JP2019506438A - がんの処置のためのｓｍｃ組合せ療法 - Google Patents

がんの処置のためのｓｍｃ組合せ療法 Download PDF

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Abstract

本発明は、がんの処置におけるSMCの効能を増強するための方法及び組成物を含む。特に、本発明は、SMCと、1つ又は複数のアポトーシス経路又は免疫経路を刺激する少なくとも第2の薬剤とを含む組合せ療法のための方法及び組成物を含む。第2の薬剤は、例えば、免疫刺激若しくは免疫調節化合物又は腫瘍溶解性ウイルスであってよい。

Description

アポトーシス(又はプログラム細胞死)、及び他の細胞死経路による細胞の死滅は、様々な細胞機構によって調節される。X結合IAP(XIAP)又は細胞性IAPタンパク質1及び2(cIAP1及び2)等のアポトーシス阻害剤(IAP)タンパク質は、(限定されるものではないが)例えば、がん細胞におけるアポトーシス経路等の、プログラム細胞死の調節因子である。他の形態の細胞死としては、限定されるものではないが、ネクロトーシス、壊死、ピロトーシス、及び免疫原性細胞死が挙げられる。更に、これらのIAPは、そのユビキチンE3リガーゼ活性によって様々な細胞シグナル伝達経路を調節し、これは細胞生存と関連する場合もあり、又は関連しない場合もある。アポトーシスの別の調節因子は、Smacポリペプチドである。Smacは、細胞死と関連してミトコンドリアから放出されるプロアポトーシスタンパク質である。Smacは、IAPに結合することができ、その機能と拮抗する。Smac模倣化合物(SMC)は、内因性Smacの1つ若しくは複数の機能又は活性を実行することができる非内因性プロアポトーシス化合物である。
プロトタイプXIAPタンパク質は、アポトーシスカスケード内の重要なイニシエータであり実行者であるカスパーゼタンパク質を直接阻害する。それにより、XIAPは、アポトーシスプログラムの完了を阻止することができる。細胞性IAPタンパク質1及び2は、免疫サイトカインが関与するアポトーシスシグナル伝達経路を調節するE3ユビキチンリガーゼである。cIAP1及び2の二重喪失により、TNFα、TRAIL、及び/又はIL-1βは、例えば、大部分のがん細胞にとって毒性になり得る。SMCは、XIAP、cIAP1、cIAP2、若しくは他のIAPを阻害する、及び/又は他のプロアポトーシス機構に寄与することができる。
SMCの投与によるがんの処置が提唱されている。しかしながら、SMCのみでは、ある特定のがんを処置するには不十分であり得る。1つ又は複数の型のがんにおけるSMC処置の効能を改善する、がんを処置する方法が必要である。
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本発明は、SMC及び免疫刺激剤、又は免疫調節剤の投与によるがんの処置のための組成物及び方法を含む。限定されるものではないが、Table 1(表1)のSMC並びにTable 2(表2)、Table 3(表3)、及びTable 4(表4)の薬剤を含む、SMC及び薬剤は本明細書に記載される。
本発明の一態様は、Table 1(表1)に由来するSMCと、それぞれの薬剤が独立に、免疫チェックポイント阻害剤(ICI)であるか、又はTable 2(表2)に由来する薬剤若しくはTable 3(表3)に由来する薬剤若しくはSTINGアゴニストである、1つ又は複数(例えば、2、3、4、5つ以上)の薬剤とを含む組成物である。一部の実施形態では、ICIは、Table 4(表4)に由来するICIである。SMC及び薬剤は、一緒になって、それを必要とする患者に投与された場合にがんを処置するのに十分な量で提供される。一部の実施形態では、2つ、3つ、又は4つの薬剤は異なるカテゴリーに由来するものである(すなわち、1つの薬剤はICIであり、1つの薬剤はTable 2(表2)に由来するものであり、1つの薬剤はTable 3(表3)に由来するものであり、及び/又は1つの薬剤はSTINGアゴニストである)。
本発明の別の態様は、がんと診断された患者を処置するための方法であって、患者に、Table 1(表1)に由来するSMCと、それぞれの薬剤が独立に、免疫チェックポイント阻害剤(ICI)であるか、又はTable 2(表2)に由来する薬剤若しくはTable 3(表3)に由来する薬剤若しくはSTINGアゴニストである、1つ又は複数(例えば、2、3、4、5つ以上)の薬剤とを投与することを含む方法である。一部の実施形態では、ICIは、Table 4(表4)に由来するICIであり、SMCと薬剤が投与される。一部の実施形態では、2、3、又は4つの薬剤は異なるカテゴリーに由来する(すなわち、1つの薬剤はICIであり、1つの薬剤はTable 2(表2)に由来するものであり、1つの薬剤はTable 3(表3)に由来するものであり、及び/又は1つの薬剤はSTINGアゴニストである)ものであり、一緒になってがんを処置するのに十分な量で同時に、又は互いに28日以内に投与される。
一部の実施形態では、SMC及び薬剤は、互いに14日以内に、互いに10日以内に、互いに5日以内に、互いに24時間以内に、互いに6時間以内に、又は同時に投与される。
特定の実施形態では、SMCは、LCL161、SM-122、GDC-0152/RG7419、GDC-0917/CUDC-427、又はSM-406/AT-406/Debio1143等の、一価SMCである。他の実施形態では、SMCは、AEG40826/HGS1049、OICR720、TL32711/ビリナパント(Birinapant)、SM-1387/APG-1387、又はSM-164等の、二価SMCである。
特定の実施形態では、薬剤の1つは、Table 2(表2)に由来するTLRアゴニストである。ある特定の実施形態では、薬剤は、リポ多糖、ペプチドグリカン、又はリポペプチドである。他の実施形態では、薬剤は、CpG-ODN2216等のCpGオリゴデオキシヌクレオチドである。更に他の実施形態では、薬剤は、イミキモッド又はポリ(I:C)である。
特定の実施形態では、薬剤の1つは、Table 3(表3)に由来するウイルスである。ある特定の実施形態では、薬剤は、VSV-M51R、VSV-MΔ51、VSV-IFNβ、又はVSV-IFNβ-NIS等の、水疱性口内炎ウイルス(VSV)である。他の実施形態では、薬剤は、アデノウイルス、マラバベシクロウイルス、レオウイルス、ラブドウイルス、若しくはワクシニアウイルス、又はそのバリアントである。一部の実施形態では、薬剤は、タリモジーン・ラハーパレプベック、単純ヘルペスウイルスバリアントである。
特定の実施形態では、薬剤の1つは、ICIである。ある特定の実施形態では、薬剤は、イピリムマブ、トレメリムマブ、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、AMP-224、AMP-514、AUNP12、PDR001、BGB-A317、REGN2810、アベルマブ、BMS-935559、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、BMS-986016、LAG525、IMP321、MBG453、リリルマブ、又はMGA271である。
一部の実施形態では、本発明の組成物又は方法は、限定されるものではないが、インターフェロン等の複数の免疫刺激剤若しくは免疫調節剤、及び/又は複数のSMCを含む。
一部の実施形態では、本発明の組成物又は方法は、1型インターフェロン剤、2型インターフェロン剤、及び/又は3型インターフェロン剤等の、1つ又は複数のインターフェロン剤を含む。
本発明の任意の方法において、がんは、免疫刺激剤又は免疫調節剤の非存在下ではSMCによる処置に対して不応性であるがんであってもよい。本発明の任意の方法において、処置は、インターフェロンを含む治療剤の投与を更に含んでもよい。
本発明の任意の方法において、がんは、副腎がん、基底細胞癌、胆道がん、膀胱がん、骨肉腫、脳腫瘍、乳がん、子宮頸がん、絨毛癌、結腸がん、結腸直腸がん、結合組織がん、消化器系のがん、子宮内膜がん、上咽頭がん、食道がん、眼がん、胆嚢がん、胃がん、頭頸部がん、肝細胞癌、上皮内新生物、腎臓がん、喉頭がん、白血病、肝臓がん、肝臓転移、肺がん、リンパ腫、メラノーマ、骨髄腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、中皮腫、神経膠腫、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、口腔がん、卵巣がん、小児がん、膵がん、膵内分泌腫瘍、陰茎がん、形質細胞腫瘍、下垂体腺腫、胸腺腫、前立腺がん、腎細胞癌、呼吸器系のがん、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、皮膚がん、小腸がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、尿管がん、及び泌尿器系のがんから選択されるがんであってもよい。
本発明は、Table 1(表1)に由来するSMCと、上記の1つ又は複数(例えば、2、3、4つ以上)の薬剤とを含む組成物を更に含む。薬剤の1つは、SMCと薬剤とが、一緒になって、それを必要とする患者に投与された場合にがんを処置するのに十分な量で提供されるような、死滅ウイルス(killed virus)、不活化ウイルス、又はウイルスワクチンを含んでもよい。特定の実施形態では、前記薬剤は、NRRP又は狂犬病ワクチンである。他の実施形態では、本発明は、SMCと薬剤とが、一緒になって、それを必要とする患者に投与された場合にがんを処置するのに十分な量で提供されるような、Table 1(表1)に由来するSMC、免疫応答をプライミングする第1の薬剤、及び免疫応答を強化する第2の薬剤を含む組成物を含む。ある特定の実施形態では、第1の薬剤及び第2の薬剤の一方又は両方は、腫瘍溶解性ウイルスワクチンである。他の特定の実施形態では、第1の薬剤は、腫瘍抗原を担持するアデノウイルスであり、第2の薬剤は、アデノウイルスと同じ腫瘍抗原を担持するMaraba-MG1又は腫瘍抗原を担持しないMaraba-MG1等の、ベシクロウイルスである。
「近隣」細胞とは、参照細胞から免疫、炎症、又はプロアポトーシスシグナルを直接的又は間接的に受け取るのに参照細胞に十分に近い細胞を意味する。
「アポトーシス又は細胞死を促進すること」とは、1つ又は複数の細胞がアポトーシスするか、又は死滅する可能性を増大させることを意味する。処置は、1つ若しくは複数の処置された細胞がアポトーシスする可能性を増大させることにより、及び/又は処置された細胞の近隣の1つ若しくは複数の細胞がアポトーシスするか、若しくは死滅する可能性を増大させることによって、細胞死を促進することができる。
「内因性Smac活性」とは、cIAP1及びcIAP2の少なくとも阻害を含む、アポトーシスの促進をもたらすSmacの1つ又は複数の生物学的機能を意味する。生物学的機能は、全ての条件下で全ての細胞において生じるか、又は可能である必要はなく、Smacがある特定の天然のin vivo条件下でいくつかの細胞中で生物学的機能を行うことができればよい。
「Smac模倣化合物」又は「SMC」とは、cIAP1及び/又はcIAP2を阻害することができる、1つ又は複数の成分、例えば、低分子、化合物、ポリペプチド、タンパク質、又はその任意の複合体の組成物を意味する。Smac模倣化合物は、Table 1(表1)に列挙される化合物を含む。
「アポトーシスプログラムを誘導すること」とは、IAP媒介性アポトーシス経路に関与することができる1つ若しくは複数のタンパク質の量、利用可能性、若しくは活性が増加するように、又はIAP媒介性アポトーシス経路に関与することができる1つ若しくは複数のタンパク質がそのような経路の活性への関与のためにプライミングされるように、1つ又は複数の細胞のタンパク質又はタンパク質プロファイルの変化を引き起こすことを意味する。アポトーシスプログラムの誘導は、細胞死の開始自体を必要としない:細胞死をもたらさない様式でのアポトーシスのプログラムの誘導は、細胞死をもたらす、アポトーシスを促進するSMCによる処置と相乗作用し得る。
「薬剤」とは、対象の1つ又は複数の細胞におけるアポトーシス又は炎症プログラム、並びに少なくともcIAP1及びcIAP2によって阻害されるこのプログラムの下流の細胞死を累積的に誘導することができる1つ又は複数の成分の組成物を意味する。薬剤は、例えば、TLRアゴニスト(例えば、Table 2(表2)に列挙される化合物)、腫瘍溶解性ウイルス等のウイルス(例えば、Table 3(表3)に列挙されるウイルス)、又は免疫チェックポイント阻害剤(例えば、Table 4(表4)に列挙されるもの)であってもよい。
「がんを処置すること」とは、対象中の1つ若しくは複数のがん細胞の死滅を誘導すること、又は腫瘍退縮をもたらし、腫瘍拡散(転移)を遮断することができる免疫応答を誘発することを意味する。がんの処置は、対象におけるがんの兆候及び症状の一部若しくは全部を完全又は部分的に無効化する、対象におけるがんの1つ若しくは複数の症状の重症度を低下させる、対象におけるがんの1つ若しくは複数の症状の進行を低下させる、又は1つ若しくは複数のその後に発生した症状の進行若しくは重症度を媒介することができる。
「プロドラッグ」とは、対象内に存在する1つ又は複数の酵素、化学物質、又は条件の作用によって、対象の体内、例えば、対象の細胞内で活性形態に変換され得る、不活性形態で調製される治療剤を意味する。
「低用量」又は「低濃度」とは、任意のヒト疾患又は状態の処置のための所与の投与経路のために製剤化された特定の化合物の最も低い標準推奨用量又は最も低い標準推奨濃度よりも少なくとも5%低い(例えば、少なくとも10%、20%、50%、80%、90%、又は更には95%)ことを意味する。
「高用量」とは、任意のヒト疾患又は状態の処置のための特定の化合物の最も高い標準推奨用量よりも少なくとも5%高い(例えば、少なくとも10%、20%、50%、100%、200%、又は更には300%)ことを意味する。
「免疫チェックポイント阻害剤」とは、免疫細胞が、対応する受容体を拮抗的に遮断するか、又はそのリガンドに結合することによってがん細胞によりスイッチを切られないようにし、かくして、腫瘍を攻撃する免疫系の能力を再確立するがん処置薬を意味する。
SMCが腫瘍溶解性ラブドウイルスと相乗作用してがん細胞死を誘導することを示すグラフと画像のセットである。図1の全パネルは、生物学的複製物(n=3)を使用する少なくとも3つの独立した実験に由来するデータの代表である。図1Aは、LCL161及び増大するMOIのVSVΔ51で処理された細胞のアラマーブルー(Alamar Blue)生存能力アッセイの結果を示す一対のグラフである。エラーバー、平均±s.d.。 SMCが腫瘍溶解性ラブドウイルスと相乗作用してがん細胞死を誘導することを示すグラフと画像のセットである。図1の全パネルは、生物学的複製物(n=3)を使用する少なくとも3つの独立した実験に由来するデータの代表である。図1Bは、LCL161及び0.1MOIのVSVΔ51-GFPで処理された細胞のマイクログラフのセットである。 SMCが腫瘍溶解性ラブドウイルスと相乗作用してがん細胞死を誘導することを示すグラフと画像のセットである。図1の全パネルは、生物学的複製物(n=3)を使用する少なくとも3つの独立した実験に由来するデータの代表である。図1Cは、増大する濃度のLCL161の存在下でVSVΔ51(0.1MOI)に感染した細胞の生存能力(アラマーブルー)を示す一対のグラフである。エラーバー、平均±s.d.。 SMCが腫瘍溶解性ラブドウイルスと相乗作用してがん細胞死を誘導することを示すグラフと画像のセットである。図1の全パネルは、生物学的複製物(n=3)を使用する少なくとも3つの独立した実験に由来するデータの代表である。図1Dは、24時間にわたってVSVΔ51に感染した細胞に由来するデータを示す一対のグラフである。細胞培養上清を、ウイルスを不活化するUV光に曝露した後、LCL161の存在下で、生存能力アッセイ(アラマーブルー)のために培地を新しい細胞に適用した。エラーバー、平均±s.d.。 SMCが腫瘍溶解性ラブドウイルスと相乗作用してがん細胞死を誘導することを示すグラフと画像のセットである。図1の全パネルは、生物学的複製物(n=3)を使用する少なくとも3つの独立した実験に由来するデータの代表である。図1Eは、LCL161と、非拡散性ウイルスVSVΔ51ΔG(0.1MOI)とで同時処理した細胞の生存能力を示すグラフである。エラーバー、平均±s.d.。 SMCが腫瘍溶解性ラブドウイルスと相乗作用してがん細胞死を誘導することを示すグラフと画像のセットである。図1の全パネルは、生物学的複製物(n=3)を使用する少なくとも3つの独立した実験に由来するデータの代表である。図1Fは、LCL161を含有するアガロース培地で覆い、ウェルの中央でVSVΔ51-GFPを接種し、蛍光によって感染性を測定し、クリスタルバイオレット染色によって細胞傷害性を評価した細胞に関するグラフ及び一対の画像である(画像を重ね合わせた;重ね合わせていない画像は図11にある)。エラーバー、平均±s.d.。 SMC処置が腫瘍溶解性ウイルス(OV)感染に対するがん細胞応答を変化させないことを示すグラフと画像とのセットである。図2の全パネルは、生物学的複製物を使用する少なくとも3つの独立した実験に由来するデータの代表である。図2Aは、LCL161で予備処理され、示されたMOIのVSVΔ51に感染させた細胞に由来するデータを示す一対のグラフである。ウイルス力価を、標準的なプラークアッセイによって評価した。 SMC処置が腫瘍溶解性ウイルス(OV)感染に対するがん細胞応答を変化させないことを示すグラフと画像とのセットである。図2の全パネルは、生物学的複製物を使用する少なくとも3つの独立した実験に由来するデータの代表である。図2Bは、LCL161及びVSVΔ51-GFPで処理した細胞に由来する経時的に捕捉された一対のグラフ及びマイクログラフのセットである。グラフは、GFPシグナル数を経時的にプロットする。エラーバー、平均±s.d.。n=12。 SMC処置が腫瘍溶解性ウイルス(OV)感染に対するがん細胞応答を変化させないことを示すグラフと画像とのセットである。図2の全パネルは、生物学的複製物を使用する少なくとも3つの独立した実験に由来するデータの代表である。図2Cは、LCL161及びVSVΔ51で処理された細胞に由来する細胞培養上清を、ELISAによってIFNβについて加工した実験に由来するデータを示す一対のグラフである。エラーバー、平均±s.d.。n=3。 SMC処置が腫瘍溶解性ウイルス(OV)感染に対するがん細胞応答を変化させないことを示すグラフと画像とのセットである。図2の全パネルは、生物学的複製物を使用する少なくとも3つの独立した実験に由来するデータの代表である。図2Dは、細胞をLCL161及びVSVΔ51で20時間処理し、RT-qPCRのために加工して、インターフェロン刺激遺伝子(ISG)発現を測定した実験に由来するデータを示す一対のグラフである。エラーバー、平均±s.d.。n=3。 SMC処置が腫瘍溶解性ウイルス(OV)感染に対するがん細胞応答を変化させないことを示すグラフと画像とのセットである。図2の全パネルは、生物学的複製物を使用する少なくとも3つの独立した実験に由来するデータの代表である。図2Eは、LCL161で予備処理した後、IFNβで刺激した細胞に対して実施されたSTAT1経路活性化に関するイムノブロットを示す一対の画像である。 OV感染したがん細胞のSMC処理が前炎症性サイトカインの1型インターフェロン(1型IFN)及び核因子カッパB(NF-κb)依存的産生を誘導することを示すグラフのセットである。図3の全パネルは、生物学的複製物(n=3)を使用する少なくとも3つの独立した実験に由来するデータの代表である。図3Aは、非標的(NT)、TNF-R1及びDR5 siRNAの組合せをトランスフェクトした後、LCL161及びVSVΔ51(0.1MOI)又はIFNβで処理した細胞のアラマーブルー生存能力アッセイを示すグラフである。エラーバー、平均±s.d.。 OV感染したがん細胞のSMC処理が前炎症性サイトカインの1型インターフェロン(1型IFN)及び核因子カッパB(NF-κb)依存的産生を誘導することを示すグラフのセットである。図3の全パネルは、生物学的複製物(n=3)を使用する少なくとも3つの独立した実験に由来するデータの代表である。図3Bは、NT又はIFNAR1 siRNAをトランスフェクトした後、LCL161及びVSVΔ51Gで処理した細胞の生存能力を示すグラフである。エラーバー、平均±s.d.。 OV感染したがん細胞のSMC処理が前炎症性サイトカインの1型インターフェロン(1型IFN)及び核因子カッパB(NF-κb)依存的産生を誘導することを示すグラフのセットである。図3の全パネルは、生物学的複製物(n=3)を使用する少なくとも3つの独立した実験に由来するデータの代表である。図3Cは、細胞をLCL161で予備処理し、0.5MOIのVSVΔ51に感染させ、サイトカイン遺伝子発現をRT-qPCRによって測定した実験に由来するデータを示すグラフである。エラーバー、平均±s.d.。 OV感染したがん細胞のSMC処理が前炎症性サイトカインの1型インターフェロン(1型IFN)及び核因子カッパB(NF-κb)依存的産生を誘導することを示すグラフのセットである。図3の全パネルは、生物学的複製物(n=3)を使用する少なくとも3つの独立した実験に由来するデータの代表である。図3Dは、NT又はIFNAR1 siRNAをトランスフェクトした後、LCL161及び0.1MOIのVSVΔ51で処理した細胞に対してサイトカインELISAを実施した実験から収集されたデータを示すチャートである。エラーバー、平均±s.d.。 OV感染したがん細胞のSMC処理が前炎症性サイトカインの1型インターフェロン(1型IFN)及び核因子カッパB(NF-κb)依存的産生を誘導することを示すグラフのセットである。図3の全パネルは、生物学的複製物(n=3)を使用する少なくとも3つの独立した実験に由来するデータの代表である。図3Eは、LCL161とサイトカインとで同時処理した細胞の生存能力を示すグラフである。エラーバー、平均±s.d.。 OV感染したがん細胞のSMC処理が前炎症性サイトカインの1型インターフェロン(1型IFN)及び核因子カッパB(NF-κb)依存的産生を誘導することを示すグラフのセットである。図3の全パネルは、生物学的複製物(n=3)を使用する少なくとも3つの独立した実験に由来するデータの代表である。図3Fは、細胞をLCL161で予備処理し、250U/mL(約20pg/mL)のIFNβで刺激し、サイトカインmRNAレベルをRT-qPCRによって決定した実験に由来するデータを示すグラフである。エラーバー、平均±s.d.。 OV感染したがん細胞のSMC処理が前炎症性サイトカインの1型インターフェロン(1型IFN)及び核因子カッパB(NF-κb)依存的産生を誘導することを示すグラフのセットである。図3の全パネルは、生物学的複製物(n=3)を使用する少なくとも3つの独立した実験に由来するデータの代表である。図3Gは、LCL161及び0.1MOIのVSVΔ51で処理した細胞に対して行ったサイトカインELISAの結果を示す一対のグラフである。 OV感染したがん細胞のSMC処理が前炎症性サイトカインの1型インターフェロン(1型IFN)及び核因子カッパB(NF-κb)依存的産生を誘導することを示すグラフのセットである。図3の全パネルは、生物学的複製物(n=3)を使用する少なくとも3つの独立した実験に由来するデータの代表である。図3Hは、IKKβ-DNを発現し、LCL161及びVSVΔ51又はIFNβで処理した細胞に対して実施したサイトカインELISAの結果を示すグラフである。エラーバー、平均±s.d.。 SMCとOV処置の組合せが、in vivoで有効であり、サイトカインシグナル伝達に依存することを示すグラフと画像とのセットである。図4Aは、EMT6-Fluc腫瘍を50mg/kgのLCL161(p.o.)及び5×108PFUのVSVΔ51(i.v.)で処置した実験に由来するデータを示す一対のグラフである。左パネルは腫瘍増殖を示す。右パネルはマウスの生存を示すカプラン-マイヤー曲線を表す。エラーバー、平均±s.e.m.。n=5/群。ホルム-シダック多重比較を用いるログランク:**、p<0.01; ***、p<0.001。2つの独立した実験に由来する代表データを示す。 SMCとOV処置の組合せが、in vivoで有効であり、サイトカインシグナル伝達に依存することを示すグラフと画像とのセットである。図4Bは、図4Aの実験から獲得された一連の代表的なIVIS画像である。 SMCとOV処置の組合せが、in vivoで有効であり、サイトカインシグナル伝達に依存することを示すグラフと画像とのセットである。図4Cは、α-VSV又はα-c-カスパーゼ-3抗体を使用して24時間処置された腫瘍における感染及びアポトーシスの免疫蛍光画像のセットである。 SMCとOV処置の組合せが、in vivoで有効であり、サイトカインシグナル伝達に依存することを示すグラフと画像とのセットである。図4Dは、α-VSV又はα-c-カスパーゼ-3抗体を使用して24時間処置された腫瘍における感染及びアポトーシスの免疫蛍光画像のセットである。 SMCとOV処置の組合せが、in vivoで有効であり、サイトカインシグナル伝達に依存することを示すグラフと画像とのセットである。図4Eは、対応して処置されたマウスに由来する腫瘍のタンパク質溶解物を示された抗体でイムノブロットしたイムノブロットを示す画像である。 SMCとOV処置の組合せが、in vivoで有効であり、サイトカインシグナル伝達に依存することを示すグラフと画像とのセットである。図4Fは、EMT6-Fluc腫瘍を担持するマウスに、中和TNFα又はアイソタイプ一致抗体を注射した後、50mg/kgのLCL161(p.o.)及び5×108PFUのVSVΔ51(i.v.)で処置した実験に由来するデータを示す一対のグラフである。左パネルは、腫瘍増殖を示す。右パネルは、マウスの生存を示すカプラン-マイヤー曲線を表す。エラーバー、平均±s.e.m.。ビヒクルα-TNFα, n=5; SMC α-TNFα, n= 5;ビヒクル+VSVΔ51, n=5;α-TNFα, n=5; SMC+VSVΔ51 α-TNFα, n=7; SMC+VSVΔ51 α-IgG, n=7。ホルム-シダック多重比較を用いるログランク:***、p<0.001。 SMCとOV処置の組合せが、in vivoで有効であり、サイトカインシグナル伝達に依存することを示すグラフと画像とのセットである。図4Gは、図4Fの実験から獲得された代表的なIVIS画像のセットである。 低分子免疫刺激剤がマウスがんモデルにおいてSMC療法を増強することを示す一連のグラフ及び画像である。図5Aは、トランスウェルシステムにおいて脾細胞と同時培養され、分離した脾細胞をLCL161及び示されたTLRアゴニストで処理したEMT6細胞のアラマーブルー生存能力アッセイの結果を示すグラフである。エラーバー、平均±s.d.。生物学的複製物(n=3)を使用する少なくとも3つの独立した実験に由来する代表データを示す。 低分子免疫刺激剤がマウスがんモデルにおいてSMC療法を増強することを示す一連のグラフ及び画像である。図5Bは、確立されたEMT6-Fluc腫瘍をSMC(50mg/kg LCL161、p.o.)及びポリ(I:C)(15μg i.t.又は2.5mg/kg i.p.)で処置した実験の結果を示す一対のグラフである。左パネルは、腫瘍増殖を示す。右パネルは、マウスの生存を示すカプラン-マイヤー曲線を表す。ビヒクル、ビヒクル+ポリ(I:C) i.p.、n=4;残りの群、n=5。エラーバー、平均±s.e.m.。ホルム-シダック多重比較を用いるログランク:**、p<0.01; ***、p<0.001。 低分子免疫刺激剤がマウスがんモデルにおいてSMC療法を増強することを示す一連のグラフ及び画像である。図5Cは、図5Bの実験から獲得された一連の代表的なIVIS画像である。 低分子免疫刺激剤がマウスがんモデルにおいてSMC療法を増強することを示す一連のグラフ及び画像である。図5Dは、EMT6-Fluc腫瘍をLCL161又は200μg(i.t.)及び/若しくは2.5mg/kg(i.p.)のCpG ODN2216の組合せで処置した実験の結果を示す一対のグラフである。左パネルは、腫瘍増殖を示す。右パネルは、マウスの生存を示すカプラン-マイヤー曲線を表す。ビヒクル、n=5; SMC、n= 5;ビヒクル+CpG i.p.、n=5; SMC+CpG i.p.、n=7;ビヒクル+CpG i.t.、n=5; SMC+CpG i.t.、n=8;ビヒクル+CpG i.p.+i.t.、n=5; SMC+CpG i.p.+i.t.、n=8。エラーバー、平均±s.e.m.。ホルム-シダック多重比較を用いるログランク:*、p<0.05; **、p<0.01; ***、p<0.001。 低分子免疫刺激剤がマウスがんモデルにおいてSMC療法を増強することを示す一連のグラフ及び画像である。図5Eは、図5Dの実験から獲得された一連の代表的なIVIS画像である。 SMCとOVとの組合せ処置に対するがん細胞と正常細胞のパネルの応答性を示すグラフである。示されたがん細胞株(n=28)及び非がんヒト細胞(一次ヒト骨格筋(HSkM)及びヒト線維芽細胞(GM38))を、LCL161及び増加するVSVΔ51で48時間処理した。SMC対ビヒクルの存在下で50%の生細胞を得るのに必要とされる用量を、非線形回帰を使用して決定し、増大する感度に向かうlog EC50シフトとしてプロットした。生物学的複製物(n=3)を使用する少なくとも2つの独立した実験に由来する代表データを示す。 SMCとOVとの同時処置ががん細胞において高度に相乗作用的であることを示す一対のグラフである。グラフは、VSVΔ51とLCL161の固定比の組合せ混合物の連続希釈液(PFU:μM LCL161)で処理された細胞のアラマーブルー生存能力を示す。併用係数(CI)を、Calcusynを使用して算出した。プロットは、影響された細胞の画分(Fa)の関数におけるCIの代数推定値を表す。エラーバー、平均±s.e.m.。生物学的複製物(n=3)を使用する3つの独立した実験に由来する代表データを示す。 一価及び二価SMCがOVと相乗作用して、がん細胞死を引き起こすことを示す一対のグラフである。グラフは、5μMの一価SMC(LCL161、SM-122)又は0.1μMの二価SMC(AEG40730、OICR720、SM-164)及び異なるMOIのVSVΔ51で処理された細胞のアラマーブルー生存能力アッセイの結果を示す。エラーバー、平均±s.d.。生物学的複製物(n=3)を使用する3つの独立した実験に由来する代表データを示す。 SMC媒介性がん細胞死が腫瘍溶解性ウイルスにより促進されることを示す画像とグラフとのセットである。図9Aは、ビヒクル又はLCL161の存在下、0.7%アガロースで覆い、500PFUの示されたウイルスをウェルの中央で拡散させた細胞のウイルス拡散アッセイの結果を示す一連の画像である。細胞傷害性を、クリスタルバイオレット染色によって評価した。矢印は、OV感染の起源からの細胞死領域の伸長を示す。 SMC媒介性がん細胞死が腫瘍溶解性ウイルスにより促進されることを示す画像とグラフとのセットである。図9Bは、LCL161及び増大するMOIのVSVΔ51又はMaraba-MG1で処理された細胞のアラマーブルー生存能力を示すグラフのセットである。エラーバー、平均±s.d.。生物学的複製物(n=3)を使用する2つの独立した実験に由来する代表データを示す。 cIAP1、cIAP2及びXIAPが、OV誘導性細胞死からがん細胞を協調的に保護することを示すグラフと画像とのセットである。図10Aは、非標的(NT) siRNA又はcIAP1、cIAP2若しくはXIAPを標的とするsiRNAをトランスフェクトした後、LCL161及び0.1MOIのVSVΔ51で48時間処理した細胞のアラマーブルー生存能力を示す。エラーバー、平均±s.d.。生物学的複製物(n=3)を使用する3つの独立した実験に由来する代表データを示す。 cIAP1、cIAP2及びXIAPが、OV誘導性細胞死からがん細胞を協調的に保護することを示すグラフと画像とのセットである。図10Bは、図10Aの実験に関する代表的なsiRNA効能イムノブロットである。 図1Gに示された重ね合わせ画像について使用された画像のセットである。細胞を、LCL161を含有するアガロース培地で覆い、ウェルの中央にVSVΔ51-GFPを接種し、蛍光によって感染性を測定し、クリスタルバイオレット(CV)染色によって細胞傷害性を示した。注記:バーは同じサイズを表す。 SMC処置が、in vivoでのOVの分布又は複製に影響しないことを示す画像とグラフとのセットである。図12Aは、EMT6担持マウスを、i.v.注射により50mg/kgのLCL161(p.o.)及び5×108PFUの蛍ルシフェラーゼタグ付きVSVΔ51(VSVΔ51-Fluc)で処置した実験に由来する画像を示す画像のセットである。ウイルスの分布及び複製を、IVISを使用して24及び48時間で画像化した。輪郭線は腫瘍の領域を示す。2つの独立した実験に由来する代表データを示す。矢印は、VSVΔ51-Flucに感染した脾臓を示す。 SMC処置が、in vivoでのOVの分布又は複製に影響しないことを示す画像とグラフとのセットである。図12Bは、感染の48時間後の腫瘍及び組織をホモジナイズし、各群についてウイルス滴定を実施した実験に由来するデータを示すグラフである。エラーバー、平均±s.e.m.。 イムノブロッティングによる非標的(NT)、TNFR1、DR5及びIFNAR1のsiRNA媒介性ノックダウンの検証を示す画像である。図13Aは、図3Aの実験に由来する試料におけるノックダウンを示すイムノブロットである。 イムノブロッティングによる非標的(NT)、TNFR1、DR5及びIFNAR1のsiRNA媒介性ノックダウンの検証を示す画像である。図13Bは、図3Bの実験に由来する試料におけるノックダウンを示すイムノブロットである。 