BR112020026045A2

BR112020026045A2 - vírus oncolítico ou terapia do câncer mediada por célula que apresenta antígeno usando interferon tipo i e ligante de cd40

Info

Publication number: BR112020026045A2
Application number: BR112020026045-2A
Authority: BR
Inventors: Amer A. Beg; Scott J. Antonia; Mark J. Cantwell
Original assignee: H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc.; Memgen, Llc
Priority date: 2018-06-19
Filing date: 2019-06-18
Publication date: 2021-03-23
Also published as: EP3810641A4; CA3104469A1; WO2019246111A1; JP7420751B2; US20210268090A1; MX2020013901A; AU2019288277A1; JP2021526842A; CN112912389B; EP3810641A1; CN112912389A

Abstract

A presente invenção refere-se a APCs, tais como DCs, que compreendem uma combinação de um interferon tipo I exógeno e um CD40-L exógeno ou uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam uma combinação de um interferon tipo I exógeno e um CD40-L exógeno, tal como uma combinação de IFNß e CD40-L; e métodos para tratar uma malignidade pela administração de tais APCs a um indivíduo necessitado. Em certas modalidades, um indivíduo é tratado com uma terapia de irradiação antes da administração das APCs, tais como DCs da invenção. A invenção também se refere a um vírus oncolítico que compreende uma combinação de IFN tipo I e CD40-L ou uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam uma combinação de IFN tipo I e CD40-L, tal como uma combinação de IFNß e CD40-L; e métodos para tratar uma malignidade pela administração de tal vírus oncolítico a um indivíduo necessitado.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “VÍRUS

ONCOLÍTICO OU TERAPIA DO CÂNCER MEDIADA POR CÉLULA

QUE APRESENTA ANTÍGENO USANDO INTERFERON TIPO I E LIGANTE DE CD40”.

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO

[001] Esse pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório dos Estados Unidos No. de Série 62/687.076, depositado em 19 de junho de 2018, que está aqui incorporado por referência em sua totalidade.

APOIO GOVERNAMENTAL

[002] Esta invenção foi feita com apoio governamental sob a Concessão No. 5P50CA168536-03 concedida pelo NCI Skin Specialized Programs of Research Excellence. O governo tem certos direitos na invenção.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] Tumores humanos expressam vários antígenos de proteína que podem ser reconhecidos pelos linfócitos T (células T), fornecendo assim alvos em potencial para a imunoterapia do câncer, vacinas celulares, virologia, imunologia e medicina. Mas particularmente, ela diz respeito a vacinas de células dendríticas e vetores virais oncolíticos para o tratamento do câncer.

[004] Células dendríticas (DCs) são células que apresentam antígeno (APCs), fundamentais na iniciação das respostas imunes dependentes de célula T. Vacinas de DC têm se mostrado promissoras para o tratamento de alguns canceres; entretanto, apenas um agente está atualmente aprovado pelo FDA, sipuleucel-T (PROVENGE®), para tratamento do câncer de próstata. Vários coquetéis de citocinas são usados para ativar as DCs com base na racionalização de que apenas as células da vacina levam à ativação da célula T. Na realidade, as DCs representam diversos subgrupos com funções distintas. Não está claro se uma vacina de DC pode ser suficiente para induzir uma ativação robusta da célula T. Adicionalmente, estudos pré-clínicos têm mostrado que diferentes subgrupos de DC possuem funções distintas, por exemplo, no transporte de antígeno de tumor até os linfonodos de drenagem versus a ativação das células T nos linfonodos.

[005] Vírus oncolíticos são uma classe de agentes terapêuticos de câncer que possuem um ou ambos os seguintes mecanismos de ação: 1) morte da célula tumoral através de replicação viral seletiva nas células do tumor que resultam na lise direta do tumor e 2) indução de imunidade sistêmica antitumor pela liberação de antígenos das células tumorais destruídas. O FDA aprovou o primeiro vírus oncolítico em 2015, talimogene laherparepvec (IMLYGIC®), um vírus do herpes oncolítico geneticamente modificado que codifica o fator de estimulação de colônia de granulócito-macrófago (GM-CSF) para o tratamento local do melanoma.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] Certas modalidades da invenção fornecem uma APC, tal como uma DC, que expressa uma combinação de uma IFN tipo I e um ligante exógeno de CD40 (CD40-L também conhecido como CD154), tal como uma combinação de um IFNβ e um ligante exógeno de CD40 (CD40-L), por exemplo, através de uma ou mais sequências de ácido nucleico heterólogo que codificam uma combinação de um IFNβ exógeno e um ligante exógeno de CD40-L.

[007] Outra modalidade da invenção fornece um vírus oncolítico que expressa uma combinação de IFN tipo I e CD40-L, por exemplo, através de uma ou mais sequências heterólogas de ácido nucleico que codificam uma combinação de IFNβ e CD40-L.

[008] Uma modalidade preferida da invenção fornece um adenovírus oncolítico que expressa uma combinação de IFN tipo I e CD40-L, por exemplo, através de uma ou mais sequências heterólogas de ácido nucleico que codificam uma combinação de IFNβ e CD40-L.

[009] Modalidades adicionais da invenção fornecem métodos de tratamento de uma malignidade em um indivíduo pela administração de uma APC, tal como uma DC, ou um vírus oncolítico aqui descrito e opcionalmente em combinação pela administração de um inibidor do ponto de controle e um indivíduo. Quando APCs, tais como DCs, da invenção são administrados ao indivíduo, uma terapia de irradiação também é administrada ao indivíduo antes da administração das APCs ou DCs.

[0010] O vírus oncolítico que expressa uma combinação de IFN tipo I e CD40-L, tal como uma combinação de IFNβ e CD40-L, pode ser administrado sem uma terapia de irradiação. Entretanto, a administração de um vírus oncolítico aqui descrito pode ser combinada com a administração de um inibidor de ponto de controle.

[0011] Em modalidades preferidas, um indivíduo que sofre de uma malignidade é refratário a uma terapia com um inibidor de ponto de controle.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0012] Figura 1 mostra um esquema de modalidades de métodos de tratamento de uma malignidade de acordo com a invenção. Referências a “IFNβ” na Figura 1 são pretendidas ser representativas de qualquer IFN tipo I. Além disso, a referência a “células dendríticas” ou “DC” na Figura 1 é pretendida ser representativa de qualquer APC.

[0013] Figura 2 mostra uma construção esquemática de um adenovírus oncolítico com cassetes de expressão duplos que codificam CD40-L e IFNβ .

[0014] Figura 3 mostra uma construção esquemática de um adenovírus oncolítico com cassete de expressão único que codifica CD40-L e IFNβ separados por um sítio de entrada interna de ribossoma (IRES).

[0015] Figura 4A-4B mostram o crescimento do tumor e a sobrevida de camundongos que possuem um tumor melanoma subcutâneo agressivo B16. São indicados camundongos de controle não tratados (n=5), camundongos injetados com células dendríticas que expressam IFNβ (IFNβ) (n=6), Adenovírus-MEM40 (MEM40) (n=6) e administração de agente duplo (n=5). Adenovírus-MEM40 (1010 partículas virais por tumor) foi injetado nos mesmos dias que as DCs como indicado. É mostrado o crescimento médio do tumor em (A) e a sobrevida do camundongo (36 dias depois do implante do tumor) em (B). O tratamento de combinação com DC-IFNβ e Ad-MEM40 reduziu significativamente o crescimento do tumor em comparação com outros braços de tratamento (teste t; p<0,05).

[0016] Figuras 5A-5B mostram que um adenovírus oncolítico que expressa MEM40 e IFNβ (MEM-288) exibe propriedades de matar o tumor a ativação imune 7 e 100 vezes maior, respectivamente, em comparação com um vírus oncolítico que expressa apenas MEM40 (MEM-188) e um adenovírus oncolítico de controle (oAdv de controle, um adenovírus inativado).

[0017] Figuras 6A-6B mostram que um adenovírus oncolítico que expressa MEM40 e IFNβ (MEM-288) é eficaz para matar múltiplos tipos de tumor e canceres direcionados por oncogene. (A) Comparação co, adenovírus oncolítico de controle na morte de tumores da vesícula, fígado e pâncreas humanos e (B) comparação com um adenovírus oncolítico que expressa apenas MEM40 (MEM-188( na morte de um tumor de pulmão com KRAS mutante (linhagem células HCC44).

[0018] Figura 7 mostra a expressão do transgene duplo de MEM40 e IFNβ por um adenovírus oncolítico que expressa MEM40 e IFNβ (MEM-288) em múltiplas linhagens celulares.

[0019] Figura 8 mostra a expressão intensificada do transgene e a replicação de um vírus oncolítico que expressa MEM40 e IFNβ.Comparação da expressão de MEM40 depois da infecção com

MEM-188 e MEM-288 na linhagem celular A549 é mostrada. As células foram infectadas com/sem MEM-188 ou MEM-288 oncolíticos em diferentes MOIs por 2, 4 e 6 dias. A expressão de MEM40 foi determinada por FACS. Para os resultados de FACS: Linha Vermelha – Dia 2, Linha Azul – Dia 4 e Linha Laranja – Dia 6. (A): células não infectadas. (B): MEM-188 MOI=100. (C): MEM-188 MOI=10. (D): MEM- 188 MOI=1. (E): MEM-288 MOI=100. (F): MEM-288 MOI=10. (G): MEM- 288 MOI=1.

[0020] Figura 9 mostra a comparação da expressão de MEM40 na linhagem celular de tumor de pulmão A549 depois da infecção com um adenovírus oncolítico que expressa MEM40 e IFNβ (MEM-288) comparada com um vírus oncolítico que expressa apenas MEM40 (MEM-188).

[0021] Figura 10 mostra a capacidade oncolítica intensificada em várias linhagens de célula de câncer depois da infecção com um adenovírus oncolítico que expressa MEM40 e IFNβ (MEM-288), comparado com um vírus oncolítico que expressa apenas MEM40 (MEM-188). As células foram coradas com cristal violeta 3 dias depois da infecção.

[0022] Figura 11 mostra a expressão intensificada de MEM 40 em várias linhagens celulares de câncer depois da infecção com um adenovírus oncolítico que expressa MEM40 e IFNβ (MEM-288), comparado com um vírus oncolítico que expressa apenas MEM40 (MEM-188). As células foram infectadas com/sem MEM-188 ou MEM- 288 oncolíticos em MOI=100 por 3 dias. A expressão de MEM40 foi determinada por FACS nas linhagens celulares (A) PC9, (B) A549, (C) H23 e (D) HCC44. Para os resultados por FACS: Linha vermelha = não corada, Linha azul = não tratado, Linha verde = MEM-188, Linha laranja = MEM-288.

[0023] Figura 12 mostra a expressão de PDL1 na linhagem celular

A549, células espectadoras mão infectadas com adenovírus. As células foram infectadas com/sem MEM-188 ou MEM-288 oncolíticos em diferentes MOIs como indicado por 3 dias A infecção por MEM-188 também foi combinada com a adição de IFNβ exógeno como indicado. A expressão de PDL-1 foi determinada por FACS especificamente em células que não expressam MEM40 (isto é, não infectadas).

[0024] Figura 13 mostra um exemplo de um mapa de vetor que ilustra um adenovírus oncolítico que expressa MEM40 e IFNβ (MEM- 288).

DESCRIÇÃO RESUMIDA DAS SEQUÊNCIAS

[0025] SEQ ID NO: 1 é a sequência de aminoácidos do interferon α humano do tipo selvagem (UniProtKB Referência No. P05014)

MALSFSLLMAVLVLSYKSICSLGCDLPQTHSLGNRRALILLAQMGRIS HFSCLKDRHDFGFPEEEFDGHQFQKAQAISVLHEMIQQTFNLFSTED SSAAWEQSLLEKFSTELYQQLNDLEACVIQEVGVEETPLMNEDSILAV RKYFQRITLYLTEKKYS PCAWEVVRAE IMRSLSFSTN LQKRLRRKD

[0026] SEQ ID NO: 2 é a sequência de aminoácidos do interferon β humano do tipo selvagem (UniProtKB Referência No. P01574)

MTNKCLLQIALLLCFSTTALSMSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNG RLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSS STGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLK RYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN

[0027] SEQ ID NO: 3 é a sequência de aminoácidos do interferon ε humano do tipo selvagem (UniProtKB Referência No. Q86WN2):

MIIKHFFGTVLVLLASTTIFSLDLKLIIFQQRQVNQESLKLLNKLQTLSIQ QCLPHRKNFLLPQKSLSPQQYQKGHTLAILHEMLQQIFSLFRANISLD GWEENHTEKFLIQLHQQLEYLEALMGLEAEKLSGTLGSDNLRLQVKM YFRRIHDYLENQDYSTCAWAIVQVEISRCLFFVFSLTEKLSKQGRPLN DMKQELTTEFRSPR

[0028] SEQ ID NO: 4 é a sequência de aminoácidos do interferon κ humano do tipo selvagem (UniProtKB Referência No. Q9P0W0):

MSTKPDMIQKCLWLEILMGIFIAGTLSLDCNLLNVHLRRVTWQNLRHL SSMSNSFPVECLRENIAFELPQEFLQYTQPMKRDIKKAFYEMSLQAF NIFSQHTFKYWKERH LKQIQIGLDQQAEYLNQCLEEDKNENEDMKEMKENEMKPSEARVPQ LSSLELRRYFHRIDNFLKEKKYSDCAWEIVRVEIRRCLYYFYKFTALFR RK

[0029] SEQ ID NO: 5 é a sequência de aminoácidos do interferon ω humano do tipo selvagem (UniProtKB Referência No. P05000):

MALLFPLLAALVMTSYSPVGSLGCDLPQNHGLLSRNTLVLLHQMRRI SPFLCLKDRRDFRFPQEMVKGSQLQKAHVMSVLHEMLQQIFSLFHTE RSSAAWNMTLLDQLHTGLHQQLQHLETCLLQVVGEGESAGAISSPA LTLRRYFQGIRVYLKEKKYSDCAWEVVRMEIMKSLFLSTNMQERLRS KDRDLGSS

[0030] SEQ ID NO: 6 é a sequência de aminoácidos de CD40-L humano (UniProtKB Referência No. P29965):

MIETYNQTSPRSAATGLPISMKIFMYLLTVFLITQMIGSALFAVYLHRRL DKIEDERNLHEDFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDI MLNKEETKKENSFEMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKG YYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIA SLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVF VNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL

[0031] SEQ ID NOS: 7-18 são exemplos de sequências de aminoácidos quiméricas de CD40-L.

[0032] SEQ ID NOS: 19-23 são sequências de ácido nucleico que codificam CD40-L quimérico humano/camundongo.

[0033] SEQ ID NO: 24 é uma sequência de ácido nucleico que codifica CD40-L MEM40 quimérico de humano/camundongo.

[0034] SEQ ID NOS: 25-30 são sequências de ácido nucleico que codificam CD40-L quimérico humano/camundongo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0035] A invenção indica que uma combinação de IFN Tipo I e CD40-L pode ativar a função de APCs, tais como DCs, para promover a ativação da célula T. Em particular, uma combinação de IFN Tipo I e CD40-L pode intensificar a função de iniciação cruzada (cross-priming) de APC, tal como DC para ativar células T CD8. Portanto, a expressão estável de uma combinação de IFN tipo I, tal como IFN-α, (ou qualquer subtipo de IFN-α, tal como o subtipo α1, α2, α4, α5, α6, α7, α8, α10, α13, α14, α16, α17, ou α21), IFN-β, IFN-ε, IFN-κ, and IFN-ω, e um CD40-L em APCs, tais como DCs, poderá intensificar a funcionalidade intrínseca de APCs ou DCs e também produzir uma vacina capaz de ativação potente de DCs endógenas, intensificando dessa maneira a capacidade de DCs endógenas para ativar células T.

[0036] Como usada aqui, a expressão “célula que apresenta antígeno” (APC) se refere a uma célula que apresenta antígeno profissional, que é selecionada entre células dendríticas, macrófagos e células B. Em algumas modalidades, a APC é uma DC. Em algumas modalidades, a APC é uma célula de mamífero. Em algumas modalidades, a APC, tal como DC, macrófago ou célula B é uma célula humana.

[0037] Consequentemente, certas modalidades da invenção fornecem APCs tais como DCs, que expressam uma combinação de um IFN tipo I, tal como IFNβ e CD40-L, por exemplo, através de uma ou mais sequências de ácidos nucleicos heterólogos que codificam um IFNβ exógeno e um CD40-L exógeno. Tal APC, em particular DC poderá induzir uma potente resposta sistêmica de célula T quando acoplada com um tratamento que induz a morte celular. Em certas modalidades, a APC tal como DC, compreende um vírus com replicação deficiente.

[0038] Em certas modalidades, a invenção fornece uma vacina de DC que compreende uma DC com um vetor viral, tal como um lentivírus,

que expressa uma combinação de IFNβ e CD40-L.

[0039] Modalidades adicionais da invenção fornecem vírus oncolítico que expressam uma combinação de um IFN do tipo I, tal como IFN-α, IFN-β, IFN-ε, IFN-κ e IFN-ω e CD40-L, por exemplo, através de uma ou mais sequências de ácido nucleico heteróloga que codificam uma combinação de IFNβ e CD40-L. Qualquer vírus oncolítico pode ser usado. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico pode ser adenovírus, reovírus, vírus do herpes, picornavírus (incluindo vírus coxsackie, poliovírus e vírus Seneca Valley), paramixovírus (incluindo o vírus do sarampo e vírus da doença de Newcastle (NDV)), parvovírus, rabdovírus (incluindo o vírus da estomatite vesicular (VSV)) ou vírus vaccinia. Preferivelmente, o vírus oncolítico tem replicação competente.

[0040] Modalidades adicionais da invenção fornecem métodos de tratamento de uma malignidade em um indivíduo pela administração de APCs, tais como DCs ou vírus oncolítico aqui descritos, em combinação pela administração de um inibidor do ponto de controle ao indivíduo. Quando APCs, tais como DCs, da invenção são administradas a um indivíduo, uma terapia de irradiação é administrada ao indivíduo antes da administração de APCs ou DCs. A Figura 1 mostra um esquema das modalidades dos métodos de tratamento de uma malignidade de acordo com a invenção (Opção 1 a 5).

[0041] IFNα pode ser um IFNα humano representado pela SEQ ID NO: 1. IFNα pode ser um IFNα de mamífero, tal como IFNα de camundongo, rato, coelho, porco, felino, canino ou bovino. Modalidades adicionais de IFNα de outros mamíferos são conhecidos daqueles versados na técnica e tais modalidades estão dentro do âmbito da invenção. Em certas modalidades, IFNα tem entre 80% e até 99,99% inclusive (por exemplo, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99%) de identidade de sequência com IFNα do tipo selvagem humano, por exemplo, IFNα da SEQ ID NO: 1.

[0042] IFNβ pode ser um IFNβ humano representado pela SEQ ID NO: 2. IFNβ pode ser um IFNβ de mamífero, tal como IFNβ de camundongo, rato, coelho, porco, felino, canino ou bovino. Modalidades adicionais de IFNβ de outros mamíferos são conhecidos daqueles versados na técnica e tais modalidades estão dentro do âmbito da invenção. Em certas modalidades, IFNβ tem entre 80% e até 99,99% inclusive (por exemplo, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99%) de identidade de sequência com IFNβ do tipo selvagem humano, por exemplo, IFNβ da SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade específica, IFNβ carece dos primeiros 22 aminoácidos da SEQ ID NO: 2 e opcionalmente, ainda tem uma substituição da cisteína 17 do peptídeo com 165 aminoácidos resultante com serina.

[0043] IFNε pode ser um IFNε humano representado pela SEQ ID NO: 3. IFNε pode ser um IFNε de mamífero, tal como IFNε de camundongo, rato, coelho, porco, felino, canino ou bovino. Modalidades adicionais de IFNε de outros mamíferos são conhecidos daqueles versados na técnica e tais modalidades estão dentro do âmbito da invenção. Em certas modalidades, IFNε tem entre 80% e até 99,99% inclusive (por exemplo, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99%) de identidade de sequência com IFNε do tipo selvagem humano, por exemplo, IFNε da SEQ ID NO: 3.

[0044] IFNκ pode ser um IFNκ humano representado pela SEQ ID NO: 4. IFNκ pode ser um IFNκ de mamífero, tal como IFNκ de camundongo, rato, coelho, porco, felino, canino ou bovino. Modalidades adicionais de IFNκ de outros mamíferos são conhecidos daqueles versados na técnica e tais modalidades estão dentro do âmbito da invenção. Em certas modalidades, IFNκ tem entre 80% e até 99,99% inclusive (por exemplo, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99%) de identidade de sequência com IFNκ do tipo selvagem humano, por exemplo, IFNκ da SEQ ID NO: 4.

