JP2023548831A - 腫瘍溶解性ウイルスが有効なｔｉｌ療法のためにｔ細胞応答を強化する - Google Patents

Abstract

腫瘍浸潤リンパ球(TIL)集団を増殖させるための方法及びがんを治療するための増殖させたTIL集団の使用の方法を開示する。

Description

本出願では、米国特許仮出願第63/106,215号の利益を主張し、これは、この全体を参照により本明細書に組み込むものである。

がん免疫療法における最近の進歩により、治療のパラダイムが改革された。しかし、多くのがん患者は、免疫チェックポイント阻害剤(ICI)を含む利用可能な治療から殆ど又は全く利益を得ることはない。多くの臨床試験により、既存の腫瘍反応性T細胞が、チェックポイント阻害剤から利益を得るのに決定的に重要であることが示されている。従って、腫瘍反応性T細胞の数及び機能を増強させるための新たな方法が必要とされている。

米国特許第7,495,090号 米国特許第7,928,213号 米国特許第8,138,310号

Racher, A.J.、Fooks, A.R. & Griffiths, J.B. Biotechnol Tech(1995) 9: 169 Senterら、Bioconjugate Chem.、2:447～451頁(1991) Bagshawe, K.D.、Br. J. Cancer、60:275～281頁(1989) Bagshaweら、Br. J. Cancer、58:700～703頁(1988) Senterら、Bioconjugate Chem.、4:3～9頁(1993) Battelliら、Cancer Immunol. Immunother.、35:421～425頁(1992) Pietersz及びMcKenzie、Immunolog. Reviews、129:57～80頁(1992) Rofflerら、Biochem. Pharmacol、42:2062～2065頁(1991) Hughesら、Cancer Research、49:6214～6220頁(1989) Litzinger及びHuang、Biochimica et Biophysica Acta、1104:179～187頁(1992) Brown及びGreene、DNA and Cell Biology 10:6、399～409頁(1991) Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19th編)編A.R. Gennaro、Mack Publishing Company,、Easton、PA 1995 Handbook of Monoclonal Antibodies、Ferroneら編、Noges Publications、Park Ridge、NJ.(1985) ch. 22及び303～357頁 Smithら、Antibodies in Human Diagnosis and Therapy、Haberら編、Raven Press、New York(1977)365～389頁

腫瘍浸潤リンパ球(TIL)集団の増殖及びがん治療のためのこのTIL集団の使用に関する方法及び組成物を開示する。

一態様では、a)1つ又は複数の外因性免疫刺激分子(例えば、CD40-L、MEM40、B7-1(CD80)/B7-2(CD86)、OX40L、4-1BBL、CD70、GITRL、LIGHT、TIM-4、ICAM-1、CD58及び/又はSLAMF6等)を発現する有効量の腫瘍溶解性ウイルスを腫瘍細胞内に投与する工程と、b)腫瘍浸潤リンパ球を回収する工程とを含む、腫瘍浸潤リンパ球を生成する方法を本明細書において開示する。一部の態様では、腫瘍溶解性ウイルスは、1つ又は複数の1型インターフェロン(IFN)(例えば、IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω及び/又はIFN-ζ等)を更に発現し得る。TILは、腫瘍溶解性ウイルスに感染していない腫瘍微小環境においても得ることができるが、一部の態様では、生成されたTILは、腫瘍溶解性ウイルスの投与部位の腫瘍微小環境において得られる。

また、腫瘍内注射を介して腫瘍溶解性ウイルスを投与する、前述の任意の態様の腫瘍浸潤リンパ球を生成する方法を本明細書において開示する。

また、回収したTILをex vivoで増殖させる工程を更に含む、前述の任意の態様の腫瘍浸潤リンパ球を生成する方法を本明細書において開示する。

一態様では、a)がんを有する対象からTIL又はMILを回収する工程と、b)1つ又は複数の外因性免疫刺激分子(例えば、CD40-L、MEM40、B7-1(CD80)/B7-2(CD86)、OX40L、4-1BBL、CD70、GITRL、LIGHT、TIM-4、ICAM-1、CD58及び/又はSLAMF6等)を発現する腫瘍溶解性ウイルスに感染させた抗原提示細胞の存在下で、回収したTIL又はMILを培養する工程とを含む、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)又は骨髄浸潤リンパ球(MIL)の集団を増殖させる方法を本明細書において開示する。一部の態様では、腫瘍溶解性ウイルスは、1つ又は複数の1型インターフェロン(IFN)(例えば、IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω及び/又はIFN-ζ等)を更に発現し得る。

また、前述の任意の態様のいずれかの治療有効量のTIL又はMILを対象に投与する工程を含む、対象におけるがん及び/又は転移を治療、減少、阻害、低下、回復、及び/又は予防する方法を本明細書において開示する。例えば、a)1つ又は複数の外因性免疫刺激分子(例えば、CD40-L、MEM40、B7-1(CD80)/B7-2(CD86)、OX40L、4-1BBL、CD70、GITRL、LIGHT、TIM-4、ICAM-1、CD58及び/又はSLAMF6等)を発現する有効量の腫瘍溶解性ウイルスを腫瘍細胞内に投与する工程と、b)腫瘍浸潤リンパ球(TIL)及び/又は骨髄浸潤リンパ球(MIL)を回収する工程と、c)回収したTIL及び/又はMILをex vivoで増殖させる工程と、d)増殖させた治療有効量のTIL及び/又はMILを対象に投与する工程とを含む、対象におけるがん及び/又はがんの転移を治療、減少、阻害、低下、回復、及び/又は予防する方法を本明細書において開示する。一部の態様では、治療、減少、阻害、低下、回復、及び/又は予防するがん性又は転移性腫瘍は、本明細書に開示の腫瘍溶解性ウイルス及び/又はTIL若しくはMILのいずれかを受ける腫瘍に対してアブスコパルである。一部の態様では、腫瘍溶解性ウイルスは、1つ又は複数の1型インターフェロン(IFN)(例えば、IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω及び/又はIFN-ζ等)を更に発現し得る。

或いは、a)がんを有する対象から腫瘍浸潤リンパ球(TIL)及び/又は骨髄浸潤リンパ球(MIL)を回収する工程と、1つ又は複数の外因性免疫刺激分子を発現する腫瘍溶解性ウイルスに感染させた抗原提示細胞の存在下で、回収したTIL又はMILを培養する工程と、増殖させた治療有効量のTIL及び/又はMILを対象に投与する工程とを含む、対象におけるがん及び/又は転移を治療、減少、阻害、低下、回復、及び/又は予防する方法を本明細書において開示する。一部の態様では、腫瘍溶解性ウイルスは、1つ又は複数の1型インターフェロン(IFN)(例えば、IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω及び/又はIFN-ζ等)を更に発現し得る。

一態様では、抗がん剤を対象に投与する工程を更に含む、前述の任意の態様のがん及び/又は転移を治療、減少、阻害、低下、回復、及び/又は予防する方法を本明細書において開示する。

本明細書に組み込み、この一部を構成する添付の図面は、いくつかの実施形態を例示し、この記載とともに開示の組成物及び方法を例示する。

B16-OVA細胞にpLenti-Puro対照レンチウイルス又はマウス若しくはヒトIFNβを発現するレンチウイルスを形質導入した後、ピューロマイシン選択を行ったことを示す図である。同数の細胞を播種し、この2日後にELISAのために上清を採取してヒト及びマウスIFNβを検出した。増殖曲線のためにtwo-way ANOVA又はOVA四量体評価のためにt検定を使用してn=6の統計学的解析を行った。統計学的有意性は、*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001としてp値により示す。NS:有意性なし。 D0及び7に野生型又はIFNAR1 KO(IFNAR)C57BL/6マウスを2ラウンドのB16-OVA-pLenti、B16-OVAマウスIFNβ又はB16-OVAヒトIFNβワクチンに供したことを示す図である(細胞は、注射前に100Gyで照射した)。D12の末梢血中のMHCII^-及びCD8⁺細胞におけるOVA四量体⁺の割合を示す。増殖曲線のためにtwo-way ANOVA又はOVA四量体評価のためにt検定を使用してn=6の統計学的解析を行った。統計学的有意性は、*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001としてp値により示す。NS:有意性なし。 図1Cは、D21にマウスに3e5の生B16-OVA細胞を曝露したことを除いて(A)と同一の図である。腫瘍増殖を指示の通りに決定した。増殖曲線のためにtwo-way ANOVA又はOVA四量体評価のためにt検定を使用してn=6の統計学的解析を行った。統計学的有意性は、*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001としてp値により示す。NS:有意性なし。 MEM40の略図である。 MEM-288の略図である。 (3A)A549又は(3C)B16-F10細胞に対照GFPウイルス又は腫瘍溶解性Ad-MEM-188若しくは288を指示の通りMOI=250で2日間感染させたことを示す図である。GFP及びMEM40発現は、フローサイトメトリーにより決定した。 (3A)A549又は(3C)B16-F10細胞に対照GFPウイルス又は腫瘍溶解性Ad-MEM-188若しくは288を指示の通りMOI=250で2日間感染させたことを示す図である。IFNβ分泌は、(3B)A549細胞又は(3D)B16-F10細胞において指示するOVによる感染後にELISAにより決定した。 (3A)A549又は(3C)B16-F10細胞に対照GFPウイルス又は腫瘍溶解性Ad-MEM-188若しくは288を指示の通りMOI=250で2日間感染させたことを示す図である。GFP及びMEM40発現は、フローサイトメトリーにより決定した。 (3A)A549又は(3C)B16-F10細胞に対照GFPウイルス又は腫瘍溶解性Ad-MEM-188若しくは288を指示の通りMOI=250で2日間感染させたことを示す図である。IFNβ分泌は、(3B)A549細胞又は(3D)B16-F10細胞において指示するOVによる感染後にELISAにより決定した。 (4A)344SQ(344)、(4B)B16-F10マウス細胞株及び(4C)A549ヒト細胞株に、指示するOV、AD-GFP(GFP)、MEM-188(188)又はMEM-288(288)を種々のMOI(1、10、100)で2日間感染させたことを示す図である。細胞生存率は、感染後2日にトリパンブルー染色アッセイにより決定した。 (4A)344SQ(344)、(4B)B16-F10マウス細胞株及び(4C)A549ヒト細胞株に、指示するOV、AD-GFP(GFP)、MEM-188(188)又はMEM-288(288)を種々のMOI(1、10、100)で2日間感染させたことを示す図である。細胞生存率は、感染後2日にトリパンブルー染色アッセイにより決定した。 (4A)344SQ(344)、(4B)B16-F10マウス細胞株及び(4C)A549ヒト細胞株に、指示するOV、AD-GFP(GFP)、MEM-188(188)又はMEM-288(288)を種々のMOI(1、10、100)で2日間感染させたことを示す図である。細胞生存率は、感染後2日にトリパンブルー染色アッセイにより決定した。 C57BL/6マウスに5e5のB16-OVA細胞をs.c.で接種したことを示す図である。D12及び16に、このようなマウスをAd-GFP、MEM-188及びMEM-288の(5A)10e8又は(5B)10e9 IUによる2回の腫瘍内注射に供した。腫瘍サイズの差の有意性は、最終時点で非処置対照マウスと比較して示す。 C57BL/6マウスに5e5のB16-OVA細胞をs.c.で接種したことを示す図である。D12及び16に、このようなマウスをAd-GFP、MEM-188及びMEM-288の(5A)10e8又は(5B)10e9 IUによる2回の腫瘍内注射に供した。腫瘍サイズの差の有意性は、最終時点で非処置対照マウスと比較して示す。 D12の末梢血中のOVA特異的MHCII及びCD8+細胞の割合を示す図であり、これは、B16-OVAにおける10e9 IUのMEM-188及びMEM-288の腫瘍内注射後に示される。増殖曲線のためにtwo-way ANOVA又はOVAT評価のためにt検定を使用して統計学的解析を行った。統計学的有意性は、*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001としてp値により示す。NS:有意性なし。 脾臓CD8T細胞から生じるIFNγELISPOTの定量を示す図である。C57BL/6 WT、IFNARl KO及びCD40 KOマウス(1群あたり3匹)の側腹上に5e5のB16-OVA細胞をs.c.で接種し、D12及びD16にPBS(UT:非処置)又はMEM-288の腫瘍内注射に10⁹IUで供した。マウス脾臓は、製造者の推奨に従ってCD8 T細胞の磁気ビーズ単離に供した。次いで、2×10⁵/ウェルのCD8細胞及び1×10⁵/ウェルの50Gy照射B16-OVA細胞を三つ組のウェルに播種し、96ウェルプレート内に37℃で24時間インキュベートした。腫瘍細胞は、IFNγにより刺激して、MHC発現を増加させた。また、陰性及び陽性対照としてT細胞を単独で又はコンカバリン(Concavalin)A(ConA)とともにそれぞれ培養した。結果は、各群のConA処理に対して示す。t検定を使用して統計学的解析を行った。統計学的有意性は、*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001としてp値により示す。NS:有意性なし。 マウスにおける治療計画を示す図である。C57BL/6マウスの原発部位に5e5のB16-F10細胞及び対側部位に2.5e5のB16-F10細胞をs.c.で接種した。示すように、このようなマウスは、D12及び16に原発腫瘍にMEM-288を10e9 IUで、並びにD16、D19、D23及び27に抗PD-1及びCTLA-4抗体をi.p.で注射した。 示すように原発部位(6B)及び対側部位(6C)において腫瘍の増殖を決定したことを示す図である。増殖曲線のためにtwo-way ANOVAを使用して統計学的解析を行った。統計学的有意性は、*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001としてp値により示す。NS:有意性なし。 示すように原発部位(6B)及び対側部位(6C)において腫瘍の増殖を決定したことを示す図である。増殖曲線のためにtwo-way ANOVAを使用して統計学的解析を行った。統計学的有意性は、*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001としてp値により示す。NS:有意性なし。 マウスの全生存を示すKaplan-Meier生存曲線を示す図である。統計学的有意性は、*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001としてp値により示す。NS:有意性なし。 129匹のマウスの側腹に5e5の344細胞をs.c.で接種し、D12及びD16に10e9 IUのAd-GFP、MEM-188又は288の腫瘍内注射に供したことを示す図である。示すように原発部位において腫瘍の増殖を決定した。有意性は、対照UT群(PBS注射)と比較して示す。統計学的有意性は、*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001としてp値により示す。NS:有意性なし。 (7A)のD38におけるs.c.による344腫瘍担持マウスの肺における腫瘍の典型的H&E染色を示す図である。 指示の通り示す種々の群の個々のマウスの腫瘍転移の定量を示す図である。統計学的有意性は、*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001としてp値により示す。NS:有意性なし。 (7A)のマウスの肺におけるCD8 T細胞の典型的IHC染色を示す図である。 指示の通り示す種々の群の個々のマウスのCD8 T細胞密度の定量を示す図である。統計学的有意性は、*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001としてp値により示す。NS:有意性なし。 129匹のマウスの側腹に5e5の344細胞をs.c.で接種し、D12及び16に10e9 IUのMEM-288の腫瘍内注射、並びにD16、D19、D23及び27にi.p.による抗PD-1抗体に供したことを示す図である。図8Aは、マウスの脾臓CD8 T細胞によるIFNγELISPOTを示し、図8Bは、(A)から生じるELISPOTの定量を示す。T検定を使用して統計学的解析を行った。統計学的有意性は、*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001としてp値により示す。NS:有意性なし。 129匹のマウスの側腹に5e5の344細胞をs.c.で接種し、D12及び16に10e9 IUのMEM-288の腫瘍内注射、並びにD16、D19、D23及び27にi.p.による抗PD-1抗体に供したことを示す図である。図8Aは、マウスの脾臓CD8 T細胞によるIFNγELISPOTを示し、図8Bは、(A)から生じるELISPOTの定量を示す。T検定を使用して統計学的解析を行った。統計学的有意性は、*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001としてp値により示す。NS:有意性なし。 示すようにマクロファージ、好中球、単球、及びDCの集団を検出するB16-OVAのフローサイトメトリー解析スキームを示す図である。 B細胞、CD4 T細胞、CD8 T細胞、及びOVA特異的CD8 T細胞の集団を検出するB16-OVAのフローサイトメトリー解析スキームを示す図である。 C57BL/6マウスの側腹に5e5のB16-OVA又はB16-OVA-ZsGreen細胞をs.c.で接種したことを示す図である。D14に、マクロファージ及びDCのZsGreen陽性集団を検出する腫瘍B16-OVAのフローサイトメトリー解析を図9Aのように同定した。陽性細胞の割合を示す。 C57BL/6マウスの側腹に5e5のB16-OVA又はB16-OVA-ZsGreen細胞をs.c.で接種したことを示す図である。D14に、フローサイトメトリー解析を実施して、示すようにCD45^-におけるZsGreen⁺腫瘍細胞を検出した。 D12にB16-OVA-ZsGreen腫瘍をPBS又は10e9 IUのMEM-288の腫瘍内注射に供したことを示す図である。PBS及びMEM-288注射腫瘍によりZsGreen⁺CD45^-細胞に対するCD40Lのフローサイトメトリー解析を実施した。 MHC-II^高マクロファージ及びDC(CD11b⁺DC2)のCD80及びCD86発現のフローサイトメトリー解析を、図1Bの腫瘍に対して実施したことを示す図である。腫瘍におけるPBS及びMEM-288の注射を示す。 結果(A)の平均蛍光強度(MFI)を示す図である。 鼠径部LNにおけるDC集団を示す図である。CD11c⁺MHC-II⁺DCの2つの主な集団を検出した。MHC-II高集団は、遊走性DC1及びDC2からなる。MHC-II中等集団は、常在DC1及びDC2からなる。予想されたように、遊走性集団は、より高い割合のCD103⁺DC1を有し、一方、常在集団は、より高い割合のCD8a⁺DC1を有する。 WT、CD40 KO及びIFNAR1 KOマウスのLNにおけるDC集団を示す図である。CD11c⁺MHC-II⁺DCの2つの主な集団を全ての遺伝子型のマウスにおいて検出した。MHC-II高集団は、遊走性DC1及びDC2からなる。MHC-II中等集団は、常在DC1及びDC2からなる。 C57BL/6マウスの側腹に5e5のB16-OVA細胞をs.c.で接種したことを示す図である。腫瘍は、D12及びD16にPBS(n=4)、アデノウイルスGFP(n=3)又はMEM-288(n=4)注射に10⁹ IUで供した。20日目に、腫瘍を得、IHCを実施して、CD8⁺腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の存在を検出した。CD8 T細胞染色は、群について知らされなかった病理医により0～3の尺度に基づいて点数化した。図15Aは、3つの治療群についての腫瘍の典型的画像を示す。 C57BL/6マウスの側腹に5e5のB16-OVA細胞をs.c.で接種したことを示す図である。腫瘍は、D12及びD16にPBS(n=4)、アデノウイルスGFP(n=3)又はMEM-288(n=4)注射に10⁹ IUで供した。20日目に、腫瘍を得、IHCを実施して、CD8⁺腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の存在を検出した。CD8 T細胞染色は、群について知らされなかった病理医により0～3の尺度に基づいて点数化した。図15Bは、3つの治療群の点数化した値を示す。