SMCがOVと相乗作用して、がん細胞におけるカスパーゼ8及びRIP-1依存的アポトーシスを誘導することを示す画像及びグラフである。図14の全パネルは、生物学的複製物を使用する3つの独立した実験に由来する代表データを示す。図14Aは、カスパーゼ及びPARP活性化に関するイムノブロッティングを、LCL161で予備処理した後、1MOIのVSVΔ51で処理した細胞に対して行ったイムノブロットの一対の画像である。 SMCがOVと相乗作用して、がん細胞におけるカスパーゼ8及びRIP-1依存的アポトーシスを誘導することを示す画像及びグラフである。図14の全パネルは、生物学的複製物を使用する3つの独立した実験に由来する代表データを示す。図14Bは、カスパーゼ3/7基質であるDEVD-488の存在下、LCL161及びVSVΔ51で同時処理された細胞を用いて獲得されたカスパーゼ活性化のマイクログラフを示す一連の画像である。 SMCがOVと相乗作用して、がん細胞におけるカスパーゼ8及びRIP-1依存的アポトーシスを誘導することを示す画像及びグラフである。図14の全パネルは、生物学的複製物を使用する3つの独立した実験に由来する代表データを示す。図14Cは、図14Bの実験に由来するDEVD-488陽性細胞の割合をプロットした(n=12)グラフである。エラーバー、平均±s.d.。 SMCがOVと相乗作用して、がん細胞におけるカスパーゼ8及びRIP-1依存的アポトーシスを誘導することを示す画像及びグラフである。図14の全パネルは、生物学的複製物を使用する3つの独立した実験に由来する代表データを示す。図14Dは、LCL161及びVSVΔ51で処理した細胞中での転座したホスファチジルセリン(アネキシンV-CF594)及び形質膜完全性の喪失(YOYO-1)のマイクログラフによってアポトーシスを評価した実験に由来する一連の画像である。 SMCがOVと相乗作用して、がん細胞におけるカスパーゼ8及びRIP-1依存的アポトーシスを誘導することを示す画像及びグラフである。図14の全パネルは、生物学的複製物を使用する3つの独立した実験に由来する代表データを示す。図14Eは、図14Dの実験に由来するアネキシンV-CF594陽性及びYOYO-1陰性アポトーシス細胞の割合をプロットした(n=9)グラフである。エラーバー、平均±s.d.。 SMCがOVと相乗作用して、がん細胞におけるカスパーゼ8及びRIP-1依存的アポトーシスを誘導することを示す画像及びグラフである。図14の全パネルは、生物学的複製物を使用する3つの独立した実験に由来する代表データを示す。図14Fは、非標的(NT)siRNA又はカスパーゼ8若しくはRIP1を標的とするsiRNAをトランスフェクトした後、LCL161及び0.1MOIのVSVΔ51(n=3)で処理した細胞のアラマーブルー生存能力を示す一対のグラフである。エラーバー、平均±s.d.。 SMCがOVと相乗作用して、がん細胞におけるカスパーゼ8及びRIP-1依存的アポトーシスを誘導することを示す画像及びグラフである。図14の全パネルは、生物学的複製物を使用する3つの独立した実験に由来する代表データを示す。図14Gは、図14Fの実験に関する代表的なsiRNA効能を示すイムノブロットの画像である。 OVに由来するTNFαトランスジーンの発現が、SMC媒介性がん細胞死を更に促進することを示すグラフのセットである。図15Aは、5μMのSMC及び増加するMOIのVSVΔ51-GFP又はVSVΔ51-TNFαで24時間にわたって同時処理した細胞のアラマーブルー生存能力アッセイを示す一対のグラフである。エラーバー、平均±s.d.。 OVに由来するTNFαトランスジーンの発現が、SMC媒介性がん細胞死を更に促進することを示すグラフのセットである。図15Aの実験に由来する代表的なEC50シフトを示すグラフである。SMC対ビヒクルの存在下で50%の生細胞を得るのに必要とされる用量を、非線形回帰を使用して決定し、EC50シフトとしてプロットした。生物学的複製物(n=3)を使用する3つの独立した実験に由来する代表データを示す。 腫瘍溶解性ウイルス感染が、SMC処置の際に増強されたTNFα発現をもたらすことを示す画像のセットである。EMT6細胞を、5μMのSMC及び0.1MOIのVSVΔ51-GFPで24時間にわたって同時処理し、細胞を、フローサイトメトリーによって細胞内TNFαの存在について加工した。画像は、4つの独立した実験に由来する代表データを示す。 TNFαシグナル伝達が、SMC処置とのI型IFN誘導性相乗作用にとって必要であることを示す一対のグラフと画像である。図17の全パネルは、生物学的複製物(n=3)を使用する少なくとも3つの独立した実験に由来する代表データを示す。図17Aは、非標的(NT)又はTNF-R1 siRNAをトランスフェクトした後、LCL161及びVSVΔ51(0.1MOI)又はIFNβで処理したEMT6細胞のアラマーブルー生存能力アッセイの結果を示すグラフである。エラーバー、平均±s.d.。 TNFαシグナル伝達が、SMC処置とのI型IFN誘導性相乗作用にとって必要であることを示す一対のグラフと画像である。図17の全パネルは、生物学的複製物(n=3)を使用する少なくとも3つの独立した実験に由来する代表データを示す。図17Bは、図17Aの実験に由来する代表的なsiRNA効能ブロットである。 TNFαシグナル伝達が、SMC処置とのI型IFN誘導性相乗作用にとって必要であることを示す一対のグラフと画像である。図17の全パネルは、生物学的複製物(n=3)を使用する少なくとも3つの独立した実験に由来する代表データを示す。図17Cは、TNFα中和抗体で予備処理した後、5μMのSMC及びVSVΔ51又はIFNβで処理したEMT6細胞の生存能力を示すグラフである。 バイスタンダーがん細胞死におけるOV誘導性I型IFNとSMCの相乗作用の略図である。図18Aは、不応性がん細胞におけるウイルス感染が1型IFNの産生をもたらした後、TRAIL等のIFNにより刺激される遺伝子の発現を誘導することを示す略図である。1型IFN刺激もまた、TNFαのNF-κB依存的産生をもたらす。SMC処理によるIAP拮抗作用は、TNFα及びTRAIL発現の上方調節並びに近隣の腫瘍細胞のアポトーシスをもたらす。 バイスタンダーがん細胞死におけるOV誘導性I型IFNとSMCの相乗作用の略図である。図18Bは、単一の腫瘍細胞の感染が、先天的な抗ウイルス性1型IFN経路の活性化をもたらし、近隣の細胞への1型IFNの分泌をもたらすことを示す略図である。近隣の細胞もまた、前炎症性サイトカインであるTNFα及びTRAILを産生する。単一に感染した細胞は腫瘍溶解を受け、残りの腫瘍塊はインタクトなままである。他方で、近隣の細胞は、TNFα/TRAILのSMC媒介性上方調節及び前炎症性サイトカイン活性化の際のアポトーシスの促進の結果として、SMC処置に起因するバイスタンダー細胞死を受ける。 SMC処置が、最小限の一過性の体重減少を引き起こし、cIAP1/2の下方調節をもたらすことを示すグラフ及びブロットである。図19Aは、単回処理(0日目)後に記録された、LCL161で処理されたメスのBALB/cマウス(50mg/kgのLCL161、p.o.)に由来する体重を示すグラフである。n=5/群。エラーバー、平均±s.e.m.。 SMC処置が、最小限の一過性の体重減少を引き起こし、cIAP1/2の下方調節をもたらすことを示すグラフ及びブロットである。図19Bは、EMT6腫瘍担持マウスを50mg/kgのLCL161(p.o.)で処置した実験に由来する試料のブロットである。腫瘍を、示された抗体を使用するウェスタンブロッティングのために示された時間に収獲した。 SMC処置が、がんの同系マウスモデルにおいて一過性の体重減少を誘導することを示すグラフのセットである。図20Aは、図4Aに示された実験に由来する腫瘍担持動物におけるSMC及び腫瘍溶解性VSVの同時処置の際のマウス体重の測定値を示すグラフである。エラーバー、平均±s.e.m.。 SMC処置が、がんの同系マウスモデルにおいて一過性の体重減少を誘導することを示すグラフのセットである。図20Bは、図5Bに示された実験に由来する腫瘍担持動物におけるSMC及びポリ(I:C)の同時処置の際のマウス体重の測定値を示すグラフである。エラーバー、平均±s.e.m.。 SMC処置が、がんの同系マウスモデルにおいて一過性の体重減少を誘導することを示すグラフのセットである。図20Cは、図5Dに示された実験に由来する腫瘍担持動物におけるSMC及びCpGの同時処置の際のマウス体重の測定値を示すグラフである。エラーバー、平均±s.e.m.。 HT-29細胞におけるVSVΔ51誘導性細胞死が、in vitro及びin vivoでSMC処置によって促進されることを示す一連のグラフである。図21Aは、細胞をVSVΔ51に感染させ、細胞培養上清をUV光に1時間曝露し、LCL161の存在下、示された用量で新しい細胞に適用した実験に由来するデータを示すグラフである。生存能力を、アラマーブルーによって確認した。エラーバー、平均±s.d.。図21Aは、生物学的複製物(n=3)を使用する3つの独立した実験に由来する代表データを示す。 HT-29細胞におけるVSVΔ51誘導性細胞死が、in vitro及びin vivoでSMC処置によって促進されることを示す一連のグラフである。図21Bは、LCL161及び非拡散性ウイルスVSVΔ51ΔG(0.1MOI)で同時処理した細胞のアラマーブルー生存能力を示すグラフである。エラーバー、平均±s.d.。図21Bは、生物学的複製物(n=3)を使用する3つの独立した実験に由来する代表データを示す。 HT-29細胞におけるVSVΔ51誘導性細胞死が、in vitro及びin vivoでSMC処置によって促進されることを示す一連のグラフである。図21Cは、確立されたHT-29腫瘍を有するCD-1ヌードマウスを、50mg/kgのLCL161(p.o.)及び1×108PFUのVSVΔ51(i.t.)で処置した実験に由来するデータを示す一対のグラフである。ビヒクル、n=5; VSVΔ51、n=6; SMC、n=6; VSVΔ51+SMC、n=7。左パネルは、処置後0日目と比較した腫瘍増殖を示す。右パネルは、マウス生存を示すカプラン-マイヤー曲線を表す。エラーバー、平均±s.e.m.。ホルム-シダック多重比較を用いるログランク:***、p<0.001。 HT-29細胞におけるVSVΔ51誘導性細胞死が、in vitro及びin vivoでSMC処置によって促進されることを示す一連のグラフである。図21Dは、腫瘍担持動物におけるSMC及びOVの同時処置の際のマウス体重の測定値を示すグラフである。エラーバー、平均±s.e.m.。 I型IFNシグナル伝達が、in vivoでのSMCとOVの相乗作用にとって必要であることを示すブロットである。EMT6腫瘍担持マウスを、ビヒクル又は50mg/kgのLCL161で4時間にわたって処置した後、中和IFNAR1又はアイソタイプ抗体で20時間にわたって処置した。続いて、動物をPBS又はVSVΔ51で18時間にわたって処置した。腫瘍を、示された抗体を用いるウェスタンブロッティングのために加工した。 先天性免疫細胞の腫瘍溶解性感染が、SMCの存在下でがん細胞死をもたらすことを示す一対のグラフである。図23Aは、免疫サブ集団を、脾細胞から選別し(CD11b+ F4/80+:マクロファージ; CD11b+ Gr1+:好中球; CD11b- CD49b+: NK細胞; CD11b- CD49b-: T及びB細胞)、24時間にわたって1MOIのVSVΔ51に感染させた実験に由来するデータを示すグラフである。細胞培養上清を、24時間にわたってSMC処理されたEMT6細胞に適用し、EMT6生存能力をアラマーブルーによって評価した。エラーバー、平均±s.d.。 先天性免疫細胞の腫瘍溶解性感染が、SMCの存在下でがん細胞死をもたらすことを示す一対のグラフである。図23Bは、骨髄由来マクロファージをVSVΔ51に感染させ、5μMのSMCの存在下で上清をEMT6細胞に適用し、生存能力をアラマーブルーによって測定した実験に由来するデータを示すチャートである。エラーバー、平均±s.d.。 完全長イムノブロットの一連の画像である。図24Aのイムノブロットは、図2Eに関するものである。 完全長イムノブロットの一連の画像である。図24Bのイムノブロットは、図4Eに関するものである。 完全長イムノブロットの一連の画像である。図24Cのイムノブロットは、図10Bに関するものである。 完全長イムノブロットの一連の画像である。図24Dのイムノブロットは、図13に関するものである。 完全長イムノブロットの一連の画像である。図24Eのイムノブロットは、図14Aに関するものである。 完全長イムノブロットの一連の画像である。図24Fのイムノブロットは、図14Gに関するものである。 完全長イムノブロットの一連の画像である。図24Gのイムノブロットは、図19に関するものである。 完全長イムノブロットの一連の画像である。図24Hのイムノブロットは、図17に関するものである。 非複製性ラブドウイルス由来粒子(NRRP)がSMCと相乗作用して、がん細胞死を引き起こすことを示すグラフのセットである。図25Aは、EMT6、DBT、及びCT-2Aがん細胞を、SMC LCL161(SMC; EMT6:5μM、DBT及びCT-2A: 15μM)及び異なる数のNRRPで48時間(EMT6)又は72時間(DBT、CT-2A)にわたって同時処理し、細胞生存能力をアラマーブルーによって評価した実験に由来するデータを示すグラフのセットである。 非複製性ラブドウイルス由来粒子(NRRP)がSMCと相乗作用して、がん細胞死を引き起こすことを示すグラフのセットである。図25Bは、非分画マウス脾細胞を、細胞あたり1個の粒子のNRRP又は250μMのCpG ODN2216と共に24時間インキュベートした実験に由来するデータを示す一対のグラフである。続いて、上清を、用量応答様式でEMT6細胞に適用し、5μMのLCL161を添加した。EMT6生存能力を、アラマーブルーによって処理の48時間後に評価した。 ワクチンがSMCと相乗作用して、がん細胞死を引き起こすことを示すグラフ及び画像のセットである。図26Aは、EMT6細胞を、ビヒクル又は5μMのLCL161(SMC)及び1000CFU/mLのBCG又は1ng/mLのTNFαで48時間処理し、生存能力をアラマーブルーによって評価した実験に由来するデータを示すグラフである。 ワクチンがSMCと相乗作用して、がん細胞死を引き起こすことを示すグラフ及び画像のセットである。図26Bは、ビヒクル又は50mg/kgのLCL161(SMC)及びPBSで腫瘍内に(i.t.)、BCG(1×105CFU)でi.t.に、又はBCG(1×105CFU)で腹腔内(i.p.)に2回処置し、様々な時点でIVIS CCDカメラによるライブ腫瘍生物発光イメージングにかけた、乳腺脂肪体腫瘍を担持するマウスの生存を示す代表的なIVIS画像のセット(EMT6-Fluc)である。スケール: p/sec/cm2/sr。 SMCがI型IFNと相乗作用して、乳腺腫瘍退縮を引き起こすことを示す一対のグラフ及び画像のセットである。図27Aは、マウスの乳腺脂肪体にEMT6-Fluc腫瘍を注射し、埋込みの後8日目に、ビヒクル又は50mg/kgのLCL161(SMC)と、ウシ血清アルブミン(BSA)との組合せで経口的に、1μgのIFNαとの組合せで腹腔内(i.p.)に、又は2μgのIFNαとの組合せで腫瘍内に(i.t.)処置した実験に由来するデータを示す一対のグラフである。左パネルは、腫瘍増殖を示す。右パネルは、マウス生存を示すカプラン-マイヤー曲線を表す。エラーバー、平均±s.e.m.。 SMCがI型IFNと相乗作用して、乳腺腫瘍退縮を引き起こすことを示す一対のグラフ及び画像のセットである。図27Bは、図27Aに記載された実験に由来する一連の代表的なIVIS画像である。スケール: p/sec/cm2/sr。 VSV-IFNβ又はVSVが、SMCと相乗作用して、がん細胞死を引き起こすことを示すグラフである。図28Aは、EMT6細胞を、ビヒクル又は5μMのLCL161(SMC)及び異なる感染多重度(MOI)のVSVΔ51-GFP、VSV-IFNβ、又はVSV-NIS-IFNβで同時処理した実験に由来するデータを示す。細胞生存能力を、アラマーブルーによって処理の48時間後に評価した。 VSV-IFNβ又はVSVが、SMCと相乗作用して、がん細胞死を引き起こすことを示すグラフである。図28Bは、EMT6乳腺腫瘍担持マウスを、ビヒクル又は50mg/kgのLCL161(SMC)で経口的に、及びPBS又は1×108PFUのVSV-IFNβ-NISで腫瘍内に2回処置した場合の一対のグラフである。 VSV-IFNβ又はVSVが、SMCと相乗作用して、がん細胞死を引き起こすことを示すグラフである。図28Cは、EMT6乳腺腫瘍担持マウスを、ビヒクル又は50mg/kgのLCL161(SMC)で経口的に、及び1×108PFUのVSVで腫瘍内に2回処置した場合の一対のグラフである。 非ウイルス及びウイルストリガーが、in vivoでTNFαのロバストな発現を誘導することを示すグラフである。マウスを、50mgのポリ(I:C)で腹腔内に、又は5×108PFUのVSVΔ51、VSV-mIFNβ、又はMaraba-MG1の静脈内注射で処置した。示された時間で、血清を単離し、ELISAのために加工して、TNFαのレベルを定量した。 ウイルスにより発現された前炎症性サイトカインが、SMCと相乗作用して、乳腺腫瘍退縮を誘導することを示すグラフと画像のセットである。図30Aは、マウスの乳腺脂肪体にEMT6-Fluc腫瘍を注射し、埋込み後7日目に、ビヒクル又は50mg/kgのLCL161(SMC)と、PBSとの組合せで経口的に、1×108PFUのVSVΔ51-memTNFαとの組合せ(i.v.)、又は1×108PFUのVSVΔ51-solTNFαとの組合せ(i.v.)で処置した実験に由来するデータを示す一対のグラフである。左パネルは、腫瘍増殖を示す。右パネルは、マウス生存を示すカプラン-マイヤー曲線を表す。エラーバー、平均±s.e.m.。 ウイルスにより発現された前炎症性サイトカインが、SMCと相乗作用して、乳腺腫瘍退縮を誘導することを示すグラフと画像のセットである。図30Bは、図30Aに記載された実験から獲得された代表的な生物発光IVIS画像のセットである。スケール: p/sec/cm2/sr。 ウイルスにより発現された前炎症性サイトカインが、SMCと相乗作用して、乳腺腫瘍退縮を誘導することを示すグラフと画像のセットである。図30Cは、マウスにCT-26腫瘍を皮下注射し、埋込み後10日目に、ビヒクル又は50mg/kgのLCL161と、PBSとの組合せで経口的に、又は1×108PFUのVSVΔ51-solTNFαとの組合せで腫瘍内に処置した実験に由来するデータを示す一対のグラフである。左パネルは、腫瘍増殖を示す。右パネルは、マウス生存を示すカプラン-マイヤー曲線を表す。エラーバー、平均±s.e.m.。 SMC処置が、グリア芽腫の同所性、同系マウスモデルにおいてin vivoでcIAP1/2タンパク質の下方調節をもたらすことを示す画像のセットである。図31Aは、CT-2A細胞を頭蓋内に埋め込み、50mg/kgのLCL161(SMC)で経口的に処置し、示された時点で腫瘍を切除し、cIAP1/2、XIAP、及びβ-チューブリンに対する抗体を使用するウェスタンブロッティングのために加工した実験に由来するイムノブロットを示す画像である。 SMC処置が、グリア芽腫の同所性、同系マウスモデルにおいてin vivoでcIAP1/2タンパク質の下方調節をもたらすことを示す画像のセットである。図31Bは、CT-2A細胞を頭蓋内に埋め込み、10μLの100μM LCL161で腫瘍内に処置し、示された時点で腫瘍を切除し、cIAP1/2、XIAP、及びβ-チューブリンに対する抗体を使用するウェスタンブロッティングのために加工した実験に由来するイムノブロットを示す画像である。 脳における一過性の前炎症性応答が、SMCと相乗作用して、グリア芽腫細胞死を引き起こすことを示すグラフと画像とのセットである。図32Aは、PBS又は50mgのポリ(I:C)を12又は24時間にわたって腹腔内注射したマウスに由来する300mgの未精製の脳タンパク質抽出物に由来する可溶性TNFαのレベルを決定するためにELISAを行った実験に由来するデータを示すグラフである。脳タンパク質抽出物を、塩水溶液中での機械的均一化によって取得した。 脳における一過性の前炎症性応答が、SMCと相乗作用して、グリア芽腫細胞死を引き起こすことを示すグラフと画像とのセットである。図32Bは、70mgの未精製の脳ホモジネート及び培養物中の5μMのLCL161(SMC)で48時間処理したマウスグリア芽腫細胞(CT-2A、K1580)のアラマーブルー生存能力アッセイに由来するデータを示すグラフである。脳ホモジネートを、ポリ(I:C)のi.p.注射、又は5×108PFUのVSVΔ51又はVSV-mIFNβの静脈内注射で12時間処置したマウスから取得した。 脳における一過性の前炎症性応答が、SMCと相乗作用して、グリア芽腫細胞死を引き起こすことを示すグラフと画像とのセットである。図32Cは、50mgのポリ(I:C)の3回の頭蓋内処置を受けたマウスの生存を示すカプラン-マイヤー曲線を表す。処置は、0、3、及び7日目に行った。 脳における一過性の前炎症性応答が、SMCと相乗作用して、グリア芽腫細胞死を引き起こすことを示すグラフと画像とのセットである。図32Dは、SMC、VSVΔ51又はポリ(I:C)の組合せを受けたCT-2A頭蓋内腫瘍を担持するマウスの生存を示すカプラン-マイヤー曲線を表す。マウスは、ビヒクルの3回の処置、75mg/kgのLCL161(経口)の3回の処置、5×108PFUのVSVΔ51(i.v.)の3回の処置、又は50mgのポリ(I:C)(頭蓋内、i.c.)の2回の処置の組合せを受けた。7及び15日目にi.c.注射を受けたポリ(I:C)処置群を除いて、マウスを、異なる条件を用いて腫瘍細胞埋込み後7、10及び14日目に処置した。括弧内の数は1群あたりのマウスの数を示す。 脳における一過性の前炎症性応答が、SMCと相乗作用して、グリア芽腫細胞死を引き起こすことを示すグラフと画像とのセットである。図32Eは、図32Dに示された実験に由来するマウス頭蓋の一連の代表的なMRI画像であり、終点での動物及び埋込み後50日目での示された群の代表的なマウスを示す。破線は脳腫瘍を示す。 SMCがI型IFNと相乗作用して、脳腫瘍を根絶することを示すグラフである。このグラフは、埋込み後7日目に、PBS又は1μgのIFNαと共に、ビヒクル又は100μMのLCL161(SMC)の頭蓋内注射を受けたCT-2Aを担持するマウスの生存を示すカプラン-マイヤー曲線を表す。 NF-κBシグナル伝達経路の概観である。TNFファミリー受容体とのリガンド遭遇時に、古典的経路又は代替経路が、cIAP1/2の活性に依存して活性化される。古典的なNF-κB活性化においては、RIP1がcIAP1/2からK63ユビキチン結合を受け取って、シグナル伝達複合体を形成し、IκB-キナーゼ(IKK)の活性化後にκBの阻害因子(IκB)のリン酸化を可能にする。リン酸化されたIκBは分解され、p50/p65ヘテロ二量体を遊離する。代替経路は、NF-κB誘導キナーゼ(NIK)のcIAP1/2 K48結合ユビキチン化によって不活性のまま保持される。NIKが安定である場合、それはIKK及び下流のp100のリン酸化を可能にし、p100のp52へのプロセシングをもたらす。この経路は、NF-κBヘテロ二量体で終結し、核に移行して、転写因子として作用し、標的遺伝子の発現を調節する。 SMCと、PD-1に対するモノクローナル抗体とを組み合わせるプロセスが、マウスMMモデルにおいて疾患進行を遅延させ、生存を延長させたことを記載する。図35Aは、2週間にわたって250μgのICI及び50mg/kgで週に3回処置したMPC-11 Fluc細胞を担持するマウスの画像を示す。マウスを、SMC及びPD-1又はCTLA-4に対するモノクローナル抗体で処置した。抗PD-1とSMCとの組合せで処置されたマウスは、細胞埋込み後の日数に対するがん負荷のIVIS生物発光画像によって決定されるように、腫瘍負荷をほとんど示さなかった。 SMCと、PD-1に対するモノクローナル抗体とを組み合わせるプロセスが、マウスMMモデルにおいて疾患進行を遅延させ、生存を延長させたことを記載する。図35Bは、抗PD-1、抗CTLA-4及びSMCを用いる処置レジメンを示す。 SMCと、PD-1に対するモノクローナル抗体とを組み合わせるプロセスが、マウスMMモデルにおいて疾患進行を遅延させ、生存を延長させたことを記載する。図35Cは、カプラン-マイヤー曲線中に示されるように、MPC-11 Fluc細胞の埋込み後に生存したマウスの日数を示すグラフである。 先天性免疫刺激剤がSMCと相乗作用してMM細胞死を引き起こすことを示す一連のグラフである。図36Aは、ビヒクル又は5μMのSMCの存在下で、1U/μLのIFNα、IFNβ、及びIFNγで処置したヒト細胞株U266、MM1R、及びMM1Sの生存能力を示す一連の棒グラフである。生存能力を、24時間後にトリパンブルー排除によって決定した。 先天性免疫刺激剤がSMCと相乗作用してMM細胞死を引き起こすことを示す一連のグラフである。図36Bは、5μMのSMC及び様々な感染多重度(MOI)のVSVΔ51で処理したマウスMM細胞株MPC-11の生存能力を示すグラフである。生存能力を、24時間後にアラマーブルーを用いて評価した。 先天性免疫刺激剤がSMCと相乗作用してMM細胞死を引き起こすことを示す一連のグラフである。図36Cは、5μMのSMC及び様々な感染多重度(MOI)のVSVmIFNで処理したマウスMM細胞株MPC-11の生存能力を示すグラフである。生存能力を、24時間後にアラマーブルーを用いて評価した。 IFNとSMCとが相乗作用して、マウスにおけるMM疾患進行を遅延させることを示す図である。MPC-11 Fluc細胞を担持するマウスを、1μgの組換えIFNα及び50mg/kgのSMCで3回処置した。図37Aは、MM細胞埋込み後の示された日数で取られたがん負荷の一連のIVIS生物発光画像である。 IFNとSMCとが相乗作用して、マウスにおけるMM疾患進行を遅延させることを示す図である。MPC-11 Fluc細胞を担持するマウスを、1μgの組換えIFNα及び50mg/kgのSMCで3回処置した。図37Bは、生存時間を示すカプラン-マイヤー曲線である。 IFNとSMCとが相乗作用して、マウスにおけるMM疾患進行を遅延させることを示す図である。MPC-11 Fluc細胞を担持するマウスを、1μgの組換えIFNα及び50mg/kgのSMCで3回処置した。図37Cは、処置レジメンを示す略図である。 腫瘍溶解性ウイルスがMM疾患進行を遅延させ、生存を増加させることができることを示す図である。図38Aは、5×108pfuのVSVΔ51及び50mg/kgのSMCで4回処理されたMPC-11 Fluc細胞を担持するマウスの埋込み後の示された日数で取られたIVIS生物発光画像である。 腫瘍溶解性ウイルスがMM疾患進行を遅延させ、生存を増加させることができることを示す図である。図38Bは、生存時間を示すカプラン-マイヤー曲線である。 腫瘍溶解性ウイルスがMM疾患進行を遅延させ、生存を増加させることができることを示す図である。図38Cは、処置レジメンを示す。 糖質コルチコイド受容体リガンドがSMCと相乗作用して、耐性細胞株をSMC媒介性細胞死に対して感作することを示す図である。図39Aは、タンパク質を、ウェスタンブロッティングのためにMM1R及びMM1S細胞から抽出し、等量のタンパク質を使用したことを示す略図である。 糖質コルチコイド受容体リガンドがSMCと相乗作用して、耐性細胞株をSMC媒介性細胞死に対して感作することを示す図である。図39Bは、細胞を、示された時間にわたって5μMのSMC、10μMのDex及び10μMのRU486で処理し、死細胞を、細胞不浸透性DNA結合染料を用いて、YOYO-1陽性として決定し、ウェル内の細胞の集密度に対して正規化したことを示すグラフである。 糖質コルチコイド受容体リガンドがSMCと相乗作用して、耐性細胞株をSMC媒介性細胞死に対して感作することを示す図である。図39Cは、細胞を、示された時間にわたって5μMのSMC、10μMのDex及び10μMのRU486で処理し、死細胞を、細胞不浸透性DNA結合染料を用いて、YOYO-1陽性として決定し、ウェル内の細胞の集密度に対して正規化したことを示すグラフである。 SMCがNF-κBシグナル伝達を増加させ、アポトーシスを引き起こすことを示す図である。ヒトMM細胞株MM1R及びMM1Sを、5μMのSMCで処理した後、1、16又は48時間後に収集した。図40Aは、NF-κB経路の様々な成分に関するウェスタンブロットを示す。 SMCがNF-κBシグナル伝達を増加させ、アポトーシスを引き起こすことを示す図である。ヒトMM細胞株MM1R及びMM1Sを、5μMのSMCで処理した後、1、16又は48時間後に収集した。図40Bは、図40Aに由来するバンドの定量化であり、未処理対照に対して正規化された、p-p65のp65に対する比として表した。 SMCがNF-κBシグナル伝達を増加させ、アポトーシスを引き起こすことを示す図である。ヒトMM細胞株MM1R及びMM1Sを、5μMのSMCで処理した後、1、16又は48時間後に収集した。図40Cは、図40Aに由来するバンドの定量化であり、未処理対照に対して正規化された、p-p65のp52:p100に対する比として表した。 SMCとIFNβとの組合せ処置が、NF-κB活性を増加させ、アポトーシスを引き起こすことを示す図である。ヒト細胞株U266、MM1R及びMM1S並びにマウス細胞株MPC-11及びFlucタグ付き亜細胞株を、5μMのSMC及び1U/μLのIFNβで1又は16時間処理した。細胞ペレットを収獲し、溶解物をウェスタンブロッティングのために同等にロードした。 SMCと組み合わせた腫瘍溶解性ウイルスがNF-κBシグナル伝達を活性化し、マウスMM細胞中でアポトーシスをもたらすことを示す図である。MPC-11細胞を、VSVΔ51又はVSVmIFNで1、12、又は24時間処理した。図42Aは、細胞ペレットを収獲し、溶解物をウェスタンブロッティングのために同等にロードしたことを示すウェスタンブロットである。 SMCと組み合わせた腫瘍溶解性ウイルスがNF-κBシグナル伝達を活性化し、マウスMM細胞中でアポトーシスをもたらすことを示す図である。MPC-11細胞を、VSVΔ51又はVSVmIFNで1、12、又は24時間処理した。図42Bは、図42A中のバンドから定量されたタンパク質レベルであり、ホスホ-p65のp65に対する比として表す。 SMCと組み合わせた腫瘍溶解性ウイルスがNF-κBシグナル伝達を活性化し、マウスMM細胞中でアポトーシスをもたらすことを示す図である。MPC-11細胞を、VSVΔ51又はVSVmIFNで1、12、又は24時間処理した。図42Cは、図42A中のバンドから定量されたタンパク質レベルであり、p52のp100に対する比として表す。 PD-L1及びPD-L2発現が、IFNβを用いる処理後にヒトMM細胞株中で増加することを示す図である。PD-L1及びPD-L2 mRNAの発現は、非処理対照と比較して、IFNβ処理又はIFNβとSMCとの処理後、6、12及び24時間で増加する。 SMCと免疫調節剤との組合せが、CD8+T細胞も含むがん細胞死をもたらすことを示すグラフである。図44Aは、二重処置された治癒したマウスの乳腺脂肪体にEMT6細胞を再注射した(初回の埋込み後の日付から180日)実験に由来するデータを示すグラフである。 SMCと免疫調節剤との組合せが、CD8+T細胞も含むがん細胞死をもたらすことを示すグラフである。図44Bは、二重処置された治癒したマウスの頭蓋内にCT-2A細胞を再注射した(初回の埋込み後の日付から190日)実験に由来するデータを示すグラフである。 SMCと免疫調節剤との組合せが、CD8+T細胞も含むがん細胞死をもたらすことを示すグラフである。図44Cは、CT-2A神経膠腫又はEMT6乳がん細胞をトリプシン処理し、コンジュゲート化アイソタイプ対照IgG又は抗PD-L1で表面を染色し、フローサイトメトリーのために加工した実験に由来するデータを示すグラフである。 SMCと免疫調節剤との組合せが、CD8+T細胞も含むがん細胞死をもたらすことを示すグラフである。図44Dは、CD8+T細胞を、CD8 T細胞陽性磁気選択キットを使用して脾細胞(ナイーブマウス又は以前にEMT6腫瘍が治癒したマウスに由来する)から富化し、IFNγ及びグランザイムBの検出のためにELISpotアッセイにかけた実験に由来するデータを示すグラフである。CD8+T細胞を、培地又はがん細胞(がん細胞のCD8+T細胞に対する比は12:1)及び10mgの対照IgG又は抗PD-1と共に48時間同時培養した。3匹のマウスを、独立した生物学的複製物として使用した(以前にEMT6腫瘍が治癒している)。4T1及びEMT6細胞は同じ主要組織適合抗原を担持するため、4T1細胞は陰性対照として役立つ。 SMCががんの同所性マウスモデルにおいて免疫チェックポイント阻害剤と相乗作用することを示すグラフである。図45Aは、EMT6乳腺腫瘍担持マウスを、PBS又は1×108PFUのVSVD51で1回、腫瘍内に処置し、5日後、マウスをビヒクル又は50mg/kgのLCL161(SMC)で経口的に、及び250mgの抗PDで腹腔内(i.p.)に組み合わせて処置した。 SMCががんの同所性マウスモデルにおいて免疫チェックポイント阻害剤と相乗作用することを示すグラフである。図45Bは、頭蓋内CT-2A腫瘍を担持するマウスを、ビヒクル又は75mg/kgのLCL161(経口)及び250mg(i.p.)の対照IgG、抗PD-1又は抗CTLA-4で4回処置したデータを示すグラフである。 SMCががんの同所性マウスモデルにおいて免疫チェックポイント阻害剤と相乗作用することを示すグラフである。図45Bは、頭蓋内GL261腫瘍を担持するマウスを、ビヒクル又は75mg/kgのLCL161(経口)及び250mg(i.p.)の対照IgG、抗PD-1又は抗CTLA-4で4回処置したデータを示すグラフである。 