KR20180120208A - 암을 치료하기 위한 smc 조합 요법 - Google Patents

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KR20180120208A
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smc
cancer
cells
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tumor
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KR1020187027746A
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로버트 지. 콜네룩
에릭 씨. 라카세
숀 티. 뷰그
베라 에이. 탕
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칠드런스 하스피탈 오브 이스턴 온타리오 리서치 인스티튜트 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 암의 치료시 SMC의 효과를 강화하기 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 보다 상세하게는, 본 발명은 SMC 및 하나 이상의 세포자살 경로 또는 면역 경로를 자극하는 적어도 제2 물질을 포함하는 조성물 및 조합 요법을 위한 방법을 포함한다. 제2 물질은 예를 들어 면역자극 화합물, 면역조절 화합물 또는 종양 용해성 바이러스일 수 있다.

Description

암을 치료하기 위한 SMC 조합 요법
세포자살에 의한 사멸 (또는 프로그래밍된 세포 사멸) 및 그외 세포 사멸 경로는 다양한 세포 기전들에 의해 조절된다. X-linked IAP (XIAP) 또는 세포성 IAP 단백질 1 및 2 (cIAP1 및 2)와 같은, 세포자살 (IAP) 단백질의 저해제들이, 예를 들어, 암 세포에서 (비-배타적인 예로) 세포자살 경로 등의, 프로그래밍된 세포 사멸의 조절 인자 (regulator)이다. 세포 사멸의 다른 형태로는 네크롭토시스 (necroptosis), 괴사, 파이롭토시스 (pyroptosis) 및 면역성 세포 사멸 (immunogenic cell death) 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한, 이들 IAP는, 세포 생존과 관련있거나 또는 관련없을 수 있는, 그들의 유비퀴틴 E3 리가제 활성을 통해 다양한 세포 신호전달 경로를 조절한다. 세포자살의 또 다른 조절인자는 폴리펩타이드 Smac이다. Smac는 세포 사멸시 미토콘드리아에서 방출되는 세포자살 촉진 단백질 (proapoptotic protein)이다. Smac가 IAP에 결합하여, 그 기능을 길항할 수 있다. Smac 모방 화합물 (Smac mimetic compound, SMC)은 내인성 (endogeneous) Smac의 한가지 이상의 기능 또는 활성을 수행할 수 있는 비-내인성의 세포자살 촉진 화합물이다.
프로토타입의 XIAP 단백질은 세포자살 케스케이드에서 주요 (key) 개시인자와 집행인자 (executioner) 카스파제 단백질을 직접 저해한다. XIAP는 따라서 세포자살 프로그램의 실행을 방해한다. 세포성 IAP 단백질 1 및 2는 면역 사이토카인이 관여하는 세포자살 신호전달 경로를 조절하는 E3 유비퀴틴 리가제이다. cIAP 1 및 2가 둘다 감소되면, TNFα, TRAIL 및/또는 IL-1β는, 예를 들어, 대부분의 암 세포에 독성이 될 수 있다. SMC는 XIAP, cIAP1, cIAP2 또는 그외 IAP를 저해할 수 있거나, 및/또는 다른 세포자살 촉진 기전에 기여할 수 있다.
SMC의 투여를 통한 암 치료가 제안된 바 있다. 그러나, SMC 단독으로는 특정 암을 치료하기에는 충분하지 않을 수 있다. 한가지 타입 이상의 암에서 SMC의 치료 효과를 개선하는 암 치료 방법이 요구되고 있다.
본 발명은 SMC 및 면역자극성 물질 또는 면역조절성 물질을 투여함으로써 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 포함한다. SMC 및 면역자극 물질 또는 면역조절성 물질은 본원에 기술되어 있으며, 비-배타적인 예로, 표 1의 SMC; 및 표 2, 표 3 및 표 4의 물질을 포함한다.
본 발명의 일 측면은 표 1의 SMC; 및 하나 이상의 (예, 2, 3, 4 또는 5종 이상) 물질을 포함하는 조성물로서, 각각의 물질은 독립적으로 면역 체크포인트 저해제 (ICI)이거나, 또는 표 2의 물질, 또는 표 3의 물질, 또는 STING 작용제이다. 일부 구현예에서, ICI는 표 4의 ICI이다. SMC 및 물질(들)은, 이들을 필요로 하는 환자에게 투여시 함께 암을 치료하기에 충분한 양으로 제공된다. 일부 구현예에서, 2종, 3종 또는 4종의 물질은 서로 다른 카데고리의 물질이다 (즉, 하나는 ICI이고, 다른 하나는 표 2에서 유래된 것이고, 다른 하나는 표 3에서 유래된 것이고, 및/또는 다른 하나는 STING 작용제임).
본 발명의 다른 측면은, 환자에게 표 1의 SMC 및 하나 이상의 (예, 2종, 3종, 4종, 5종 또는 그 이상) 물질을 투여하는 단계를 포함하며, 각 물질이 독립적으로 ICI이거나 또는 표 2의 물질 또는 표 3의 물질 또는 STING 작용제인, 암으로 진단된 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, ICI는 표 4의 ICI이며, SMC와 물질이 투여된다. 일부 구현예에서, 2종, 3종 또는 4종의 물질은 서로 다른 카테고리이며 (즉, 하나는 ICI이고, 다른 하나는 표 2에서 유래되고, 다른 하나는 표 3에서 유래되고, 및/또는 다른 하나는 STING 작용제임), 이들은 동시에 또는 서로 28일 이내에 함께 암을 치료하기에 충분한 양으로 투여된다.
일부 구현예에서, SMC 및 물질(들)은 서로 14일 이내에, 서로 10일 이내에, 서로 5일 이내에, 서로 24시간 이내에, 서로 6시간 이내에 또는 동시에 투여된다.
특정 구현예에서, SMC는 1가 (monovalent) SMC, 예를 들어 LCL161, SM-122, GDC-0152/RG7419, GDC-0917/CUDC-427 또는 SM-406/AT-406/Debio1143이다. 다른 구현예들에서, SMC는 2가 SMC (bivalent SMC), 예를 들어 AEG40826/HGS1049, OICR720, TL32711/Birinapant, SM-1387/APG-1387 또는 SM-164이다.
특정 구현예에서, 물질들 중 하나는 표 2의 TLR 작용제이다. 특정 구현예들에서, 이 물질은 리포폴리사카라이드, 펩티도글리칸 또는 리포펩타이드이다. 다른 구현예들에서, 이 물질은 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드, 예를 들어 CpG-ODN 2216이다. 또 다른 구현예에서, 이 물질은 이미퀴모드 (imiquimod) 또는 poly(I:C)이다.
특정 구현예에서, 물질들 중 하나는 표 3의 바이러스이다. 특정 구현예들에서, 이 물질은 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 예를 들어 VSV-M51R, VSV-MΔ51, VSV-IFNβ 또는 VSV-IFNβ-NIS이다. 다른 구현예들에서, 이 물질은 아데노바이러스, 마라바 베지쿨로바이러스 (maraba vesiculovirus), 레오바이러스 (reovirus), 랍도바이러스 (rhabdovirus) 또는 백시니아 바이러스 (vaccinia virus), 또는 이들의 변이체이다. 일부 구현예에서, 이 물질은 탈리모겐 라헤르파렙벡 (Talimogene laherparepvec), 헤르페스 심플렉스 바이러스 변이체 (variant herpes simplex virus)이다.
특정 구현예에서, 물질들 중 하나는 ICI이다. 특정 구현예들에서, 이 물질은 이필리무맵 (ipilimumab), 트레멜리무맵 (tremelimumab), 펨브롤리주맵 (pembrolizumab), 니볼루맵 (nivolumab), 피딜리주맵 (pidilizumab), AMP-224, AMP-514, AUNP 12, PDR001, BGB-A317, REGN2810, 아벨루맵 (avelumab), BMS-935559, 아테졸리주맵 (atezolizumab), 두르발루맵 (durvalumab), bmBMS-986016, LAG525, IMP321, MBG453, 리릴루맵 (lirilumab) 또는 MGA271이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 또는 방법은 복수의 면역자극성 물질 또는 면역조절성 물질, 비-배타적인 예로, 인터페론, 및/또는 복수의 SMC를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 또는 방법은 한가지 이상의 인터페론 물질, 예를 들어 인터페론 타입 1 물질, 인터페론 타입 2 물질 및/또는 인터페론 타입 3 물질을 포함한다.
본 발명의 임의의 방법에서, 암은 면역자극성 물질 또는 면역조절성 물질의 부재 하 SMC에 의한 치료에는 난치성 (refractory)이다. 본 발명의 임의의 방법에서, 치료는 인터페론 등의 치료 물질의 투여를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 임의의 방법에서, 암은 부신암, 기저세포암, 담관암, 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 융모암, 대장암, 결장직장암, 결합조직암, 소화계 암, 자궁내막암, 상인두암, 식도암, 안구암, 담낭암, 위암 (gastric cancer), 두경부암, 간세포암, 상피내암종, 신장암, 후두암, 백혈병, 간암, 간 전이, 폐암, 림프종, 흑색종, 골수종, 다발성 골수종, 신경모세포종, 중피종, 신경교종, 골수이형성 증후군, 다발성 골수종, 구강암, 난소암, 소아암, 췌장암, 췌장 내분비 종양, 음경암, 형질세포 종양, 뇌하수체 선종, 흉선종, 전립선암, 신장 세포 암종, 호흡계 암, 횡문근육종, 침샘암, 육종, 피부암, 소장암, 위암 (stomach cancer), 고환암, 갑상선암, 요관암 및 비뇨계 암으로부터 선택되는 암일 수 있다.
본 발명은, 표 1의 SMC; 및 전술한 하나 이상의 (예, 2, 3, 4 또는 그 이상) 물질을 포함하는 조성물을 또한 포함한다. 이들 물질들 중 하나는 바이러스 사멸 균체 (killed virus), 불활화 바이러스 (inactivated virus) 또는 바이러스 백신을 포함할 수 있으며, SMC 및 물질은 이들을 필요로 하는 환자에게 투여시 함께 암을 치료하기에 충분한 양으로 제공된다. 특정 구현예에서, 상기 물질은 NRRP 또는 광견병 백신이다. 다른 구현예들에서, 본 발명은 표 1의 SMC, 면역 반응을 촉발 (priming)하는 제1 물질, 및 면역 반응을 부스팅하는 제2 물질을 포함하는 조성물을 포함하며, SMC와 물질은 이들을 필요로 하는 환자에게 투여시 함께 암을 치료하기에 충분한 양으로 제공된다. 특정 구현예들에서, 제1 물질과 제2 물질 중 하나 또는 둘다는 종양 용해성 바이러스 백신 (oncolytic virus vaccine)이다. 다른 특정 구현예에서, 제1 물질은 종양 항원을 운반하는 아데노바이러스이고, 제2 물질은 베지쿨로바이러스 (vesiculovirus), 예를 들어, 아데노바이러스와 동일한 종양 항원을 운반하는 Maraba-MG1 또는 종양 항원을 운반하지 않는 Maraba-MG1이다
"이웃하는" 세포는 기준 세포로부터 면역, 염증 또는 세포자살 촉진 신호를 직접 또는 간접적으로 수신하기 위해 기준 세포로부터 충분히 인접한 세포를 의미한다.
"세포자살 또는 세포 사멸 강화"는 하나 이상의 세포가 세포자살하거나 또는 사멸할 가능성을 증가시키는 것을 의미한다. 치료는 하나 이상의 치료된 세포가 세포자살할 가능성을 높이거나 및/또는 치료된 세포에 이웃한 하나 이상의 세포가 세포자살하거나 또는 사멸할 가능성을 높임으로써 세포 사멸을 강화할 수 있다.
"내인성 Smac 활성"은, 적어도 cIAP1 및 cIAP2의 저해 등의, 세포자살을 강화하는 결과를 발생시키는 Smac의 하나 이상의 생물학적 기능을 의미한다. Smac가 천연적으로 형성되는 특정 생체내 조건에서 일부 세포들에서 생물학적 기능을 수행할 수 있는 경우를 제외하고는, 생물학적 기능이 모든 상황에서 모든 세포에서 발생하거나 또는 가능하여야 하는 것은 아니다.
"Smac 모방 화합물" 또는 "SMC"는, cIAP1을 저해할 수 있거나 및/또는 cIAP2를 저해할 수 있는, 하나 이상의 구성 성분, 예를 들어, 소분자, 화합물, 폴리펩타이드, 단백질 또는 이들의 임의 복합체 조성물을 의미한다. Smac 모방 화합물은 표 1에 열거된 화합물을 포함한다.
"세포자살 프로그램 유도"는, IAP-매개 세포자살 경로에 참여할 수 있는 하나 이상의 단백질의 양, 이용가능성 또는 활성이 증가되도록 또는 IAP-매개 세포자살 경로에 참여할 수 있는 하나 이상의 단백질이 이러한 경로의 활성에 참여하도록 촉발되게끔, 하나 이상의 세포의 단백질들 또는 단백질 프로파일에 변화를 유발하는 것을 의미한다. 세포자살 프로그램의 유도가 세포 사멸 그 자체의 개시이어야 하는 것은 아니며; 세포 사멸을 발생시키지 않는 방식으로의 세포자살 프로그램 유도는 세포자살을 강화하는 SMC를 이용한 치료와 상승작용하여, 세포 사멸을 유도할 수 있다.
"물질"은 개체의 하나 이상의 세포에서 누적하여 세포자살 또는 염증 프로그램, 및 적어도 cIAP1 및 cIAP2에 의해 저해되는 프로그램의 세포 사멸의 하류 과정을 유도할 수 있는 하나 이상의 구성 성분들로 된 조성물을 의미한다. 물질은, 예를 들어, TLR 작용제 (예, 표 2에 열거된 화합물), 바이러스 (예, 표 3에 열거된 바이러스), 예를 들어 종양 용해성 바이러스 또는 면역 체크포인트 저해제 (예, 표 4에 열거된 것)일 수 있다.
"암 치료"는 개체에서 하나 이상의 암 세포의 사멸을 유도하거나, 또는 종양 퇴행을 유도할 수 있는 면역 반응을 일으키고, 종양 전파 (전이)를 차단하는 것을 의미한다. 암 치료는 개체에서 암의 신호 및 증상의 일부 또는 전체 완전한 또는 부분적인 소거, 개체에서 암의 하나 이상의 증상의 중증도 완화, 개체에서 암의 하나 이상의 증상의 진행 약화, 또는 후차적으로 발생되는 한가지 이상의 증상의 진행 또는 중증도 조정일 수 있다.
"프로드럭"은, 하나 이상의 효소, 화학제 또는 개체의 내부에 존재하는 조건에 의해, 개체의 체내에서, 예를 들어 개체의 세포내에서 활성 상태로 바뀔 수 있는 불활성 형태로 제조된 치료학적 물질을 의미한다.
"낮은 투여량" 또는 "저 농도"는 임의의 인간 질환 또는 병태를 치료하기 위해 소정의 투여 경로용으로 제형화된 특정 화합물에 대해 권고되는 최저 표준 투여량 또는 최저 표준 농도 보다 적어도 5% (예, 적어도 10%, 20%, 50%, 80%, 90%, 또는 심지어 95%) 낮은 것을 의미한다.
"높은 투여량"은 임의의 인간 질환 또는 병태를 치료하기 위한 특정 화합물에 대해 권고되는 최고 표준 투여량 보다 적어도 5% (예, 적어도 10%, 20%, 50%, 100%, 200% 또는 심지어 300%) 높은 것을 의미한다.
"면역 체크포인트 저해제"는 해당 수용체를 길항적으로 차단하거나 또는 리간드에 결합하여 면역계의 종양 공격 능력을 재확립함으로써, 면역 세포가 암 세포를 인지하지 못하는 상태 (turn off)되지 않게 방지하는 암 치료 약물을 의미한다.
도 1a-1f는 SMC가 종양 용해성 랍도바이러스와 상호작용하여 암 세포 사멸을 유발함을 보여주는, 그래프 세트와 사진이다. 도 1의 전체 패널은 생물학적 레플리케이트 (n=3)를 이용한 3번 이상의 독립적인 실험들의 데이터를 나타낸다. 도 1a는 LCL161 처리된 세포의 VSVΔ51의 MOI 증가에 따른 알라마르 블루 생존성 분석 결과를 도시한 그래프이다. 오차 막대, 평균 ± s.d. 도 1b는 LCL161 및 VSVΔ51-GFP 0.1 MOI 처리된 세포의 현미경 사진들이다. 도 1c는 LCL161의 농도를 증가시킨 조건에서 VSVΔ51 (0.1 MOI) 감염 세포의 생존성 (알라마르 블루)을 나타낸 그래프이다. 오차 막대, 평균 ± s.d. 도 1d는 24시간 동안 VSVΔ51로 감염된 세포의 데이터를 도시한 그래프이다. 세포 배양 상층액을 바이러스-불활화 UV 광에 노출시킨 다음 LCL161의 존재 하에 생존성 분석 (알라마르 블루)을 위해 새로운 세포에 적용하였다. 오차 막대, 평균 ± s.d. 도 1e는 LCL161 및 비-전파성 (non-spreading) 바이러스 VSVΔ51ΔG (0.1 MOI)로 공동-처리된 세포의 생존성을 나타낸 그래프이다. 오차 막대, 평균 ± s.d. 도 1f는 LCL161을 포함하는 아가로스 배지와 함께 적층하고, 웰 중앙에서 VSVΔ51- GFP를 접종하여 형광으로 감염성을 측정한, 세포에 대한 그래프와 사진으로서, 세포독성은 크리스탈 바이올렛 염색으로 분석하였다 (사진을 겹쳐 도시함; 도 11에 사진을 겹치지 않고 도시함). 오차 막대, 평균 ± s.d.
도 2a-2e는, SMC 처리가 종양 용해성 바이러스 (OV) 감염에 대한 암 세포 반응을 변형시키지 않음을 보여주는 그래프와 사진 세트이다. 도 2의 모든 패널들은 생물학적 레플리케이트를 사용한 3번 이상의 독립적인 실험의 데이터이다. 도 2a는LCL161로 전처리한 다음 VSVΔ51을 지정된 MOI로 감염시킨 세포의 데이터를 나타낸 그래프 쌍이다. 바이러스 역가는 표준 플라그 분석으로 분석하였다. 도 2b는 LCL161 및 VSVΔ51-GFP 처리 세포의 시간 경과에 따라 포착한 그래프들과 현미경 사진 세트이다. 그래프는 시간 경과에 따른 GFP 신호의 수를 나타낸다. 오차 막대, 평균 ± s.d. n=12. 도 2c는 LCL161 및 VSVΔ51 처리 세포의 세포 배양 상층액을 IFNβ의 존재에 대해 ELISA에 의해 처리한 실험의 데이터를 나타낸 그래프들이다. 오차 막대, 평균 ± s.d. n=3. 도 2d는 세포를 LCL161 및 VSVΔ51로 20시간 처리한 다음 RT-qPCR로 처리하여 인터페론 자극된 유전자 (ISG) 발현을 측정한 실험의 데이터를 나타낸 그래프들이다. 오차 막대, 평균 ± s.d. n=3. 도 2e는 LCL161로 전처리한 다음 IFNβ로 자극된 세포에 대해 수행된 STAT1 경로 활성화에 대한 면역블롯을 나타낸 사진들이다.
도 3a-3h는 OV-감염된 암 세포의 SMC 처리가 타입 I 인터페론 (타입 I IFN) 및 핵-인자 κB (NF-κB) 의존적인 전염증성 사이토카인 생산을 유도함을 보여주는 그래프 세트이다. 도 3의 모든 패널들은 생물학적 레플리케이트를 사용한 3번 이상의 독립적인 실험의 데이터 (n=3)를 나타낸다. 도 3a는 비-타겟팅 (NT), TNF-R1 및 DR5 siRNA의 조합으로 형질감염시킨 후 LCL161 및 VSVΔ51 (0.1 MOI) 또는 IFNβ 처리된 세포의 알라마르 블루 생존성 분석 결과를 나타낸 그래프이다. 오차 막대, 평균 ± s.d. 도 3b는 NT 또는 IFNAR1 siRNA로 형질감염시킨 다음 LCL161 및 VSVΔ51ΔG가 처리된 세포의 생존성을 나타낸 그래프이다. 오차 막대, 평균 ± s.d. 도 3c는 LCL161으로 전처리한 다음 0.5 MOI의 VSVΔ51을 감염시키고 사이토카인 유전자 발현을 RT-qPCR로 측정한 실험의 데이터를 나타낸 그래프이다. 오차 막대, 평균 ± s.d. 도 3d는 NT 또는 IFNAR1 siRNA로 형질감염 후 LCL161 및 0.1 MOI의 VSVΔ51을 처리한 세포에 대해 사이토카인 ELISA를 수행한 실험에서 수집된 데이터 차트이다. 오차 막대, 평균 ± s.d. 도 3e는 LCL161 및 사이토카인으로 공동-처리된 세포의 생존성을 나타낸 그래프이다. 오차 막대, 평균 ± s.d. 도 3f는 세포를 LCL161로 전처리한 다음 250 U/mL (~20 pg/mL) IFNβ로 자극하고, 사이토카인 mRNA 수준을 RT-qPCR로 측정한 실험의 데이터를 나타낸 그래프이다. 오차 막대, 평균 ± s.d. 도 3g는 LCL161 및 0.1 MOI의 VSVΔ51로 처리된 세포를 대상으로 수행된 사이토카인 ELISA 결과를 나타낸 그래프들이다. 도 h는 IKKβ-DN을 발현하며 LCL161 및 VSVΔ51 또는 IFNβ로 처리된 세포에서 수행된 사이토카인 ELISA 결과를 나타낸 그래프이다. 오차 막대, 평균 ± s.d.