本発明の化合物、組成物、物品、装置、及び/又は方法を開示及び記載する前に、これらは他に特定しない限り、特定の合成方法若しくは組換えによる特定の生物工学的方法、又は他に特定しない限り、特定の試薬に制限されず、これらは勿論、異なり得るものであることが理解されるべきである。また、本明細書において使用する用語法は、特定の実施形態のみを記載する目的のためのものであり、制限となることは意図していないことが理解されるべきである。

A.定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用する場合、「a」、「an」及び「the」の単数形は、文脈上明白に他に指示しない限り複数の参照対象を含む。従って、例えば、「医薬担体」への参照は、2つ以上のこのような担体等の混合物を含む。

範囲は、ある特定の「およその」値から及び/又は別の特定の「およその」値までとして本明細書において表し得る。このような範囲を表す場合、別の実施形態では、一方の特定の値から及び/又は他方の特定の値までを含む。同様に、値を近似として表す場合、先行詞「およそ」を使用することにより、特定の値によって別の実施形態を形成することが理解される。更に、それぞれの範囲の両終点が、他方の終点に関して、かつ他方の終点とは独立的に重要であることが理解される。また、本明細書では多数の値を開示しており、本明細書では各値を、値それ自体に加えて、この特定の「およその」値としても開示することが理解される。例えば、「10」の値を開示する場合は、「およそ10」をも開示する。また、その値「以下」の値を開示する場合、当業者により適切に理解されるように、「その値以上」及び値間の可能な範囲をも開示することが理解される。例えば、「10」の値を開示する場合、「10以下」並びに「10以上」をも開示する。また本出願を通じて、データは、多数の異なる形式により提供し、その上、このデータは、終点及び始点、並びにデータ点の任意の組合せの範囲を表すことが理解される。例えば、特定のデータ点「10」及び特定のデータ点15を開示する場合、10及び15を超える、それら以上、それら未満、それら以下、及びそれらと等価である場合も開示されていると考えられるだけでなく、10～15の範囲も開示されていると考えられることが理解される。また、2つの特定の単位間の各単位をも開示することが理解される。例えば、10及び15を開示する場合は、11、12、13及び14をも開示する。

本明細書及び後続の特許請求の範囲では、次の意味を有すると定義すべき多数の用語について言及する。

「任意選択の」又は「任意選択で」は、引き続いて記載する現象又は状況が発生するか又は発生しない可能性を有し、記載が、この現象又は状況が発生する場合及びこれが発生しない場合を含むことを意味する。

本明細書において使用する場合、「抗原提示細胞」(APC)の用語は、プロフェッショナル抗原提示細胞を指し、これは、樹状細胞、マクロファージ及びB細胞の中から選択される。一部の実施形態では、APCは、DCである。一部の実施形態では、APCは、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、APC、例えば、DC、マクロファージ又はB細胞は、ヒト細胞である。

「上昇」は、多量の症候、疾患、組成物、症状、又は活性が生じる任意の変化を指し得る。上昇は、統計学的に有意な量の症状、症候、活性、組成物における個々の、中位の又は平均的な任意の上昇であり得る。従って上昇は、上昇が統計学的に有意である限り1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95又は100%の上昇であり得る。

「低下」は、少量の症候、疾患、組成物、症状、又は活性が生じる任意の変化を指し得る。また、物質による遺伝子産物の遺伝的産出量が、この物質によらない遺伝子産物の産出量に対して少ない場合、物質によって遺伝子の遺伝的産出量が低下することが理解される。また例えば、低下は、症候が、それまでに観察された症候よりも少ないような、障害の症候における変化であり得る。低下は、統計学的に有意な量の症状、症候、活性、組成物における個々の、中位の又は平均的な任意の低下であり得る。従って、低下は、低下が統計学的に有意である限り1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95又は100%の低下であり得る。

「阻害(inhibit、inhibiting及びinhibition)」は、活性、応答、症状、疾患、又は他の生物学的パラメータを低下させることを意味する。これは、活性、応答、症状、又は疾患の完全な消失を含み得るが、これに限定されない。またこれは、例えば、天然又は対照レベルと比較した場合の活性、応答、症状、又は疾患における10%の減少を含み得る。従って、減少は、天然又は対照レベルと比較した場合の10、20、30、40、50、60、70、80、90、100%の又はこれらの量の間の任意の量の減少であり得る。

「減少(reduce)」又は単語の他の形式、例えば、「reducing」又は「reduction」は、現象又は特性(例えば、腫瘍の増殖)を低下させることを意味する。これは典型的に、一部の標準又は予想値と関連し、換言すれば、相対的であるが、参照する標準又は相対値に常に必要であるとは限らないことが理解される。例えば、「腫瘍の増殖を減少する」は、標準又は対照に対して腫瘍の増殖率が減少することを意味する。

「予防(prevent)」又は単語の他の形式、例えば、「preventing」又は「prevention」は、特定の現象又は特性を停止して、特定の現象若しくは特性の発症若しくは増悪を安定化若しくは遅延させるか、又は特定の現象若しくは特性が発生する機会を最小化することを意味する。予防は、例えば、減少よりも典型的に絶対であるため、対照との比較を必要としない。本明細書において使用する場合、減少し得るが予防されないものもあれば、減少し、かつ予防され得るものもある。同様に、予防され得るが減少しないものもあれば、予防され、かつ減少し得るものもある。減少又は予防を使用する場合、詳細に他に指示しない限り、他の単語の使用をも明示的に開示することが理解される。

「対象」の用語は、投与又は治療の標的である任意の個体を指す。対象は、脊椎動物、例えば、哺乳動物であり得る。一態様では、対象は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、又はネコであり得る。また、対象は、モルモット、ラット、ハムスター、ウサギ、マウス又はモグラであり得る。従って、対象は、ヒト又は患畜であり得る。「患者」の用語は、臨床医、例えば、内科医による治療下の対象を指す。

「治療的に有効」の用語は、使用する組成物の量が、疾患又は障害の1つ又は複数の原因又は症候を回復させるのに十分な量であることを指す。このような回復には、必ずしも除去ではなく、減少又は変化のみが必要とされる。

「治療」の用語は、疾患、病状、又は障害を治癒、回復、安定、又は予防することを意図する患者の医学的管理を指す。この用語は、積極的治療、即ち、詳細には、疾患、症状、又は障害の改善に方向づける治療を含み、原因治療、即ち、関連する疾患、病状、又は障害の原因の除去に方向づける治療をも含む。加えて、この用語は、姑息的治療、即ち、疾患、病状、又は障害の治癒というよりは症候の鎮静のために設計した治療;予防的治療、即ち、関連する疾患、病状、又は障害の発症の最小化又は部分的若しくは完全な阻害に方向づける治療;及び支持的治療、即ち、関連する疾患、病状、又は障害の改善に方向づける別の特定の療法を補うために利用する治療を含む。

「生体適合性」は、レシピエントに対して一般に非毒性であり、対象に対して著しい有害作用が発生しない物質及びこの任意の代謝物又は分解産物を一般に指す。

「含む」は、組成物、方法等が列挙する要素を含むが、この他を除外しないことを意味することを意図する。「から本質的になる」は、組成物及び方法を定義するために使用する場合、列挙する要素を含むが、この組合せに対する任意の本質的な意義を有する他の要素を除外しないことを意味するものとする。従って、本明細書において定義する要素から本質的になる組成物は、単離及び精製方法による微量の夾雑物、並びに薬学的に許容される担体、例えば、リン酸緩衝食塩水、保存剤等を除外しない。「からなる」は、他の成分の微量を超える量の要素、並びに本開示において提供及び/又は主張する組成物を投与するための実質的方法工程を除外することを意味するものとする。このような転換用語のそれぞれにより定義する実施形態は、本開示の範囲内である。

「対照」は、比較目的のための実験において使用する代替の対象又は試料である。対照は、「陽性」又は「陰性」であり得る。

薬剤の「有効量」は、所望の作用をもたらすのに十分な薬剤の量を指す。「有効」な薬剤の量は、対象の年齢及び全身状態、1つ又は複数の特定の薬剤等のような多くの因子に応じて対象毎に異なる。従って、定量した「有効量」を特定することが常に可能であるとは限らない。しかし、任意の対象の場合における適切な「有効量」は、日常の実験法を使用して当業者により決定し得る。また、本明細書において使用する場合、及び詳細に他に述べない限り、薬剤の「有効量」は、治療的に有効な量及び予防的に有効な量の両方を包含する量をも指し得る。治療作用を達成するのに必要な薬剤の「有効量」は、対象の年齢、性別、及び体重のような因子に応じて異なり得る。投与計画は、最適な治療応答をもたらすように調整することができる。例えば、いくつかの分割用量を毎日投与し得るか、又は治療状況の緊急性によって指示される通りに用量を比例的に減少させ得る。

「薬学的に許容される」成分は、生物学的又はその他により不適当ではない成分、即ち、著しく不適当な生物学的作用が発生するか又は含まれる製剤の他の成分のいずれかと有害に相互作用することなく、本開示により提供する医薬製剤に組み込み、本明細書に記載のように対象に投与し得る成分を指し得る。ヒトへの投与に関して使用する場合、この用語は、成分が、毒性学的及び製造検査の必要な基準に見合うか、又は米国食品医薬品局により作成された不活性成分ガイドに含まれることを一般に意味する。

「薬学的に許容される担体」(「担体」と呼ぶこともある)は、一般に安全かつ非毒性の、医薬又は治療組成物の調製において有用な担体又は賦形剤を意味し、動物及び/又はヒトへの薬学的又は治療的使用に許容される担体を含む。「担体」又は「薬学的に許容される担体」の用語は、リン酸緩衝食塩溶液、水、乳濁液(例えば、油/水又は水/油乳濁液)及び/又は各種の湿潤剤を含み得るが、これらに限定されない。本明細書において使用する場合、「担体」の用語は、任意の賦形剤、希釈剤、フィラー、塩、緩衝液、安定化剤、可溶化剤、脂質、安定化剤、又は医薬製剤における使用のため及び本明細書に更に記載の、当技術分野において周知の他の物質を包含するが、これらに限定されない。

「薬理学的に活性」な誘導体又は類似体におけるような「薬理学的に活性」(又は単に「活性」)は、親化合物と同種の薬理学的活性を有し、ほぼ同程度の誘導体又は類似体(例えば、塩、エステル、アミド、コンジュゲート、代謝物、異性体、断片等)を指し得る。

「治療剤」は、有益な生物学的作用を有する任意の組成物を指す。有益な生物学的作用は、治療的作用、例えば、障害又は他の不適当な生理学的症状の治療、及び予防的作用、例えば、障害又は他の不適当な生理学的症状(例えば、非免疫原性がん)の予防の両方を含む。また、この用語は、本明細書において詳細に言及する有益な薬剤の、薬学的に許容され、薬理学的に活性な誘導体を包含し、塩、エステル、アミド、プロエージェント、活性代謝物、異性体、断片、類似体等を含むが、これらに限定されない。「治療剤」の用語を使用する場合、又は特定の薬剤を特異的に同定する場合、この用語が、薬剤それ自体だけでなく薬学的に許容され、薬理学的に活性な塩、エステル、アミド、プロエージェント、コンジュゲート、活性代謝物、異性体、断片、類似体等を含むことが理解されるべきである。