SMCががんの同所性マウスモデルにおいて免疫チェックポイント阻害剤と相乗作用することを示すグラフである。CT-2A頭蓋内腫瘍を担持する無胸腺CD-1ヌードマウスを、75mg/kgのLCL161(経口)及び250mg(i.p.)の抗PD-1で処置したデータを示すグラフである。 SMCがサイトカイン又は腫瘍溶解性ウイルスの存在下でグリア芽腫細胞の死滅を誘導することを示すグラフである。ビヒクル又は5μMのLCL161(SMC)及び0.1ng/mLのTNF-α又は0.01MOIのVSVΔ51で48時間処理したヒト(M059K、SNB75、U118)及びマウス(CT-2A、GL261)グリア芽腫細胞のアラマーブルー生存能力アッセイ(図46A)。エラーバー、平均、s.d.。n=4。図46Aは、生物学的複製物を使用する3回の独立した実験に由来する代表データを示す。統計的有意性を、ダネットの多重比較検定を使用するANOVAを使用して、ビヒクル及びBSA処理と比較した。p<0.0001(*)の場合、有意性が報告される。 SMCがサイトカイン又は腫瘍溶解性ウイルスの存在下でグリア芽腫細胞の死滅を誘導することを示すグラフである。示された一次マウスNF1-/+p53-/+細胞株を、ビヒクル又は5μMのLCL161(SMC)及び0.01%BSA、1ng/mLのTNF-α又は示されたMOIの非拡散型のVSVΔ51(VSVΔ51ΔG)で48時間処理し、生存能力をアラマーブルーによって評価した(図46B)。エラーバー、平均、s.d.。n=4。図46Bは、生物学的複製物を使用する3回の独立した実験に由来する代表データを示す。統計的有意性を、ダネットの多重比較検定を使用するANOVAを使用して、ビヒクル及びBSA処理と比較した。p<0.0001(*)の場合、有意性が報告される。 SMCがサイトカイン又は腫瘍溶解性ウイルスの存在下でグリア芽腫細胞の死滅を誘導することを示すグラフである。ビヒクル又は5μMのLCL161及び0.001MOIのVSVΔ51又はMaraba-MG1で48時間処理したヒト脳腫瘍開始細胞(BTIC)のアラマーブルー生存能力アッセイ(図46C)。エラーバー、平均、s.d.。n=3。統計的有意性を、ダネットの多重比較検定を使用するANOVAを使用して、ビヒクル及びBSA処理と比較した。p<0.0001(*)の場合、有意性が報告される。 SMCがTNF-αと強力に相乗作用して、グリア芽腫細胞の死滅を誘導することを示すグラフである。0.01%のBSA又は0.1ng/mLのTNF-α及びビヒクル又は5μMの示された単量体若しくは二量体で48時間の処理に対するマウスグリア芽腫CT-2A細胞の生存能力。生存能力を、アラマーブルーによって評価した。エラーバー、平均、s.d.。n=4。生物学的複製物を使用する2つの独立した実験に由来する代表データ。統計的有意性を、ダネットの多重比較検定を使用するANOVAを使用して、ビヒクル及びBSA処理と比較した。p<0.0001(*)の場合、有意性が報告される。 グリア芽腫細胞におけるSMCに基づく組合せに対する耐性がcFLIPの下方調節を用いて回避されることを示す一連のグラフ及び画像である。一次マウスNF1-/+p53-/+(K5001)又はヒト(SF539)グリア芽腫細胞又はヒト非形質転換細胞(GM38)に、非標的(NT)又はcFLIP siRNAを48時間トランスフェクトした後、ビヒクル又は5μMのLCL161(SMC)及びBSA、0.1ng/mLのTNF-α又は示されたMOIの非拡散型のVSVΔ51(VSVΔ51ΔG;図48A)で48時間処理した。生存能力を、アラマーブルーによって決定した。エラーバー、平均、s.d.。n=4。生物学的複製物を使用する3つの独立した実験に由来する代表データ。統計的有意性を、ダネットの多重比較検定を使用するANOVAを使用して、ビヒクル及びBSA処理と比較した。p<0.0001(*)の場合、有意性が報告される。(図48B)における実験に由来するNT siRNA又はcFLIPを標的とするsiRNAの効能。 グリア芽腫細胞におけるSMCに基づく組合せに対する耐性がcFLIPの下方調節を用いて回避されることを示す一連のグラフ及び画像である。一次マウスNF1-/+p53-/+(K5001)又はヒト(SF539)グリア芽腫細胞又はヒト非形質転換細胞(GM38)に、非標的(NT)又はcFLIP siRNAを48時間トランスフェクトした後、ビヒクル又は5μMのLCL161(SMC)及びBSA、0.1ng/mLのTNF-α又は示されたMOIの非拡散型のVSVΔ51(VSVΔ51ΔG;図48A)で48時間処理した。生存能力を、アラマーブルーによって決定した。エラーバー、平均、s.d.。n=4。生物学的複製物を使用する3つの独立した実験に由来する代表データ。統計的有意性を、ダネットの多重比較検定を使用するANOVAを使用して、ビヒクル及びBSA処理と比較した。p<0.0001(*)の場合、有意性が報告される。(図48B)における実験に由来するNT siRNA又はcFLIPを標的とするsiRNAの効能。 グリア芽腫のマウス同系同所性モデルの確立を示す画像である。PBS又は5×104個のCT-2A細胞を頭蓋内注射され、埋込み後35日目に犠牲にされたC57BL/6マウスのMRI画像が示される。スケールバー、2mm。ルーラーはmm区分と共にcmで示される。 グリア芽腫のマウス同系同所性モデルの確立を示す画像である。PBS又は5×104個のCT-2A細胞を頭蓋内注射され、埋込み後35日目に犠牲にされたC57BL/6マウスの肉眼画像が示される。スケールバー、2mm。ルーラーはmm区分と共にcmで示される。 SMCがグリア芽腫の処置のための先天性免疫刺激剤と相乗作用することを示すグラフである。スケールバー、2mm。ビヒクル又は5μMのLCL161及び0.01%BSA又は1μg/mLのIFN-αB/Dで処理したCT-2A細胞のアラマーブルー生存能力アッセイ。エラーバー、平均、s.d.。n=4(図50A)。 SMCがグリア芽腫の処置のための先天性免疫刺激剤と相乗作用することを示すグラフである。スケールバー、2mm。7日齢の頭蓋内CT-2A腫瘍を担持するマウスを、75mg/kgのLCL161(経口)及びBSA又は1μgのIFN-αB/D(i.p.)の組合せで処置した(図50B)。図50Bは、マウス生存を示すカプラン-マイヤー曲線を表すデータを示す。ホルム-シダック多重比較を用いるログランク:**、p<0.01; ***、p<0.001。括弧内の数は、1群あたりのマウスの数を表す。 SMC処置が非腫瘍担持マウスに由来する脳組織中でIAPの下方調節を誘導しないことを示す画像である。マウスを、75mg/kgのLCL161(SMC)で示された時間にわたって処置し、示された抗体を使用するウェスタンブロットのために組織を加工した。各時点についてn=2。 SMCに基づく組合せ処置が長期間の免疫学的抗腫瘍記憶をもたらすことを示すグラフである。CT-2A細胞を、ビヒクル又は5μMのLCL161(SMC)及び0.01%BSA、1ng/mLのTNF-α、250U/mLのIFN-β又は0.1MOIのVSVΔ51で24時間処理し、生細胞(Zombie Green陰性)を、示された抗体を使用するフローサイトメトリーによって分析した(図52A)。生物学的複製物を使用する3つの独立した実験に由来する代表データ。 SMCに基づく組合せ処置が長期間の免疫学的抗腫瘍記憶をもたらすことを示すグラフである。ナイーブマウス又は乳腺脂肪体EMT6(乳腺癌、図52B)若しくは頭蓋内CT-2A(グリア芽腫、図52C)腫瘍のSMCに基づく処置を用いて以前に治癒したマウスに、EMT6又は乳腺癌4T1細胞を、乳腺脂肪体内に、又はCT-2A細胞を皮下(s.c.)に、若しくは頭蓋内(i.c.)に再注射した。細胞を、初回の埋込み後180日で埋め込んだ。データは、マウス生存を示すカプラン-マイヤー曲線を表す。ホルム-シダック多重比較を用いるログランク(埋込み方法と比較した):*、p<0.05; **、p<0.01; ***、p<0.001。括弧内の数は、1群あたりのマウスの数を表す。 SMCに基づく組合せ処置が長期間の免疫学的抗腫瘍記憶をもたらすことを示すグラフである。ナイーブマウス又は乳腺脂肪体EMT6(乳腺癌、図52B)若しくは頭蓋内CT-2A(グリア芽腫、図52C)腫瘍のSMCに基づく処置を用いて以前に治癒したマウスに、EMT6又は乳腺癌4T1細胞を、乳腺脂肪体内に、又はCT-2A細胞を皮下(s.c.)に、若しくは頭蓋内(i.c.)に再注射した。細胞を、初回の埋込み後180日で埋め込んだ。データは、マウス生存を示すカプラン-マイヤー曲線を表す。ホルム-シダック多重比較を用いるログランク(埋込み方法と比較した):*、p<0.05; **、p<0.01; ***、p<0.001。括弧内の数は、1群あたりのマウスの数を表す。 SMC処置がチェックポイント阻害剤分子又はMHC I/IIタンパク質の発現を無効化しないことを示すグラフである。SNB75細胞を、ビヒクル又は5μMのLCL161(SMC)及び1ng/mLのTNF-α、250U/mLのIFN-β又は0.1MOIのVSVΔ51で24時間処理し、生細胞(Zombie Green陰性)を、示された抗体を使用するフローサイトメトリーのために加工した。3つの独立した実験に由来する代表データ。 SMCがグリア芽腫のマウスモデルにおいて免疫チェックポイントを標的とする抗体と相乗作用することを示すグラフである。脾臓CD8+T細胞を、ナイーブマウス又はCT-2A腫瘍が以前に治癒したマウスから富化し、IFN-γ及びGrzBの検出のためにELISpotアッセイにかけた。がん細胞(CT-2A、LLC)を、CD8+細胞(25:1比)及び10μg/mLの対照IgG又はα-PD-1と共に48時間、同時培養した。n=4匹のマウス/群(図54A)。有意性を、ダネットの多重比較検定を用いるANOVAによって評価されるように、CT-2A細胞と同時インキュベートしたナイーブCD8+T細胞と比較した。*、p<0.05; **、p<0.01; ***、p<0.001。図54Aにおいて、十字は平均を示し、実線の水平線は中央値を示し、囲みは第一から第三四分位数を示し、ひげは値の最小-最大範囲を示す。 SMCがグリア芽腫のマウスモデルにおいて免疫チェックポイントを標的とする抗体と相乗作用することを示すグラフである。頭蓋内CT-2A腫瘍を担持するマウスを、埋込み後14、16、21及び23日目に、75mg/kgのLCL161で経口的に(SMC)処置した(図54B)。図54Bにおいて、十字は平均を示し、実線の水平線は中央値を示し、囲みは第一から第三四分位数を示し、ひげは値の最小-最大範囲を示す。 SMCがグリア芽腫のマウスモデルにおいて免疫チェックポイントを標的とする抗体と相乗作用することを示すグラフである。腫瘍塊に由来する生細胞を、CD45(BV605)、CD3(APC-Cy7)、CD8(PE)及びPD-1(BV421)の検出のためにフローサイトメトリーによって分析した。実験に由来する生腫瘍細胞を、抗体CD45(PE)及びPD-L1(BV421)を使用するフローサイトメトリーによって分析した(図54C)。n=6匹のマウス/群。FMO、蛍光-1。統計的有意性をt検定によって評価した。図54Cにおいて、十字は平均を示し、実線の水平線は中央値を示し、囲みは第一から第三四分位数を示し、ひげは値の最小-最大範囲を示す。 SMCがグリア芽腫のマウスモデルにおいて免疫チェックポイントを標的とする抗体と相乗作用することを示すグラフである。頭蓋内CT-2A(図54D、図54F、及び図54G)又はGL261(図54E)腫瘍を担持するマウスを、示された時間で、ビヒクル、75mg/kgのLCL161で経口(図54D、図54E、及び図54G)に、又はビヒクル若しくは30mg/kgのビリナパントで腹腔内(i.p.;図54F)に、及び250μgのIgG、α-PD-1若しくはα-CTLA-4(i.p.)の組合せで、又は両方の組合せで処置した(図54G)。データは、マウス生存を示すカプラン-マイヤー曲線を表す。ホルム-シダック多重比較を用いるログランク: *、p<0.05; **、p<0.01; ***、p<0.001。括弧内の数は1群あたりのマウスの数を表す。図54Dは、2つの独立した実験に由来する代表データを示す。 SMCがグリア芽腫のマウスモデルにおいて免疫チェックポイントを標的とする抗体と相乗作用することを示すグラフである。頭蓋内CT-2A(図54D、図54F、及び図54G)又はGL261(図54E)腫瘍を担持するマウスを、示された時間で、ビヒクル、75mg/kgのLCL161で経口(図54D、図54E、及び図54G)に、又はビヒクル若しくは30mg/kgのビリナパントで腹腔内(i.p.;図54F)に、及び250μgのIgG、α-PD-1若しくはα-CTLA-4(i.p.)の組合せで、又は両方の組合せで処置した(図54G)。データは、マウス生存を示すカプラン-マイヤー曲線を表す。ホルム-シダック多重比較を用いるログランク: *、p<0.05; **、p<0.01; ***、p<0.001。括弧内の数は1群あたりのマウスの数を表す。 SMCがグリア芽腫のマウスモデルにおいて免疫チェックポイントを標的とする抗体と相乗作用することを示すグラフである。頭蓋内CT-2A(図54D、図54F、及び図54G)又はGL261(図54E)腫瘍を担持するマウスを、示された時間で、ビヒクル、75mg/kgのLCL161で経口(図54D、図54E、及び図54G)に、又はビヒクル若しくは30mg/kgのビリナパントで腹腔内(i.p.;図54F)に、及び250μgのIgG、α-PD-1若しくはα-CTLA-4(i.p.)の組合せで、又は両方の組合せで処置した(図54G)。データは、マウス生存を示すカプラン-マイヤー曲線を表す。ホルム-シダック多重比較を用いるログランク: *、p<0.05; **、p<0.01; ***、p<0.001。括弧内の数は1群あたりのマウスの数を表す。 SMCがグリア芽腫のマウスモデルにおいて免疫チェックポイントを標的とする抗体と相乗作用することを示すグラフである。頭蓋内CT-2A(図54D、図54F、及び図54G)又はGL261(図54E)腫瘍を担持するマウスを、示された時間で、ビヒクル、75mg/kgのLCL161で経口(図54D、図54E、及び図54G)に、又はビヒクル若しくは30mg/kgのビリナパントで腹腔内(i.p.;図54F)に、及び250μgのIgG、α-PD-1若しくはα-CTLA-4(i.p.)の組合せで、又は両方の組合せで処置した(図54G)。データは、マウス生存を示すカプラン-マイヤー曲線を表す。ホルム-シダック多重比較を用いるログランク: *、p<0.05; **、p<0.01; ***、p<0.001。括弧内の数は1群あたりのマウスの数を表す。 SMC処置がCD8 T細胞中でPD-1の上方調節をもたらすことを示す一連のグラフである。頭蓋内CT-2A腫瘍を担持するマウスを、埋込み後14、16、21、及び23日目に、75mg/kgのLCL161で経口的に(SMC)処置した。CT-2A腫瘍に由来する生細胞を、抗体CD45(BV605)、CD3(APC-Cy7)、CD8(PE)、及びPD-1(BV421)を使用するフローサイトメトリーのために加工した。 SMCが多発性骨髄腫のマウスモデルの処置のための免疫チェックポイント阻害剤と相乗作用することを示すグラフである。MPC-11細胞を、ビヒクル又は5μMのLCL161(SMC)及び0.1ng/mLのTNF-α、250U/mLのIFN-α、若しくは250U/mLのIFN-βで処理した(図56A)。生存能力を、処理後48時間でアラマーブルーによって決定した。エラーバー、平均、s.d.。n=4。統計的有意性を、ダネットの多重比較検定を使用するANOVAを使用して、ビヒクル及びBSA処理と比較した。p<0.0001(***)の場合、有意性が報告される。生物学的複製物を使用する3つの独立した実験に由来する代表データ。 SMCが多発性骨髄腫のマウスモデルの処置のための免疫チェックポイント阻害剤と相乗作用することを示すグラフである。MPC-11細胞を解離させ、PE-Cy7コンジュゲート化アイソタイプIgG又はPD-L1を用いるフローサイトメトリーのために加工した(図56B)。 乳腺がんのマウスモデルにおけるSMCと免疫チェックポイント阻害剤を標的とする抗体との組合せを示すグラフである。ビヒクル又は5μMのLCL161(SMC)及び0.1ng/mLのTNF-α、250U/mLのIFN-β又は0.1MOIのVSVΔ51で48時間にわたって処理したEMT6細胞の生存能力アッセイ(図57A)。エラーバー、平均、s.d.。n=4。統計的有意性を、ダネットの多重比較検定を使用するANOVAを使用して、ビヒクル及びBSA処理と比較した。p<0.0001(***)の場合、有意性が報告される。生物学的複製物を使用する3つの独立した実験に由来する代表データ。 乳腺がんのマウスモデルにおけるSMCと免疫チェックポイント阻害剤を標的とする抗体との組合せを示すグラフである。EMT6細胞を解離させ、PE-Cy7コンジュゲート化アイソタイプIgG又はPD-L1を用いるフローサイトメトリーのために加工した(図57B)。3つの独立した実験に由来する代表データ。 乳腺がんのマウスモデルにおけるSMCと免疫チェックポイント阻害剤を標的とする抗体との組合せを示すグラフである。約100mm3のEMT6-Fluc腫瘍を担持するマウスを、示された埋込み後の時間で、PBS又は5×108PFUのVSVΔ51で腫瘍内に処置した後、ビヒクル又は50mg/kgのLCL161(SMC)で経口的に、及び250μgのIgG又はα-PD-1で腹腔内に処置した(図57C)。左パネルは、腫瘍増殖を示す。エラーバー、平均、s.e.m.。右パネルは、マウス生存を示すカプラン-マイヤー曲線を表す。ホルム-シダック多重比較を用いるログランク: *、p<0.05; **、p<0.01。括弧内の数は、1群あたりのマウスの数を表す。 SMCの含有がグリア芽腫細胞の存在下で免疫応答を増加させることを示すグラフである。示された因子の発現を、ナイーブマウス又はSMCと抗PD-1との同時処置によって頭蓋内CT-2A腫瘍が以前に治癒したマウスに由来する脾細胞と48時間同時インキュベートしたCT-2A細胞の細胞培養上清に由来するELISAによって検出した(CT-2A細胞の脾細胞に対する比1:20;図58A)。十字は平均を示し、実線の水平線は中央値を示し、囲みは第一から第三四分位数を示し、ひげは値の最小-最大範囲を示す。統計的有意性を、ダネットの多重比較検定を用いるANOVAによって評価されるようにナイーブCD8+T細胞と比較した。*、p<0.05; **、p<0.01; ***、p<0.001。 SMCの含有がグリア芽腫細胞の存在下で免疫応答を増加させることを示すグラフである。示されたサイトカインを、ナイーブマウス又は治癒したマウスに由来する脾細胞と同時培養し、ビヒクル又は5μMのLCL161(SMC)で48時間処理したCT-2A細胞に由来するELISAによって決定した(図58B)。十字は平均を示し、実線の水平線は中央値を示し、囲みは第一から第三四分位数を示し、ひげは値の最小-最大範囲を示す。統計的有意性を、ダネットの多重比較検定を用いるANOVAによって評価されるようにビヒクル及びIgG処理されたT細胞と比較した。**、p<0.01; ***、p<0.001。 グリア芽腫の処置のためのSMCと免疫チェックポイント阻害剤との間の相乗作用にとってCD8+T細胞が必要であることを示す画像及びグラフである。示された免疫因子の発現を、ナイーブマウス又はSMCと抗PD-1との同時処置によって頭蓋内CT-2A腫瘍が以前に治癒したマウスに由来する脾細胞と48時間同時インキュベートしたCT-2A細胞の細胞培養上清に由来するELISAによって検出した(CT-2A細胞の脾細胞に対する比1:20;図59A)。データを、正規化されたスケーリングを使用してヒートマップとしてプロットする。データの囲み及びひげプロットを、図58Aに示す。 グリア芽腫の処置のためのSMCと免疫チェックポイント阻害剤との間の相乗作用にとってCD8+T細胞が必要であることを示す画像及びグラフである。示された因子の定量化を、ナイーブマウス又は治癒したマウスに由来する脾細胞と同時培養し(1:20比)、ビヒクル又は5μMのLCL161(SMC)で48時間処理したCT-2A細胞に由来するELISAによって検出した(図59B)。 グリア芽腫の処置のためのSMCと免疫チェックポイント阻害剤との間の相乗作用にとってCD8+T細胞が必要であることを示す画像及びグラフである。ナイーブマウス又は治癒したマウスに由来する脾細胞を、20μg/mLの対照IgG又は抗PD1及び5μMの示されたSMCの存在下で、mKate2タグ付きCT-2A細胞(CT-2A-mKate2)と同時培養した(図59C)。CT-2A-mKate2細胞の計数を、Incucyte Zoomを使用して実施した。十字は平均を示し、実線の水平線は中央値を示し、囲みは第一から第三四分位数を示し、ひげは値の最小-最大範囲を示す。統計的有意性を、ダネットの多重比較検定を用いるANOVAによって評価されるようにナイーブ脾細胞と比較した。* <0.0001の場合、有意性が報告される。ナイーブマウスについてはn=6及び治癒マウスについてはn=6である。スケールバー、100μm。 グリア芽腫の処置のためのSMCと免疫チェックポイント阻害剤との間の相乗作用にとってCD8+T細胞が必要であることを示す画像及びグラフである。頭蓋内CT-2A腫瘍を担持するC57BL/6マウスを、示された日付に、IgG(i.p.)及びビヒクル(経口)又はα-PD-1(i.p.)及び75mg/kgのLCL161(経口)、並びにIgG、α-CD4又はα-CD8のi.p.投与の組合せで処置した(全ての抗体は250μgであった;図59D)。 グリア芽腫の処置のためのSMCと免疫チェックポイント阻害剤との間の相乗作用にとってCD8+T細胞が必要であることを示す画像及びグラフである。頭蓋内CT-2A腫瘍を担持するCD-1ヌードマウスを、示された時間に、ビヒクル又は75mg/kgのLCL161(経口)及びPBS又は250μgのIgG若しくはα-PD-1(腹腔内)の組合せで処置した(i.p.;図59E)。データは、マウス生存を示すカプラン-マイヤー曲線を表す。ホルム-シダック多重比較を用いるログランク: *、p<0.05; **、p<0.01。括弧内の数は1群あたりのマウスの数を表す。 SMCと免疫チェックポイント阻害剤処置との組合せが、前炎症性サイトカインの全身的存在の増加をもたらすことを示す一連のグラフである。マウス由来血清を、示されたタンパク質の定量化のための多重ELISAのために加工した。十字は平均を示し、実線の水平線は中央値を示し、囲みは第一から第三四分位数を示し、ひげは値の最小-最大範囲を示す。統計的有意性を、ダネットの多重比較検定を用いるANOVAによって評価されるようにビヒクル及びIgG処置マウスと比較した。*、p<0.05。各処置群についてn=6。 グリア芽腫のマウスモデルにおけるSMCと免疫チェックポイント阻害剤による処置が免疫エフェクター細胞浸潤の変化をもたらすことを示すグラフである。頭蓋内CT-2A腫瘍を担持するマウスを、示された時間に、ビヒクル又は75mg/kgのLCL161で経口的に(SMC)、及び250μgのIgG又は抗PD-1で腹腔内に処置した(図61A)。マウスを、埋込み後27日目に犠牲にした。全パネル:十字は平均を示し、実線の水平線は中央値を示し、囲みは第一から第三四分位数を示し、ひげは値の最小-最大範囲を示す。統計的有意性を、ダネットの多重比較検定を用いるANOVAによって評価されるようにビヒクル及びIgG処置マウスと比較した。*、p<0.05、**、p<0.01。各処置群についてn=6。 グリア芽腫のマウスモデルにおけるSMCと免疫チェックポイント阻害剤による処置が免疫エフェクター細胞浸潤の変化をもたらすことを示すグラフである。腫瘍から単離された生きたT細胞を、以下の抗体: CD45 (PE-Cy5)、CD3 (APC)、CD4 (PE-Cy7)、CD8 (BV786)、CD25 (BV605)及びPD-1 (BV421;図61B〜図61E)を使用するフローサイトメトリーのために加工した。全パネル:十字は平均を示し、実線の水平線は中央値を示し、囲みは第一から第三四分位数を示し、ひげは値の最小-最大範囲を示す。統計的有意性を、ダネットの多重比較検定を用いるANOVAによって評価されるようにビヒクル及びIgG処置マウスと比較した。*、p<0.05、**、p<0.01。各処置群についてn=6。 グリア芽腫のマウスモデルにおけるSMCと免疫チェックポイント阻害剤による処置が免疫エフェクター細胞浸潤の変化をもたらすことを示すグラフである。腫瘍から単離された生きたT細胞を、以下の抗体: CD45 (PE-Cy5)、CD3 (APC)、CD4 (PE-Cy7)、CD8 (BV786)、CD25 (BV605)及びPD-1 (BV421;図61B〜図61E)を使用するフローサイトメトリーのために加工した。全パネル:十字は平均を示し、実線の水平線は中央値を示し、囲みは第一から第三四分位数を示し、ひげは値の最小-最大範囲を示す。統計的有意性を、ダネットの多重比較検定を用いるANOVAによって評価されるようにビヒクル及びIgG処置マウスと比較した。*、p<0.05、**、p<0.01。各処置群についてn=6。 グリア芽腫のマウスモデルにおけるSMCと免疫チェックポイント阻害剤による処置が免疫エフェクター細胞浸潤の変化をもたらすことを示すグラフである。腫瘍から単離された生きたT細胞を、以下の抗体: CD45 (PE-Cy5)、CD3 (APC)、CD4 (PE-Cy7)、CD8 (BV786)、CD25 (BV605)及びPD-1 (BV421;図61B〜図61E)を使用するフローサイトメトリーのために加工した。全パネル:十字は平均を示し、実線の水平線は中央値を示し、囲みは第一から第三四分位数を示し、ひげは値の最小-最大範囲を示す。統計的有意性を、ダネットの多重比較検定を用いるANOVAによって評価されるようにビヒクル及びIgG処置マウスと比較した。*、p<0.05、**、p<0.01。各処置群についてn=6。 グリア芽腫のマウスモデルにおけるSMCと免疫チェックポイント阻害剤による処置が免疫エフェクター細胞浸潤の変化をもたらすことを示すグラフである。腫瘍から単離された生きたT細胞を、以下の抗体: CD45 (PE-Cy5)、CD3 (APC)、CD4 (PE-Cy7)、CD8 (BV786)、CD25 (BV605)及びPD-1 (BV421;図61B〜図61E)を使用するフローサイトメトリーのために加工した。全パネル:十字は平均を示し、実線の水平線は中央値を示し、囲みは第一から第三四分位数を示し、ひげは値の最小-最大範囲を示す。統計的有意性を、ダネットの多重比較検定を用いるANOVAによって評価されるようにビヒクル及びIgG処置マウスと比較した。*、p<0.05、**、p<0.01。各処置群についてn=6。 グリア芽腫のマウスモデルにおけるSMCと免疫チェックポイント阻害剤による処置が免疫エフェクター細胞浸潤の変化をもたらすことを示すグラフである。(a)における実験に由来する生細胞を、以下の抗体: CD45 (BV605)、CD11b (APC-Cy7)、Gr1 (BV786)、F4/80 (PE)及びCD3 (APC;図61F及び図61G)を使用するフローサイトメトリーのために加工した。全パネル:十字は平均を示し、実線の水平線は中央値を示し、囲みは第一から第三四分位数を示し、ひげは値の最小-最大範囲を示す。統計的有意性を、ダネットの多重比較検定を用いるANOVAによって評価されるようにビヒクル及びIgG処置マウスと比較した。*、p<0.05、**、p<0.01。各処置群についてn=6。 グリア芽腫のマウスモデルにおけるSMCと免疫チェックポイント阻害剤による処置が免疫エフェクター細胞浸潤の変化をもたらすことを示すグラフである。(a)における実験に由来する生細胞を、以下の抗体: CD45 (BV605)、CD11b (APC-Cy7)、Gr1 (BV786)、F4/80 (PE)及びCD3 (APC;図61F及び図61G)を使用するフローサイトメトリーのために加工した。全パネル:十字は平均を示し、実線の水平線は中央値を示し、囲みは第一から第三四分位数を示し、ひげは値の最小-最大範囲を示す。統計的有意性を、ダネットの多重比較検定を用いるANOVAによって評価されるようにビヒクル及びIgG処置マウスと比較した。*、p<0.05、**、p<0.01。各処置群についてn=6。 SMCと免疫チェックポイント阻害剤との組合せが前炎症性サイトカイン応答を誘導し、効能がI型IFNシグナル伝達に依存することを示すグラフ及び画像である。脳腫瘍に由来する生細胞を単離し、以下の抗体: CD45 (BV605)、CD3 (APC-Cy7)、Cd4 (PE-Cy7)、CD8 (BV786/0)、IFN-γ(BV421)、TNF-α(PE)及びGrzB (AF647;図62A〜図62D)を使用するフローサイトメトリーのために加工した。十字は平均を示し、実線の水平線は中央値を示し、囲みは第一から第三四分位数を示し、ひげは値の最小-最大範囲を示す。統計的有意性を、ダネットの多重比較検定を用いるANOVAによって評価されるようにビヒクル及びIgG処置マウスと比較した。*、p<0.05。各処置群についてn=6。 SMCと免疫チェックポイント阻害剤との組合せが前炎症性サイトカイン応答を誘導し、効能がI型IFNシグナル伝達に依存することを示すグラフ及び画像である。脳腫瘍に由来する生細胞を単離し、以下の抗体: CD45 (BV605)、CD3 (APC-Cy7)、Cd4 (PE-Cy7)、CD8 (BV786/0)、IFN-γ(BV421)、TNF-α(PE)及びGrzB (AF647;図62A〜図62D)を使用するフローサイトメトリーのために加工した。十字は平均を示し、実線の水平線は中央値を示し、囲みは第一から第三四分位数を示し、ひげは値の最小-最大範囲を示す。統計的有意性を、ダネットの多重比較検定を用いるANOVAによって評価されるようにビヒクル及びIgG処置マウスと比較した。*、p<0.05。各処置群についてn=6。 SMCと免疫チェックポイント阻害剤との組合せが前炎症性サイトカイン応答を誘導し、効能がI型IFNシグナル伝達に依存することを示すグラフ及び画像である。脳腫瘍に由来する生細胞を単離し、以下の抗体: CD45 (BV605)、CD3 (APC-Cy7)、Cd4 (PE-Cy7)、CD8 (BV786/0)、IFN-γ(BV421)、TNF-α(PE)及びGrzB (AF647;図62A〜図62D)を使用するフローサイトメトリーのために加工した。十字は平均を示し、実線の水平線は中央値を示し、囲みは第一から第三四分位数を示し、ひげは値の最小-最大範囲を示す。統計的有意性を、ダネットの多重比較検定を用いるANOVAによって評価されるようにビヒクル及びIgG処置マウスと比較した。*、p<0.05。各処置群についてn=6。 SMCと免疫チェックポイント阻害剤との組合せが前炎症性サイトカイン応答を誘導し、効能がI型IFNシグナル伝達に依存することを示すグラフ及び画像である。脳腫瘍に由来する生細胞を単離し、以下の抗体: CD45 (BV605)、CD3 (APC-Cy7)、Cd4 (PE-Cy7)、CD8 (BV786/0)、IFN-γ(BV421)、TNF-α(PE)及びGrzB (AF647;図62A〜図62D)を使用するフローサイトメトリーのために加工した。十字は平均を示し、実線の水平線は中央値を示し、囲みは第一から第三四分位数を示し、ひげは値の最小-最大範囲を示す。統計的有意性を、ダネットの多重比較検定を用いるANOVAによって評価されるようにビヒクル及びIgG処置マウスと比較した。*、p<0.05。各処置群についてn=6。 SMCと免疫チェックポイント阻害剤との組合せが前炎症性サイトカイン応答を誘導し、効能がI型IFNシグナル伝達に依存することを示すグラフ及び画像である。マウス由来血清を、示されたタンパク質の定量化のための多重ELISAのために加工した(図62E)。データを、正規化されたスケーリングを使用してヒートマップとしてプロットする。各処置群についてn=6。 SMCと免疫チェックポイント阻害剤との組合せが前炎症性サイトカイン応答を誘導し、効能がI型IFNシグナル伝達に依存することを示すグラフ及び画像である。マウスを処置し、頭蓋内CT-2A腫瘍を、RT-qPCRによる176のサイトカイン及びケモカイン遺伝子の定量化のために加工した(図62F)。階層的クラスタリングにより同定された2つの主要な群の正規化されたヒートマップが示される。各処置群についてn=4。 SMCと免疫チェックポイント阻害剤との組合せが前炎症性サイトカイン応答を誘導し、効能がI型IFNシグナル伝達に依存することを示すグラフ及び画像である。頭蓋内CT-2A腫瘍を担持するマウスを、示された埋込み後の日数で、ビヒクル若しくは75mg/kgのLCL161(経口)で、又は関連するアイソタイプIgG対照若しくは2.5mgのα-IFNAR1、350μgのα-IFN-γ若しくは250μgのα-PD-1で腹腔内に処置した(図62G)。有意性を、ダネットの多重比較検定を用いるANOVAによって評価されるようにビヒクル及びIgG処置マウスと比較した。*、p<0.05。括弧内の数は処置群のサイズを示す。 前炎症性サイトカイン及び化学誘引物質であるケモカイン遺伝子シグナチャーが、SMCと免疫チェックポイント阻害剤との組合せ処置によって上方調節されることを示す画像である。頭蓋内CT-2A腫瘍を、RT-qPCRによる176のサイトカイン及びケモカイン遺伝子の定量化のために加工した。階層的クラスタリングにより同定された主要な群の正規化されたヒートマップが示される。各処置群についてn=4。 SMCがグリア芽腫標的細胞の存在下でCD8+T細胞のクローン性増殖を増強することを示す一連のグラフである。CT-2A腫瘍が以前に治癒したマウスに由来する単離された脾臓CD8+T細胞を、CFSEに充填し、ビヒクル若しくは5μMのLCL161(SMC)又は20μg/mLの対照IgG若しくは抗PD-1の存在下で、CT-2A細胞(10:1比)と共に96時間同時インキュベートした。