도 4a-4g는 SMC 및 OV 조합 처리가 생체내에서 효과적이며, 사이토카인 신호전달에 의존적임을 보여주는 그래프 및 사진 세트이다. 도 4a는 EMT6-Fluc 종양에 50 mg/kg LCL161 (p.o.) 및 5x108 PFU VSVΔ51 (i.v.)을 처리한 실험의 데이터를 나타낸 그래프 쌍이다. 좌측 패널은 종양 증식을 도시한 것이다. 우측 패널은 마우스 생존성을 나타낸 카플란-마이어 곡선이다. 오차 막대, 평균 ± s.e.m. n=5 /그룹. Holm-Sidak 다중 비교를 이용한 Log-rank: **, p < 0.01; ***, p < 0.001. 2번의 독립적인 실험의 데이터를 도시한다. 도 4b는 도 4a의 실험에서 획득된 IVIS 사진 시리즈이다. 도 4c 및 d는 α- VSV 또는 α-c-카스파제-3 항체를 이용해 24시간 처리된 종양에서의 감염 및 세포자살 결과를 보여주는 면역형광 사진 세트이다. 도 4e는 각각 처리된 마우스로부터 유래된 종양의 단백질 용해물을 지정된 항체로 면역블롯팅한 면역블롯을 나타낸 사진이다. 도 4f는 EMT6-Fluc 종양을 가진 마우스에 TNFα 중화 항체 또는 이소형 매칭된 항체를 주사한 다음 50 mg/kg LCL161 (p.o.) 및 5x108 PFU VSVΔ51 (i.v.)을 처리한 실험의 데이터를 나타낸 그래프 쌍이다. 좌측 패널은 종양 증식을 도시한다. 우측 패널은 마우스 생존성을 도시한 카플란-마이어 곡선이다. 오차 막대, 평균 ± s.e.m. 비히클 α-TNFα, n=5; SMC α-TNFα, n= 5; 비히클+VSVΔ51, n=5; α-TNFα, n=5; SMC+VSVΔ51 α-TNFα, n=7; SMC+VSVΔ51 α-IgG, n=7. Holm-Sidak 다중 비교를 이용한 Log-rank: ***, p < 0.001. 도 4g는 도 4f의 실험에서 획득한 IVIS 사진 세트이다.
도 5a-5e는 소분자 면역 자극인자가 뮤라인 암 모델에서 SMC 요법을 강화함을 보여주는 그래프 및 사진 시리즈이다. 도 5a는 트랜스웰 시스템에서 비장 세포와 공-배양된 EMT6 세포의 알라마르 블루 생존성 분석 결과를 나타낸 그래프로서, 분리된 (segregated) 비장 세포에 LCL161 및 지정된 TLR 작용제를 처리하였다. 오차 막대, 평균 ± s.d. 생물학적 레플리케이트를 사용한 3번 이상의 독립적인 실험의 데이터 (n=3)를 도시한다. 도 5b는 확립된 EMT6-Fluc 종양에 SMC (50 mg/kg LCL161, p.o.) 및 폴리(I:C) (15 ug i.t. 또는 2.5 mg/kg i.p.)을 처리한, 실험의 결과를 나타낸 그래프들이다. 우측 패널은 마우스 생존성을 도시한 카플란-마이어 곡선이다. 비히클, 비히클+폴리(I:C) i.p., n=4; 나머지 군, n=5. 오차 막대, 평균 ± s.e.m. Holm-Sidak 다중 비교를 이용한 Log-rank: **, p < 0.01; ***, p < 0.001. 도 5c는 도 5b의 실험에서 입수한 IVIS 사진 시리즈이다. 도 5d는 EMT6-Fluc 종양에 LCL161 또는 200 ㎍ (i.t.) 및/또는 2.5 mg/kg (i.p.) CpG ODN 2216의 조합을 처리한 실험의 결과를 나타낸 그래프 쌍이다. 좌측 패널은 종양의 증식을 도시한 것이다. 우측 패널은 마우스 생존성을 도시한 카플란-마이어 곡선이다. 비히클, n=5; SMC, n= 5; 비히클+CpG i.p., n=5; SMC+CpG i.p., n=7; 비히클+CpG i.t., n=5; SMC+CpG i.t., n=8; 비히클+CpG i.p.+i.t., n=5; SMC+CpG i.p.+i.t., n=8. 오차 막대, 평균 ± s.e.m. Holm-Sidak 다중 비교를 이용한 Log-rank: *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001. 도 5e는 도 5d의 실험에서 획득된 IVIS 사진 시리즈이다.
도 6은 SMC 및 OV 조합 처리에 대한 암 세포 패널 및 정상 세포의 반응성을 나타낸 그래프이다. 나타낸 암 세포주 (n=28) 및 비-암성 인간 세포 (일차 인간 골격근 (HSkM) 및 인간 섬유모세포 (GM38))에 LCL161와 농도를 증가시키면서 VSVΔ51을 48시간 동안 처리하였다. 비히클 대비 SMC의 존재 하에 생존 세포의 50%를 달성하는데 필요한 용량을 비-선형 회귀를 사용해 측정하고, log EC50의 민감도 증가 쉬프트로서 도시하였다. 생물학적 레플리케이트를 사용한 2번 이상의 독립적인 실험의 데이터 (n=3)를 도시한다.
도 7은 SMC 및 OV 공동-처리가 암 세포에서 높은 수준으로 상승작용함을 보여주는 그래프들이다. 그래프는 고정된 비율의 VSVΔ51 및 LCL161 (PFU: μM LCL161) 조합 혼합물을 연속 희석하여 처리한 세포의 생존성을 분석한 알라마르 블루 분석 결과를 보여준다. 조합 지수 (combination index, CI)를 Calcusyn으로 계산하였다. 플롯은 감염된 세포의 분획 (function, Fa)에 대한 CI의 대수 추정치 (algebraic estimate)를 나타낸다. 오차 막대, 평균 ± s.e.m. 생물학적 레플리케이트를 이용한 3번 이상의 독립적인 실험의 데이터 (n=3)를 나타낸다.
도 8은 1가 및 2가 SMC가 OV와 상승작용하여 암 세포 사멸을 유발함을 보여주는 그래프들이다. 그래프는, 5 μM 2가 SMC (LCL161, SM-122) 또는 0.1 μM 2가 SMC (AEG40730, OICR720, SM-164) 및 여러가지 MOI의 VSVΔ51이 처리된 세포에 대한 알라마르 블루 생존성 분석의 결과를 도시한다. 오차 막대, 평균 ± s.d. 생물학적 레플리케이트를 이용한 3번 이상의 독립적인 실험의 데이터 (n=3)가 표시된다.
도 9a 및 9b는 SMC-매개 암 세포 사멸이 종양 용해성 바이러스에 의해 강화됨을 보여주는 사진 및 그래프 세트이다. 도 9a는 비히클 또는 LCL161 및 웰의 중앙에 분배되는 500 PFU의 지정된 바이러스의 존재 하에 0.7% 아가로스가 적층된 바이러스 전파 분석의 결과를 나타낸 사진 시리즈이다. 세포독성은 크리스탈 바이올렛 염색으로 분석하였다. 화살표는 OV 감염 오리진에서의 세포 사멸 존의 확장을 나타낸다. 도 9b는 LCL161 및 VSVΔ51 또는 Maraba-MG1의 MOI을 증가시키면서 처리한 세포의 알라마르 블루 생존성 분석의 결과를 나타낸 그래프 세트이다. 오차 막대, 평균 ± s.d. 생물학적 레플리케이트를 이용한 2번 이상의 독립적인 실험의 데이터 (n=3)를 나타낸다.
도 10a 및 10b는 cIAP1, cIAP2 및 XIAP가 협력하여 암 세포를 OV-유발성 세포 사멸로부터 보호함을 보여주는 그래프 및 사진 세트이다. 도 10a는 비-타겟팅 (NT) siRNA 또는 siRNA 타겟팅 cIAP1, cIAP2 또는 XIAP로 형질감염시킨 후 LCL161 및 0.1 MOI VSVΔ51을 48시간 처리한 세포의 알라마르 블루 생존성을 나타낸 것이다. 오차 막대, 평균 ± s.d. 생물학적 레플리케이트를 이용한 3번 이상의 독립적인 실험의 데이터 (n=3)를 나타낸다. 도 10b는 도 10a의 실험에서의 siRNA 효과 면역블롯을 나타낸 것이다.
도 11은 도 1g에 도시된 사진에 사용된 사진 세트이다. 세포 위에 LCL161이 포함된 아가로스 배지를 적층한 다음 웰의 중간에 VSVΔ51-GFP를 접종하였으며, 형광에 의해 측정된 감염성 및 세포독성을 크리스탈 바이올렛 (CV) 염색에 의해 보여준다. 주석: 막대는 동일한 크기를 의미함.
도 12a 및 12b는 SMC 처리가 생체내 OV 분포 또는 복제에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여주는 사진 및 그래프 세트이다. 도 12a는 EMT6-보유 마우스에 50 mg/kg LCL161 (p.o.)를 처리하고 5x108 PFU 반딧불이 루시퍼라제 테깅된 VSVΔ51 (VSVΔ51-Fluc)를 i.v. 주사한 실험에서 입수한 사진을 도시한 사진 세트이다. 바이러스 분포 및 복제를 IVIS를 사용해 24시간 및 48시간에 사진으로 촬영하였다. 윤곽선은 종양이 있는 부위를 표시한다. 2번의 독립적인 실험의 대표적인 데이터를 나타낸다. 화살표는 VSVΔ51-Fluc에 감염된 비장이다. 도 12b는 감염 후 48시간에 종양 및 조직을 균질화하고, 각 군에서 바이러스 역가 측정을 수행한 실험의 데이터를 나타낸 그래프이다. 오차 막대, 평균 ± s.e.m.
도 13a 및 13b는 비-타겟팅 (NT), TNFR1, DR5 및 IFNAR1의 siRNA-매개 넉다운을 면역블롯팅에 의해 검증한 사진이다. 도 13a는 도 3a의 실험의 샘플에서 넉다운을 보여주는 면역블롯이다. 도 13b는 도 3b의 실험의 샘플에서 넉다운을 보여주는 면역블롯이다.
도 14a-14g는 암 세포에서 SMC가 OV와 상승작용하여 카스파제-8- 및 RIP-1-의존적인 세포자살을 유도함을 보여주는 사진 및 그래프이다. 도 14의 전체 패널은 생물학적 레플리케이트를 이용한 3번의 독립적인 실험의 대표적인 데이터를 보여준다. 도 14a는 LCL161로 전처리한 다음 1 MOI의 VSVΔ51을 처리한 세포에 대해 카스파제 및 PARP 활성화에 대한 면역블롯팅을 실시한, 면역블롯 결과 사진들이다. 도 14b는 카스파제-3/7 기질 DEVD-488의 존재 하에 LCL161 및 VSVΔ51를 공동-처리한 세포에서 수집된 카스파제 활성화에 대한 현미경 사진을 나타낸 사진 시리즈이다. 도 14c는 도 14b의 실험에서 DEVD-488-양성 세포의 비율을 나타낸 그래프이다 (n=12). 오차 막대, 평균 ± s.d. 도 14d는, LCL161 및 VSVΔ51 처리 세포에서, 전좌된 포스파티딜 세린 (Annexin V-CF594) 및 원형질막 온전성 상실 (YOYO-1)에 의해 세포자살을 분석한, 실험의 사진 시리즈이다. 도 14e는 도 14d의 실험에서의 Annexin V-CF594-양성 및 YOYO-1-음성 세포자살 세포의 비율을 도시한 그래프이다 (n=9). 오차 막대, 평균 ± s.d. 도 14f는 비-타겟팅 (NT) siRNA 또는 siRNA 타겟팅 카스파제-8 또는 RIP1로 형질감염한 후 LCL161 및 0.1 MOI의 VSVΔ51 처리 세포 (n=3)의 알라마르 블루 생존성을 나타낸 그래프 쌍이다. 오차 막대, 평균 ± s.d. 도 14g는 도 14f의 실험에서의 siRNA 효능을 나타낸 면역블롯 사진이다.
도 15a 및 15b는, OV 유래 TNFα 전이유전자의 발현이 SMC-매개 암 세포 사멸을 추가로 강화함을 보여주는 그래프 세트이다. 도 15a는, 5 μM SMC와 MOI를 증가시키면서 VSVΔ51-GFP 또는 VSVΔ51-TNFα를 24시간 공동-처리한 세포의 알라마르 블루 생존성 분석을 나타낸 그래프들이다. 오차 막대, 평균 ± s.d. 도 15b는 도 15a의 실험에서 수득한 대표적인 EC50 쉬프트를 나타낸 그래프이다. 비히클 대비 SMC 존재 하에 생존 세포의 50%를 달성하는데 필요한 용량을 비-선형 회귀를 사용해 구하였으며, EC50 쉬프트로서 작성하였다. 생물학적 레플리케이트를 이용한 3번의 독립적인 실험의 대표적인 데이터가 표시된다 (n=3).
도 16은 SMC 처리시 종양 용해성 바이러스 감염이 TNFα 발현 증가를 유발함을 보여주는 사진 세트이다. EMT6 세포에 5 μM SMC 및 0.1 MOI VSVΔ51-GFP를 24시간 공동-처리하고, 유세포 측정을 통한 세포내 TNFα 존재 분석을 위해 세포를 처리하였다. 사진은 4번의 독립적인 실험의 대표적인 데이터를 보여준다.
도 17a-17c는 TNFα 신호전달이 SMC 처리와 타입 I IFN 유발성 상호작용에 필수적임을 보여주는 그래프 및 사진 쌍이다. 도 17의 전체 패널은 생물학적 레플리케이트를 사용한 3번 이상의 독립적인 실험의 데이터 (n=3)를 보여준다. 도 17a는 비-타겟팅 (NT) 또는 TNF-R1 siRNa로 형질감염된 후 LCL161 및 VSVΔ51 (0.1 MOI) 또는 IFNβ로 처리된 EMT6 세포의 알라마르 블루 생존성 분석 결과를 나타낸 그래프이다. 오차 막대, 평균 ± s.d. 도 17b는 도 17a의 실험의 대표적인 siRNA 효과를 보여주는 블롯이다. 도 17c는 TNFα 중화 항체로 전처리 후 5 μMSMC 및 VSVΔ51 또는 IFNβ로 처리된 EMT6 세포의 생존성을 나타낸 그래프이다.
도 18a 및 18b는 방관자 (bystander) 암 세포 사멸에 있어 OV-유발성 타입 I IFN 및 SMC 상호작용을 보여주는 개략도이다. 도 18a는 난치성 암 세포에서 바이러스 감염이 타입 I IFN의 생산을 유도하고, 후속적으로 IFN 자극된 유전자, 예를 들어 TRAIL의 발현을 유도함을 나타낸 개략도이다. 타입 I IFN 자극은 또한 NF-κB-의존적인 TNFα의 생산을 유발한다. SMC 처리에 의한 IAP 길항작용이 이웃한 종양 세포의 TNFα 및 TRAIL 발현의 상향 조절 및 세포자살을 유도한다. 도 18b는 하나의 종양 세포의 감염이 선천적인 항바이러스성 타입 I IFN 경로를 활성화하여, 타입 I IFN이 이웃 세포로의 방출됨을 도시한 개략도이다. 이웃한 세포는 또한 전염증성 사이토카인 TNFα 및 TRAIL을 생산하게 된다. 감염으로만 단독 처리된 세포는 종양 용해로 진행되고, 나머지 종양 덩어리는 온전한 상태를 유지한다. 한편, 이웃한 세포는 SMC-매개의 TNFα/TRAIL의 상향 조절 및 전염증성 사이토카인 활성화시 세포자살 촉진의 결과로서, SMC 처리로 인해 방관자 세포 사멸을 겪게 된다.
도 19a 및 19b는 SMC 처리가 최소한의 일시적인 중량 감소를 유발하며, cIAP1/2의 하향 조절을 유도함을 보여주는 블롯 및 그래프이다. 도 19a는 LCL161 처리된 BALB/c 암컷 마우스 (50 mg/kg LCL161, p.o.)의 1회 처리 (0일) 후 기록된 체중 감소를 도시한 그래프이다. n=5 /그룹. 오차 막대, 평균 ± s.e.m. 도 19b는 EMT6-종양 보유 마우스에 50 mg/kg LCL161 (p.o.)을 처리한 실험에서 샘플에 대한 블롯 결과를 나타낸다. 지정 항체로 웨스턴 블롯팅하기 위해 지정된 시간에 종양을 회수하였다.
도 20a-20c는 SMC 처리가 동계 마우스 암 모델에서 일시적인 체중 감소를 유도함을 보여주는 그래프 세트이다. 도 20a-20c는 SMC 및 종양 용해성 VSV (도 20a), 폴리(I:C) (도 20b) 또는 CpG (도 20c)를 도 4a, 5b 및 5d 각각에 기술된 실험의 종양-보유 동물에 공동-처리하였을 때 마우스의 체중 측정치를 나타낸 그래프이다. 오차 막대, 평균 ± s.e.m.
도 21a-21d는 HT-29 세포에서 VSVΔ51-유발성 세포 사멸이 SMC 처리에 의해 시험관내 및 생체내에서 강화됨을 보여주는 그래프 시리즈이다. 도 21a는, 세포를 VSVΔ51로 감염시키고, 세포 배양 상층액을 1시간 동안 UV 광에 노출한 후 지정된 용량으로 새로운 세포에 LCL161의 존재 하에 적용한, 실험의 데이터를 나타낸 그래프이다. 생존성은 알라마르 블루로 검증하였다. 오차 막대, 평균 ± s.d. 도 21b는 LCL161 및 비-전파성 바이러스 VSVΔ51ΔG (0.1 MOI)로 공동-처리된 세포의 알라마르 블루 생존성 분석 결과를 나타낸 그래프이다. 오차 막대, 평균 ± s.d. 도 21a 및 21b는 생물학적 레플리케이트를 이용한 3번의 독립적인 실험의 대표적인 데이터를 나타낸다 (n=3). 도 21c는 확립된 HT-29 종양을 가진 CD-1 누드 마우스에 50 mg/kg LCL161 (p.o.) 및 1x108 PFU VSVΔ51 (i.t.)을 처리한 실험의 데이터를 나타낸 그래프들이다. 비히클, n=5; VSVΔ51, n=6; SMC, n=6; VSVΔ51+SMC, n=7. 좌측 패널은 처리 후 0일 대비 종양의 증식을 도시한 것이다. 우측 패널은 마우스 생존성을 도시한 카플란-마이어 곡선이다. 오차 막대, 평균 ± s.e.m. Holm-Sidak 다중 비교를 이용한 Log-rank: ***, p < 0.001. 도 21d는 종양-보유 동물에서 SMC 및 OV 공동-처리시 마우스의 체중 측정치를 나타낸 그래프이다. 오차 막대, 평균 ± s.e.m.
도 22는 타입 I IFN 신호전달이 생체내 SMC 및 OV 상승작용에 필요하다는 것을 보여주는 블롯 결과이다. EMT6 종양 보유 마우스에 비히클 또는 50 mg/kg LCL161을 4시간 처리한 다음 IFNAR1 중화 항체 또는 이소형 항체를 20시간 처리하였다. 그런 후, 동물에 PBS 또는 VSVΔ51을 18시간 처리하였다. 지정된 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅을 위해 종양을 처리하였다.
도 23a 및 23b는 선천적인 면역 세포의 종양 용해성 감염이 SMC의 존재 하에 암 세포 사멸을 유도함을 보여주는 그래프들이다. 도 23a는 비장 세포로부터 면역 하위집단을 분류 (CD11b+ F4/80+: 대식세포; CD11b+ Gr1+: 호중구; CD11b- CD49b+: NK 세포;1b- CD49b-: T 및 B 세포)한 다음 1 MOI의 VSVΔ51을 24시간 감염시킨, 실험의 데이터를 나타낸 그래프이다. 세포 배양 상층액을 SMC-처리된 ETM6 세포에 24시간 적용한 다음 EMT6 생존성을 알라마르 블루에 의해 분석하였다. 오차 막대, 평균 ± s.d. 도 23b는 골수 유래 대식세포를 VSVΔ51로 감염시키고 상층액을 5 μM SMC의 존재 하에 EMT6 세포에 적용한 다음 생존성을 알라마르 블루에 의해 측정한, 실험의 데이터를 나타낸 차트이다. 오차 막대, 평균 ± s.d.