組成物(即ち、薬剤を含む組成物)の「治療有効量」又は「治療有効用量」は、所望の治療結果を達成するのに有効な量を指す。一部の実施形態では、所望の治療結果は、I型糖尿病の調節である。一部の実施形態では、所望の治療結果は、肥満の調節である。治療有効量の所与の治療剤は、治療する障害又は疾患の型及び重症度、並びに患者の年齢、性別及び体重のような因子に応じて典型的に異なる。また、この用語は、所望の治療作用、例えば、鎮痛を促進するのに有効な、治療剤の量、又は治療剤の送達速度(例えば、経時的量)を指す。正確な所望の治療作用は、治療する症状、患者の耐性、投与する薬剤及び/又は薬剤製剤(例えば、治療剤の効力、製剤中の薬剤の濃度等)、並びに当業者により理解される他の多様な因子に応じて異なる。一部の場合では、所望の生物学的又は医学的応答は、数日、数週間、又は数年にわたる複数回投与量の組成物の対象への投与後に達成される。

本出願を通じて、種々の論文を参照する。このような論文の開示の全体は、これが属する分野の先行技術を更に十分に記載するために本明細書において参照により本出願に組み込む。また、開示する参考文献は、これらに含まれる物質について、参照により本明細書に個々にかつ詳細に組み込み、これは、参考文献を信頼する文中において考察する。

B.組成物
開示の組成物、並びに本明細書に開示の方法において使用する組成物それ自体の調製に使用する成分を開示する。これら及び他の物質を本明細書において開示し、このような物質の組合せ、サブセット、相互作用、群等を開示する場合、このような化合物のそれぞれの種々の個体及び集団的組合せ並びに順列の特定の参照を明示的には開示しない可能性を有し、それぞれを詳細に検討し、本明細書に記載することが理解される。例えば、特定の1型IFN及び免疫刺激性物質含有腫瘍溶解性ウイルスを開示及び考察し、1型IFN及び免疫刺激性物質含有腫瘍溶解性ウイルスを含む多数の分子になされ得る多数の修飾を考察する場合、1型IFN及び免疫刺激性物質含有腫瘍溶解性ウイルスのありとあらゆる組合せ及び順列、並びにそれとは反対の詳細に指示しない限り可能な修飾を詳細に検討する。従って、ある種の分子A、B及びC並びにある種の分子D、E及びF並びに分子の組合せの例を開示する場合、A～Dを開示し、次いで、それぞれを個々には列挙しなくても、個々にかつ集合的に検討する、A～E、A～F、B～D、B～E、B～F、C～D、C～E及びC～Fの組合せを意味するそれぞれを開示すると考える。同様に、これらの任意のサブセット又は組合せをも開示する。従って、例えば、A～E、B～F及びC～Eの亜群を開示すると考える。この概念は、本出願の全ての態様に適用し、開示の組成物を生成及び使用する方法における工程を含むが、これに限定されない。従って、実施可能な多様な更なる工程が存在する場合、このような更なる工程のそれぞれを、本開示の方法の特定の任意の実施形態又は実施形態の組合せにより実施可能であることが理解される。

CD40Lリガンドによる、DC上に発現するCD40のエンゲージメントによって、CD8T細胞を活性化する重要な交差提示機能の獲得が生じる。結果的に、CD40アゴニストの治療的使用は、強力な抗腫瘍T細胞免疫を引き起こす可能性を有する。最近の臨床試験では、ICIによるCD40アゴニスト抗体及び化学療法の組合せの全身送達の有望な応答率が示されたが、これは、著しい毒性とも関連した。1型IFNは、複数の細胞型における免疫機能遺伝子の発現を増加させることにより腫瘍免疫原性を増強するこれらの役割に加えて、樹状細胞(DC)及びT細胞の両方の機能の直接的活性化因子として機能し得る。1型IFNのこの鍵となる免疫刺激機能は、1型IFN発現の刺激因子、例えば、STING及びTLR9アゴニストの使用により最近開発された。CD40ライゲーションと1型IFNの刺激因子との間にロバストなCD8 T細胞活性化に関して相乗関係が発生する。しかし、CD40アゴニスト及び1型IFNの活性化因子を組み合わせた全身投与は、高い毒性を有する。

病巣内免疫療法の手法では、腫瘍は、ワクチン部位として作用し、DCの活性化及び後続のT細胞刺激が生じて、遠位の非処置腫瘍の増殖を調節することが可能な全身性抗腫瘍免疫がもたらされる。全身毒性の回避を目標としたこのような手法は、STING及びTLR9アゴニストにより最近試験された。CD40及び1型IFNシグナル伝達の複合的病巣内活性化により、腫瘍微小環境(TME)においてロバストな免疫活性化が生じて、全身T細胞応答における高レベルの上昇が生じることがここで示される。

腫瘍溶解性ウイルス(OV)は、がん細胞において特異的に複製するこれらの能力について開発された。最近の研究は、宿主抗腫瘍免疫の刺激が、OVの作用の鍵となる機構であることを示す。また、OVにより、免疫応答の強力な活性化因子を発現させて、抗腫瘍免疫を更に増強するために使用し得る導入遺伝子をコードする能力を有することが可能となる。TMEにおける免疫刺激分子(例えば、CD40等)及び/又は1型IFNシグナル伝達を活性化可能な病巣内送達したOVが、全身T細胞応答の強力な活性化因子として機能し得ることが本明細書において示される。これを吟味するために、キメラCD40Lリガンド(MEM40)及びIFNβを発現する、条件的に複製可能なアデノウイルス5型をMemgen, Inc.社と共同で開発した。我々は、MEM-288により、CD40L及びIFNβの高レベル発現が誘導され、マウスメラノーマ及び肺腫瘍モデルにおいて遠位の腫瘍増殖を著しく削減することが可能である、ロバストな全身T細胞応答が誘導されることを更に実証した。

一態様では、a)1つ若しくは複数の1型インターフェロン(IFN)(例えば、IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω及び/又はIFN-ζ等)及び/又は1つ若しくは複数の外因性免疫刺激分子(例えば、CD40-L、MEM40、B7-l(CD80)/B7-2(CD86)、OX40L、4-lBBL、CD70、GITRL、LIGHT、TIM-4、ICAM-1、CD58及び/又はSLAMF6等)を発現する腫瘍溶解性ウイルスを腫瘍細胞内に投与する工程と、b)腫瘍浸潤リンパ球を回収する工程とを含む、腫瘍浸潤リンパ球を生成する方法を本明細書において開示する。腫瘍内注射を含むが、これに限定されない本技術分野において公知の任意の手段により、腫瘍溶解性ウイルスを腫瘍に投与することができることを理解し、本明細書において検討する。上記の方法によって腫瘍部位においてTIL及びMILの数の劇的な増加が生じるが、治療する腫瘍微小環境外の腫瘍部位においてTIL及びMilが生成及び/又は増加し得ること(即ち、アブスコパル作用)も認識される。

TIL及びMIL数が腫瘍溶解性ウイルス投与の標的部位及び/又はアブスコパルな腫瘍部位において増加するというだけで、更なる増殖が発生し得ないことを意味しない。一態様では、このTIL及びMILをex vivoで培養する場合、更に増殖させ得ることを理解し、本明細書において検討する。従って、回収したTILをex vivoで増殖させる工程を更に含む、腫瘍浸潤リンパ球を生成する方法をも本明細書において開示する。

一態様では、TIL及びMILの増殖では、腫瘍に腫瘍溶解性ウイルスの注射を投与して回収するin vivoでの腫瘍溶解性ウイルス方法に制限する必要を有せず、むしろ、がん部位においてTIL及びMILを回収し、次いで、腫瘍溶解性ウイルスを感染させた抗原提示細胞の存在下で回収した細胞を培養することにより、TILの増殖がex vivoで発生し得ることを理解し、本明細書において検討する。従って、TIL及び/又はMILの増殖は、完全にex vivoで発生する。よって、a)がんを有する対象からTIL又はMILを回収する工程と、b)1つ若しくは複数の1型インターフェロン(IFN)(例えば、IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω及び/又はIFN-ζ等)及び/又は1つ若しくは複数の外因性免疫刺激分子(例えば、CD40-L、MEM40、B7-l(CD80)/B7-2(CD86)、OX40L、4-lBBL、CD70、GITRL、LIGHT、TIM-4、ICAM-1、CD58及び/又はSLAMF6等)を発現する腫瘍溶解性ウイルスを感染させた抗原提示細胞の存在下で回収したTIL又はMILを培養する工程とを含む、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)又は骨髄浸潤リンパ球(MIL)の集団を増殖させる方法を本明細書において開示する。

特定の実施形態では、1つ若しくは複数の1型インターフェロン(IFN)(例えば、IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω及び/又はIFN-ζ等)及び/又は1つ若しくは複数の外因性免疫刺激分子(例えば、CD40-L、MEM40、表面抗原分類(CD)80及び/若しくはCD86(B7-1(CD80)及びB7-2(CD86)としても知られる)、OX40L、4-lBBリガンド(4-1BBL)、CD70、LIGHT、グルココルチコイド誘導TNFR関連タンパク質リガンド(GITRL)、LIGHT、T-細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン4(TIM-4)、細胞内接着分子1(ICAM-1)、CD58、並びに/又はシグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAM)ファミリーメンバー6(SLAMF6)等)或いはこれらの任意の組合せを発現するウイルスベクター、例えば、レンチウイルスを本発明において提供する。

本発明の更なる実施形態では、1型IFN、例えば、IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ及びIFN-ω並びに免疫刺激分子(例えば、CD40-L、MEM40、B7-l(CD80)/B7-2(CD86)、OX40L、4-lBBL、CD70、GITRL、LIGHT、TIM-4、ICAM-1、CD58及び/又はSLAMF6等)の任意の組合せを、例えば、IFN-β及びCD40-Lの組合せをコードする1つ又は複数の異種核酸配列を介して発現する腫瘍溶解性ウイルスを提供する。任意の腫瘍溶解性ウイルスを利用し得る。一部の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、アデノウイルス、レオウイルス、ヘルペスウイルス、ピコルナウイルス(コクサッキーウイルス、ポリオウイルス及びセネカバレーウイルスを含む)、パラミクソウイルス(麻疹ウイルス及びニューキャッスル病ウイルス(NDV)を含む)、パルボウイルス、ラブドウイルス(水疱性口内炎ウイルス(VSV)を含む)又はワクシニアウイルスであり得る。好ましくは、腫瘍溶解性ウイルスは、複製可能である。

本発明の更なる実施形態では、チェックポイント阻害剤を対象に投与することによる組合せによって、本明細書に開示の腫瘍溶解性ウイルスを投与することにより、対象における悪性病変を治療する方法を提供する。

IFN-αは、配列番号1の配列により表すヒトIFN-αであり得る。IFN-αは、哺乳動物IFN-α、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ネコ、イヌ又はウシIFN-αであり得る。他の哺乳動物由来のIFN-αの更なる実施形態は、当業者に公知であり、このような実施形態は、本発明の範囲内である。特定の実施形態では、IFN-αは、ヒト野生型IFN-α、例えば、配列番号1のIFN-aに対して80.00%から最大で99.99%を含む(例えば、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99%の)配列同一性を有する。

IFN-βは、配列番号2の配列により表すヒトIFN-βであり得る。IFN-βは、哺乳動物IFN-β、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ネコ、イヌ又はウシIFN-βであり得る。他の哺乳動物由来のIFN-βの更なる実施形態は、当業者に公知であり、このような実施形態は、本発明の範囲内である。特定の実施形態では、IFN-βは、ヒト野生型IFN-β、例えば、配列番号2のIFN-βに対して80.00%から最大で99.99%を含む(例えば、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99%の)配列同一性を有する。特定の実施形態では、IFN-βは、配列番号2の最初の22アミノ酸を欠き、任意選択で、生じる165アミノ酸ペプチドのシステイン17のセリンとの置換を更に有する。

IFN-εは、配列番号3の配列により表すヒトIFN-εであり得る。IFN-εは、哺乳動物IFN-ε、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ネコ、イヌ又はウシIFN-εであり得る。他の哺乳動物由来のIFN-eの更なる実施形態は、当業者に公知であり、このような実施形態は、本発明の範囲内である。特定の実施形態では、IFN-εは、ヒト野生型IFN-ε、例えば、配列番号3のIFN-εに対して80.00%から最大で99.99%を含む(例えば、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99%の)配列同一性を有する。

IFN-κは、配列番号4の配列により表すヒトIFN-κであり得る。IFN-κは、哺乳動物IFN-κ、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ネコ、イヌ又はウシIFN-κであり得る。他の哺乳動物由来のIFN-κの更なる実施形態は、当業者に公知であり、このような実施形態は、本発明の範囲内である。特定の実施形態では、IFN-κは、ヒト野生型IFN-κ、例えば、配列番号4のIFN-κに対して80.00%から最大で99.99%を含む(例えば、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99%の)配列同一性を有する。

IFN-ωは、配列番号5の配列により表すヒトIFN-ωであり得る。IFN-ωは、哺乳動物IFN-ω、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ネコ、イヌ又はウシIFN-ωであり得る。他の哺乳動物由来のIFN-ωの更なる実施形態は、当業者に公知であり、このような実施形態は、本発明の範囲内である。特定の実施形態では、IFN-ωは、ヒト野生型IFN-ω、例えば、配列番号5のIFN-ωに対して80.00%から最大で99.99%を含む(例えば、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99%の)配列同一性を有する。

CD40-Lは、配列番号6の配列により表すヒトCD40-Lであり得る。CD40-Lは、哺乳動物CD40-L、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ネコ、イヌ又はウシCD40-Lであり得る。他の哺乳動物由来のCD40-Lの更なる実施形態は、当業者に公知であり、このような実施形態は、本発明の範囲内である。特定の実施形態では、CD40-Lは、ヒト野生型CD40-L、例えば、配列番号6のCD40-Lに対して80.00%から最大で99.99%を含む(例えば、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99%の)配列同一性を有する。

CD40-Lは、キメラCD40-L又は非キメラCD40-Lポリペプチドであり得る。一部の実施形態では、本発明の腫瘍溶解性ウイルスにおいて発現するCD40-Lは、キメラCD40-Lである。このようなキメラCD40-Lポリペプチドは、少なくとも2つの異なる種由来のCD40-L、例えば、ヒト及びマウスCD40-Lのドメイン又はサブドメインを含む。キメラCD40-Lにより、天然に存在するCD40-Lと比較して高い免疫応答刺激がもたらされる。本発明における使用に適するキメラCD40-Lの例は、米国特許第7,495,090号、第7,928,213号、及び第8,138,310号に開示されている。このような特許のそれぞれは、これらの全体を参照により本明細書に組み込む。