生細胞をフローサイトメトリーのために加工した。有意性を、ダネットの多重比較検定を用いるANOVAによって評価されるようにビヒクル及びIgG処置マウスと比較した。*、p<0.05; **、p<0.01; ***、p<0.001。各処置群についてn=5。 前炎症性サイトカインTNF-αが、Smac模倣物質と免疫チェックポイント阻害剤との処置の際にグリア芽腫細胞のT細胞媒介性細胞死にとって必要であることを示すグラフ及び画像である。頭蓋内CT-2A腫瘍が以前に治癒したマウスに由来する脾臓及びリンパ節に由来する単離されたCD8 T細胞を、ビヒクル又は5μMのLCL161及び20μg/mLのアイソタイプ一致したIgG又はα-PD-1の存在下で24時間、CT-2A細胞と同時培養した。生きたT細胞を、以下の抗体: CD3 (APC-Cy7)、CD8 (BV711)、GrzB (AF647)及びTNF-α(PE;図65A)を使用するフローサイトメトリーのために加工した。十字は平均を示し、実線の水平線は中央値を示し、囲みは第一から第三四分位数を示し、ひげは値の最小-最大範囲を示す。有意性を、ダネットの多重比較検定を用いるANOVAによって評価されるようにビヒクル及びIgG処置マウスと比較した。*、p<0.05;**、p<0.01; ***、p<0.001。各処置群についてn=5。 前炎症性サイトカインTNF-αが、Smac模倣物質と免疫チェックポイント阻害剤との処置の際にグリア芽腫細胞のT細胞媒介性細胞死にとって必要であることを示すグラフ及び画像である。CD8+T細胞を、ビヒクル又は5μMのLCL161及び20μg/mLの対照IgG、α-PD-1又はα-TNF-αの存在下で72時間、mKate2タグ付きCT-2A細胞(CT-2A-mKate2)と同時培養した(図65B)。mKate2陽性細胞の計数を、Incucyte Zoomソフトウェアを使用して獲得した。十字は平均を示し、実線の水平線は中央値を示し、囲みは第一から第三四分位数を示し、ひげは値の最小-最大範囲を示す。有意性を、ダネットの多重比較検定を用いるANOVAによって評価されるようにビヒクル及びIgG処置マウスと比較した。p<0.01; ***、p<0.001。各処置群についてn=5。スケールバー、100μm。 前炎症性サイトカインTNF-αが、Smac模倣物質と免疫チェックポイント阻害剤との処置の際にグリア芽腫細胞のT細胞媒介性細胞死にとって必要であることを示すグラフ及び画像である。頭蓋内CT-2A腫瘍を担持するマウスを、示された埋込み後の日数で、ビヒクル又は75mg/kgのLCL161(経口)で、又は関連するアイソタイプIgG対照若しくは500μgのα-TNF-α若しくは250μgのα-PD-1で腹腔内に処置した(図65C)。有意性を、ダネットの多重比較検定を用いるANOVAによって評価されるようにビヒクル及びIgG処置マウスと比較した。**、p<0.01。括弧内の数は1群あたりのマウスの数を表す。 SMCが、腫瘍及び免疫細胞に対して作用して、先天性免疫系及び適応免疫系を介してがんを根絶する免疫調節薬であることを示す略図である。本発明者らの結果に基づくSmac模倣物質の単剤及び組合せの免疫調節効果を示すモデルが示される。これらの免疫細胞又は腫瘍細胞に対するIAP拮抗作用の効果を、以下に概略する:(1)SMCは、マクロファージ又はT細胞等の様々な免疫細胞からのサイトカイン及びケモカインの産生を刺激し、腫瘍微小環境内への免疫細胞の浸潤をもたらす。(2)SMC処置は、免疫抑制性マクロファージM2集団を減少させ、同時に、前炎症性M1集団を増加させる。(3)SMCは、cIAP1及びcIAP2を枯渇させて、TNF-α又はTRAIL1等の免疫リガンドによる細胞死に対して腫瘍を感作する。腫瘍細胞死は、細胞傷害性T細胞(CTL)応答のプライミングをもたらす免疫系によって感知される。(4)SMCは、抗原提示細胞(APC)上のTNF/TNFRファミリーメンバーCD40L/CD40シグナル伝達経路を刺激して、樹状細胞(DC)及びマクロファージの分化及び成熟を促進する。APCは、腫瘍抗原を免疫系に対して提示し、細胞傷害性炎症性サイトカインを更に放出する。(5)SMC処置によるcIAP1及びcIAP2の分解の結果として、SMCは、代替NF-κB経路を活性化し、TNFスーパーファミリーリガンド(4-1BB等)の必要性を除去し、したがって、T細胞共刺激シグナルを提供する。(6)SMCは、CTL及びナチュラルキラー細胞により媒介される細胞死を増加させることが示されている。グランザイムBにより媒介される細胞死は、X結合IAP、XIAPによって遮断され、この遮断は、Smacのミトコンドリア放出によって、又はその薬物模倣体であるSMC13-15によって克服され得る。 SMCと免疫チェックポイント阻害剤(ICI)との相乗作用に関する協調的及び相補的機構を示す略図である。(1)PD-1/PD-L1軸を遮断する治療組換え抗体の存在は、主要組織適合複合体I(MHC-I)分子を介するがん細胞によって提示されるその関連抗原を用いるCD8+T細胞のT細胞受容体(TCR)のシグナル伝達を可能にする。SMC処置によるIAPの同時的枯渇は、おそらく、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー(TNFRSF)共刺激応答(4-1BB又はOX40活性化と同様)を提供することによって、T細胞活性化を増強することができ、腫瘍特異的CD8+T細胞の活性化及び増殖の増強をもたらす。結果として、グランザイムB(GrzB)及びパーフォリン(Pfn)が分泌され、標的細胞を殺傷する。(2)casp-3阻害剤であるXIAPのSMC媒介性拮抗作用は、GrzBによる腫瘍細胞の細胞死の増強をもたらすことができる。(3)SMCによるcIAP1及びcIAP2の枯渇は、腫瘍微小環境においてT細胞によるTNF-αの局所産生の増加をもたらし、これは、おそらく代替ND-κB経路の活性化によって媒介される効果である。(4)cIAP1/2喪失の結果として、SMC処置されたがん細胞は、TNF-α等の前炎症性サイトカインの存在下で細胞死誘導に対して感作される。 完全長ウェスタンブロットを示す画像である。 完全長ウェスタンブロットを示す画像である。 完全長ウェスタンブロットを示す画像である。 完全長ウェスタンブロットを示す画像である。
本発明は、がんの処置におけるSmac模倣化合物(SMC)の効能を増強するための方法及び組成物を含む。特に、本発明は、SMCと、cIAP1及び/又はcIAP2によって阻害される1つ又は複数の細胞死経路を刺激する第2の薬剤とを含む組合せ療法のための方法及び組成物を含む。第2の薬剤は、例えば、TLRアゴニスト、腫瘍溶解性ウイルス等のウイルス、又はインターフェロン又は関連する薬剤であってもよい。
本明細書に提供されるデータは、薬剤とSMCとを用いる処置が、in vivoで腫瘍退縮及び永続的な治癒をもたらすことを証明する(例えば、実施例1を参照されたい)。これらの組合せ療法は、マウスによって良好に寛容され、体重は、療法の停止後すぐに処置前のレベルに戻る。試験した組合せ療法は、がんのいくつかの処置不応性の侵攻性マウスモデルを処置することができた。当業者であれば、本明細書に提供される開示及びデータに基づいて、様々なSMCのいずれか1つ又は複数と、TLRアゴニスト、病原体、又は病原体模倣物質等の様々な薬剤のいずれか1つ又は複数とを、本発明の1つ又は複数の実施形態において組み合わせて、アポトーシスを促進し、がんを処置することができることを認識できる。
SMC療法を改善するための他の手法が試みられてきたが、特に、侵攻性免疫応答性モデル系において、完全な応答が観察されたのは非常に稀であった。病原体模倣物質、例えば、TRAILに部分的に依存する作用機構を有する病原体模倣物質を用いるがんの処置を含む、本発明の一部の実施形態は、ある特定の利点を有し得る。第1に、この手法は、TNFα媒介性アポトーシス及びネクロトーシスを誘発することができる:一部の進行がんの可塑性及び不均一性を考慮すると、複数の異なる細胞死機構を同時に誘導する処置は、そうしないものよりも高い効能を有し得る。第2に、病原体模倣物質は、負のフィードバックの層を含む、統合された先天性免疫応答を惹起することができる。これらのフィードバック機構は、組換えタンパク質を使用して複製するのが難しい様式でサイトカイン応答を和らげるように作用し、かくして、この組合せ療法戦略に対するセーフガードとして作用することができる。
多発性骨髄腫(MM)は、骨髄中の形質細胞の急速な増殖を特徴とする不治のがんである。MMは、2番目に最も一般的な血液悪性腫瘍であり、その中央生存期間は、診断後わずか3〜5年である。MM細胞は、骨髄コンパートメントに居住するため、骨折及び免疫抑制をもたらす骨吸収を引き起こす。MM細胞は他の組織に播種して、形質細胞腫を形成し、この疾患は侵攻性白血病相を有し得る。現在の療法は、生存を延長し、症状を軽減することができるが、それらは治癒的処置ではない。処置耐性及び不可避の再発と戦うために、新規療法が是非とも必要である。
悪性細胞は、疾患の初期段階においては骨髄微小環境に、特に、骨髄微小環境内の細胞に由来するTNF-α及びインターロイキン-6(IL-6)に依存する。疾患が進行するにつれて、細胞はその環境に依存しなくなくなり、TNFαの高い自己分泌産生で生き延びる。全ての段階を通して、細胞は、部分的には、経路の重要な成分における共通の突然変異のため、その生存を増強する高レベルのNF-κBシグナル伝達を有する。MMにおけるNF-κB経路の標的化は、プロテアソーム阻害剤であるボルテゾミブ、免疫調節剤(IMiD)であるサリドマイド及びレナリドミド並びに合成糖質コルチコイドであるデキサメタゾン等の、MMにおいて使用される多くの標準的な治療剤の効能の増大に寄与する。
TNFα媒介性NF-κBシグナル伝達を、アポトーシスの細胞性阻害因子(cIAP)の除去により、生存促進シグナルからアポトーシスシグナルにスイッチすることができる;このプロセスは、がん細胞に対して選択的であると考えられる。cIAP1及びcIAP2は、TNFα受容体スーパーファミリーの全メンバーにおいてE3リガーゼとして互換的に作用し、特定のタンパク質をユビキチン化して、シグナル伝達複合体のための足場を形成するか、又は分解のためにそれらを標的化する。この例は、NF-κB経路の両アームに見ることができる:RIP1は、K63結合によってユビキチン化され、古典的経路の活性化にとって必要である足場シグナル伝達複合体を形成するが、NIKは、分解のためにそれを標的化するK48結合したユビキチン化を受容し、代替経路を不活性のまま保持する(図35)。SMCは、固有のアポトーシス経路の活性化に関与する、内因性Smacタンパク質を模倣する新しいクラスの抗がん治療剤である。Smacペプチド及びSMCは、cIAPのBIRドメインに結合し、それらが自己ユビキチン化するのを引き起こし、プロテアソーム分解のためにそれらを標的化する。RIP1が最早ユビキチン化されない場合、それはリポプトソームを自由に形成するようになり、カスパーゼカスケード及び細胞死を開始する。
SMCは、多くのがん系列においてTNFαと強力に相乗作用して、NF-κB媒介性アポトーシスを誘導することが示されている。SMCはまた、TLRアゴニスト又は腫瘍溶解性ウイルスによって誘導され得る、IFN等の他の炎症性サイトカインと共に、相乗的ながん細胞殺傷を有する。SMCは更に、MMのために使用される治療剤を標準化して、がん細胞のアポトーシスを増強することができる。MM並びに他のがんにおいて化学療法剤と共にSMCの効能を評価するために現在行われているいくつかの臨床試験により、高い治療能力が示されている。
免疫系の活性化は、サイトカイン産生を増加させ、SMC媒介性MM細胞殺傷にとって有利である。しかしながら、このサイトカイン産生は、MM細胞に対して望ましくない結果を有し得る。IFN及びTLRアゴニスト等の、多くの先天性免疫刺激剤は、免疫チェックポイントPD-1のリガンドを上方調節することが示されている。PD-1は、T細胞及びNK細胞の表面上に発現される。PD-1がそのリガンドであるPD-L1及びPD-L2に結合する場合、それはT細胞受容体のための共刺激シグナルとして作用して、T細胞の細胞傷害能力を抑制する。PD-L1は多くの組織において低レベルで構成的に発現され、おそらく自己免疫反応を防止するために、上方調節することができる。しかしながら、PD-L1はがん細胞上で上方調節され、適応免疫系による検出を回避する細胞をもたらす。特に、PD-L1を、IFNγ及びLPS等のTLRアゴニストに応答してMMにおいて上方調節することができる。PD-L2は、PD-L1と比較してはるかにより選択的な発現を有する。それはB細胞のサブセット中に存在し、強力なNF-κB又はSTAT6シグナル伝達に応答して選択細胞上で上方調節される。
SMCはまた、in vitroとin vivoの両方においてSMC処置されたマウスのT細胞の機能、例えば、SMCへの曝露後にマウス脾臓から抽出された活性化T細胞の増殖の増加、サイトカイン産生の増加、並びにNKT及びNK細胞からのより高いサイトカイン産生に影響することもできる。更に、SMCで処置されたマウスは、抗原刺激時のT細胞に対する過剰応答を示す。したがって、SMCに基づく組合せ療法は、MM細胞のアポトーシスを増加させるだけでなく、選択的適応応答も刺激することができる。SMCと、先天性免疫刺激剤又は免疫チェックポイント阻害剤(ICI)との組合せは、MM細胞が受容する強力な生存促進シグナルに打ち勝つための最良の手段であり得る。
がん細胞は、健康な細胞が細胞死誘導シグナルに対して耐性にするために使用する多くの生存促進戦略を操作することができる。MM細胞は具体的には、アポトーシス刺激に対して耐性にする形質細胞中で使用される構成的NF-κBシグナル伝達を更に増幅することができる。これは、IL-6及びTNFα等の生存促進性NF-κB標的遺伝子の発現の増加によって達成される。更に、MM細胞は、おそらく炎症環境及び細胞傷害環境から細胞を保護するために使用される、チェックポイント阻害剤の発現を増強することができる;これは、それらがT細胞及びNK細胞による検出を回避するのを助ける。MMにおけるアポトーシス耐性と免疫回避の両方の標的化は、この疾患における処置耐性の主要な側面のうちの2つを克服する能力を有する。
PD-1遮断は、同系マウスMMモデルを使用して示されるように、MM疾患進行の遅延及びマウスの生存時間の改善において有意に有効である。PD-1に対するモノクローナル抗体の使用は、免疫チェックポイント遮断のための代替手段と比較していくつかの利点を有する。第1に、それは両方のPD-1リガンドであるPD-L1及びPD-L2の結合を遮断することができる。多くのがんは、インターフェロン処置に応答してPD-L1を上方調節することができ、PD-1/PD-L1は、処置後のMM患者において上方調節される。更に、非特異的抗体を分泌する、B1細胞と呼ばれる未熟B細胞のサブセットは、PD-L2の高い発現を示した。更に、PD-L2発現は、NF-κB及びSTAT6活性化等のある特定の刺激に応答して増加することができ、MM細胞上での両リガンドの発現レベルを検査する重要性を証明する。ヒトMM細胞は、両PD-1リガンドを上方調節することができ、それらを固形がんと比較して独特のものにする。これは、PD-L1のみを標的とするモノクローナル抗体療法(Bristol-Myers Squibb社のBMS-936559/MDX-1105、Genentech社のMPDL3280A、MedImmune社のMEDI473、及びEMD Serono社のアベルマブ)は、PD-1を標的とする処置(Bristol-Myers Squibb社のニボルマブ、Merck社のペンブロリズマブ、及びCuretech社のピジリズマブ)よりもあまり有効ではないが、それは、MMにおいて抗PD-1抗体を使用する価値を示す。
第2に、PD-1標的手法は、抗CTLA-4等の他のICIと比較して、がんに対するよりロバストな応答を有する可能性を有する。活性の差異は、T細胞調節におけるこれらの分子の特定の役割に起因するものであり得る。PD-1は、CD8+T細胞上に見出されることが多く、そのリガンドとの遭遇は、TCRシグナル伝達によって活性化される細胞傷害応答を阻害する。対照的に、CTLA-4は、調節性T細胞上の二次リンパ系組織におけるより顕著な役割を有する。CTLA-4の、その受容体であるCD28との遭遇は、CD28のための活性化リガンドを打ち負かし、更には下方調節し、T細胞の二次クローン性増殖を鈍らせる。実施例3における抗CTLA-4処置の効能の欠如は、二次リンパ系臓器へのMMの侵入を示すことが全体として可能である。これは、胚中心内で比例して低いCD4+T細胞集団、又は阻害される二次リンパ系臓器へのT細胞浸潤によって抗CTLA-4の効能を損ない得る。髄外MMにおいては、細胞は、実施例3で考察されるMMマウスモデルの後期段階において見られることが多い、脾臓及びリンパ節において形質細胞腫を形成することができる。したがって、胚中心は、MPC-11細胞によって損なわれることが明らかである。
SMC
本発明のSMCは、cIAP1、cIAP2及び/又はXIAP、並びに、場合により、1つ又は複数の更なる内因性Smac活性を阻害することができる、又は阻害することができると予測される、任意の低分子、化合物、ポリペプチド、タンパク質、又はその任意の複合体であってもよい。本発明のSMCは、限定されるものではないが、cIAP1の阻害及びcIAP2の阻害等の、内因性Smacの1つ又は複数の活性を模倣することによって、アポトーシスを促進することができる。内因性Smac活性は、例えば、特定のタンパク質との相互作用、特定のタンパク質の機能の阻害、又は特定のIAPの阻害であってもよい。特定の実施形態では、SMCは、cIAP1とcIAP2との両方を阻害する。一部の実施形態では、SMCは、cIAP1及びcIAP2に加えて、XIAP又はLivin/ML-IAP、単一のBIRを含有するIAP等の1つ又は複数の他のIAPも阻害する。特定の実施形態では、SMCは、cIAP1、cIAP2、及びXIAPを阻害する。SMCと免疫刺激剤とを含む任意の実施形態では、特定の活性を有するSMCを、1つ又は複数の特定の免疫刺激剤との組合せのために選択することができる。本発明の任意の実施形態では、SMCは、Smacが行うことができない活性を行うことができる。一部の例では、これらの更なる活性は、本発明の方法又は組成物の効能に寄与することができる。
SMCを用いる処置は、例えば、自己ユビキチン化又はトランスユビキチン化及びプロテアソーム媒介性分解の誘導により、cIAP1及びcIAP2の細胞を枯渇させることができる。SMCはまた、カスパーゼのXIAPによる阻害を抑制することもできる。SMCは主として、cIAP1及び2を標的化することにより、また、TNFα、及び例えば、がん細胞のために、他のサイトカイン又は細胞死リガンドを、生存シグナルから細胞死シグナルに変換することにより機能することができる。
ある特定のSMCは、少なくともXIAP及びcIAPを阻害する。そのような「パン-IAP」SMCは、プログラム細胞死阻害の複数の異なる未だ相互に関係する段階で介在し得る。この特徴は、複数の細胞死経路がそのようなSMCによって影響され、SMCが介在し得る様々なアポトーシス経路を活性化する元々存在する、及び新たに発生するがん治療剤との相乗作用を可能にするため、がんが、パン-IAP SMCを用いる処置に対する耐性を生じる機会を最小化する。
TNFα、TRAIL、及びIL-1β等の、1つ又は複数の炎症性サイトカイン又は細胞死リガンドは、多くの腫瘍由来細胞株においてSMC療法と強力に相乗作用する。特に、組換えサイトカイン療法と共通して関連する毒性を制限する手法を使用して、SMC処置された腫瘍において細胞死リガンド濃度を増加させるための戦略は、かくして非常に魅力的である。TNFα、TRAIL、及び多くの他のサイトカイン及びケモカインを、対象の先天性免疫系による病原体認識に応答して上方調節することができる。重要なことは、微生物病原体に対するこの古代的な応答が、その活性の強度及び持続期間を制限する厳密な負の調節のため、通常は対象にとって自己制限的であり、安全であることである。
SMCは、Smacに基づいて合理的に設計することができる。内因性Smacの1つ又は複数の機能又は活性を模倣することによってアポトーシスを促進する化合物の能力を、内因性Smac又は既知のSMCとの類似性に基づいて予測することができる。SMCは、化合物、ポリペプチド、タンパク質、又は2つ以上の化合物、ポリペプチド、若しくはタンパク質の複合体であってもよい。
一部の例では、SMCは、SmacポリペプチドのN末端テトラペプチド配列(プロセシング後に示される)に基づく低分子IAPアンタゴニストである。一部の例では、SMCは、単量体(一価)又は二量体(二価)である。特定の例では、SMCは、カスパーゼの第2のミトコンドリア活性化因子であるSmac/DIABLO、又は他の類似するIBM(例えば、casp9のような他のタンパク質に由来するIAP結合モチーフ)に由来するAVPIのテトラペプチド配列を模倣する1つ又は2つの部分を含む。本発明のSMC二量体は、ホモ二量体又はヘテロ二量体であってもよい。ある特定の実施形態では、二量体サブユニットは、様々なリンカーによって係留される。リンカーは、いずれかのサブユニットの同じ規定のスポット中にあってもよいが、異なる固定点(「aa」位置P1、P2、P3又はP4であってもよく、時にはP5基も利用可能である)に位置してもよい。様々な配置で、二量体サブユニットは、異なる向きにあってもよく、例えば、頭部から尾部、頭部から頭部、又は尾部から尾部の向きにあってもよい。ヘテロ二量体は、異なるBIRドメイン又は異なるIAPに対する異なる親和性を有する2つの異なる単量体を含んでもよい。或いは、ヘテロ二量体は、Smac単量体と、IAPではない別の受容体又は標的のためのリガンドとを含んでもよい。一部の例では、SMCは環状であってもよい。一部の例では、SMCは、三量体又は多量体であってもよい。多量体化したSMCは、1つ又は複数の対応する単量体と比較して10、20、30、40、50、100、200、1,000、5,000、7,000倍以上(例えば、in vitroでEC50によって測定される)等の、7,000倍以上の活性の倍数増加を示してもよい。一部の例では、例えば、係留がIAP間のユビキチン化を増強するため、又は二重BIR結合が相互作用の安定性を増強するため、これが起こり得る。二量体等の多量体は活性の増加を示し得るが、一部の実施形態では単量体が好ましい。例えば、一部の例では、例えば、バイオアベイラビリティと関連する理由のため、低分子量SMCが好ましい。
本発明の一部の例では、cIAP1/2を阻害することができる薬剤は、ベスタチン又はMe-ベスタチン類似体である。ベスタチン又はMe-ベスタチン類似体は、cIAP1/2の自己ユビキチン化を誘導し、Smacの生物学的活性を模倣することができる。
本発明のある特定の実施形態では、SMC組合せ処置は、1つ又は複数のSMCと、1型インターフェロン剤、2型インターフェロン剤、及び3型インターフェロン剤等の、1つ又は複数のインターフェロン剤とを含む。インターフェロン剤を含む組合せ処置は、多発性骨髄腫等のがんの処置において有用であり得る。
一部の実施形態では、IFNを発現する、場合により、ナトリウム-ヨウ素共輸送体であるNIS等の、イメージングを可能にする遺伝子を発現するVSVが、SMCと組み合わせて使用される。例えば、そのようなVSVを、Ascentage社のSmac模倣物質SM-1387/APG-1387、Novartis社のSmac模倣物質LCL161、又はビリナパント等の、SMCと組み合わせて使用することができる。そのような組合せは、肝細胞癌又は肝臓転移等の、がんの処置において有用であり得る。
様々なSMCが当業界で公知である。SMCの非限定例を、Table 1(表1)に提供する。Table 1(表1)は、様々なSMCが機能し得る提唱される機構を含むが、本発明の方法及び組成物は、これらの機構によって、又はそれに限定されない。
薬剤
本発明の免疫刺激剤又は免疫調節剤は、対象の1つ又は複数の細胞中でcIAP1及びcIAP2によって阻害される受容体媒介性アポトーシスプログラムを誘導することができる任意の薬剤であってもよい。本発明の免疫刺激剤は、cIAP1(BIRC2)、cIAP2(BIRC3又はAPI2)、及び場合により、1つ又は複数の更なるIAP、例えば、1つ又は複数のヒトIAPタンパク質NAIP(BIRC1)、XIAP(BIRC4)、スルビビン(BIRC5)、アポロン/ブルース(BIRC6)、ML-IAP(BIRC7又はリビン)、及びILP-2(BIRC8)によって調節されるアポトーシスプログラムを誘導してもよい。CpG又はIAPアンタゴニスト等の、様々な免疫調節剤が、免疫細胞の状況を変化させることができることが更に公知である。
一部の例では、免疫刺激剤は、TLRリガンド等のTLRアゴニストであってもよい。本発明のTLRアゴニストは、ヒトにおけるTLR-1、TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-6、TLR-7、TLR-8、TLR-9、及びTLR-10のうちの1つ若しくは複数、又は他の種における関連タンパク質(例えば、マウスTLR-1〜TLR-9及びTLR-11〜TLR-13)のアゴニストであってもよい。TLRは、専ら微生物病原体によって発現される病原体関連微生物パターン(PAMP)、並びに壊死細胞又は死につつある細胞から放出される内因性分子である危険関連分子パターン(DAMP)として知られる高度に保存された構造モチーフを認識することができる。PAMPは、リポ多糖(LPS)、ペプチドグリカン(PGN)、及びリポペプチド等の様々な細菌細胞壁成分、並びに、フラゲリン、細菌DNA、及びウイルス二本鎖RNAを含む。DAMPは、ヒートショックタンパク質等の細胞内タンパク質並びに細胞外マトリックスに由来するタンパク質断片を含む。本発明のアゴニストは、例えば、クラスA、B、及びC CpG ODN等のCpGオリゴデオキシヌクレオチド(CpG ODN)、塩基類似体、dsRNA若しくは病原体DNA等の核酸、又は病原体若しくは病原体様細胞若しくはビリオンを更に含む。ある特定の実施形態では、薬剤は、ウイルス若しくは細菌を模倣する薬剤であるか、又は合成TLRアゴニストである。
様々なTLRアゴニストが、当業界で公知である。TLRアゴニストの非限定例を、Table 2(表2)に提供する。Table 2(表2)は、様々なTLRアゴニストが機能し得る、提唱される機構、使用、又はTLR標的を含むが、本発明の方法及び組成物は、これらの機構、使用、又は標的によって、又はそれらに限定されない。
他の例では、免疫刺激剤は、ウイルス、例えば、腫瘍溶解性ウイルスであってもよい。腫瘍溶解性ウイルスは、がん細胞に選択的に感染する、複製する、及び/又は選択的に殺傷するウイルスである。本発明のウイルスとしては、限定されるものではないが、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、パルボウイルス、ポリオウイルス、レオウイルス、セネカバレーウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、水疱性口内炎ウイルス、レンチウイルス、ラブドウイルス、シンドビスウイルス、コクサッキーウイルス、ポックスウイルス、その他が挙げられる。本発明の特定の実施形態では、薬剤は、ラブドウイルス、例えば、VSVである。ラブドウイルスは、高いIFN産生と共に迅速に複製することができる。他の特定の実施形態では、薬剤は、MG1二重突然変異を有する、Marabaウイルス、Farmingtonウイルス、Carajasウイルス等の野生ウイルスである。本発明のウイルス剤は、ウイルス変異体(例えば、Matrix、又はMタンパク質中にΔ51突然変異を有するVSV)、トランスジーン改変ウイルス(例えば、VSV-hIFNβ)、TNFα、LTα/TNFβ、TRAIL、FasL、TL1αを担持するウイルス、キメラウイルス(例えば、ラビ)、又は偽型化ウイルス(例えば、LCMV若しくは他のウイルスに由来するGタンパク質で偽型化されたウイルス)を含む。一部の例では、本発明のウイルスを、神経毒性を軽減するように選択する。一般的なウイルス、特に、腫瘍溶解性ウイルスは、当業界で公知である。
ある特定の実施形態では、薬剤は、死滅VSV NRRP粒子又はプライムブースト腫瘍ワクチンである。NRRPは、最早複製も拡散もできないが、腫瘍溶解特性及び免疫刺激特性を保持する感染性ベクターを産生するように改変された野生型VSVである。NRRPを、ガンマ照射、UV、又はブスルファンを使用して産生することができる。特定の組合せ療法は、アデノ-MAGE3(メラノーマ抗原)及び/又はMaraba-MG1-MAGE3を用いるプライムブーストを含む。他の特定の組合せ療法は、UVにより死滅させた、又はガンマ照射によって死滅させた野生型VSV NRRPを含む。NRRPは低い神経毒性を示すか、又は神経毒性を示さない。NRRPは、例えば、神経膠腫、血液(液体)腫瘍、又は多発性骨髄腫の処置において有用であり得る。
一部の例では、本発明の薬剤は、ワクチン株、弱毒化ウイルス若しくは微生物、又は死滅ウイルス若しくは微生物である。一部の例では、薬剤は、例えば、BCG、生きた、若しくは死んだラビワクチン、又はインフルエンザワクチンであってもよい。
本発明のウイルス、例えば、腫瘍溶解性ウイルスの非限定例を、Table 3(表3)に提供する。Table 3(表3)は、提供されるウイルスの提唱される機構又は使用を含むが、本発明の方法及び組成物は、これらの機構又は使用によって、又はそれらに限定されない。
がん
本発明の方法及び組成物を使用して、様々ながん型を処置することができる。当業者であれば、全てのがんではないとしても多くの細胞が受容体媒介性アポトーシスを行うことができるため、本発明の方法及び組成物は全てではないとしても多くのがんに広く適用可能であることを理解できる。本発明の組合せ手法は、様々な侵攻性の処置不応性腫瘍モデルにおいて有効である。特定の実施形態では、例えば、本発明の方法によって処置されるがんは、副腎がん、基底細胞癌、胆道がん、膀胱がん、骨肉腫、脳腫瘍及び他の中枢神経系(CNS)のがん、乳がん、子宮頸がん、絨毛癌、結腸がん、結腸直腸がん、結合組織がん、消化器系のがん、子宮内膜がん、上咽頭がん、食道がん、眼がん、胆嚢がん、胃がん、頭頸部がん、肝細胞癌、上皮内新生物、腎臓がん、喉頭がん、白血病、肝臓がん、肝臓転移、肺がん、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、メラノーマ、骨髄腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、中皮腫、神経膠腫、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、口腔がん(例えば、唇、舌、口、及び咽頭)、卵巣がん、小児がん、膵がん、膵内分泌腫瘍、陰茎がん、形質細胞腫瘍、下垂体腺腫、前立腺がん、腎細胞癌、呼吸器系のがん、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、皮膚がん、小腸がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、尿管がん、泌尿器系のがん、並びに他の癌腫及び肉腫であってもよい。他のがんは、当業界で公知である。
がんは、SMCのみによる処置に対して不応性であるがんであってよい。本発明の方法及び組成物は、SMCのみによる処置に対して不応性であるがんにおいて特に有用であってよい。典型的には、SMCのみを用いる処置に対して不応性であるがんは、IAP媒介性アポトーシス経路が有意に誘導されないがんであってよい。特定の実施形態では、本発明のがんは、1つ又は複数のアポトーシス経路が有意に誘導されない、すなわち、SMCのみによる処置ががんを効率的に処置するのに十分であるような様式で活性化されないがんである。例えば、本発明のがんは、cIAP1/2媒介性アポトーシス経路が有意に誘導されないがんであってもよい。
本発明のがんは、1つ又は複数の薬剤による処置に対して不応性のがんであってよい。特定の実施形態では、本発明のがんは、1つ又は複数の薬剤(SMCがない)による処置に対して不応性であり、また、1つ又は複数のSMC(薬剤がない)による処置に対して不応性であるがんであってもよい。
製剤及び投与
一部の例では、裸の、すなわち、天然形態のSMC及び/又は薬剤の送達は、アポトーシスを促進する、及び/又はがんを処置するのに十分なものであってもよい。塩、エステル、アミド、プロドラッグ又は誘導体が好適には、薬理学的に有効である、例えば、アポトーシスを促進する、及び/又はがんを処置することができるという条件で、SMC及び/又は薬剤を、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、誘導体等の形態で投与することができる。
SMC又は薬剤の塩、エステル、アミド、プロドラッグ及び他の誘導体を、合成有機化学の当業界で公知の標準的な手順を使用して調製することができる。例えば、SMC及び/又は薬剤の酸塩を、典型的には、好適な酸との反応を含む従来の方法を使用して、遊離塩基形態のSMC又は薬剤から調製することができる。一般的には、塩基形態のSMC又は薬剤を、メタノール又はエタノール等の極性有機溶媒に溶解し、酸をそれに添加する。得られる塩は沈降するか、又は極性の低い溶媒の添加によって溶液から取り出すことができる。酸付加塩を調製するための好適な酸としては、限定されるものではないが、有機酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、サリチル酸等、並びに無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の両方が挙げられる。