도 24a-24h는 전체 면역블롯 (full-length immunoblot)의 사진 시리즈이다. 도 24a-24h의 면역블롯은 각각 (a) 도 2E, (b) 도 4E, (c) 도 10B, (d) 도 13, (e) 도 14A, (f) 도 14G, (g) 도 19 및 (h) 도 17에 대한 것이다.
도 25a 및 25b는 비-복제성 랍도바이러스-유래 입자 (NRRP)가 SMC와 상승작용하여 암 세포 사멸을 유발함을 보여주는 그래프 세트이다. 도 25a는 EMT6, DBT 및 CT-2A 암 세포에 SMC LCL161 (SMC; EMT6: 5 μM, DBT 및 CT-2A: 15 μM) 및 다양한 수의 NRRP를 48 hr (EMT6) 또는 72 hr (DBT, CT-2A) 처리하고, 세포 생존성을 알라마르 블루에 의해 분석한, 실험의 데이터를 나타낸 그래프 세트이다. 도 25b는, 비-분획화된 마우스 비장 세포를 세포 당 NRRP 입자 1개 또는 250 μM CpG ODN 2216와 함께 24시간 인큐베이션한, 실험의 데이터를 나타낸 그래프들이다. 이후, 상층액을 EMT6 세포에 용량-의존적인 방식으로 적용하였으며, 5 μM LCL161을 첨가하였다. EMT6 생존성은 알라마르 블루에 의해 처리 후 48시간에 분석하였다.
도 26a 및 26b는 백신이 SMC와 상호작용하여 암 세포 사멸을 유도함을 보여주는 그래프와 사진 세트이다. 도 26a는, EMT6 세포에 비히클 또는 5 μM LCL161 (SMC) 및 1000 CFU/mL BCG 또는 1 ng/mL TNFα를 48시간 처리하고 생존성을 알라마르 블루에 의해 분석한, 실험의 데이터를 나타낸 그래프이다. 도 26b는, 비히클 또는 50 mg/kg LCL161 (SMC)로 처리되고, PBS 종양내 (i.t.), BCG (1x105 CFU) i.t., 또는 BCG (1x105 CFU) 복막내 (i.p.) 투여된, 유방 지방 패드 종양 (EMT6-Fluc)을 가진 마우스의 생존성을 나타낸 IVIS 사진 세트로서, IVIS CCD 카메라를 사용해 살아있는 종양 생발광 사진을 다양한 시간대에 측정하였다. 스케일: p/sec/cm2/sr.
도 27a 및 27b는 SMC가 타입 I IFN과 상호작용하여 유방 종양의 퇴행을 유발함을 보여주는 그래프들과 사진 세트이다. 도 27a는 마우스의 유방 지방 패드에 EMT6-Fluc 종양을 주사한 다음 이식 후 8일에 비히클 또는 50 mg/kg LCL161 (SMC) (경구로), 그리고 소 혈청 알부민 (BSA), 1 ㎍ IFNα 복막내 (i.p.) 또는 2 ㎍ IFNα 종양내 (i.t.)을 처리하는 조합 처리된, 실험의 데이터를 나타낸 그래프들이다. 좌측 패널은 종양의 증식을 도시한 것이다. 우측 패널은 마우스 생존성을 도시한 카플란-마이어 곡선이다. 오차 막대, 평균 ± s.e.m. 도 27b는 도 27a에 기술된 실험의 IVIS 사진 시리즈이다. 스케일: p/sec/cm2/sr.
도 28a-28c는 VSV-IFNβ 또는 VSV가 SMC와 상호작용하여 암 세포 사멸을 유발함을 나타낸 그래프이다. 도 28a는 EMT6 세포에 비히클 또는 5 μM LCL161 (SMC) 및 여러가지 MOI (multiplicity of infection)의 VSVΔ51-GFP, VSV-IFNβ 또는 VSV-NIS-IFNβ를 처리한 실험의 데이터를 도시한 것이다. 세포 생존성은 알라마르 블루에 의해 48시간에 분석하였다. 도 28b는 EMT6 유방 종양 보유 마우스에 비히클 또는 50 mg/kg LCL161 (SMC) (경구) 및 PBS 또는 1x108 PFU의 VSV-IFNβ-NIS (종양내)를 2번 처리한 실험의 그래프들이다. 도 28c는 EMT6 유방 종양 보유 마우스에 비히클 또는 50 mg/kg LCL161 (경구) 및 1x108 PFU의 VSV (종양내)를 2회 처리한 실험의 그래프들이다.
도 29는 비-바이러스성 촉발제 및 바이러스성 촉발제가 생체내 견고한 TNFα의 발현을 유도함을 나타낸 그래프이다. 마우스에 50 mg의 폴리(I:C)를 복막내로 또는 5x108 PFU VSVΔ51, VSV-mIFNβ 또는 Maraba-MG1을 복막내 주사하여 처리하였다. 지정된 시간에, 혈청을 분리하고, TNFα의 수준을 정량하기 위한 ELISA 분석을 위해 처리하였다.
도 30a-30c는 바이러스에서 발현된 전염증성 사이토카인이 SMC와 상승작용하여 유방 종양의 퇴행을 유도함을 나타낸 그래프 및 사진 세트이다. 도 30a는 마우스의 유방 지방 패드에 EMT6-Fluc 종양을 주사한 다음 이식 후 7일에 비히클 또는 50 mg/kg LCL161 (SMC) (경구) 및 PBS, 1x108 PFU VSVΔ51-memTNFα (i.v.) 또는 1x108 PFU VSVΔ51-solTNFα (i.v.)을 조합 처리한, 실험의 데이터를 나타낸 그래프 쌍이다. 좌측 패널은 종양의 증식을 도시한 것이다. 우측 패널은 마우스 생존성을 도시한 카플란-마이어 곡선이다. 오차 막대, 평균 ± s.e.m. 도 30b는 도 30a에 기술된 실험에서 획득한 IVIS 생발광 사진 세트이다. 스케일: p/sec/cm2/sr. 도 30c는 마우스에 피하로 CT-26 종양을 주입하고, 이식 후 10일에 비히클 또는 50 mg/kg LCL161 (경구) 및 PBS 또는 1x108 PFU VSVΔ51-solTNFα (종양내) 조합 처리한, 실험의 데이터를 나타낸 그래프 쌍이다. 좌측 패널은 종양의 증식을 도시한 것이다. 우측 패널은 마우스 생존성을 도시한 카플란-마이어 곡선이다. 오차 막대, 평균 ± s.e.m.
도 31a 및 31b는 정위, 동계 마우스 교모세포종 모델에서 SMC가 생체내에서 cIAP1/2 단백질의 하향 조절을 유발함을 나타낸 사진 세트이다. 도 31a는 CT-2A 세포를 두개강내 이식한 다음 LCL161 (SMC)를 경구로 50 mg/kg 처리하고, 지정된 시점에 종양을 적출하여 cIAP1/2, XIAP 및 β-튜불린 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅으로 가공 처리한 실험의 면역블롯 결과를 나타낸 사진이다. 도 31b는 CT-2A 세포를 두개강내 이식한 다음 100 μM LCL161을 종양내 10 ㎕ 처리하고, 지정된 시점에 종양을 적출하여 cIAP1/2, XIAP 및 β-튜불린 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅으로 가공 처리한 실험의 면역블롯 결과를 나타낸 사진이다.
도 32a-32e는 뇌에서의 일시적인 전염증성 반응이 SMC와 상호작용하여 교모세포종의 세포 사멸을 유발함을 나타낸 그래프 및 사진 세트이다. 도 32a는 12시간 또는 24시간 동안 복막내 (i.p.) PBS 또는 50 mg 폴리(I:C)가 주사된 마우스로부터 유래된 뇌 단백질 조 추출물 300 mg에서 용해성 TNFα 수준을 측정하기 위해 ELISA를 수행한 실험의 데이터를 나타낸 그래프이다. 뇌 단백질 추출물은 식염수 중에 기계적 균질화에 의해 수득하였다. 도 32b는 뇌 조 균질물 70 mg 및 5 μM LCL161 (SMC)이 배양시 48시간 처리된 마우스 교모세포종 세포 (CT-2A, K1580)의 알라마르 블루 생존성 분석 데이터를 나타낸 그래프이다. 뇌 균질물은 12시간 동안 폴리(I:C) i.p. 주사 또는 5x108 PFU VSVΔ51 또는 VSV-mIFNβ 정맥내 주사로 처리된 마우스로부터 수득하였다. 도 32c는 두개강내 50 mg 폴리(I:C)로 3번 처리된 마우스의 생존성을 나타낸 카플란-마이어 곡선이다. 처리는 0일, 3일 및 7일에 수행하였다. 도 32d는 SMC, VSVΔ51 또는 폴리(I:C)가 조합 처리된 CT-2A 두개강내 종양을 가진 마우스의 생존성을 나타낸 카플란-마이어 곡선이다. 마우스에는, 비히클 3회 처리, 75 mg/kg LCL161 (경구) 3회 처리, 5x108 PFU VSVΔ51 (i.v.) 3회 처리 또는 50 mg 폴리(I:C) (두개강내, i.c.) 3회 처리가 조합 실시되었다. 종양 세포 이식 후 7일, 10일 및 14일 후 서로 다른 조건에서 마우스에 처리하였으며, 단, 폴리(I:C) 처리군에는 7일 및 15일에 i.c.로 주사하였다. 괄호 안 숫자는 그룹 당 마우스의 수를 나타낸다. 도 32e는 도 32d에 기술된 실험의 마우스 머리를 MRI 촬영한 사진 시리즈로서, 엔드포인트 시의 동물과, 이식 후 50일째의 지정된 군의 마우스 동물이다. 점선은 뇌암을 표시한다.
도 33은 SMC가 타입 I IFN과 상승작용하여 뇌암을 제거함을 나타낸 그래프이다. 그래프는 이식 후 7일에 PBS 또는 IFNα 1 ㎍과 함께 비히클 또는 100 μM LCL161 (SMC)이 두개강내 주사된 CT-2A 보유 마우스의 생존성을 나타낸 카플란-마이어 곡선이다.
도 34는 NF-κB 신호전달 경로를 나타낸 개괄도이다. 리간드가 TNF 패밀리 수용체에 결합하면, 클래식 (classical) 또는 얼터너티브 경로가 cIAP1/2의 활성도에 따라 활성화된다. 클래식 NF-κB가 활성화되면, RIP1이 cIAP1/2로부터 K63 유비퀴틴를 받아 결합하여 신호전달 복합체를 형성하게 되고, 이로써 IκB-inase (IKK)의 활성화 후 κB (IκB) 저해제는 인산화된다. 인산화된 IκB가 분해되어 p50/p65 헤테로다이머로 분리된다. 얼터너티브 경로는 NF-κB 유도성 키나제 (NIK)의 cIAP1/2 K48 연계된 유비퀴틴화에 의해 불활성 상태로 유지된다. NIK가 안정되면, IKK 및 하류 p100의 인산화가 이루어지고, p100이 p52로 처리된다. 이 경로는, 타겟 유전자의 발현을 조절하기 위한 전사 인자로서 작용하기 위해, NF-κB 헤테로다이머가 핵으로 이동하는 것으로 끝난다.
도 35a-35c는 뮤라인 MM 모델에서 PD-1 지연성 질환 진행 및 연장된 생존성에 대한 SMC와 단일클론 항체의 조합 처리 결과를 나타낸 것이다. 도 35a는 2주간 주당 3회로 250 ㎍ ICI 및 50 mg/kg 처리된, MPC-11 Fluc 세포를 가진 마우스의 사진을 도시한 것이다. 마우스에 SMC 및 PD-1 또는 CTLa-4 단일클론 항체를 처리한다. anti-PD-1 및 SMC으로 조합 처리된 마우스는, 세포 이식 후 경과 일수에 따른 암 부하 (burden)를 IVIS 생발광 사진으로 측정하여 확인된 바와 같이, 종양 부하가 거의 없었다. 도 35b는 anti-PD-1, anti-CTLA-4 및 SMC를 이용한 치료 용법을 보여준다. 도 35c는 카플란-마이어 곡선으로 나타낸, MPC-11 Fluc 세포 이식 후 마우스의 생존 일수를 나타낸 그래프이다.
도 36a-36c는 선천적인 면역 자극제가 SMC와 상승작용하여 MM 세포 사멸을 유발함을 나타낸 그래프 시리즈이다. 도 36a는 비히클 또는 5 μM SMC의 존재 하에 1 U/μL IFNα, IFNβ 및 IFNγ로 처리된 인간 세포주 U266, MM1R 및 MM1S의 생존성을 나타낸 일련의 막대 그래프이다. 생존성은 24시간 후 트리판 블루 배제에 의해 측정하였다. 도 36b 및 도 36c는 5 μM SMC 및 각각의 다양한 수준의 MOI의 VSVΔ51 및 VSVmIFN으로 처리된 뮤라인 MM 세포주 MPC-11의 생존성을 나타낸 그래프이다. 생존성은 24시간 후 알라마르 블루로 측정하였다.
도 37a-37c는 IFN 및 SMC가 상승작용하여 마우스에서 MM 질환 진행을 지연시킴을 나타낸 것이다. MPC-11 Fluc 세포를 보유한 마우스에 재조합 IFNα 1 ㎍ 및 50 mg/kg SMC를 3회 처리하였다. 도 37a는 MM 세포 이식 후 지정된 경과 일에 수득한 일련의 IVIS 생발광 암 부하 사진이다. 도 37b는 생존 기간을 도시한 카플란-마이어 곡선이다. 도 37c는 처리 용법을 나타낸 개략도이다.
도 38a-38c는 종양 용해성 바이러스가 MM 질환의 진행을 지연시키고 생존성을 증가시킬 수 있음을 나타낸 것이다. 도 38a는 5x108 pfu VSVΔ51 및 50 mg/kg SMC로 4번 처리된 MPC-11 Fluc 세포 보유 마우스에서 이식 후 지정된 일에 취한 IVIS 생발광 사진이다. 도 38b는 생존 기간을 나타낸 카플란-마이어 곡선이다. 도 38C는 처리 용법을 나타낸 것이다.
도 39a-39c는 글루코코르티코이드 수용체 리간드가 SMC와 상호작용하여 SMC-매개 세포 사멸에 내성인 세포주를 감작화함을 나타낸 것이다. 도 39a는 웨스턴 블롯팅을 위해 MM1R 및 MM1S 세포로부터 추출한 단백질을 개략적으로 도시한 것으로, 동량의 단백질이 사용되었다. 도 39b 및 39c는 지정된 기간 동안 5 μM SMC, 10 μMDex 및 10 μMRU486로 처리된 세포를 나타낸 그래프로서, 사멸 세포는 세포 비-투과성 DNA 결합 염료인 YOYO-1 양성으로서 측정하였으며, 웰내 세포의 컨플루언시에 대해 정규화 (normalization)하였다.
도 40a-40c는 SMC가 NF-κB 신호전달을 증가시키고 세포자살을 유도함을 나타낸 것이다. 인간 MM 세포주 MM1R 및 MM1S에 5 μM SMC를 처리한 다음 1, 16 또는 48시간 후에 수집하였다. 도 40a는 NF-κB 경로의 다양한 구성 요소들에 대한 웨스턴 블롯 결과이다. 도 40b 및 40c는 도 40a의 밴드를 각각 p-p65 : p65의 비율 및 p52:p100로 정량한 결과로서, 비처리 대조군에 대해 정규화하였다.
도 41은 SMC 및 IFNβ 조합 처리가 NF-κB 활성을 증가시켜 세포자살을 유발함을 나타낸 것이다. 인간 세포주 U266, MM1R 및 MM1S와 뮤라인 세포주 MPC-11 및 Fluc 테깅된 하위주 (subline)에 5 μM SMC 및 1 U/μL IFNβ를 1시간 또는 16시간 처리하였다. 세포 펠릿을 수확하고, 세포용해물을 웨스턴 블롯팅을 위해 동일하게 로딩하였다.
도 42a-42c는 종양 용해성 바이러스가 SMC와 조합하여 NF-κB 신호전달을 활성화함으로써 뮤라인 MM 세포에서 세포자살을 유도함을 나타낸 것이다. MPC-1 세포에 VSVΔ51 또는 VSVmIFN를 1시간, 12시간 또는 24시간 처리하였다. 도 42a는 세포 펠릿을 회수하여 세포용해물을 웨스턴 블롯팅을 위해 동일하게 로딩한, 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 것이다. 도 42b 및 42c는 포스포-p65 : p65 또는 p52 : p100 비율로서 각각 나타낸, 도 42a의 밴드에서 정량된 단백질 수준을 도시한 것이다.
도 43은 IFNβ 처리 후 인간 MM 세포주에서 PD-L1 및 PD-L2 발현이 증가됨을 나타낸 것이다. PD-L1 및 PD-L2 mRNA 발현은 비-처리 대조군 대비 IFNβ 또는 IFNβ 및 SMC 처리 후 6, 12 및 24시간째에 증가한다.
도 44a-44d는 SMS 및 면역조절성 물질의 조합이 CD8+ T 세포를 또한 수반하는 암 세포의 사멸을 유발함을 나타낸 그래프이다. 도 44a 및 44b는 이중 처리에 의해 치유된 동물에 EMT6 세포를 유방 지방 패드에 재-주사하거나 (이식 후 첫날부터 180일) 또는 CT-2A 세포를 두개강내 재-주사 (이식 후 첫날부터 190일)한, 실험의 데이터를 도시한 그래프이다. 도 44c는, CT-2A 신경교종 또는 EMT6 유방암 세포에 트립신을 처리하고, 접합된 이소형 대조군 IgG 또는 anti-PD-L1으로 표면 염색한 후 유세포 측정 처리한, 실험의 데이터를 나타낸 그래프이다. 도 44d는, CD8+ T-세포를 CD8 T-세포 양성 자기 선별 키트를 이용해 (naive 마우스 또는 사전에 EMT6 종양이 치유된 마우스의) 비장 세포로부터 농화한 다음, IFNγ 및 Granzyme B 검출을 위해 ELISpot 분석을 수행한, 실험의 데이터를 나타낸 그래프이다. CD8+ T-세포를 배지 또는 암 세포 (암 세포 : CD8+ T-세포 12:1) 및 대조군 IgG 또는 anti-PD-1 10 mg과 48시간 동안 공-배양하였다. 마우스 3마리를 독립적인 생물학적 레플리케이트로 사용하였다 (이전에 EMT6 종양 치유됨). 4T1 및 EMT6 세포는 동일한 주 조직적합성 항원을 가지고 있어, 4T1 세포가 음성 대조군으로 사용된다.
도 45a-45d는 SMC가 정위 마우스 암 모델에서 면역 체크포인트 저해제와 상승작용함을 나타낸 도래프이다. 도 45a는 EMT6 유방 종양 보유 마우스에 PBS 또는 1x108 PFU VSVD51을 종양내 1회 처리하고, 5일 후 마우스에 비히클 또는 50 mg/kg LCL161 (SMC) (경구) 및 250 mg의 anti-PD (복막내, i.p.)를 조합 처리한 실험의 데이터를 나타낸 그래프이다. 도 45b 및 45c는 두개강내 CT-2A 또는 GL261을 보유한 마우스에 비히클 또는 75 mg/kg LCL161 (경구) 및 250 mg (i.p.)의 대조군 IgG, anti-PD-1 또는 anti-CTLA-4를 4번 처리한 실험의 데이터를 나타낸 그래프이다. 도 45d는, CT-2A 두개강내 종양을 가진 무-흉선 CD-1 누드 마우스에 75 mg/kg LCL161 (경구) 및 250 mg (i.p.) anti-PD-1을 처리한 실험의 데이터를 나타낸 그래프이다.
도 46a-46c는 SMC가 사이토카인 또는 종양 용해성 바이러스의 존재 하에 교모세포종 세포의 사멸을 유도함을 나타낸 그래프이다. 비히클 또는 5 μM LCL161 (SMC) 및 TNF-α 0.1 ng/mL 또는 0.01 MOI의 VSVΔ51로 48시간 처리된 인간 (M059K, SNB75, U118) 및 마우스 (CT-2A, GL261) 교모세포종 세포에 대한 알라마르 블루 생존성 분석 (도 46a). 오차 막대, 평균, s.d. n = 4. 지정된 일차 마우스 NF1-/+p53-/+ 세포주에 비히클 또는 5 μM LCL161 (SMC) 및 0.01% BSA, 1 ng/mL TNF-α 또는 표시된 MOI의 비-전파 형태 VSVΔ51 (VSVΔ51ΔG)을 48시간 처리하고, 생존성을 알라마르 블루에 의해 분석하였다 (도 46b). 오차 막대, 평균, s.d. n = 4. 비히클 또는 5 μM LCL161 및 0.001 MOI의 VSVΔ51 또는 Maraba-MG1으로 48시간 처리된 인간 뇌암 개시 세포 (BTIC)에 대한 알라마르 블루 생존성 분석 (도 46c). 오차 막대, 평균, s.d. n = 3. 도 46a 및 46b는 생물학적 레플리케이트를 이용한 3번의 독립적인 실험의 대표적인 데이터를 나타낸다. 통계학적 유의성은 듀넷의 다중 비교 검사를 이용한 ANOVA로 비히클 및 BSA 처리군과 비교하였다. p < 0.0001 (*)이면 유의한 것으로 기록하였다.