キメラCD40-Lの特定の実施形態では、ヒトCD40-Lの切断部位を含むCD40-Lの少なくとも1つのドメイン又はサブドメインは、非ヒトCD40-L、好ましくは、マウスCD40-Lの対応するドメイン又はサブドメインと置換する。加えて、キメラCD40-Lは、CD40-L受容体に結合するヒトCD40-Lのドメイン又はサブドメインを含み得る。ヒトCD40-L(配列番号6)のドメインI～IVは、配列番号6のアミノ酸部分1～14、14～45、46～110及び111～261に対応する。当業者は、ヒトCD40-Lによる非ヒトCD40-Lの配列アラインメントに基づいて非ヒトCD40-LのドメインI～IVを決定することができる。非ヒトCD40-Lの特定のドメイン位置は、米国特許第7,495,090号のTable1に提示され、これは、この全体を参照により本明細書に組み込む。

一部の実施形態では、キメラCD40-Lは、サブドメインをヒトCD40-Lの切断部位と置換する非ヒトCD40-Lの第1のサブドメイン、及びCD40-L受容体に結合するヒトCD40-Lの第2のサブドメインを含む。

第1のサブドメインは、非ヒトCD40-LのドメインIVのサブドメインを含み得る。加えて、第1のサブドメインは、非ヒトCD40-LのドメインIII又はサブドメイン若しくはドメインIIIを更に含み得る。特定の実施形態では、第1のサブドメインは、ヒトCD40-Lの切断部位の部分と置換する。更なる実施形態では、非ヒトCD40-LのドメインIV又はドメインIVのサブドメイン、及び任意選択で、ドメインIII又はドメインIIIのサブドメインに加えて、キメラCD40-Lは、ドメインII又はドメインIIのサブドメインを更に含む。その上、キメラCD40-Lの第1のサブドメインは、非ヒトCD40-LのドメインI又はサブドメイン若しくはドメインIを含み得る。従って、特定のキメラCD40-Lでは、第1のサブドメインは、非ヒトCD40-LのドメインI、II、III及びIVのドメイン又はサブドメインを含む。好ましい実施形態では、非ヒトCD40-Lは、マウスCD40-Lである。

好ましい実施形態では、キメラヒト/マウスCD40リガンドは、ヒトCD40Lとの92%のアミノ酸配列相同性を有する(配列番号12)(米国特許第7,495,090号を参照、これは参照により本明細書に組み込み、本明細書において「MEM40」と呼ぶ)。「CD40リガンド」及び「CD40-L」は、本明細書において互換的に使用してもよく、「CD154」とも呼び得る。詳細には、その分子の細胞内、膜内、及び近位の細胞外ドメインをそれぞれ含む領域であるドメインI、II及びIIIは、完全にヒト化されている。分子のCD40結合部分を含むドメインIVでは、細胞における最適CD40リガンド発現に必要なマウスドメインのみを維持する。MEM40は、分子の3'末端において完全にヒト化されており、ヒトに投与した場合、ここで抗体結合により、マウスCD154(CD40リガンド)の活性が中和される。

本発明において有用なキメラCD40-Lの非限定的な例としては、次の配列が挙げられる。
配列番号7

配列番号8

配列番号9

配列番号10

配列番号11

配列番号12

配列番号13

配列番号14

配列番号15

配列番号16

配列番号17

配列番号18

配列番号7～18のキメラCD40-Lをコードする特定のヌクレオチド配列は、米国特許第7,495,090号、第7,928,213号、及び第8, 138,310号に開示されている。このようなヌクレオチド配列は、参照により本明細書に組み込み、このようなヌクレオチド配列の使用を本明細書において想定する。

本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、IFN-αをコードする核酸を含んでもよく、ここで、IFN-αは、ヒト野生型IFN-α(配列番号1)、又はヒト野生型IFN-α、例えば、配列番号1のIFN-αに対して80.00%から最大で99.99%を含む(例えば、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99%の)配列同一性を有するIFN-αを含む。

本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、IFN-βをコードする核酸を含んでもよく、ここで、IFN-βは、ヒト野生型IFN-β(配列番号2)、又はヒト野生型IFN-β、例えば、配列番号2のIFNPに対して80.00%から最大で99.99%を含む(例えば、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99%の)配列同一性を有するIFN-βを含む。特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号2の最初の22アミノ酸を欠くIFN-βをコードし、任意選択で、生じる165アミノ酸ペプチドのシステイン17のセリンとの置換を更に有する。

本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、IFN-εをコードする核酸を含んでもよく、ここで、IFN-εは、ヒト野生型IFN-ε(配列番号3)、又はヒト野生型IFN-ε、例えば、配列番号3のIFN-εに対して80.00%から最大で99.99%を含む(例えば、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99%の)配列同一性を有するIFN-εを含む。

本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、IFN-κをコードする核酸を含んでもよく、ここで、IFN-κは、ヒト野生型IFN-κ(配列番号4)、又はヒト野生型IFN-κ、例えば、配列番号4のIFN-κに対して80.00%から最大で99.99%を含む(例えば、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99%の)配列同一性を有するIFN-κを含む。

本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、IFN-ωをコードする核酸を含んでもよく、ここで、IFN-ωは、ヒト野生型IFN-ω(配列番号5)、又はヒト野生型IFN-ω、例えば、配列番号5のIFN-ωに対して80.00%から最大で99.99%を含む(例えば、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99%の)配列同一性を有するIFN-ωを含む。

本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、CD40-Lをコードする核酸を含んでもよく、ここで、CD40-Lは、ヒト野生型CD40-L (配列番号6)、又はヒト野生型CD40-L、例えば、配列番号6のCD40-Lに対して80.00%から最大で99.99%を含む(例えば、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99%の)配列同一性を有するCD40-Lを含む。また、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、キメラCD40-Lをコードする核酸を含んでもよく、ここで、キメラCD40-Lは、配列番号7～18から選択される配列、又は配列番号7～18から選択される配列を有するキメラCD40-Lに対して80.00%から最大で99.99%を含む(例えば、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99%の)配列同一性を有するCD40-Lを有する。

好ましい実施形態では、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、MEM40をコードする核酸を含み得る。例えば、好ましい実施形態では、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、ヒトIFNβ(配列番号2)に対して少なくとも80%の配列同一性を含むIFNβを含み、CD40-Lは、配列番号12の配列を有するキメラCD40-Lに対して少なくとも80%の配列同一性を含む。

1型IFNとCD40-Lとの組合せをコードする1つ又は複数の異種核酸配列は、1つ又は複数のウイルス構築物に存在し得る。ウイルス構築物の非限定的な例としては、アデノウイルス構築物、アデノ随伴ウイルス構築物(AAV)、ポックスウイルス構築物、レンチウイルス構築物、アルファウイルス構築物、ヘルペスウイルス構築物、レトロウイルス構築物、ワクシニアウイルス構築物、水疱性口内炎ウイルス構築物、又は単純ヘルペスウイルス構築物が挙げられる。

1型インターフェロン(例えば、IFNP)及びCD40-L(キメラヒト/マウスCD40-L)をコードする核酸に加えて、本発明による腫瘍溶解性ウイルスは、このゲノムにおいて他の修飾を更に含み得る。例えば、これは、既に不活化した遺伝子内に挿入するか又は欠失させた遺伝子に対して置換した、更なるDNAを含み得る。また、腫瘍溶解性ウイルスは、増強レベルの腫瘍細胞特異性をウイルスに付与する1つ又は複数のプロモーターをそこに組み込み得る。このようにして、腫瘍溶解性ウイルスは、がん細胞特異的プロモーターを使用して特定のがん型を標的とし得る。「腫瘍細胞特異的プロモーター」又は「腫瘍細胞特異的転写制御配列」又は「腫瘍特異的プロモーター」又は「腫瘍特異的転写制御配列」の用語は、転写制御配列、標的がん細胞に正常細胞よりも高レベルで存在するプロモーター及び/又はエンハンサーを示す。例えば、本発明における使用のための腫瘍溶解性ウイルスは、外因的に加えた制御因子の調節下に存在し得る。

好ましい実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、アデノウイルス(Ad)である。Adは、ヒトに感染する大型(約36kb)のDNAウイルスであるが、広範な宿主範囲をも呈する。物理的には、アデノウイルスは、二重鎖の直鎖DNAゲノムを含む正二十面体のウイルスである。約50血清型のヒトアデノウイルスが存在し、これは分子的、免疫学的、及び機能的基準に基づいて6つのファミリーに分けられる。成人期までには、実質的に全てのヒトが、更に一般的なアデノウイルス血清型に感染しており、主要な作用は、感冒様症候である。

宿主細胞のアデノウイルス感染により、アデノウイルスDNAがエピソームに維持され、これは、ベクターの組込みと関連する潜在的遺伝子毒性を低減する。加えて、アデノウイルスは、構造的に安定であり、大規模な増幅後にゲノム再配列は検出されていない。アデノウイルスは、細胞周期段階にかかわらず殆どの上皮細胞に感染し得る。今までのところ、アデノウイルス感染は、ヒトにおける軽度の疾患、例えば、急性呼吸器疾患のみに関連すると思われる。

アデノウイルスの感染周期は、2工程:アデノウイルスゲノムの複製開始に先行し、制御タンパク質及びウイルスDNAの複製及び転写に関与するタンパク質の産生が可能となる初期相と、構造タンパク質の合成が引き起こされる後期相とにより生じる。初期遺伝子は、アデノウイルスゲノムに散在する、E1～E4と名付けられた(「E」は「初期」を意味する)4つの領域に分布する。初期領域は、少なくとも6つの転写単位を含み、このそれぞれは、独自のプロモーターを有する。初期遺伝子の発現は、それ自体で制御され、一部の遺伝子は、他より先に発現する。3つの領域、E1、E2及びE4は、ウイルスの複製に必須である。従ってアデノウイルスが、このような機能のうちの1つに欠陥を有する場合、このタンパク質は、トランスに供給しなければならないか、又はウイルスは、複製不能である。

E1初期領域は、アデノウイルスゲノムの5'末端に位置し、2つのウイルス転写単位、E1A及びE1Bを含む。この領域は、非常に初期にウイルス周期に関与し、アデノウイルスの殆ど全ての他の遺伝子の発現に必須のタンパク質をコードする。特には、E1A転写単位は、E1B、E2A、E2B、E3及びE4領域のプロモーターによる転写を含む他のウイルス遺伝子並びに後期遺伝子の転写をトランス活性化するタンパク質をコードする。

アデノウイルスは、細胞表面受容体を介して許容宿主細胞に進入し、次いで、内部移行する。複製周期の最初の工程に必要とされる特定のウイルスタンパク質と関連するウイルスDNAは、感染細胞の核に進入し、ここで転写が開始される。アデノウイルスDNAの複製は、感染細胞の核において生じ、細胞複製を必要としない。新たなウイルス粒子又はビリオンは、会合した後、感染細胞から放出され、他の許容細胞に感染し得る。

アデノウイルスは、魅力的な送達系である。本開示の実施形態では、広範な予防及び治療の両ワクチン製剤に適するものとするタンパク質、血清、及び動物由来成分を含まないか又は本質的に含まない可能性を有する製造プロセスを利用することができる。

条件的に複製可能(特定の条件下で複製可能)であるようにアデノウイルスが変異している場合、ウイルス複製にヘルパー細胞を必要とし得る。必要とする場合、ヘルパー細胞株は、ヒト細胞、例えば、ヒト胚性腎臓細胞、筋肉細胞、造血細胞、又は他のヒト胚性間葉若しくは上皮細胞に由来し得る。或いは、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスに許容的な他の哺乳動物種の細胞に由来し得る。このような細胞としては、例えば、ベロ細胞、又は他のサル胚性間葉若しくは上皮細胞が挙げられる。特定の態様では、ヘルパー細胞株は、293である。宿主及びヘルパー細胞を培養する種々の方法は、当技術分野において見出され得る(例えば、Racher, A.J.、Fooks, A.R. & Griffiths, J.B. Biotechnol Tech(1995) 9: 169)。

1.医薬担体/医薬製剤の送達
上記のように、組成物はまた、薬学的に許容される担体によりin vivoで投与することができる。「薬学的に許容される」により、生物学的又はその他により不適当ではない物質を意味する。即ち、物質は、不適当ないかなる生物学的作用も発生させることなく、又は含まれる医薬組成物の他の成分のいずれかと有害に相互作用することなく、核酸又はベクターとともに対象に投与し得る。担体は、当業者に周知のように、活性成分のいかなる分解をも最小化し、対象において有害ないかなる副作用をも最小化するように当然選択される。

組成物は、経口的、非経口的(例えば、静脈内)に、筋肉内注射により、腹腔内注射により、経皮的に、体外から、局所的等により投与してもよく、局所的鼻腔内投与、又は吸入による投与を含む。本明細書において使用する場合、「局所的鼻腔内投与」は、一方又は両方の鼻孔からの鼻及び鼻腔への組成物の送達を意味し、核酸又はベクターの噴霧機構若しくは液滴機構、又はエアロゾル化による送達を含み得る。吸入による組成物の投与は、噴霧又は液滴機構による送達を介する鼻又は口からの投与であり得る。また、送達では、挿管を介する呼吸器系(例えば、肺)の任意の領域に送達することができる。必要とされる組成物の正確な量は、対象の種、年齢、体重及び全身状態、治療するアレルギー障害の重症度、使用する特定の核酸又はベクター、この投与方法等に応じて、対象毎に異なる。従って、全ての組成物の正確な量を特定することは不可能である。しかし、適切な量は、本明細書の教示を考慮し日常の実験法のみを使用して、当業者により決定することができる。

組成物の非経口投与は、使用する場合、注射により一般に特徴づけられる。注射剤は、溶液若しくは懸濁液のいずれかとして、注射前の液中懸濁の溶液に適する固形形態で、又は乳濁液として、従来の形態で調製することができる。非経口投与のための更に最近の改訂手法は、一定の投与量を維持するような徐放又は持続放出系の使用を含む。例えば、米国特許第3,610,795号を参照されたく、これは、参照により本明細書に組み込む。