[0045] IFNω pode ser um IFNω humano representado pela SEQ ID NO: 5. IFNω pode ser um IFNω de mamífero, tal como IFNω de camundongo, rato, coelho, porco, felino, canino ou bovino. Modalidades adicionais de IFNω de outros mamíferos são conhecidos daqueles versados na técnica e tais modalidades estão dentro do âmbito da invenção. Em certas modalidades, IFNω tem entre 80% e até 99,99% inclusive (por exemplo, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99%) de identidade de sequência com IFNω do tipo selvagem humano, por exemplo, IFNω da SEQ ID NO: 5.

[0046] CD40-L pode ser um CD40-L humano representado pela SEQ ID NO: 6. CD40-L pode ser um CD40-L de mamífero, tal como CD40-L de camundongo, rato, coelho, porco, felino, canino ou bovino. Modalidades adicionais de CD40-L de outros mamíferos são conhecidos daqueles versados na técnica e tais modalidades estão dentro do âmbito da invenção. Em certas modalidades, CD40-L tem entre 80% e até 99,99% inclusive (por exemplo, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99%) de identidade de sequência com CD40-L do tipo selvagem humano, por exemplo, CD40-L da SEQ ID NO: 6.

[0047] CD40-L pode ser um polipeptídeo quimérico de CD40-L ou um não quimérico de CD40-L. Em algumas modalidades, CD40-L expresso em APC, tal como DC ou um vírus oncolítico da invenção, é um CD40-L quimérico. Tais polipeptídeos quiméricos de CD40-L compreendem domínios ou subdomínios de CD40-L de pelo menos duas espécies diferentes, por exemplo CD40-L de humano e camundongo. Um CD40-L quimérico fornece uma estimulação maior da resposta imune em comparação com um CD40-L que ocorre naturalmente. Exemplos de CD40-L quimérico adequados para uso na presente invenção estão descritos nas Patentes U.S. Nos. 7.495.090,

7.928.213 e 8.138.310. Cada uma dessas patentes está incorporada aqui por referência em sua totalidade.

[0048] Em certas modalidades de CD40-L quimérico, pelo menos um domínio ou subdomínio de CD40-L que contém um sítio de clivagem de CD40-L humano é substituído com um domínio ou subdomínio correspondente de CD40-L, preferivelmente CD40-L de murino. Adicionalmente, um CD40-L quimérico pode compreender um domínio ou subdomínio de CD40-L humano que se liga ao receptor de CD40-L. Os domínios I a IV de um CD40-L humano (SEQ ID NO: 6) correspondem às porções de aminoácidos 1-14, 14-45, 46-110 e 111- 261 of SEQ ID NO: 6. Aquele versado na técnica pode determinar os domínios I a IV de um CD40-L não humano com base no alinhamento de sequência da CD40-L não humano com o CD40-L humano. Certas posições do domínio de CD40-L não humano estão fornecidas na Tabela 1 da Patente U.S. No. 7.495.090 que está incorporada aqui por referência em sua totalidade.

[0049] Em algumas modalidades, o CD40-L quimérico compreende um primeiro subdomínio de CD40-L não humano, em que o subdomínio substitui um sítio de clivagem de CD40-L humano e um segundo subdomínio de CD40-L humano que se liga a um receptor de CD40-L.

[0050] O primeiro subdomínio pode compreender um subdomínio do domínio IV de um CD40-L não humano. Adicionalmente, o primeiro subdomínio pode compreender ainda o domínio III ou um subdomínio ou domínio III de um CD40-L não humano. Em certas modalidades, o primeiro subdomínio substitui uma porção do sítio de clivagem de CD40- L humano. Em modalidades adicionais, em adição ao domínio IV ou a um subdomínio do domínio IV e, opcionalmente, domínio III ou um subdomínio do domínio III, um CD40-L quimérico compreende ainda um domínio II ou um subdomínio do domínio II, de um CD40-L não humano. Adicionalmente, o primeiro subdomínio de um CD40-L quimérico pode compreender um domínio I ou um subdomínio ou domínio I de CD40-L não humano. Assim, em certos CD40-L quiméricos, o primeiro subdomínio compreende os domínios ou subdomínios do domínio I, II, III e IV, de um CD40-L não humano. Em modalidades preferidos, o CD40-L não humano é um CD40-L de murino.

[0051] Em modalidades preferidas, o ligante de CD40 quimérico de humano/camundongo tem 92% de homologia de sequência de aminoácidos com CD40L humano (SEQ ID NO: 12) (Veja a Patente U.S. No. 7.495.090 que está incorporada aqui por referência e referida aqui coo “MEM40”). “Ligante de CD40” e “CD40-L” podem ser usados alternativamente aqui e também podem ser referidos como “CD154”. Especificamente, os domínios I, II e III – as regiões que contêm os domínios intracelular, intramembrana e extracelular proximal, respectivamente desta molécula – foram totalmente humanizados. No domínio IV, que contém a porção de ligação de CD40 da molécula, apenas aqueles domínios de murino necessários para a expressão ótima do ligante de CD40 nas células são retidos. MEM40 é totalmente humanizado na extremidade 3’ da molécula, onde a ligação do anticorpo neutraliza a atividade de CD154 de murino (ligante de CD40) quando administrado a humanos.

[0052] Exemplos não limitantes de CD40-L quimérico úteis na presente invenção compreendem as seguintes sequências:

[0053] SEQ ID NO: 7

MIETYSQPSPRSVATGLPASMKIFMYLLTVFLITQMIGSVLFAVYLHRR LDKVEEEVNLHEDFVFIKKLKRCNKGEGSLSLLNCEEMRRQFEDLVK DITLNKEEKKENSFEMQRGDEDPQIAAHVVSEANSNAASVLQWAKK GYYTMKSNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREPSSQRPFI VGLWLKPSSGSERILLKAANTHSSSQLCEQQSVHLGGVFELQPGAS VFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLK

[0054] SEQ ID NO:8

MIETYNQTSPRSAATGLPISMKIFMYLLTVFLITQMIGSALFAVYLHRRL DKIEDERNLHEDFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDI MLNKEETKKDEDPQIAAHVVSEANSNAASVLQWAKKGYYTMKSNLV TLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREPSSQRPFIVGLWLKPSSG SERILLKAANTHSSSQLCEQQSVHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQV SHGTGFTSFGLLKL

[0055] SEQ ID NO: 9

MIETYSQPSPRSVATGLPASMKIFMYLLTVFLITQMIGSVLFAVYLHRR LDKVEEEVNLHEDFVFIKKLKRCNKGEGSLSLLNCEEMRRQFEDLVK DITLNKEEKKENSFEMQRGDEDPQIAAHVVSEANSNAASVLQWAKK GYYTMKSNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFI VGLWLKPSSGSERILLKAANTHSSSQLCEQQSVHLGGVFELQPGAS VFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL

[0056] SEQ ID NO: 10

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[0057] SEQ ID NO 11

MIETYSQPSPRSVATGLPASMKIFMYLLTVFLITQMIGSVLFAVYLHRR LDKVEEEVNLHEDFVFIKKLKRCNKGEGSLSLLNCEEMRRQFEDLVK DITLNKEEKKENSFEMQRGDEDPQIAAHVVSEANSNAASVLQWAKK GYYTMKSNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFI VGLWLKPSSGSERILLKAANTHSSSQLCEQQSIHLGGVFELQPGASV FVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLK

[0058] SEQ ID NO: 12

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[0059] SEQ ID NO: 13

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[0060] SEQ ID NO: 14

MIETYNQTSPRSAATGLPISMKIFMYLLTVFLITQMIGSALFAVYLHRRL DKIEDERNLHEDFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDI MLNKEETKKDEDPQIAAHVVSEANSNAASVLQWAKKGYYTMKSNLV TLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIVGLWLKPSSG SERILLKAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQV SHGTGFTSFGLLKL

[0061] SEQ ID NO: 15

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[0062] SEQ ID NO: 16

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[0063] SEQ ID NO: 17

MIETYSQPSPRSVATGLPASMKIFMYLLTVFLITQMIGSVLFAVYLHRR LDKVEEEVNLHEDFVFIKKLKRCNKGEGSLSLLNCEEMRRQFEDLVK DITLNKEEKKENSFEMQRGDEDPQIAAHVVSEANSNAASVLQWAKK GYYTMKSNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREPSSQRPFI VGLWLKPSSGSERILLKAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASV FVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL

[0064] SEQ ID NO: 18

MIETYNQTSPRSAATGLPISMKIFMYLLTVFLITQMIGSALFAVYLHRRL DKIEDERNLHEDFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDI MLNKEETKKDEDPQIAAHVVSEANSNAASVLQWAKKGYYTMKSNLV TLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREPSSQRPFIVGLWLKPSSG SERILLKAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQV SHGTGFTSFGLLKL

[0065] Certas sequências de nucleotídeo que codificam o CD40-L quimérico da SEQ ID NOs: 7 a 18 estão descritas nas Patentes U.S.

7.495.090, 7.928.213 e 8.138.310. Estas sequências de nucleotídeos estão incorporadas aqui por referência e o uso de tais sequências de nucleotídeos está previsto aqui.

[0066] As APCs ou vírus oncolíticos da invenção podem compreender um ácido nucleico que codifica IFNα, em que IFNα compreende o IFNα do tipo selvagem humano (SEQ ID NO:1) ou um IFNα que possui 80% e até 99,99% inclusive (por exemplo, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99%) de identidade de sequência com IFNα do tipo selvagem humano, por exemplo, IFNα da SEQ ID NO: 1.

[0067] As APCs ou vírus oncolíticos da invenção podem compreender um ácido nucleico que codifica IFNβ, em que IFNβ compreende o IFNβ do tipo selvagem humano (SEQ ID NO:2) ou um

IFNβ que possui 80% e até 99,99% inclusive (por exemplo, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99%) de identidade de sequência com IFNβ do tipo selvagem humano, por exemplo, IFNβ da SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade específica, a sequência de nucleotídeos que codifica IFNβ carece dos primeiros 22 aminoácidos da SEQ ID NO: 2 e opcionalmente, ainda tem uma substituição da cisteína 17 dos peptídeo com 165 aminoácidos resultante com serina.

[0068] As APCs ou vírus oncolíticos da invenção podem compreender um ácido nucleico que codifica IFNε, em que IFNε compreende o IFNε do tipo selvagem humano (SEQ ID NO:3) ou um IFNε que possui 80% e até 99,99% inclusive (por exemplo, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99%) de identidade de sequência com IFNε do tipo selvagem humano, por exemplo, IFNε da SEQ ID NO: 3.

[0069] As APCs ou vírus oncolíticos da invenção podem compreender um ácido nucleico que codifica IFNκ, em que IFNκ compreende o IFNκ do tipo selvagem humano (SEQ ID NO:4) ou um IFNκ que possui 80% e até 99,99% inclusive (por exemplo, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99%) de identidade de sequência com IFNκ do tipo selvagem humano, por exemplo, IFNκ da SEQ ID NO: 4.

[0070] As APCs ou vírus oncolíticos da invenção podem compreender um ácido nucleico que codifica IFNω, em que IFNω compreende o IFNω do tipo selvagem humano (SEQ ID NO: 5) ou um IFNω que possui 80% e até 99,99% inclusive (por exemplo, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99%) de identidade de sequência com IFNω do tipo selvagem humano, por exemplo, IFNω da SEQ ID NO: 5.

[0071] As APCs ou vírus oncolíticos da invenção podem compreender um ácido nucleico que codifica CD40-L, em que CD40-L compreende o CD40-L do tipo selvagem humano (SEQ ID NO: 6) ou um CD40-L que possui entre 80% e até 99,99% inclusive (por exemplo, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99%) de identidade de sequência com CD40-L do tipo selvagem humano, por exemplo, CD40-L da SEQ ID NO: 6. As APCs ou vírus oncolíticos da invenção podem compreender um ácido nucleico que codifica CD40-L quimérico, em que CD40-L quimérico tem uma sequência selecionada entre as SEQ ID NOs: 7 a 18 ou um CD40-L que possui entre 80% e até 99,99% inclusive (por exemplo, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99%) de identidade de sequência com CD40-L quimérico tem uma sequência selecionada entre as SEQ ID NOs: 7 a 18.

[0072] Em modalidades preferidas, as APCs ou vírus oncolítico da invenção podem compreender um ácido nucleico que codifica MEM40. Por exemplo, em modalidades preferidas, as APCs ou vírus oncolítico da invenção compreendem IFNβ que compreende pelo menos 80% de identidade de sequência com CD40-L quimérico que possui a SEQ ID NO: 12.

[0073] Uma ou mais sequências de ácidos nucleicos heterólogos que codificam a combinação do IFN tipo I e CD40-L pode estar em um ou mais construtos virais. Exemplos não limitantes dos construtos virais incluem um construto adenoviral, um construto viral adeno-associado (AAV), um construto de poxvírus, um construto lentiviral, um construto alfaviral, um construto de vírus do herpes, um construto retroviral, um construto do vírus vaccinia, um construto da estomatite viral vesicular ou um construto do vírus do herpes simplex.

[0074] Em adição aos ácidos nucleicos que codificam o interferon do tipo I (por exemplo, IFNβ) e CD40-L (CD40-L quimérico de humano/camundongo), o vírus oncolítico de acordo com a presente invenção pode incluir ainda outras modificações em seu genoma. Por exemplo, ele pode incluir outras modificações em seu genoma. Por exemplo, ele pode compreender DNA adicional inserido em um gene já ativado ou substituído por um gene deletado. O vírus oncolítico também pode ter incorporado nele um ou mais promotores que transmitem ao vírus um nível intensificado de especificidade pela célula tumoral. Dessa maneira, o vírus oncolítico pode ser direcionado para tipos específicos de câncer que usam promotores específicos para célula de câncer. A expressão “promotor específico para célula de tumor” ou “sequência regulatória transcricional específica para o tumor” indica uma sequência regulatória transcricional, promotora e/ou intensificadora que está presente em um nível mais elevado na célula de câncer alvo do que na célula normal. Por exemplo, o vírus oncolítico para uso na invenção pode estar sob o controle de um regulador adicionado exogenamente.

[0075] Em modalidades preferidas, o vírus oncolítico é um adenovírus (Ad). Ad é um vírus DNA grande (aproximadamente 36 kb) que infecta humanos, mas que também apresenta uma ampla faixa de hospedeiros. Fisicamente, o adenovírus é um vírus icosaédrico que contém um DNA linear de fita dupla no genoma. Há aproximadamente 50 sorotipos de adenovírus humanos, que estão divididos em seis famílias com base em critérios moleculares, imunológicos e funcionais. Na idade adulta, virtualmente cada humano já foi infectado com os sorotipos mais comuns de adenovírus, o efeito principal sendo sintomas semelhantes a gripe.

[0076] A infecção adenoviral de células hospedeiras resulta no DNA adenoviral sendo mantido epissomicamente, o que reduz a genotoxicidade potencial associada com vetores de integração. Adicionalmente, os adenovírus são estruturalmente estáveis e nenhum rearranjo no genoma foi detectado após amplificação intensa. O adenovírus pode infectar a maioria das células epiteliais independente do seu estágio no ciclo celular. Até agora, a infecção adenoviral parece estar ligada apenas a uma doença leve tal como uma doença respiratória aguda em humanos.

[0077] O ciclo infeccioso do adenovírus ocorre em 2 etapas: a fase precoce que precede o início da replicação do genoma adenoviral e que permite a produção das proteínas regulatórias e das proteínas envolvidas na replicação e transcrição do DNA viral e a fase tardia que leva à síntese das proteínas estruturais. Os genes precoces estão distribuídos em 4 regiões que estão dispersas no genoma adenoviral, designadas E1 a E4 (“E” significa “precoce (early)”). As regiões precoces compreendem pelo menos seis unidades de transcrição, cada uma das quais possuindo seu próprio promotor. A expressão dos genes precoces é auto-regulada, alguns genes sendo expressos antes dos outros. Três regiões, E1, E2 e E4 são essenciais para a replicação do vírus. Assim, se o adenovírus é deficiente em uma dessas funções essa proteína deverá ser fornecida em trans ou o vírus não pode replicar.

[0078] A região precoce E1 está localizada na extremidade 5’ do genoma adenoviral e contém 2 unidades de transcrição viral, E1A e E1B. Esta região codifica proteínas que participam muito precocemente no ciclo viral e são essenciais para a expressão de quase todos os outros genes do adenovírus. Em particular, a unidade transcrição E1A codifica uma proteína que transativa a transcrição de outros genes virais, induzindo a transcrição dos promotores das regiões E1B, E2A, E2B, E3, e E4 e os genes tardios.

[0079] O adenovírus entra na célula hospedeira permissiva através de um receptor da superfície celular e então ele é internalizado. O DNA viral associado com certas proteínas virais necessárias para as primeiras etapas do ciclo de replicação entra no núcleo das células infectadas, onde a transcrição é iniciada. A replicação do DNA adenoviral ocorre no núcleo das células infectadas e não requer replicação celular. Novas partículas virais ou vírions são montadas depois do que elas são liberadas das células infectadas e podem infectar outras células permissivas.

[0080] O adenovírus é um sistema de liberação atraente. Modalidades da descrição podem utilizar o processo de fabricação que pode estar livre ou essencialmente livre de proteína, soro e componentes derivados de animais, tornando-o adequado para uma ampla faixa de produtos de vacina profilática ou terapêutica.

[0081] Se um adenovírus foi mutado de modo que ele seja condicionalmente replicativo (competente para replicação sob certas condições), uma célula auxiliar pode ser necessária para a replicação viral. Quando necessário, as linhagens de célula auxiliar podem ser derivadas de células humanas tais como células de rim embrionário humano, células musculares, células hematopoiéticas ou outras células mesenquimais embrionárias humanas ou epiteliais. Alternativamente, as células auxiliares podem ser derivadas de células de outra espécie de mamífero que sejam permissivas para o adenovírus humano. Tais células incluem, por exemplo, células Vero ou outras células mesenquimais embrionárias ou epiteliais de macaco. Em certos aspectos, uma linhagem celular auxiliar é 293. Vários métodos de cultivar células do hospedeiro e auxiliares podem ser encontrados na técnica, por exemplo (Racher, A.J., Fooks, A.R. & Griffiths, J.B. Biotechnol Tech (1995) 9: 169.).

[0082] Os adenovírus podem ser isolados usando metodologias diferentes. Muito frequentemente, depois da transfecção do genoma de Ad, placas adenovirais são isoladas das células superpostas em agarose e as partículas virais são expandidas para análise. Para protocolos detalhados, aquele versado na técnica é direcionado para (Graham, F.L., and Prevec, L. (1991). Manipulation of adenovirus vectors. Methods Mol Biol 7, 109-128.).

[0083] Tecnologias alternativas para a geração de vetores de adenovírus incluem a utilização do sistema do cromossomo bacteriano artificial (BAC), em recombinação bacteriana in vivo em uma cepa bacteriana recA+ que utiliza dois plasmídeos que contêm sequências adenovirais complementares e o sistema de cromossomo artificial em levedura (YAC) (publicações PCT 95/27071 e 96/33280, que estão incorporadas aqui por referência.).

[0084] Há uma ampla gama de tipos de vírus oncolítico em desenvolvimento como agentes anticâncer, incluindo os adenovírus (vide Russell et. al., 2012 Nat. Biotechnol.; 30(7):658–670; Lawler et. al., 2017 JAMA Oncology; 3(6):841-849; Choi et al., 2016, Biomedicines; 4(3):18; e Chiocca and Rabkin, 2014 Cancer Immunol Res. 2(4):295- 300, que estão incorporados aqui por referência em sua totalidade).

[0085] Múltiplas propriedades biológicas podem ser consideradas na seleção ou projeto de um adenovírus oncolítico terapêutico para a atividade terapêutica desejada, incluindo: direcionamento seletivo para células de câncer para infecção através de tropismo natural de proteínas da superfície celular ou pela manipulação do adenovírus para atingir diretamente as células de câncer; replicação seletiva em células de câncer; atenuação de patogênese viral; intensificação da atividade lítica; modificação da resposta imune antiviral que pode levar à depuração rápida do adenovírus; e modificação da imunidade sistêmica anti-tumor através da modificação genética dos adenovírus para incorporar citocinas, agonistas imunes ou bloqueadores do ponto de controle imune.