酸付加塩を、好適な塩基を用いる処理によって遊離塩基に変換することができる。SMC及び/又は薬剤のある特定の典型的な酸付加塩、例えば、ハロゲン化物塩等を、塩酸又は臭化水素酸を使用して調製することができる。逆に、本発明のSMC及び/又は薬剤の塩基性塩の調製を、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、トリメチルアミン等の薬学的に許容される塩基を使用して同様の様式で調製することができる。ある特定の塩基性塩としては、限定されるものではないが、アルカリ金属塩、例えば、ナトリウム塩、及び銅塩が挙げられる。
エステルの調製は、例えば、SMC及び/又は薬剤の分子構造内に存在するヒドロキシル及び/又はカルボキシル基の官能化を含んでもよい。ある特定の実施形態では、エステルは、遊離アルコール基、すなわち、式RCOOH(式中、Rはアルキルであり、好ましくは低級アルキルである)のカルボン酸に由来する部分のアシル置換誘導体である。必要に応じて、従来の水素化分解又は加水分解手順を使用することにより、エステルを遊離酸に再変換することができる。
アミドを、当業界で公知の技術を使用して調製することもできる。例えば、アミドを、好適なアミン反応物を使用してエステルから調製するか、又はアンモニア若しくは低級アルキルアミンとの反応により無水物若しくは酸塩化物から調製することができる。
本発明のSMC又は薬剤を、薬学的に許容される担体(賦形剤)と組み合わせて、医薬組成物を形成させることができる。薬学的に許容される担体は、例えば、組成物を安定化する、SMC若しくは薬剤の吸収を増加させる、若しくは減少させる、又は血液脳関門の透過を改善する(必要に応じて)ように作用する、1つ又は複数の生理的に許容される化合物を含有してもよい。生理的に許容される化合物は、例えば、炭水化物(例えば、グルコース、スクロース、若しくはデキストラン)、酸化防止剤(例えば、アスコルビン酸若しくはグルタチオン)、キレート剤、低分子量タンパク質、保護及び取込み増強剤(例えば、脂質)、活性薬剤のクリアランス若しくは加水分解を減少させる組成物、又は賦形剤若しくは他の安定剤及び/若しくはバッファーを含んでもよい。特に、錠剤、カプセル、ゲルキャップ等の調製において有用な他の生理的に許容される化合物としては、限定されるものではないが、結合剤、希釈剤/充填剤、崩壊剤、潤滑剤、懸濁剤等が挙げられる。ある特定の実施形態では、医薬製剤は、SMC又は薬剤の送達又は効能を増強することができる。
様々な実施形態では、本発明のSMC又は薬剤を、非経口、局所、経口、経鼻(又はそうでなければ吸入)、直腸、又は局部投与のために調製することができる。投与は、例えば、経皮的に、予防的に、又はエアロゾルにより行うことができる。
本発明の医薬組成物を、投与方法に応じて、様々な単位剤形で投与することができる。好適な単位剤形としては、限定されるものではないが、粉末、錠剤、ピル、カプセル、ロゼンジ剤、坐剤、パッチ剤、鼻スプレー、注射剤、埋込み可能な持続放出製剤、及び脂質複合体が挙げられる。
ある特定の実施形態では、賦形剤(例えば、ラクトース、スクロース、デンプン、マンニトール等)、場合により崩壊剤(例えば、炭酸カルシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスポビドン等)、結合剤(例えば、アルファデンプン、アラビアゴム、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、シクロデキストリン等)、又は場合により潤滑剤(例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール6000等)を、SMC又は薬剤に添加し、得られる組成物を圧縮して、経口剤形(例えば、錠剤)を製造することができる。特定の実施形態では、圧縮された生成物をコーティングして、例えば、圧縮された生成物の味を隠す、圧縮された生成物の腸での溶解を促進する、又はSMC若しくは薬剤の持続的放出を促進することができる。好適なコーティング材料としては、限定されるものではないが、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、酢酸フタル酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びEudragit(Rohm & Haas社、Germany;メタクリル酸-アクリル酸コポリマー)が挙げられる。
SMC又は薬剤を含む医薬組成物中に含有させることができる他の生理的に許容される化合物は、微生物の増殖又は活動を防止するのに特に有用である湿潤剤、乳化剤、分散剤又は保存剤を含んでもよい。様々な保存剤が周知であり、例えば、フェノール及びアスコルビン酸が挙げられる。生理的に許容される化合物を含む、薬学的に許容される担体の選択は、例えば、SMC又は薬剤の投与経路及びSMC又は薬剤の特定の物理化学的特徴に依存する。
ある特定の実施形態では、SMC又は薬剤を含む医薬組成物における使用のための1つ又は複数の賦形剤は、滅菌されている、及び/又は望ましくない物質を実質的に含まないものであってよい。そのような組成物を、当業界で公知の従来の技術によって滅菌することができる。錠剤及びカプセル等の、様々な経口剤形の賦形剤にとっては、滅菌は必要ない。標準、例えば、USP/NF標準は当業界で公知である。
本発明のSMC又は薬剤の医薬組成物を、用量、必要とされる投与頻度、並びに用量及び投与頻度に関する医薬組成物に関する対象の既知の、又は予想される寛容性に応じて、単回又は複数回の投与で投与することができる。様々な実施形態では、組成物は、がんを効率的に処置するための十分な量の本発明のSMC又は薬剤を提供することができる。
対象に投与されるSMC又は薬剤の量及び/又は濃度は、広く変化してもよく、典型的には、SMC又は薬剤の活性及び対象の特徴、例えば、種及び体重、並びに特定の投与様式及び例えば、がんの型に関する、対象の必要性に主に基づいて選択される。用量を、特定の対象又は対象群における治療及び/又は予防レジメンを最適化するように変化させることができる。
ある特定の実施形態では、本発明のSMC又は薬剤を、例えば、ロゼンジ剤、エアロゾルスプレー、口内洗浄液、コーティングスワブ、又は当業界で公知の他の機構の使用により、口腔に投与する。
ある特定の実施形態では、本発明のSMC又は薬剤は、外科手術の時点での腫瘍切除の際に脳内の空洞に挿入される徐放性固体ウエハーを使用して投与される。ウエハーは、SMC又はポリ(I:C)を含有する生分解性ポリ無水物ウエハーであってもよい。置かれるウエハーの数は、原発脳腫瘍の外科的切除後の切除物のサイズに依存してもよい。徐放性ウエハーから脳組織への直接的な薬物の送達は、血液脳関門を横断する全身性処置を送達する問題を回避する。ポリマーマトリックスは、薬物と共に有機溶媒中に溶解し、1〜20μmの範囲の微粒子に噴霧乾燥され、ウエハーに圧縮成型される、1,3-ビス-(p-カルボキシフェノキシ)プロパンとセバシン酸とのコポリマー(PCPP-SA; 80:20のモル比)から構成されていてもよい。ある特定の実施形態では、剛性ウエハーは、水の浸透が最初の10時間の間に無水物結合を加水分解した後、コポリマーを周囲の水性環境に浸食させる、2工程のプロセスで分解する。
ある特定の実施形態では、本発明のSMC又は薬剤を、当業界で公知の標準的な方法に従って、全身的に(例えば、経口的に、又は注射として)投与することができる。ある特定の実施形態では、SMC又は薬剤が、典型的には皮膚に固定される薬物送達デバイスとして働く層状構造内に含有される、経皮薬物送達系、すなわち、経皮「パッチ」を使用して、皮膚を介して、SMC又は薬剤を送達することができる。そのような構造において、薬物組成物は、典型的には、上背層の下部の層又はリザーバに含有される。経皮パッチのリザーバは、最終的には皮膚の表面への送達に利用可能であるSMC又は薬剤の量を含む。かくして、リザーバは、例えば、パッチの背層上の接着剤中、又は当業界で公知の任意の様々な異なるマトリックス製剤中に本発明のSMC又は薬剤を含んでもよい。パッチは、単一のリザーバ又は複数のリザーバを含有してもよい。
特定の経皮パッチの実施形態では、リザーバは薬物送達中に系を皮膚に固定するように働く薬学的に許容される接触接着材料のポリマーマトリックスを含んでもよい。好適な皮膚接触接着材料の例としては、限定されるものではないが、ポリエチレン、ポリシロキサン、ポリイソブチレン、ポリアクリレート、及びポリウレタンが挙げられる。或いは、SMC及び/又は薬剤を含有するリザーバ及び皮膚接触接着剤は、別々の、及び異なる層として存在し、リザーバの下部にある接着剤は、この場合、上記のポリマーマトリックス、液体若しくはヒドロゲルリザーバ、又は当業界で公知の別の形態のリザーバであってもよい。デバイスの上側表面として働く、これらの積層板中の背層は、好ましくは、パッチの一次構造エレメントとして機能し、デバイスに実質的な可撓性部分を提供する。背層のために選択される材料は、好ましくは、SMC及び/又は薬剤に、また、存在する任意の他の材料に実質的に不浸透性である。
局所送達のための更なる製剤としては、限定されるものではないが、軟膏、ゲル、スプレー、流体、及びクリームが挙げられる。軟膏は、典型的には、ワセリン又は他の石油誘導体に基づく、半固体調製物である。SMC又は薬剤を含むクリームは、典型的には、粘性の液体又は半固体エマルジョン、例えば、水中油又は油中水エマルジョンである。クリーム基剤は、典型的には、水で洗浄可能であり、油相、乳化剤、及び水性相を含む。クリーム基剤の油相は、「内部」相とも呼ばれ、一般的には、ワセリン及び脂肪アルコール、例えば、セチルアルコール又はステアリルアルコールから構成される;水性相は、通常、必ずしもそうではないが、体積において油相を超え、一般的には、保湿剤を含有する。クリーム製剤中の乳化剤は、一般的には、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性、又は両性の界面活性剤である。使用される特定の軟膏又はクリーム基剤を、当業界による最適な薬物送達を提供するように選択することができる。他の担体又はビヒクルに関して、軟膏基剤は、不活性、安定性、非刺激性、及び非感作性であってよい。
様々な頬製剤及び舌下製剤も企図される。
ある特定の実施形態では、本発明のSMC又は薬剤の投与は、非経口であってもよい。非経口投与は、髄腔内、硬膜外、くも膜下、皮下、又は静脈内投与を含んでもよい。非経口投与の手段は、当業界で公知である。特定の実施形態では、非経口投与は、皮下に埋め込まれるデバイスを含んでもよい。
ある特定の実施形態では、SMC又は薬剤を脳に送達することが望ましい。全身投与を含む実施形態では、これには、SMC又は薬剤が血液脳関門を横断することが必要である。様々な実施形態では、これは、SMC又は薬剤と、血液脳関門を越えてSMC又は薬剤を運搬することができる、陽イオン性デンドリマー又はアルギニンリッチペプチド等の、担体分子とを同時投与することによって容易にすることができる。
ある特定の実施形態では、SMC又は薬剤を、生体適合性放出系(例えば、リザーバ)の埋込みを介する投与により、埋め込まれたカニューレを介する直接投与により、埋め込まれた、若しくは部分的に埋め込まれた薬物ポンプを介する投与により、又は当業界で公知の同様の機能の機構により、脳に直接送達することができる。ある特定の実施形態では、SMC又は薬剤を、全身的に投与する(例えば、静脈に注射する)ことができる。ある特定の実施形態では、SMC又は薬剤を、血液脳関門を横断する輸送を増強するために医薬組成物中に含まれる更なる化合物を使用することなく、血液脳関門を横断して輸送することが期待される。
ある特定の実施形態では、本発明の1つ又は複数のSMC又は薬剤を、例えば、ある容量の水、アルコール、過酸化水素、又は他の希釈剤による希釈又はそれへの添加の準備ができている保存容器又は可溶性カプセル中に、濃縮物として提供することができる。本発明の濃縮物を、特定量のSMC若しくは薬剤及び/又は特定の総量で提供することができる。濃縮物を、投与前に特定容量の希釈剤中での希釈のために製剤化することができる。
SMC又は薬剤を、錠剤、カプセル、エリキシル剤若しくはシロップの形態で経口的に、又は坐剤の形態で直腸的に投与することができる。また、化合物を、気泡、ローション、ドロップ、クリーム、軟膏、皮膚軟化剤、又はゲルの形態で局所的に投与することもできる。化合物の非経口投与は、好適には、例えば、塩水溶液の形態で、又はリポソーム中に組み込まれた化合物と共に実施される。化合物自体が溶解するには十分に可溶性ではない場合、エタノール等の可溶化剤を適用することができる。他の好適な製剤及び投与の様式は、当業界で公知であるか、又は当業界に由来するものであってもよい。
本発明のSMC又は薬剤を、がんを有すると診断された哺乳動物等の、それを必要とする哺乳動物に投与することができる。本発明のSMC又は薬剤を投与して、アポトーシスを促進する、及び/又はがんを処置することができる。
本発明の医薬組成物の治療有効用量は、対象の年齢、対象の性別、対象の種、特定の病理、症状の重症度、及び対象の健康の一般的状態に依存してもよい。
本発明は、がんと診断されたヒト対象等の、ヒト対象の処置のための組成物及び方法を含む。更に、本発明の医薬組成物は、動物への投与にとって、例えば、獣医学的使用にとって好適なものであってもよい。本発明のある特定の実施形態は、非ヒト生物、例えば、非ヒト霊長類、イヌ、ウマ、ネコ、ブタ、有蹄動物、若しくはウサギ目の動物又は他の脊椎動物種への本発明の医薬組成物の投与を含んでもよい。
本発明による療法を、単独で、又は別の療法、例えば、別のがん療法と共に実施し、家庭、医院、診療所、病院の外来部門、又は病院で提供することができる。場合により、医師が療法の効果を密接に観察し、必要な調整を行うことができるように、処置は病院で開始するか、又は外来患者ベースで開始してもよい。療法の持続期間は、処置される疾患又は障害の型、対象の年齢及び状態、対象の疾患のステージ及び型、並びに患者が処置にどのように応答するかに依存する。
ある特定の実施形態では、本発明の療法の組合せは、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、ペグ化されたIFN、又はリポソームインターフェロン等の、組換えインターフェロンを用いる処置を更に含む。一部の実施形態では、本発明の療法の組合せは、例えば、四肢かん流のための、組換えTNF-αを用いる処置を更に含む。特定の実施形態では、本発明の組合せ療法は、DMXAA、リバビリン等の、1つ又は複数のTNF-α又はIFN誘導化合物を用いる処置を更に含む。本発明と組み合わせて使用することができる更なるがん免疫療法は、CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、又は他のチェックポイント阻害剤を標的とする抗体、例えば、モノクローナル抗体を含む。環状ジヌクレオチド(CDN)[環状ジ-GMP(グアノシン5'-一リン酸)(CDG)、環状ジAMP(アデノシン5'-一リン酸)(CDA)、及び環状GMP-AMP(cGAMP)]は、インターフェロン遺伝子の細胞質パターン認識受容体刺激因子(STING)によりTBK1/インターフェロン調節因子3(IRF3)/1型インターフェロン(IFN)シグナル伝達軸を活性化する病原体関連分子パターン分子(PAMP)のクラスである。ある特定の実施形態では、STINGアゴニストを、SMCと組み合わせて、がんを処置することができる。
様々な実施形態のための投与経路としては、限定されるものではないが、局所、経皮、経鼻、及び全身投与(静脈内、筋肉内、皮下、吸入、直腸、頬、経膣、腹腔内、関節内、眼、耳、又は経口投与)が挙げられる。本明細書で使用される場合、「全身投与」とは、全ての非皮膚投与経路を指し、具体的には、局所及び経皮投与経路を含まない。
上記実施形態のいずれかにおいて、投与経路を、SMC又は薬剤の特徴に基づいて最適化することができる。一部の例では、SMC又は薬剤は、低分子又は化合物である。他の例では、SMC又は薬剤は、核酸である。更に他の例では、薬剤は、細胞又はウイルスであってもよい。これらの実施形態又は他の実施形態のいずれかにおいて、適切な製剤及び投与経路は、当業界に従って選択されるであろう。
本発明の実施形態では、SMC及び薬剤を、それを必要とする対象、例えば、がんを有する対象に投与する。一部の例では、SMC及び薬剤は、同時に投与される。一部の実施形態では、SMC及び薬剤は、単一の治療剤形中に存在してもよい。他の実施形態では、SMC及び薬剤を、それを必要とする対象に別々に投与してもよい。別々に投与する場合、SMC及び薬剤を、同時に、又は異なる時間に投与してもよい。一部の例では、対象は、単一用量のSMC及び単一用量の薬剤を受ける。ある特定の実施形態では、1つ又は複数のSMC及び薬剤を、2つ以上の用量で対象に投与する。ある特定の実施形態では、SMCの投与頻度及び薬剤の投与頻度は、非同一である、すなわち、SMCを第1の頻度で投与し、薬剤を第2の頻度で投与する。
一部の実施形態では、SMCを、薬剤の投与の1週間以内に投与する。特定の実施形態では、SMCを、薬剤の投与の3日(72時間)以内に投与する。更により特定の実施形態では、SMCを、薬剤の投与の1日(24時間)以内に投与する。
本発明の方法のいずれかの特定の実施形態では、SMC及び薬剤は、互いに28日以内に、又はそれ以下で、例えば、互いに14日以内に投与される。本発明の方法のいずれかのある特定の実施形態では、SMC及び薬剤は、例えば、同時に、又は互いに1分、5分、10分、15分、30分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、18時間、24時間、36時間、2日、4日、8日、10日、12日、16日、20日、24日、若しくは28日以内に投与される。これらの実施形態のいずれかにおいて、本発明のSMCの1回目の投与は、本発明の薬剤の1回目の投与の前であってもよい。或いは、これらの実施形態のいずれかにおいて、本発明のSMCの1回目の投与は、本発明の薬剤の1回目の投与の後であってもよい。本発明のSMC及び/又は薬剤を、2つ以上の用量で対象に投与してもよいため、また、そのような例では、本発明のSMC及び薬剤の用量を、異なる頻度で投与してもよいため、SMCの投与と薬剤の投与との間の時間が、所与の処置経過内で、又は所与の対象について一定のままであることは必要ではない。
SMCと薬剤の一方又は両方を、低用量又は高用量で投与することができる。SMC及び薬剤を別々に製剤化する実施形態では、各薬剤の薬物動態プロファイルを、製剤、用量、及び投与経路等と好適に一致させることができる。一部の例では、SMCを標準的な用量又は高用量で投与し、薬剤を低用量で投与する。一部の例では、SMCを低用量で投与し、薬剤を標準的な用量又は高用量で投与する。一部の例では、SMCと薬剤の両方を、標準的な用量又は高用量で投与する。一部の例では、SMCと薬剤の両方を、低用量で投与する。
組合せの各成分の投与の用量及び頻度を、独立に制御することができる。例えば、1つの成分を1日3回投与するが、第2の成分を1日1回投与するか、又は1つの成分を週に1回投与するが、第2の成分を2週間に1回投与することができる。組合せ療法を、対象の身体が処置の効果から回復する機会を有するように、休止期間を含むオンオフ周期で投与してもよい。
キット
一般的に、本発明のキットは、1つ又は複数のSMCと、1つ又は複数の薬剤とを含有する。これらのものを、別々の組成物としてキット中に提供するか、又は上に記載されたように単一の組成物中で組み合わせることができる。本発明のキットはまた、1つ又は複数のSMCと、1つ又は複数の薬剤との投与のための指示書を含有してもよい。
本発明のキットはまた、本発明のSMC又は薬剤ではない、がんを処置することが知られる薬剤等の、更なる薬理学的に許容される物質を投与するための指示書を含有してもよい。
個別に、又は別々に製剤化される薬剤を、キットとして一緒に包装することができる。非限定例としては、例えば、2つのピル、ピルと粉末、坐剤とバイアル中の液体、2つの局所クリーム、軟膏、気泡等を含有するキットが挙げられる。キットは、粉末形態を再構成するためのバイアル、注射のための注射筒、カスタマイズされたIV送達システム、吸入器等の、対象への単位用量の投与を補助する任意の成分を含有してもよい。更に、単位用量キットは、組成物の調製及び投与のための指示書を含有してもよい。キットを、ある対象のための単回使用単位用量として、特定の対象のための複数回使用(一定用量レジメンで、若しくは個々の化合物は、療法が進行するにつれて効力が変化してもよい)として製造することができる;又はキットは、複数の対象への投与にとって好適な複数用量を含有してもよい(「バルク包装」)。キットの成分を、カートン、ブリスターパック、ボトル、チューブ等の中に集合させることができる。
特許請求される組合せの各化合物の用量は、投与方法、処置される疾患(例えば、がんの型)、疾患の重症度、並びに処置される個人の年齢、体重、及び健康等のいくつかの因子に依存する。更に、特定の対象に関する薬理ゲノム(治療剤の薬物動態、薬力学又は効能プロファイルに対する遺伝子型の効果)情報は、用量レジメン又は投与の他の態様に影響し得る。
(実施例1)
Smac模倣物質は先天性免疫系による破壊のために腫瘍をプライミングする
Smac模倣化合物は、がん患者の第I相臨床試験において安全であることが証明されているアポトーシス感作薬のクラスである。先天性抗病原体応答の刺激は、Smac模倣物質を用いて処置される腫瘍の死を誘発する強力だが安全な炎症性「サイトカインストーム」を生成することができる。本実施例は、腫瘍溶解性ウイルスと、ポリ(I:C)及びCpG等のアジュバントによる先天性免疫応答の活性化が、IFNβ、TNFα又はTRAILにより媒介される様式でSmac模倣物質を用いて処置されるがん細胞のバイスタンダー細胞死を誘導することを証明する。この治療戦略は、例えば、がんのいくつかの侵攻性マウスモデルにおいて、永続的な治癒をもたらし得る。ヒト臨床試験において安全性を示したこれらの及び他の先天性免疫刺激剤に関して、本明細書で提供されるデータは、がんを処置するためにSmac模倣物質と共にその組み合わせた使用を強く指し示す。
本実施例は、病原体模倣物質を使用する先天性免疫系の刺激が、SMCを用いて処置される腫瘍においてアポトーシスを開始させるのに必要なサイトカイン環境を生成するための安全で有効な戦略であるかどうかを検査するものである。本発明者らはここで、非病原性腫瘍溶解性ウイルス、並びにポリ(I:C)及びCpG等の、微生物RNA又はDNAの模倣物質が、IFNβ、TNFα、又はTRAIL産生のいずれかに依存する、SMCで処置されたがん細胞のバイスタンダー殺傷を誘導することを報告する。重要なことに、この治療戦略は、in vivoで許容され、がんのいくつかの侵攻性マウスモデルにおいて永続的な治癒をもたらした。
SMC療法は腫瘍溶解性ウイルス感染中にがん細胞をバイスタンダー細胞死に対して感作する
腫瘍溶解性ウイルス(OV)は、現在、第I〜III相臨床評価にあるがんのための新しい生物療法である。OV療法に対する1つの障壁は、腫瘍における抗ウイルス状態を指揮する宿主によるI型IFN及びNFκB応答性サイトカインの誘導であり得る。本発明者らが、SMCで予備処置されたがん細胞においてアポトーシスを誘導するためにこれらの先天性免疫サイトカインを利用することができるかどうかを検査した。最初に、腫瘍由来細胞株及び正常細胞株の小パネル(n=30)を、SMC LCL161及び腫瘍溶解性ラブドウイルスVSVΔ51に対する応答性についてスクリーニングした。本発明者らは、この化合物がSMCクラスにおいて最も臨床的に進行した薬物であるため、LCL161を選択し、ロバストな抗ウイルスサイトカイン応答を誘導することが知られているため、VSVΔ51を選択する。試験した28のがん細胞株のうちの15(54%)において、SMC処置は、VSVΔ51の感度EC50を10〜10,000倍増強した(図6、並びに図1A及び図1Bにおける代表例)。同様に、低用量のVSVΔ51は、2つの代表的な細胞株:それぞれ、マウス乳腺癌EMT6及びヒトグリア芽腫SNB75細胞において、不確定レベル(>2500nM)から4.5及び21.9nMまで、SMC療法のEC50を減少させた(図1C)。併用係数分析により、SMC療法とVSVΔ51との相互作用が相乗作用的であることが決定された(図7)。他の4つのSMC及び他の5つの腫瘍溶解性ウイルスを使用する実験により、様々な一価及び二価SMCがVSVΔ51と相乗作用することが示された(図8)。本発明者らは、腫瘍溶解性ラブドウイルスVSVΔ51及びMaraba-MG1が、全て先天性免疫シグナル伝達の態様を武装解除する機構を変化させたHSV、レオウイルス、ワクシニア及び野生型VSVプラットフォームと比較して、SMCと相乗作用してバイスタンダー殺傷を惹起するのに優れていることを見出した(図9A及び図9B)。RNAi媒介性サイレンシングを使用する遺伝子実験により、VSVΔ51との相乗作用を得るためには、XIAPとcIAPの両方を阻害する必要があることが示された(図10A、図10B、及び図24C)。腫瘍由来細胞株における結果とは全く対照的に、非がんGM38原発性ヒト皮膚線維芽細胞及びHSkMヒト骨格筋芽細胞は、VSVΔ51とSMCとの組合せ療法によって影響されなかった(図6)。まとめると、これらのデータは、腫瘍溶解性VSVが、腫瘍選択様式でSMC療法と相乗作用することを示している。
VSVΔ51が、ウイルスによって感染していないIAP枯渇近隣細胞においてバイスタンダー細胞死を惹起するかどうかを決定するために、低用量のVSVΔ51(MOI=0.01感染性粒子/細胞)による感染の前に、細胞をSMCで処置した。本発明者らは、VSVΔ51に感染させた細胞(次いで、UV光によって不活化される)に由来する馴化培地が、SMCで処置されたウイルスナイーブがん細胞のプレートに移した場合に細胞死を誘導することができるかどうかを評価した。馴化培地は、細胞をSMCで同時処置した場合にのみ、細胞死を誘導した(図1D)。本発明者らはまた、ウイルスを、1ラウンドの感染に限定するその糖タンパク質(VSVΔ51ΔG)をコードする遺伝子の欠失を含有する、低用量のVSVΔ51の偽型無G株(MOI=0.1)が、SMCで処置されたがん細胞の全プレートに対して毒性的であることも見出した(図1E)。最後に、本発明者らは、蛍光タグを発現するVSVΔ51の拡散を遅延させるために使用した、アガロースで覆った細胞中で細胞傷害性アッセイを実施し、ウイルス感染の領域の外側のSMC処置された細胞において劇的な細胞死を観察した(図1F及び図11)。全体として、これらの結果は、VSVΔ51感染が、SMCで処置された近隣の、未感染のがん細胞におけるバイスタンダー細胞死を強力に誘導することができる少なくとも1つの可溶性因子の放出をもたらすことを示している。
SMC療法は腫瘍溶解性VSVに対する細胞性先天性免疫応答を損傷しない
哺乳動物腫瘍細胞中でのRNAウイルス感染に対する細胞性先天性免疫応答を、細胞質ゾル(RIG-I様受容体、RLR)及びエンドソーム(toll様受容体、TLR)ウイルスRNAセンサーのファミリーのメンバーによって開始させることができる。一度誘発されたら、これらの受容体は、同時的IFN応答因子(IRF)3/7及び核因子カッパB(NF-κB)細胞シグナル伝達カスケードを播種することができる。これらのシグナルは、IFN及びその応答性遺伝子並びに炎症性ケモカイン及びサイトカインのアレイの産生をもたらすことができる。これは、抗ウイルス遺伝子兵器を先制して発現するよう近隣細胞を刺激し、また、先天性及び適応免疫系内の細胞の動員及び活性化を補助して、ウイルス感染を最終的に消失させる。cIAPタンパク質は、RLR及びTLRから発するものを含む、病原体認識の下流のいくつかのシグナル伝達経路に最近関与している。したがって、SMC療法が、腫瘍細胞及びマウスにおいて腫瘍溶解性VSV感染に対する抗ウイルス応答を変化させるかどうかを検査した。最初に、VSVΔ51の生産性及び拡散に対するSMC療法の効果を評価した。VSVΔ51の生産性の単一工程及び複数工程の増殖曲線により、SMC処置がin vitroのEMT6又はSNB75細胞におけるVSVΔ51の増殖動力学に影響しないことが示された(図2A)。更に、低速度撮影顕微鏡観察による分析により、SMC処置が腫瘍細胞におけるVSVΔ51の感染性又は腫瘍細胞による拡散を変化させないことが示される(図2B)。更に、in vivoでのウイルス複製及び拡散を、IVISイメージング及び組織ウイルス滴定を使用して腫瘍量を決定することによって分析した。ウイルス動力学における差異は、EMT6腫瘍担持マウスにおけるSMC処置の際に見出されなかった(図12A及び図12B)。EMT6細胞とSNB75細胞は両方とも、VSVライフサイクルを調節する機能的なI型IFN応答を有するため、これらのデータは、SMC療法ががん細胞における抗ウイルスシグナル伝達カスケードに影響しないことの間接的ではあるが強力な証拠を提供する。
より深く精査するために、VSVΔ51及びSMCで処理されたEMT6及びSNB75細胞中でIFNβ産生を測定した。この実験により、SMC処理されたがん細胞が、VSVΔ51のみと比較してわずかに低レベルであるが、IFNβを分泌することによってVSVΔ51に応答する(図2C)ことが示された。SMC処理された細胞からの抑制されたIFNβ分泌が、下流のIFNで刺激される遺伝子(ISG)の誘導と関係があるかどうかを調べた。VSVΔ51及びSMCで処理された細胞中でのISGの小パネルの定量的RT-PCR分析により、IAP阻害が腫瘍溶解性VSV感染に応答するISG遺伝子発現と関係しないことが示された(図2D)。この知見と一致して、ウェスタンブロット分析により、SMCはIFNβの下流のJak/Statシグナル伝達の活性化を変化させないことが示された(図2E及び図24A)。まとめて、これらのデータは、SMCがVSVΔ51からの感染を感知し、それに応答する腫瘍細胞の能力を阻害しないことを示唆している。
IFNβはSMCと腫瘍溶解性VSVとの同時療法中にバイスタンダー細胞死を指揮する
SMCは、TNFα、TRAIL、及びIL-1βにより誘導されるカスパーゼ8依存的アポトーシスに対していくつかのがん細胞株を感作する。RNAウイルスは細胞性抗ウイルス応答の一部としてこれらのサイトカインの産生を誘発することができるため、SMC及びOVにより誘導される細胞死におけるサイトカインシグナル伝達の関与を調査した。最初に、TNF受容体(TNF-R1)及び/又はTRAIL受容体(DR5)をサイレンシングし、SMCとVSVΔ51との相乗作用をアッセイした。この実験により、TNFα及びTRAILが関与するだけでなく、集合的に、バイスタンダー細胞死にとって必須であることが示された(図3A〜図3H、図13A、及び図24D)。この知見と一致して、ウェスタンブロット免疫蛍光実験により、外因性アポトーシス経路の強力な活性化が示され、RNAiノックダウン実験により、相乗的応答におけるカスパーゼ8とRip1の両方に対する要件が示された(図14A〜図14G、図24E、及び図24F)。更に、TNFαのVSVΔ51への操作は、SMC療法との相乗作用を1桁改善した(図15A及び図15B)。
次に、I型IFN受容体(IFNAR1)をサイレンシングしたところ、予想外にも、IFNAR1ノックダウンがSMC療法と腫瘍溶解性VSVとの相乗作用を防止することが見出された(図3B、図13B、及び図24D)。TRAILはI型IFN28に応答する確立されたISGであるため、IFNAR1ノックダウンは、バイスタンダー殺傷を完全に抑制しないが、鈍らせると予測された。TNFα及びIL-1βは、IFNシグナル伝達とは無関係であると考えられるが、それにも拘わらず、それらはウイルス検出の下流のNF-κBシグナル伝達に応答する。この結果は、TNFα及び/又はIL-1βの産生のための非標準的なI型IFN依存的経路の可能性を示唆している。実際、IFNβ、TRAIL、TNFα、及びIL-1βのmRNA発現を腫瘍溶解性VSV感染中に精査した場合、IFNβの誘導と、TRAIL及びTNFαの誘導との間に、有意な時間的遅延が見出された(図3C)。このデータはまた、TRAILのようにTNFαをIFNβの次に誘導することができることも示唆している。この概念を証明するために、IFNAR1を、VSVΔ51で細胞を処理する前にサイレンシングした。IFNAR1ノックダウンは、腫瘍溶解性VSVによるTRAILとTNFαの両方の誘導を完全に無効化した(図3D)。更に、SMCとの相乗作用を、III型IFN(IL28/29)ではなく、組換えI型IFN(IFNα/β)及びII型IFN(IFNγ)を使用して要約した(図3E)。総合すると、これらのデータは、I型IFNが腫瘍細胞のVSVΔ51感染中のTNFα及びTRAILの誘導にとって必要であることを示している。更に、これらのサイトカインの産生は、近隣の、未感染のSMC処理細胞のバイスタンダー殺傷の原因となる。
TNFαの非標準的誘導を更に調査するために、組換えIFNβで処理されたSNB75細胞中でのTRAIL及びTNFαのmRNA発現レベルを測定した。両サイトカインは、IFNβ処理によって誘導され(図3F)、ELISA実験により、細胞培養培地中でのその対応するタンパク質産物の産生が確認された(図3G)。興味深いことに、TRAILの誘導と、TNFαの誘導との間には有意な時間的遅延があった。TRAILは真正のISGであり、TNFαはそうではないため、この結果は、TNFαがIFNβによって直接誘導されないが、IFNβにより上方調節される下流のISGに応答する可能性をもたらした。かくして、定量的RT-PCRを、SNB75細胞中の176種のサイトカインに対して実施し、IFNβにより有意に上方調節された70種が同定された(Table 5(表5))。IFNβによるTNFαの誘導におけるこれらのISGの役割は、現在調査されている。また、SMC処置が、SNB75細胞中でのIFNβによるTRAILとTNFαの両方の誘導を促進したことも興味を引きつける(図3F及び図3G)。更に、IKKのドミナントネガティブ構築物を使用して、IFNβの下流のこれらの炎症性サイトカインの産生が、少なくとも部分的に、古典的NF-κBシグナル伝達に依存することが見出された(図3H)。EMT6細胞中では、SMC処理は、VSV感染の際にTNFαの細胞産生を増強する(5〜7倍のパーセンテージ増加)ことが見出された(図16)。最後に、TNF-R1シグナル伝達の遮断(抗体又はsiRNAを用いる)は、SMC及びVSVΔ51又はIFNβの存在下でEMT6細胞死を防止することも示された(図17A〜図17C及び図24H)。I型IFNとTNFαとの関係は複雑であり、生物学的状況に応じて相補的又は阻害的効果を有する。しかしながら、本発明を任意の特定の作用機構に限定するものではないが、単純なワーキングモデルを以下のように提唱することができる:腫瘍溶解性RNAウイルスにより感染した腫瘍細胞はI型IFNを上方調節し、このプロセスは、IAPタンパク質のSMC拮抗作用によって影響されない。これらのIFNは次いで、TNFα及びTRAILを発現し、分泌するように、近隣の未感染のがん細胞にシグナルを伝達し、このプロセスはSMC処理によって増強され、結果として、SMCに曝露された未感染の腫瘍細胞における自己分泌型及び傍分泌型プログラム細胞死を誘導する(図18A及び図18B)。