도 47은 SMC가 TNF-α와 상승작용하여 교모세포종 세포의 사멸을 유도함을 보여주는 그래프이다. 0.01% BSA 또는 0.1 ng/mL TNF-α 및 비히클 또는 5 μM의 지정된 모노머 또는 다이머의 48시간 처리에 따른 마우스 교모세포종 CT-2A 세포의 생존성. 생존성은 알라마르 블루에 의해 분석하였다. 오차 막대, 평균, s.d. n = 4. 생물학적 레플리케이트를 이용한 2번의 독립적인 실험에서 수득한 데이터. 통계학적 유의성은 듀넷의 다중 비교 검사를 이용한 ANOVA로 비히클 및 BSA 처리군과 비교하였다. p < 0.0001 (*)이면 유의한 것으로 기록하였다.
도 48a 및 48b는 교모세포종 세포에서 SMC-기반의 조합물에 대한 내성이 cFLIP의 하향 조절로 회피됨을 보여주는 일련의 그래프 및 사진이다. 일차 마우스 NF1-/+p53-/+ (K5001) 또는 인간 (SF539) 교모세포종 세포 또는 인간 비-형질감염 세포 (GM38)를 48시간 동안 비-타겟팅 (NT) 또는 cFLIP siRNA로 형질감염한 다음 비히클 또는 5 μM LCL161 (SMC) 및 BSA, 0.1 ng/mL TNF-α 또는 지정된 MOI의 비-전파 버전 VSVΔ51을 48시간 처리하였다 (VSVΔ51ΔG; 도 48A). 생존성은 알라마르 블루에 의해 확인하였다. 오차 막대, 평균, s.d. n = 4. 생물학적 레플리케이트를 이용한 3번의 독립적인 실험의 대표적인 데이터가 표시된다. 통계학적 유의성은 듀넷의 다중 비교 검사를 이용한 ANOVA로 비히클 및 BSA 처리군과 비교하였다. p < 0.0001 (*)이면 유의한 것으로 기록한다. 실험에서 NT siRNA 또는 siRNA 타겟팅 cFLIP 효과 (도 48b).
도 49a 및 49b는 마우스의 교모세포종 동계 정위 모델의 확립 결과를 나타낸 사진이다. PBS 또는 5x104 CT-2A 세포를 두개강내 주사하고, 이식 후 35일에 안락사한 C57BL/6 마우스의 MRI 사진 (도 49a) 및 전체 사진 (도 49b)을 도시한다. 스케일 바, 2 mm. 자는 cm이고, mm 단위가 표시된다.
도 50a 및 50b는 SMC가 교모세포종의 치료에 있어 선천적인 면역자극성 물질과 상승작용함을 나타낸 그래프이다. 스케일 바, 2 mm. 비히클 또는 5 μM LCL161 및 0.01% BSA 또는 1 ㎍/mL IFN-αB/D로 처리된 CT-2A 세포의 알라마르 블루 생존성 분석. 오차 막대, 평균, s.d. n = 4 (도 50a). 7일된 두개강내 CT-2A 종양을 가진 마우스에 75 mg/kg LCL161 (경구) 및 BSA 또는 IFN-α 1 ㎍ B/D (i.p.; 도 50b)를 조합 처리하였다. 도 50b는 마우스 생존성을 나타낸 카플란-마이어 곡선을 도시한 것이다. Holm-Sidak 다중 비교를 이용한 Log-rank: **, p < 0.01; ***, p < 0.001. 괄호 안 숫자는 그룹 당 마우스의 수를 표시한다.
도 51은 SMC 처리가 종양이 없는 마우스 유래 뇌 조직에서는 IAP의 하향 조절을 유도하지 않음을 보여주는 사진이다. 마우스에 지정된 기간 동안 LCL161 (SMC)을 75 mg/kg으로 처리하고, 지정된 항체를 사용해 웨스턴 블롯팅을 위해 조직을 가공 처리하였다. 각 시점에, n = 2.
도 52a-52c는 SMC-기반의 조합이 장기간 면역학적 항-종양 기억을 형성함을 나타낸 그래프이다. CT-2A 세포에 비히클 또는 5 μM LCL161 (SMC) 및 0.01% BSA, 1 ng/mL TNF-α, 250 U/mL IFN-β 또는 0.1 MOI의 VSVΔ51을 24시간 처리하고, 생존 세포 (Zombie Green 음성)를 지정된 항체를 사용해 유세포 측정에 의해 분석하였다 (도 52a). 생물학적 레플리케이트를 이용한 3번의 독립적인 실험에서 수득한 데이터를 나타낸다. naive 마우스 또는 유방 지방 패드 EMT6 (유방암종, 도 52b) 또는 두개강내 CT-2A (교모세포종, 도 52c)에 대한 SMC-기반의 치료로 이미 치유된 마우스에, EMT6 또는 유방암종 4T1 세포를 유방 지방 패드 내에 재-주사하거나 또는 CT-2A 세포를 피하 (s.c.) 또는 두개강내 (i.c.)로 재-주사하였다. 일차 이식 후 180일째에 세포를 이식하였다. 데이터는 마우스 생존성을 도시한 카플란-마이어 곡선으로 나타낸다. Holm-Sidak 다중 비교를 이용한 Log-rank (이식 방법에 따라 비교): *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001. 괄호 안 숫자는 그룹 당 마우스의 수를 나타낸다.
도 53은 SMC 처리가 체크포인트 저해제 분자 또는 MHC I/II 단백질의 발현을 방해하지 않는다는 것을 보여주는 그래프이다. SNB75 세포에 비히클 또는 5 μM LCL161 (SMC) 및 1 ng/mL TNF-α, 250 U/mL IFN-β 또는 0.1 MOI의 VSVΔ51을 24시간 처리하였으며, 생존 세포 (Zombie Green 음성)를 지정된 항체를 사용하여 유세포 측정하기 위해 가공 처리하였다.
도 54a-54g는 마우스의 교모세포종 모델에서 SMC가 면역체크포인트를 타겟팅하는 항체와 상승작용함을 나타낸 그래프이다. 나이브 마우스 또는 CT-2A 종양이 이미 치유된 마우스로부터 비장 CD8+ T-세포를 농화하고, IFN-γ 및 GrzB를 검출하기 위해 ELISpot 분석을 수행하였다. 암 세포 (CT-2A, LLC)를 CD8+ 세포 (비율 25:1) 및 대조군 IgG 10 ㎍/mL 또는 α-PD-1과 48시간 동안 공-배양하였다. n = 4, 마우스/그룹 (도 54a). 유의성은, 듀넷의 다중 비교 검사를 이용한 ANOVA로 분석한 바와 같이, CT-2A 세포와 공-배양한 나이브 CD8+ T-세포와 비교하였다. *, p < 0.05; *, p < 0.01; ***, p < 0.001. 두개강내 CT-2A 종양을 가진 마우스에 이식한 다음 14, 16, 21 및 23일에 75 mg/kg LCL161 (SMC)을 경구 처리하였다 (도 54b). 종양 덩어리에서 생존 세포를 CD45 (BV605), CD3 (APC-Cy7), CD8 (PE) 및 PD-1 (BV421) 검출을 위해 유세포 측정으로 분석하였다. 각 쌍의 통계학적 유의성을 t-검정으로 분석하였다. *, p < 0.05; **, p < 0.01 (도 54c). 실험에서 살아있는 종양 세포를 항체 CD45 (PE) 및 PD-L1 (BV421; 도 54c)를 이용한 유세포 측정에 의해 분석하였다. n = 6, 마우스/그룹. FMO (fluorescence minus one). 통계학적 유의성은 t-검정으로 분석하였다. 두개강내 CT-2A (도 54d, 54f 및 54g) 또는 GL261 (도 54e) 종양을 가진 마우스에, 비히클, 75 mg/kg LCL161 (경구) (도 54d, 54e 및 54g) 또는 비히클 또는 30 mg/kg Birinapant (복막내) (i.p.; 도 54f) 및 250 ㎍의 IgG, α-PD-1 또는 α-CTLA4 (i.p.) 또는 조합물 (도 54g)을 지정된 시점에 처리하였다. 데이터는 마우스 생존성을 도시한 카플란-마이어 곡선이다. Holm-Sidak 다중 비교를 이용한 Log-rank: *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001. 괄호 안 숫자는 그룹 당 마우스의 수이다. 도 54a-54c에서, +는 평균이고, 수평 실선은 중간값이고, 박스는 25분위수에서 75분위수까지를 표시하며, 휘스커 (whisker)는 값들의 최소-최고 범위를 표시한다. 도 54d는 2번의 독립적인 실험에서 수득한 데이터를 나타낸다.
도 55는 SMC가 CD8 T-세포에서 PD-1의 상향 조절을 유발함으로 보여주는 일련의 그래프이다. 두개강내 CT-2A 종양을 가진 마우스에 이식 후 14일, 16일, 21일 및 23일에 75 mg/kg LCL161 (SMC)를 경구로 처리하였다. CT-2A 종양에서 생존 세포를 항체 CD45 (BV605), CD3 (APC-Cy7), CD8 (PE) 및 PD-1 (BV421)를 사용하여 유세포 측정하기 위해 가공 처리하였다.
도 56a 및 56b는 SMC가 다발성 골수종의 마우스 모델을 치료하는데 있어 면역 체크포인트 저해제와 상승작용함을 나타낸 그래프이다. MPC-11 세포에 비히클 또는 5 μM LCL161 (SMC) 및 0.1 ng/mL TNF-α, 250 U/mL IFN-α, 또는 250 U/mL IFN-β를 처리하였다 (도 56a). 처리 후 48시간에 알라마르 블루에 의해 생존성을 확인하였다. 오차 막대, 평균, s.d. n= 4. 통계학적 유의성은 듀넷의 다중 비교 검사를 이용한 ANOVA로 비히클 및 BSA 처리군과 비교하였다. p < 0.0001 (***)이면 유의한 것으로 기록한다. 생물학적 레플리케이트를 이용한 3번의 독립적인 실험의 대표적인 데이터가 표시된다. MPC-11 세포를 분리하고, PE-Cy7-접합된 이소형 IgG 또는 PD-L1을 사용한 유세포 측정을 위해 가공 처리하였다 (도 56b).
도 57a-57c는 유방암 마우스 모델에서 면역 체크포인트 저해제를 타겟팅하는 항체와 SMC의 조합을 나타낸 그래프이다. 비히클 또는 5 μM LCL161 (SMC) 및 0.1 ng/mL TNF-α, 250 U/mL IFN-β 또는 0.1 MOI의 VSVΔ51으로 48시간 처리된 EMT6 세포의 생분석 분석 (도 57a). 오차 막대, 평균, s.d. n = 4. 통계학적 유의성은 듀넷의 다중 비교 검사를 이용한 ANOVA로 비히클 및 BSA 처리군과 비교하였다. p < 0.0001 (***)이면 유의한 것으로 기록한다. 생물학적 레플리케이트를 이용한 3번의 독립적인 실험의 대표적인 데이터를 나타낸다. EMT6 세포를 분리하고, PE-Cy7-접합된 이소형 IgG 또는 PD-L1을 사용한 유세포 측정을 위해 가공 처리하였다 (도 57b). 3번의 독립적인 실험의 데이터를 나타낸다. ~100 mm3 EMT6-Fluc 종양를 가진 마우스에 이식 후 지정된 시점에 PBS 또는 5x108 PFU의 VSVΔ51을 종양내 처리한 다음, 비히클 또는 50 mg/kg LCL161 (SMC)을 경구로, 그리고 250 ㎍의 IgG 또는 α-PD-1을 복막내 처리하였다 (도 57c). 좌측 패널은 종양의 증식을 도시한 것이다. 오차 막대, 평균, s.e,m. 우측 패널은 마우스 생존성을 도시한 카플란-마이어 곡선이다. Holm-Sidak 다중 비교를 이용한 Log-rank: *, p < 0.05; **, p < 0.01. 괄호 안 숫자는 그룹 당 마우스의 수이다.
도 58a 및 58b는 SMC의 포함이 교모세포종 세포의 존재 하에 면역 반응을 증가시킴을 나타낸 그래프이다. 나이브 마우스 또는 SMC 및 anti-PD-1 공동-처리 (CT-2A 세포 : 비장 세포 1:20)에 의해 두개강내 CT-2A 종양이 이미 치유된 마우스 유래의 비장 세포와 48시간 공-배양한 CT-2A 세포의 세포 배양 상층액으로부터, 지정된 인자의 발현을 ELISA에 의해 검출하였다 (도 58a). +는 평균이고, 수평 실선은 중간값이고, 박스는 25분위수에서 75분위수까지를 표시하며, 휘스커는 값들의 최소-최고 범위를 표시한다. 통계학적 유의성을 듀넷의 다중 비교 검사를 이용한 ANOVA에 의해 분석한 바와 같이 나이브 CD8+ T-세포와 비교하였다. *, p < 0.05; ** p < 0.01; ***, p < 0.001. 나이브 마우스 또는 치유된 마우스로부터 유래된 비장 세포와 공-배양한 다음, 48시간 동안 비히클 또는 5 μM LCL161 (SMC)으로 처리된 CT-2A 세포에서, ELISA에 의해 지정된 사이토카인을 확인하였다 (도 58b). +는 평균을 표시하고, 수평 실선은 중간값을 표시하고, 박스는 25분위수에서 75분위수까지를 표시하며, 휘스커는 값들의 최소-최고 범위를 표시한다. 통계학적 유의성을 듀넷의 다중 비교 검사를 이용한 ANOVA에 의해 분석한 바와 같이 비히클 및 IgG 처리된 T-세포와 비교하였다. **p < 0.01; ***, p < 0.001.
도 59a-59e는 CD8+ T-세포가 교모세포종의 치료에 있어 SMC와 면역 체크포인트 저해제의 상승작용에 필수임을 보여주는 사진 및 그래프이다. 나이브 마우스 또는 SMC 및 anti-PD-1 공동-처리 (CT-2A 세포 : 비장 세포 1:20)에 의해 두개강내 CT-2A 종양이 이미 치유된 마우스 유래의 비장 세포와 48시간 공-배양한 CT-2A 세포의 세포 배양 상층액으로부터, ELISA에 의해 지정된 면역 인자의 발현을 검출하였다 (도 59a). 데이터는 정규화된 스케일링 (normalized scaling)을 이용한 히트 맵 (heat map)으로 작성한다. 데이터의 박스 및 휘스커 플롯을 도 59a에 도시한다. 지정된 인자에 대한 정량은, 나이브 마우스 또는 치유된 마우스로부터 유래된 비장 세포와 공-배양 (비율 1:20)한 다음 48시간 동안 비히클 또는 5 μM LCL161 (SMC)으로 처리된 CT-2A 세포로부터 ELISA에 의해 검출하였다 (도 59b). 나이브 마우스 또는 치유된 마우스 유래의 비장 세포를, 20 ㎍/mL 대조군 IgG 또는 anti-PD1 및 5 μM의 지정된 SMC의 존재 하에 mKate2 테깅된 CT-2A 세포 (CT-2A-mKate2)와 공-배양하였다 (도 59c). CT-2A-mKate2 세포 수 측정을 Incucyte Zoom을 이용해 수행하였다. +는 평균을 표시하고, 수평 실선은 중간값을 표시하고, 박스는 25분위수에서 75분위수까지를 표시하며, 휘스커는 값들의 최소-최고 범위를 표시한다. 유의성을 듀넷의 다중 비교 검사를 이용한 ANOVA에 의해 분석한 바와 같이 나이브 비장 세포와 비교하였다. < 0.0001이면 *로 유의한 것으로 기록한다. 나이브 마우스, n = 6 및 치유된 마우스 n = 6. 스케일 바, 100 ㎛. 두개강내 CT-2A 종양을 가진 C57BL/6 마우스에 지정된 일에, 조합물 IgG (i.p.) 및 비히클 (경구) 또는 α-PD-1 (i.p) 및 75 mg/kg LCL161 (경구)을 처리하고, 그리고 IgG, α-CD4 또는 α-CD8을 i.p.로 처리하였다 (모든 항체는 250 ㎍임; 도 59d). 두개강내 CT-2A 종양을 가진 CD-1 누드 마우스에 지정된 시기에 조합물 비히클 또는 75 mg/kg LCL161 (경구) 및 PBS 또는 250 ㎍의 IgG 또는 α-PD-1 (복막내)을 처리하였다 (도 59e). 데이터는 마우스 생존성을 도시한 카플란-마이어 곡선이다. Holm-Sidak 다중 비교를 이용한 Log-rank: *, p < 0.05; **, p < 0.01. 괄호 안 숫자는 그룹 당 마우스의 수이다.
도 60은 SMC 및 면역 체크포인트 저해제의 조합 처리가 전염증성 사이토카인의 전신 존재를 증가시킴을 나타낸 일련의 그래프이다. 지정된 단백질을 정량하기 위한 멀티플렉스 ELISA를 위해 마우스의 혈청을 가공 처리하였다. +는 평균을 표시하고, 수평 실선은 중간값을 표시하고, 박스는 25분위수에서 75분위수까지를 표시하며, 휘스커는 값들의 최소-최고 범위를 표시한다. 유의성을 듀넷의 다중 비교 검사를 이용한 ANOVA에 의해 분석한 바와 같이 비히클 및 IgG 처리 마우스와 비교하였다. *, p < 0.05. 각 처리군 당 n = 6.
도 61a-61g는 SMC 및 면역 체크포인트 저해제 처리가 마우스 교모세포종 모델에서 면역 작동자의 세포 침윤을 변화시킴을 보여주는 그래프이다. 두개강내 CT-2A 종양을 가진 마우스에, 지정된 시간에, 비히클 또는 75 mg/kg LCL161 (경구) (SMC) 및 250 ㎍ IgG 또는 anti-PD-1 (복막내)을 처리하였다 (도 61a). 마우스를 이식 후 27일에 안락사시켰다. 종양에서 분리된 생존 T 세포를, 다음과 같은 항체를 이용한 유세포 측정을 위해 가공 처리하였다: CD45 (PE-Cy5), CD3 (APC), CD4 (PE-Cy7), CD8 (BV786), CD25 (BV605) 및 PD-1 (BV421; 도 61b-61e). (a)의 실험에서 생존 세포를, 다음과 같은 항체를 이용한 유세포 측정을 위해 가공 처리하였다: CD45 (BV605), CD11b (APC-Cy7), Gr1 (BV786), F4/80 (PE) 및 CD3 (APC; 도 61f 및 61g). 전체 패널: +는 평균을 표시하고, 수평 실선은 중간값을 표시하고, 박스는 25분위수에서 75분위수까지를 표시하며, 휘스커는 값들의 최소-최고 범위를 나타낸다. 유의성을 듀넷의 다중 비교 검사를 이용한 ANOVA에 의해 분석한 바와 같이 비히클 및 IgG 처리된 마우스와 비교하였다. *, p < 0.05; **, p < 0.01. 각 처리군에서, n=6.
도 62a-62g는 SMC 및 면역 체크포인트 저해제 조합이 전염증성 사이토카인 반응을 유도하며 그 효과가 타입 I IFN 신호전달에 의존적임을 나타낸 그래프 및 사진이다. 뇌암 유래의 생존 세포를 분리하여, 다음과 같은 항체를 사용한 유세포 측정을 위해 가공 처리하였다: CD45 (BV605), CD3 (APC-Cy7), Cd4 (PE-Cy7), CD8 (BV786/0), IFN-γ (BV421), TNF-α (PE) 및 GrzB (AF647; 도 62a-62d). +는 평균을 표시하고, 수평 실선은 중간값을 표시하고, 박스는 25분위수에서 75분위수까지를 표시하며, 휘스커는 값들의 최소-최고 범위를 표시한다. 유의성을 듀넷의 다중 비교 검사를 이용한 ANOVA에 의해 분석한 바와 같이 비히클 및 IgG 처리된 마우스와 비교하였다. *, p < 0.05. 각 처리군에서, n=6. 지정된 단백질을 정량하기 위해 멀티플렉스 ELISA로 마우스의 혈청을 가공 처리하였다 (도 62e). 데이터는 정규화된 스케일링 (normalized scaling)을 이용한 히트 맵 (heat map)으로 작성한다. 각 처리군에서, n=6. 마우스에 처리하고, RT-qPCR에 의해 176종의 사이토카인 및 케모카인 유전자를 정량하기 위해 두개강내 CT-2A 종양을 가공 처리하였다 (도 62f). 층화 클러스터링에 의해 식별된 2개의 주 그룹들에 대한 정규화된 히트 맵을 도시한다. 각 처리군에 대해 n = 4. 두개강내 CT-2A 종양을 가진 마우스에 이식 후 지정된 일에, 비히클 또는 75 mg/kg LCL161 (경구)을 또는 각 이소형 IgG 대조군 또는 2.5 mg α-IFNAR1, 350 ㎍ α-IFN-γ 또는 250 ㎍ α-PD-1을 복막내 처리하였다 (도 62g). 유의성을 듀넷의 다중 비교 검사를 이용한 ANOVA에 의해 분석한 바와 같이 비히클 및 IgG 처리된 마우스와 비교하였다. *, p < 0.05. 괄호 안 숫자는 처리군의 크기를 나타낸다.