[0086] Vetores de adenovírus oncolítico competente para replicação possuem várias propriedades que os tornam ideais para aplicações terapêuticas, incluindo a infectividade de uma ampla faixa de tipos de célula e tumor, infecção de células que não se dividem, falta de integração genômica, altos títulos, capacidade para transportar transgenes, estabilidade in vitro e in vivo e altos níveis de expressão de transgenes. Vetores de expressão de adenovírus incluem construtos que contêm sequências de adenovírus suficientes para (a) suportar o envelopamento do construto e (b) para exprimir em última análise um construto de gene recombinante que tenha sido aí clonado.

[0087] A modulação das propriedades biológicos dos adenovírus oncolítico pode impactar uma faixa de interações imunes que podem ser benéficas ou prejudiciais no efeito de tratamento do câncer. As interações dependem do tumor específico, o sítio e a extensão da doença, o microambiente imunossupressor do tumor, a plataforma do vírus oncolítico, a dose, o tempo e as condições de liberação assim como as respostas individuais do paciente (vide, de modo geral, Aurelian L. “Oncolytic viruses as immunotherapy: progress and remaining challenges” Onco. Targets Ther. 2016; 9:2627-2637). Por exemplo, a presença dos genes E3 de adenovírus tem sido descrita para aumentar a potência oncolítica de adenovírus que se replicam condicionalmente in vitro e in vivo (vide Suzuki K, Alemany R, Yamamoto M, and Curiel DT “The presence of the adenovirus E3 region improves the oncolytic potency of conditionally replicative adenoviruses” Clin. Cancer Res. 2002 Nov;8(11):3348-59). Em particular, a Proteína de Morte do Adenovírus (ADP) E3-11.6 kDa é considerada ser necessária para a morte celular eficiente (vide Tollefson A, Ryerse J, and Scaria A, et al. “The E3-11.6-kDa Adenovirus Death Protein (ADP) is required for efficient cell death: characterization of cells infected with adp mutants,” Virology 1996; 220:152-162). Entretanto, para abordagens imunoterapêuticas do tratamento do câncer, pode ser importante equilibrar a morte celular rápida com a expressão suficiente de proteínas moduladoras imunes para indução ótima de respostas imunes anticâncer. A presente descrição fornece tais adenovírus oncolítico.

[0088] Membros de qualquer um dos 57 sorotipos de adenovírus humanos (HAdV-1 a 57) pode incorporar ácido nucleico heterólogo que codifica moléculas exógenas, por exemplo, IFN tipo I exógeno e um ligante de CD40-L exógeno como descritos aqui. Ad5 humano é bem caracterizado geneticamente e bioquimicamente (GenBank M73260; AC 000008). Assim, em uma modalidade particular, o adenovírus oncolítico é um sorotipo Ad5 competente para replicação ou um sorotipo híbrido que compreende um componente de Ad5. O adenovírus pode ser uma cepa de tipo selvagem, mas pode ser geneticamente modificada para intensificar a seletividade pelo tumor, por exemplo, pela atenuação da habilidade do vírus em replicar dentro de células quiescentes normais sem afetar a habilidade do vírus para replicar nas células do tumor. Exemplos não limitantes de adenovírus oncolítico competente para replicação abrangidos pela presente descrição incluem Delta-24, Delta-24-RGD, ICOVIR-5, ICOVIR-7, ONYX-015, ColoAd1, H101 e AD5/3-D24-GMCSF. Onyx-015 é um híbrido do vírus do sorotipo Ad2 e Ad5 com deleções nas regiões E1B-55K e E3B para intensificar a seletividade pelo câncer. H101 é uma versão modificada de Onyx-015. ICOVIR-5 e ICOVIR-7 compreendem uma deleção do sítio de ligação a Rb-de E1A e uma substituição do promotor de E1A por um promotor de E2F. ColoAd1 é um sorotipo quimérico de Add11p/Ad3. AD5/3-D24-GMCSF (CGTG-102) é um sorotipo de adenovírus co capsídeo modificado 5/3 que codifica GM-CSF (o knob da proteína do capsídeo de Ad5 é substituído por um knob do domínio do sorotipo 3).

[0089] Adenovírus oncolíticos injetados em um tumor induzem a morte celular e a liberação da nova progênie de adenovírus que, pela infecção das células da vizinhança, geram uma onda de tratamento que, se não paralisada, pode levar a destruição total do tumor.

[0090] Dentro de algumas modalidades da descrição, uma combinação de sequências heterólogas que codificam IFN Tipo I e

CD40-L pode ser incorporada em regiões não essenciais do adenovírus. Em uma modalidade preferida da descrição, o adenovírus contém uma deleção de 24 nucleotídeos em E1, deleção da região E1B-55K e deleção das regiões E3B para intensificar a seletividade pelo câncer.

[0091] Regiões virais podem ser alteradas para múltiplos propósitos para transmitir as propriedades terapêuticas desejadas. Exemplos não limitantes das propriedades terapêuticas podem incluir replicação e disseminação viral intensificadas, oncólise intensificada, direcionamento preferencial de células tumorais versus células normais, ativação imune intensificada e proteção do vírus contra o sistema imune do hospedeiro. As regiões virais para os propósitos descritos acima podem ser eliminadas (deleções completa ou parcial), tornadas não funcionais, modificadas para atenuar a função ou substituídas por outras sequências. Vírus oncolítico também podem ser alterados para incluir um ou mais genes heterólogos que codificam as proteínas terapêuticas e/ou proteínas imunomoduladoras. Em uma modalidade particular, um vírus oncolítico é modificado para expressar uma combinação de IFNβ e CD40-L.

[0092] Opcionalmente, peptídeos de sinal ou ácidos nucleicos que os codificam podem ser empregados para a localização na superfície de um polipeptídeo desejado.

[0093] Em modalidades preferidas, a APC, tal como DC, é uma APC ou DC humanas. Preferivelmente, APCs, tal como DCs, de um indivíduo humano que possui uma malignidade são isoladas e geneticamente modificadas para expressar uma combinação de um IFN tipo I exógeno e um CD40-L exógeno, por exemplo, através de uma ou mais sequências de ácido nucleico heterólogo que codificam uma combinação de IFNβ e CD40-L. Em modalidades preferidas, CD40-L é MEM40.

[0094] O vírus oncolítico pode ser geneticamente modificado para aperfeiçoar uma ou mais propriedades para uso no tratamento do câncer, incluindo a replicação seletiva nas células de câncer; atenuação da patogênese viral; intensificação da atividade lítica; modificação da resposta imune antiviral que pode levar a depuração rápida do vírus; e modificação da imunidade sistêmica antitumor induzida por vírus.

[0095] Em modalidades, nas quais o vírus oncolítico tem um genoma de RNA, os genes que codificam o IFN tipo I e CD40-L podem ser tornados adequados para a expressão a partir de um genoma de RNA viral antes da inserção do gene no genoma. Por exemplo, o gene que codifica o IFN tipo I e CD40-L pode sofrer a substituição de timina com uracil para facilitar a expressão a partir de um genoma de RNA viral. Outras modificações que podem ser adequadas para tais modalidades serão conhecidas pelas pessoas versadas na técnica.

[0096] Cassetes de expressão incluídos nos vetores úteis na presente descrição contêm (em uma direção de 5’ para 3’) um promotor transcricional operativamente ligado a uma sequência codificadora de proteína, sinais de splice que incluem sequências intervenientes e uma sequência de terminação da transcrição/poliadenilação. Os promotores e intensificadores que controlam a transcrição dos genes que codificam proteínas em células eucarióticas são compostos por múltiplos elementos genéticos. O maquinario celular reúne e integra a informação regulatória expressa por cada elemento, permitindo que genes diferentes desenvolvam padrões distintos, frequentemente complexos de regulação da transcrição. Um promotor usado no contexto da presente descrição inclui promotores constitutivos, induzíveis e específicos para tecido.

[0097] A expressão dos ácidos nucleicos de IFN tipo I e CD40-L pode estar sob o controle de um promotor funcional em células de mamífero, tais como células de tumor humano. Em uma modalidade, os promotores que direcionam a expressão de um IFN tipo I e CD40-L são um promotor de SV e um promotor de citomegalovírus (CMV), respectivamente.

[0098] Os construtos de expressão fornecidos aqui podem compreender um promotor para direcionar a expressão dos genes programados. Um promotor geralmente compreende uma sequência que funciona para posicionar o sítio de partida da síntese de RNA.O melhor exemplo disto é o TATA box, mas em alguns promotores não existe TATA box, tal como no promotor para o gene da desoxinucleotidil transferase terminal de mamífero e o promotor para os genes tardios de SV40, um elemento diferente que se superpõe ao próprio sítio de partida e ajuda a corrigir o local da iniciação. Elementos promotores adicionais regulam a frequência da iniciação da transcrição. Estes estão, tipicamente, na região 30 a 110 bp a montante do sítio de partida, embora promotores tenham mostrado conter elementos funcionais a jusante do sítio de partida também. Para trazer uma sequência codificadora “sob o controle de” um promotor, é posicionada a extremidade 5’ do sítio de iniciação da transcrição da fase de leitura transcricional “a jusante” de (isto é, 3’ de) do promotor escolhido. O promotor “a montante” estimula a transcrição do DNA e promove a expressão do RNA codificado.

[0099] O espaçamento entre elementos promotores frequentemente é flexível, tal que a função do promotor é preservada quando os elementos são invertidos ou movidos um em relação ao outro. Dependendo do promotor, parece que os elementos individuais podem funcionar cooperativamente ou independentemente para ativar a transcrição. Um promotor pode ou não ser usado em conjunto com um “intensificador”, que se refere a uma sequência regulatória que atua em cis na ativação da transcrição de uma sequência de ácido nucleico.

[00100] Um promotor pode estar naturalmente associado com uma sequência de ácido nucleico e obtido pelo isolamento das sequências não codificadoras 5’ localizadas a montante do segmento codificador e/ou éxon. Tal promotor pode ser referido como “endógeno”. Similarmente, um intensificador pode estar naturalmente associado com uma sequência de ácido nucleico, localizada a jusante ou a montante desta sequência. Alternativamente, certas vantagens serão obtidas pelo posicionamento do segmento de ácido nucleico sob o controle de um promotor recombinante ou heterólogo, que ser refere a um promotor que está normalmente associado com uma sequência de ácido nucleico em seu ambiente natural. Tais promotores ou intensificadores podem incluir promotores ou intensificadores de outros genes e promotores ou intensificadores isolados de qualquer outro vírus ou célula procariótica ou eucariótica e promotores ou intensificadores que “não ocorrem naturalmente”, isto é, que contêm elementos diferentes de regiões regulatórias da transcrição diferentes e/ou mutações que alteram a expressão.

[00101] Pode ser empregado um promotor e/ou intensificador que direciona efetivamente a expressão do segmento de DNA na organela, tipo celular, tecido, órgão ou organismo escolhido para a expressão. Aqueles versados na técnica da biologia molecular geralmente conhecem o uso de promotores, intensificadores e combinações do tipo celular para expressão de proteína. Os promotores empregados podem ser constitutivos, específicos para o tecido, induzíveis e/ou úteis sob as condições apropriadas para direcionar a expressão em alto nível do segmento de DNA introduzido, tal como é vantajoso na produção em larga escala de proteínas e/ou peptídeos recombinantes. O promotor pode ser heterólogo ou endógeno.

[00102] Exemplos não limitantes de promotores incluem promotores virais precoces ou tardios, tais como promotores precoces ou tardios de SV40, promotores precoces imediatos de citomegalovírus (CMV), promotores precoces do Vírus do Sarcoma de Rous (RSV) e promotores de célula eucariótica.

[00103] Um sinal de iniciação específico também pode ser usado nos construtos de expressão fornecidos na presente descrição para tradução eficiente das sequências codificadoras. Esses sinais incluem um códon de iniciação ATG ou sequências adjacentes Sinais exógenos de controle da tradução, incluindo o códon de iniciação ATG, podem precisar ser fornecidos. Aquele versado na técnica será prontamente capaz de fornecer os sinais necessários. É bem conhecido que o códon de iniciação pode estar “em fase” com a fase de leitura da sequência codificadora desejada para assegurar a tradução do inserto inteiro. Os sinais exógenos de controle da tradução e os códons de iniciação podem ser naturais ou sintéticos. A eficiência da expressão pode ser intensificada pela inclusão dos elementos intensificadores da transcrição apropriados.

[00104] Em certas modalidades, o uso de elementos dos sítios de entrada de ribossoma (IRES) são usados para criar multigene ou mensagens policistrônicas. Elementos de IRES podem desviar o modelo de rastreamento de ribossomo da tradução dependente de Cap metilado 5’ e começar a tradução em sítios internos (Pelletier et. al. 1988 Molecular and Cellular Biology). Elementos de IRES de dois membros da família de picornavírus (pólio e encefalomielite) foram descritos (Pelletier et. al. 1988 Molecular and Cellular Biology), assim como um IRES de uma mensagem de mamífero (Macejak et. al. 1991 Nature). Elementos IRES podem ser ligados a fases de leitura abertas heterólogas. Múltiplas fases de leitura aberta podem ser transcritas juntas, cada uma separada por um IRES, criando mensagens policistrônicas. O elemento IRES permite que cada fase de leitura aberta seja acessível aos ribossomos para a tradução eficiente. Múltiplos genes podem ser eficiente expressos usando um único promotor/intensificador capaz de transcrever uma única mensagem

(Patente U.S. Nos. 5.925.565 e 5.935.819, cada uma das quais incorporada aqui por referência). Em certas modalidades, o IFN tipo I e CD40-L estão ligados por elementos IRES para a expressão eficiente de ambos os genes.

[00105] Modalidades adicionais da invenção fornecem uma composição que compreende a APC, tal como DC, ou o vírus oncolítico da invenção e um veículo ou adjuvante farmaceuticamente aceitáveis.

[00106] Como observado acima, a invenção fornece estas APCs, tais como DCs, que expressam uma combinação de IFN tipo I e CD40-L que induz uma potente resposta sistêmica de célula T quando acoplado com um tratamento que induz a morte celular. Tais efeitos podem ser fornecidos pela administração de vírus oncolítico que expressam uma combinação de IFN tipo I e CD40-L, por exemplo, através de uma ou mais sequências de ácido nucleico heterólogo que codificam uma combinação de IFNβ e CD40-L.

[00107] Consequentemente, certas modalidades da invenção fornecem um método para o tratamento de uma malignidade, compreendendo administrar a um indivíduo que necessita de tratamento, uma quantidade eficaz de APCs, tais como DCs, ou vírus oncolítico da invenção que expressam uma combinação de IFN tipo I e CD40-L, por exemplo, através de uma ou mais sequências de ácido nucleico heterólogo que codificam uma combinação de IFNβ e CD40-L.

[00108] Em modalidades preferidas, as APCs, tais como DCs, usadas nos métodos da invenção sã APCs autólogas, isto é, APCs de um indivíduo que sofre de uma malignidade são isoladas e modificadas para expressar uma combinação de IFN tipo I exógena e um CD40-L exógeno, por exemplo, através de uma ou mais sequências de ácido nucleico heterólogo que codificam uma combinação de IFNβ e CD40-L e administradas ao indivíduo. Entretanto, as APCs podem ser autólogas, alogênicas ou xenogênicas.

[00109] APCs, tais como DCs ou o vírus oncolítico da invenção que compreendem uma combinação de IFN tipo I e CD40-L podem ser administradas sozinhas ou em combinação com um ou mais agentes anticâncer adicionais. Tais agentes incluem um fármaco quimioterapêutico (por exemplo, melfalan), imunomodulador, adjuvante, fármaco para anemia (por exemplo, eritropoietina), terapia de radiação, transplante de célula-tronco, células T que expressam o receptor de antígeno quimérico (células CAR T) ou uma combinação de dois ou mais dos precedentes. Em certas modalidades, tal terapia é administrada antes, durante ou depois da administração das APCs, tais como DCs ou dos vírus oncolítico.

[00110] A atividade ótima de APCs, tais como DCs, da invenção podem ser observadas quando há uma abundância de antígenos tumorais. Um fenômeno observado em pacientes humanos com câncer que passaram pelo tratamento de radiação (IR) é o efeito abscopal, onde IR pode induzir a regressão de tumores fora do campo da radiação. O efeito abscopal é baseado na ativação da célula T que acompanha a morte celular induzida por IR levando a liberação de antígenos tumorais. A raridade desse efeito pode ser devida aos sinais necessários para ativação de DC e célula T que não são fornecidos pela IR sozinha. O efeito abscopal é considerado ser baseado na liberação de antígenos tumorais pela IR, o que leva à indução da resposta imune antitumor da célula T, mas o meio para fazer a resposta abscopal mais comum a fim de beneficiar um grande número de pacientes não é conhecido. A invenção prevê que a radiação sozinha pode não ser um ativador suficientemente forte da imunidade inata que leva à ativação de DC e apresentação de antígeno. Portanto, a invenção prevê que a administração exógena de estimuladores da imunidade inata aumentará a resposta antitumor da célula T levando a um grande efeito abscopal.

[00111] Um de tais estimuladores da imunidade inata é uma APC, tal como DC, que compreende uma combinação de IFN tipo I e CD40-L, por exemplo, uma vacina de APC transduzida de lentivírus, tal como DC, que expressa níveis elevados de uma combinação de IFNβ e CD40- L, que regule a ativação da APC, tal como DC. APCs tais como DCs aqui descritas podem ser usadas para injeção intratumoral. A invenção prevê que combinar IR e APCs que compreendem uma combinação de IFN tipo I e CD40-L, tal como uma combinação de IFNβ e CD40-L, resulte em um efeito abscopal antitumor potente através da acentuada ativação da célula T. Este tratamento foi especialmente eficaz quando combinado com a terapia com um bloqueador do ponto de controle.

[00112] De acordo com a invenção, a administração de APCs tais como DCs, que compreendem uma combinação de IFN tipo I e CD40- L, tal como uma combinação de IFNβ e CD40-L, em tumores irradiados pode intensificar o efeito abscopal.

[00113] Consequentemente, em certos métodos de tratamento de uma malignidade no indivíduo compreendem administrar uma terapia de irradiação ao indivíduo seguida pela administração de APCs, tais como DCs, que compreendem uma combinação de IFN tipo I e CD40- L, tal como uma combinação de IFNβ e CD40-L, por exemplo, através de uma ou mais sequências de ácido nucleico heterólogo que codificam uma combinação de IFNβ e CD40-L. APCs, tais como DCs podem ser administradas múltiplas vezes durante um período de dias. Em modalidades adicionais, APCs, tais como DCs podem ser administradas em cerca de 20 a 40 horas, preferivelmente cerca de 25 a 35 horas, até mais preferivelmente, cerca de 30 horas e o mais preferivelmente cerca de 24 horas depois da administração da radiação.

[00114] A irradiação administrada a um indivíduo é preferivelmente uma irradiação ionizante, tal como raios X, raios gama, radônio ou outras formas de radiação de alta energia.

[00115] Em certas modalidades, as APCs tais como DCs ou os vírus oncolíticos são administrados por uma injeção intradérmica, particularmente em um sítio anatômico que drene para as redes de linfonodos axilares e/ou inguinais do indivíduo. Em outras modalidades, as APCs, tais como DCs ou os vírus oncolíticos são administrados no tumor (intra-tumoral) ou em um linfonodo, tal como um linfonodo inguinal do indivíduo. Em outras modalidades, as APCs, tais como DCs ou os vírus oncolíticos são administrados por uma injeção intravascular (por exemplo, intravenosa).

[00116] Em algumas modalidades, em adição a administração de uma terapia de irradiação e APCs, tais como DCs ou administração dos vírus oncolíticos da invenção, o método compreende ainda a realização de transplante de célula hematopoiética (células-tronco hematopoiéticas ou células progenitoras, por exemplo, da medula óssea, sangue periférico ou sangue do cordão) no indivíduo. O transplante de célula hematopoiética pode ser autólogo ou alogênico. APCs tais como DCs ou os vírus oncolíticos da invenção podem ser administrados antes e/ou depois do transplante de célula hematopoiética.

[00117] Em modalidades adicionais, em adição à administração de uma terapia de irradiação e APCs, tais como DCs ou administração dos vírus oncolíticos da invenção e opcionalmente, a realização de transplante de célula hematopoiética, os métodos compreendem a realização de mobilização de célula-tronco (por exemplo, usando G- CSF) no indivíduo e coletar as células hematopoiéticas do indivíduo antes do transplante de célula hematopoiética autóloga.

[00118] Tipicamente, APCs, tais como DCs são coletadas do indivíduo, modificadas de acordo com a invenção e administradas ao indivíduo. APCs, tais como DCs podem ser criopreservadas antes da administração a um indivíduo.