腫瘍溶解性VSVは、がんの前臨床動物モデルにおいてSMC療法を促進する
in vivoでのSMCと腫瘍溶解性VSVとの同時療法を評価するために、EMT6乳腺癌を、同系同所モデルとして使用した。予備的安全性及び薬力学実験により、経口強制摂取により送達された50mg/kgの用量のLCL161が良好に許容され、少なくとも24時間、一部の事例においては最大で48〜72時間にわたって腫瘍中でcIAP1/2ノックダウンを誘導した(図19A、図19B、及び図24G)。腫瘍が約100mm3に達した時、本発明者らは、SMC及びVSVΔ51で週2回マウスを処置し始め、全身的に送達した。単剤として、SMC療法は、腫瘍増殖速度の低下及び生存の適度の延長をもたらしたが、VSVΔ51処置は、腫瘍サイズ又は生存に影響しなかった(図4A及び図4B)。全く対照的に、SMCとVSVΔ51との組合せ処置は、劇的な腫瘍退縮を誘導し、処置されたマウスの40%において永続的な治癒をもたらした。in vitroで解明されたバイスタンダー殺傷機構と一致して、免疫蛍光分析により、VSVΔ51の感染性が一過的であり、腫瘍内の小さい病巣に限定される(図4C)が、カスパーゼ3の活性化がSMCとVSVΔ51とで同時処置された腫瘍に広がっている(図4D)ことが示された。更に、腫瘍溶解物を用いるイムノブロットにより、二重に処置された腫瘍におけるカスパーゼ8及びカスパーゼ3の活性化が示された(図4E、図24B、及び図24G)。組合せ処置コホートの動物は体重減少を経験したが、最後の処置後にマウスは完全に回復した(図20A)。
別のモデル系においてこれらのin vivoでのデータを確認するために、ヒトHT-29結腸直腸腺癌異種移植モデルを、ヌード(無胸腺)マウスにおいて試験した。HT-29は、in vitroでSMCとVSVΔ51との同時処理によるバイスタンダー殺傷に高く応答する細胞株である(図21A及び図21B)。EMT6モデル系における本発明者らの知見と同様、SMCとVSVΔ51とを用いる組合せ療法が、腫瘍退縮及びマウス生存の有意な延長を誘導した(図21C)。対照的に、いずれの単剤療法も、HT-29腫瘍に対して効果がなかった。更に、SMCで処置されたマウスと比較して、二重に処置されたマウスでは更なる体重の減少はなかった(図21D)。これらの結果は、不応性異種移植モデルにおいて相乗作用が非常に有効であること、及び適応免疫応答がSMCとOVとの同時療法の効能において最初は大きな役割を有さないことを示している。
同時処置相乗作用における先天性抗ウイルス応答及び免疫エフェクターの役割
次に、SMC処置と組み合わせた腫瘍溶解性VSV感染が、in vivoでTNFα又はIFNβにより媒介される細胞死をもたらすかどうかを決定した。中和抗体によるTNFαシグナル伝達の遮断が、EMT6腫瘍モデルにおいてSMCとVSVΔ51の相乗作用に影響するかどうかを調査した。アイソタイプ一致抗体対照と比較して、TNFα中和抗体の適用は、腫瘍退縮を逆転させ、生存率を、対照及び単一処置群に近い値まで低下させた(図4F及び図4G)。これは、TNFαが、SMCと腫瘍溶解性VSVとの抗腫瘍組合せ効能にとってin vivoで必要であることを示している。
SMCとOVとの組合せのパラダイムにおけるIFNβシグナル伝達の役割を調査するために、EMT6腫瘍を担持するBalb/cマウスを、IFNAR1遮断抗体で処置した。IFNAR1遮断抗体で処置されたマウスは、感染後24〜48時間以内にウイルス血症に屈服した。死亡の前に、ウイルス感染後18〜20時間で腫瘍を収集し、カスパーゼ活性について腫瘍を分析した。I型IFNシグナル伝達が欠損したこれらの動物は大きいウイルス負荷に起因して病気であったにも拘わらず、切り出された腫瘍はカスパーゼ8活性の兆候を示し、腫瘍内のカスパーゼの予想された活性化を示した対照群(図22)とは対照的に、カスパーゼ3活性の最小限の兆候のみを示した(図22)。これらの結果は、インタクトなI型IFNシグナル伝達が、組合せ手法の抗腫瘍効果を媒介するのに必要であるという仮説を支持する。
OV/SMC組合せ療法の効能に対する先天性免疫細胞又は他の免疫メディエータの寄与を評価するために、免疫欠損NOD-スキッド又はNSG(NOD-スキッド-IL2Rガンマnull)マウスにおいて、EMT6腫瘍の処置を最初に試みた。しかしながら、IFNAR1枯渇シグナル伝達試験と同様、これらのマウスもまた、ウイルス血症に起因して迅速に死亡した。したがって、先天性免疫細胞の寄与に、代理モデルとしてex vivo脾細胞培養系を用いることにより対処した。TNFαを産生する能力を有する先天性免疫集団を陽性選択し、ナイーブ脾細胞から更に選別した。マクロファージ(CD11b+F4/80+)、好中球(CD11b+Gr1+)、NK細胞(CD11b-CD49b+)及び骨髄陰性(リンパ球)集団(CD11b-CD49-)を、VSVΔ51で刺激し、馴化培地をEMT6細胞に移して、SMCの存在下で細胞傷害性を測定した。これらの結果は、NK細胞ではなく、VSVΔ51により刺激したマクロファージ及び好中球が、SMCの存在下でがん細胞死をもたらす因子を産生することができることを示している(図23A)。骨髄由来一次マクロファージも単離し、これらのマクロファージはまた、用量依存的様式で腫瘍溶解性VSV感染に応答して、EMT6細胞を殺傷する因子を産生した(図23B)。要するに、これらの知見は、複数の先天性免疫細胞集団が、観察される抗腫瘍効果を媒介するように応答することができること、及びマクロファージがこの応答の最も可能性のあるエフェクターであることを示している。
免疫アジュバントであるポリ(I:C)及びCpGはin vivoでのSMC療法を促進する
次に、先天性前炎症性応答を誘導することが知られる合成TLRアゴニストが、SMC療法と相乗作用するかどうかを調査した。EMT6細胞を、トランスウェル挿入システムにおいてマウス脾細胞と同時培養し、脾細胞を、SMCと、TLR3、4、7又は9のアゴニストとで処理した。試験したTLRアゴニストは全て、SMCで処理されたEMT6細胞のバイスタンダー細胞死を誘導することがわかった(図5A)。TLR4、7、及び9アゴニストであるLPS、イミキモッド、及びCpGはそれぞれ、おそらく、その標的であるTLR受容体がEMT6細胞中で発現されないため、EMT6細胞のバイスタンダー殺傷を誘導するために脾細胞を必要とした。しかしながら、TLR3アゴニストであるポリ(I:C)は、SMCの存在下で直接的にEMT6細胞の細胞死をもたらした。次に、ポリ(I:C)及びCpGを、in vivoでSMC療法と組み合わせて試験した。これらのアゴニストは、ヒトにおいて安全であることが証明されており、現在、がんのためのいくつかの中期から後期段階の臨床試験にあるため、それらを選択した。EMT6腫瘍を確立し、上記のように処置した。ポリ(I:C)処置は、単剤として腫瘍増殖に対して影響しなかったが、SMCとの組合せは実質的な腫瘍退縮を誘導し、腹腔内送達した場合、処置されたマウスの60%において永続的な治癒をもたらした(図5B及び図5C)。同様に、CpG単剤療法は、腫瘍サイズ又は生存に影響しなかったが、SMC療法と組み合わせた場合、処置されたマウスの88%において腫瘍退縮及び永続的な治癒をもたらした(図5D及び図5E)。重要なことに、これらの組合せ療法は、マウスによって良好に許容され、その体重は療法の停止後すぐに処置前のレベルに戻った(図20B及び図20C)。腫瘍溶解性VSVの結果と一緒にまとめると、このデータは、一連の臨床的に進行した先天性免疫アジュバントが、in vivoでSMC療法と強く、かつ安全に相乗作用し、いくつかのがんの処置不応性の、侵攻性マウスモデルにおいて腫瘍退縮及び永続的な治癒を誘導することを示している。
(実施例2)
不活化ウイルス粒子、がんワクチン、及び刺激性サイトカインはSMCと相乗作用して腫瘍を殺傷する
BCG(Bacillus Calmette-Guerin)、組換えインターフェロン(例えば、IFNα)、及び組換え腫瘍壊死因子(例えば、四肢かん流において使用されるTNFα)等の現在のがん免疫療法の使用、並びに免疫系の腫瘍媒介性抑制に打ち勝つ免疫チェックポイント阻害剤(抗CTLA-4及び抗PD-1又はPD-L1モノクローナル抗体等)に対する生物製剤(例えば、遮断抗体)の最近の臨床使用は、有効な処置モダリティとしての「がん免疫療法」の潜在能力を強調する。実施例1に示されたように、本発明者らは、SMCと相乗作用する非ウイルス免疫刺激剤のロバストな潜在能力を証明した(図5)。これらの試験を更に詳しく説明するために、本発明者らはまた、複製し、拡散する能力なしにその感染性及び免疫刺激特性を保持するUV照射されたVSV粒子である、非複製性ラブドウイルス由来粒子(NRRPと呼ばれる)と相乗作用するSMCの潜在能力について試験した。NRRPがSMCと直接相互作用するかどうかを評価するために、本発明者らは、様々ながん細胞株、EMT6、DBT、及びCT-2Aを、SMC及び様々なレベルのNRRPで同時処理し、アラマーブルーによって細胞生存能力を評価した。本発明者らは、NRRPがこれらのがん細胞株中でSMCと相乗作用することを観察した(図25A)。NRRPが強力な前炎症性応答を誘導することができるかどうかを評価するために、本発明者らは、分画化されたマウス脾細胞をNRRP(又は陽性対照としての合成CpG ODN 2216)で処理し、用量応答様式で細胞培養上清を培養物中のEMT6細胞に移し、細胞をビヒクル又はSMCで処理した。本発明者らは、SMCの存在下で高い程度のEMT6細胞死をもたらしたかなりの前炎症性応答があったため、NRRPの免疫原性がCpGの類似するレベルにあることを観察した(図25B)。EMT6腫瘍モデルにおけるCpG及びSMCの処置は88%の治癒率をもたらした(図5D)ため、これらの知見は、SMCとNRRPとの組合せがin vivoで非常に相乗作用的であり得ることを示唆している。
SMCと、生又は不活化一本鎖RNA腫瘍溶解性ラブドウイルス(例えば、VSVΔ51、Maraba-MG1、及びNRRP)との相乗作用の発見における本発明者らの成功により、診療において認可された弱毒化ワクチンがSMCと相乗作用することができるかもしれないことが示唆された。この可能性を試験するために、本発明者らは、典型的には、TNFαの高い局部産生のためin situで膀胱がんを処置するために使用される、がん生物製剤、結核マイコバクテリウム、BCGのSMCと相乗作用する能力を評価した。実際、SMCとBCGとの組合せは、強力に相互作用して、in vitroでEMT6細胞を殺傷する(図26A)。これらの知見は、同様にin vivoにも拡張された;本発明者らは、局部的又は全身的に投与された(すなわち、それぞれ、腫瘍内又は腹腔内に投与された)経口SMCとBCGとの組合せ処置に関して有意な腫瘍退縮を観察した(図26B)。これらの知見は、SMCとの組合せがん免疫療法のための認可されたワクチンの適用可能性を証明する。
I型IFNはin vivoでSMCと相乗作用する
ウイルス、及びおそらく他のTLRアゴニスト及びワクチンの効果は、部分的には、mRNA翻訳等の様々なシグナル伝達機構によって制御される、I型IFN産生によって媒介されると考えられる。本発明者らの知見は、がんを処置するための有効な手法として、SMC処置と、組換えIFN等の、現行の免疫療法とを組み合わせる異なる可能性を惹起した。この組合せの可能性を探索するために、本発明者らは、同系同所性EMT6乳腺癌モデルにおいて、SMCと、組換えIFNαの腹腔内又は腫瘍内注射のいずれかとの2つの処置レジメンを行った。IFNαの処置はEMT6腫瘍増殖又は全生存に対する効果がなかったが、SMC処置はマウスの生存をわずかに延長させ、17%の治癒率を有していた(図27)。しかしながら、SMCと、IFNαの腹腔内又は腫瘍内注射との組合せ処置は、腫瘍増殖を有意に遅延させ、腫瘍担持マウスの生存を延長させ、それぞれ、57%及び86%の治癒率が得られた(図27)。これらの結果は、I型IFNによる直接刺激は、SMCと相乗作用して、in vivoで腫瘍を根絶することができるという仮説を支持する。
SMCとの相乗作用の可能性に関する更なる腫瘍溶解性ラブドウイルスの評価
VSVΔ51は前臨床候補であるが、腫瘍溶解性ラブドウイルスVSV-IFNβ及びMaraba-MG1が、がん患者において臨床試験を現在受けている。実施例1に示されたように、本発明者らは、Maraba-MG1がin vitroでSMCと相乗作用することを証明した(図9)。本発明者らはまた、SMCが、EMT6細胞中で、臨床候補であるVSV-IFNβ及びVSV-NIS-IFNβ(すなわち、イメージング遺伝子、NIS、ナトリウム-ヨウ素共輸送体を担持する)と相乗作用することも確認した(図28)。これらのウイルスがin vivoで前炎症性状態を誘導することができるかどうかを評価するために、本発明者らは、感染したマウスをi.v.で5×108PFUのVSVΔ51、VSV-IFNβ、及びMaraba-MG1で処置し、感染したマウスの血清からTNFαのレベルを測定した。全事例において、感染後12時間で、腫瘍溶解性ウイルス感染に由来する一過的であるがロバストなTNFαの増加があったが、これは24時間までにかろうじて検出可能であった(図29)。これらの感染は免疫応答性宿主において自己制限的であるため、これは当然である。これらの結果は、臨床候補である腫瘍溶解性ラブドウイルスが、VSVΔ51と同様の様式でSMCと相乗作用する可能性を有することを示唆している。
実施例1に示されたように、本発明者らは、完全長TNFαを発現するように操作されたVSVΔ51の形態が、SMCの存在下で腫瘍溶解性ウイルスにより誘導される細胞死を増強することができることを実証した(図15)。これらの知見を更に詳しく説明するために、本発明者らはまた、VSVΔ51を、その細胞内及び膜貫通成分がヒト血清アルブミンに由来する分泌シグナルで置き換えられたTNFαの形態(VSVΔ51-solTNFα)を発現するように操作した。完全長TNFα(memTNFα)と比較して、solTNF-αは宿主細胞から構成的に分泌されるが、memTNFα形態は細胞膜上に固定され得る(依然として、接触分泌様式で細胞死を誘導することができる)か、又はメタロプロテアーゼ(ADAM17等)による内因性プロセシングに起因して放出され、傍分泌様式で細胞を殺傷し得る。本発明者らは、腫瘍溶解性VSV感染細胞に由来するTNFαの両方の形態が、同所性同系乳腺がんモデル、EMT6においてSMCと相乗作用するかどうかを評価した。予想通り、SMCを用いる処置は、EMT6腫瘍増殖速度をわずかに遅延させ、腫瘍担持マウスの生存をわずかに延長させ、ビヒクルと、VSVΔ51-memTNFα又はVSVΔ51-solTNFαのいずれかとの組合せは、全生存又は腫瘍増殖速度に影響しなかった(図30A及び図30B)。他方、ウイルスにより発現されたTNFαは、腫瘍増殖速度を有意に遅らせ、それぞれ、30%及び70%の生存率の増加をもたらした。注目すべきことに、SMCとVSVΔ51との組合せに由来する40%の腫瘍治癒率(図4A)には、4回の処置及び5×108PFUの用量のVSVΔ51を必要とした。しかしながら、TNFαを発現する腫瘍溶解性VSVとSMCとの組合せは、より高い治癒率をもたらし、1×108PFUのウイルス用量の2つの処置レジメンを用いて達成された。この処置戦略を他の不応性同系モデルに適用することができるかどうかを評価するために、本発明者らは、VSVΔ51-solTNFαが、マウス結腸癌細胞株CT-26の皮下モデルにおいてSMCと相乗作用するかどうかを評価した。予想通り、本発明者らは、VSVΔ51-solTNFαに関する腫瘍増殖速度又は生存の影響を観察せず、腫瘍増殖速度の適度な低下及び生存のわずかな延長を観察した(図30C)。しかしながら、本発明者らは、SMCとVSVΔ51-solTNFαとの組合せ処置を用いて、これらの腫瘍担持マウスの腫瘍増殖を更に遅延させ、生存を延長させることができた。したがって、腫瘍溶解性ウイルス内へのTNFαトランスジーンの含有は、SMCの組合せにとって大きな利点である。SMCと相乗作用させるための、TRAIL、FasL、又はリンホトキシン等の他の細胞死リガンドトランスジーンの、ウイルス中への含有は、容易に想定され得る。
脳腫瘍を根絶するSMCの潜在能力の探索
SMCと、免疫刺激剤との組合せは、有効な療法がなく、免疫療法が期待できる脳の悪性腫瘍等の、多くの異なる型のがんに適用可能である。第1の工程として、血液脳関門(BBB)は脳に進入する薬物に対する大きな障壁であるため、本発明者らは、SMCが脳腫瘍のマウスモデルにおいてBBBを横断することができるかどうかを決定した。本発明者らは、薬物投与の数時間後の頭蓋内CT-2A腫瘍中のcIAP1/2タンパク質のSMC誘導性分解が、SMCがBBBを横断して、脳腫瘍内のcIAP1/2及び潜在的には、XIAPと拮抗することができることを示すことを観察した(図31A)。本発明者らはまた、SMCの頭蓋内への直接的注射(100μM溶液10μL)が、cIAP1/2とXIAPタンパク質との両方の強力な下方調節をもたらすことができ(図31B)、これは、IAPのSMC誘導性自己ユビキチン化の直接的結果であるか、又はXIAP喪失の場合、腫瘍細胞死誘導の結果であることを示した。第2の工程として、本発明者らは、免疫刺激剤の全身刺激がナイーブマウスの脳において前炎症性応答をもたらし得るかどうかを決定することを望んだ。実際、本発明者らは、ウイルス模倣物質、ポリ(I:C)、TLR3アゴニストを腹腔内注射したマウスに由来する脳からTNFαレベルの顕著な上方調節を観察した(図32A)。本発明者らは、ポリ(I:C)又は臨床候補である腫瘍溶解性ラブドウイルスVSVΔ51、VSV-IFNβ、若しくはMaraba-MG1で処置されたマウスの脳から未精製のタンパク質溶解物を抽出した後、これらの溶解物をSMCの存在下でCT-2A又はK1580グリア芽腫細胞に適用することによって、この知見をフォローアップした。本発明者らは、これらの非ウイルス性合成又は生物ウイルス剤を用いる先天性免疫応答の刺激が、これらの2つのグリア芽腫細胞株に関してSMCの存在下で細胞死の増強をもたらすことを観察した(図32B)。第3の工程として、本発明者らはまた、ポリ(I:C)を、腫瘍の部位でサイトカイン誘導の増加さえもたらし得る、明白な毒性なく頭蓋内に直接投与することができることを確認した(図32C)。最後に、本発明者らは、脳又は全身刺激内の直接免疫刺激が、脳のがんのSMC処置マウスモデルにおいて永続的な治癒をもたらすかどうかを評価した。SMC(経口)と、ポリ(I:C)(頭蓋内)又はVSVΔ51(i.v.)との組合せは、CT-2A担持マウスの神経膠腫のほぼ完全な生存をもたらす(図32D及び図32E)が、期待される生存率は、それぞれ、86%及び100%である。SMCとポリ(I:C)の頭蓋内処置との観察される相乗作用に対するフォローアップとして、本発明者らはまた、SMCと組換えヒトIFNα(B/D)との直接的な、同時的頭蓋内注射を用いるCT-2A神経膠腫の処置のための可能性を評価した。実際、本発明者らは、組合せ処置を用いた場合のマウス生存の顕著な正の影響を観察し、その治癒率は50%であった(図33)。重要なことに、単一又は組合せのSMC又はIFNα処置は、これらの腫瘍担持マウスにおいて明白な神経毒性をもたらさなかった。全体として、これらの結果は、複数の様式のSMC処置が、複数の局部的又は全身的に投与される先天性免疫刺激剤と相乗作用して、in vitroでがん細胞を殺傷し、がんの動物モデルにおいて腫瘍を根絶することができることを示す。
方法
試薬
Novartis社は、LCL161を提供した(Houghton, P. J.ら、Initial testing (stage 1) of LCL161, a SMAC mimetic, by the Pediatric Preclinical Testing Program. Pediatr Blood Cancer 58: 636〜639頁(2012); Chen, K. F.ら、Inhibition of Bcl-2 improves effect of LCL161, a SMAC mimetic, in hepatocellular carcinoma cells. Biochemical Pharmacology 84: 268〜277頁(2012))。SM-122及びSM-164は、Dr. Shaomeng Wang(University of Michigan、USA)(Sun, H.ら、Design, synthesis, and characterization of a potent, nonpeptide, cellpermeable, bivalent Smac mimetic that concurrently targets both the BIR2 and BIR3 domains in XIAP. J Am Chem Soc 129: 15279〜15294頁(2007))によって提供された。AEG40730(Bertrand, M. J.ら、cIAP1 and cIAP2 facilitate cancer cell survival by functioning as E3 ligases that promote RIP1 ubiquitination. Mol Cell 30: 689〜700頁(2008))は、Vibrant Pharma Inc社(Brantford、Canada)によって合成された。OICR720は、Ontario Institute for Cancer Research (Toronto、Canada) (Enwere, E. K.ら、TWEAK and cIAP1 regulate myoblast fusion through the noncanonical NF-kappaB signalling pathway. Sci Signal 5: ra75 (2013))によって合成された。IFNα、IFNβ、IL28及びIL29を、PBL Interferonsource社(Piscataway、USA)から取得した。全てのsiRNAを、Dharmacon社(Ottawa、Canada; ON TARGETplus SMARTpool)から取得した。CpG-ODN 2216は、IDT社によって合成された(5'-gggGGACGATCGTCgggggg-3' (配列番号1)、小文字は、これらのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を示すが、斜体はホスホジエステル結合を含む3個のCpGモチーフを同定する)。イミキモッドを、BioVision Inc.社(Milpitas、USA)から購入した。ポリ(I:C)を、InvivoGen社(San Diego、USA)から取得した。LPSは、Sigma社(Oakville、Canada)からのものであった。
細胞培養物
細胞を、10%熱不活化ウシ胎仔血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、及び1%非必須アミノ酸(Invitrogen社、Burlington、USA)を添加したDMEM培地中、37℃及び5%CO2で維持した。全ての細胞株を、以下: SNB75 (Dr. D. Stojdl、Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute)及びSF539 (UCSF Brain Tumor Bank)を除いて、ATCCから取得した。細胞株を、マイコプラズマ汚染について規則的に試験した。siRNAトランスフェクションのために、製造業者のプロトコールに従って、細胞に48時間にわたってLipofectamine RNAiMAX (Invitrogen社)又はDharmaFECT I (Dharmacon社)を逆トランスフェクトした。
ウイルス
Indiana血清型のVSVΔ51(Stojdl, D. F.ら、VSV strains with defects in their ability to shutdown innate immunity are potent systemic anti-cancer agents. Cancer Cell 4(4)、263〜275頁(2003))を、この試験において使用し、Vero細胞中で増殖させた。VSVΔ51-GFPは、クラゲ緑色蛍光タンパク質を発現するVSVΔ51の組換え誘導体である。VSVΔ51-Flucは、蛍ルシフェラーゼを発現する。糖タンパク質をコードする遺伝子を欠失したVSVΔ51(VSVΔ51ΔG)を、Lipofectamine 2000(Invitrogen社)を使用してpMD2-GをトランスフェクトしたHEK293T細胞中で増殖させた。VSVΔ51-TNFα構築物を生成するために、完全長ヒトTNFα遺伝子を、Gウイルス遺伝子とLウイルス遺伝子との間に挿入した。全てのVSVΔ51ウイルスを、スクロースクッション上で精製した。Maraba-MG1、VVDD-B18R-、レオウイルス及びHSV1 ICP34.5を、以前に記載されたように生成した(Brun, J.ら、Identification of genetically modified Maraba virus as an oncolytic rhabdovirus. Mol Ther 18、1440〜1449頁(2010); Le Boeuf, F.ら、Synergistic interaction between oncolytic viruses augments tumor killing. Mol Ther 18、888〜895頁(2011); Lun, X.ら、Efficacy and safety/toxicity study of recombinant vaccinia virus JX-594 in two immunocompetent animal models of glioma. Mol Ther 18、1927〜1936頁(2010))。GFPを発現する、又はGFPとドミナントネガティブIKKβとを同時発現するアデノウイルスベクターの生成は、以前に記載された通りで
あった。
in vitro生存能力アッセイ
細胞株を、96ウェルプレート中に播種し、一晩インキュベートした。細胞を、ビヒクル(0.05%DMSO)又は5μMのLCL161で処理し、示されたMOIのOVに感染させるか、又は250U/mLのIFNβ、500U/mLのIFNα、500U/mLのIFNγ、10ng/mLのIL28、若しくは10ng/mLのIL29で48時間処理した。細胞生存能力を、アラマーブルー(レサズリンナトリウム塩(Sigma社))によって決定し、データをビヒクル処理に対して正規化した。選択されたサンプルサイズは、生存能力アッセイのために同様の分析を使用した以前の報告と一致する。併用係数について、細胞を一晩播種し、固定された混合比のVSVΔ51及びLCL161(5000:1、1000:1及び400:1の比のPFU VSVΔ51:μM LCL161)の連続希釈液で48時間処理し、細胞生存能力をアラマーブルーによって評価した。併用係数(CI)を、Calcusynを使用するChou及びTalalayの方法に従って算出した(Chou, T. C. & Talaly, P. A simple generalized equation for the analysis of multiple inhibitions of Michaelis-Menten kinetic systems. J Biol Chem 252、6438〜6442頁(1977))。n=3の生物学的複製物を使用して、統計的尺度(平均と標準偏差又は標準誤差)を決定した。
拡散アッセイ
786-0細胞の集密単層を、完全培地中、0.7%アガロースで覆った。ウェルの中央のアガロースオーバーレイ中にピペットで小さい穴を作り、そこに5×103PFUのVSVΔ51-GFPを投与した。ビヒクル又は5μMのLCL161を含有する培地を、オーバーレイの頂部に添加し、細胞を4日間インキュベートし、蛍光画像を獲得し、細胞をクリスタルバイオレットで染色した。
脾細胞同時培養
EMT6細胞をマルチウェルプレート中で培養し、未分画の脾細胞を含有する細胞培養挿入物で覆った。簡単に述べると、単一細胞懸濁液を、マウス脾臓を70μmのナイロンメッシュに通すことによって取得し、赤血球をACK溶解バッファーで溶解した。脾細胞を、1μMのLCL161の存在下に置く前に、0.1MOIのVSVΔ51ΔG、1μg/mLのポリ(I:C)、1μg/mLのLPS、2μMのイミキモッド、又は0.25μMのCpGのいずれかで24時間処理した。EMT6細胞の生存能力を、クリスタルバイオレット染色によって決定した。n=3の生物学的複製物を使用して、統計的尺度(平均、標準偏差)を決定した。
サイトカイン応答性バイオアッセイ
細胞を、示されたMOIのVSVΔ51に24時間感染させ、細胞培養上清をUV光に1時間曝露して、VSVΔ51粒子を不活化した。続いて、UVで不活化された上清を、5μMのLCL161の存在下でナイーブ細胞に48時間加えた。細胞生存能力を、アラマーブルーによって評価した。n=3の生物学的複製物を使用して、統計的尺度(平均、標準偏差)を決定した。
顕微鏡観察
カスパーゼ3/7活性化を測定するために、5μMのLCL161、示されたMOIのVSVΔ51、及び5μMのCellPlayer Apoptosisカスパーゼ3/7試薬(Essen Bioscience社、Ann Arbor、USA)を細胞に添加した。細胞を、10X対物レンズ及び位相コントラストを備えたIncuCyte Zoom顕微鏡を装備したインキュベータ中に入れ、48時間のスパンで蛍光画像を獲得した。或いは、細胞を、5μMのLCL161及び0.1MOIのVSVΔ51-GFP及びSMCで36時間処理し、Magic Red Caspase-3/7 Assay Kit(ImmunoChemistry Technologies社、Bloomington、USA)で標識した。アポトーシス細胞の割合を測定するために、1μg/mLのAnnexin V-CF594(Biotium社、Hayward、USA)及び0.2μMのYOYO-1(Invitrogen社)を、SMC及びVSVΔ51処理細胞に添加した。画像を、IncuCyte Zoomを使用して処置の24時間後に獲得した。蛍光シグナルの計数を、IncuCyte Zoomソフトウェア内の統合対象計数アルゴリズムを使用して加工した。n=12(カスパーゼ3/7)又はn=9(Annexin V、YOYO-1)の生物学的複製物を使用して、統計的尺度(平均、標準偏差)を決定した。
複数工程の増殖曲線
細胞を、ビヒクル又は5μMのLCL161で2時間処理した後、示されたMOIのVSVΔ51に1時間感染させた。細胞をPBSで洗浄し、細胞にビヒクル又は5μMのLCL161を補給し、37℃でインキュベートした。アリコートを示された時間で取得し、ウイルス力価を、アフリカミドリザルVERO細胞を使用する標準的なプラークアッセイによって評価した。
ウェスタンイムノブロッティング
細胞を擦り取り、遠心分離によって収集し、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche社、Laval、Canada)を含有するRIPA溶解バッファー中で溶解した。等量の可溶性タンパク質をポリアクリルアミドゲル上で分離した後、ニトロセルロース膜に転写した。個々のタンパク質を、以下の抗体: Cell Signalling Technology社(Danvers、USA)からのpSTAT1 (9171)、カスパーゼ-3 (9661)、カスパーゼ-8 (9746)、カスパーゼ-9 (9508)、DR5 (3696)、TNF-R1 (3736)、cFLIP (3210)、及びPARP (9541); Enzo Life Sciences社(Farmingdale、USA)からのカスパーゼ-8 (1612); Abcam社(Cambridge、USA)からのIFNAR1 (EP899)及びTNF-R1 (19139); Invitrogen社からのカスパーゼ-8 (AHZ0502); Alexis Biochemicals社(Lausen、Switzerland)からのcFLIP (クローンNF6); BD Biosciences社(Franklin Lakes、USA)からのRIP1 (クローン38);並びにDevelopmental Studies Hybridoma Bank社(Iowa City、USA)からのE7を使用するウェスタンイムノブロッティングによって検出した。本発明者らのウサギ抗ラットIAP1及びIAP3ポリクローナル抗体を使用して、それぞれ、ヒト及びマウスのcIAP1/2及びXIAPを検出した。AlexaFluor680(Invitrogen社)又はIRDye800(Li-Cor、Lincoln、USA)を使用して、一次抗体を検出し、赤外蛍光シグナルを、Odyssey Infrared Imaging System (Li-Cor)を使用して検出した。