物質は、溶液、懸濁液中に存在し得る(例えば、微小粒子、リポソーム又は細胞に組み込む)。これらは、抗体、受容体、又は受容体リガンドを介して特定の細胞型を標的とし得る。次の参考文献は、腫瘍組織に対して特異的なタンパク質を標的とするこの技術の使用の例である(Senterら、Bioconjugate Chem.、2:447～451頁(1991); Bagshawe, K.D.、Br. J. Cancer、60:275～281頁(1989); Bagshaweら、Br. J. Cancer、58:700～703頁(1988); Senterら、Bioconjugate Chem.、4:3～9頁(1993); Battelliら、Cancer Immunol. Immunother.、35:421～425頁(1992); Pietersz及びMcKenzie、Immunolog. Reviews、129:57～80頁(1992);並びにRofflerら、Biochem. Pharmacol、42:2062～2065頁(1991))。媒体、例えば、「ステルス」及び他の抗体コンジュゲートリポソーム(結腸癌の液体媒介薬物標的化を含む)、細胞特異的リガンドによるDNAの受容体媒介標的化、リンパ球特異的腫瘍標的化、並びにin vivoでのマウス神経膠腫細胞の高度に特異的な治療的レトロウイルス標的化。次の参考文献は、腫瘍組織に対して特異的なタンパク質を標的とするこの技術の使用の例である(Hughesら、Cancer Research、49:6214～6220頁(1989);並びにLitzinger及びHuang、Biochimica et Biophysica Acta、1104:179～187頁(1992))。一般には、受容体は、構成的又はリガンド誘導のいずれかのエンドサイトーシスの経路に関与する。クラスリン被覆ピット内のこのような受容体クラスターは、クラスリン被覆小胞を介して細胞に進入し、受容体が選別される酸性化エンドソームを通過し、次いで、細胞表面へ再循環するか、細胞内に貯蔵されるか、又はリポソームで分解される。内部移行経路は、例えば、栄養素取込み、活性化タンパク質の除去、高分子のクリアランス、ウイルス及びトキシンの日和見進入、リガンドの解離及び分解、並びに受容体レベル制御のような多様な機能を果たす。多くの受容体は、細胞型、受容体濃度、リガンド型、リガンド結合価、及びリガンド濃度に応じて1つ以上の細胞内経路に従う。受容体媒介エンドサイトーシスの分子及び細胞機構については、総説が記載されている(Brown及びGreene、DNA and Cell Biology 10:6、399～409頁(1991))。

a)薬学的に許容される担体
抗体を含む組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせて治療的に使用することができる。

適する担体及びこれらの製剤は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (第１９版)A.R. Gennaro編、Mack Publishing Company,、Easton、PA 1995に記載されている。典型的には、適量の薬学的に許容される塩は、製剤を等張性とするために製剤に使用する。薬学的に許容される担体の例としては、食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液が挙げられるが、これらに限定されない。溶液のpHは、好ましくは、およそ5～およそ8であり、より好ましくは、およそ7～およそ7.5である。更に、担体は、持続放出製剤、例えば、抗体を含む固形疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは、造形品、例えば、フィルム、リポソーム又は微小粒子の形態である。特定の担体が、例えば、投与する組成物の投与経路及び濃度に応じて、より好ましい可能性を有することは当業者に明らかである。

医薬担体は、当業者に公知である。これらの最も典型的なものは、薬物のヒトへの投与のための標準的担体であり、生理学的pHの滅菌水、食塩水、及び緩衝液のような溶液を含む。組成物は、筋肉内又は皮下に投与することができる。他の化合物は、当業者により使用される標準的手順に従って投与する。

医薬組成物は、選択された分子に加えて担体、増粘剤、希釈剤、緩衝液、保存剤、界面活性剤等を含み得る。また、医薬組成物は、1つ又は複数の活性成分、例えば、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔剤等を含み得る。

医薬組成物は、局所的又は全身的治療が望ましいか、及び治療する領域に応じて多数の方法により投与し得る。投与は、局所(眼内、膣内、直腸内、鼻腔内を含む)、吸入による経口、又は例えば、静脈点滴、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注射による非経口投与であり得る。開示する抗体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、又は経皮的に投与することができる。

非経口投与のための製剤は、滅菌の水性又は非水性溶液、懸濁液、及び乳濁液を含む。非水性溶液の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えば、オリーブ油、及び注射用有機エステル、例えば、オレイン酸エチルである。水性担体は、水、アルコール/水溶液、乳濁液、又は懸濁液を含み、食塩水、及び緩衝培地を含む。非経口媒体は、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、又は固定油を含む。静脈内媒体は、液体及び栄養補給剤、電解質補給剤(例えば、リンゲルデキストロースを基剤とするもの)等を含む。保存剤及び他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガス等も存在し得る。

局所投与のための製剤は、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、液滴、坐剤、噴霧剤、液剤、及び散剤を含み得る。従来の医薬担体、水性、粉末又は油性基剤、増粘剤等が必要であるか又は望ましい可能性を有する。

経口投与のための組成物は、粉末又は顆粒、水又は非水性培地中の懸濁液又は溶液、カプセル、サシェ、又は錠剤を含む。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、又は結合剤が望ましい可能性を有する。

組成物の一部は、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸及びリン酸、並びに有機酸、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸及びフマル酸による反応、又は無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムと、有機塩基、例えば、モノ、ジ、トリアルキル及びアリールアミン並びに置換されたエタノールアミンとによる反応によって形成される、薬学的に許容される酸又は塩基付加塩として潜在的に投与し得る。

b)治療的使用
組成物を投与するための有効投与量及びスケジュールは、経験的に決定することができ、このような決定は、当技術分野の範囲内である。組成物の投与のための投与量範囲は、障害の症候が影響される所望の作用をもたらすのに十分に広い範囲である。投与量は、有害な副作用、例えば、不必要な交差反応、アナフィラキシー反応等が発生するほど広くあってはならない。一般には、投与量は、年齢、症状、性別、及び患者における疾患の程度、投与経路、又は他の薬物が計画に含まれるかどうかにより異なり、当業者により決定することができる。投与量は、禁忌の場合では、それぞれの医師により調整することができる。投与量は、変動してもよく、1日又は数日の間、毎日1回又は複数回用量の投与で投与することができる。所与の種の医薬製剤の適切な投与量についてのガイダンスは、文献において見出すことができる。例えば、抗体の適切な用量の選択におけるガイダンスは、抗体の治療的使用についての文献、例えば、Handbook of Monoclonal Antibodies、Ferroneら編、Noges Publications、Park Ridge、NJ.(1985) ch. 22及び303～357頁; Smithら、Antibodies in Human Diagnosis and Therapy、Haberら編、Raven Press、New York(1977)365～389頁に見出すことができる。単独で使用する抗体の典型的な毎日の投与量は、上記の因子に応じて、1日あたり体重のおよそ1μg/kg～最大100mg/kg又はこれ以上の範囲であり得る。

C.がんを治療する方法
本開示の組成物は、調節不能な細胞増殖が発生する任意の疾患、例えば、がんを治療するために使用することができる。開示の組成物を治療に使用可能な、がんの代表的であるが、非限定的なリストは、次の通りである:リンパ腫、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱がん、脳がん、神経系がん、頭頸部がん、頭頸部扁平上皮癌、肺がん、例えば、小細胞肺がん及び非小細胞肺がん、神経芽細胞腫/神経膠芽腫、卵巣がん、皮膚がん、肝臓がん、メラノーマ、口、咽喉、咽頭、及び肺の扁平上皮癌、子宮頸がん、子宮頸癌、乳がん、及び上皮がん、腎臓がん、泌尿生殖器がん、肺がん、食道癌、頭頸部癌、大腸がん、造血系がん;精巣がん;結腸がん、直腸がん、前立腺がん、又は膵臓がん。

一態様では、増殖させた本明細書に開示のTIL又はMILのいずれかを対象に投与する工程を含む、対象におけるがん及び/又は転移(アブスコパル腫瘍を含む)を治療、減少、阻害、低下、回復、及び/又は予防する方法を本明細書において開示する。例えば、a)1つ若しくは複数の1型インターフェロン(IFN)(例えば、IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω及び/又はIFN-ζ等)及び/又は1つ若しくは複数の外因性免疫刺激分子(例えば、CD40-L、MEM40、B7-l(CD80)/B7-2(CD86)、OX40L、4-lBBL、CD70、GITRL、LIGHT、TIM-4、ICAM-1、CD58及び/又はSLAMF6等)を発現する腫瘍溶解性ウイルスを腫瘍細胞内に投与する工程と、b)腫瘍浸潤リンパ球(TIL)及び/又は骨髄浸潤リンパ球(MIL)を回収する工程と、c)回収したTIL及び/又はMILをex vivoで増殖させる工程と、d)増殖させたTIL及び/又はMILを対象に投与する工程とを含む、対象におけるがん及び/又はがんの転移を治療、減少、阻害、低下、回復、及び/又は予防する方法を本明細書において開示する。一部の態様では、治療、減少、阻害、低下、回復、及び/又は予防する癌性又は転移性腫瘍は、本明細書に開示の腫瘍溶解性ウイルス及び/又はTIL若しくはMILのいずれかを受ける腫瘍に対してアブスコパルである。

或いは、TIL又はMILは、腫瘍から最初に回収し、次いで、1つ又は複数の1型インターフェロン(IFN)及び/又は1つ又は複数の外因性免疫刺激分子を発現する腫瘍溶解性ウイルスに感染させた抗原提示細胞の存在下でex vivoで増殖させて、増殖させたTIL及び/又はMILを対象に投与することができる。次いで、増殖させたTIL又はMILは、がんを有する対象に投与(養子導入)することができる。従って、一態様では、a)がんを有する対象から腫瘍浸潤リンパ球(TIL)及び/又は骨髄浸潤リンパ球(MIL)を回収する工程と、1つ若しくは複数の1型インターフェロン(IFN)(例えば、IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω及び/又はIFN-ζ等)及び/又は1つ若しくは複数の外因性免疫刺激分子(例えば、CD40-L、MEM40、B7-l(CD80)/B7-2(CD86)、OX40L、4-lBBL、CD70、GITRL、LIGHT、TIM-4、ICAM-1、CD58及び/又はSLAMF6等)を発現する腫瘍溶解性ウイルスに感染させた抗原提示細胞の存在下で、回収したTIL又はMILを培養する工程と、増殖させたTIL及び/又はMILを対象に投与する工程とを含む、対象におけるがん及び/又は転移を治療、減少、阻害、低下、回復、及び/又は予防する方法を本明細書において開示する。