[00119] Em certas modalidades, os métodos compreendem administrar um agente quimioterapêutico (por exemplo, melfalan) antes, durante ou depois da administração de APCs, tais como DCs ou os vírus oncolíticos da invenção.

[00120] Em certas modalidades, depois da administração de uma terapia de irradiação e APCs, tais como DCs ou os vírus oncolíticos da invenção, os métodos compreendem ainda a administração de um inibidor do ponto de controle ao indivíduo.

[00121] Certos inibidores do ponto de controle têm sido usados na terapia do câncer. Inibidores do ponto de controle se referem a vias inibitórias no sistema imune que são responsáveis para manter a auto- tolerância e a modulação do grau de resposta do sistema imune para minimizar o dano do tecido periférico. As células tumorais podem ativar os pontos de controle do sistema imune para diminuir a eficácia da resposta imune contra as células do tumor. Inibidores do ponto de controle exemplificadores incluem inibidores, tais como anticorpos, contra o antígeno 4 do linfócito T citotóxico (CTLA4, também conhecido como CD152), proteína 1 da morte celular programada (PD-1, também conhecida como CD279) e o ligante 1 da morte celular programada (PD- L1, também conhecido como CD274). Anticorpos anti-PD-1 exemplificadores estão disponíveis comercialmente e incluem pembrolizumab, lambrolizumab, nivolumab, AMP-224 e pidilizumab. Anticorpos anti-PDL-1 exemplificadores também estão disponíveis comercialmente e incluem atezolizumab, MDX-1105, MEDI4736, MPDL3280A, BMS-936559 e MIH1. Anticorpos anti-CTLA4 exemplificadores incluem ipilimumab e tremelimumab. Ipilimimab recebeu aprovação do FDA para o tratamento de melanoma metastático (Wada et al., 2013, J Transl Med 11:89). Exemplos adicionais de alvos de proteína de ponto de controle incluem, mas não são limitados a B7- H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4 (pertence à família CD2 de moléculas e é expressa em todas as células

NK e células de memória CD8+ T), CD160 (também referido como BY55), CGEN-15049, CHK 1 e CHK2 quinases, A2aR e vários ligantes da família B-7. Exemplos não limitantes de anticorpos incluem MEDI0680 (AMP-514), AUNP-12, avelumab (MSB0010718C), BMS935559 (MDX-1105), rHIgM12B7, BMS-986016, GSK2831781, IMP321, lirilumab (BMS-986015), IPH2101 (1-7F9), Indoximod (NLG 9189), NLG 919, INCB024360, PF-05082566, Urelumab (BMS-663513), e MEDI6469.

[00122] Exemplos não limitantes de inibidores de ponto de controle que podem ser usados estão listados na Tabela 1 abaixo. Tabela 1. Exemplos de Inibidores de Ponto de Controle, Classes e Moléculas Alvo Nome Classe do Agente Alvo Ipilumumab (a.k.a. MDX-010; MDX- mAb para IgG1 Antigeno 4 do linfócito 101; BMS-734016; comercializado humana T citotóxico (CTLA-4) como Yervoy) Tremelimumab (a.k.a. ticilimumab; CP- mAb para IgG2 CTLA-4 675-206) humana Nivolumab (a.k.a. ONO-4538; BMS- mAb para IgG4 Morte programada-1 936558; MDX1106; comercializado humana (PD-1) como Opdivo) Pembrolizumab (a.k.a., MK-3475; mAb para IgG4 PD-1 lambrolizumab; comercializado como humanizado Keytruda) Pidlizumab (a.k.a. CT-011) mAb para IgG1 PD-1 humanizado MEDI0680 (a.k.a. AMP-514) mAb para IgG4 PD-1 humanizado AMP-224 proteina de fusão de PD-1 Fc-PD-L2 AUNP-12 Peptídeo de 29 PD-1 aminoácidos, ramificado BMS-936559 mAb para IgG4 Ligante-1 de morte humana programada (PD-L1)

Nome Classe do Agente Alvo Atezolizumab (a.k.a. MPDL3280A; mAb para IgG1 PD-L1 RG7446) humana Durvalumab (a.k.a. MEDI4736) mAb para IgG1 PD-L1 humana Avelumab (a.k.a. MSB0010718C) mAb para IgG1 PD-L1 humana BMS935559 (a.k.a. MDX-1105) mAb para IgG4 PD-L1 humana rHIgM12B7 mAb para IgGM Ligante-2 de morte humana programada (PD-L2) BMS-986016 mAB Gene 3 de ativação de linfócito (LAG-3; a.k.a. CD223) GSK2831781 mAb afuscado LAG-3 humanizado IMP321 LAG-3 solúvel LAG-3 Lirilumab (a.k.a. BMS-986015) mAb para IgG4 Receptor semelhante a humanizado célula killer de imunoglobulina (KIR) IPH2101 (a.k.a. 1-7F9) Ab monoclonal anti- KIR inibidor Indoximod (a.k.a. NLG 9189; CAS Molécula pequena (Indoleamina-2,3- #110117-83-4) (isômero D de 1-metil- dioxigenase 1 (IDO1) triptofano) NLG 919 (CAS # 1402836-58-1) Molécula pequena IDO1 INCB024360 (CAS # 914471-09-3) Molécula pequena IDO1 PF-05082566 mAb para IgG2 4-1BB (a.k.a. CD137) humana Urelumab (a.k.a. BMS-663513) mAb para IgG4 4-1BB humanizado MEDI6469 Ab de camundongo OX40 (a.k.a. CD134) anti-IgG1 humana

[00123] Em uma modalidade, uma combinação de dois ou mais inibidores do ponto de controle é administrada ao indivíduo. Em uma modalidade, a combinação de inibidores do ponto de controle é selecionada entre aqueles da Tabela 1. Os dois ou mais inibidores do ponto de controle podem ser administrados simultaneamente ou consecutivamente com relação um ao outro. Em uma modalidade adicional, a combinação de dois ou mais inibidores de ponto de controle atinge diferentes proteínas de ponto de controle, tais como PD-1 (por exemplo, nivolumab ou outro inibidor de PD-1) e CTLA-4 (por exemplo, ipilumumab ou outro inibidor de CTLA-4) , são administrados ao indivíduo simultaneamente ou consecutivamente com relação um ao outro. Em uma modalidade, a combinação de dois ou mais inibidores de ponto de controle atinge duas ou mais proteínas de ponto de controle diferentes entre: CTLA-4, PD-L1, PD-L2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1 quinase, CHK2 quinase, A2aR e ligantes da família B-7. Em uma modalidade, a combinação de dois ou mais inibidores de ponto de controle atinge duas ou mais proteínas de ponto de controle diferentes é selecionada entre aquelas na Tabela 1.

[00124] O nível de dose, frequência de dosagem, duração da dosagem e outros aspectos da administração do inibidor de ponto de controle podem ser otimizados de acordo com a apresentação clínica do paciente, durante ou curso da doença, comorbidades e outros aspectos do cuidado clínico. A invenção não é tão limitante com relação aos aspectos particulares do componente inibidor do ponto de controle dos métodos incorporados aqui. Inibidores do ponto de controle adicionais são bem conhecidos por aqueles versados na técnica e tais modalidades estão dentro do âmbito da invenção.

[00125] Exemplos de cânceres que podem ser tratados de acordo com os materiais e métodos aqui descritos incluem, mas não são limitados a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia. Exemplos mais particulares de tais cânceres incluem câncer de mama, câncer de próstata, câncer de cólon, câncer de célula escamosa, câncer de pulmão de célula pequena, câncer de pulmão de célula não pequena,

câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer cervical, câncer ovário, câncer peritoneal, câncer de fígado, por exemplo, carcinoma hepático, câncer de bexiga, câncer de coloretal, carcinoma endometrial, câncer de rim câncer de tireoide. Em algumas modalidades, o câncer é o melanoma, MDS, câncer de ovário, câncer de mama ou mieloma múltiplo.

[00126] Outros exemplos não limitantes de cânceres são: carcinoma de célula basal, câncer do trato biliar; câncer ósseo; câncer do cérebro e SNC; coriocarcinoma; câncer do tecido conjuntivo; câncer de esôfago; câncer do olho; câncer de cabeça e pescoço; câncer gástrico; neoplasma intra-epitelial; câncer de laringe; linfoma incluído linfoma de Hodgkin e Não Hodgkin; melanoma; mieloma; neuroblastoma; câncer da cavidade oral (por exemplo, lábio, língua, boca e faringe); retinoblastoma; rabdomiosarcoma; câncer retal; câncer do sistema respiratório; sarcoma; câncer de pele; câncer de estômago; câncer testicular; câncer uterino; câncer do sistema urinário, assim como outros carcinomas e sarcomas. Exemplos de tipos de câncer que podem ser tratados com as composições e métodos da invenção estão listados na Tabela 2. Tabela 2. Exemplos de Tipos de Câncer Leucemia Linfoblástica Aguda, Adulto Leucemia de Célula Pilosa Leucemia Linfoblástica Aguda, Infantil Câncer de Cabeça e Pescoço Leucemia Mieloide Aguda, Adulto Câncer Hepatocelular (Fígado), Adulto Leucemia Mieloide Aguda, Infantil (Primário) Carcinoma Adrenocortical Câncer Hepatocelular (Fígado), Infantil Carcinoma Adrenocortical, Infantil (Primário) Cânceres Relacionados a AIDS Linfoma de Hodgkin, Adulto Linfoma Relacionado a AIDS Linfoma de Hodgkin, Infantil Câncer Anal Linfoma de Hodgkin Durante a Gestação Astrocitoma, Infantil Cerebelar Câncer da Hipofaringe Astrocitoma, Infantil Cerebral Glioma Hipotalâmico e da Via Visual, Infantil Carcinoma de Célula Basal Melanoma Intraocular Câncer de Duto Biliar, Extrahepático Carcinoma de Célula da Ilhota (Pâncreas

Câncer de Bexiga Endócrino) Câncer de Bexiga, Infantil Sarcoma de Kaposi Câncer Ósseo, Osteosarcoma/ Câncer de Rim (Célula Renal) Histiocitoma Fibroso Maligno Câncer de Rim, Infantil Glioma de Tronco Cerebral, Infantil Câncer de Laringe Tumor Cerebral, Adulto Câncer de Laringe, Infantil Tumor Cerebral, Glioma de Tronco Leucemia, Linfoblástica Aguda, Adulto Cerebral, Infantil Leucemia, Linfoblástica Aguda, Infantil Tumor Cerebral, Astrocitoma Cerebelar, Leucemia, Mieloide Aguda, Adulto Infantil Leucemia, Mieloide Aguda, Infantil Tumor Cerebral, Astrocitoma Cerebral / Leucemia, Linfocítica Crônica Glioma Maligno, Infantil Leucemia, Mielogênica Crônica Tumor Cerebral, Ependimoma, Infantil Leucemia, Célula Pilosa Tumor Cerebral, Meduloblastoma, Infantil Câncer do Lábio e cavidade Oral Tumor Cerebral, Tumores Supratentoriais Câncer do Fígado, Adulto (Primário) do Neuroectoderma Primitivo, Infantil Câncer do Fígado, Infantil (Primário) Tumor Cerebral, Via Visual e Glioma Câncer de Pulmão, Célula Não Pequena Hipotalâmico, Infantil Câncer de Pulmão, Célula Pequena Linfoma, Tumor Cerebral, Infantil Relacionado a AIDS Câncer de Mama Linfoma, Burkitt Câncer de Mama, Infantil Linfoma, Célula T Cutânea, vide Micose Câncer de Mama, Masculino Fungoide e Síndrome de Sézary Adenomas Brônquicos/Carcinoides, Linfoma, Hodgkin, Adulto Infantil Linfoma, Hodgkin, Infantil Linfoma de Burkitt Linfoma, Hodgkin Durante a Gestação Tumor Carcinoide, Infantil Linfoma, Não Hodgkin, Adulto Tumor Carcinoide, Gastrointestinal Linfoma, Não Hodgkin, Infantil Carcinoma Primário Desconhecido do Linfoma, Não Hodgkin Durante a Gestação Sistema Nervoso Central Linfoma, Primário do Sistema Nervoso Linfoma, Primário Central Astrocitoma Cerebelar Astrocitoma, Macroglobulinemia, Waldenström Infantil Histiocitoma Fibroso Maligno do Osso Astrocitoma Cerebral /Glioma Maligno, /Osteosarcoma Infantil Meduloblastoma, Infantil Câncer Cervical Melanoma Cânceres Infantis Melanoma, Intraocular (Olho) Leucemia Linfocítica Crônica Carcinoma de Célula de Merkel Leucemia Mielogênica Crônica Mesotelioma, Maligno Adulto Distúrbios Mieloproliferativos Crônicos Mesotelioma, Infantil

Câncer de Colón Câncer de Pescoço Escamoso Metastático Câncer Coloretal, Infantil com Síndrome Neoplásica Endócrina Múltipla Linfoma Cutâneo de Célula T, vide Primária, Infantil Micoses Fungoides e Síndrome de Mieloma Múltiplo / Neoplasma de Célula Sézary Plasmática Câncer Endometrial Micose Fungoide Ependimoma, Infantil Síndromes Mielodisplásicas Câncer de Esôfago Doenças Mielodisplásicas/ Mieloproliferativas Câncer de Esôfago, Infantil Leucemia Mielogênica, Crônica Família de Tumores de Ewing Leucemia Mieloide, Adulto Aguda Tumor de Célula Germinativa Leucemia Mieloide, Infantil Aguda Extracraniana, Infantil Mieloma, Múltiplo Tumor de Célula Germinativa Distúrbios Mieloproliferativos, Crônicos Extragonadal Câncer da Cavidade Nasal e Seio Paranasal Câncer de Duto Biliar Extra-hepático Câncer Nasofaríngeo Câncer de Olho, Melanoma Intraocular Câncer Nasofaríngeo, Infantil Câncer de Olho, Retinoblastoma Neuroblastoma Câncer da Vesícula Biliar Linfoma Não Hodgkin, Adulto Câncer Gástrico (Estômago) Linfoma Não Hodgkin, Infantil Câncer Gástrico (Estômago), Infantil Linfoma Não Hodgkin Durante a Gestação Tumor Carcinoide Gastrointestinal Câncer de Pulmão de Célula Não pequena Tumor de Célula Germinativa, Câncer Oral, Infantil Extracraniana, Infantil Câncer da Cavidade Oral, Lábio e Câncer da Tumor de Célula Germinativa, Orofaringe Extragonadal Osteosarcoma/ Histiocitoma Fibroso Maligno Tumor de Célula Germinativa, Ovariana do Osso Tumor Trofoblástico Gestacional Câncer Ovariano, Infantil Glioma, Adulto Câncer Epitelial Ovariano Glioma, Tronco Cerebral Infantil Tumor de Célula Germinativa Ovariana com Glioma, Cerebral Infantil Astrocitoma Baixo Potencial Maligno Glioma, Via Visual Infantil e Hipotalâmica Câncer Pancreático Câncer de Pele (Melanoma) Câncer Pancreático, Infantil Carcinoma de Pele, Célula de Merkel Câncer Pancreático, Célula da Ilhota Câncer de Pulmão de Célula Pequena Câncer da Cavidade Nasal e Seio Paranasal Câncer do Intestino Delgado Câncer da Paratireoide Sarcoma do Tecido Mole, Adulto Câncer Peniano Sarcoma do Tecido Mole, Infantil Feocromocitoma Carcinoma de Célula Escamosa, vide Pineoblastoma e Tumores Supratentoriais do Câncer de Pele (não Melanoma) Neuroectoderma Primitivo, Infantil

Câncer Escamoso de Pescoço com Tumor da Pituitária Metástase Oculta Primária Neoplasma de Célula Plasmática/ Mieloma Câncer de Estômago (Gástrico) Múltiplo Câncer de Estômago (Gástrico), Infantil Blastoma Pleuropulmonar Tumores Supratentoriais do Gestação e Câncer de Mama Neuroectoderma Primitivo, Infantil Gestação e Linfoma de Hodgkin Linfoma de Célula T, Cutâneo, vide Gestação e Linfoma Não Hodgkin Micoses Fungoides e Síndrome de Linfoma Primário do Sistema Nervoso Central Sézary Câncer de Próstata Câncer Testicular Câncer Retal Timoma, Infantil Câncer de Célula Renal (Rim) Timoma e Carcinoma Tímico Câncer de Célula Renal (Rim), Infantil Câncer de Tireoide Câncer da Pelve Renal e Ureter, Câncer de Câncer de Tireoide, Infantil Célula Transicional Câncer de Célula Transicional da Pelve Retinoblastoma Renal e Ureter Rabdomiosarcoma, Infantil Tumor Trofoblástico, Gestacional Câncer de Glândula Salivar Carcinoma de Sítio Primário Câncer de Glândula Salivar, Infantil Desconhecido, Adulto Sarcoma, Família de Tumores de Ewing Câncer de Sítio Primário Desconhecido, Sarcoma, Kaposi Infantil Sarcoma, Tecido Mole, Adulto Cânceres Infantis Incomuns Sarcoma, Tecido Mole, Infantil Pelve Renal e Ureter, Câncer de Célula Sarcoma, Uterino de Transição Síndrome de Sezary Câncer Uretral Câncer de Pele (não Melanoma) Câncer Uterino, Endometrial Câncer de Pele, Infantil Sarcoma Uterino Câncer Vaginal Glioma da Via Visual e Hipotalâmico, Infantil Câncer Vulvar Macroglobulinemia de Waldenström Tumor de Wilms

[00127] Como usada aqui, a expressão “tumor” se refere a toda proliferação e crescimento celular neoplásico, seja maligno ou benigno e toas as células e tecidos pré-cancerosos e cancerosos. Por exemplo, um câncer particular pode ser caracterizado por uma massa tumoral sólida ou um tumor não sólido. A massa tumoral sólida, se presente, pode ser uma massa tumoral primária. Uma massa tumoral primária se refere ao crescimento de células de câncer em um tecido que resulta da transformação de uma célula normal daquele tecido. Na maioria dos casos, a massa tumoral primária é identificada pela presença de um cisto, que pode ser encontrado através de métodos visuais ou pela palpação ou pela irregularidade na forma, textura ou peso do tecido. Entretanto, alguns tumores primários não são palpáveis e podem ser detectados apenas através de técnicas de imagem médica, tais como raios X (por exemplo, mamografia) ou imagem de ressonância magnética (MRI) por aspiração com agulha. O uso dessas ultimas técnicas é mais comum na detecção precoce. A análise molecular e fenotípica das células de câncer dentro de um tecido pode ser usada para confirmar se o câncer é endógeno para o tecido ou se a lesão é devida à metástase de outro sítio. Alguns tumores não são ressecáveis (não podem ser removidos cirurgicamente devido a, por exemplo, número de focos metastáticos ou porque ele está em uma zona cirúrgica perigosa). O tratamento e os métodos prognósticos da invenção podem ser utilizados para a doença em estágio precoce, mediano ou tardio e na doença aguda ou crônica. Composições e Tratamentos

[00128] Vários métodos podem ser usados para liberar uma combinação de IFN tipo I e CD40-L tal como uma combinação de IFNβ e CD40-L ou liberar uma sequência de ácido nucleico que codifica uma combinação de IFN tipo I e CD40-L tal como uma combinação de IFNβ e CD40-L, para produzir uma APC, em particular DC ou um vírus oncolítico da invenção.

[00129] Exemplos de métodos que podem ser utilizados para liberar a combinação de um polipeptídeo de IFN tipo I e CD40-L ou uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam uma combinação de

IFN tipo I e CD40-L para produzir as APCs, tais como DCs da invenção incluem, mas não estão limitados a vetores virais, tais como retrovírus, adenovírus, vírus adeno-associados, lentivírus, vírus da estomatite vesicular ou vírus do herpes simplex; nanopartículas; proteína nua ou envelopada; sistemas de edição de gene tais como os sistemas TALEN (Nucleases Efetoras Semelhantes a Ativador da Transcrição) ou CRISPR (Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas)/Cas9 (vide, por exemplo, Nemudryi AA et al., Acta Naturae, 2014 July-Sep, 6(3):19-40, que está incorporado aqui por referência); DNA (nu ou envelopado), mRNA (nu ou envelopado); eletroporação; sonoporação; gene gun, partículas de ouro ou outro metal; magnetofecção; liberação hidrodinâmica; plasmídeo de DNA; siRNA, oligonucleotídeos, lipoplexos; lipoproteínas, nucleases homing; polimersomas; poliplexos; transposon (por exemplo, transposon da Bela Adormecida, vide, por exemplo, Ivics Z et al., Hum Gene Ther 2011, 22(9):1043-1051, que está incorporado aqui por referência em sua totalidade); dendrímero; macromolécula; nanopartícula inorgânica; quantum dot, peptídeo que penetra na células (também conhecido como um domínio de transdução do peptídeo) tal como a proteína HIV TAT; domínio de transdução Antennapedia, transportan ou poliarginina (vide, por exemplo, Copolovici DM et al., ACS Nano, 2014, 8(3):1972-1994; Wagstaff KM et al., Curr Meth Chem, 2006, 13(12):1371-87, and Trabulo S et al., Pharmaceuticals, 2010, 3:961-993 que estão incorporados aqui por referência em sua totalidade); virossoma; vírus hibridizante; bacteriófago; ou direcionamento de gene.