RT-qPCR
全RNAを、RNAEasy Mini Plusキット(Qiagen社、Toronto、Canada)を使用して細胞から単離した。2工程のRT-qPCRを、Mastercycler ep realplex(Eppendorf社、Mississauga、Canada)上でSuperscript III(Invitrogen社)及びSsoAdvanced SYBR Greenスーパーミックス(BioRad社、Mississauga、Canada)を使用して実施した。全てのプライマーを、realtimeprimers.comから取得した。n=3の生物学的複製物を使用して、統計的尺度(平均、標準偏差)を決定した。
ELISA
細胞を、示されたMOIでウイルスに感染させたか、又はIFNβで24時間処理し、明澄化された細胞培養上清を、Amicon限外濾過ユニットを使用して濃縮した。サイトカインを、TNFα Quantikine高感度、TNFα DuoSet、TRAIL DuoSet(R&D Systems社、Minneapolis、USA)及びVeriKine IFNβ(PBL Interferonsource社)アッセイキットを用いて測定した。n=3の生物学的複製物を使用して、統計分析を決定した。
EMT6乳腺腫瘍モデル
1×105個の野生型EMT6又は蛍ルシフェラーゼタグ付きEMT6(EMT6-Fluc)細胞を、6週齢のメスBALB/cマウスの乳腺脂肪体に注射することにより、乳腺腫瘍を確立した。触診可能な腫瘍(約100mm3)を有するマウスを、ビヒクル(30%の0.1M HCl、70%の0.1M NaOAc、pH4.63)又は50mg/kgのLCL161(経口)で、及びPBS又は5×108PFUのVSVΔ51のi.v.注射で、2週間にわたって週に2回、同時処置した。ポリ(I:C)25及びSMC処置のために、動物を週に2回、LCL161で処置し、BSA(i.t.)、20μgのポリ(I:C)(i.t.)又は2.5mg/kgのポリ(I:C)(i.p.)で週に4回処置した。SMC及びCpG群に、2mg/kgのCpG(i.p.)を注射し、次の日、CpG及びSMC処置を行った。CpG及びSMC処置を、4日後に繰り返した。処置群を、ケージごとに割り当て、各群は統計的尺度(平均、標準誤差;ログランク分析を用いるカプラン-マイヤー)について最小でn=4〜8を有していた。サンプルサイズは、がん処置後に腫瘍増殖及びマウス生存を検査した以前の報告と一致する。盲検は不可能であった。腫瘍が腹腔内で転移したか、又は腫瘍負荷が2000mm3を超えた時、動物を安楽死させた。腫瘍体積を、(π)(W)2(L)/4(式中、W=腫瘍の幅であり、L=腫瘍の長さである)を使用して算出した。腫瘍の生物発光イメージングを、4mgのルシフェリン(Gold Biotechnology社、St.Louis、USA)のi.p.注射後、Xenogen 2000 IVIS CCD-カメラシステム(Caliper Life Sciences社、Massachusetts、USA)を用いて捕捉した。
HT-29皮下腫瘍モデル
3×106個のHT-29細胞を、6週齢のメスのCD-1ヌードマウスの右脇腹に注射することによって、皮下腫瘍を確立した。触診可能な腫瘍(約200mm3)を、PBS又は1×108PFUのVSVΔ51の5回の腫瘍内注射(i.t.)で処置した。4時間後、マウスにビヒクル又は50mg/kgのLCL161を経口投与した。処置群をケージごとに割り当て、各群は統計的尺度(平均、標準誤差;ログランク分析を用いるカプラン-マイヤー)について最小でn=5〜7を有していた。サンプルサイズは、がん処置後に腫瘍増殖及びマウス生存を検査した以前の報告と一致する。盲検は不可能であった。腫瘍負荷が2000mm3を超えた時、動物を安楽死させた。腫瘍体積を、(π)(W)2(L)/4(式中、W=腫瘍の幅であり、L=腫瘍の長さである)を使用して算出した。
全ての動物実験を、Canadian Council on Animal Careによって確立された指針に従って、University of Ottawa Animal Care and Veterinary Serviceの認可と共に行った。
抗体媒介性サイトカイン中和
in vitroでTNFαシグナル伝達を中和するために、25μg/mLのα-TNFα(XT3.11)又はアイソタイプ対照(HRPN)を、EMT6細胞に1時間にわたって添加した後、LCL161とVSVΔ51又はIFNβとで48時間同時処理した。生存能力を、アラマーブルーによって評価した。EMT6-Fluc腫瘍モデルにおいてTNFαを中和するために、0.5mgのα-TNFα又はα-HRPNを、埋込みの8、10及び12日後に投与した。マウスを、埋込みの8、10及び12日後に50mg/kgのLCL161(p.o.)で処置し、9、11及び13日目に5×108PFUのVSVΔ51をi.v.により感染させた。I型IFNシグナル伝達の中和のために、2.5mgのα-IFNAR1(MAR1-5A3)又はアイソタイプ対照(MOPC-21)を、EMT6腫瘍担持マウスに注射し、50mg/kgのLCL161(p.o.)で20時間処置した。マウスに、5×108PFUのVSVΔ51(i.v.)を18〜20時間感染させ、腫瘍をウェスタンブロッティングのために加工した。全ての抗体は、BioXCell社(West Lebanon、USA)からのものであった。
フローサイトメトリー及び選別
EMT6細胞を、0.1MOIのVSVΔ51-GFP及び5μMのLCL161で20時間同時処理した。細胞をトリプシン処理し、CytoFix/CytoPermキット(BD Biosciences社)を用いて透過処理し、APC-TNFα(MP6-XT22)(BD Biosciences社)で染色した。細胞を、Cyan ADP 9フローサイトメーター(Beckman Coulter社、Mississauga、Canada)上で分析し、データをFlowJo(Tree Star社、Ashland、USA)を用いて分析した。
脾細胞を、EasySep CD11b陽性選択キット(StemCell Technologies社、Vancouver、Canada)を使用してCD11bについて富化した。CD49+細胞を、EasySep CD49b陽性選択キット(StemCell Technologies社)を使用して、CD11b-画分から富化した。CD11b+細胞を、F4/80-PE-Cy5(BM8、eBioscience社)及びGr1-FITC(RB6-8C5、BD Biosciences社)で染色し、MoFlo Astrios(Beckman Coulter社)を用いて更に選別した。フローサイトメトリーデータを、Kaluza(Beckman Coulter社)を使用して分析した。単離された細胞を、VSVΔ51に24時間感染させ、明澄化された細胞培養上清を、5μMのLCL161の存在下で24時間、EMT6細胞に加えた。
骨髄由来マクロファージ
マウスの大腿骨及び橈骨を取り出し、洗い流して骨髄を取り出した。細胞を、8%FBS及び5ng/mlのM-CSFを含むRPMI中で7日間培養した。フローサイトメトリーを使用して、マクロファージ(F4/80+CD11b+)の純度を確認した。
免疫組織化学
切除された腫瘍を、4%PFA中で固定し、OCT化合物と30%スクロースの1:1混合物中に包埋し、12μmで、クリオスタット上で切片化した。切片を、ブロッキング溶液(50mM Tris-HCl pH7.4、100mM L-リシン、145mM NaCl及び1%BSA、10%ヤギ血清)中の0.1%Triton X-100を用いて透過処理した。α-切断されたカスパーゼ3(C92-605、BD Pharmingen社、Mississauga、Canada)及びポリクローナル抗血清VSV(Dr.Earl Brown、University of Ottawa、Canada)を一晩インキュベートした後、AlexaFluor結合二次抗体(Invitrogen社)と共に二次インキュベートした。
統計分析
カプラン-マイヤー生存プロットの比較を、ログランク分析により行い、その後、ペアワイズ多重比較を、ホルム-シダック法(SigmaPlot社、San Jose、USA)を使用して実施した。EC50値の算出を、正規化非線形回帰分析を使用してGraphPad Prism中で実施した。VSVΔ51によって感染したビヒクル処理細胞のlog10 EC50から、SMC処理及びVSVΔ51感染細胞のlog10 EC50を差し引くことにより、EC50のシフトを算出した。SMC相乗作用の程度を正規化するために、EC50値を100%に正規化して、SMC処理のみによって誘導された細胞死を相殺した。
(実施例3)
SMC含有免疫療法は抗骨髄腫活性を示す
免疫チェックポイント遮断剤は、SMC処置と相乗作用して、MMにおける疾患進行を遅延させる
ルシフェラーゼトランスジーンを安定に発現するMPC-11細胞を、静脈内注射によってBALB/cマウスに埋め込んだ。このin vivo MMモデルは、ヒト疾患を良好に模倣し、予測できる疾患進行に従う。MPC-11細胞は、マウス形質細胞腫から得られる。SMC及びPD-1又はCTLA-4に対するモノクローナル抗体による2ラウンドの処置後、抗PD-1抗体に基づく処置のみが、疾患進行の遅延に関して応答を示した。抗PD-1抗体とSMCとの組合せで処置されたマウスは、最良の応答を示し、発光シグナルによって決定した場合、腫瘍負荷はほぼなかった(図35)。この組合せはまた、対照群(p=0.01)と比較して、また、PD-1処置のみ(p=0.0163)と比較して、マウスの生存を有意に延長させた。
1型インターフェロンはSMCと相乗作用してMM細胞死を引き起こす
SMCと組み合わせた様々なサイトカインの効果を試験するin vitroでの研究は、1型IFNの潜在能力を強調した。具体的には、IFNα及びIFNβは、試験した多くの細胞株において、SMCとのMM細胞の非常に強力な相乗作用的殺傷を示した(図36A)。同じMPC-11マウスモデルを使用して、マウスを、3つの異なる時点で組換えIFNα及びSMCで処置した(図37)。
腫瘍溶解性ウイルスはSMCと相乗作用してMM細胞死を引き起こす
水疱性口内炎ウイルスに由来する腫瘍溶解性ウイルス、VSVΔ51は、in vitroでSMCと良好に相乗作用して、MPC-11細胞中で細胞死を引き起こす(図36B及び図36C)。SMCを含有する組合せも、MPC-11同系マウスモデルにおいて試験した。組合せ処置は、VSVΔ51単独ほど有効に腫瘍負荷を減少させず、マウスによって良好に許容されなかった。VSVΔ51単独の処置は、疾患進行を遅延させたが、生存の増加は未処置対照群と比較して有意であった(p=0.0379、ログランク分析)(図38)。
SMCは標準的なMM治療剤と相乗作用する
in vitroでの生存能力アッセイにより、合成糖質コルチコイドであるデキサメタゾン(Dex)とのSMCに基づく組合せにおけるMM細胞の相乗作用的細胞殺傷が示された(図39B)。SMCを糖質コルチコイド受容体アンタゴニストRU486と組み合わせた場合、同等のレベルの細胞死が存在し、相乗作用が、GCRの活性化に起因するものではなく、むしろNF-κBに対するその阻害効果に起因することを示唆している。
SMCに基づく組合せ処置はNF-κBシグナル伝達を活性化し、MM細胞におけるアポトーシスを引き起こす
SMC処置は、cIAP1及びcIAP2の急速な分解を有効に引き起こした(図40A)。単剤として、SMC処置はNF-κBシグナル伝達を増加させた;リン酸化p65のp65に対するより高い比によって示されるように、古典的経路におけるわずかな短期ブーストから始まり、次いで、長く減少する(図40B)。古典的経路の活性化が衰えるにつれて、p52のp100に対する比の増大によって示されるように、代替NF-κB経路が非常に強く活性化された(図40C)。細胞中でのアポトーシスは、切断されたポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(PARP)の存在によって確認された。PARPの切断は、それが初期段階のアポトーシスにおけるカスパーゼの基質であるため、アポトーシスマーカーとしてよく使用される。
SMCと、IFNβ(図41)又はVSVΔ5若しくはVSVmIFN(マウスIFNβのための挿入遺伝子を含有する)(図42)との組合せは、SMC処置のみと同じ特徴の多くを有していた。例えば、古典的経路は、最終的に下方調節され、代替経路は上方調節された。また、PARP切断とカスパーゼ8切断との両方によって示されるように、アポトーシスもあった。IFN受容体、IFNAR1も、IFN処置と共に下方調節されたが、それがIFNβに対する継続的応答にとって必要であるため、興味深い。VSV処置を用いた場合、RIP1は遅い時点でほぼ完全に分解された;リポプトソームが形成される後にカスパーゼ8によってそれは分解されるため、これはアポトーシスの更に別のシグナルである。
MM1R及びMM1SにおけるSMCに対する感度は糖質コルチコイド受容体発現と関連する
SMC媒介性細胞死に対する応答性は、同じ親細胞株に由来し、GCRの発現においてのみ異なる、関連するヒトMM細胞株MM1RとMM1Sの間で劇的に変化する。GCRの検出可能な発現を示さなかったMM1R(図39A)は、SMCに対して非常に感受性である(図39C)が、高いGCR発現を有するMM1Sは耐性である。MM1Sは、Dex、又はGCRアンタゴニストRU486で処置された場合、SMC処置に対して感受性になり得る(図39B)。
先天性免疫刺激剤は適応免疫応答の阻害剤を上方調節する
ヒトMM細胞株U266、MM1R及びMM1Sは、IFNβ処理に応答してPD-L1を強力に上方調節した。SMCとIFNβとの組合せに関しても同等の上方調節が見られた。PD-1のための他のリガンド、PD-L2も、IFNβに基づく処理と共に同様に上方調節された。この効果は、両タンパク質に関して早い時点と遅い時点の両方において顕著であった(図43)。これは、I型IFNを活性化する任意の免疫刺激剤がT細胞同時阻害分子の上方調節をもたらすことを示唆する。
SMCと免疫調節剤との組合せは、CD8+T細胞も含むがん細胞死をもたらす
図44A及び図44Bは、二重処置され、治癒したマウスの乳腺脂肪体にEMT6細胞を再注射した(初回の埋込み日から180日)か、又はCT-2A細胞を頭蓋内に再注射した(初回の埋込み日から190日)実験に由来するデータを示すグラフである。図44Cは、CT-2A神経膠腫又はEMT6乳がん細胞をトリプシン処理し、コンジュゲート化されたアイソタイプ対照IgG又は抗PD-L1で表面染色し、フローサイトメトリーのために加工した実験に由来するデータを示すグラフである。図44Dは、CD8+T細胞を、CD8 T細胞陽性磁気選択キットを使用して脾細胞(ナイーブマウス又はEMT6腫瘍が以前に治癒したマウス)から富化し、IFNγ及びグランザイムBの検出のためにELISpotアッセイにかけた実験に由来するデータを示すグラフである。CD8+T細胞を、培地又はがん細胞(がん細胞のCD8+T細胞に対する比は12:1)及び10mgの対照IgG又は抗PD-1と共に48時間同時培養した。3匹のマウスを、独立した生物学的複製物(EMT6腫瘍が以前に治癒したもの)として使用した。4T1及びEMT6細胞は同じ主要組織適合抗原を担持するため、4T1細胞を陰性対照として用いた。
SMCは、がんの同所性マウスモデルにおいて免疫チェックポイント阻害剤と相乗作用する
図45Aは、EMT6乳腺腫瘍を担持するマウスを、PBS又は1×108PFUのVSVD51を用いて腫瘍内で1回処置し、5日後、マウスをビヒクル又は50mg/kgのLCL161(SMC)(経口)と、250mgの抗PD(腹腔内(i.p.))との組合せで処置したデータを示すグラフである。図45B及び図45Cは、頭蓋内CT-2A又はGL261腫瘍を担持するマウスを、ビヒクル又は75mg/kgのLCL161(経口)及び250mg(i.p.)の対照IgG、抗PD-1又は抗CTLA-4で4回処置したデータを示すグラフである。図45Dは、CT-2A頭蓋内腫瘍を担持する無胸腺CD-1ヌードマウスを、75mg/kgのLCL161(経口)及び250mg(i.p.)の抗PD-1で処置したデータを示すグラフである。
(実施例4)
Smac模倣物質は免疫チェックポイント阻害剤と相乗作用して、腫瘍免疫を促進する
細胞培養
RPMI-8226、U266、MM1R、MM1S、MPC-11細胞株を、ATCC社から獲得した。MPC-11を、10%FBS(Hyclone社)を含むDMEM(Hyclone社)中で培養し、U266を、15%FBSを含むRPMI-1640(Hyclone社)中で培養し、他の全ての細胞株を、10%FBSを含むRPMI-1640中で培養した。
細胞を、10%熱不活化ウシ胎仔血清及び1%非必須アミノ酸(Invitrogen社)を添加したDMEM培地中、37℃及び5%CO2で維持した。以下: SNB75 (Dr. D. Stojdl, Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute)及びSF539 (UCSF Brain Tumor Bank社)を除いて、全ての細胞株をATCC社から取得した。一次NF1-/+p53-/+細胞は、C57Bl/6J p53+/-/NF1+/-マウスに由来するものであった。細胞株を、マイコプラズマ汚染について規則的に試験した。BTICを、EGF及びFGF-250を添加した無血清培養培地中で培養した。siRNAトランスフェクションのために、製造業者のプロトコールに従って、細胞にLipofectamine RNAiMAX(Invitrogen社)を48時間逆トランスフェクトした。細胞株を、マイコプラズマ汚染について規則的に試験した。BTICを、EGF及びFGF-2を添加した無血清培養培地中で培養した。siRNAトランスフェクションのために、製造業者のプロトコールに従って、細胞にLipofectamine RNAiMAX(Invitrogen社)を48時間逆トランスフェクトした。
抗体及び試薬
in vivo: LCL161はNovartis社からの惜しみない贈り物であった。抗PD-1(クローンJ43)を、BioXcell社から購入した。ポリ(I:C)(HMWワクチングレード、Invivogen社)。IFNα(in vivoでの使用のため)は、ドイツのDr. Peter Staeheliからの惜しみない贈り物であった。ビリナパントはTetralogic Pharmaceuticals社から入手した。
in vitro: IFNを、PBL assay science社から取得した。デキサメタゾン及びRU486を、Sigma Aldrich社から購入した。
使用した抗体は、RIAP1 (社内)、PD-L1 (Abcam社)、PD-L2 (R&D Systems社)、GCR (Santa Cruz社)、P100 (Cell Signalling社)、P65 (cell signalling社)、p-P65 (cell signalling社)、IFNAR1 (Abcam社)、PARP (Cell Signalling社)、チューブリン(Developmental Studies Hybridoma Bank社)、RIP1 (R&D Systems社)、カスパーゼ8 (R&D Systems社)を含む。
AT-406、GDC-0917、及びAZD-5582を、Active Biochem社から購入した。TNF-αを、Enzo社から購入した。IFN-βを、PBL Assay Science社から取得した。広域宿主IFN-αB/Dを、酵母中で産生させ、アフィニティクロマトグラフィーによって精製した。非標的siRNA又はcFLIPを標的とするsiRNAを、Dharmacon社(ON-TARGETplus SMARTプール)から取得した。高分子量ポリ(I:C)を、Invivogen社から取得した。
動物実験
4〜5週齢のBALB/cマウスを、Charles River社から購入し、蛍ルシフェラーゼ(Fluc)トランスジーンを安定に発現する、1×106個のMPC-11 Fluc細胞をIV注射した。処置は、50mg/kgのLCL161、250μgの抗PD-1抗体、250μgの抗CTLA-4抗体、25μgのポリ(I:C)、5×108pfuのVSVΔ51、1μgのIFNαを含む。発光を測定するために200μLのルシフェリンをIP注射した後、マウスのイメージングを、in vivoイメージングシステムIVISを用いて行った。
ウイルス
Indiana血清型のVSVを、この試験において使用した。VSV-EGFP、VSVΔ51(M遺伝子中でアミノ酸51を欠く)及びMaraba-MG1を、Vero細胞中で増殖させ、OptiPrep勾配上で精製した。糖タンパク質をコードする遺伝子を欠失したVSVΔ51(VSVΔ51ΔG)を、Lipofectamine 2000(Invitrogen社)を使用してpMD2-GをトランスフェクトしたHEK293T細胞中で増殖させ、スクロースクッション上で精製した。XL-1000 UV架橋剤(Spectrolinker社)を使用して、VSV-EGFPをUV(250mJ cm-2)に曝露することによって、NRRPを生成した。
in vitroでの生存能力アッセイ
細胞株を96ウェルプレート中に播種し、一晩インキュベートした。細胞をビヒクル(0.05%DMSO)又はLCL161で処理し、示されたMOIのウイルスに感染させたか、又は1μg/mLのIFN-αB/D、0.1ng/mLのTNF-α、又は示されたNRRPで48時間処理した。細胞生存能力を、アラマーブルー(レサズリンナトリウム塩(Sigma社))によって決定し、データをビヒクル処理に対して正規化した。統計学的方法を使用してサンプルサイズを決定しなかったが、選択されたサンプルサイズは、生存能力アッセイのために同様の分析を使用した以前の報告と一致する。
ウェスタンブロッティング
細胞を擦り取り、遠心分離によって収集し、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche社)を含有するRIPA溶解バッファー中で溶解した。腫瘍を切除し、ミンチし、上記のように溶解した。等量の可溶性タンパク質を、ポリアクリルアミドゲル上で分離した後、ニトロセルロース膜に転写した。個々のタンパク質を、cFLIP(7F10、1:500、Alexis Biochemicals社)及びβ-チューブリン(1:1000、E7、Developmental Studies Hybridoma Bank社)を使用するウェスタンブロッティングによって検出した。ウサギ抗ラットIAP1及びIAP3ポリクローナル抗体を使用して、ヒト及びマウスcIAP1/2及びXIAPをそれぞれ検出した（1:5000、Cyclex Co.社）。AlexaFluor680(Invitrogen社)又はIRDye800(Li-Cor)(1:2500)を使用して、一次抗体を検出し、赤外蛍光シグナルを、Odyssey Infrared Imaging System(Li-Cor)を使用して検出した。完全長ブロットを、図68A〜図68Dに示す。
ELISA
in vivoでのTNF-αの検出のために、マウスを50μgのポリ(I:C)で腹腔内(i.p.)に、又は5×108PFUのVSVΔ51で静脈内(i.v.)に処置した。EDTA非含有プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche社)を添加した、20mM HEPES-KOH(pH7.4)、150mM NaCl、10%グリセロール及び1mM MgCl2中で、脳を均一化した。NP-40を、0.1%の最終濃度で添加し、遠心分離によって明澄化した。等量を、TNF-α Quantikineアッセイキット(R&D Systems社)を用いるTNF-αの検出のために加工した。
適応免疫応答の特異度を評価するために、SMCと抗PD-1抗体との処置によってCT-2A腫瘍が治癒したマウス及び週齢一致対照(ナイーブ)C57BL/6メスマウスに、1×106個のCT-2A細胞を皮下に注射した。7日後、脾細胞を単離し、ビヒクル若しくは5μMのSMC又は20μg/mLの示された抗体の存在下で、CT-2A細胞と共に48時間同時培養した(脾細胞のがん細胞に対する比20:1)。IFN-γ、GrzB、TNF-α、IL-17、IL-6、及びIL-10の分泌を、ELISAによって決定した(キットはR&D Systems社からのものである)。
CT-2A及びGL261脳腫瘍モデル
メスの5週齢C57BL/6又はCD-1ヌードマウスを、イソフルランで麻酔し、手術部位の毛を剃り、70%エタノールで準備した。5×104個の細胞を、以下の座標:0.5mm前部、ブレグマから2mm側部、及び3.5mm深部に1分かけて左線条体に10μLの容量で定位的に注射した。皮膚を、外科用接着剤を使用して閉じた。マウスを、ビヒクル(30%の0.1M HCl、70%の0.1M NaOAc pH4.63)又は75mg/kgのLCL161で経口的に、10μL中の50μgのポリ(I:C)で腫瘍内に(i.t.)、5×108のVSVΔ51で静脈内(i.v.)に、又は250μgの抗CD4抗体(GK1.5)、抗CD8抗体(YTS169.4)、抗PD1抗体(J43)、若しくはCTLA-4(9H10)で腹腔内(i.p.)に処置した。
ビリナパントを用いる処置のために、マウスを、ビヒクル(12.5%Captisol)又は30mg/kgのビリナパント(i.p.)で処置した。一部の事例では、動物を、抗IFNAR1抗体(MAR1-5A3)、抗IFN-γ抗体(R4-6A2)又は抗TNF-α抗体(XT3.11)で処置した。アイソタイプ対照IgG抗体を、適切に使用した:BE0091、BE0087、BP0090、MOPC-21、又はHPRN。全ての中和抗体及び対照抗体は、BioXCell社製であった。SMC及びI型IFNの頭蓋内同時処置のために、マウスに、ビヒクル(0.5%DMSO)、100μMのLCL161、0.01%BSA、又は1μgのIFN-αB/Dの組合せの10μLをi.t.で注射した。或いは、マウスを、ビヒクル又は75mg/kgのLCL161で経口的に、及び1μgのIFN-αB/D(i.p.)で処置した。動物が神経障害の所定の兆候(歩き回ることができない、20%を超える体重減少、不活発、猫背の姿勢)を示した場合、動物を安楽死させた。処置群を、ケージごとに割り当て、各群は統計的尺度(ログランク分析を用いるカプラン-マイヤー)のために5〜9匹のマウスを有していた。無作為化はなく、調査主任は群の割り当てに対して盲検であった。
統計学的方法を使用してサンプルサイズを決定しなかったが、サンプルサイズは、がん処置後の腫瘍増殖及びマウス生存を検査した以前の報告と一致する。
MRI
ライブマウス脳MRIを、7 Tesla GE/Agilent MR 901を使用して、University of Ottawa前臨床イメージングコアで実施した。マウスを、イソフルランを使用してMRI手順のために麻酔した。2D高速スピンエコーシーケンス(FSE)パルスシーケンスを、以下のパラメータ:15の所定のスライス、スライス厚さ=0.7mm、スペーシング=0mm、視野=2cm、マトリックス=256×256、エコー時間=25ms、反復時間=3,000ms、エコー訓練長=8、バンド幅=16kHz、1平均、及び脂肪飽和を用いて、イメージングのために使用した。FSEシーケンスを、約5分の合計イメージング時間のために、横断面と前頭面の両方において実施した。
EMT6乳腺腫瘍モデル
5週齢のメスのBALB/cマウスの乳腺脂肪体に1×105個のEMT6細胞を注射することにより、乳腺腫瘍を確立した。触診可能な腫瘍(約100mm3)を有するマウスを、ビヒクル(30%の0.1M HCl、70%の0.1M NaOAc pH4.63)又は50mg/kgのLCL161で経口的に、及び5×108PFUのVSVΔ51のi.t.注射又は対照IgG(BE0091)若しくは抗PD-1抗体(J43)のi.p.注射で同時処置した。腫瘍が腹腔内に転移した場合、又は腫瘍負荷が2,000mm3を超えた場合、動物を安楽死させた。腫瘍体積を、(π)(W)2(L)/4(式中、W=腫瘍の幅であり、L=腫瘍の長さである)を使用して算出した。処置群をケージごとに割り当て、各群は統計的尺度(平均、標準誤差;ログランク分析を用いるカプラン-マイヤー)について4〜5匹のマウスを有していた。無作為化はなく、調査主任は群の割り当てに対して盲検であった。
MPC-11多発性骨髄腫モデル
1×106個のルシフェラーゼタグ付きMPC-11細胞(i.v.)をメスの4〜5週齢のBALB/cマウスに注射することによって、多発性骨髄腫及び形質細胞腫のマウスモデルを確立した。マウスを、ビヒクル(30%の0.1M HCl、70%の0.1M NaOAc pH4.63)又は75mg/kgのLCL161で経口的に、及び250μgの対照IgG又はα-PD-1抗体(i.p.)で処置した。4mgのルシフェリン(Gold Biotechnology社)のi.p.注射後、Xenogen 2000 IVIS CCD-カメラシステム(Caliper Life Sciences社)を用いて生物発光イメージングを捕捉した。処置群をケージごとに割り当て、各群は統計的尺度(ログランク分析を用いるカプラン-マイヤー)について3〜4匹のマウスを有していた。無作為化はなく、調査主任は群の割り当てに対して盲検であった。
腫瘍再チャレンジ
ナイーブの週齢一致したメスのC57BL/6マウス又は免疫刺激剤を用いるSMCに基づく組合せ処置により頭蓋内CT-2A腫瘍が以前に治癒したマウス(埋込み後、最小で180日)に、上記のようなCT-2A細胞をi.c.で又は5×105個の細胞を皮下に再注射した。ナイーブBALB/c又はSMCとVSVΔ51との組合せ処置でルシフェラーゼタグ付きEMT6乳腺腫瘍が以前に治癒したマウス(埋込み後、90〜120日)の脂肪体に、5×105個のタグなしEMT6細胞を再注射した。動物を、上記のように安楽死させた。盲検化又は無作為化は不可能であった。全ての動物実験を、Canadian Council on Animal Careによって確立された指針に従って、University of Ottawa Animal Care and Veterinary Serviceの認可と共に行った。
フローサイトメトリー
in vitroでの分析のために、細胞を、ビヒクル(0.01%DMSO)又は5μMのLCL161及び0.01%BSA、1ng/mLのTNF-α、250U/mLのIFN-β又は0.1MOIのVSVΔ51で24時間処理した。細胞を、酵素非含有解離バッファー(Gibco社)を用いてプレートから遊離させ、Zombie Green及び示された抗体で染色した。腫瘍免疫浸潤物の分析のために、頭蓋内CT-2A腫瘍を機械的に解離し、RBCをACK溶解バッファー中に溶解し、Zombie Green及び示された抗体で染色した。一部の事例では、ブレフェルジンAの存在下で5時間、5ng/mlのPMA及び500ng/mlのイオノマイシンで細胞を刺激し、BD Cytofix/Cytopermキットを使用して細胞内抗原を加工した。抗体は、Fc Block (101319, 1:500)、PD-L1(10F.9G2、1:250)、PD-L2 (TY25、1:100)、I-A/I-E (M5/114.15.2、1:200)及びH-2Kd/H-2Dd- (34-1-2S、1:200)、CD45 (30-F11、1:300)、CD3 (17A2、1:500)、CD4 (GK1.5、1:500)、CD8 (53-6.7,1:500)、PD-1 (29.1A12、1:200)、CD25 (PC61、1:150)、Gr1 (RB6-AC5、1:200)、F4/80 (BM8、1:200)、GrzB (GB11、1:150)及びIFN-γ(XMG1.2、1:200)を含む。BD Biosciences社製のTNF-α(MP6-XT22、1:200)及びCD11b(M1/70、1:100)を除いて、全ての抗体は、BioLegend社製であった。Cyan ADP9(Beckman Coulter社)又はBD Fortessa(BD Biosciences社)上で細胞を分析し、FlowJo(Tree Star)を用いてデータを分析した。
顕微鏡観察
10X対物レンズを装備したIncucyte Zoom顕微鏡を備えたインキュベータ中で、mKate2-CT-2A細胞の検出を実施した。Incucyte Zoomからの蛍光シグナルの計数を、Incucyte Zoomソフトウェア内の統合対象計数アルゴリズムを使用して加工した。
多重ELISA
SMCと抗PD-1抗体との組合せ処置後の血清タンパク質の検出を、フローサイトメトリーに基づく多重キット(Biolegend社からのLEGENDplex炎症パネル)によって分析した。階層分析を、Morpheus(https://software.broadinstitute.org/morpheus)を使用して決定した。
RT-qPCR
全RNAを、RNeasy mini prepキット(Qiagen社)を使用して細胞から抽出した。2工程のRT-qPCRを、Mastercycler ep realplex(Eppendorf社)上でiScript及びSsoAdvanced SYBR Greenスーパーミックス(BioRad社)を使用して実施した。qPCRを、PD-L1及びPD-L2プライマー(Qiagen社)並びにSIBR緑色試薬(Bio-Rad社)を用いて行った。対照としてRPL13Aを使用して、相対的発現をΔΔCtとして算出した。
サイトカイン及びケモカイン遺伝子のライブラリーパネルは、realtimeprimers.comからのものであった。条件化された各処置についてn=4を実施し、データを8つの異なる参照遺伝子に対して正規化し、それぞれのビヒクル及びIgGサンプルと比較した。データを、Morpheusを使用する階層分析によって分析した。
ELISpot