一態様では、対象におけるがん治療の成功が重要であり、そのように成功するためには、更なる治療の施術を含み得ることを理解し、本明細書において検討する。従って、がんを治療、阻害、減少、及び/又は予防する開示の方法により、限定されないが、手術、放射線、及び/又は医薬によるがん治療を含む、任意のがん治療処置を増強させることが可能であることを本明細書において意図する。従って、開示の治療は、限定されないが、アベマシクリブ、アビラテロン酢酸エステル、アビトレキセート(Abitrexate)(メトトレキセート)、アブラキサン(パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子製剤)、ABVD、ABVE、ABVE-PC、AC、AC-T、アドセトリス(ブレンツキシマブベドチン)、ADE、Ado-トラスツズマブエムタンシン、アドリアマイシン(ドキソルビシン塩酸塩)、アファチニブマレイン酸塩、アフィニトール(エベロリムス)、アキンゼオ(Akynzeo)(ネツピタント及びパロノセトロン塩酸塩)、アルダラ(Aldara)(イミキモド)、アルデスロイキン、アレセンサ(アレクチニブ)、アレクチニブ、アレムツズマブ、アリムタ(ペメトレキセド二ナトリウム)、アリコパ(Aliqopa)(コパンリシブ塩酸塩)、注射用アルケラン(メルファラン塩酸塩)、アルケラン錠剤(メルファラン)、アロキシ(パロノセトロン塩酸塩)、アルンブリグ(ブリグチニブ)、アムボクロリン(Ambochlorin)(クロラムブシル)、アムボクロリンクロラムブシル、アミホスチン、アミノレブリン酸塩、アナストロゾール、アプレピタント、アレディア(パミドロン酸二ナトリウム)、アリミデックス(アナストロゾール)、アロマシン(エキセメスタン)、アラノン(Arranon)(ネララビン)、三酸化ヒ素、アーゼラ(オファツムマブ)、黒脚病菌(Erwinia chrysanthemi)アスパラギナーゼ、アテゾリズマブ、アバスチン(ベバシズマブ)、アベルマブ、アキシチニブ、アザシチジン、バベンチオ(アベルマブ)、BEACOPP、ベセヌム(Becenum)(カルムスチン)、ベレオダック(Beleodaq)(ベリノスタット)、ベリノスタット、ベンダムスチン塩酸塩、BEP、ベスポンサ(イノツズマブオゾガマイシン)、ベバシズマブ、ベキサロテン、ベキサール(トシツモマブ及びヨウ素I 131トシツモマブ)、ビカルタミド、BiCNU(カルムスチン)、ブレオマイシン、ブリナツモマブ、ビーリンサイト(ブリナツモマブ)、ボルテゾミブ、ボシュリフ(ボスチニブ)、ボスチニブ、ブレンツキシマブベドチン、ブリグチニブ、BuMel、ブスルファン、ブスルフェクス(ブスルファン)、カバジタキセル、カボメティクス(カボザンチニブ-S-リンゴ酸塩)、カボザンチニブ-S-リンゴ酸塩、CAFキャンパス(アレムツズマブ)、カムプトサール(Camptosar)(イリノテカン塩酸塩)、カペシタビン、CAPOX、カラック(Carac)(フルオロウラシル--局所用)、カルボプラチン、カルボプラチン-タキソール、カルフィルゾミブ、カルムブリス(Carmubris)(カルムスチン)、カルムスチン、カルムスチンインプラント、カソデックス(ビカルタミド)、CEM、セリチニブ、セルビジン(Cerubidine)(ダウノルビシン塩酸塩)、サーバリックス(組換えHPV 2価ワクチン)、セツキシマブ、CEV、クロラムブシル、クロラムブシル-プレドニゾン、CHOP、シスプラチン、クラドリビン、クラフェン(Clafen)(シクロホスファミド)、クロファラビン、クロファレックス(Clofarex)(クロファラビン)、クロラー(Clolar)(クロファラビン)、CMF、コビメチニブ、コメトリク(Cometriq)(カボザンチニブ-S-リンゴ酸塩)、コパンリシブ塩酸塩、COPDAC、COPP、COPP-ABV、コスメゲン(ダクチノマイシン)、コテリック(Cotellic)(コビメチニブ)、クリゾチニブ、CVP、シクロホスファミド、サイフォス(Cyfos)(イホスファミド)、サイラムザ(ラムシルマブ)、シタラビン、シタラビンリポソーム、サイトサール(Cytosar)-U(シタラビン)、シトキサン(シクロホスファミド)、ダブラフェニブ、ダカルバジン、ダコジェン(Dacogen)(デシタビン)、ダクチノマイシン、ダラツムマブ、ダラザレックス(ダラツムマブ)、ダサチニブ、ダウノルビシン塩酸塩、ダウノルビシン塩酸塩及びシタラビンリポソーム、デシタビン、デフィブロチドナトリウム、デファイテリオ(デフィブロチドナトリウム)、デガレリクス、デニロイキンジフチトクス、デノスマブ、デポサイト(シタラビンリポソーム)、デキサメタゾン、デクスラゾキサン塩酸塩、ジヌツキシマブ、ドセタキセル、ドキシル(ドキソルビシン塩酸塩リポソーム)、ドキソルビシン塩酸塩、ドキソルビシン塩酸塩リポソーム、Dox-SL(ドキソルビシン塩酸塩リポソーム)、DTIC-Dome(ダカルバジン)、デュルバルマブ、Efudex(フルオロウラシル--局所用)、エリテック(Elitek)(ラスブリカーゼ)、エレンス(Ellence)(エピルビシン塩酸塩)、エロツズマブ、エロキサチン(Eloxatin)(オキサリプラチン)、エルトロンボパグオラミン、イメンド(アプレピタント)、エムプリシティ(エロツズマブ)、エナシデニブメシル酸塩、エンザルタミド、エピルビシン塩酸塩、EPOCH、アービタックス(セツキシマブ)、エリブリンメシル酸塩、エリベッジ(ビスモデギブ)、エルロチニブ塩酸塩、アーウィナーゼ(Erwinaze)(黒脚病菌アスパラギナーゼ)、エチオール(Ethyol)(アミホスチン)、エトポホス(Etopophos)(エトポシドリン酸塩)、エトポシド、エトポシドリン酸塩、エバセト(Evacet)(ドキソルビシン塩酸塩リポソーム)、エベロリムス、エビスタ(ラロキシフェン塩酸塩)、エボメラ(Evomela)(メルファラン塩酸塩)、エキセメスタン、5-FU(フルオロウラシル注射)、5-FU(フルオロウラシル--局所用)、フェアストン(トレミフェン)、ファリーダック(パノビノスタット)、フェソロデックス(フルベストラント)、FEC、フェマーラ(レトロゾール)、フィルグラスチム、フルダラ(フルダラビンリン酸塩)、フルダラビンリン酸塩、フルオロプレックス(Fluoroplex)(フルオロウラシル--局所用)、フルオロウラシル注射、フルオロウラシル--局所用、フルタミド、フォレックス(Folex)(メトトレキセート)、フォレックスPPS(メトトレキセート)、フォルフィリ、フォルフィリ-ベバシズマブ、フォルフィリ-セツキシマブ、フォルフィリノックス、フォルフォックス、フォロチン(プララトレキセート)、FU-LV、フルベストラント、ガーダシル(組換えHPV 4価ワクチン)、ガーダシル9(組換えHPV 9価ワクチン)、ガザイバ(オビヌツズマブ)、ゲフィチニブ、ゲムシタビン塩酸塩、ゲムシタビン-シスプラチン、ゲムシタビン-オキサリプラチン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ジェムザール(ゲムシタビン塩酸塩)、ジオトリフ(Gilotrif)(アファチニブ二マレイン酸塩)、グリベック(イマチニブメシル酸塩)、ギリアデル(カルムスチンインプラント)、グリアデル(Gliadel)ウェファー(カルムスチンインプラント)、グルカルピダーゼ、ゴセレリン酢酸塩、ハラベン(エリブリンメシル酸塩)、ヘマンジオル(Hemangeol)(プロプラノロール塩酸塩)、ハーセプチン(トラスツズマブ)、HPV 2価ワクチン、組換えHPV 9価ワクチン、組換えHPV 4価ワクチン、組換えハイカムチン(トポテカン塩酸塩)、ハイドレア(ヒドロキシ尿素)、ヒドロキシ尿素、Hyper-CVAD、イブランス(パルボシクリブ)、イブリツモマブチウキセタン、イブルチニブ、ICE、アイクルシグ(ポナチニブ塩酸塩)、イダマイシン(イダルビシン塩酸塩)、イダルビシン塩酸塩、イデラリシブ、イディファ(Idhifa)(エナシデニブメシル酸塩)、アイフェックス(Ifex)(イホスファミド)、イホスファミド、イフォスファミダム(Ifosfamidum)(イホスファミド)、IL-2(アルデスロイキン)、イマチニブメシル酸塩、イムブルビカ(イブルチニブ)、イミフィンジ(デュルバルマブ)、イミキモド、イムリジック(Imlygic)(タリモジーンラハーパレプベック)、インライタ(アキシチニブ)、イノツズマブオゾガマイシン、インターフェロンアルファ-2b、組換えインターロイキン-2(アルデスロイキン)、イントロンA(組換えインターフェロンアルファ-2b)、ヨウ素I 131 トシツモマブ及びトシツモマブ、イピリムマブ、イレッサ(ゲフィチニブ)、イリノテカン塩酸塩、イリノテカン塩酸塩リポソーム、イストダックス(ロミデプシン)、イクサベピロン、イキサゾミブクエン酸塩、イグゼンプラ(イクサベピロン)、ジャカフィ(Jakafi)(ルキソリチニブリン酸塩)、JEB、ジェブタナ(カバジタキセル)、カドサイラ(Ado-トラスツズマブエムタンシン)、ケオキシフェン(Keoxifene)(ラロキシフェン塩酸塩)、ケピバンス(パリフェルミン)、キイトルーダ(ペムブロリズマブ)、キスカリ(Kisqali)(リボシクリブ)、キムリア(チサゲンレクルユーセル)、カイプロリス(カルフィルゾミブ)、ランレオチド酢酸塩、ラパチニブ二トシル酸塩、ラートルーボ(Lartruvo)(オララツマブ)、レナリドミド、レンバチニブメシル酸塩、レンビマ(レンバチニブメシル酸塩)、レトロゾール、ロイコボリンカルシウム、ロイケラン(クロラムブシル)、リュープロリド酢酸塩、ロイスタチン(クラドリビン)、レブラン(Levulan)(アミノレブリン酸塩)、リンフォリジン(Linfolizin)(クロラムブシル)、リポドックス(LipoDox)(ドキソルビシン塩酸塩リポソーム)、ロムスチン、ロンサーフ(トリフルリジン及びチピラシル塩酸塩)、リュープロン(リュープロリド酢酸塩)、リュープロンデポ(Lupron Depot)(リュープロリド酢酸塩)、リュープロンデポ-Ped(リュープロリド酢酸塩)、リムパーザ(オラパリブ)、マーキボ(Marqibo)(ビンクリスチン硫酸塩リポソーム)、マツラン(Matulane)(プロカルバジン塩酸塩)、メクロレタミン塩酸塩、メゲストロール酢酸塩、メキニスト(トラメチニブ)、メルファラン、メルファラン塩酸塩、メルカプトプリン、メスナ、メスネックス(Mesnex)(メスナ)、メタゾラストン(Methazolastone)(テモゾロミド)、メトトレキセート、メトトレキセートLPF(メトトレキセート)、メチルナルトレキソン臭化物、メキセート(Mexate)(メトトレキセート)、メキセート-AQ(メトトレキセート)、ミドスタウリン、マイトマイシンC、ミトキサントロン塩酸塩、ミトジトレックス(Mitozytrex)(マイトマイシンC)、MOPP、モゾビル(プレリキサホル)、マスタージェン(Mustargen)(メクロレタミン塩酸塩)、ムタマイシン(Mutamycin)(マイトマイシンC)、ミレラン(ブスルファン)、ミロサール(Mylosar)(アザシチジン)、マイロターグ(ゲムツズマブオゾガマイシン)、ナノ粒子パクリタキセル(パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子製剤)、ナベルビン(ビノレルビン酒石酸塩)、ネシツムマブ、ネララビン、ネオサール(Neosar)(シクロホスファミド)、ネラチニブマレイン酸塩、ネルリンクス(Nerlynx)(ネラチニブマレイン酸塩)、ネツピタント及びパロノセトロン塩酸塩、ヌーラスタ(Neulasta)(ペグフィルグラスチム)、ニューポジェン(フィルグラスチム)、ネクサバール(ソラフェニブトシル酸塩)、ニランドロン(Nilandron)(ニルタミド)、ニロチニブ、ニルタミド、ニンラーロ(イキサゾミブクエン酸塩)、ニラパリブトシル酸塩一水和物、ニボルマブ、ノルバデックス(タモキシフェンクエン酸塩)、エヌプレート(Nplate)(ロミプロスチム)、オビヌツズマブ、オドムゾ(Odomzo)(ソニデギブ)、OEPA、オファツムマブ、OFF、オラパリブ、オララツマブ、オマセタキシンメペコハク酸塩、オンキャスパー(Oncaspar)(ペグアスパルガーゼ)、オンダンセトロン塩酸塩、オニバイド(イリノテカン塩酸塩リポソーム)、オンタック(Ontak)(デニロイキンジフチトクス)、オプジーボ(ニボルマブ)、OPPA、オシメルチニブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子製剤、PAD、パルボシクリブ、パリフェルミン、パロノセトロン塩酸塩、パロノセトロン塩酸塩及びネツピタント、パミドロン酸二ナトリウム、パニツムマブ、パノビノスタット、パラプラット(Paraplat)(カルボプラチン)、パラプラチン(カルボプラチン)、パゾパニブ塩酸塩、PCV、PEB、ペグアスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペグインターフェロンアルファ-2b、PEG-イントロン(ペグインターフェロンアルファ-2b)、ペムブロリズマブ、ペメトレキセド二ナトリウム、パージェタ(ペルツズマブ)、ペルツズマブ、プラチノール(Platinol)(シスプラチン)、プラチノール-AQ(シスプラチン)、プレリキサホル、ポマリドミド、ポマリスト(ポマリドミド)、ポナチニブ塩酸塩、ポートラーザ(ネシツムマブ)、プララトレキセート、プレドニゾン、プロカルバジン塩酸塩、プロロイキン(
Proleukin)(アルデスロイキン)、プロリア(デノスマブ)、プロマクタ(エルトロンボパグオラミン)、プロプラノロール塩酸塩、プロベンジ(シプロイセルT)、プリネトール(Purinethol)(メルカプトプリン)、プリクサン(Purixan)(メルカプトプリン)、塩化ラジウム223、ラロキシフェン塩酸塩、ラムシルマブ、ラスブリカーゼ、R-CHOP、R-CVP、組換えヒトパピローマウイルス(HPV)2価ワクチン、組換えヒトパピローマウイルス(HPV)9価ワクチン、組換えヒトパピローマウイルス(HPV)4価ワクチン、組換えインターフェロンアルファ-2b、レゴラフェニブ、レリストール(メチルナルトレキソン臭化物)、R-EPOCH、レブラミド(レナリドミド)、リウマトレックス(メトトレキセート)、リボシクリブ、R-ICE、リツキサン(リツキシマブ)、リツキサンハイセラ(Rituxan Hycela)(リツキシマブ及びヒトヒアルロニダーゼ)、リツキシマブ、リツキシマブ及びヒトヒアルロニダーゼ、ロラピタント塩酸塩、ロミデプシン、ロミプロスチム、ルビドマイシン(Rubidomycin)(ダウノルビシン塩酸塩)、ルブラカ(Rubraca)(ルカパリブカンシル酸塩)、ルカパリブカンシル酸塩、ルキソリチニブリン酸塩、リダプト(Rydapt)(ミドスタウリン)、スクレロゾール(Sclerosol)胸膜内エアロゾル(タルク)、シルツキシマブ、シプロイセルT、ソマチュリンデポ(ランレオチド酢酸塩)、ソニデギブ、ソラフェニブトシル酸塩、スプリセル(ダサチニブ)、STANFORD V、滅菌タルク粉末(タルク)、ステリタルク(Steritalc)(タルク)、スチバーガ(レゴラフェニブ)、スニチニブリンゴ酸塩、スーテント(スニチニブリンゴ酸塩)、シラトロン(Sylatron)(ペグインターフェロンアルファ-2b)、シルバント(Sylvant)(シルツキシマブ)、シンリボ(Synribo)(オマセタキシンメペコハク酸塩)、タブロイド(Tabloid)(チオグアニン)、TAC、タフィンラー(ダブラフェニブ)、タグリッソ(オシメルチニブ)、タルク、タリモジーンラハーパレプベック、タモキシフェンクエン酸塩、タラビン(Tarabine)PFS(シタラビン)、タルセバ(エルロチニブ塩酸塩)、タルグレチン(ベキサロテン)、タシグナ(ニロチニブ)、タキソール(パクリタキセル)、タキソテール(ドセタキセル)、テセントリク(アテゾリズマブ)、テモダール(Temodar)(テモゾロミド)、テモゾロミド、テムシロリムス、サリドマイド、サロミド(Thalomid)(サリドマイド)、チオグアニン、チオテパ、チサゲンレクルユーセル、トラック(Tolak)(フルオロウラシル--局所用)、トポテカン塩酸塩、トレミフェン、トーリセル(テムシロリムス)、トシツモマブ及びヨウ素I 131トシツモマブ、トテクト(Totect)(デクスラゾキサン塩酸塩)、TPF、トラベクテジン、トラメチニブ、トラスツズマブ、トレアンダ(ベンダムスチン塩酸塩)、トリフルリジン及びチピラシル塩酸塩、トリセノックス(三酸化ヒ素)、タイケルブ(ラパチニブ二トシル酸塩)、ユニツキシン(Unituxin)(ジヌツキシマブ)、ウリジン三酢酸塩、VAC、バンデタニブ、VAMP、バルビ(Varubi)(ロラピタント塩酸塩)、ベクティビックス(パニツムマブ)、VeIP、ベルバン(Velban)(ビンブラスチン硫酸塩)、ベルケイド(ボルテゾミブ)、ベルサール(Velsar)(ビンブラスチン硫酸塩)、ベムラフェニブ、ベネクレクスタ(ベネトクラクス)、ベネトクラクス、ベージニオ(アベマシクリブ)、ビアドゥール(Viadur)(リュープロリド酢酸塩)、ビダーザ(アザシチジン)、ビンブラスチン硫酸塩、ビンカサール(Vincasar)PFS(ビンクリスチン硫酸塩)、ビンクリスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩リポソーム、ビノレルビン酒石酸塩、VIP、ビスモデギブ、ビストガード(Vistogard)(ウリジン三酢酸塩)、ボラクサーゼ(Voraxaze)(グルカルピダーゼ)、ボリノスタット、ボトリエント(パゾパニブ塩酸塩)、ビキセオズ(Vyxeos)(ダウノルビシン塩酸塩及びシタラビンリポソーム)、ウェルコボリン(Wellcovorin)(ロイコボリンカルシウム)、ザーコリ(クリゾチニブ)、ゼローダ(カペシタビン)、XELIRI、XELOX、ザイゲバ(Xgeva)(デノスマブ)、ゾーフィゴ(塩化ラジウム223)、イクスタンジ(エンザルタミド)、ヤーボイ(イピリムマブ)、ヨンデリス(トラベクテジン)、ザルトラップ(Ziv-アフリベルセプト)、ザルシオ(Zarxio)(フィルグラスチム)、ゼジューラ(ニラパリブトシル酸塩一水和物)、ゼルボラフ(ベムラフェニブ)、ゼバリン(イブリツモマブチウキセタン)、ジンカード(Zinecard)(デクスラゾキサン塩酸塩)、Ziv-アフリベルセプト、ゾフラン(オンダンセトロン塩酸塩)、ゾラデックス(ゴセレリン酢酸塩)、ゾレドロン酸塩、ゾリンザ(ボリノスタット)、ゾメタ(ゾレドロン酸塩)、ザイデリグ(Zydelig)(イデラリシブ)、ジカディア(セリチニブ)並びに/又はザイティガ(アビラテロン酢酸塩)を含む、当技術分野において公知の任意の抗がん療法を含んでもよく、及び/又はこれらを更に含む。また、PDl/PDLl遮断阻害剤(例えば、ランブロリズマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、BMS-936559、アテゾリズマブ、デュルバルマブ又はアベルマブ等)である化学療法剤を本明細書において検討する。

