰＤ－１経路阻害剤が、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ＰＤＲ－００１、ＰＤ１－１、ＰＤ１－２、ＰＤ１－３、ＰＤ１－４及びＰＤ１－５からなる群より選択される、請求項２４又は２５記載のリコンビナント水疱性口内炎ウイルス又は医薬組成物。
  28. リコンビナント水疱性口内炎ウイルス又は医薬組成物が、ＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣ模倣物とは異なる投与経路を介して投与される、請求項２４～２６のいずれか一項記載のリコンビナント水疱性口内炎ウイルス又は医薬組成物。
  29. リコンビナント水疱性口内炎ウイルス又は医薬組成物が、少なくとも１回腫瘍内に投与され、ＰＤ－１経路阻害剤又はＳＭＡＣ模倣物が、静脈内に投与される、請求項２４～２６のいずれか一項記載のリコンビナント水疱性口内炎ウイルス又は医薬組成物。
  30. 請求項１～１０のいずれか一項記載のリコンビナント水疱性口内炎ウイルスを産生する、ウイルス産生細胞。
  31. ベロ細胞、ＨＥＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞である、請求項３０記載のウイルス産生細胞。
  32. そのＲＮＡゲノム中で少なくとも１種のＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質をコードするリコンビナント水疱性口内炎ウイルスであって、
    ＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質は、ＣＤ８０の細胞外ドメインを含み、ＩｇＧのＦｃドメインを更に含み、
    リコンビナント水疱性口内炎ウイルスのＲＮＡゲノムは、配列番号：２４と同一又は９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一のコード配列を含むか又はそれからなる、
    リコンビナント水疱性口内炎ウイルス。
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