[00130] Métodos para fazer APC, tal como DC, vacinas com outros antígenos de tumor e seus usos na imunoterapia do câncer são conhecidos e podem ser usados com a combinação de IFN tipo I e CD40-L aqui descrita (vide, por exemplo, Palucka K et al., Nature Reviews Câncer, 2012, 12:265-277, que está incorporado aqui por referência em sua totalidade).

[00131] Métodos de liberação de gene viral ou não viral podem ser usados para transduzir as células tais com APCs, tais como DCs, com uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam uma combinação de IFN tipo I e CD40-L,

[00132] Exemplos de vetores virais que podem ser usados para liberar as sequências de ácido nucleico incluem, mas não são limitados a adenovírus (AV), vírus adeno-associado (AAV), poxvírus, lentivírus, alfavírus, herpesvírus, retrovírus e vírus vaccinia. Quando usado em uma APC tal como DC, o vírus tipicamente tem replicação deficiente.

[00133] Métodos não virais para liberação de gene incluem, mas não são limitados a injeção de DNA nu, partículas inorgânicas, partículas biodegradáveis sintéticas ou naturais. assim como métodos físicos tais como injeção com agulha, injeção de DNA balístico, eletroporação, sonoporação, fotoporação, magnetofecção e hidroporação. Exemplos de partículas inorgânicas incluem fosfato de cálcio, sílica, ouro e partículas magnéticas. Exemplos de partículas biodegradáveis sintéticas ou naturais incluem vetores não virais baseados em polímero tais como ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA), ácido poliláctico (PLA), poli(etilenoimina4) (PEI), quitosana, dendrímeros e polimetacrilatos; vetores não virais baseados em lipídeos catiônicos tais como lipossomas catiônicos, emulsões catiônicas e nanopartículas lipídicas sólidas; e vetores não virais baseados em peptídeo tais como poli-L- lisina.

[00134] Opcionalmente, APCs, tais como DCs ou vírus oncolíticos da invenção podem ser coadministrados, simultaneamente ou consecutivamente, com um ou mais outros agentes a um indivíduo. Agentes anticâncer que podem ser administrados incluem, mas não são limitados àqueles listados na Tabelas 1 e 3.

[00135] A coadministração pode ser realizada simultaneamente (nas mesmas formulações ou formulações separadas) ou consecutivamente com o agente adicional administrado antes e/ou depois de um ou mais dos compostos aqui descritos.

[00136] Assim, APCs tais como DCs ou os vírus oncolíticos da invenção, administrados separadamente ou como uma composição farmacêutica podem incluir vários outros componentes. Exemplos de componentes aceitáveis ou adjuntos que podem ser empregados em circunstancias relevantes incluem antioxidantes, agentes de remoção de radical livre, peptídeos, fatores de crescimento, antibióticos, agentes bacteriostáticos, imunossupressores, anticoagulantes, agentes de tamponamento, agentes anti-inflamatórios, agentes anti-angiogênicos, antipiréticos, aglutinantes, anestésicos, esteroides e corticosteroides. Tais componentes podem fornecer um benefício terapêutico adicional atuar no efeito da ação terapêutica das APCs tais como DCs ou atuar frente a prevenção de quaisquer efeitos colaterais potenciais que podem ser colocadas como um resultado da administração dos compostos.

[00137] Agentes adicionais que podem ser coadministrados às células-alvo in vitro ou in vivo, tal como em um indivíduo, na mesma formulação ou como uma formulação separada, incluem aqueles que modificam uma dada resposta biológica, tal como imunomoduladores. Os agentes adicionais podem ser, por exemplo, moléculas pequenas, polipeptídeos (proteínas, peptídeos ou anticorpos ou fragmentos de anticorpo) ou ácidos nucleicos (que codificam polipeptídeos ou ácidos nucleicos inibitórios, tais como oligonucleotídeos antissenso ou RNA de interferência). Por exemplo, proteínas tais como o fator de necrose do tumor (TNF), interferon (tal como alfa-interferon ou beta-interferon), fator de crescimento de nervo (NGF), fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF) e um ativador do plasminogênio tecidual podem ser administrados. Modificadores da resposta biológica, tais como linfocinas, interleucinas (tais como interleucina-1 (IL-1), interleucina-2

(IL-2), e iinterleucina-6 (IL-6)), fator de estimulação de colônia de granulócito macrófago (GM-CSF), fator de estimulação de colônia de granulócito (G-CSF), ou outros fatores podem ser administrados. Em uma modalidade, os métodos e composições da invenção incorporam um ou mais agentes anticâncer, tais como agentes citotóxicos, agentes quimioterapêuticos, agentes anti-sinalização e agentes anti- angiogênicos.

[00138] Em algumas modalidades, as composições da invenção incluem pelo menos um agente anticâncer adicional (por exemplo, um agente quimioterapêutico). Em algumas modalidades dos métodos da invenção, pelo menos um agente anticâncer adicional é administrado com as composições da invenção. Em algumas modalidades, ao agente anticâncer é selecionado entre o ácido hidroxâmico de suberoanilida (SAHA) ou outro inibidor de histona deacetilase, trióxido arsênico, doxorrubicina ou outro agente intercalador de DNA de antraciclina e etoposídeo ou outro inibidor da topoisomerase II.

[00139] Em algumas modalidades, as composições podem incluir e os métodos podem incluir a administração de um ou mais inibidores de proteassoma (por exemplo, bortezomib), inibidores da autofagia (por exemplo, cloroquina), agentes alquilantes (por exemplo, melfalan, ciclofosfamida), inibidores de MEK (por exemplo, PD98509), inibidores de FAK/PYK2 (por exemplo, PF562271), ou inibidores de EGFR (por exemplo, erlotinib, gefitinib, cetuximab, panitumumab, zalutumumab, nimotuzumab, matuzumab) ou uma combinação de dois ou mais dos precedentes.

[00140] Assim, os imunoterapêuticos, administrados separadamente ou como uma composição farmacêutica, pode incluir vários outros componentes como aditivos. Exemplos de componentes aceitáveis ou adjuntos que podem ser empregados em circunstancias relevantes incluem antioxidantes, agentes de remoção de radical livre, peptídeos,

fatores de crescimento, antibióticos, agentes bacteriostáticos, imunossupressores, anticoagulantes, agentes de tamponamento, agentes anti-inflamatórios, agentes anti-angiogênicos, antipiréticos, aglutinantes, anestésicos, esteroides e corticosteroides. Tais componentes podem fornecer um benefício terapêutico adicional, atuar no efeito da ação terapêutica dos compostos da invenção ou atuar frente a prevenção de quaisquer efeitos colaterais potenciais que podem ser colocadas como um resultado da administração dos compostos. O agente imunoterapêutico pode ser conjugado a um agente terapêutico ou outro agente também.

[00141] Como usado aqui, a expressão “imunoterapia” se refere ao tratamento de uma doença através da estimulação, indução, subversão, mimetismo, intensificação, aumento ou qualquer outra modulação de um sistema imune do indivíduo para desencadear ou amplificar a imunidade adaptativa ou inata (ativamente ou passivamente) contra proteínas de câncer ou proteínas prejudiciais de outra forma, células ou tecidos. Imunoterapias (isto é, agentes imunoterapêuticos) incluem vacinas contra o câncer, imunomoduladores, anticorpos monoclonais (por exemplo, anticorpos monoclonais humanizados), imunoestimulantes, células dendríticas e terapias virais, designadas para tratar canceres existentes ou prevenir o desenvolvimento de canceres ou para uso no ajuste do adjuvante para reduzir a probabilidade de recorrência de câncer. Exemplos de vacinas para o câncer incluem GVAX, Stimuvax, DCVax e outras vacinas designadas para desencadear respostas imunes para o tumor e outros antígenos incluindo MUC1, NY-ESO-1, MAGE, p53 e outros. Exemplos de imunomoduladores incluem 1MT, Ipilimumab, Tremelimumab e/ou qualquer outro fármaco designado para deprimir ou modular de outra maneira a atividade citotóxica da célula T ou outra célula contra um tumor ou outros antígenos, incluindo, mas não restritos a tratamentos que modulam as vias de controle da célula T-Reg através de CTLA-4, CD80, CD86, MHC, B7-DC, B7-H1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, CD28, outros TCRs, PD-1, PDL-1, ICOS e seus ligantes, seja através de bloqueio, agonismo ou antagonismo. Exemplos de imunoestimulantes incluem corticosteroides e qualquer outro agente anti- ou pró-inflamatório, esteroidal ou não esteroidal, incluindo, mas não restritos a GM-CSF, interleucinas (por exemplo, IL-2, IL-7, IL-12), citocinas tais como os interferons e outros. Exemplos de terapias com células dendríticas (DCs) incluem células dendríticas modificadas e qualquer outra célula que apresente antígeno, antígenos autólogos ou xeno-antígenos, modificados por múltiplos antígenos, células de câncer íntegras, antígenos únicos, por mRNA, apresentação em fago ou qualquer outra modificação, incluindo, mas não restrita a células dendríticas (DCs) carregadas com antígeno, geradas ex vivo para induzir a imunidade de célula T específica para o antígeno, DCs carregadas com gene ex vivo para induzir a imunidade humoral, DCs carregadas com antígeno ex vivo para induzir a imunidade específica para o tumor, CDs imaturas geradas ex vivo para induzir tolerância, incluindo, mas não limitadas à Provenge e outras. Exemplos de terapias virais incluem vírus oncolíticos ou vírus derivado de material genético ou outro material designado para desencadear a imunidade antitumor e inibidores de vírus infecciosos associados com o desenvolvimento do tumor, tal como fármacos na série Prophage. Exemplos de anticorpos monoclonais incluem Alemtuzumab, Bevacizumab, Cetuximab, Gemtuzumab ozogamicin, Rituximab, Trastuzumab, Radioimmunoterapia, Ibritumomab tiuxetan, regime de Tositumomab/ tositumomab iodo. Uma imunoterapia pode ser uma monoterapia ou usada em combinação com uma ou mais terapias (uma ou mais outras imunoterapias ou não imunoterapias).

[00142] Como usada aqui, a expressão “agente citotóxico” se refere a uma substancia que inibe ou previne a função de células e/ou causa a destruição de células in vitro e/ou in vivo. A expressão pretende incluir isótopos radioativos (por exemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioativos de Lu), agentes quimioterapêuticos, toxinas tais como toxinas de molécula pequena ou toxinas enzimaticamente ativas de bactérias, fungos, plantas ou de origem animal e anticorpos, incluindo seus fragmentos e/ou variantes.

[00143] Como usada aqui, a expressão “agente quimioterapêutico” é um composto químico útil no tratamento do câncer, tal como, por exemplo, taxanos, por exemplo, paclitaxel e docetaxel, clorambucil, vincristina, vinblastina, antiestrogênicos incluindo, por exemplo, tamoxifen, raloxifen, 4(5)-imidazóis que inibem a aromatase, 4- hidroxitamoxifen, trioxifen, keoxifen, LY117018, onapristona, e toremifen e anti-androgênios tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolide e goserelina. Exemplos de agentes anticâncer, incluindo agentes quimioterapêuticos, que podem ser usados em conjunto com os compostos da invenção estão listados na Tabela 3. Em uma modalidade preferida, o agente quimioterapêutico é uma ou mais antraciclinas. Antraciclinas são uma família de fármacos quimioterapêuticos que também são antibióticos. As antraciclinas atuam para prevenir a divisão celular pela ruptura da estrutura do DNA e termina sua função por: (1) intercalando em pares de bases nos sulcos menores do DNA; e (2) causando dano de radical livre da ribose do DNA. As antraciclinas são frequentemente usadas na terapia da leucemia. Exemplos de antraciclinas incluem daunorubicina, doxorubicina, epirubicina e idarubicina. Tabela 3. Exemplos de Agentes Anticâncer - Ácido 13-cis-Retinoico - Mylocel -2-Amino-6-Mercaptopurina - Letrozole - 2-CdA - Neosar - 2-Clorodesoxiadenosina - Neulasta

- 5-fluorouracila - Neumega - 5-FU - Neupogen - 6 - TG - Nilandron - 6 - Tioguanina - Nilutamida - 6-Mercaptopurina - Mostarda de Nitrogênio - 6-MP - Novaldex - Accutane - Novantrone - Actinomicina-D - Octreotide - Adriamicina - Acetato de Octreotide - Adrucila - Oncospar - Agrylin - Oncovin - Ala-Cort - Ontak - Aldesleukin - Onxal - Alemtuzumab - Oprevelkin - Alitretinoina - Orapred - Alkaban-AQ - Orasone - Alkeran - Oxaliplatina - Ácido transretinoico totalmente - Paclitaxel trans - Pamidronato - Alfa interferon - Panretina - Altretamina - Paraplatina - Ametopterina - Pediapred - Amifostina - PEG Interferon - Aminoglutetimida - Pegaspargase - Anagrelide - Pegfilgrastim - Anandron - PEG-INTRON - Anastrozol - PEG-L-asparaginase - Arabinosilcitosina - Mostarda de Fenilalanina - Ara-C - Platinol - Aranesp - Platinol-AQ - Aredia - Prednisolona - Arimidex - Prednisona - Aromasin - Prelone - Trióxido de Arsênio - Procarbazina - Asparaginase - PROCRIT - ATRA - Proleukin - Avastin - Prolifeprospan 20 com implante de Carmustina

- BCG - Purinetol - BCNU - Raloxifeno - Bevacizumab - Rheumatrex - Bexarotene - Rituxan - Bicalutamida - Rituximab - BiCNU - Roveron-A (interferon alfa-2a) - Blenoxane - Rubex - Bleomcina - Cloridrato de Rubidomicina - Bortezomib - Sandostatin - Busulfan - Sandostatin LAR - Busulfex - Sargramostim - C225 - Solu-Cortef - Leucovorin Cálcico - Solu-Medrol - Campath - STI-571 - Camptosar - Estreptozocina - Camptotecina-11 - Tamoxifen - Capecitabina - Targretin - Carac - Taxol - Carboplatina - Taxotere - Carmustina - Temodar - Carmustina wafer - Temozolomide - Casodex - Teniposideo - CCNU - TESPA - CDDP - Talidomida - CeeNU - Thalomid - Cerubidine - TheraCys - cetuximab - Tioguanina - Clorambucila - Tioguanina Tabloid - Cisplatina - Tiofosfoamida - Fator Citrovorum - Thioplex - Cladribina - Tiotepa - Cortisona - TICE - Cosmegen - Toposar - CPT-11 - Topotecan - Ciclofosfamida - Toremifeno - Cytadren - Trastuzumab - Citarabina - Tretinoina

- Citarabina liposomal - Trexall - Cytosar-U - Trisenox - Cytoxan - TSPA - Dacarbazina - VCR - Dactinomicina - Velban - Darbepoetina alfa - Velcade - Daunomicina - VePesid - Daunorubicina - Vesanoid - Cloridrato de Daunorubicina - Viadur - Daunorubicina liposomal - Vinblastina - DaunoXome - Sulfato de Vinblastina - Decadron - Vincasar Pfs - Delta-Cortef - Vincristina - Deltasona - Vinorelbina - Denileukin diftitox - Tartarato de Vinorelbina - DepoCyt - VLB - Dexametasona - VP-16 - Acetato de Dexametasona - Vumon - Fosfato sódico de dexametasona- Xeloda - Dexasona - Zanosar - Dexrazoxane - Zevalin - DHAD - Zinecard - DIC - Zoladex - Diodex - Ácido Zoledronico - Docetaxel - Zometa - Doxil - Gliadel wafer - Doxorubicina - Glivec - Doxorubicina liposomal - GM-CSF - Droxia - Goserelina - DTIC - Fator de estimulação de colônia de granulócito - DTIC-Dome - Fator de estimulação de colônia de granulócito macrófago - Duralone - Halotestina - Efudex - Herceptina - Eligard - Hexadrol - Ellence - Hexalen - Eloxatin - Hexametilmelamina - Elspar - HMM

- Emcyt - Hycamtin - Epirubicina - Hydrea - Epoetina alfa - Acetato de Hidrocort - Erbitux - Hidrocortisona - L-asparaginase de Erwinia - Fosfato sódico de Hidrocortisona - Estramustina - Succinato sódico de Hidrocortisona - Ethyol - Fosfato de Hidrocortona - Etopofos - Hidroxiureia - Etoposídeo - Ibritumomab - Fosfato de Etoposideo - Ibritumomab Tiuxetan - Eulexin - Idamicina - Evista - Idarubicina - Exemestane - Ifex - Fareston - IFN-alfa - Faslodex - Ifosfamida - Femara - IL - 2 - Filgrastim - IL-11 - Floxuridina - Mesilato de Imatinib - Fludara - Imidazol Carboxamida - Fludarabina - Interferon alfa - Fluoroplex - Interferon Alfa-2b (conjugado com PEG) - Fluorouracil - Interleucina - 2 - Fluorouracil (creme) - Interleucina-11 - Fluoximesterona - Intron A (interferon alfa-2b) - Flutamida - Leucovorin - Ácido Folinico - Leukeran - FUDR - Leukine - Fulvestrant - Leuprolide - G-CSF - Leurocristina - Gefitinib - Leustatina - Gemcitabina - Liposomal Ara-C - Gemtuzumab ozogamicina - Liquid Pred - Gemzar - Lomustina - Gleevec - L-PAM - Lupron - L-Sarcolisina - Lupron Depot - Meticorten - Matulane - Mitomicina

- Maxidex - Mitomicina-C - Mecloretamina - Mitoxantrona -Cloridrato de Mecloretamina - M-Prednisol - Medralone - MTC - Medrol - MTX - Megace - Mustargen - Megestrol - Mustina - Acetato de Megestrol - Mutamicina - Melfalan - Myleran - Mercaptopurina - Iressa - Mesna - Irinotecan - Mesnex - Isotretinoina - Metotrexate - Kidrolase - Metotrexate Sódico - Lanacort - Metilprednisolona - L-asparaginase - LCR

[00144] Embora as APCs, tais como DCs ou os vírus oncolíticos da invenção possam ser administrados a indivíduos como agentes isolados, é preferido administrar essas células ou vírus como parte de uma composição farmacêutica. A invenção em questão fornece ainda composições que compreendem as APCs descritas, tais como DCs, ou vírus oncolíticos em associação com pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode ser adaptada para várias vias de administração, tais como enteral, parenteral, intravenosa, intramuscular, tópica, subcutânea e assim por diante. A administração pode ser contínua ou em intervalos distintos, como pode ser determinado pela pessoa versada na técnica.

[00145] As composições administradas de acordo com os métodos da invenção podem ser formuladas de acordo com métodos conhecidos para preparar composições farmaceuticamente úteis. São descritas formulações em um número variado de fontes que são bem conhecidas e prontamente disponibilizadas para aqueles versados na técnica. Por exemplo, Remington’s Pharmaceutical Science (Martin, E.W., 1995, Easton Pennsylvania, Mack Publishing Company, 19th ed.) descreve formulações que podem ser usadas em conjunto com a invenção em questão. Formulações adequadas para administração incluem, por exemplo, soluções estéreis aquosas para injeção, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do receptor pretendido; e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes. As formulações podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou de múltiplas doses, por exemplo, ampolas e frascos lacrados e podem ser armazenadas em uma condição seca pelo congelamento (liofilizada) que requer apenas a condição de um veículo líquido estéril, por exemplo, água para injeção, antes do uso. Soluções e suspensões extemporâneas para injeção podem ser preparadas a partir de pó estéril, grânulos, comprimidos, etc. Deve ser compreendido que em adição aos ingredientes particularmente mencionados acima, as composições da presente invenção podem incluir outros agentes convencionais na técnica com relação ao tipo de formulação em questão.

[00146] Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis são sais de adição ácida orgânicos formados com ácidos que formam um ânion fisiologicamente aceitável, por exemplo, tosilato, metanosulfonato, acetato, citrato, malonato, tartarato, succinato, benzoato, ascorbato, alfa-cetoglutarato e alfa-glicerofosfato. Sais inorgânicos aceitáveis também podem ser formados, incluindo sais de cloridrato, sulfato, nitrato, bicarbonato e carbonato.