도 63은 전염증성 사이토카인과 화학주성 인자인 케모카인 유전자 시그니처가 SMC 및 면역 체크포인트 저해제 조합 처리시 상향 조절됨을 나타낸 사진이다. RT-qPCR에 의해 176종의 사이토카인 및 케모카인 유전자를 정량하기 위해 두개강내 CT-2A 종양을 가공 처리하였다. 층화 클러스터링에 의해 식별된 2개의 주 그룹들에 대한 정규화된 히트 맵을 도시한다. 각 처리군에 대해, n = 4.
도 64는 SMC가 교모세포종 타겟 세포의 존재시 CD8+ T-세포의 클론 증폭을 강화함을 보여주는 일련의 그래프이다. CT-2A 종양으로부터 이미 치유된 마우스로부터 분리된 비장 CD8+ T-세포를 CFSE와 함께 로딩하여, 비히클 또는 5 μM LCL161 (SMC) 또는 20 ㎍/mL의 대조군 IgG 또는 anti-PD1의 존재 하에 CT-2A 세포 (비율 10:1)와 함께 96시간 동안 공-배양하였다. 유세포 측정을 위해 생존 세포를 가공 처리하였다. 유의성을 듀넷의 다중 비교 검사를 이용한 ANOVA에 의해 분석한 바와 같이 비히클 및 IgG 처리된 마우스와 비교하였다. *, p <0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001. 각 처리군에 대해 n = 5임.
도 65a-65c는 전염증성 사이토카인 TNF-α가 Smac 모방체 및 면역 체크포인트 저해제 처리시 교모세포종 세포의 T 세포 매개 사멸에 필수임을 보여주는 그래프 및 사진이다. 두개강내 CT-2A 종양으로부터 이미 치유된 마우스의 비장 및 림프절로부터 CD8 T-세포를 분리하고, 이를 비히클 또는 5 μM LCL161 및 20 ㎍/mL 이소형-매칭된 IgG 또는 α-PD-1의 존재 하에 CT-2A 세포와 24시간 공-배양하였다. 다음과 같은 항체를 이용한 유세포 측정을 위해 생존 T 세포를 가공 처리하였다: CD3 (APC-Cy7), CD8 (BV711), GrzB (AF647) 및 TNF-α (PE; 도 65a). +는 평균을 표시하고, 수평 실선은 중간값을 표시하고, 박스는 25분위수에서 75분위수까지를 표시하며, 휘스커는 값들의 최소-최고 범위를 표시한다. 유의성을 듀넷의 다중 비교 검사를 이용한 ANOVA에 의해 분석한 바와 같이 비히클 및 IgG 처리된 마우스와 비교하였다. *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001. 각 처리군에 대해 n = 5이다. CD8+ T-세포를, 비히클 또는 5 μM LCL161 및 20 ㎍/mL의 대조군 IgG, α-PD-1 또는 α-TNF-α의 존재 하에 mKate2-테깅된 CT-2A 세포 (CT-2A-mKate2)와 함께 72시간 공-배양하였다 (도 65b). mKate2-양성 세포의 수 측정을 Incucyte Zoom 소프트웨어를 사용해 실시하였다. +는 평균을 표시하고, 수평 실선은 중간값을 표시하고, 박스는 25분위수에서 75분위수까지를 표시하며, 휘스커는 값들의 최소-최고 범위를 표시한다. 유의성을 듀넷의 다중 비교 검사를 이용한 ANOVA에 의해 분석한 바와 같이 비히클 및 IgG 처리된 마우스와 비교하였다. p < 0.01; ***, p < 0.001. 각 처리군에 대해 n = 5. 스케일 바, 100 ㎛. 두개강내 CT-2A 종양을 가진 마우스에, 비히클 또는 75 mg/kg LCL161 (경구) 또는 (복막내) 해당 이소형 IgG 대조군 또는 500 ㎍ α-TNF-α 또는 250 ㎍ α-PD-1을 이식 후 지정된 날짜에 처리하였다 (도 65c). 유의성을 듀넷의 다중 비교 검사를 이용한 ANOVA에 의해 분석한 바와 같이 비히클 및 IgG 처리된 마우스와 비교하였다. **, p < 0.01. 괄호 안 숫자는 그룹 당 마우스의 수이다.
도 66은 SMC가 종양 및 면역 세포에 작용하여 선천 면역 시스템 및 획득 면역 시스템을 통해 암을 근절하는 면역조절 약물임을 도시한 개략도이다. 본 발명의 결과에 기초한 Smac 모방체의 단독 물질 및 조합 면역조절 효과를 발휘하는 모델이 도시된다. 면역 또는 종양 세포에 대한 IAP 길항 효과는 다음과 같이 개략적으로 설명된다: (1) SMC는 대식세포 또는 T 세포와 같은 다양한 면역 세포로부터 사이토카인 및 케모카인의 생산을 자극하여, 종양 미세환경으로 면역 세포를 침윤시킨다. (2) SMC 처리는 면역억제 대식세포 M2 집단을 감소시키며, 동시에 전-염증성 M1 집단을 증가시킨다. (3) SMC는 cIAP1 및 cIAP2를 고갈시켜, TNF-α 또는 TRAIL1과 같은 면역 리간드에 의해 종양이 사멸에 감수성이 되게 만든다. 종양 세포 사멸이 면역계에 의해 감지되어, 세포독성 T 세포 (CTL) 반응이 촉발된다. (4) SMC는 항원-제시 세포 (APC) 상에 TNF/TNFR 패밀리 멤버 CD40L/CD40 신호전달 경로를 자극하여, 수지상 세포 (DC) 및 대식세포의 분화 및 성숙화를 촉진한다. APC는 종양 항원을 면역계에 제시하며, 추가로 세포독성 염증성 사이토카인을 분비한다. (5) SMC 처리에 의한 cIAP1 및 cIAP2의 분해 결과로서, SMC는 얼터너티브 NF-κB 경로를 활성화하여, TNF 슈퍼패밀리 리간드 (예, 4-1BB)의 필요성을 제거하며, 따라서 T 세포 공-자극 신호를 공급한다. (6) SMC는 CTL 및 자연 살상 세포 매개의 세포 사멸을 증가시키는 것으로 입증되어 있다. Granzyme B-매개 세포 사멸은 X-연계된 IAP, XIAP에 의해 차단되는데, 이 차단은 미토콘드리아의 Smac 방출에 의해 또는 이의 약물 모방체 SMC13-15에 의해 해소될 수 있다.
도 67은 SMC와 면역 체크포인트 저해제 (ICI)의 상승작용의 협동적이고 상보적인 (complimentary) 기전을 도시한 개략도이다. (1) PD-1/PD-L1 축을 차단하는 치료학적 재조합 항체의 존재는, 주 조직적합성 복합체 I (MHC-I) 분자를 통해 암 세포에 의해 제시된 관련 항원에 대한 CD8+ T-세포의 T 세포 수용체 (TCR)의 신호전달을 허용하게 된다. SMC 치료를 통한 IAP의 동시적인 고갈은, 아마도 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 (TNFRSF) 공-자극 반응 (4-1BB 또는 OX40 활성화와 유사함)을 제공함으로써, T 세포 활성화를 강화하게 되며, 이로써 종양-특이적인 CD8+ T-세포의 활성화와 증폭을 증가시킬 수 있다. 그 결과, Granzyme B (GrzB) 및 Perforin (Pfn)이 방출되어 타겟 세포를 사멸시키게 된다. (2) casp-3 저해제, XIAP의 SMC-매개 길항작용이 GrzB에 의한 종양 세포 사멸을 강화할 수 있다. (3) SMC에 의한 cIAP1 및 cIAP2의 고갈은 종양 미세환경에서 T 세포에 의한 TNF-α의 국소 생산의 증가를 유도하며, 이는 얼터너티브 NF-κB 경로의 활성화에 의해 매개되는 것일 수 있다. (4) cIAP1/ 2 감소 결과로, SMC-처리된 암 세포는 TNF-α와 같은 전염증성 사이토카인의 존재 시 세포 사멸 유도에 대해 감수성인 상태가 된다.
도 68a-68d는 전체 웨스턴 블롯을 도시한 사진이다.
본 발명은, 암 치료에 있어 Smac 모방 화합물 (SMC)의 효과를 강화하기 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 특히, 본 발명은, SMC; 및 cIAP1 및/또는 cIAP2에 의해 저해되는 하나 이상의 세포 사멸 경로를 자극하는 제2 물질을 포함하는, 조합 치료를 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 제2 물질은, 예를 들어, TLR 작용제, 종양 용해성 바이러스와 같은 바이러스 또는 인터페론 또는 관련 물질일 수 있다.
본원에 제시된 데이터는, 물질 및 SMC를 이용한 치료가 생체내 종양 퇴행 및 영구적인 치유 (durable cure)를 달성함을, 제시한다 (예, 실시예 1). 이러한 조합 요법은 마우스에 양호한 허용성을 나타내며, 치료 중단 후 체중이 처리 전 수준으로 회복되었다. 테스트한 조합 요법은, 여러가지 치료 난치성의 공격적인 마우스 암 모델을 치료할 수 있었다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 본원에 제시된 내용 및 데이터에 기초하여, 다양한 SMC 중 임의의 하나 및 다양한 물질들 중 임의의 하나, 예를 들어, TLR 작용제, 병원체 또는 병원성 모방체를, 세포자살을 강화하고 암을 치료하기 위해 본 발명의 하나 이상의 구현예로 조합할 수 있음을, 인지할 것이다.
SMC 요법을 개선하기 위한 다른 방식들이 시도되었지만, 완전 반응 (complete response)은 거의 관찰되지 않았으며, 특히 공격적인 면역적격 모델 시스템에서도 매우 드물었다. 병원체 모방체, 예를 들어, TRAIL에 일부 의존적인 작용 기전을 가진 병원체 모방체를 이용한 암 치료를 포함하는, 본 발명의 일부 구현예들은, 특별한 이점을 가질 수 있다. 첫째, 이 방식은 TNFα-매개 세포자살 및 네트롭토시스 (necroptosis)를 유발할 수 있으며: 일부 진행된 암의 가소성 및 이질성을 감안하면, 별개의 여러가지 세포 사멸 기전을 동시에 유도하는 치료가 그렇지 않은 경우 보다 효과가 더 우수할 수 있다. 둘째, 병원체 모방체는 네거티브 피드백의 층들을 포함하는 통합된 선천 면역 반응을 유발할 수 있다. 이러한 피드백 기전은 사이토카인 반응을 재조합 단백질을 이용하여 반복하기 어려운 방식으로 완화하게 작용할 수 있으며, 따라서 이러한 조합 요법 전략에 대한 보호 조치로서 작용할 수 있다.
다발성 골수종 (MM)은 골수에서 형질세포가 빠르게 증식하는 불치성 암이다. MM은 2번째로 가장 흔한 혈액 악성으로서, 진단 후 생존 중간값이 3-5년에 불과하다. MM 세포는 뼈 재흡수를 유발하여 골수 구획에서 증식하면서 면역 억제 및 골절을 야기한다. MM 세포는 다른 조직으로 퍼져 형질세포종을 형성할 수 있으며, 이 질환은 공격적인 백혈병 단계로 진행될 수 있다. 현행 요법은 생존을 연장하고 증상을 완화할 수 있지만, 근치적 치료 (curative treatment)는 아니다. 치료 내성 및 불가피한 재발을 해결하기 위해 새로운 요법이 절실하게 필요한 실정이다.
악성 세포는 질환 초기 단계에 골수 미세환경, 특히 골수 미세환경에 놓인 세포로부터 유래되는 TNFα 및 인터루킨-6 (IL-6)에 의지한다. 질환이 진행됨에 따라, 세포는 환경에 독립적이게 되어, 높은 자가분비성 TNFα 생산을 통해 생존하게된다. 이들 세포는, 전체 단계에서, 부분적으로 경로의 주 요소의 공통적인 돌연변이화를 통해, 생존성을 강화하는 NF-κB 신호전달이 높은 수준으로 이루어지게 된다. MM에서 NF-κB 경로를 타겟팅하는 방식은 프로테아좀 저해제 보르테조밉 (bortezomib), 면역조절제 (IMiD) 탈리도미드 및 레날리도미드 및 합성 글루코코르티코이드 덱사메타손과 같은 다수의 표준 치료제의 효과를 높이는데, 기여한다.
TNFα-매개 NF-κB 신호전달은 세포자살의 세포 저해제 (cIAP)를 제거하여 생존촉진 신호 (pro-survival signal)를 세포자살 신호로 전환할 수 있으며; 이 프로세스는 암 세포에 선택적인 것으로 보인다. cIAP1과 cIAP2는 TNFα 수용체 슈퍼패밀리의 모든 멤버들에서 E3 리가제로서 상호호환적으로 작용하여, 특정 단백질을 유비퀴틴화함으로써 신호전달 복합체의 스캐폴드를 형성하거나 또는 이를 분해되게 타겟팅한다. 이러한 것의 예는 NF-κB 경로의 양쪽 과정에서 볼 수 있다: RIP1은 K63 결합을 통해 유비퀴틴화되어 클래식 경로를 활성화하는데 필요한 신호전달 복합체 지지체를 형성하는 반면, NIK는 K48 연결된 유비퀴틴화를 수용하여, 분해로 진행되게 타겟팅되며, 얼터네이티브 경로의 불활성을 유지시킨다 (도 35). SMC는, 고유한 세포자살 경로의 활성화에 참여하는 내인성 Smac 단백질을 모방하는 새로운 계열의 항암 치료제이다. Smac 펩타이드 및 SMC는 cIAP의 BIR 도메인에 결합하여, 이를 자가-유비퀴틴화되게 유발함으로써 이를 프로테아좀에 의해 분해되도록 타겟팅한다. RIP1이 더이상 유비퀴틴화되지 않으면, 자유롭게 되어 리폽토좀 (ripoptosome)을 형성하여, 카스파제 케스케이드 및 세포 사멸을 개시한다.
SMC는 TNFα와 강력한 상승작용을 발휘하여 다수 암 세포주들에서 NF-κB -매개 세포자살을 유도하는 것으로 입증된 바 있다. 또한, SMC는 IFN과 같은 다른 염증성 사이토카인과 조합하여 상승적인 암 세포 사멸성을 나타내며, 이는 TLR 작용제 또는 종양 용해성 바이러스에 의해 유발될 수 있다. SMC는 심지어 MM에 사용되는 치료제를 암 세포의 세포자살을 강화하기 위한 용도로 표준화할 수 있다. MM 뿐만 아니라 다른 암에서 화학치료제와 SMC의 효능을 분석하기 위해 현재 수행 중인 여러가지 임상 실험들에서, 강력한 치료학적 잠재성이 확인되고 있다.
면역계 활성화는 사이토카인 생산을 증가시켜, SMC-매개 MM 세포를 사멸시키는데 유익하다. 그러나, 이러한 사이토카인 생산은 MM 세포에는 바람직하지 않은 결과를 초래할 수 있다. IFN 및 TLR 작용제와 같은 다수의 선천 면역 자극제들은 면역 체크포인트 PD-1의 리간드를 상향 조절하는 것으로 입증되어 있다. PD-1은 T 세포 및 NK 세포의 표면에서 발현된다. PD-1이 이의 리간드, PD-L1 및 PD-L2와 결합하면, T 세포 수용체에 대한 공동-저해 신호로서 작용하여, T 세포의 세포독성 능력을 억제한다. PD-L1은 다수의 조직들에서 낮은 수준으로 구성적으로 발현되며, 어쩌면 자가면역 반응을 방지하기 위해 상향 조절될 수 있다. 그러나, PD-L1이 암 세포 상에서 상향 조절되면, 획득 면역 시스템에 의한 검출로부터 세포를 벗어나게 한다.. 특히, PD-L1은 LPS와 같이 TLR 작용제 및 IFNγ에 반응하여 MM에서 상향 조절될 수 있다. PD-L2는 PD-L1과 비교해 훨씬 더 선택적인 발현성을 가진다. 이는 B 세포 서브세트에 존재하며, 강력한 NF-κB 또는 STAT6 신호전달에 반응하여 선택 세포 상에서 상향 조절된다.
또한, SMC는 시험관내 및 생체내에서 SMC-치료 마우스의 T 세포의 기능에 영향을 미칠 수 있으며, 예를 들어, 증식 증가, SMC 노출 후 마우스 비장에서 추출된 활성화된 T 세포의 사이토카인 생산 증가 및 NKT 및 NK 세포로부터 사이토카인 생산 증가를 유발할 수 있다. 또한, SMC 처리된 마우스는 항원 자극시 과반응성 T 세포를 생성한다. 따라서, SMC-기반의 조합 요법은 MM 세포의 세포자살을 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라 선택적인 획득 반응을 자극할 수 있다. SMC와 선천 면역 자극제 또는 면역 체크포인트 저해제 (ICI)의 조합이 MM 세포에 수신되는 강력한 생존 촉진 신호를 극복하기 위한 최상의 접근법일 수 있다.
암 세포는 사멸-유발성 신호에 내성이게 만들기 위해 건강한 세포들의 여러가지 생존 촉진 전략을 이용하도록 조작할 수 있다. MM 세포는 특이적으로 형질세포에 사용되는 구성적인 NF-κB 신호전달을 더욱 증폭시켜, 이를 세포자살 자극에 내성이게 만들 수 있다. 이는 IL-6 및 TNFα와 같은 생존 촉진성 NF-κB 타겟 유전자의 발현 증가에 의해 달성된다. 또한, MM 세포는, 추측컨대 염증성 환경 및 세포독성 환경으로부터 세포를 보호하기 위해 사용되는, 체크포인트 저해제의 발현을 강화할 수 있으며; 이는 T 세포 및 NK 세포에 의한 검출로부터 회피하는데 일조한다. MM에서 세포자살 내성 및 면역 회피 둘다를 타겟팅하는 방식은 이 질환에서 치료 내성의 주요 특성들 중 2가지를 극복할 가능성을 가진다.
PD-1 차단은 MM 질환 진행을 지연시키고, 동계 뮤라인 MM 모델을 이용하여 확인된 바와 같이 마우스에서 생존 기간을 유의하게 개선하는데 효과적이다. PD-1에 대한 단일클론 항체 사용은 면역 체크포인트를 차단하기 위한 대안적인 접근 방식과 비교해 몇가지 이점을 가진다. 첫째, 이는 PD-1 리간드, PD-L1 및 PD-L2에의 결합을 차단할 수 있다. 다수 암들이 인터페론 처리에 반응하여 PD-L1을 상향 조절할 수 있으며, 처치 후 MM 환자에서 PD-1/PD-L1이 상향 조절된다. 또한, 미성숙 B 세포의 서브세트, 즉 B1 세포는 비-특이적인 항체를 방출하며, PD-L2를 고도로 발현하는 것으로 확인되었다. 또한, PD-L2 발현은 NF-κB 및 STAT6 활성화와 같은 특정 자극에 반응하여 증가할 수 있으며, 이는 MM 세포 상에서 이들 2종의 리간드의 발현 수준을 조사하는 것이 중요하다는 것을 보여준다. 인간 MM 세포는 PD-1 리간드 2종 다 상향 조절하여, 고형 암과 비교해 고유성을 가진다. 이는 오직 PD-L1을 타겟팅하는 단일클론 항체 요법 (예, Bristol-Myers Squibb의 BMS-936559/MDX-1105, Genentech의 MPDL3280A, MedImmune의 MEDI473, 및 EMD Serono의 Avelumab)이 PD-1을 타겟팅하는 치료 (예, Bristol-Myers Squibb의 nivolumab, Merck의 Pembrolizumab 및 Curetech의 Pidilizumab) 보다 덜 효과적일 것으로 시사됨에도 불구하고, MM에서 anti-PD-1 항체의 이용 가치를 보여준다.