CD8磁気選択キット(Stemcell Technologies社)を使用して、メスの週齢一致ナイーブマウス又は頭蓋内CT-2A(埋込み後180日)又は乳腺EMT6腫瘍(埋込み後120日)が以前に治癒したマウスの脾細胞から、CD8+T細胞を富化した。IFN-γ又はグランザイムB ELISpotキット(R&D Systems社)を使用して、CD8+細胞を、がん細胞(CT-2A、LLCについては1:20、及びEMT6又は4T1細胞については1:12.5)と、及び10μg/mLのIgG(BE0091)又は抗PD-1抗体(J43)と48時間同時培養した。
統計
全ての動物試験について、MM細胞の埋込み後の日数から生存を算出し、カプラン-マイヤー曲線としてプロットした。これらのものから、ログランク検定を使用して、有意性を決定した。in vitroでの生存能力アッセイのために、誤差を標準偏差として提示する。その後のペアワイズ多重比較を、ホルム-シダック法(SigmaPlot)を使用して実施した。複数の処置群間の比較を、一元配置ANOVA、次いで、多重比較のための調整(GraphPad)と共に、ダネットの多重比較検定を使用するポストホック分析を使用して分析した。変動の推定値を、GraphPadを用いて分析した。処置対の比較を、両側t検定(GraphPad)によって分析した。
(実施例5)
グリア芽腫療法のための免疫刺激剤の組合せ
本発明者らは、培養及び一次グリア芽腫細胞株が、外因性TNF-α、腫瘍溶解性ウイルスVSVΔ51、又は感染性であるが、非複製性であるウイルスVSVΔ51ΔGと組み合わせた場合、SMCで殺傷されることを示す(図46A及び図46B)。本発明者らは、TNF-αと様々なSMCとの組合せを用いたグリア芽腫細胞の細胞死を観察したため、SMC、LCL161、及びTNF-α間の相乗作用効果が、この薬物クラス内では一般的現象であることを確認した(図47)。更に、本発明者らはまた、ヒト脳腫瘍開始細胞(BTIC)について、腫瘍溶解性ラブドウイルス、VSVΔ51又はMaraba-MG1を用いたSMC効能の促進も観察した(図46C)。複製する能力なしにその感染性及び免疫刺激特性を保持する、非複製性ラブドウイルス粒子(NRRP)は、SMCと相乗作用して、グリア芽腫細胞死を誘導することが同様に見出された。注目すべきことに、プロファイルされたがん細胞株の約50%のみが、SMCとTNF-α又はTNF関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)との組合せにおいて細胞死に対して感作される;大部分の耐性細胞株は、カスパーゼ8阻害剤、cFLIP(細胞性FLICE様阻害タンパク質)の下方調節と共に細胞死に対して更に感作される。これらの以前の知見と一致して、SMCと、TNF-α又はVSVΔ51ΔGとの組合せ処置に対して不応性である2つのグリア芽腫細胞株は、cFLIPのサイレンシングの際に殺傷された(図48A及び図48B)。対照的に、正常な二倍体ヒト線維芽細胞は、cFLIPの下方調節及び組合せ処置と共に細胞死に対して感作されなかった。これらの知見は、直接的なウイルス誘導性細胞溶解ではなく、IFN及び/又はサイトカイン応答が、グリア芽腫細胞のSMC誘導細胞死の原因となることを示唆する。
VSVΔ51は神経毒性であり、「免疫特権」を有する脳の微小環境及び血液脳関門(BBB)を横断する薬物の浸透に関する問題が依然として存在するため、本発明者らは、全身性及び頭蓋内免疫療法剤送達の効果を試験しようとした。頭蓋内CT-2A腫瘍の確立後(図49A及び図49B)、本発明者らは、SMC、LCL161の経口強制摂取による全身投与が、頭蓋内マウス腫瘍内で、その主要な標的タンパク質であるcIAP1及びcIAP2の一過的分解を引き起こすことができるかどうかを試験した。対照的に、本発明者らは、近隣の非腫瘍性脳組織中でも、非腫瘍担持マウス中の皮質又は小脳中でもcIAPの下方調節を観察しなかった(図51)。したがって、SMCは、BBBが損傷した脳内の腫瘍に到達する能力を有する。腹腔内(i.p.)に注射された合成TLR3アゴニストであるポリ(I:C)又は静脈内(i.v.)に投与された腫瘍溶解性ウイルスVSVΔ51等の、免疫刺激剤の全身投与は、非腫瘍担持マウスの血清及び脳中でサイトカインTNF-αの産生を誘導した。
頭蓋内CT-2Aグリア芽腫を担持するマウスを、SMC(経口強制摂取)、VSVΔ51(i.v.)m又はポリ(I:C)(頭蓋内、i.c.)で単独で処置した場合、マウス生存の延長は、この侵攻性がんについて最小であった(17%の生存率)(図51C)。しかしながら、全身性SMCと、免疫刺激誘発剤、VSVΔ51又はポリ(I:C)との組合せは、生存を有意に延長させ、それぞれ、71%又は86%のマウスについて永続的な治癒をもたらした。腫瘍(免疫の増強を回避するための外来タンパク質でタグ付けられていない)を、MRIによって埋込み後40日目にイメージングして、観察される処置の転帰を確認した。
ウイルス誘導性免疫効果は、部分的には、I型IFNによって媒介される。本発明者らは、CT-2A細胞が、in vitroでSMCと組換えIFN-αとの組合せに対して一部感受性であることを示す(図50A)。本発明者らは、SMCの頭蓋内投与が、CT-2A脳腫瘍においてIAPタンパク質の更により顕著な分解をもたらすことを観察した(図53)。in vivoでの試験のために、本発明者らは、広範囲の種の間で強力な抗ウイルス活性を示す、ヒトアイソフォームIFN-αB及びIFN-αDのハイブリッドからなる組換え型のIFN-αを使用した。SMCとIFN-αとの単回の同時投与は、マウスの生存を有意に延長させ、50%の永続的な治癒率をもたらした。長期生存マウスは、SMC、ポリ(I:C)又はIFN-αの単回又は組合せの頭蓋内処置に由来する明白な身体的又は行動的欠陥を示さなかった(図54)。更に、本発明者らは全身性VSVΔ51感染又はポリ(I:C)を用いる処置の際に脳内で頭蓋内TNF-αの一過的増加を観察したため、本発明者らは、SMC処置と同時の組換えIFN-αの全身投与が、CT-2Aグリア芽腫モデルにおいて有効であるかどうかを決定しようとした。SMCとVSVΔ51との組合せと同様、SMCの経口強制摂取と共にi.p.投与されたIFN-αの組合せは、55%のマウスにおいて永続的な治癒をもたらした(図50B)。これらの結果は、脳における一過的な炎症環境の存在が許容されることを示唆し、組合せ処置の投与の間接的な、及び他の直接的な(頭蓋内)経路が実現可能であり得ることを示している。
(実施例6)
治癒したマウスにおける長期腫瘍免疫の生成
先天性免疫系は、腫瘍細胞のSMC媒介性細胞死における中心的存在である。それにも拘わらず、このSMC組合せ手法における適応免疫系の寄与的な役割に関する根本的な疑問が残っている。更に、SMC処置と組み合わせた腫瘍溶解性ウイルス又は他の免疫刺激剤の提唱される使用の潜在的な落とし穴は、がん細胞上のチェックポイント阻害剤リガンドの発現の増加、それによる、腫瘍のCTL媒介性攻撃の無効化であり得る。フローサイトメトリー分析により、TNF-αによる処置ではなく、組換えI型IFNによる神経膠腫細胞の処置又はVSVΔ51による感染が、PD-L1及び主要組織適合複合体(MHC)Iマーカーの表面発現の増加をもたらすことが示された。更に、SMC処置によってこれらの腫瘍表面分子の発現に対して有意な影響はなかった(図52A及び図56)。
興味深いことに、SMC組合せ処置によって同所性EMT6乳腺癌が以前に治癒したマウスは、EMT6細胞を再チャレンジした場合、腫瘍生着に対して完全に耐性であった(図52B)。しかしながら、主要組織適合タンパク質を共有する、別の同系細胞株4T1は、これらの治癒したマウスから拒絶されなかった。本発明者らは、頭蓋内CT-2A腫瘍が治癒したマウスも、皮下又は頭蓋内に注射されたCT-2A細胞の腫瘍生着に対して耐性であることを見出した(図52C)。本発明者らは次に、ELISpotアッセイによって、治癒したマウスに由来するCD8 T細胞の細胞傷害能力を評価した。ナイーブマウスから単離された細胞ではなく、治癒したマウスに由来するCD8+T細胞の、CT-2A細胞による刺激は、IFN-γ及びグランザイムB(GrzB)産生の増強によって示されるように、特異的な反応性T細胞の存在を示した(図54A)。抗PD-1遮断抗体の含有は、IFN-γ及びGrzBの発現を更に増加させた。同様の結果は、EMT6腫瘍が治癒したマウスに関しても観察された(図44D)。まとめると、これらの結果は、SMC組合せ療法を使用する、ロバストで特異的な長期腫瘍免疫の生成を示唆する。
(実施例7)
免疫チェックポイント阻害剤はIAPアンタゴニストと相乗作用する
本発明者らは次に、免疫チェックポイント阻害剤又はICIとして知られる、がん免疫療法の現在のクラスが、SMC効能を増強することができるかどうかを調査した。マウスにおけるグリア芽腫のICI処置が、生存の少なくとも部分的な延長をもたらすことが最近報告されている。本発明者らは最初に、SMC処置が、CT-2A脳腫瘍内の浸潤免疫細胞のサブセットにおけるPD-1発現に影響するかどうかを決定しようとした。頭蓋内CT-2A腫瘍内の浸潤CD3+又はCD3+CD8+細胞のレベル間に統計的差異はなかったが、本発明者らは、免疫チェックポイント、PD-1を発現するCD3+及びCD3+CD8+細胞のロバストな増加を観察した(図54B及び図55)。主にCT-2A細胞である、CD25-細胞中でのPD-L1の発現の全体的増加があったが、その傾向は統計的有意性にまでは達しなかった(図54C)。
PD-1+CD8 T細胞のレベルの増加が、SMC効能に関する負の調節因子であるかどうかを決定するために、本発明者らは、グリア芽腫の2つのマウスモデルを使用して、SMCと組み合わせた、チェックポイント標的、PD-1並びにCTLA-4の遮断を評価した。抗PD-1抗体又は抗CTLA4抗体の全身投与は、それ自身に対して活性を示さなかった(図54D及び図54E)。対照的に、抗PD-1抗体とSMCとの組合せは、それぞれ、CT-2A及びGL261モデルにおいて、生存を有意に延長させ、71%及び33%の永続的な治癒率をもたらした。更に、SMCと組み合わせた場合、抗PD-1生物製剤は、CT-2Aモデルにおいて抗CTLA-4生物製剤よりも優れていた(71%対43%;図54D)。
SMCの2つの構造クラスが存在する:単量体及び二量体。単量体SMCは、IAPのBIRドメインに結合する単一の化学分子からなるが、二量体SMCは、IAPの協調的結合及び/又は係留を可能にするリンカーによって接続された2個のSMC分子からなる。臨床的に進行したSMCであるLCL161は、本発明者らの研究の多くの焦点であり、強力な単量体である。本発明者らは次に、別の臨床的に進行した二量体SMCが、グリア芽腫の処置のためにICIと同様に相乗作用するかどうかを評価しようとした。本発明者らは、抗PD-1抗体と二量体SMCであるビリナパントとで処置した場合、頭蓋内CT-2A腫瘍を担持するマウスの生存の有意な増加を観察した(図54F)。PD-1又はCTLA-4の組み合わせた遮断は、メラノーマを有する患者にとって有益であるため、本発明者らは、PD-1とCTLA-4との組合せがSMC療法を同様に有意に増強するかどうかを決定しようとした。PD-1及びCTLA-4を標的とする抗体の組合せは、がんのマウスモデルにおいて永続的な治癒を誘導するのに有効であり、本発明者らは、67%の全生存率を観察した(図54G)。驚くべきことに、SMC処置と、抗PD-1抗体及び抗CTLA-4抗体との含有により、100%の永続的な治癒率が得られた。
SMCとICIとの相乗効果は、脳腫瘍に限定されない。本発明者らはまた、MPC-11細胞を使用して、多発性骨髄腫の高侵攻性及び処置不応性モデルを担持するマウスの生存の有意な延長を観察した(図56A及び図56B)。乳腺EMT6腫瘍を担持するマウスにおいても、75%の永続的な治癒率が観察され、これは免疫刺激剤の含有によって100%に更に増加した(図57A〜図57C)。
(実施例8)
CD8+T細胞は、SMCとICIとの効能にとって必要である
細胞作用機序における最初の洞察を提供するために、本発明者らは、SMCと抗PD-1抗体との組合せ処置を使用して頭蓋内CT-2A腫瘍が治癒したマウスに由来する脾細胞と同時培養したCT-2A細胞からの免疫因子の産生をプロファイルした。本発明者らは、生存マウスに由来する脾細胞と同時培養したCT-2A細胞からのIFN-γ及びGrzBの産生の有意な増加を観察した(図58A及び図59A)。注目すべきことに、インターロイキン17(IL-17)の産生の増加があった。本発明者らはまた、IL-17はNF-κB経路を刺激することが以前に見出されていることを考慮して、前炎症性サイトカインIL-6及びTNF-αの発現の減少を観察したが、これは予想外であった。
しかしながら、治癒したマウスから単離された脾細胞からのIFN-γ及びIL-17の発現は、抗PD-1又はPD-L1処置で有意に増加したが、これは、T細胞に基づく免疫応答を、PD-1軸によるチェックポイント阻害の際に増大させることができることを示唆している。本発明者らは次に、この遺伝子応答がSMC処置によって影響されるかどうかを決定しようとした。以前に分析されたサイトカインのうち、抗PD-1遮断剤と共にこれらの同時培養物中へのSMCの含有は、IFN-γ、GrzB、IL-17、及びTNF-αの分泌を増加させた(図59B及び図59B)。注目すべきことに、上清中のIL-6のレベルは、SMC処置によって影響されなかった。更に、免疫抑制サイトカインIL-10は、SMCと抗PD-1との組合せ処置に関して分泌が減少する一般的傾向を有していた。
XIAP31-33及びTNFαによって部分的に遮断される細胞傷害性因子であるGrzBレベルの増加があるため、本発明者らは次に、グリア芽腫細胞と、ナイーブマウス又はCT-2A頭蓋内腫瘍が以前に治癒したマウスに由来する脾細胞との同時培養が、CT-2A細胞の細胞死をもたらすかどうかを評価した。様々な異なる構造のSMCを使用して、本発明者らは、SMCの存在下でCT-2A細胞の細胞死の統計的に有意な増加を見たが、この応答は抗PD-1抗体の含有と共に増加した(図59C)。
まとめると、これらの結果は、ICIとSMCとの組合せ処置を用いて、ロバストなエフェクターT細胞応答が惹起されることを示す。細胞性作用機序を更に解明するために、本発明者らは、特異的CD4又はCD8標的化抗体を使用して免疫細胞の枯渇を行った。本発明者らは、組合せ療法により誘導される71%の治癒率は、CD8+T細胞の枯渇時に完全に無効化されることを見出した(図59D)。興味深いことに、CD4+T細胞の枯渇は、SMCと抗PD-1抗体との組合せに関して100%の治癒率をもたらし、対照群においては17%の治癒率をもたらした。これらの結果は、CD4+免疫抑制細胞(調節性T細胞等)の除去が、腫瘍退縮の誘導を助けること、及びCD4+細胞が組合せ処置手法の効能にとって必要ではないことを示唆する。第2の手法において、頭蓋内CT-2A腫瘍を、機能的T細胞を欠くCD1ヌードマウス中で確立した後、抗PD-1抗体と、ビヒクル又はSMCとの組合せで処置した。SMCと抗PD-1抗体との組合せによって提供される生存利益は、これらのT細胞欠損マウスにおいては失われていた(図59E)。全体として、SMCと、抗PD-1抗体との相乗効果は、機能的な適応免疫応答に依存し、かくして、in vivoでの効能のための一次免疫細胞メディエータとしてCD8+T細胞を関与させる。
(実施例9)
SMC処置は腫瘍内免疫細胞浸潤に影響する
SMCとICI処置の間の相乗作用の免疫細胞的態様を理解するために、本発明者らは、グリア芽腫を担持するマウスの浸潤CD45+免疫細胞のプロファイルを評価した。これらの試験において、本発明者らは、抗PD-1抗体とSMCとの同時処置後に後期段階のグリア芽腫腫瘍中の浸潤免疫細胞を評価した(図61A)。腫瘍浸潤性T細胞のフローサイトメトリー分析により、ビヒクル及びIgG対照処置群と、全ての単一及び二重処置マウスとの間でCD4+及びCD8+T細胞の割合に統計的に有意ではない傾向が示された(図61B)。しかしながら、調節性T細胞(Treg)集団を示す、CD4+及びCD25+T細胞の分析により、SMC処置のみ、又はSMCとICIとの組合せに関して、この細胞集団の有意な減少が示された(図61C)。
次に、本発明者らは、単一処置及び組合せ処置後のT細胞におけるPD-1の表面提示を特徴付けた。本発明者らは、SMCのみ、抗PD-1抗体の処置、又はSMCと抗PD-1抗体との組合せ処置で処置されたマウスにおいてPD-1を発現するCD8+T細胞の有意な増加が、PD-1のあまり検出可能ではない表面提示をもたらすことに気付いた(図61D)。更に、本発明者らは、SMC又は抗PD-1処置群においてCD4+T細胞中でのPD-1の提示の減少の傾向を観察した。しかしながら、検出可能なレベルの表面PD-1は、SMCと抗PD-1との組合せ処置を用いて無効化された(図61E)。
頭蓋内グリア芽腫腫瘍の観察されたT細胞浸潤に加えて、本発明者らは次に、骨髄由来抑制細胞(MDSC)及び星状細胞/ミクログリアの存在を特徴付けた。以前の報告とは対照的に、本発明者らは、全ての処置コホートにおいてMDSC集団(CD11b+Gr1+)の差異を検出しなかった(図61F)。しかしながら、本発明者らは、星状細胞/ミクログリア集団が、抗PD-1抗体を含む処置コホート中で有意に減少することに気付いた(図61G)。全体として、これらの結果は、組合せ処置の結果が、T細胞中でのPD-1提示の同時的減少及び星状細胞及び/又はミクログリアの減少と共に、免疫抑制性CD4 T細胞集団の減少であることを示す。
(実施例10)
SMCとICIとの相乗作用はTNF-αに依存する
本発明者らは次に、SMCと抗PD-1抗体との組合せで処置された頭蓋内グリア芽腫腫瘍を担持するマウスの腫瘍細胞性サイトカイン及びケモカインプロファイルを特徴付けた。フローサイトメトリー分析により、抗PD-1抗体の含有と共にGrzBを発現するCD8+細胞の増加があることが示された。細胞傷害性CD8+の比(図62A)とCD4+Tregの比も、抗PD-1抗体及びSMCと抗PD-1抗体との処置コホートにおいて増加した(図62B)。GrzB発現を評価することに加えて、本発明者らは、T細胞中のIFN-γ及びTNF-αのレベルを分析した。予想外に、本発明者らは、SMC処置の際にIFN-γを発現するCD4+細胞の割合の低下を観察した(PD-1を標的とする抗体の含有においても)が、CD8+細胞内の任意の処置コホートにおけるIFN-γの発現レベルの変化を見なかった(図62C)。次いで、本発明者らは、T細胞中のTNF-αの発現レベルを分析した。この文脈で、本発明者らは、CD4+及びCD8+T細胞を発現するTNF-αの有意な増加を観察した(図62D)が、これは、これらのT細胞がSMC媒介性腫瘍細胞死を直接誘導することができることを示している。
本発明者らはまた、頭蓋内CT-2Aグリア芽腫モデルにおいて、サイトカイン及びケモカインの血清濃度及び遺伝子発現レベルに対する、SMC処置と、抗PD-1抗体遮断剤との組合せの効果を評価した。本発明者らは、前炎症性サイトカインIFN-、IL-1-α、IL-1β、及びIL-17並びに多面的サイトカインIFN-γ、IL-27、及びGM-CSFの統計的に有意な増加を検出した(図60及び図62E)。注目すべきことに、IL-10等の抗炎症性サイトカインの存在下では差異はなかった。同様に、SMCとICIとの組合せ処置後の頭蓋内CT-2A腫瘍内のサイトカイン及びケモカイン発現プロファイルの分析により、前炎症性サイトカイン及びケモカインのクラスタリングが示された(図62F及び図63)。SMC又はSMCとICIとの組合せ処置に由来するこれらの候補は、前炎症性サイトカインIFN-β、IL-1β、IL-17、Osm、及びTNF-α、ケモカインCcl2(MCP-1としても知られる)、Ccl5、Ccl7、Ccl22、Cxcl9、Cscl10、及びCxcl11、並びにFasL、IL-2、IL-12及びIFN-γ等の多面的因子であった。
本発明者らはIFN-βとIFN-γのレベルの一致した増加を観察したため、本発明者らは次に、頭蓋内CT-2A腫瘍を担持し、SMCと抗PD-1とで処置されたマウスにおいて、遮断/中和抗体を使用してこれらのシグナル伝達分子の機能的役割を特徴付けようとした。IFNAR1受容体を遮断する抗体を使用することによるI型IFNシグナル伝達の無効化は、SMCと抗PD1抗体との組合せ処置後に頭蓋内CT-2A腫瘍を担持するマウスの生存の増加に向かう相乗効果を無効化した(図62G)。対照的に、抗IFN-γ抗体を用いることによるIFN-γ機能の拮抗作用は、SMCとICIとの組合せ処置の相乗効果を部分的に阻害した。全体として、これらの結果は、各処置剤は、組み合わせた場合も含めて、異なる遺伝子及びタンパク質シグナチャーの生成をもたらすが、全体として、インタクトなI型IFNシグナル伝達に依存する。
全体として、本発明者らの結果は、SMCとICIとの相乗効果が、グリア芽腫細胞に対するCTL媒介性攻撃の増強に主として起因し得ることを示し、これはI型IFNを含む前炎症性応答を含む。CT-2A細胞と、頭蓋内腫瘍が以前に治癒したマウスから単離されたCD8+T細胞との同時培養は、GrzB陽性CD8+T細胞の増加をもたらしたが、これはSMC処置のみによっては増加しなかった(図65A)。しかしながら、PD-1/PD-L1軸が無効化された場合であっても、同じCTLと同時培養した場合、生きたCT-2A細胞はわずかに減少したに過ぎなかった(図65B)。本発明者らは、I型IFN応答がTNF-αの産生をももたらすことに以前に気付いたため、本発明者らは、グリア芽腫細胞の存在下でSMC処置後にTNF-αを産生するT細胞の能力を評価した。したがって、本発明者らは次に、TNF-αの産生を評価した。
SMCの含有は、PD-1を標的とする抗体の含有とは無関係に、TNF-αを発現するCD8+T細胞の割合を有意に増加させた(図65A)。CD8 T細胞からのTNF-αの発現レベルの増加に従って、本発明者らは、治癒したマウスに由来するCT-2A細胞及びCD8 T細胞を使用する同時培養系においてCT-2A細胞の有意な減少を観察した(図65B)。注目すべきことに、CT-2A細胞の細胞死の惹起に対するSMC媒介性効果は、主に、TNF-α(SMC誘導性腫瘍殺傷の主なメディエータ)に依存してした。次に、本発明者らは、SMC処置がT細胞増殖を増強するかどうかを評価した。実際、本発明者らは、CT-2A細胞の同時インキュベーション後に、かすかに標識されたCFSE細胞の新しい集団の出現と共に、CFSEをロードしたCD8+T細胞の有意な減少を観察し、この効果は、SMCと抗PD-1抗体との含有に関して顕著であった(図64)。
これらの結果は、細胞傷害性T細胞が、SMCと抗PD-1抗体との処置に応答して、IAPの拮抗作用に起因して腫瘍細胞死を誘導する細胞死促進因子であるGrzBとTNF-αの産生の増加に起因して腫瘍細胞死の増強をもたらし得ることを示す。本発明者らは、TNF-αを標的とする遮断抗体を用いることにより、TNF-αの役割を機能的に特徴付けた。TNF-αの全身的遮断を加えた場合、本発明者らは、SMCとICIとの組合せ処置の効能のほぼ完全な逆転を観察した(図65C)が、これは、これらの異なる薬剤の相乗効果のためのTNF-αの重要性を強調している。
SMCの免疫調節性抗がん効果は、多様である(図66及び図67)。SMCは、免疫抑制性M2型から、炎症性TNF-αを産生するM1表現型に向かってマクロファージを二極化することができる。更に、SMC抗がん効果は、前炎症性サイトカインによって高度に促進され、腫瘍微小環境内の、TNF-α又はTRAIL等のこれらのサイトカインの存在は、腫瘍細胞死をもたらす。具体的には、cIAPのSMC媒介性枯渇は、がん細胞中で、TNF-α媒介性生存応答を細胞死経路に変化させる。
本発明者らの現在の研究は、SMCが、抗PD-1抗体又は抗CTLA4抗体を含む、ICIの作用と協力し、劇的に強化することができ、侵攻性頭蓋内腫瘍を担持するマウスの永続的な治癒を可能にすることを証明する。SMC療法と関連する機構の多重性及び複雑性は、組合せの相乗作用における免疫調節作用の変化に関する個々の役割を単離するのを困難にする。しかしながら、TNF-αの細胞傷害性が関与することは明らかである。更に、現在の研究は、ICIをSMCと組み合わせた場合の抗がん活性にとって、CD8+T細胞も必要であることを更に証明する。
まとめると、本発明者らは、SMCがマウス腫瘍モデルにおいてICIの活性を促進することができることを初めて示した。更に、この組合せ効果は、免疫抑制性CD4+T細胞と、I型及びII型IFN並びにTNF-αシグナル伝達経路との同時的減少と共に、CD8+T細胞の存在に依存し、マウスにおけるSMC媒介性治癒のための適応免疫の役割を明確に示す。かくして、SMC媒介性T細胞共刺激シグナルは、腫瘍に対して生じる適応免疫応答の駆動を提供し、これは、PD-1又はPD-L1等の、共阻害シグナルによって課されるブレーキがICIによって除去される場合に完全に実現される。
他の実施形態
本明細書に記載される全ての刊行物、特許出願、及び特許は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明を特定の実施形態と共に記載してきたが、更なる改変が可能であることが理解されるであろう。したがって、本出願は、一般的には、当業界内の公知の、又は慣用的な実務内にある本開示からの逸脱を含む、本発明の原理に従う本発明の任意の変更、使用、又は適応を包含することが意図される。

Claims (46)

  1. (i)Table 1(表1)に由来するSMCと、(ii)Table 2(表2)若しくはTable 3(表3)に由来する薬剤又は免疫チェックポイント阻害剤(ICI)若しくはSTINGアゴニストである薬剤とを含む組成物であって、前記SMC及び前記薬剤が、一緒になって、それを必要とする患者に投与された場合にがんを処置するのに十分な量で提供される、組成物。
  2. がんと診断された患者を処置するための方法であって、患者に、(i)Table 1(表1)に由来するSMCと、(ii)Table 2(表2)若しくはTable 3(表3)に由来する薬剤又はICI若しくはSTINGアゴニストである薬剤とを投与する工程を含み、前記SMC及び前記薬剤が、一緒になって前記がんを処置するのに十分な量で、同時に、又は互いに28日以内に投与される、方法。
  3. 前記SMC及び前記薬剤が、互いに14日以内に投与される、請求項2に記載の方法。
  4. 前記SMC及び前記薬剤が、互いに10日以内に投与される、請求項3に記載の方法。
  5. 前記SMC及び前記薬剤が、互いに5日以内に投与される、請求項4に記載の方法。
  6. 前記SMC及び前記薬剤が、互いに24時間以内に投与される、請求項5に記載の方法。
  7. 前記SMC及び前記薬剤が、互いに6時間以内に投与される、請求項6に記載の方法。
  8. 前記SMC及び前記薬剤が実質的に同時に投与される、請求項7に記載の方法。
  9. 前記SMCが一価SMCである、請求項2から8のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記SMCがLCL161である、請求項9に記載の方法。
  11. 前記SMCがGDC-0152/RG7419、又はGDC-0917/CUDC-427である、請求項9に記載の方法。
  12. 前記SMCがSM-406/AT-406/Debio1143である、請求項9に記載の方法。
  13. 前記SMCが二価SMCである、請求項2から8のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記SMCがAEG40826/HGS1049である、請求項13に記載の方法。
  15. 前記SMCがOICR720である、請求項13に記載の方法。
  16. 前記SMCがTL32711である、請求項13に記載の方法。
  17. 前記SMCがSM-1387/APG-1387である、請求項13に記載の方法。
  18. 前記薬剤がTable 2(表2)に由来するTLRアゴニストである、請求項2から17のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記薬剤がリポ多糖、ペプチドグリカン、又はリポペプチドである、請求項18に記載の方法。
  20. 前記薬剤がCpGオリゴデオキシヌクレオチドである、請求項18に記載の方法。
  21. 前記薬剤がCpG-ODN2216である、請求項20に記載の方法。
  22. 前記薬剤がイミキモッドである、請求項18に記載の方法。
  23. 前記薬剤がポリ(I:C)である、請求項18に記載の方法。
  24. 前記薬剤がBCGである、請求項18に記載の方法。
  25. 前記薬剤がTable 3(表3)に由来するウイルスである、請求項2から17のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記薬剤が水疱性口内炎ウイルス(VSV)である、請求項25に記載の方法。
  27. 前記薬剤がVSV-M51R、VSV-MΔ51、VSV-IFNβ、又はVSV-IFNβ-NISである、請求項26に記載の方法。
  28. 前記薬剤がアデノウイルス、マラバベシクロウイルス、レオウイルス、ラブドウイルス、ワクシニアウイルス、又はそのバリアントである、請求項25に記載の方法。
  29. 前記薬剤がタリモジーン・ラハーパレプベックである、請求項25に記載の方法。
  30. 前記薬剤がICIである、請求項2から17のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記ICIがイピリムマブ、トレメリムマブ、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、AMP-224、AMP-514、AUNP12、PDR001、BGB-A317、REGN2810、アベルマブ、BMS-935559、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、BMS-986016、LAG525、IMP321、MBG453、リリルマブ、又はMGA271からなる一覧から選択される、請求項30に記載の方法。
  32. 前記がんが、薬剤の非存在下でSMCによる処置に対して不応性である、請求項2から31のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記処置が、インターフェロンを含む治療剤の投与を更に含む、請求項2から32のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記インターフェロンが1型インターフェロンである、請求項33に記載の方法。
  35. 前記がんが、副腎がん、基底細胞癌、胆道がん、膀胱がん、骨肉腫、脳腫瘍、乳がん、子宮頸がん、絨毛癌、結腸がん、結腸直腸がん、結合組織がん、消化器系のがん、子宮内膜がん、上咽頭がん、食道がん、眼がん、胆嚢がん、胃がん、頭頸部がん、肝細胞癌、上皮内新生物、腎臓がん、喉頭がん、白血病、肝臓がん、肝臓転移、肺がん、リンパ腫、メラノーマ、骨髄腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、中皮腫、神経膠腫、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、口腔がん、卵巣がん、小児がん、膵がん、膵内分泌腫瘍、陰茎がん、形質細胞腫瘍、下垂体腺腫、胸腺腫、前立腺がん、腎細胞癌、呼吸器系のがん、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、皮膚がん、小腸がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、尿管がん、及び泌尿器系のがんから選択される、請求項2から34のいずれか一項に記載の方法。
  36. Table 1(表1)に由来するSMCと薬剤とを含む組成物であって、前記薬剤が死滅ウイルス、不活化ウイルス、又はウイルスワクチンを含み、前記SMCと前記薬剤とが、それを必要とする患者に投与された場合、一緒になってがんを処置するのに十分な量で提供される、組成物。
  37. 前記薬剤がNRRP又は狂犬病ワクチンである、請求項36に記載の組成物。
  38. Table 1(表1)に由来するSMCと薬剤とを含む組成物であって、前記薬剤が免疫応答をプライミングする第1の薬剤と、前記免疫応答をブーストする少なくとも第2の薬剤とを含み、前記SMCと前記薬剤とが、それを必要とする患者に投与された場合、一緒になってがんを処置するのに十分な量で提供される、組成物。
  39. 前記第1の薬剤と前記第2の薬剤の一方又は両方が腫瘍溶解性ウイルスワクチンである、請求項38に記載の組成物。
  40. 前記第1の薬剤が腫瘍抗原を担持するアデノウイルスであり、前記第2の薬剤がベシクロウイルスである、請求項39に記載の組成物。
  41. 前記ベシクロウイルスが、前記アデノウイルスと同じ腫瘍抗原を担持するMaraba-MG1及び腫瘍抗原を担持しないMaraba-MG1から選択される、請求項38に記載の組成物。
  42. SMCとICIとを含む組成物であって、前記SMCと、前記ICIとが、それを必要とする患者に投与された場合に一緒になってがんを処置するのに十分な量で提供される、組成物。
  43. 前記SMCが、Table 1(表1)に由来するSMCである、請求項42に記載の組成物。
  44. 前記ICIが、Table 4(表4)に由来するICIである、請求項42又は43に記載の組成物。
  45. (i)Table 1(表1)に由来するSMCと、(ii)2、3、4、5つ以上の薬剤とを含む組成物であって、各薬剤が、独立にICIであるか、又はTable 2(表2)に由来する薬剤若しくはTable 3(表3)に由来する薬剤であるか、又はSTINGアゴニストである、組成物。
  46. ICIがTable 4(表4)に由来するICIである、請求項45に記載の組成物。
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