[00147] Sais farmaceuticamente aceitáveis de compostos podem ser obtidos usando procedimentos padronizados bem conhecidos na técnica, por exemplo, pela reação de um composto suficientemente básico tal como uma amina com um ácido adequado fornecendo um ânion fisiologicamente aceitável. Sais de metal alcalino (por exemplo, sódio, potássio, lítio) ou de metal alcalino terroso (por exemplo, cálcio) de ácidos carboxílicos também podem ser feitos.

[00148] Composições da invenção, APCs tais como DCs ou os vírus oncolíticos e outros agentes usados nos métodos da invenção podem ser administrados localmente em um ou mais sítios anatômicos, tais como sítios de crescimento de célula indesejada (tal como o sítio do tumor), por exemplo, injetadas ou aplicadas topicamente ao tumor), opcionalmente em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável tal como um diluente inerte. As composições da invenção e outros agentes usados nos métodos da invenção podem ser administrados sistemicamente, tal como por via intravenosa ou oral, opcionalmente em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável tal como um diluente inerte ou em um veículo ingerível assimilável para liberação oral. Elas podem ser encerradas em cápsulas de gelatina dura ou macia, podem ser prensadas em comprimidos ou podem ser incorporadas diretamente com o alimento da dieta do paciente. Para a administração terapêutica oral, os agentes podem ser combinados com um ou mais excipientes e usados na forma de comprimidos ingeríveis, comprimidos bucais, drágeas, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, wafers, sprays em aerossol e semelhantes.

[00149] Os comprimidos, drágeas, pílulas, cápsulas e semelhantes também podem conter o seguinte: aglutinantes tais como goma de tragacanto, acácia, amido de milho ou gelatina; excipientes tais como fosfato dicálcico; um agente de desintegração tal como amido, amido de batata, ácido algínico e semelhantes; um lubrificante tal como estearato de magnésio; e um agente edulcorante tal como sacarose, frutose, lactose ou aspartame ou um agente flavorizante tal como hortelã, óleo de gaultéria ou sabor de cereja podem ser adicionados. Quando a forma de dosagem unitária é uma cápsula, ela pode conter além dos materiais do tipo acima, um veículo líquido, tal como um óleo vegetal ou um polietileno glicol. Vários outros materiais podem estar presentes como revestimentos ou para modificar de outra maneira a forma física da forma de dosagem unitária sólida. Por exemplo, comprimidos, pílulas ou cápsulas podem ser revestidos com gelatina, cera, goma laca ou açúcar e semelhantes. Um xarope ou elixir pode conter o composto ativo, sacarose ou frutose como agente edulcorante, metil ou propilparabenos como conservantes, um corante e um flavorizante tal como sabor de cereja ou laranja. É claro, qualquer material usado no preparo de qualquer forma de dosagem unitária deve ser farmaceuticamente aceitável e substancialmente não tóxica nas quantidades empregadas. Adicionalmente, as composições ou agentes podem ser incorporados em preparações de liberação sustentada e dispositivos.

[00150] Os agentes ativos (por exemplo, APCs tais como DCs ou os vírus oncolíticos) da invenção podem ser administrados no tumor (intra- tumoral) ou no linfonodo, tal como linfonodo inguinal do indivíduo. Os agentes ativos da invenção também podem ser administrados por via intradérmica, intravenosa ou intraperitoneal por infusão ou injeção. Em algumas modalidades, as APCs tais como DCs, são administradas por injeção intradérmica tal como em um sítio anatômico que drena as redes dos linfonodos axilares e/ou inguinais do indivíduo. Soluções dos agentes ativos podem ser preparadas em água, opcionalmente misturadas com um tensoativo não tóxico. As dispersões também podem ser preparadas em glicerol, polietileno glicóis líquidos, triacetina e suas misturas e em óleos. Sob condições comuns de armazenamento e uso, essas preparações podem conter um conservante para evitar o crescimento de microrganismos.

[00151] As formas de dosagem farmacêutica adequadas para injeção ou infusão podem incluir soluções aquosas estéreis ou dispersões ou pós estéreis que compreendem as APCs , tais como DCs ou os vírus oncolíticos da invenção, que são adaptados para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões estéreis para infusão ou injeção, opcionalmente encapsuladas em lipossomas. A forma de dosagem final deve ser estéril, fluida e estável sob as condições de fabricação e armazenamento. O veículo ou transportador líquido pode ser um solvente ou um meio de dispersão líquido que compreenda, por exemplo, água, etanol, um poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, polietileno glicois líquidos e semelhantes), óleos vegetais, ésteres glicerílico não tóxicos e misturas adequadas desses. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pela formação de lipossomas, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersões ou pelo uso de tensoativos. Opcionalmente, a prevenção da ação de microrganismos pode ser promovida por vários agentes antibacterianos ou antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e semelhantes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, tampões ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser obtida pela inclusão de agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

[00152] Soluções injetáveis estéreis são preparadas pela incorporação das APCs, tais como DCs ou os vírus oncolíticos e outros agentes na quantidade requerida no solvente apropriado com vários outros ingredientes enumerados acima, como necessário, seguido pela esterilização por filtração. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação preferidos são as técnicas de secagem a vácuo e liofilização, que fornecem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado presente nas soluções previamente esterilizadas por filtração.

[00153] Para administração tópica, as composições e agentes podem ser aplicados na forma pura, isto é, quando elas são líquidas. Entretanto, será geralmente desejável administrá-las topicamente à pele como composições em combinação com um veículo dermatologicamente aceitável, que pode ser um sólido ou um líquido.

[00154] Veículos sólidos úteis incluem pós finamente divididos tais como talco, argila, celulose microcristalina, sílica, alumina e semelhantes. Veículos líquidos úteis incluem água, álcoois ou glicóis ou misturas de água-álcool/glicol, nos quais o peptídeo pode ser dissolvido ou disperso em níveis eficazes, opcionalmente com o auxílio de tensoativos não tóxicos. Aditivos tais como fragrâncias e agentes antimicrobianos adicionais podem ser adicionados para otimizar as propriedades para um dado uso. As composições líquidas resultantes podem ser aplicadas a partir de almofadas absorventes, usadas para impregnar bandagens e outros curativos ou pulverizadas sobre a área afetada usando aspersores do tipo bomba ou de aerossol, por exemplo.

[00155] Espessantes tais como polímeros sintéticos, ácidos graxos, sais e ésteres de ácidos graxos, álcoois graxos, celuloses modificadas ou materiais minerais modificados também podem ser empregados com veículos líquidos para formar pastas dispersíveis, géis, unguentos, sabonetes e semelhantes, para aplicação diretamente sobre a pele do usuário. Exemplos de composições dermatológicas úteis que podem ser usadas para liberar os peptídeos na pele estão descritas em Jacquet et al. (Patente U.S. No. 4.608.392), Geria (Patente U.S. No. 4.992.478), Smith et al. (Patente U.S. No. 4.559.157) e Woltzman (Patente U.S. No.

4.820.508).

[00156] Dosagens úteis das composições farmacêuticas da presente invenção podem ser determinadas pela comparação de suas atividade in vitro e atividade in vivo em modelos em animais. Métodos para a extrapolação de dosagens eficazes em camundongos e outros animais para humanos são conhecidos na técnica: por exemplo, vide Patente U.S. No. 4.938.949.

[00157] Consequentemente, a presente invenção inclui uma composição farmacêutica que compreende as APCs, tais como DCs ou vírus oncolíticos, opcionalmente, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas adaptadas para administração oral, tópica ou parenteral, que compreendem uma quantidade de APCs, tais como DCs ou vírus oncolíticos constituem uma modalidade preferida da invenção. A dose administrada ao paciente, particularmente um humano, no contexto da presente invenção deve ser suficiente para atingir uma resposta terapêutica no paciente durante um período de tempo razoável, sem toxicidade letal e preferivelmente sem causar mais do que um nível aceitável de efeitos colaterais ou morbidade. Aquele versado na técnica reconhecerá que a dosagem dependerá de uma variedade de fatores que incluem a condição (saúde) do paciente, o peso corporal do indivíduo, tipo de tratamento concomitante, se houver, frequência de tratamento, proporção terapêutica, assim como a severidade e o estágio da condição patológica. Vantajosamente, em algumas modalidades, a administração dos compostos da invenção não induz perda de peso ou sinais evidentes de toxicidade no indivíduo.

[00158] Dependendo do distúrbio ou da condição de doença a ser tratada (por exemplo, uma malignidade tal como o mieloma), as doses adequadas podem ser aquelas quantidades que reduzirão a proliferação ou o crescimento das células-alvo ou induzir a morte celular. No contexto do câncer, uma dose adequada resulta em uma concentração do agente ativo no tecido do câncer, tal como um tumor maligno, que é conhecida por obter a resposta desejada. A dosagem preferida é a quantidade que resulta na inibição máxima do crescimento da célula de câncer, sem efeitos colaterais incontroláveis. A administração das APCs, tais como DCs ou vírus oncolíticos e outros agentes pode ser contínua ou em intervalos distintos, como pode ser determinado pela pessoa versada na técnica.

[00159] Para fornecer a administração de tais dosagens para o tratamento terapêutico desejado, em algumas modalidades, as composições farmacêuticas da invenção podem compreender entre cerca de 0,1% e 45% e especialmente 1 e 15% em peso do peso total do um ou mais agentes da invenção com base no peso total da composição incluindo veículo e diluentes. Ilustrativamente, os níveis de dosagem dos ingredientes ativos administrados podem ser: intravenosa, 0,01 a cerca de 20 mg/kg; intraperitoneal, 0.01 a cerca de 100 mg/kg; subcutânea, 0.01 a cerca de 100 mg/kg; intramuscular, 0,01 a cerca de 100 mg/kg; 0,01 a cerca de 200 mg/kg e preferivelmente cerca de 1a 100 mg/kg por via oral; instilação intranasal, 0,01 a cerca de 20 mg/kg; e aerossol, 0,01 a cerca de 20 mg/kg do peso (corporal) do animal. Preparação de APCs, tal como DCs

[00160] APCs são importantes no desencadeamento de uma resposta imune eficaz. APCs não apenas apresentam antígenos às células T com receptores específicos para o antígeno, mas também fornecem sinais necessários para a ativação da célula T. Tais sinais permanecem incompletamente definidos, mas são conhecidos por envolver uma variedade de moléculas da superfície celular assim como citocinas e fatores de crescimento. Os fatores necessários para a ativação de células T naives ou não ativadas podem ser diferentes daqueles requeridos para a reativação de células T de memória previamente ativadas. Embora monócitos e células B tenham mostrado ser APC competente, suas capacidades de apresentar antígeno parecem ser limitadas à reativação de células T previamente sensibilizadas. Portanto, elas não são capazes de ativar diretamente populações de células T naives ou não ativadas. Por outro lado, DCs são capazes de ativas ambas as células T naives e previamente ativadas.

[00161] DCs possuem uma morfologia distinta e uma ampla distribuição tecidual, incluindo no sangue. A superfície celular das células dendríticas é incomum, com projeções semelhantes a um véu características. Células dendríticas maduras são geralmente identificadas como CD3−, CD11c+, CD19−, CD83+, CD86+ e HLA-DR+.

[00162] DCs processam e apresentam antígenos e estimulam respostas das células T naives e não ativadas e células T de memória. Em particular, DCs possuem uma grande capacidade para sensibilizar células T restritas a MHC e são muito eficazes na apresentação de antígenos às células T, ambos autoantígenos durante o desenvolvimento da célula T e tolerância e antígenos estranhos durante uma resposta imune. Adicionalmente ao seu papel na apresentação do antígeno, DCs também comunicam diretamente com o tecido não linfoide e tecido não linfoide de pesquisa quanto a um sinal de lesão (por exemplo, isquemia, infecção ou inflamação) ou crescimento do tumor. Uma vez sinalizadas, DCs iniciam uma resposta imune pela liberação de citocinas que estimulam a atividade de linfócitos e monócitos.

[00163] Devido a sua eficácia na apresentação de antígeno, DCs podem ser usadas como um agente imunoestimulador, in vivo e ex vivo. Entretanto, o uso de DCs isoladas como agentes imunoestimuladores tem sido limitado, devido à baixa frequência de DCs no sangue periférico e a baixa pureza de DCs isoladas por métodos anteriores. Em particular, a frequência de DCs no sangue periférico humano foi estimada em cerca de 0,1% das células brancas. Similarmente, há uma acessibilidade limitada de DCs de outros tecidos, tais como órgão linfoide. A baixa frequência de DCs tem aumentado o interesse no isolamento de uma população celular enriquecida com precursores de

DC e no cultivo desses precursores ex vivo ou in vitro para obter populações enriquecidas de DCs imaturas ou maduras. Como as características de precursores de DC permanecem incompletamente definidas, métodos tipicamente usados para isolar precursores de DC não resultam em frações purificadas dos precursores desejados, mas ao invés disso produzem geralmente populações mistas de leucócitos enriquecidos em precursores de DC. Monócitos CD14+ derivados do sangue, especialmente aqueles que expressam em suas superfícies o receptor para o fator de estimulação de colônia de granulócito-monócito (GM-CSF) são precursores conhecidos de DC. Outros precursores de DC derivadas do sangue podem ser isolados primeiro pela remoção de monócitos e outros “precursores de célula não dendrítica”. (Veja, por exemplo Patentes U.S. Nos. 5.994.126 e 5.851.756). Outros precursores de DC conhecidos incluem células derivadas da medula óssea que expressam o marcador da superfície celular de CD34.

[00164] Populações celulares enriquecidas em precursoras de DC têm sido obtidas por vários métodos e podem ser utilizados com a invenção, tal como, por exemplo, separação por gradiente de densidade, classificação celular ativada por fluorescência, técnicas imunológicas de separação de célula, por exemplo, panning, lise do complemento, rosetting, técnicas magnéticas de separação de célula, separação em nylon algodão w combinações de tais métodos. (Veja, por exemplo, O'Doherty et al., J. Exp. Med. 178:1067-76 (1993); Young and Steinman, J. Exp. Med. 171:1315-32 (1990); Freudenthal and Steinman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:7698-702 (1990); Macatonia et al., Immunol. 67:285-89 (1989); Markowicz and Engleman, J. Clin. Invest. 85:955-61 (1990), todos incorporados aqui por referência em sua totalidade). Métodos para a seleção imunológica de DCs incluem, por exemplo, o uso de anticorpos para marcadores da superfície celular associados com precursores de célula dendrítica, tais como anticorpos anti-CD34 e/ou anto-CD14 acoplados a um substrato. (Veja, por exemplo, Bernhard et al., Câncer Res. 55:1099-104 (1995); Caux et. al., Nature 360:258-61 (1992)).

[00165] Em um exemplo típico de método, os leucócitos são isolados por um procedimento de leucoaferese. Métodos adicionais são tipicamente usados para a purificação adicional para enriquecer as frações celulares consideradas conter DCs e/ou precursoras de DC. Similarmente, métodos tais como a centrifugação diferencial (por exemplo, isolamento de uma camada leuco-plaquetária), panning com anticorpos monoclonais específicos para certas proteínas da superfície celular (por exemplo, seleção positiva e negativa) e a filtração também produz uma mistura bruta de precursoras de DC que contêm leucócitos.

[00166] Outro método de isolamento reportado para o isolamento de precursoras de DC proliferativas é usar um substrato plástico comercialmente tratado (por exemplo, esferas ou esferas magnéticas) para remover seletivamente monócitos aderentes e outros “precursores de célula não dendrítica)”. (Veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos.

5.994.126 e 5.851.756). Os monócitos aderentes e precursoras não DC são descartadas enquanto que as células não aderentes são retidas para cultura e maturação ex vivo. Em outro método, células de aferese foram cultivadas em bolsa de cultura plásticas, isto é, poliestireno ou estireno, esferas micro-transportadoras foram adicionadas para aumentar a área da superfície da bolsa. As células foram cultivadas por um período de tempo suficiente para as células aderirem às esferas e as células não aderentes foram lavadas da bolsa. Maffei, et al., Transfusion 40:1419-1420 (2000); WO 02/44338, incorporados aqui por referência).

[00167] Subsequente a essencialmente todos os métodos reportados para a preparação de uma população de células enriquecida quanto a precursores de DC, as populações de células são tipicamente cultivadas ex vivo ou in vitro para a diferenciação ou manutenção das precursoras de DC e/ou expansão das DCs. Resumidamente, a diferenciação ex vivo de precursoras de DC monocítica envolveu a cultura das populações celulares mistas enriquecidas quanto a precursores de DC na presença de combinações de fatores de crescimento celular, tais como citocinas. Por exemplo, precursores DC monocítica requerem o fator de estimulação de colônia de granulócito/monócito (GM-CSF) em combinação com pelo menos uma outra citocina selecionada, por exemplo, entre Interleucina 4 (IL-4), Interleucina 15 (IL-15), Interleucina 13 (IL-13), interferon α (IFN-α) e semelhantes, para diferenciar as células em um estado ótimo para absorção de antígeno, processamento e/ou apresentação. Os números de DCs a partir de precursoras de DC não monocíticas, tais como aqueles obtidos pela remoção de monócitos e outras células precursoras não DC, também foram expandidos pela cultura na presença de certas citocinas. Tanto GM-CSF sozinho quanto uma combinação de GM-CSF com IL-4 tem sido usada nos métodos para produzir populações de DC a partir de tais precursoras de DC em proliferação para uso terapêutico.

[00168] A eficácia de tal diferenciação ex vivo, manutenção e/ou expansão tem sido limitada, entretanto, pela qualidade da população de partida enriquecida em DCs e precursoras de DC. Sob algumas condições de cultura, populações de DCs e precursoras de DC que estão acentuadamente contaminadas com neutrófilos, macrófagos e linfócitos ou suas combinações, são menos adequados para uso como preparações imunoestimuladores.

[00169] APCs, tais como DCs podem ser administradas a um indivíduo para estimular uma resposta imune por injeção em bolo, pela infusão contínua, liberação sustentada a partir de implantes ou outras técnicas adequadas conhecidas. As APCs, tais como DCs também podem ser coadministradas com veículos, excipientes, tampões e/ou diluentes fisiologicamente aceitáveis. Além disso, APCs tais como DCs podem ser usadas para ativar células T, por exemplo, células T citotóxicas, usando métodos ex vivo bem conhecidas por aqueles versados na técnica. Essas combinações podem ser usadas como elas mesmas ou como um adjuvante para outras terapias, tais como por exemplo, ressecção cirúrgica, quimioterapia, terapia de radiação, células T que expressam o receptor de antígeno quimérico (CAR) (células CAR T) e suas combinações assim como outras modalidades terapêuticas apropriadas para a condição a ser tratada. Definições

[00170] As expressões “que compreende”, “consiste em” e “consistindo essencialmente em” são definidas de acordo com seu significado padronizado. As expressões podem ser substituídas uma pela outra ao longo do presente pedido para unir o significado específico associado com cada expressão.

[00171] As expressões “isolado” ou “biologicamente puro” se referem ao material que é substancialmente ou essencialmente isento de componentes que normalmente acompanham o material como ele é encontrado em seu estado nativo. Assim compostos de acordo com a invenção preferivelmente não contém materiais normalmente associados com os peptídeos em seu ambiente in situ.

[00172] Como usado nesse pedido, as formas no singular “um/uma”, “o/a” incluem referências no plural a menos que o contexto dite claramente de outra maneira. Assim por exemplo, uma referência a “um composto” inclui mais do que um de tais compostos. A referência a “uma célula” inclui mais do que uma de tais células e assim por diante.

[00173] Como usada aqui, a expressão “vírus oncolítico” se refere a uma classe de vírus de câncer terapêuticos que possuem um ou ambos dos seguintes mecanismos de ação: 1) morte da célula tumoral através da replicação viral seletiva em células tumorais resultando em lise direta do tumor; e 2) indução de imunidade sistêmica pela liberação de antígenos a partir de células de tumor destruídas.

[00174] A prática da presente invenção pode empregar, a menos que indicado ao contrário, técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia, tecnologia de DNA recombinante, eletrofisiologia e farmacologia que estão dentro do conhecimento da técnica. Tais técnicas são explicadas completamente na literatura (vide, por exemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989); DNA Cloning, Vols. I and II (D. N. Glover Ed. 1985); Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the series, Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan Eds., Academic Press, Inc.); Transcription and Translation (Hames et al. Eds. 1984); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller et al. Eds. (1987) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (2nd ed., Springer- Verlag); and PCR: A Practical Approach (McPherson et al. Eds. (1991) IRL Press)), cada uma das quais está incorporada aqui por referência em sua totalidade.