둘째, PD-1 타겟팅 방식은, anti-CTLA-4와 같은 다른 ICI와 비교해 암에 대해 보다 견고한 반응을 나타낼 가능성이 있다. 활성 차이는 T 세포 조절에서 이들 분자들의 구체적인 역할로 인한 것일 수 있다. PD-1은 종종 CD8+ T 세포 상에서 발견되며, 이의 리간드와 결합하여 TCR 신호전달에 의해 활성화된 세포독성 반응을 저해한다. 대조적으로, CTLA-4는 이차성 림프 조직에서 조절성 T 세포에 대해 보다 현저하게 작용한다. CTLA-4가 이의 수용체 CD28과 결합하면, 우세해지고 (outcompete), 심지어 CD28에 대한 활성화 리간드를 하향 조절하고, T 세포 이차성 클론 증폭을 약화시킨다. 실시예 3에서 anti-CTLA-4 처리 효능의 결핍이 이차성 림프 장기로 MM의 침습을 의미한다는 것은 전적으로 가능한 일이다. 이는 CD4+ T 세포 집단에 의한 anti-CTLA4 효과를 손상시켜, 배 중심 (germinal centre) 내에서 비례하여 낮아지거나 또는 이차 림프 장기로의 T 세포 침윤을 방해한다. 골수외 MM의 경우, 세포는 비장 및 림프절에서 형질세포종을 형성할 수 있는데 이는 종종 실시예 3에 기술된 MM 마우스 모델의 후기 단계에서 관찰된다. 따라서, 배중심이 MPC-11 세포에 의해 손상된다는 것은 명백한 사실이다.
SMC
본 발명의 SMC는, cIAP1, cIAP2 및/또는 XIAP, 및 선택적으로 하나 이상의 부가적인 내인성 Smac 활성을 저해할 수 있거나 또는 저해할 수 있는 것으로 예측되는, 임의의 소분자, 화합물, 폴리펩타이드, 단백질 또는 이들의 임의 복합체일 수 있다. 본 발명의 SMC는, 비-배타적인 예로, cIAP1 저해 및 cIAP2의 저해 등의, 내인성 Smac의 하나 이상의 활성을 모방함으로써, 세포자살을 강화할 수 있다. 내인성 Smac 활성은, 예를 들어, 특정 단백질과 상호작용할 수 있으며, 특정 단백질의 기능의 저해 또는 특정 IAP의 기능을 저해할 수 있다. 특정 구현예에서, SMC는 cIAP1 및 cIAP2 둘다 저해한다. 일부 구현예에서, SMC는, cIAP1 및 cIAP2 이외에, XIAP 또는 Livin/ML-IAP, single BIR-함유 IAP와 같은, 하나 이상의 다른 IAP를 저해한다. 특정 구현예에서, SMC는 cIAP1, cIAP2 및 XIAP를 저해한다. SMC 및 면역 자극성 물질을 포함하는 임의 구현예에서, 하나 이상의 특정 면역 자극성 물질과 조합하기 위해 특정 활성을 가진 SMC가 선택될 수 있다. 본 발명의 임의 구현예에서, SMC는 Smac가 할 수 없는 활성을 할 수 있다. 일부 예에서, 이러한 부가적인 활성은 본 발명의 방법 또는 조성물의 효과에 기여할 수 있다.
SMC를 이용한 치료는, 예를 들어, 자가- 또는 트랜스-유비퀴틴화 및 프로테아좀-매개 분해의 유발을 통해, cIAP1 및 cIAP2 세포를 고갈시킬 수 있다. 또한 SMC는 카스파제의 XIAP의 저해를 탈-억제할 수 있다. SMC는 주로 cIAP 1 및 2를 타겟팅하고, TNFα 및 기타 사이토카인 또는 사멸 리간드를 생존 신호에서 사멸 신호로, 예를 들어 암 세포에서 변환함으로써, 기능할 수 있다.
특정 SMC는 적어도 XIAP와 cIAP를 저해한다. 이러한 "pan-IAP" SMC는 프로그래밍된 세포 사멸을 저해하는 복수의 뚜렷한 연관된 단계들에 개입할 수 있다. 이러한 특징은, 복수의 사멸 경로들이 이러한 SMC에 의해 영향을 받고 SMC가 개입할 수 있는 다양한 세포자살 경로를 활성화하는 기존 암 치료제 및 신생 암 치료제와 상승작용할 수 있어, 암이 pan-IAP SMC를 이용한 치료에 내성으로 진행될 기회를 최소화한다.
하나 이상의 염증성 사이토카인 또는 사멸 리간드, 예를 들어 TNFα, TRAIL 및 IL-1β는 다수의 종양-유래 세포주에서 SMC 요법과 강하게 상승작용한다. SMC-처리 종양에서, 특히 재조합 사이토카인 요법과 통상적으로 관련있는 독성을 제한하는 방식을 이용하여, 사멸 리간드 농도를 증가시키기 위한 전략은, 따라서 매우 매력적이다. TNFα, TRAIL 및 수십개의 다른 사이토카인 및 케모카인은 개체의 선천 면역 시스템에 의한 병원체 인지에 반응하여 상향 조절될 수 있다. 중요한 것은, 이러한 미생물 병원체에 대한 원시 반응 (ancient response)은, 활성의 세기 및 기간을 제한하는 엄격한 네거티브 조절로 인해, 통상적으로 개체에 자가-한정적이고 안전하다는 것이다.
SMC는 합리적으로 Smac에 기초하여 설계될 수 있다. 내인성 Smac의 하나 이상의 기능 또는 활성을 모방함으로써 세포자살을 강화하는 화합물의 능력은, 내인성 Smac 또는 공지된 SMC와의 유사성에 기반하여 예측할 수 있다. SMC는 화합물, 폴리펩타이드, 단백질 또는 2종 이상의 화합물, 폴리펩타이드 또는 단백질의 복합체일 수 있다.
일부 경우에, SMC는 폴리펩타이드 Smac의 N-말단 테트라펩타이드 서열 (가공 처리 후 드러남)에 기초한 소분자 IAP 길항제이다. 일부 경우, SMC는 모노머 (1가) 또는 다이머 (2가)이다. 특정 경우에, SMC는 Smac/DIABLO로부터 AVPI의 테트라펩타이드 서열을 모방하는 1 또는 2개의 모이어티, 카스파제의 제2 미토콘드리아 활성인자 또는 그외 유사한 IBM (예, casp9과 같은 다른 단백질로부터 유래된 IAP-결합성 모티프)를 포함한다. 본 발명의 다이머 SMC는 호모다이머 또는 헤테로다이머일 수 있다. 특정 구현예들에서, 다이머 서브유닛은 다양한 링커에 의해 조합된다. 링커는 각 서브유닛의 동일한 규정된 스팟에 있을 수 있지만, 또한 다른 앵커 포인트에 위치할 수도 있다 (이는 'aa' 위치, P1, P2, P3 또는 P4일 수 있으며, 때때로 P5 그룹이 이용가능할 수 있음). 다양한 배열에서, 다이머 서브유닛은 서로 다른 방향성으로, 예를 들어 헤드에서 꼬리, 헤드에서 헤드, 또는 꼬리에서 꼬리로 존재할 수 있다. 헤테로다이머는 서로 다른 BIR 도메인 또는 서로 다른 IAP에 대해 다른 친화성을 가진 2종의 다른 모노머를 포함할 수 있다. 다른 예로, 헤테로다이머는 Smac 모노머와, IAP가 아닌 타겟 또는 다른 수용체에 대한 리간드를 포함할 수 있다. 일부 경우, SMC는 고리 형태 (cyclic)일 수 있다. 일부 경우에, SMC는 트라이머 또는 멀티머일 수 있다. 멀티머 형태의 SMC는 (예, 시험관내 EC50에 의해 측정시) 하나 이상의 대응되는 모노머와 비교해, 7,000배 이상, 예를 들어, 10-, 20-, 30-, 40-, 50-, 100-, 200-, 1,000-, 5,000-, 7,000-배 또는 그 이상의 활성의 배수 증가를 나타낼 수 있다. 이는, 일부 경우, 예를 들어, 테더링 (tethering)이 IAP들 간의 유비퀴틴화를 강화하거나 또는 듀얼 BIR 결합이 상호작용의 안정성을 강화하기 때문에, 발생할 수 있다. 다이머와 같이 멀티머는 증가된 활성을 나타낼 수 있지만, 일부 경우에는 모노머가 바람직할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 저분자량의 SMC가, 예를 들어, 생체이용성과 관련된 이유로, 바람직할 수 있다.
본 발명의 일부 경우에, cIAP1/2를 저해할 수 있는 물질은 베스타틴 (bestatin) 또는 Me-베스타틴 유사체이다. 베스타틴 또는 Me-베스타틴 유사체는 cIAP1/2 자가-유비퀴틴화 (autoubiquitination)를 유도하여, Smac의 생물 활성을 모방할 수 있다.
본 발명의 특정 구현예들에서, SMC 조합 처리는 하나 이상의 SMC 및 하나 이상의 인터페론 물질, 예를 들어, 타입 1 인터페론, 타입 2 인터페론 및 타입 3 인터페론을 포함한다. 인터페론을 포함하는 조합 치료제는 다발성 골수종과 같은 암을 치료하는데 유용할 수 있다.
일부 구현예에서, IFN을 발현하며; 선택적으로 NIS 소듐-아이오다이드 심포터 (sodium-iodide symporter)와 같이 촬영할 수 있는 유전자를 발현하는, VSV가 SMC와 조합하여 사용된다. 예를 들어, 이러한 VSV는 Ascentage Smac 모방체 SM-1387/APG-1387, Novartis Smac 모방체 LCL161 또는 Birinapant와 같은 SMC와 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 조합은 간세포암 또는 간 전이와 같은 암을 치료하는데 사용할 수 있다.
다양한 SMC들이 당해 기술 분야에 공지되어 있다. SMC에 대한 비-배타적인 예들이 표 1에 제시된다. 표 1은 다양한 SMC가 기능할 수 있는 제안된 기전들을 포함하고 있지만, 본 발명의 방법 및 조성물은 이러한 기전으로 또는 기전에 의해 한정되지 않는다.
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물질
본 발명의 면역자극성 물질 또는 면역조절성 물질은 개체의 하나 이상의 세포에서 cIAP1 및 cIAP2에 의해 저해되는 수용체-매개 세포자살 프로그램을 유도할 수 있는 임의의 물질일 수 있다. 본 발명의 면역 자극제 (immune stimulant)는 cIAP1(BIRC2), cIAP2 (BIRC3 또는 API2)에 의해, 및 선택적으로 하나 이상의 부가적인 IAP, 예를 들어, 하나 이상의 인간 IAP 단백질 NAIP (BIRC1), XIAP (BIRC4), survivin (BIRC5), Apollon/Bruce (BIRC6), ML-IAP (BIRC7 또는 livin) 및 ILP-2 (BIRC8)에 의해 조절되는 세포자살 프로그램을 유도할 수 있다. 부가적으로 CpG 또는 IAP 길항제와 같은 다양한 면역조절 물질 또는 물질들이 면역 세포 환경 (immune cell context)을 바꿀 수 있는 것으로 알려져 있다.
일부 경우에, 면역 자극제는 TLR 리간드와 같은 TLR 작용제일 수 있다. 본 발명의 TLR 작용제는 인간에서 TLR-1, TLR-2, TLR-3, TLR-4, TLR-5, TLR-6, TLR-7, TLR-8, TLR-9 및 TLR-10, 또는 다른 종에서의 관련 단백질 (예, 뮤라인 TLR-1 내지 TLR-9 및 TLR-11 내지 TLR-13) 중 하나 이상의 작용제일 수 있다. TLR은, 미생물 병원체에 의해서만 발현되는 병원체-관련 미생물 패턴 (PAMP) 뿐만 아니라 세포괴사 또는 사멸 중인 세포에서 방출되는 내인성 분자인 위험-관련 분자 패턴 (danger-associated molecular pattern, DAMP)으로 알려진 고도로 보존된 구조 모티프를 인지할 수 있다. PAMP는 리포폴리사카라이드 (LPS), 펩티도글리칸 (PGN) 및 리포펩타이드 뿐만 아니라 플라젤라, 세균 DNA 및 바이러스 이중가닥 RNA과 같은 다양한 세균의 세포 벽 성분을 포함한다. DAMP는 열 충격 단백질과 같은 세포내 단백질 뿐만 아니라 세포외 기질 유래의 단백질 단편을 포함한다. 본 발명의 작용제는, 예를 들어, CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (CpG ODN), 예로 Class A, B 및 C CpG ODN's, 염기 유사체, 핵산, 예로 dsRNA 또는 병원체 DNA, 또는 병원체 또는 병원체-유사 세포 또는 비리온을 포함한다. 특정 구현예들에서, 이 물질은 바이러스 또는 세균을 모방하는 물질이거나, 또는 합성 TLR 작용제이다.
다양한 TLR 작용제들이 당해 기술 분야에 공지되어 있다. TLR 작용제의 비-배타적인 예들은 표 2에 제공된다. 표 2가 다양한 TKR 작용제가 작용할 수 있는 제시된 기전, 용도 또는 TLR 타겟들을 포함하고 있지만, 본 발명의 방법 및 조성물이 이러한 기전, 용도 또는 타겟에 의해 또는 타겟으로 한정되는 것은 아니다.
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다른 예로, 면역 자극제는 바이러스, 예를 들어, 종양 용해성 바이러스일 수 있다. 종양 용해성 바이러스는 암 세포를 선택적으로 감염시키거나, 복제되거나 및/또는 선택적으로 사멸시키는 바이러스이다. 본 발명의 바이러스로는, 비-배타적인 예로, 아데노바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 홍역 바이러스, 뉴캐슬 질환 바이러스, 파르보바이러스, 소아마비바이러스, 레오바이러스, 세네카 밸리 (Seneca Valley) 바이러스, 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 렌티바이러스, 랍도바이러스, 신드비스 (sindvis) 바이러스, 콕사키바이러스, 폭스바이러스 등을 포함한다. 본 발명의 특정 구현예에서, 이 물질은 랍도바이러스 (rhabodvirus), 예컨대, VSV이다. 랍도바이러스는 높은 IFN 생산과 더불어 빨리 복제할 수 있다. 다른 특정 구현예에서, 이 물질은 패럴 (feral) 멤버, 예를 들어 MG1 이중 돌연변이를 가진 마라바 바이러스 (Maraba virus), 파르밍톤 바이러스 (Farmington virus), 카라야스 바이러스 (Carajas virus)이다. 본 발명의 바이러스 물질은 돌연변이 바이러스 (예, 매트릭스 또는 M 단백질에 Δ51 돌연변이를 가진 VSV), 전이유전자-변형된 바이러스 (예, VSV-hIFNβ), TNFα-, LTα/TNFβ-, TRAIL-, FasL-, TL1α-수송 바이러스, 키메라 바이러스 (예, 광견병), 또는 슈도타입의 바이러스 (pseudotyped virus) (예, LCMV 유래 G 단백질을 가진 슈도타입의 바이러스 또는 기타 바이러스)를 포함한다. 일부 예에서, 본 발명의 바이러스는 신경독성을 줄이도록 선택될 것이다. 바이러스, 일반적으로, 특히, 종양 용해성 바이러스는 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
특정 구현예들에서, 이 물질은 사멸 VSV NRRP 입자 또는 프라임 및 부스팅 종양 (prime-and-boost tumor) 백신이다. NRRP는 더 이상 복제 또는 전파될 수 없는 감염성 벡터를 생산하도록 변형되었지만, 종양 용해성 및 면역자극성 특성은 유지한 야생형 타입의 VSV이다. NRRP는 감마 조사, UV 또는 부설판을 이용해 제조할 수 있다. 특정 조합 요법은 adeno-MAGE3 (흑색종 항원) 및/또는 Maraba-MG1-MAGE3를 이용한 프라임 및 부스트를 포함한다. 그외 특정 조합 요법은 UV-사멸 또는 감마 조사-사멸 야생형 VSV NRRP를 포함한다. NRRP는 신경독성이 저하되거나 또는 없을 수 있다. NRRP는, 예를 들어, 신경교종, 혈액 (액체) 종양 또는 다발성 골수종을 치료하는데 사용할 수 있다.
일부 경우에, 본 발명의 물질은 백신 균주, 약독화된 바이러스 또는 미생물 또는 사멸 바이러스 또는 미생물이다. 일부 예에서, 물질은, 예를 들어, BCG, 광견병 생 또는 사 백신 또는 인플루엔자 백신일 수 있다.
본 발명의 바이러스에 대한 비-배타적인 예, 예를 들어, 종양 용해성 바이러스는 표 3에 제시된다. 표 3은 제시된 바이러스에 대한 제안되는 기전 또는 용도를 포함하고 있지만, 본 발명의 방법 및 조성물이 이들 기전 또는 용도에 의해 또는 기전 또는 용도로 제한되는 것은 아니다.
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표 4. 미국 식의약청으로부터 승인되거나 또는 임상 개발 중인 면역 체크포인트 저해제 생물제제 리스트
타겟 수용체 또는 리간드 클래스 생물제제의 일반 약물명 또는 계획된 약물명 (가명 또는 설명) 회사
1 CTLA4 Ipilimumab
(MDX-010, 10D1)		 BMS
2 CTLA4 Tremelimumab (CP-675,206, ticilimumab) Pfizer
1 PD1 Pembrolizumab (lambrolizumab, MK-3475) Merck
2 PD1 Nivolumab (MDX-1106, BMS-936558, ONO-4538) BMS
3 PD1 Pidilizumab (CT-011, MDV9300) Medivation (Curetech)
4 PD1 AMP-224 (융합 단백질) GSK/ Amplimmune
5 PD1 AMP-514 (MEDI0680) GSK/ Amplimmune
6 PD1 AUNP 12 (펩타이드) Aurigene/ Pierre Fabre
7 PD1 PDR001 Novartis
8 PD1 BGB-A317 BeiGene
9 PD1 REGN2810 Regeneron
10 PD-L1 Avelumab(MSB0010718C) Pfizer/ Merck Serono
11 PD-L1 BMS-935559 (MDX-1105) BMS / Medarex
12 PD-L1 Atezolizumab (MPDL3280A, RG7446) Roche-Genentech
13 PD-L1 Durvalumab (MEDI4736) AZ/ Medimmune
14 PD-L1 Novartis (CoStim)
1 LAG3 BMS-986016 BMS
2 LAG3 LAG525 Novartis
3 LAG3 IMP321 ImmuTep
1 TIM3 MBG453 Novartis
1 KIRs Lirilumab (IPH2102/BMS-986015) BMS
1 B7H3/ CD276 MGA271 Macrogenics
암
본 발명의 방법 및 조성물은 매우 다양한 암 타입을 치료하는데 이용할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 전체 암이 그런 것은 아니지만 다수의 세포가 수용체-매개 세포자살을 수행할 수 있기 때문에, 본 발명의 방법 및 조성물이 전체 암은 아니더라도 다수의 암에 광범위하게 적용 가능하다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 조합 방식은 다양한 공격적이고, 난치성의 종양 모델에 효과적이다. 특정 구현예에서, 예를 들어, 본 발명의 방법에 의해 치료되는 암은 부신암, 기저세포암, 담관암, 방광암, 골암, 뇌 및 기타 중추 신경계 (CNS) 암, 유방암, 자궁경부암, 융모암, 대장암, 결장직장 암, 결합 조직 암, 소화계 암, 자궁내막암, 상인두암, 식도암, 안구암, 담낭암, 위암, 두경부암, 간세포암, 상피내암종, 신장암, 후두암, 백혈병, 간암, 간 전이, 폐암, 림프종, 예를 들어 호지킨 림프종 및 비-호지킨 림프종, 흑색종, 골수종, 다발성 골수종, 신경모세포종, 중피종, 신경교종, 골수이형성 증후군, 다발성 골수종, 구강암 (예, 입술, 혀, 입 및 인두), 난소암, 소아암, 췌장암, 췌장 내분비 종양, 음경암, 형질세포 종양, 뇌하수체 선종, 흉선종, 전립선암, 신장세포 암종, 호흡계 암, 횡문근육종, 침샘암, 육종, 피부암, 소장암, 위암, 고환암, 갑상선암, 요관암, 비뇨기계 암, 및 기타 암종 및 육종일 수 있다. 그외 암들은 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
암은 SMC 단독에 의한 치료에 난치성인 암일 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물은 SMC 단독에 의한 치료에 난치성인 암에 특히 유용할 수 있다. 전형적으로, SMC 단독에 의한 치료에 난치성이 암은, IAP-매개 세포자살 경로가 현저하게 유도되지 않는 암일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 암은, 하나 이상의 세포자살 경로가 현저하게 유도되지 않는, 즉, SMC 단독 치료에 의해 암을 효과적으로 치료하기에 충분한 방식으로 활성화되지 않는, 암이다. 예를 들어, 본 발명의 암은, cIAP1/2-매개 세포자살 경로가 현저하게 유도되지 않는 암일 수 있다.