D.実施例
次の実施例は、本明細書において主張する化合物、組成物、物品、装置、及び/又は方法を行い、評価する方法の完全な開示及び記載を当業者に提供するために提示し、単に例示的であることを意図し、開示を制限することを意図しない。数(例えば、量、温度等)に関する正確性を確実とする試みがなされているが、一部の誤差及び偏差は説明すべきである。他に指示しない限り、分率は、体重による分率であり、温度は、℃であるか又は環境温度であり、圧力は、大気圧であるか又はその付近である。

(実施例1)
マウスメラノーマモデルにおけるヒトIFNβの免疫刺激活性
ヒトにおいて試験されるものと同一の薬剤を使用して動物試験を実施することが重要である。しかし、これは生物学的薬剤にとっての問題を呈し、例えば、サイトカインの使用では、種々のヒト及びマウスサイトカイン間で交差反応性が大幅に変動する。上に考察したように、我々は、抗がん治療薬としてCD40L及びヒトIFNβを発現するOVを開発することを望む。IFNβにより、マウスIFNβ未満の能力ではあるが、マウスにおいてシグナル伝達が引き起こされる。OV開発の前に、この試験の第1の焦点であるため、ヒトIFNβにより、マウスにおいて抗腫瘍T細胞応答が引き起こされ得るかどうかを最初に決定した。この目的を達するために、我々は、最近開発されたアッセイを利用し、ここで我々は、マウスIFNβを発現する照射したB16-FlO又はB16-OVAメラノーマが、強力な予防ワクチンとして機能し、この防御作用は、CD8及びCD4の両T細胞に依存することを見出した(結果非公表)。この手法は、GM-CSF発現腫瘍細胞(GVAX)に機能的に類似する。B16-OVA細胞に、pLenti-Puro対照レンチウイルス又はマウス若しくはヒトIFNβを発現するレンチウイルスを形質導入した後、ピューロマイシン選択を行った。同数の細胞を播種し、この2日後にELISAのために上清を採取してヒト及びマウスIFNβを検出した。ヒト及びマウスIFNβの両方は、高レベルで発現したが、より高レベルのマウスIFNβが検出された(図1A)。注目すべきことには、我々は、マウスIFNβによって更に高い応答が誘導されたが、マウス及びヒトの両IFNβが、腫瘍コードモデル抗原に対するT細胞応答の誘導において高度に有効であることを見出した(図1B)。マウスIFNβに対する高応答は、部分的に、高発現のためである可能性を有する(図1A)。その上、ヒトIFNβのこの作用は、宿主における1型IFN受容体α1(IFNAR1)の存在に厳密に依存した(図1B;得られた類似の結果は、マウスIFNβによる別々の実験である)。機能的には、マウス及びヒトの両IFNβは、生B16-OVAによる曝露後の腫瘍増殖の予防において高度に有効であった(図1C)。このような結果は、OV使用の設定により、ヒトIFNβによって、マウスにおける抗腫瘍T細胞応答を誘導することも可能であることを示す。

(実施例2)
MEM-288の生成及びin vitroでの試験
我々は、CMVプロモーターにより駆動されるキメラCD40Lの発現を有する腫瘍溶解性アデノウイルス5型(図2A)を、ヒトIFNβ発現を駆動する発現カセット(MEM-288)(図2B)を加えることにより生成した。対照として、我々は、GFP(Ad-GFP)及びキメラCD40Lのみ(MEM-188)を発現するアデノウイルスを使用した。使用した3つ全てのウイルスは、がん細胞の特異的複製及び溶解が可能となるE1A D24欠失を含む(以下の図4を参照)。MEM-188又はMEM-288のいずれかを有するヒトA549肺がん株の感染では、フローサイトメトリーにより決定した場合、高いCD40L発現が誘導されたが、Ad-GFPによる感染では、高いGFP発現が引き起こされた(図3A)。培養上清中へのIFNβの高レベルの分泌が、MEM-288感染後のみに見られた(図3B)。類似の結果が、複数の更なるヒト細胞株において得られた。また、B16-F10メラノーマ細胞株による試験では、高い導入遺伝子発現(図3C)及びMEM-288感染後の培養上清中へのIFNβの分泌(図3D)が実証された。OVによる細胞死は、細胞溶解を引き起こす感染がん細胞におけるウイルス複製のためである。1型IFNでは、アデノウイルス複製が障害されなかった。注目すべきことには、マウス細胞では、アデノウイルス複製が支持されず、これと一致して、Δ24欠失ウイルスによりマウスB16-F10及び344SQ細胞株の溶解が誘導されなかった(図4)が、ヒトA549細胞は、容易に溶解された(図4;指示するMEM-288)ことを我々は見出した。このような結果は、in-vivoでのマウス試験では、OV注射により誘導された抗腫瘍応答は、腫瘍溶解作用ではなく免疫刺激作用による可能性がより高いことを示す。マウス細胞において腫瘍溶解作用を欠くにもかかわらず、我々は、このようなウイルスをOVと呼んで、ヒトにおけるこれらの適用について示す。

(実施例3)
マウスメラノーマモデルにおける試験
病巣内手法の使用の主な前提は、非注射病変を標的とする、即ち、アブスコパル作用を引き起こすことが可能な全身性抗腫瘍免疫応答の生成の可能性である。従って、試験の主な目標は、CD40及び1型IFNシグナル伝達の複合的活性化により、注射及び非注射の両腫瘍の増殖を削減することが可能な、強力な抗腫瘍T細胞応答をもたらすことが可能であるかどうかを決定することであった。MEM40/CD40Lを発現する非腫瘍溶解性複製不能アデノウイルスによる試験では、B16-F10メラノーマモデルにおける活性が示された。しかし、4回のこのウイルスの注射が、単一薬剤として又はICIとの組合せによる活性を観察するのに必要とされた。

我々は、B16-OVAメラノーマにおける試験を最初に実施して、OVA反応性CD8 T細胞の追跡を可能とした。抗腫瘍治療作用を決定するためのマウスにおいて使用したアデノウイルスの典型的容量は、10e9～10感染単位(IU)である。1×10⁸の低容量のAd-GFP、MEM-188及びMEM-288を、第1の実験における腫瘍内注射に使用した(図5A)。興味深いことには、MEM-288では、Ad-GFP及びMEM-188と比較して腫瘍増殖の有意な減少が示された(図5A)。次の実験では、我々は、10倍高い10e9 IU用量のウイルス3つ全てを使用し、ここで、MEM-288注射により、腫瘍増殖の最も有意な低下が引き起こされた(図5B)。上記の試験では、MEM40/CD40L発現アデノウイルスによる4回の注射後に注目すべき活性が示された。しかし、我々は、MEM-188による2回の注射後には類似の活性を認めず、更に持続したCD40L発現が、複数回のウイルス注射により、必要とされ得ることが示された。また、MEM-188では引き起こされなかったが、MEM-288によって、循環するOVA特異的CD8 T細胞の上昇が引き起こされた(図5C)。

a)MEM-288が全身性T細胞応答に影響する:CD40及びIFNAR1の役割
このような試験では、我々は、PBS対照と比較してMEM-288のみを使用した。B16-OVA腫瘍内へのMEM-288投与により、IFNγ分泌(ELISPOTアッセイ)により決定した場合、マウス脾臓における腫瘍反応性CD8 T細胞数の劇的上昇が引き起こされた(図5D)。これにおけるCD40及び1型IFNシグナル伝達の役割を評価するために、我々は、B16-OVA腫瘍を有するCD40及びIFNAR1 KOマウスを使用した。重要なことには、CD8 T細胞応答は、IFNAR1及びCD40の両KOマウスにおいて有意に減少し(図5D)、両経路が、MEM-288活性に独立的に必要とされることが実証された。本出願において提唱する試験によって、APC及びT細胞の両方の制御を調べることにより、このような2つの経路がT細胞応答の活性化においてどのように機能するかを正確に決定する。

b)ICI治療によるMEM-288活性
我々は、注射及び非注射両方の対側腫瘍の増殖に対するMEM-288の腫瘍内注射の作用を決定することを望んだ(図6A)。重要なことには、MEM-288により、注射された腫瘍及び対側腫瘍の両方の増殖が抑制された(図6B～図6C)。対照的に、この腫瘍モデルについて知られているように、ICI抗CTLA4及び抗PD-1療法は、腫瘍増殖に最小限に影響した(図6B～図6C)。このような結果は、MEM-288が、抗CTLA4+PD-1治療と比較して、この腫瘍モデルにおいて優れた有効性を有することを示す。重要なことには、抗CTLA4+PD-1とMEM-288との組合せにより、MEM-288単独と比較して腫瘍の増殖が有意に減少し、ICIの利益は、MEM-288と組み合わせた場合、更に明らかであることを示した(図6B～図6C)。最終的には、MEM-288単独により、マウスの生存が向上し、これはICIと組み合わせた場合、更に増強された(図6D)。従って、このような結果は、(a)限局的MEM-288投与により、単一薬剤としての強力なアブスコパル活性が誘導され、(b) MEM-288と組み合わせた場合、別のICI耐性腫瘍モデルにおいて、ICI療法による利益が明らかとなることを示す。

(実施例4)
肺転移モデルにおける試験
皮下注射したKRAS及びTP53変異マウス344SQ(344)肺腫瘍細胞により、注射の原発部位において腫瘍が形成され、その後、肺及び他部位への転移性播種が生じる。我々は、このモデルが、PD-1チェックポイント遮断に対して耐性であることを見出した。我々が取り組むことを望む鍵となる問いは、PD-1抵抗性腫瘍における単一薬剤としてのMEM-288の有効性である。我々は、MEM-288誘導T細胞の活性化及び発現により、転移性播種が予防され、及び/又は原発腫瘍の増殖が削減されるかどうかを本明細書において示す。10e9 IUの2回用量のAd-GFP、MEM-188及びMEM-288を、接種後12日に腫瘍内投与した。MEM-288投与のみにより、s.c.腫瘍増殖の有意な低下が引き起こされた(図7A)。腫瘍接種後38日に、肺における腫瘍病変を決定した。予想どおり、s.c.により腫瘍にPBSを注射したマウスでは肺転移数が高く、Ad-GFP及びMEM-188注射マウスも同様であった(図7B～図7C)。好対照的に、MEM-288注射マウスにおける肺腫瘍病変は、有意に減少した(図7B～図7C)。その上、腫瘍病変のサイズも、MEM-288並びにMEM-188注射マウスにおいて実質的に小さくなると思われる。CD8 IHCでは、MEM-288及びわずかにMEM-188処置マウスの肺腫瘍においてTIL密度が有意に高いことが更に明らかとなった(図7D～図7E)。このような結果は、CD40LへのIFNβの追加により、このモデルにおいて免疫刺激機能が増強され得ることを示す。次いで我々は、これが実際にこの場合であるかどうかを決定し、加えて、MEM-288有効性を、抗PD-1と並行して調査した。重要なことには、我々は、MEM-288注射マウスの脾臓においてIFNγELISPOTにより決定した場合の腫瘍細胞反応性CD8T細胞のロバストな上昇を見出した(図8A～図8B)。一方、抗PD-1により、腫瘍反応性T細胞が実質的に上昇しなかった。我々は、限局的MEM-288注射が、PD-1耐性腫瘍において単一薬剤として腫瘍の増殖を調節可能であると思われる、強力な全身性T細胞応答を引き起こす可能性を有すると結論づける。進行中の更なる試験では、我々は、このモデルにおいてMEM-288及びICI(抗PD-1+/-抗CTLA4)を組み合わせた場合の抗腫瘍活性における相乗作用を決定する。

(実施例5)
腫瘍微小環境におけるCD40L及びIFNβの免疫刺激機構の調査
この結果は、CD40L及びIFNβを発現するウイルス(MEM-288)が、アブスコパル腫瘍病変の増殖を調節可能な、強力な全身性抗腫瘍T細胞応答を誘導することができることを示す。上記のウイルスに加えて、我々は、本明細書において提唱する試験のための、ヒトIFNb単独を発現するウイルスをも利用することができる。我々は、複数の免疫細胞型、特には、DC上のTMEにおけるCD40L及びIFNb発現の影響を決定することができる。マクロファージは、CD40L活性の別の主要な標的を代表し、これらの抗腫瘍活性の増強を引き起こすことができる。この試験は、CD40L及びIFNbのユニークかつ相乗的寄与を定義する鍵となる目標によるDC、マクロファージ及びT細胞に対するOVの影響の徹底的評価を含む。上記のIFNAR1及びCD40 KOマウスに加えて、我々は、DC1を欠く(以下参照)BATF3 KOマウスをも使用することができる。我々は、ヒトIFNbにより、マウスにおいてT細胞活性化がIFNAR1依存的方法で引き起こされることを上に示した(図1)。しかし、ヒトIFNbにより、マウス細胞のヒトIFNAR1/2受容体の設定において更に実質的な応答が引き起こされ得る可能性を有する。重要なことには、Harariらは、ヒトIFNAR1/2細胞外リガンド結合ドメイン及びマウスIFNAR1/2受容体シグナル伝達ドメインを有するHyBNAR(ハイブリッドIFNAR)と名付けられる遺伝子導入マウス系統を作製した。この試験では、ヒトIFNbにより野生型マウスにおいてシグナル伝達が誘導されるが、この結果と一致して、この応答がHyBNARマウスにおいて増強されることが示された。