[00175] Em uma APC, tal como uma DC, que contém uma combinação de um IFN Tipo I exógeno e um CD40-L exógeno, tal como uma combinação de IFNβ e CD40-L, o FN tipo I e CD4o-L é expressa através de uma ou mais sequências de ácido nucleico heterólogo que contêm genes heterólogos que codificam IFN tipo I e CD40-L, isto é, gees diferentes daqueles que ocorrem naturalmente dentro da APC, tal como DC. Os genes heterólogos que codificam o IFN tipo I e CD40-L podem ter a mesma sequência com os genes correspondentes que ocorrem naturalmente presentes na APC, tal como DC. Os genes heterólogos podem ter sequências diferentes comparados os genes correspondentes que ocorrem naturalmente presentes na APC, tal como DC. Os genes heterólogos podem ser codificados pelo mesmo ou por um tipo diferente de IFN tipo I e/ou o mesmo ou um CD40-L diferente daqueles codificados pelos genes que ocorrem naturalmente na APC, tal como DCs.

[00176] A expressão “sítio de clivagem” de CD40-L se refere a uma sequência de aminoácidos que é reconhecida pelas proteases, tais como metaloproteases da matriz. As proteases clivam CD40-L da superfície da célula na qual CD40-L é expresso. O sítio de clivagem de CD40-L é tipicamente encontrado nos ou em torno dos limites do domínio III e IV de CD40-L. Tal sítio de clivagem está localizado na região aproximadamente entre os aminoácidos 108 e 116 da SEQ ID NO: 6.

[00177] Um CD40-L que é menos suscetível a clivagem se refere a uma maior resistência de um CD40-L quimérico à clivagem proteolítica comparada com aquela de CD40-L humano nativo. A suscetibilidade de um CD40-L quimérico à clivagem é tipicamente medida pela quantidade de CD40-L solúvel gerada por um dado número de células durante um período de tempo. Um CD40-L quimérico da presente invenção é clivado em uma taxa pelo menos 90% menor do que aquela de CD40-L nativa.

[00178] A expressão “identidade de sequência” indica uma medida quantitativa do grau de homologia entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de ácido nucleico de igual extensão. Se as duas sequências a serem combinadas não têm a mesma extensão, elas podem ser alinhadas para dar a melhor combinação possível, permitindo a inserção de lacunas ou, alternativamente, o truncamento nas extremidades das sequências de polipeptídeo ou sequências de nucleotídeos.

[00179] Com relação a todas as modalidades da invenção que se referem a sequências de nucleotídeos, o percentual de identidade de sequência entre uma ou mais sequências também pode ser baseado em alinhamentos que usam qualquer programa adequado tal como o programa clustalW (vide o website: ebi.ac.uk/clustalW/index.html) com ajustes padronizados. Para alinhamentos de sequência de nucleotídeo esses ajustes são: Alinhamento = 3Dfull, Lacuna Aberta 10,00, Lacuna Ext. 0,20 Dist. Separação de Lacuna 4, matriz de peso do DNA: identidade (IUB). Alternativamente, as sequências de nucleotídeos podem ser analisadas usando qualquer programa adequado tal como DNASIS Max e a comparação das sequências pode ser feita no website: paralicin.orci/. Este serviço é baseado nos dois algoritmos de comparação chamados de Smith-Waterman (SW) e ParAlign. O primeiro algoritmo foi publicado por Smith e Waterman (1981) e é um método bem estabelecido que encontra o alinhamento local ótimo de duas sequências. O outro algoritmo, ParAlign, é um método heurístico para o alinhamento de sequências; detalhes do método estão publicados em Rognes (2001). Os ajustes padronizados para a matriz de escore e penalidades de Lacuna assim como valores de E foram usados.

[00180] Quando se faz referência às sequências complementares, as seguintes regras de pareamento de base podem ser aplicadas, G pareia com C e U, A pareia com T e U. “Sequência de ácido nucleico” e “ sequência de polinucleotídeos” são expressões alternativas no contexto da presente invenção.

[00181] A expressão “vetor” se refere a uma molécula de DNA usada como veículo para transferir material genético recombinante em uma célula hospedeira. Os quatro tipos principais de vetores são plasmídeos, bacteriófagos e outros vírus, cosmídeos e cromossomos artificiais. O próprio vetor é geralmente uma sequência de DNA ou RNA que consiste em um inserto (uma sequência de ácido nucleico heterólogo, transgene) e uma sequência maior que serve como o “arcabouço” do vetor. O propósito do vetor que transfere informação genética para o hospedeiro é tipicamente isolar, multiplicar ou expressar o inserto na célula alvo. Os vetores chamados de vetores de expressão (construtos de expressão) são especificamente adaptados para a expressão das sequências heterólogas na célula alvo e geralmente possuem uma sequência promotora que direciona a expressão das sequências heterólogas. Vetores mais simples chamados de vetores de transcrição são capazes apenas de serem transcritos, mas não traduzidos: eles podem ser replicados em uma célula alvo mas não expressos, diferente dos vetores de expressão. Vetores de transcrição são usados para amplificar as sequências heterólogas inseridas. Os transcritos podem ser subsequentemente isolados e usados como modelos adequados para sistemas de tradução in vitro. A escolha do vetor empregado nas modalidades da presente invenção depende da aplicação específica do vetor que codifica os polipeptídeos ou polinucleotídeo da invenção. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral. Em outras modalidades, o vetor é um vetor não viral.

[00182] A expressão “operativamente ligado “ se refere à conexão de elementos sendo uma parte de uma unidade funcional tal como um gene ou uma fase de leitura aberta (por exemplo, que codifica IFNβ). Consequentemente, pela ligação operativa de um promotor a uma sequência de ácido nucleico que codifica IFNβ, os dois elementos se tornam parte da unidade funcional – um gene. A ligação da sequência de controle da expressão (promotor) à sequência de ácido nucleico possibilita a transcrição da sequência de ácido nucleico direcionada pelo promotor. Sequências de controle da expressão podem ser ligadas a uma sequência de ácido nucleico que codifica IFNβ ou CD40-L com um construto de expressão. Por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que codifica IFNβ e CD40-L pode estar sob o controle do mesmo controle de expressão, isto é, uma única cópia do controle de expressão. Alternativamente, cada uma das sequências de ácido nucleico que codifica IFNβ e CD40-L pode estar sob o controle de um controle de expressão separado, isto é, uma primeira cópia da sequência de controle da expressão controla a expressão de IFNβ e uma segunda cópia da sequência de controle da expressão controla a expressão de CD40-L, isto é, as duas sequências de controle da expressão são diferentes uma da outra.

MATERIAIS E MÉTODOS

[00183] Geração da Célula Dendrítica e carregamento do pool de peptídeo. DCs podem ser geradas pela suspensão de 7-11 x 106 PBMCs/mL em meio XVIVO-15 sem soro (Lonza, Allendale, NJ) seguido por 3 horas de cultura em um frasco de cultura de 25cm2 (Corning, Corning, NY). As células podem então ser lavadas duas vezes PBS para remover células não aderentes. As células aderentes podem ser cultivadas em meio X-VIVO sem soro suplementado com 1000 unidades/ml de cada um de GM-CSF e IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, MN) por seis dias. DCs podem então ser coletadas, lavadas e contadas. DCs podem então ser carregadas com o pool de peptideo indicado pela incubação por uma hora a 37°C em 100µl de meio XVIVO-15 suplementado com 1µg/peptídeo/ml.

[00184] Transdução de célula dendrítica. Após a geração de DCs aderentes em plástico, DCs podem ser resuspensas em 500 µL de meio XVIVO-15 sem soro suplementado com GM-CSF e IL-4 e transduzidas com 20.000 partículas virais/célula de vírus ou vírus que expressam IFNβ e CD40-L por 2 horas a 37°C (25). Depois de 2 horas, 2 x 105 DCs/poço foram semeadas em placas de 24 poços e suplementadas com 1,5 ml de meio de cultura completo (XVIVO-15 + 10% soro humano (SeraCare) + Penicilina/Estreptomicina) por um adicional de 24 horas.

[00185] Exemplos de modalidades da invenção incluem, mas não são limitadas a:

[00186] Modalidade 1. Uma células que apresenta antígeno (APC) que compreende uma combinação de um interferon tipo I exógeno e um CD40-L exógeno ou uma ou mais sequências de ácido nucleico heterólogo que codificam uma combinação de um IFN tipo I exógeno e um CD40-L exógeno.

[00187] Modalidade 2. A APC da modalidade 1, em que:

[00188] a) o IFN tipo I é: IFNα que compreende pelo menos 80% de identidade de sequência com IFNα humano (SEQ ID NO: 1), IFNβ que compreende pelo menos 80% de identidade de sequência com IFNβ humano (SEQ ID NO: 2), IFNω que compreende pelo menos 80% de identidade de sequência com IFNω humano (SEQ ID NO: 3), IFNω que compreende pelo menos 80% de identidade de sequência com IFNω humano (SEQ ID NO: 4), ou IFNω que compreende pelo menos 80% de identidade de sequência com IFNω humano (SEQ ID NO: 5); e/ou

[00189] b) o CD40-L compreende pelo menos 80% de identidade de sequência com CD40-L humano (SEQ ID NO: 6), pelo menos 80% de identidade de sequência com um CD40-L quimérico que possui uma sequência selecionada entre as SEQ ID NOs: 7 a 18, ou pelo menos 80% de identidade de sequência com um CD40-L quimérico que possui uma sequência da SEQ ID NO: 12; e/ou

[00190] c) o IFN tipo I é IFNβ que compreende pelo menos 80% de identidade de sequência com IFNβ humano (SEQ ID NO: 2) e o CD40- L compreende pelo menos 80% de identidade com um CD40-L quimérico que possui a sequência de SEQ ID NO: 12.

[00191] Modalidade 3. A APC da modalidade 1 ou 2, em que a uma ou mais sequências de ácido nucleico heterólogo que codifica a combinação de IFN tipo I e CD40-L é um ou mais construtos virais.

[00192] Modalidade 4. A APC da modalidade 3, em que cada um ou mais dos construtos virais, independentemente, é um construto adenoviral, um construto viral adeno-associado (AAV), um construto de poxvírus, um construto lentiviral, um construto alfaviral, um construto herpesviral, um construto retroviral, um construto viral do vírus da vacínia, um construto viral da estomatite vesicular ou um construto viral do herpes simplex.

[00193] Modalidade 5. A APC de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que a APC é uma APC humana.

[00194] Modalidade 6. A APC de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que a APC é uma DC.

[00195] Modalidade 7. Uma composição que compreende a APC de qualquer uma das modalidades precedentes e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00196] Modalidade 8. A composição da modalidade 7, compreendendo ainda um adjuvante.

[00197] Modalidade 9. Um método de tratamento de uma malignidade, compreendendo administrar a um indivíduo necessitado uma quantidade eficaz de APCs de qualquer uma das modalidades precedentes.

[00198] Modalidade 10. O método da modalidade 9, em que as APCs são células autólogas.

[00199] Modalidade 11. O método de qualquer uma das modalidades 9 ou 10, em que o método compreende ainda administrar ao indivíduo um ou mais agentes anticâncer adicionais.

[00200] Modalidade 12. O método de qualquer uma das modalidades 9 a 11, em que o método compreende ainda administrar um fármaco quimioterapêutico (por exemplo, melfalan), imunomodulador, adjuvante, fármaco para anemia (por exemplo, eritropoietina), terapia de radiação, transplante de célula-tronco, células T que expressam o receptor de antígeno quimérico (células CAR T) ou uma combinação de dois ou mais dos precedentes.

[00201] Modalidade 13. O método de qualquer uma das modalidades

9 a 12, compreendendo administrar a terapia de radiação antes da administração das APCs.

[00202] Modalidade 14. O método de qualquer uma das modalidades 9 a 13, em que o indivíduo é humano.

[00203] Modalidade 15. O método de qualquer uma das modalidades 9 a14, em que as APCs são administradas por uma injeção intradérmica, injeção intratumoral ou uma injeção em um linfonodo que drena o tumor.

[00204] Modalidade 16. O método da modalidade 15, em que a injeção intradérmica é em um sítio anatômico que drena as redes dos linfonodos axilares e/ou inguinais do indivíduo.

[00205] Modalidade 17. O método de qualquer uma das modalidades 9 a 16, em que as APCs são administradas múltiplas vezes durante um período de dias.

[00206] Modalidade 18. O método de qualquer uma das modalidades 9 a 17, em que o método compreende ainda conduzir o transplante de uma célula hematopoiética (células tronco hematopoiéticas ou células progenitoras, por exemplo, da medula óssea, sangue periférico ou sangue do cordão) no indivíduo.

[00207] Modalidade 19. O método da modalidade 18, em que o transplante da célula hematopoiética é autólogo.

[00208] Modalidade 20. O método da modalidade 18 ou 19, em que as APCs são administradas antes e depois do transplante de célula hematopoiética.

[00209] Modalidade 21. O método de qualquer uma das modalidades 18 a 20, compreendendo ainda realizar a mobilização de célula-tronco (por exemplo, usando G-CSF) no indivíduo e coletar as células hematopoiéticas do indivíduo antes do transplante de célula hematopoiética autóloga.

[00210] Modalidade 22. O método de qualquer uma das modalidades

9 a 21, compreendendo ainda, antes da dita administração das APCs, coletar as APCs para a produção das APCs a serem administradas ao indivíduo.

[00211] Modalidade 23. O método da modalidade 22, em que as APCs são criopreservadas antes da dita administração.

[00212] Modalidade 24. O método de qualquer uma das modalidades 9 a 23, compreendendo ainda administrar um agente quimioterapêutico (por exemplo, melfalan) antes, durante ou depois da dita administração de APCs.

[00213] Modalidade 25. O método da modalidade 24, compreendendo ainda administrar um agente quimioterapêutico (por exemplo, melfalan) durante o transplante de célula hematopoiética.

[00214] Modalidade 26. O método de qualquer uma das modalidades 9 a 24, compreendendo ainda administrar um inibidor de ponto de controle ao indivíduo.

[00215] Modalidade 27. O método da modalidade 26, em que o inibidor do ponto de controle é um inibidor de: antígeno 4 do linfócito T citotóxico (CTLA4, também conhecido como CD152), proteína 1 da morte celular programada (PD-1, também conhecida como CD279) e o ligante 1 da morte celular programada (PD-L1, também conhecido como CD274).

[00216] Modalidade 28. O método da modalidade 27, em que o inibidor de CTLA4 é um anticorpo que se liga a CTLA4, o inibidor de PD- 1 é um anticorpo que se liga a PD-1, e o inibidor de PD-L1 é um anticorpo que se liga a PD-L1.

[00217] Modalidade 29. Um vírus oncolítico que compreende uma combinação de um interferon tipo I e um CD40-L ou uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam uma combinação de um IFN tipo I e um CD40-L.

[00218] Modalidade 30. O vírus oncolítico da modalidade 29, em que:

[00219] a) o IFN tipo I é: IFNα que compreende pelo menos 80% de identidade de sequência com IFNα humano (SEQ ID NO: 1), IFNβ que compreende pelo menos 80% de identidade de sequência com IFNβ humano (SEQ ID NO: 2), IFNω que compreende pelo menos 80% de identidade de sequência com IFNω humano (SEQ ID NO: 3), IFNω que compreende pelo menos 80% de identidade de sequência com IFNω humano (SEQ ID NO: 4), ou IFNω que compreende pelo menos 80% de identidade de sequência com IFNω humano (SEQ ID NO: 5); e/ou

[00220] b) o CD40-L compreende pelo menos 80% de identidade de sequência com CD40-L humano (SEQ ID NO: 6), pelo menos 80% de identidade de sequência com um CD40-L quimérico que possui uma sequência selecionada entre as SEQ ID NOs: 7 a 18, ou pelo menos 80% de identidade de sequência com um CD40-L quimérico que possui uma sequência da SEQ ID NO: 12; e/ou

[00221] c) o IFN tipo I é IFNβ que compreende pelo menos 80% de identidade de sequência com IFNβ humano (SEQ ID NO: 2) e o CD40- L compreende pelo menos 80% de identidade com um CD40-L quimérico que possui a sequência de SEQ ID NO: 12.

[00222] Modalidade 31. O vírus oncolítico de qualquer uma das modalidades 29 a 30, em que o vírus oncolítico é adenovirus, reovirus, vírus do herpes, picornavírus (por exemplo, vírus coxsackie, poliovirus e vírus Seneca Valley), paramixovirus (por exemplo, vírus do sarampo e vírus da doença de Newcastle), parvovirus, rabdovirus (por exemplo, vírus da estomatite vesicular), vírus da vacinia, poxvirus, vírus Sindbis, vírus do mixoma, vírus Maraba, vírus influenza, vírus da caxumba, arenavirus, vírus da vacinia ou adenovírus recombinante contendo uma deleção E1A delta-24, deleção E1b-55K e deleção da região E3.

[00223] Modalidade 32. Uma composição que compreende o vírus oncolítico de qualquer uma das modalidades 29 a 31 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00224] Modalidade 33. A composição da modalidade 32, compreendendo ainda um adjuvante.

[00225] Modalidade 34. Um método para o tratamento de uma malignidade, compreendendo administrar a um indivíduo necessitado uma quantidade eficaz de um vírus oncolítico de qualquer uma das modalidades 29 a 31 ou a composição da modalidade 31 ou 32.

[00226] Modalidade 35. O método da modalidade 34, em que o método compreende ainda administrar um ou mais agentes anticâncer ao indivíduo.

[00227] Modalidade 36. O método da modalidade 35, em que o método compreende ainda administrar um fármaco quimioterapêutico (por exemplo, melfalan), imunomodulador, adjuvante, fármaco para anemia (por exemplo, eritropoietina), terapia de radiação, transplante de célula-tronco, células T que expressam o receptor de antígeno quimérico (células CAR T) ou uma combinação de dois ou mais dos precedentes.

[00228] Modalidade 37. O método de qualquer uma das modalidades 34 a 36, em que o indivíduo é um humano.

[00229] Modalidade 38. O método de qualquer uma das modalidades 34 a 37, em que o vírus oncolítico é administrado múltiplas vezes durante um período de dias.

[00230] Modalidade 39. O método de qualquer uma das modalidades 34 a 38, em que o vírus oncolítico é administrado por injeção intradérmica, injeção intra-tumoral, injeção intravenosa ou uma injeção em um linfonodo que drena o tumor.

[00231] Modalidade 40. O método da modalidade 39, em que a injeção intradérmica é em um sítio anatômico que drena as redes de linfonodos axilar e/ou inguinal do indivíduo.

[00232] Modalidade 41. O método de qualquer uma das modalidades 34 to 40, em que o método compreende ainda a realização de transplante de célula hematopoiética (células-tronco hematopoiéticas ou células progenitoras, por exemplo, da medula óssea, sangue periférico ou sangue do cordão) no indivíduo.

[00233] Modalidade 42. O método da modalidade 41, em que o transplante da célula hematopoiética é autólogo.

[00234] Modalidade 43. O método da modalidade 41 ou 42, em que o vírus oncolítico é administrado antes e depois do transplante de célula hematopoiética.

[00235] Modalidade 44. O método de qualquer uma das modalidades 34 a 43, compreendendo ainda conduzir a mobilização de célula-tronco (por exemplo, usando G-CSF) no indivíduo e coletar as células hematopoiéticas do indivíduo antes do transplante de célula hematopoiética autóloga.

[00236] Modalidade 45. O método de qualquer uma das modalidades 34 a 44, compreendendo ainda administrar um agente quimioterapêutico (por exemplo, melfalan) antes, durante ou depois da administração do vírus oncolítico.

[00237] Modalidade 46. O método de qualquer uma das modalidades 43 a 45, compreendendo ainda administrar um agente quimioterapêutico (por exemplo, melfalan) durante o transplante da célula hematopoiética.

[00238] Modalidade 47. O método de qualquer uma das modalidades 34 a 46, compreendendo ainda administrar um inibidor do ponto de controle ao indivíduo.

[00239] Modalidade 48. O método da modalidade 47, em que o inibidor do ponto de controle é um inibidor de: antígeno 4 do linfócito T citotóxico (CTLA4, também conhecido como CD152), proteína 1 da morte celular programada (PD-1, também conhecida como CD279) e o ligante 1 da morte celular programada (PD-L1, também conhecido como CD274).

[00240] Modalidade 49. O método da modalidade 48, em que o inibidor de CTLA4 é um anticorpo que se liga a CTLA4, o inibidor de PD- 1 é um anticorpo que se liga a PD-1, e o inibidor de PD-L1 é um anticorpo que se liga a PD-L1.