본 발명의 암은 하나 이상의 물질에 의해 치료에 난치성인 암일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 암은 하나 이상의 물질 (SMC 비-포함)에 의한 치료에 난치성이고, 또한 하나 이상의 SMC (물질 비-포함)에 의한 치료에 난치성인, 암일 수 있다.
제형 및 투여
일부 경우에, 네이키드 (naked), 즉 천연 형태의 SMC 및/또는 물질의 전달이 세포자살을 강화하거나 및/또는 암을 치료하는데 충분할 수 있다. SMC 및/또는 물질은, 염, 에스테르, 아미드, 프로드럭 또는 유도체가 적합하게는 약제학적으로 효과적이고, 예를 들어 세포자살을 강화할 수 있거나 및/또는 암을 치료할 수 있는 한, 염, 에스테르, 아미드, 프로드럭, 유도체 등의 형태로 투여될 수 있다.
SMC 또는 물질의 염, 에스테르, 아미드, 프로드럭 및 기타 유도체는 합성 유기 화학 분야에 공지된 표준 공정에 따라 제조할 수 있다. 예를 들어, SMC 및/또는 물질의 산성 염은, 전형적으로 적합한 산과의 반응을 수반하는, 통상적인 방법을 이용해 SMC 또는 물질의 유리 염기 형태로부터 제조될 수 있다. 일반적으로, SMC 또는 물질의 염기 형태는 메탄올 또는 에탄올과 같은 극성 유기 용매에 용해되며, 산이 여기에 첨가된다. 제조되는 염은 극성이 낮은 용매를 첨가함으로써, 용액에서 석출시키거나 또는 이끌어낼 수 있다. 산 부가염을 제조하기에 적합한 산으로는, 유기 산, 예컨대, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 살리실산, 등 뿐만 아니라 무기 산, 예컨대, 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
산 부가 염은 적절한 염기 처리에 의해 유리 염기로 다시 변환될 수 있다. SMC 및/또는 물질의 일부 전형적인 산 부가 염, 예를 들어, 할라이드 염은 하이드로클로르산 또는 브롬화수소산을 이용해 제조될 수 있다. 역으로, 본 발명의 SMC 및/또는 물질의 염기성 염의 제조는 소듐 하이드록사이드, 포타슘 하이드록사이드, 암모늄 하이드록사이드, 칼슘 하이드록사이드 또는 트리메틸아민 등과 같은 약제학적으로 허용가능한 염기를 이용해 비슷한 방식으로 제조될 수 있다. 일부 전형적인 염기성 염으로는 알칼리 금속 염, 예를 들어, 소듐염 및 구리염 등이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
에스테르의 제조는 예를 들어, SMC 및/또는 물질의 분자 구조 내에 존재하는 하이드록시기 및/또는 카르복시기의 관능화를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 에스테르는 유리 알코올 기의 아실-치환된 유도체, 즉, R이 알킬이고, 바람직하게는 저급 알킬인 식 RCOOH의 카르복시산으로부터 유래되는 모이어티이다. 에스테르는, 필요에 따라, 통상적인 수소화분해 (hydrogenolysis) 또는 가수분해 공정을 이용함으로써 유리 산으로 다시 변환될 수 있다.
또한, 아미드는 당해 기술 분야에 공지된 기법을 이용해 제조할 수 있다. 예를 들어, 아미드는 적절한 아민 반응제를 사용해 에스테르로부터, 또는 암모니아 또는 저급 알킬 아민과의 반응에 의해 무수물 또는 산 클로라이드로부터 제조할 수 있다.
본 발명의 SMC 또는 물질은 약제학적으로 허용가능한 담체 (부형제)와 조합되어 약학적 조성물을 형성할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체는, 예를 들어, 조성물을 안정화하거나, SMC 또는 물질의 흡수를 증가 또는 감소시키거나, 또는 혈액 뇌 장벽 (적절한 경우)의 침투성을 개선하도록 작용하는, 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 화합물(들)을 포함할 수 있다. 생리학적으로 허용가능한 화합물은 예를 들어, 탄수화물 (예, 글루코스, 슈크로스 또는 덱스트란), 항산화제 (예, 아스코르브산 또는 글루타티온), 킬레이트제, 저 분자량 단백질, 보호 및 흡수 (uptake) 강화제 (예, 지질), 활성 물질의 제거 또는 가수분해를 감소시키는 조성물, 또는 부형제 또는 기타 안정화제 및/또는 완충제를 포함할 수도 있다. 특히 정제, 캡슐제, 겔 캡 (gel cap) 등의 사용에 있어, 그외 생리학적으로 허용가능한 화합물은 비-배타적으로, 결합제, 희석제/충진제, 붕해제, 윤활제, 현탁화제 등을 포함한다. 특정 구현예들에서, 약학적 제형은 SMC 또는 물질의 전달 또는 효능을 강화할 수 있다.
다양한 구현예들에서, 본 발명의 SMC 또는 물질은 비경구, 국소 (topical), 경구, 코 (또는 흡입형), 직장 또는 국부 (local) 투여용으로 준비될 수 있다. 투여는 예를 들어, 경피적으로, 예방적으로 또는 에어로졸에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 투여 방법에 따라 다양한 단위 투약 형태 (unit dosage form)로 투여될 수 있다. 적합한 단위 투약 형태로는 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 로젠제 (lozenges), 좌제, 패치, 코 스프레이, 주사제 (injectibles), 이식가능한 지속-방출형 제형 (implantable sustained-release formulation) 및 지질 복합체 (lipid complexe) 등이 있으나, 이들로 한정되진 않는다.
특정 구현예들에서, 부형제 (예, 락토스, 슈크로스, 전분, 만니톨, 등), 선택적인 붕괴제 (예, 칼슘 카보네이트, 카르복시메틸셀룰로스 칼슘, 소듐 전분 글리콜레이트, 크로스포비돈, 등), 결합제 (예, alpha-전분, 아라비아 검, 미세결정 셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필셀룰로스, 사이클로덱스트린, 등) 또는 선택적인 윤활제 (예, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜 6000, 등)이 SMC 또는 물질에 첨가될 수 있으며, 제조되는 조성물을 압착하여 경구 투약 형태 (예, 정제)를 제조할 수 있다. 특정 구현예에서, 압착 산물은, 예를 들어, 압착 산물의 맛을 은폐하거나, 압착 산물의 장 용해를 촉진하기 위해, 또는 SMC 또는 물질의 지속 방출을 촉진하기 위해, 코팅될 수 있다. 적합한 코팅 물질로는, 에틸-셀룰로스, 하이드록시메틸셀룰로스, 폴리옥시에틸렌 글리콜, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 하이드록시프로필메틸셀룰로스 프탈레이트 및 Eudragit (Rohm & Haas, Germany; 메타크릴-아크릴 코폴리머) 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
SMC 또는 물질을 포함하는 약학적 조성물에 포함될 수 있는 생리학적으로 허용가능한 그외 화합물은, 습윤제, 유화제, 분산화제 또는 미생물의 증식 또는 작용을 방지하는데 특히 유용한 보존제를 포함할 수 있다. 다양한 보존제들이 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 페놀 및 아스코르브산 등이 있다. 생리학적으로 허용가능한 화합물 등의 약제학적으로 허용가능한 담체(들)의 선택은, 예를 들어, SMC 또는 물질의 투여 경로 및 SMC 또는 물질의 구체적인 물리-화학적 특징에 따라 결정된다.
특정 구현예들에서, SMC 또는 물질을 포함하는 약학적 조성물에 사용하기 위한 하나 이상의 부형제는 무균성일 수 있거나 및/또는 부적절한 물질이 실질적으로 없을 수 있다. 이러한 조성물은 당해 기술 분야에 공지된 통상적인 기법에 의해 멸균될 수 있다. 정제 및 캡슐제와 같은 다양한 경구 투약 형태의 부형제의 경우, 멸균성이 필수적이진 않다. 표준 방식들이 당해 기술 분야에, 예를 들어, USP/NF standard에 공지되어 있다.
본 발명의 SMC 또는 물질의 약학적 조성물은 투여량, 필요한 투여 빈도 및 투여 빈도 및 투여량과 관련된 약학적 조성물에 대한 개체의 공지된 또는 예상되는 허용성에 따라, 1회 투여로 또는 다회 투여 방식으로 투여될 수 있다. 다양한 구현예들에서, 조성물은 암을 효과적으로 치료하기 위해 본 발명의 SMC 또는 물질을 충분한 양을 제공할 수 있다.
개체에게 투여되는 SMC 또는 물질의 양 및/또는 농도는 광범위하게 달라질 수 있으며, 전형적으로는 SMC 또는 물질의 활성 및 개체의 특징, 예를 들어, 종 및 체중 뿐만 아니라 구체적인 투여 방식과 개체의 필요성, 예를 들어 암 타입과 관련한 필요성에 일차적으로 기초하여 선택될 것이다. 투여량은 특정 개체 또는 개체 그룹에서 치료학적 및/또는 예방학적 용법을 최적화하기 위해 변경할 수 있다.
특정 구현예들에서, 본 발명의 SMC 또는 물질은 구강으로, 예를 들어, 로젠제, 에어로졸 스프레이, 입세척제, 코팅된 스왑 (coated swab)에 의해 또는 당해 기술 분야에 공지된 그외 기전을 사용하여 투여된다.
특정 구현예들에서, 본 발명의 SMC 또는 물질은 수술 시점에 종양 절제시 생기는 뇌강내 삽입되는 서방형 (slow-release) 고체 웨이퍼 (solid wafer)를 사용해 투여된다. 웨이퍼는 SMC 또는 폴리(I:C)를 함유한 생분해성 폴리무수물 웨이퍼 (polyanhydride wafer)일 수 있다. 배치되는 웨이퍼의 개수는 원발성 뇌암을 외과적으로 적출한 다음 절제 공간 (resection cavity)의 크기에 따라 결정될 수 있다. 서방형 웨이퍼로부터 뇌 조직으로의 직접적인 약물의 전달은 전신 치료제를 혈액-뇌 장벽을 통과하여 전달하여야 하는 문제를 우회한다. 폴리머 매트릭스는, 유기 용매 중에 약물과 함께 용해되는, 1,3-비스-(p-카르복시페녹시) 프로판과 세바스산 (PCPP-SA; 80:20 몰 비)으로 된 코폴리머로 구성될 수 있으며, 이는 1-20 ㎛ 범위의 미세입자에 분무 건조되고, 웨이퍼로 압착 몰딩된다. 특정 구현예에서, 단단한 웨이퍼 (rigid wafer)는, 물 침투로 처음 10시간 동안 안하이드라이드 결합이 가수분해된 다음, 코폴리머가 주변 수계 환경으로 분해되는, 2-단계 공정으로 분해된다.
특정 구현예들에서, 본 발명의 SMC 또는 물질은 당해 기술 분야에 공지된 표준 방법에 따라 전신 투여할 수 있다 (예, 경구 또는 주사제로서). 특정 구현예들에서, SMC 또는 물질은 경피 약물 전달 시스템, 즉, 경피 "패치"를 사용해 피부를 통해 전달할 수 있으며, 이때 SMC 또는 물질은 전형적으로 피부에 고정시킬 약물 전달 디바이스로서 사용되는 박층 구조 (laminated structure) 내에 함유된다. 이러한 구조에서, 약물 조성물은 전형적으로 상위 지지층 (upper backing layer)의 하부 저장소 (reservoir) 또는 층 내에 포함된다. 경피 패치의 저장소는 피부의 표면에 전달하기 위해 궁극적으로 이용가능한 함량으로 SMC 또는 물질을 포함한다. 따라서, 저장소는, 예를 들어, 패치의 지지층 위의 부착층 내에, 또는 당해 기술 분야에 공지된 다양한 여러가지 임의의 매트릭스 제형 내에 본 발명의 SMC 또는 물질을 포함할 수 있다. 패치는 하나의 저장소 또는 복수의 저장소들을 포함할 수 있다.
구체적인 경피 패치에 대한 구현예에서, 저장소는 약물을 전달하는 동안 시스템을 피부에 고정하기 위해 사용되는 약제학적으로 허용가능한 접촉 접착제 물질로 된 폴리머 매트릭스를 포함할 수 있다. 적합한 피부 접촉 접착제 물질의 예로는 폴리에틸렌, 폴리실록산, 폴리이소부틸렌, 폴리아크릴레이트 및 폴리우레탄 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 다른 예로, SMC 및/또는 물질-함유 저장소 및 피부 접촉 접착제는 별개의 구분되는 층으로서 존재하며, 접착제 층이 저장소 하부에 존재하고, 이 경우, 이는 전술한 바와 같이 폴리머 매트릭스, 액체 또는 하이드로겔 저장소이거나 또는 당해 기술 분야에 공지된 다른 형태의 저장소일 수 있다. 이들 박층에서, 디바이스의 상부 표면으로서 제공되는, 지지층은, 바람직하게는 패치의 기본적인 구조 요소로서 기능하며, 디바이스에 유연성의 상당 부분을 제공한다. 지지층으로 선택되는 물질은 바람직하게는 SMC 및/또는 물질 및 존재하는 임의의 다른 물질에 실질적으로 비투과성이다.
국소 전달을 위한 부가적인 제형으로는, 연고제, 젤제, 스프레이제, 액체 (fluid) 및 크림제 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 연고제는 전형적으로 페트롤륨 또는 그외 페트롤륨 유도체에 기반한 반고체 제제이다. SMC 또는 물질을 포함하는 크림제는 전형적으로 점성의 액체 또는 반고체 유제, 예를 들어, 수중유 유제 또는 유중수 유제이다. 크림 베이스는 전형적으로 수세 가능하며, 오일상, 유화제 및 수상을 포함한다. 크림 베이스에서, 때때로 "내부" 상으로도 지칭되는 오일상은 일반적으로 페트롤라툼과 지방 알코올, 예를 들어, 세틸 알코올 또는 스테아릴 알코올로 구성되며; 수상은 일반적으로, 필수적이진 않지만 오일상 보다 다량이며, 일반적으로 습윤제 (humectant)를 포함한다. 크림 제형에서 유화제는 일반적으로 비-이온성, 양이온성, 음이온성 또는 양쪽성 계면활성제이다. 사용할 구체적인 연고 또는 크림 베이스는 당해 기술 분야에 따라 최적의 약물 전달을 제공하도록 선택될 수 있다. 다른 담체 또는 비히클과 같이, 연고 베이스는 불활성이며, 안정적이며, 비-자극성이며, 비-민감성일 수 있다.
다양한 볼 제형 및 설하 제형도 고려된다.
특정 구현예들에서, 본 발명의 SMC 또는 물질의 투여는 비경구일 수 있다. 비경구 투여는 척수내, 경막외, 척추강내, 피하 또는 정맥내 투여를 포함할 수 있다. 비경구 투여의 수단을 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 특정 구현예에서, 비경구 투여는 피하 이식되는 디바이스를 포함할 수도 있다.
특정 구현예들에서, SMC 또는 물질을 뇌에 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 전신 투여를 포함하는 구현예에서, SMC 또는 물질의 혈액 뇌 장벽을 통과를 요구할 수 있다. 다양한 구현예에서, SMC 또는 물질을, SMC 또는 물질을 혈액 뇌 장벽을 통과하여 운반할 수 있는, 양이온성 덴드리머 또는 아르기닌이 풍부한 펩타이드와 같은 담체 분자와 함께 공동-투여함으로써, 이를 용이하게 달성할 수 있다.
특정 구현예들에서, SMC 또는 물질은, 생체적합한 방출 시스템 (예, 저장소) 이식을 통한 이식에 의해, 이식된 캐뉼러를 통한 직접 투여에 의해, 이식되거나 또는 부분적으로 이식된 약물 펌프를 통한 투여에 의해, 또는 당해 기술 분야에 공지된 비슷한 기능의 기전에 의해 뇌로 직접 전달할 수 있다. 특정 구현예들에서, SMC 또는 물질은 전신으로 (예, 정맥 주사) 투여될 수 있다. 특정 구현예들에서, SMC 또는 물질이, 혈액 뇌 장벽을 통과한 수송을 강화하기 위해 약학적 조성물에 포함되는 부가적인 화합물의 사용없이, 혈액 뇌 장벽을 통과하여 운반되는 것도 예상할 수 있다.
특정 구현예들에서, 본 발명의 SMC 또는 물질 중 하나 이상은, 예를 들어, 다량의 물, 알코올, 과산화수소 또는 기타 희석제에 희석 또는 첨가하기 위해 준비된 저장 용기 또는 용해성 캡슐 내, 농축물 (concentrate)로서, 공급될 수 있다. 본 발명의 농축물은 특정량의 SMC 또는 물질로 및/또는 특정 총 부피로 공급될 수 있다. 농축물은 투여하기 전 일정량의 희석제로 희석하기 위한 용도로 제형화될 수 있다.
SMC 또는 물질은 정제, 캡슐제, 엘릭서제 또는 시럽제 형태로 경구로, 또는 좌제 형태로 직장으로 투여될 수 있다. 또한, 이들 화합물은 폼제 (foam), 로션제, 점적제, 크림제, 연고제, 연화제 (emollient) 또는 겔제 형태로 국소적으로 투여될 수도 있다. 화합물의 비경구 투여는, 예를 들어, 식염수 용액 형태로, 또는 리포좀에 화합물을 병합하여, 적절하게 수행된다. 화합물 자체가 용해될 만큼 충분히 용해성이 아닐 경우, 에탄올과 같은 용해제가 사용될 수 있다. 다른 적합한 제형과 투여 방식들이 당해 기술 분야에 공지되어 있거나, 또는 당해 기술 분야로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 SMC 또는 물질은 암을 가진 것으로 진단된 포유류와 같이 필요한 포유류에게 투여될 수 있다. 본 발명의 SMC 또는 물질은 세포자살을 강화하거나 및/또는 암을 치료하기 위해 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 치료학적 유효량은 개체의 나이, 개체의 성별, 개체의 종, 구체적인 병태, 증상의 중증도 및 개체의 전체적인 건강 상태에 따라 결정될 수 있다.
본 발명은 암으로 진단된 인간 등의 인간을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 동물에, 예를 들어 수의학적인 용도로 투여하기에 적합할 수 있다. 본 발명의 화합물에 대한 임의 구현예는 본 발명의 약학적 조성물을 인간 이외의 유기체, 예를 들어, 인간을 제외한 영장류, 개, 말, 고양이, 돼지, 유제류 또는 토끼목 유기체 또는 그외 척추동물 종에 본 발명의 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 요법은, 단독으로, 또는 다른 요법과, 예를 들어 다른 항암 요법과 함께 수행될 수 있으며, 집에서, 진료소, 임상 센터에서, 병원의 외래 병동 또는 병원에서 제공될 수 있다. 치료는 선택적으로 의사가 요법의 효과를 면밀하게 관찰하고 필요한 임의 조정을 수행하거나 또는 외래 환자 수술 (outpatient basis)에 착수할 수 있도록, 병원에서 착수한다. 요법의 기간은 치료 중인 질환 또는 장애의 타입, 개체의 나이와 증상, 개체의 질환의 병기와 타입, 그리고 환자가 치료에 어떻게 반응하는지에 따라 결정된다.
특정 구현예들에서, 본 발명의 요법의 조합은 재조합 인터페론, 예를 들어, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 페길화 IFN 또는 리포솜 인터페론을 이용한 치료를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 요법의 조합은, 예를 들어, 고립된-사지 관류 (isolated-limb perfusion)에 대해 재조합 TNF-α를 이용한 치료를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조합 요법은 TNF-α 또는 IFN-유도성 화합물, 예로, DMXAA, 리바비린 (ribavirin) 등 중 하나 이상을 이용한 치료를 더 포함한다. 본 발명과 조합하여 사용될 수 있는 부가적인 암 면역요법은 항체, 예를 들어, 단일클론 항체, 타겟팅 CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2 또는 기타 면역체크포인트 저해제를 포함한다. 사이클릭 다이뉴클레오티드 (CDN) [사이클릭 다이-GMP (구아노신 5'-모노포스페이트) (CDG), 사이클릭 다이-AMP (아데노신 5'-모노포스페이트) (CDA) 및 사이클릭 GMP-AMP (cGAMP)]는, 인터페론 유전자의 세포질 패턴 인지 수용체 자극인자 (STING)를 통해 TBK1/인터페론 조절 인자 3 (IRF3)/타입 I 인터페론 (IFN) 신호전달 축을 활성화하는 병원체-관련 분자 패턴 분자 (PAMP) 계열이다. 특정 구현예들에서, STING 작용제는 SMC와 조합하여 암을 치료할 수 있다.
다양한 구현예들에서 투여 경로로는 국소, 경피, 코 및 전신 투여 (예, 정맥내, 근육내, 피하, 흡입, 직장, 볼, 질, 복막내, 관절내, 안, 귀 또는 경구 투여) 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본원에서, "전신 투여"는 모든 비-피부 (nondermal route) 투여 경로를 지칭하며, 구체적으로는 국소 및 경피 투여 경로를 제외한다.