ここでの主な目標は、B16メラノーマ及び344肺腫瘍モデルにおけるTMEに対する病巣内OV投与の影響を示すことである。我々は、TMEにおける免疫細胞に対するCD40L及びIFNb受容体のエンゲージメントのユニークかつ相補的な作用をここで定義し、CD40又はIFNAR1を欠くマウスの使用によって、根底にある機構をも調査することができる。我々は、DCが、MEM-288活性の主要な標的を代表すると考え、この目的のために、我々は、DC1及びDC2サブセットの機能性に対するOVの影響を調査するのに最も徹底的な試験を実施することができる。

a)TMEに対するOVの影響:CD40L及びIFNβの特異的役割の説明
主な目標は、Ad-GFP、Ad-IFNβ、MEM-188及びMEM-288 OVを使用可能なTMEにおけるCD40L及びIFNβの作用機構を決定することである。このような探索的試験は、骨髄系細胞、DC、T及びB細胞の主要な集団に対する上記OVの広範な影響の評価に役立てることができる。図9Aに示すように、我々は、マクロファージ(F4/80⁺ Ly6C⁺ CD11b⁺ MHC-II⁺)、単球及び好中球(F4/80^- CD11b⁺ Ly6C⁺又はLy6G⁺)並びにDC1(CD11c⁺ CD11b^- MHC-II⁺ CD103⁺)及びDC2(CD11c⁺ CD11b⁺ MHC-II⁺ CD103^-)を含むDCを、B16-OVA腫瘍のフローサイトメトリー解析により容易に検出した。また、我々は、B細胞、CD4⁺T細胞、CD8⁺T細胞及びOVA特異的CD8 T細胞を検出した(図9B)。主な焦点は、腫瘍におけるDCの活性化に対するOVの作用を決定することであり得る。腫瘍抗原は、常在マクロファージ及びDCにより容易に取り込まれ、これらは、GFP又はZsGreenを発現する腫瘍を使用することにより検出することができる。また、最近の試験では、抗原取込みによってDCが機能的に初期化されることが実証された。我々は、腫瘍常在APCによる抗原取込みを追跡するためにZsGreenを発現するB16-OVA及びB16-F10を生成した(図10)。図10に示すように、マクロファージ及びDCのZsGreen⁺集団は、親の非発現腫瘍と比較して、ZsGreen発現腫瘍において容易に検出された。ZsGreen発現を使用して腫瘍細胞(ZsGreen⁺ CD45^-)を同定し、ここで我々は、単回MEM-288注射後2日にCD40L発現をも検出することができた(図11A～図11B)。重要なことには、我々は、MEM-288注射後に同一の腫瘍においてDC及びMHC-II^高マクロファージにおけるCD80/CD86の上昇をも見出した(図12A～図12B)。このような結果は、MEM-288によりマクロファージ及びDCの両方の活性化が誘導されることを示すが、我々は、実際の知見としてではなく、APCにおけるCD40L発現及び活性化マーカー検出の実現可能性を実証するために、これらを示す。我々は現在、B16及び344の両モデルにおける単回注射後2、4及び6日の腫瘍を検査することによりCD40L導入遺伝子発現の動態を更に決定している。我々は、以下の試験のために、発現が最も高い時点を選択することができる。

b)TMEに対するOVの影響
ここで我々は、B16-OVA、B16-FlO及び344モデルにおける腫瘍浸潤CD45⁺免疫細胞の数及び表現型に対する種々のOVの影響を決定する。各細胞型の列挙を、CD45⁺細胞の割合及び腫瘍1グラムあたりの細胞数を決定することにより実施することができる。主な集団は、図9に示すものであり得るが、NK細胞がCD40L及び1型IFNの両方の公知の標的であるためNK1.1Ab、並びにOV注射後のT細胞応答の調節における役割をも果たすためTreg(細胞内FoxP3発現を有する)によるNK細胞検出を追加する。ZsGreen発現腫瘍を有するマウスの群(統計学的計画も参照)は、PBS又は上の4つのOVで処置し得る。我々は、2回の独立的実験において1処置あたり5匹のマウスを使用し得る。処置後2日(又は上の試験の最も高いCD40L発現に基づいた異なる時点)に腫瘍を分解し、フローサイトメトリーを実施して、種々のOVの注射後に免疫細胞の差を決定し得る。特定の焦点は、B16-OVA腫瘍における腫瘍抗原特異的CD8 T細胞に対してであり得る。MEM-288で処置したB16-OVA移植マウスでは、我々は、血液(図5C)及び脾臓(図5D)の抗腫瘍T細胞の増加を容易に検出した。我々は、MEM-288処置により、腫瘍において最も高レベルの総及びOVA特異的CD8 T細胞が生じるかどうかをここで決定することができる(図9Bのように検出)。次いで我々は、種々のOVが、マクロファージ及びDCによるZsGreen取込みにどのように影響するかを決定する。鍵となる試験では、DC1及びDC2におけるMHC-II並びに活性化マーカーCD80、CD86及びCD40の発現を決定することができる。また、我々は、ZsGreen⁺及びZsGreen^-の両細胞における活性化状態を決定することができる。加えて我々は、CCR7発現がDCのDLN移行において重要な役割を果たすため、DCにおけるCCR7発現に対する治療作用を決定することができる。IL-12 p70は、DCにより分泌される決定的なTh1応答促進サイトカインであり、CD40Lの公知の標的である。その上、腫瘍DCによるIL-12 p70の発現は、T細胞抗腫瘍免疫応答に重要である。我々は、記載のようにマウスへのブレフェルジンA投与後のDCにおける細胞内の流れによりIL-12p40サブユニットの発現を決定することができる。まとめると、このような試験は、種々の導入遺伝子、即ち、CD40L、IFNβ及びCD40L+IFNβが、DC1及びDC2の全体数及び活性化状態にどのように影響するかの決定に役立ち得る。例えば、このような試験は、MEM-288注射後に我々が観察したCD80/CD86発現の上昇(図12)が、CD40L、IFNβ又はこの両方のためであるかどうかの決定に役立ち得る。統計学的検定:2群比較では、スチューデントのt検定を使用して、手段における差を決定することができる。多重処置群の手段(例えば、特異的細胞型又は活性化マーカー発現)における差を、Tukeyの方法により決定することができる。

c)受容体KOマウスを使用したCD40L及びIFNβの特異的役割の定義
種々の導入遺伝子を発現するOVは、広範なTME及びT細胞/DC活性化に応じて異なる作用を有する。その上、MEM-288は、CD40L及びIFNβの複合的発現のため、最もロバストな刺激作用を有する。相補的手法を使用して、我々は、CD40及びIFNAR1を欠くマウスを使用したMEM-288注射後に観察される鍵となる表現型に対するCD40L及びIFNβの個々の役割を決定することができる。上の試験により、CD40及びIFNAR1がT細胞応答に重要であることが示されたが(図5D)、我々は、この応答におけるDCの役割をここで決定する。この手法は、MEM-288治療の文脈において、このような2つの経路のユニークで重複する機能への更なる洞察をもたらすのに役立ち得る。このような試験は、CD40及びIFNAR1 KOのC57BL/6遺伝的背景をマッチさせるために、B16-F10及びB16-OVAモデルにおいて実施することができる。

d)DLNへのDC移行に対するOVの影響及びT細胞刺激能の定義
図10に示すように、マクロファージ及びDCの両方は、ZsGreenを容易に取り込む。しかしDCは、腫瘍から、腫瘍抗原をナイーブT細胞に提示してこれらの活性化を引き起こすDLNへと移行するユニークな能力を有する。種々OVがDLNへのDC遊走にどのように影響するか、及びT細胞を刺激するこれらの能力を本明細書において示す。このような試験では、我々は、最近の試験に示すように、ZsGreenによりDLNへのDC1及びDC2移行を追跡することができ、T細胞を活性化するこれらの能力をも評価する。このような試験は、種々の導入遺伝子がDC遊走及びT細胞刺激にどのように影響するかの決定に役立つ。

図13に示すように、MHC-II⁺CD11c⁺細胞の2つの主な集団を鼠径部DLNにおいて検出する。MHC^高集団は、遊走性DC1及びDC2からなると考えられ、これらは予想どおり、高い割合のCD103⁺DC並びにCD11b⁺DCを有する。中等レベルのMHC-II(MHC^中)集団を有するCD11c⁺集団は、常在DC1及びDC2からなり、低い割合のCD103⁺DCを有する。ZsGreen+DCの大多数は、MHC^高集団に存在する。我々は、このような別個の集団の分布及び活性化表現型に対する種々のOVの影響をここで決定することができる。MEM-288投与によって最も高いDLN移行が生じ、これらのDCが、最も強力な活性化表現型を有することとなり得る。また、我々は、CD40及びIFNAR1 KOマウスにおいてDC遊走を誘導するMEM-288の能力を決定することができる。図14に示すように、DCのLN集団は、CD40及びIFNAR1の非存在に影響されるとは考えられない。それにもかかわらず、CD40及びIFNAR1の非存在が、腫瘍からDLNへのDC遊走に影響するかどうかはわかっていない。

次いで、我々は、T細胞を活性化するLN DCの能力を決定することができる。試験により、T細胞刺激がMEM-288によって大いに増強されることが既に示されているが、このような試験により、これが少なくとも部分的にDC活性化によるものかどうかを特異的に決定することができる。この目的のために、我々は、B16-OVA腫瘍を有するマウスを使用して、4つ全てのOVにより注射することができる。次いで、我々は、DLN細胞から選別したDC1及びDC2を使用してCFSE標識ナイーブOT-1 CD8 T細胞と同時培養して、本明細書に記載のCFSE希釈アッセイを実施することができる。このような試験では、MEM-288により誘導されたDC活性化によって、最も高いレベルのT細胞集団が生じるかどうかを決定することができる。加えて、我々は、OT-1 CD8 T細胞とともにDCを培養することによりELISPOTアッセイを実施して、IFNγ分泌を決定することができる。次いで、MEM-288を使用し、我々は、CD40及びIFNAR1 KOマウスを使用して、2つの導入遺伝子が、T細胞を活性化するDCの能力において果たす特異的役割を決定することができる。最終的には、BATF3 KOマウスを使用して、我々は、MEM-288により誘導されるT細胞集団及びIFNγ分泌の上昇に対するDC1の役割を決定することができる。

(実施例6)
腫瘍の腫瘍溶解性ウイルス治療
in vivoでの腫瘍に対する腫瘍溶解性ウイルスの作用を示すために、C57BL/6マウスの側腹上に5e5のB16-OVA細胞をs.c.で接種した。腫瘍は、D12及びD16にPBS、アデノウイルスGFP又はMEM-288注射に10⁹IUで供した。20日目に、腫瘍を得、IHCを実施して、CD8⁺腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の存在を検出した。PBS又はGFPを発現する腫瘍溶解性ウイルスで処置したマウスは、同等数のTILを示した。それに対して、MEM-288ワクチン接種腫瘍では、TILが、ほぼ3倍上昇した(図15)。

E.参考文献
［参考文献］

配列
配列番号1は、ヒト野生型インターフェロンαのアミノ酸配列である(UniProtKB参照番号P05014)。

配列番号2は、ヒト野生型インターフェロンβのアミノ酸配列である(UniProtKB参照番号P01574)。

配列番号3は、ヒト野生型インターフェロンεのアミノ酸配列である(UniProtKB参照番号Q9P0W0)。

配列番号5は、ヒト野生型インターフェロンωのアミノ酸配列である(UniProtKB参照番号P05000)。

配列番号6は、ヒトCD40-Lのアミノ酸配列である(EtniProtKB参照番号P29965)。

Claims (20)

1. a.1つ又は複数の外因性免疫刺激分子を発現する腫瘍溶解性ウイルスを腫瘍細胞内に投与する工程と、
   b.腫瘍浸潤リンパ球を回収する投与する工程と
   を含む、腫瘍浸潤リンパ球を生成する方法。
2. 腫瘍溶解性ウイルスが、1つ又は複数の1型インターフェロンを更に発現する、請求項1に記載の腫瘍浸潤リンパ球を生成する方法。
3. 1つ又は複数の1型インターフェロンが、IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω及び/又はIFN-ζを含む、請求項2に記載の腫瘍浸潤リンパ球を生成する方法。
4. 1つ又は複数の免疫刺激分子が、CD40-L、MEM40、B7-1(CD80)/B7-2(CD86)、OX40L、4-1BBL、CD70、GITRL、LIGHT、TIM-4、ICAM-1、CD58及び/又はSLAMF6を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の腫瘍浸潤リンパ球を生成する方法。
5. 腫瘍溶解性ウイルスが、MEM288である、請求項1から4のいずれか一項に記載の腫瘍浸潤リンパ球を生成する方法。
6. 腫瘍内注射を介して腫瘍溶解性ウイルスを投与する、請求項1から5のいずれか一項に記載の腫瘍浸潤リンパ球を生成する方法。
7. 回収したTILをex vivoで増殖させる工程を更に含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の腫瘍浸潤リンパ球を生成する方法。
8. a.がんを有する対象からTIL又はMILを回収する工程と、
   b.1つ又は複数の外因性免疫刺激分子を発現する腫瘍溶解性ウイルスに感染させた抗原提示細胞の存在下で、回収したTIL又はMILを培養する工程と
   を含む、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)又は骨髄浸潤リンパ球(MIL)の集団を増殖させる方法。
9. 腫瘍溶解性ウイルスが、1つ又は複数の1型インターフェロンを更に発現する、請求項8に記載の腫瘍浸潤リンパ球(TIL)又は骨髄浸潤リンパ球(MIL)の集団を増殖させる方法。
10. 1つ又は複数の1型インターフェロンが、IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω及び/又はIFN-ζを含む、請求項9に記載の腫瘍浸潤リンパ球(TIL)又は骨髄浸潤リンパ球(MIL)の集団を増殖させる方法。
11. 1つ又は複数の免疫刺激分子が、CD40-L、MEM40、B7-1(CD80)/B7-2(CD86)、OX40L、4-1BBL、CD70、GITRL、LIGHT、TIM-4、ICAM-1、CD58及び/又はSLAMF6を含む、請求項8から10のいずれか一項に記載の腫瘍浸潤リンパ球(TIL)又は骨髄浸潤リンパ球(MIL)の集団を増殖させる方法。
12. 腫瘍溶解性ウイルスが、MEM-288である、請求項8から11のいずれか一項に記載の腫瘍浸潤リンパ球(TIL)又は骨髄浸潤リンパ球(MIL)の集団を増殖させる方法。
13. 請求項1から12のいずれか一項に規定のTIL又はMILを対象に投与する工程を含む、対象におけるがんを治療する方法。
14. a.1つ又は複数の免疫刺激分子を発現する腫瘍溶解性ウイルスを腫瘍細胞内に投与する工程と、
    b.腫瘍浸潤リンパ球(TIL)及び/又は骨髄浸潤リンパ球(MIL)を回収する工程と、
    c.回収したTIL及び/又はMILをex vivoで増殖させる工程と、
    d.増殖させたTIL及び/又はMILを対象に投与する工程と
    を含む、対象におけるがんを治療する方法。
15. a.がんを有する対象から腫瘍浸潤リンパ球(TIL)及び/又は骨髄浸潤リンパ球(MIL)を回収する工程と、
    b.1つ又は複数の外因性免疫刺激分子を発現する腫瘍溶解性ウイルスに感染させた抗原提示細胞の存在下で、回収したTIL又はMILを培養する工程と、
    c.増殖させたTIL及び/又はMILを対象に投与する工程と
    を含む、対象におけるがんを治療する方法。
16. 腫瘍溶解性ウイルスが、1つ又は複数の1型インターフェロンを更に発現する、請求項14又は15に記載の対象におけるがんを治療する方法。
17. 1つ又は複数の1型インターフェロンが、IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω及び/又はIFN-ζを含む、請求項16に記載のがんを治療する方法。
18. 1つ又は複数の免疫刺激分子が、CD40-L、MEM40、B7-1(CD80)/B7-2(CD86)、OX40L、4-1BBL、CD70、GITRL、LIGHT、TIM-4、ICAM-1、CD58及び/又はSLAMF6を含む、請求項14から17のいずれか一項に記載のがんを治療する方法。
19. 腫瘍溶解性ウイルスが、MEM-288である、請求項14から18のいずれか一項に記載のがんを治療する方法。
20. 抗がん剤を対象に投与する工程を更に含む、請求項13から19のいずれか一項に記載のがんを治療する方法。

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