[00241] Todas as patetes, pedidos de patente, pedidos provisórios e publicações referidas ou citadas aqui estão incorporadas por referência em sua totalidade, incluindo todas as figuras e tabelas, na medida em que eles não são inconsistentes com os ensinamentos explícitos deste pedido.

[00242] Os exemplos a seguir que ilustram os procedimentos para a prática da invenção. Esses exemplos não devem ser considerados como limitantes. Todos os percentuais são em peso e todas as proporções de mistura de solvente são em volume a menos que notado de outra maneira.

[00243] Exemplo 1. Construção do Cassete de Expressão Duplo MEM40 e IFNβ de Adenovírus Oncolítico

[00244] Um adenovírus oncolítico tipo 5 foi construído com um cassete de expressão para MEM40 que inclui um promotor de CMV, uma sequência de nucleotídeos de MEM40 e uma sequência de poliadenilação. O cassete de expressão foi inserido a montante da região do gene E1A do adenovírus que contém uma deleção de 24 nucleotídeos. Em adição um segundo cassete de expressão para IFNβ que inclui um promotor de SV40, uma sequência de nucleotídeos de IFNβ e uma sequência de poliadenilação foi inserida na localização do genoma do adenovírus onde a região E3 do adenovírus foi deletada. A região E1b 55k do genoma do adenovírus também tinha sido deletada. Figura 2 mostra uma construção esquemática do adenovírus oncolítico exemplificado com cassetes de expressão duplos que codificam CD40- L e IFNβ.

[00245] Exemplo 2. Construção do Cassete de Expressão Único

MEM40 e IFNβ de Adenovírus Oncolítico

[00246] Um adenovírus oncolítico tipo 5 foi construído com um cassete de expressão para MEM40 e IFNβ que inclui um promotor de CMV, sequências de nucleotídeos de MEM40 e IFNβ separadas por um sítio de entrada interna de ribossomo e uma sequência de poliadenilação. O cassete de expressão foi inserido a montante da região do gene E1A do adenovírus que contém uma deleção de 24 nucleotídeos. O adenovírus contém deleções na região E3 e E1b 55 kb. A Figura 3 mostra uma construção esquemática do vírus oncolítico exemplificado com um cassete de expressão único que codifica CD40- L e IFNβ separados por um sítio de entrada interna de ribossomo (IRES).

[00247] Exemplo 3 – Atividade oncolítica de um vírus que expressa IFNβ e MEM40

[00248] O efeito individual e combinado da expressão de IFNβ e MEM40 sobre o crescimento do tumor em camundongos que possuem um melanoma B16 subcutâneo agressivo foi testado. Células dendríticas que expressam IFNβ (106 células transduzidas com um lentivírus que expressa IFNβ) e um adenovírus com replicação deficiente que expressa MEM40 (Ad-MEM40, 1010 partículas virais) foram injetadas nos tumores como indicado na Figura 4A. De grande importância, comparado com o agente sozinha, o tratamento combinado reduziu significativamente o crescimento do tumor (Figura 4A). Como mostrado na Figura 4B, depois do tratamento com ambos os agentes, todos os camundongos implantados com o tumor de melanoma B16 agressivo estavam vivos na finalização do experimento. Ao contrário, depois do tratamento com Ad-MEM40, nenhum dos camundongos implantados com o tumor de melanoma B16 agressivo estava vivo na finalização do experimento; e depois do tratamento com DC que expressa IFNβ, apenas 17% dos camundongos implantados com o tumor de melanoma B16 agressivo estava vivo na finalização do experimento.

[00249] Adenovirus (24) que expressam MEM40 e/ou IFNβ foram testados quanto a sua habilidade oncolítica em vários modelos de câncer. MEM-188 se refere a um adenovirus 24 que expressa apenas MEM40 e MEM-288 se refere a um adenovirus 24 que expressa ambos MEM40 e IFNβ. Em células A549 de tumor de pulmão, MEM-288 exibe 7 e 100 vezes mais morte do tumor e ativação imune, respectivamente, em comparação com oAdv de controle e MEM-188. Por exemplo, a Figura 5A mostra que a infecção em células A549 de tumor de pulmão com doses crescentes de MEM-288 resultou em viabilidade celular muito baixa de cerca de 5%. Uma LD50 de 26 de multiplicidade de infecção (MOI) foi obtida para MEM-288. Ao contrário, a infecção de células A549 de tumor de pulmão com doses crescentes de MEM-188 resultou em uma viabilidade celular um pouco maior de cerca de 15% e uma LD50 muito maior de 194 MOI. Um oAdv de controle não mostrou propriedade de morte cellular significativa. Para esses experimentos, a viabilidade cellular doi determinada pelo ensaio da atividade da luciferase.

[00250] O alvo a jusante de IFNβ CXCL10 foi determinado por qRT- PCR depois de 48 horas de infecção com MEM-188, MEM-288 ou um oAdv de controle (Figura 5B). A Figura 5B mostra que em cerca de 48 horas depois da infecção com MEM-288, a expressão de CXCL10, que é um interferon induzível por quimiocina e um ativador de célula T, aumentou em cerca de 200 a 300 vezes. A infecção com um oAdv de controle não mostrou tal aumento e a infecção com MEM-188 mostrou um aumento moderado de cerca de 2 a 3 vezes.

[00251] Figura 6A mostra que MEM-288 é amplamente ativo contra vários tipos de tumor. Diferentes tipos de tumor de carcinoma foram infectados com MEM-288 (azul) ou oAdv de controle (cinza) e a morte celular foi analisada depois de 48 horas. A infecção com MEM-288 forneceu uma citotoxicidade significativamente maior comparada com a infecção com um oAdv de controle.

[00252] Tumor de pulmão KRAS mutante (linhagem cellular HCC44), um exemplo da forma mutante oncogênica direcionada mais comum de adenocarcinoma de pulmão, foi infectado com doses crescentes de MEM-188 e MEM-288. A viabilidade cellular foi medida pela coloração com cristal violeta (roxo = viável; clara = morta). Figura 6B mostra que comparado com MEM-188, MEM-288 foi aproximadamente 100 vezes mais eficaz na morte desta linhagem celular de tumor. Resultados similares foram observados com linhagens celulares de tumor adicionais (Figura 10).

[00253] A expressão in vitro de MEM40 e IFNβ em diferentes linhagens celulares de tumor foi testada e os resultados são mostrados na Figura 7. As células foram infectadas com MEM-288 em MOI de 250 por 2 dias. A expressão de MEM40 foi determinada pela classificação cellular ativada por fluorescência (FACS) na linhagem celular A549 de câncer de pulmão humano, linhagens LKR e 344 de câncer de pulmão de camundongo e linhagem celular B16-OVA de melanoma de camundongo enquanto que a expressão de IFNβ foi determinada por um ensaio ELISA. Todas as linhagens celulares mostraram expressão detectável de MEM40 na superfície celular e a liberação de IFNβ no sobrenadante de cultura.

[00254] Figura 8 mostra a expressão intensificada do transgene e a replicação de MEM-288 infectado na linhagem celular A549 de câncer de pulmão humano. Neste experimento, A549 não foram infectadas (A) ou foram infectadas com MOI de MEM-188 (B-D) ou MEM-288 (E-G). A expressão de MEM40 foi detectada por citometria de fluxo usando um anticorpo contra CD40L de camundongo. A expressão de MEM40 foi detectada nos dias 2, 4 e 6 depois da infecção com ambos em vírus em diferentes MOI como indicado. A expressão de MEM40 depois da infecção com MEM-188 foi alta no dia 2, mas diminuiu substancialmente no dia 6 (Figura 8B). Em contraste, as células infectadas com MEM-288 mantiveram a expressão alta de MEM40 nos dias 4 e 6 (Figura 8E). em um MOI de 10, a expressão de MEM40 foi prontamente detectada em células infectadas com MEM-288 (Figura 8F), mas não em células infectadas com MEM-188 (Figura 8C). Depois da infecção com MEM- 288 em um MOI de 1, MEM40 aumentou temporariamente a expressão de baixa para alta nos dias 2, 4 e 6, respectivamente (Figura 8G). Nenhuma de tais alterações ocorreu em células infectadas com MEM- 188 (Figura 8D). Esse resultado indica que MEM-88 tem atividade de replicação substancialmente maior em comparação com MEM-188. Os resultados expressão de MEM40 depois da infecção com MEM-188 ou MEM-288 na linhagem celular A549 na Figura 8 são representados em gráfico e mostrados na Figura 9.

[00255] A habilidade oncolítica de MEM-288 foi testada em várias linhagens celulares de câncer de pulmão. As células foram infectadas com MEM-188 ou MEM-288 em diferentes MOIs por 3 dias. A viabilidade cellular foi determinada pelo ensaio de contagem celular e ensaio com cristal violeta nas linhagens celulares PC9, A549, H23, e HCC44. MEM-288 mostra maior capacidade de morte cellular em MOI de 10 e 100 contra todas essas linhagens celulares (Figura 10). A expressão de MEM40 em linhagens celulares mostradas na Figura 10 é mostrada na Figura 11. As células foram infectadas com/sem MEM-188 ou MEM-288 oncolíticos em MOI=100 por 3 dias, depois do que a expressão de MEM40 foi encontrada ser substancialmente maior em células infectadas com MEM-288.

[00256] Figura 12 mostra que as células em uma cultura mista de células infectadas e não infectadas com MEM-288, as células não infectadas espectadoras regulam positivamente a expressão de PDL1.

A infecção por MEM-188 não regula positivamente a expressão de PDL1 em células espectadoras a menos que IFNβ exógeno seja adicionado. Portanto, IFNβ aumenta a expressão de PDL1 por células espectadoras não infectadas depois da infecção com MEM-288.

[00257] Figura 13 mostra o mapa do vetor viral de MEM-288 e o adenovírus oncolítico (24) que expressam MEM40 e/ou IFNβ.

[00258] Deve ficar compreendido que os exemplos e modalidades aqui descritas tem propósitos ilustrativos apenas e que várias modificações e alterações serão sugeridas pelas pessoas versadas na técnica e devem estar incluídas dentro do espírito e âmbito deste pedido e do escopo das reivindicações em anexo. Adicionalmente, quaisquer elementos ou limitações de qualquer invenção ou modalidade aqui descrita podem ser combinadas com qualquer um e/ou todos os elementos ou limitações (individualmente ou em qualquer combinação) ou qualquer outra invenção ou modalidade aqui descritas e todas tais combinações são contempladas com o escopo da invenção sem qualquer limitação.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Célula que apresenta antígeno (APC), caracterizada pelo fato de que compreende uma combinação de um interferon tipo I exógeno e um CD40-L exógeno ou uma ou mais sequências de ácido nucleico heterólogo que codificam uma combinação de um IFN tipo I exógeno e um CD40-L exógeno.

2. APC de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que: a) o IFN tipo I é: IFNα que compreende pelo menos 80% de identidade de sequência com IFNα humano (SEQ ID NO: 1), IFNβ que compreende pelo menos 80% de identidade de sequência com IFNβ humano (SEQ ID NO: 2), IFNω que compreende pelo menos 80% de identidade de sequência com IFNω humano (SEQ ID NO: 3), IFNω que compreende pelo menos 80% de identidade de sequência com IFNω humano (SEQ ID NO: 4), ou IFNω que compreende pelo menos 80% de identidade de sequência com IFNω humano (SEQ ID NO: 5); e/ou b) o CD40-L compreende pelo menos 80% de identidade de sequência com CD40-L humano (SEQ ID NO: 6), pelo menos 80% de identidade de sequência com um CD40-L quimérico que possui uma sequência selecionada entre as SEQ ID NOs: 7 a 18, ou pelo menos 80% de identidade de sequência com um CD40-L quimérico que possui uma sequência da SEQ ID NO: 12; e/ou c) o IFN tipo I é IFNβ que compreende pelo menos 80% de identidade de sequência com IFNβ humano (SEQ ID NO: 2) e o CD40- L compreende pelo menos 80% de identidade com um CD40-L quimérico que possui a sequência de SEQ ID NO: 12.

3. APC de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que que a uma ou mais sequências de ácido nucleico heterólogo que codifica a combinação de IFN tipo I e CD40-L é um ou mais construtos virais.

4. APC de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que cada um ou mais dos construtos virais, independentemente, é um construto adenoviral, um construto viral adeno-associado (AAV), um construto de poxvírus, um construto lentiviral, um construto alfaviral, um construto herpesviral, um construto retroviral, um construto viral do vírus da vacínia, um construto viral da estomatite vesicular ou um construto viral do herpes simplex.

5. APC de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a APC é uma APC humana.

6. APC de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a APC é uma DC.

7. Composição caracterizada pelo fato de que compreende a APC como definida em qualquer uma reivindicações precedentes e um veículo farmaceuticamente aceitável.

8. Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um adjuvante.

9. Método de tratamento de uma malignidade, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um indivíduo necessitado uma quantidade eficaz de APCs como definidas em qualquer uma das reivindicações precedentes.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que as APCs são células autólogas.

11. Método de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda administrar ao indivíduo um ou mais agentes anticâncer adicionais.

12. Método de acordo qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administrar um fármaco quimioterapêutico (por exemplo, melfalan), imunomodulador, adjuvante, fármaco para anemia (por exemplo, eritropoietina), terapia de radiação, transplante de célula-tronco, células T que expressam o receptor de antígeno quimérico (células CAR T) ou uma combinação de dois ou mais dos precedentes.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de compreender administrar a terapia de radiação antes da administração das APCs.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é ser humano.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 14, caracterizado pelo fato de que as APCs são administradas por uma injeção intradérmica, injeção intratumoral ou uma injeção em um linfonodo que drena o tumor.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a injeção intradérmica é em um sítio anatômico que drena as redes dos linfonodos axilares e/ou inguinais do indivíduo.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 16, caracterizado pelo fato de que as APCs são administradas múltiplas vezes durante um período de dias.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 17, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda conduzir o transplante de uma célula hematopoiética (células-tronco hematopoiéticas ou células progenitoras, por exemplo, da medula óssea, sangue periférico ou sangue do cordão) no indivíduo.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o transplante da célula hematopoiética é autólogo.

20. Método de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que as APCs são administradas antes e depois do transplante de célula hematopoiética.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, caracterizado pelo fato de compreender ainda realizar a mobilização de célula-tronco (por exemplo, usando G-CSF) no indivíduo e coletar as células hematopoiéticas do indivíduo antes do transplante de célula hematopoiética autóloga.

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 21, caracterizado pelo fato de compreender ainda, antes da dita administração das APCs, coletar as APCs para a produção das APCs a serem administradas ao indivíduo.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que as APCs são criopreservadas antes da dita administração.

24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 23, caracterizado pelo fato de compreender ainda administrar um agente quimioterapêutico (por exemplo, melfalan) antes, durante ou depois da dita administração de APCs.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de compreender ainda administrar um agente quimioterapêutico (por exemplo, melfalan) durante o transplante de célula hematopoiética.

26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 24, caracterizado pelo fato de compreender ainda administrar um inibidor de ponto de controle ao indivíduo.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o inibidor do ponto de controle é um inibidor de: antígeno 4 do linfócito T citotóxico (CTLA4, também conhecido como CD152), proteína 1 da morte celular programada (PD-1, também conhecida como CD279) e o ligante 1 da morte celular programada (PD- L1, também conhecido como CD274).

28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o inibidor de CTLA4 é um anticorpo que se liga a CTLA4, o inibidor de PD-1 é um anticorpo que se liga a PD-1, e o inibidor de PD-L1 é um anticorpo que se liga a PD-L1.

29. Vírus oncolítico caracterizado pelo fato de compreender uma combinação de um interferon tipo I e um CD40-L ou uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam uma combinação de um IFN tipo I e um CD40-L.

30. Vírus oncolítico de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que: a) o IFN tipo I é: IFNα que compreende pelo menos 80% de identidade de sequência com IFNα humano (SEQ ID NO: 1), IFNβ que compreende pelo menos 80% de identidade de sequência com IFNβ humano (SEQ ID NO: 2), IFNω que compreende pelo menos 80% de identidade de sequência com IFNω humano (SEQ ID NO: 3), IFNω que compreende pelo menos 80% de identidade de sequência com IFNω humano (SEQ ID NO: 4), ou IFNω que compreende pelo menos 80% de identidade de sequência com IFNω humano (SEQ ID NO: 5); e/ou b) o CD40-L compreende pelo menos 80% de identidade de sequência com CD40-L humano (SEQ ID NO: 6), pelo menos 80% de identidade de sequência com um CD40-L quimérico que possui uma sequência selecionada entre as SEQ ID NOs: 7 a 18, ou pelo menos 80% de identidade de sequência com um CD40-L quimérico que possui uma sequência da SEQ ID NO: 12; e/ou c) o IFN tipo I é IFNβ que compreende pelo menos 80% de identidade de sequência com IFNβ humano (SEQ ID NO: 2) e o CD40- L compreende pelo menos 80% de identidade com um CD40-L quimérico que possui a sequência de SEQ ID NO: 12.

31. Vírus oncolítico de acordo com a reivindicação 29 ou 30, caracterizado pelo fato de que o vírus oncolítico é adenovirus, reovirus, vírus do herpes, picornavírus (por exemplo, vírus coxsackie, poliovirus e vírus Seneca Valley), paramixovirus (por exemplo, vírus do sarampo e vírus da doença de Newcastle), parvovirus, rabdovirus (por exemplo, vírus da estomatite vesicular), vírus da vacinia, poxvirus, vírus Sindbis,

vírus do mixoma, vírus Maraba, vírus influenza, vírus da caxumba, arenavirus, vírus da vacinia ou adenovírus recombinante contendo uma deleção E1A delta-24, deleção E1b-55K e deleção da região E3.

32. Composição caracterizada pelo fato de que compreende o vírus oncolítico como definido em qualquer uma das reivindicações 29 a 31 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

33. Composição de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um adjuvante.

34. Método para o tratamento de uma malignidade, caracterizado pelo fato de compreender administrar a um indivíduo necessitado uma quantidade eficaz de um vírus oncolítico como definido em qualquer uma das reivindicações 29 a 31 ou a composição como definida na reivindicação 31 ou 32.

35. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administrar um ou mais agentes anticâncer ao indivíduo.

36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de compreender ainda administrar um fármaco quimioterapêutico (por exemplo, melfalan), imunomodulador, adjuvante, fármaco para anemia (por exemplo, eritropoietina), terapia de radiação, transplante de célula-tronco, células T que expressam o receptor de antígeno quimérico (células CAR T) ou uma combinação de dois ou mais dos precedentes.

37. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 36, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.

38. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 37, caracterizado pelo fato de que o vírus oncolítico é administrado múltiplas vezes durante um período de dias.

39. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 38, caracterizado pelo fato de que o vírus oncolítico é administrado por injeção intradérmica, injeção intra-tumoral, injeção intravenosa ou uma injeção em um linfonodo que drena o tumor.

40. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a injeção intradérmica é em um sítio anatômico que drena as redes de linfonodos axilar e/ou inguinal do indivíduo.

41. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 40, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda a realização de transplante de célula hematopoiética (células-tronco hematopoiéticas ou células progenitoras, por exemplo, da medula óssea, sangue periférico ou sangue do cordão) no indivíduo.

42. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o transplante da célula hematopoiética é autólogo.

43. Método de acordo com a reivindicação 41 ou 42, caracterizado pelo fato de que o vírus oncolítico é administrado antes e depois do transplante de célula hematopoiética.

44. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 43, caracterizado pelo fato de compreender ainda conduzir a mobilização de célula-tronco (por exemplo, usando G-CSF) no indivíduo e coletar as células hematopoiéticas do indivíduo antes do transplante de célula hematopoiética autóloga.

45. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 44, caracterizado pelo fato de compreender ainda administrar um agente quimioterapêutico (por exemplo, melfalan) antes, durante ou depois da administração do vírus oncolítico.

46. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 45, caracterizado pelo fato de compreender ainda administrar um agente quimioterapêutico (por exemplo, melfalan) durante o transplante da célula hematopoiética.

47. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 46, caracterizado pelo fato de compreender ainda administrar um inibidor do ponto de controle ao indivíduo.

48. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o inibidor do ponto de controle é um inibidor de: antígeno 4 do linfócito T citotóxico (CTLA4, também conhecido como CD152), proteína 1 da morte celular programada (PD-1, também conhecida como CD279) e o ligante 1 da morte celular programada (PD- L1, também conhecido como CD274).

49. Método de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que o inibidor de CTLA4 é um anticorpo que se liga a CTLA4, o inibidor de PD-1 é um anticorpo que se liga a PD-1, e o inibidor de PD-L1 é um anticorpo que se liga a PD-L1.