전술한 임의 구현예에서, 투여 경로는 SMC 또는 물질의 특징에 기초하여 최적화할 수 있다. 일부 경우, SMC 또는 물질은 소분자 또는 화합물이다. 다른 경우, SMC 또는 물질은 핵산이다. 또 다른 경우, 물질은 세포 또는 바이러스일 수 있다. 이들 또는 그외 구현예들 중 임의 구현예에서, 적절한 제형 및 투여 경로는 당해 기술 분야에 따라 선택될 것이다.
본 발명의 구현예에서, SMC 및 물질은 필요한 개체에, 예를 들어, 암에 걸린 개체에 투여된다. 어떤 경우에는, SMC와 물질은 동시에 투여될 것이다. 일부 구현예에서, SMC와 물질은 단일한 치료학적 투약 형태로 존재할 수 있다. 다른 구현예들에서, SMC와 물질은 필요한 개체에 분리하여 투여될 수 있다. 분리하여 투여되는 경우, SMC와 물질은 동시에 또는 서로 다른 시점에 투여될 수 있다. 어떤 경우에는, 개체는 SMC 1회 투여량 및 물질 1회 투여량을 제공받을 것이다. 특정 구현예들에서, SMC와 물질 중 하나 이상은 개체에 2회 이상으로 투여될 것이다. 특정 구현예들에서, SMC의 투여 횟수와 물질의 투여 횟수는 동일하지 않으며, 즉, SMC가 첫번째로 투여되고, 물질은 2번째로 투여된다.
일부 구현예에서, SMC는 물질 투여 후 1주일 이내에 투여된다. 특정 구현예에서, SMC는 물질 투여 후 3일 (72시간) 이내에 투여된다. 보다 구체적인 구현예에서, SMC는 물질 투여 후 1일 (24시간) 이내에 투여된다.
본 발명의 임의 방법에 대한 특정 구현예에서, SMC와 물질은 서로 28일 이하의 기간내에, 예를 들어, 서로 14일 이내에 투여된다. 본 발명의 임의 방법에 대한 특정 구현예에서, SMC와 물질은, 예를 들어 동시에, 또는 서로 1분, 5분, 10분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간, 2일, 4일, 8일, 10일, 12일, 16일, 20일, 24일 또는 28일 이내에 투여된다. 임의 구현예에서, 본 발명의 SMC의 1차 투여는 본 발명의 물질의 1차 투여 전에 이루어질 수 있다. 다른 예로, 임의 구현예에서, 본 발명의 SMC의 1차 투여는 본 발명의 물질의 1차 투여 이후에 이루어질 수 있다. 본 발명의 SMC 및/또는 물질이 개체에 2회 이상으로 투여될 수 있고, 이 경우, 본 발명의 SMC와 물질의 투여는 서로 다른 횟수로 투여될 수 있기 때문에, SMC의 투여와 물질의 투여 사이의 기간이 소정의 치료 코스 동안 또는 소정의 개체에 대해 일정하게 유지되어야 할 필요는 없다.
SMC 및 물질 중 하나 또는 둘다는 저 투여량 또는 고 투여량으로 투여될 수 있다. SMC와 물질이 각각 제형화되는 경우, 각 물질의 약동학 프로파일은 제형, 투여량 및 투여 경로 등에 적절하게 매칭될 수 있다. 어떤 경우에는, SMC가 표준 투여량 또는 고 투여량으로 투여되고, 물질은 저 투여량으로 투여된다. 어떤 경우에는, SMC가 저 투여량으로 투여되고, 물질은 표준 투여량 또는 고 투여량으로 투여된다. 어떤 경우에는, SMC와 물질 둘다 표준 투여량 또는 고 투여량으로 투여된다. 어떤 경우에는, SMC와 물질 둘다 저 투여량으로 투여된다.
조합물의 각 구성성분의 투여량 및 투여 빈도는 독립적으로 조절될 수 있다. 예를 들어, 한 성분은 매일 3회로 투여되고, 제2 성분은 매일 1회로 투여될 수 있거나, 또는 한 성분은 주당 1회로, 제2 성분은 2주당 1회로 투여될 수 있다. 조합 요법은 개체의 신체가 치료 효과로부터 회복될 기회를 가지도록 휴지기를 포함하는 단속적인 (on-and-off) 사이클로 제공될 수 있다.
키트
일반적으로, 본 발명의 키트는 하나 이상의 SMC와 하나 이상의 물질을 포함한다. 이는 키트에 개별 조성물로서 제공되거나, 또는 전술한 바와 같이 하나의 조성물로 조합될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 SMC 및 하나 이상의 물질을 투여하기 위한 설명서를 포함할 수도 있다.
또한, 본 발명의 키트는 본 발명의 SMC 또는 물질 이외의 암을 치료하는 것으로 알려진 물질 등과 같은 부가적인 약학적으로 허용가능한 물질을 투여하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.
각각 또는 분리하여 제형화된 물질이 키트로서 함께 패킹될 수 있다. 비-배타적인 예로는, 예를 들어, 2개의 환제, 환제 및 산제, 좌제 및 바이얼내 액체, 2종의 국소 크림제, 연고제, 폼제를 포함하는 키트 등이 있다. 키트는 개체에 단위 용량을 투여하도록 보조하는 옵션 요소, 예를 들어, 분말 형태를 재구성하기 위한 바이얼, 주사용 시린지, 맞춤식 IV 전달 시스템, 흡입기 등을 포함할 수 있다. 또한, 단위 용량 키트는 조성물을 준비 및 투여하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 키트는 개체에 대한 1회 단위 용량으로서, 특정 개체에 대한 다회용으로 (일정한 투여량 용법 또는 개별 화합물이 치료 진행에 따라 효능이 달라질 수 있는 경우) 제조될 수 있거나; 또는 키트는 여러 개체에 투여하기 적합한 다회분을 포함할 수 있다 ("벌킹 패킹"). 키트 구성 요소는 카톤 (carton), 블리스터 팩, 바틀, 튜브 등 내에 조립될 수 있다.
청구되는 조합물의 각 화합물의 투여량은, 투여 방법, 치료할 질환 (예, 암 타입), 질환의 중증도 및 치료할 개체의 나이, 체중 및 건강 등의 여러가지 인자들에 따라 결정된다. 또한, 특정 개체에 대한 약물유전체 (치료제의 약동학, 약력학 또는 효능 프로파일) 정보가 투여량 용법 또는 그외 투여 측면에 영향을 미칠 수도 있다.
실시예
실시예 1: Smac 모방체는 암을 선천 면역 시스템에 의한 파괴되게 유도한다
Smac 모방 화합물은 임상 1상에서 암 환자에서 안전한 것으로 입증된 세포자살 감작화 약물 (sensitizing drug) 계열이다. 선천적인 항-병원체 반응의 자극은 Smac 모방체로 처리된 종양의 사멸을 촉발시키는 강력하지만 안전한 염증성 "사이토카인 폭풍"을 발생시킬 수 있다. 본 실시예는, 종양 용해성 바이러스와 보강제, 예를 들어 폴리(I:C) 및 CpG를 통한 선천적인 면역 반응의 활성화가 IFNβ, TNFα 또는 TRAIL에 의해 매개되는 방식으로 Smac 모방체로 처리된 암 세포의 방관자 사멸을 유발함을, 입증한다. 이러한 치료학적 전략은 영구적인 치유, 예를 들어, 몇가지 공격적인 마우스 암 모델에서 영구적인 치유를 유도할 수 있다. 본 발명에 제공된 데이터는, 암을 치료하기 위해, 인간 임상 실험에서 안전성이 입증된 상기한 그리고 그외 선천적인 면역 자극제와 Smac 모방체의 조합 사용을 강하게 시사한다.
본 실시예에서는, 병원체 모방체를 이용한 선천적인 면역 시스템의 자극이 SMC가 처리된 종양에서 세포자살을 개시하는데 필요한 사이토카인 환경 (milieu)을 구축하는데 안전하고 효과적인 전략인지를, 조사한다. 본 발명자들은, 본원에서, 비-병원성의 종양 용해성 바이러스 뿐만 아니라 미생물 RNA 또는 DNA의 모방체, 예를 들어, poly (I:C) 및 CpG가, IFNβ, TNFα 또는 TRAIL 생산과 의존적인, SMC로 처리된 암 세포의 방관자 사멸을 유도함을 개시한다. 중요한 점은, 이러한 치료학적 전략이 생체내에서 허용적이었으며, 몇가지 공격적인 마우스 암 모델에서 영구적인 치유를 유발한다는 것이다.
SMC 요법은 종양 용해성 바이러스 감염시 암 세포를 방관자 세포 사멸에 민감하게 만든다
종양 용해성 바이러스 (OV)는 현재 임상 I-III 중에 있는 새로운 암 생물요법제이다. OV 요법의 한가지 장애는, 종양에서 항-바이러스 상태를 구축하는, 숙주에 의한 타입 I IFN- 및 NFκB-반응성 사이토카인의 유도일 수 있다. 선천적인 면역 사이토카인을 이용해 SMC 전처리된 암 세포에서 세포자살을 유도할 수 있는 지를 평가하였다. 이를 위해, 소규모의 종양 유래 세포주와 정상 세포주 패널 (n=30)에서 SMC LCL161 및 종양 용해성 랍도바이러스 VSVΔ51에 대한 반응성을 스크리닝하였다. LCL161 화합물이 SMC 클래스에서 임상적으로 가장 최신 약물이어서 이를 선택하고, VSVΔ51이 견고한 항-바이러스성 사이토카인 반응을 유도하는 것으로 알려져 있어 이를 선택하였다. 테스트한 암 세포주 28주 중 15주 (54%)에서, SMC 처리가 민감성 VSVΔ51의 EC50을 10 내지 10,000배로 증가시켰다 (도 6, 및 도 1a 및 1b의 해당 실시예). 마찬가지로, 저용량의 VSVΔ51이 대표적인 2종의 세포주, 즉 마우스 유방암 EMT6 및 인간 교모세포종 SNB75 세포주에서 SMC 요법의 EC50을 미정의 수준 (>2500 nM)에서 각각 4.5 및 21.9 nM로 감소시켰다 (도 1c). 조합 지수 분석에서, SMC 요법과 VSVΔ51의 상호작용이 상승적인 것으로 확인되었다 (도 7). 다른 4종의 SMS와 5종의 다른 종양 용해성 바이러스를 이용한 실험들에서, 다양한 1가 SMC 및 2가 SMC가 VSVΔ51과 상승작용하는 것으로 확인되었다 (도 8). 본 발명자들은, 종양 용해성 랍도바이러스, VSVΔ51 및 Maraba-MG1이, 선천적인 면역 신호전달의 측면들을 해제시키기 위한 정교한 기전을 모두 가지고 있는 HSV, 레오바이러스, 백시니아 및 야생형 VSV 플랫폼과 비교해, SMC와 상승작용하여 방관자 사멸을 유발하는데 우수하다는 것을 확인하였다 (도 9a 및 9b). RNAi-매개 침묵화를 이용한 유전자 실험에서, XIAP 및 cIAP 둘다 VSVΔ51과의 상승 작용을 달성하기 위해 저해되어야 함이 입증되었다 (도 10a, 10b 및 24c). 종양-유래 세포주에서의 결과와 극명하게 대조적으로, 암 세포가 아닌 GM38 일차 인간 피부 섬유모세포 및 HSkM 인간 골격근 모세포 (skeletal myoblast)는 VSVΔ51 및 SMC 조합 요법에 의해 영향을 받지 않았다 (도 6). 요컨대, 이들 데이터는, 종양 용해성 VSV가 종양-선택적인 방식으로 SMC 요법과 상승작용함을, 보여준다.
VSVΔ51이 바이러스로 감염되지 않은 IAP-고갈된 이웃 세포에서 방관자 세포 사멸을 유도하는 지를 확인하기 위해, 세포에 SMC를 처리한 다음 저용량의 VSVΔ51 (MOI = 0.01 세포당 감염성 입자의 개수)을 감염시켰다. VSVΔ51으로 감염된 (이후 UV 광에 의해 불활성화됨) 세포로부터 유래된 컨디셔닝화된 배지가, SMC로 처리된 바이러스 나이브 암 세포의 플레이트에 첨가하였을 때, 사멸을 유발할 수 있는 지를 평가하였다. 컨디셔닝화된 배지는, 세포에 SMC가 공동-처리된 경우에만, 세포 사멸을 유발하였다 (도 1d). 또한, 바이러스를 1회 감염으로 한정하는 당단백질을 코딩하는 유전자에 결손 (VSVΔ51ΔG)을 가진 저용량의 VSVΔ51의 pseudo-typed G-less 균주 (MOI = 0.1)가, SMC로 처리된 암 세포의 전체 플레이트에 독성을 나타낸다는 것을 발견하였다 (도 1e). 마지막으로, 형광 테그를 발현하는 VSVΔ51의 전파를 지연시키기 위해 사용된, 아가로스가 적층된 세포에서 세포독성 분석을 수행하였으며, 바이러스 감염 구역 바깥쪽에서 SMC 처리 세포에 대한 급격한 세포 사멸을 관찰하였다 (도 1f 및 11). 전체적으로, 이들 결과는, VSVΔ51 감염이, SMC 처리된 이웃한 비-감염 암 세포에서 방관자 세포 사멸을 강하게 유도할 수 있는 하나 이상의 용해성 인자의 방출을 발생시킨다는 것을, 보여준다.
SMC 요법은 종양 용해성 VSV에 대한 세포의 선천적인 면역 반응을 손상시키지 않는다.
포유류 종양 세포에서 RNA 바이러스 감염에 대한 세포의 선천적인 면역 반응은 사이토졸 (RIG-I-유사 수용체, RLR) 및 엔도좀 (Toll-유사 수용체, TLR) 바이러스 RNA 센서 패밀리의 멤버에 의해 개시될 수 있다. 촉발되면, 이들 수용체는 병렬적인 IFN-반응 인자 (IRF) 3/7 및 핵 인자 κB (NF-κB) 세포 신호전달 케스케이드를 개시할 수 있다. 이들 신호는 IFN의 생산 및 이의 반응성 유전자 뿐만 아니라 다수의 염증성 케모카인과 사이토카인을 누적시킬 수 있다. 이는 이웃한 세포들이 항-바이러스 유전자 무기를 우선적으로 발현하게 유도하고, 또한 선천 및획득 면역 시스템의 세포를 동원 및 활성화하여, 궁극적으로 바이러스 감염의 박멸에 일조하게 된다. 최근, cIAP 단백질은, RLR 및 TLR로부터 발생되는 등의, 병원체를 인지한 이후의 수많은 하류 신호전달 경로와 연루된 것으로 확인되었다. 이에, SMC 요법이 종양 세포 및 마우스에서 종양 용해성 VSV 감염에 대한 항-바이러스 반응을 변형시키는 지를 조사하였다. 이를 위해, VSVΔ51 생산성 및 전파에 대한 SMC 요법의 효과를 조사하였다. VSVΔ51 생산성의 한단계 및 다단계 증식 곡선에서, SMC 처리가 EMT6 또는 SNB75 세포에서 시험관내에서 VSVΔ51의 증식 카이네틱스에 영향을 미치지 않는 것으로 드러났다 (도 2a). 또한, 저속 촬영 현미경 검경을 통한 분석에서, SMC 처리가 종양 세포에 대한 VSVΔ51 감염성 또는 이의 전파를 변형시키지 않는 것으로 입증되었다 (도 2b). 아울러, 생체내 바이러스 복제 및 전파를 IVIS 촬영 및 조직 바이러스 타이트레이션을 이용해 종양 부하를 측정함으로써 분석하였다. EMT6 종양-보유 마우스에서 SMC 처리시 바이러스 카이네틱스에 차이가 관찰되지 않았다 (도 12a 및 12b). EMT6 및 SNB75 세포 둘다 VSV 생활주기를 조절하는 기능성 타입 I IFN 반응을 나타내므로, 이들 데이터는, SMC 요법이 암 세포에서 항바이러스 신호전달 케스케이드에 영향을 미치지 않는다는, 강력한 간접 증거를 제시한다.
보다 심층적으로 입증하기 위해, VSVΔ51 및 SMC로 처리된 EMT6 및 SNB75 세포에서 IFNβ 생산을 측정하였다. 실험에서, SMC 처리된 암 세포가 VSVΔ51 단독과 비교해 약간 낮은 수준으로, IFNβ를 분비함으로써 VSVΔ51에 반응하는 것으로 드러났다 (도 2c). SMC 처리된 세포로부터 약화된 IFNβ 분비가 하류 IFN 자극된 유전자 (ISG)의 유도와 어떠한 관련이 있는 지를 확인하고자 하였다. VSVΔ51 및 SMC로 처리된 세포에서, 소규모의 ISG 패널에 대한 정량적인 RT-PCR 분석을 통해, IAP 저해는 종양 용해성 VSV 감염에 반응한 ISG 유전자 발현과 관련없는 것으로 확인되었다 (도 2d). 이러한 결과와 일치하여, 웨스턴 블롯 분석에서도, SMC는 IFNβ의 하류 Jak/Stat 신호전달의 활성화를 변형시키지 않는 것으로 나타났다 (도 2e 및 24a). 종합해보면, 이들 데이터는 종양 세포가 VSVΔ51 감염을 감지하여 반응하는 능력을 SMC가 방해하지 않는다는 것을 시사해준다.
IFNβ는 SMC와 종양 용해성 VSV의 병용-요법시 방광자 세포 사멸을 구축한다
SMC는 다수의 암 세포주들을 TNFα, TRAIL 및 IL-1β에 의해 유발되는 카스파제 8-의존적인 세포자살 쪽으로 반응하게 유도한다. RNA 바이러스가 이들 사이토카인을 세포의 항바이러스 반응의 일환으로 생산되게 촉발할 수 있기 때문에, SMC 및 OV 유발성 세포 사멸에서의 사이토카인 신호전달의 참여를 조사하였다. 이를 위해, TNF 수용체 (TNF-R1) 및/또는 TRAIL 수용체 (DR5)를 침묵화시키고, SMC와 VSVΔ51 간의 상승작용을 분석하였다. 본 실험 결과, TNFα 및 TRAIL이 참여할 뿐만 아니라, 총체적으로 방관자 세포 사멸에 필수적인 것으로 드러났다 (도 3A-3H, 13A, 및 24D). 이러한 사실과 일관되게, 웨스턴 블롯 및 면역형광 실험에서도 외인성 세포자살 경로의 강력한 활성화가 확인되었으며, RNAi 넉다운 실험에서 상승적인 반응에 카스파제-8 및 Rip1 둘다 필요한 것으로 입증되었다 (도 14A-14G, 24E, 및 24F). 아울러, VSVΔ51에 TNFα를 조작한 결과, SMC 요법과 몇십배 수준으로 상승작용이 향상되었다 (도 15a 및 15b).
다음으로, 타입 I IFN 수용체 (IFNAR1)를 침묵화시켰으며, 그 결과 IFNAR1 넉다운이 SMC 요법과 종양 용해성 VSV 간의 상승작용을 방지함을 예상치 못하게도 확인하게 되었다 (도 3b, 13b 및 24d). TRAIL은 타입 I IFN28에 반응성인 잘-확립된 ISG이기 때문에, IFNAR1 넉다운이 방관자 사멸을 약화시키지만 완전히 억제하진 않을 것으로 예측되었다. TNFα 및 IL-1β는 IFN 신호전달과 독립적으로 보이지만, 그럼에도 불구하고 바이러스 검출에 따른 하류 NF-κB 신호전달에 반응을 나타낸다. 이런 결과는, TNFα 및/또는 IL-1β의 생산에 있어 non-canonical 타입 I IFN-의존적인 경로의 가능성을 시사한다. 실제, IFNβ, TRAIL, TNFα 및 IL-1β의 mRNA 발현을 프로브로 종양 용해성 VSV 감염시 탐침하였을 때, IFNβ의 유도와 TRAIL 및 TNFα의 유도 사이에 현저한 시간 지연이 나타났다 (도 3C). 이 데이터는, 또한, TNFα가 - TRAIL 처럼 - IFNβ에 부차적으로 유도될 수 있음을 시사해준다. 이 가설을 입증하기 위해, IFNAR1을 침묵화시킨 다음 VSVΔ51을 세포에 처리하였다. IFNAR1 넉다운은 종양 용해성 VSV에 의한 TRAIL 및 TNFα의 유도를 완전히 상쇄시켰다 (도 3d). 또한, 재조합 타입 I IFN (IFNα/β) 및 타입 II IFN (IFNγ)을 이용해 SMC와의 상승작용이 재개되었지만, 타입 III IFN (IL28/29) (도 3E)와는 그렇지 않았다. 요컨대, 이들 데이터는 타입 I IFN이 종양 세포의 VSVΔ51 감염시 TNFα 및 TRAIL의 유도에 필요하다는 것을 시사해준다. 또한, 이들 사이토카인의 생산이 이웃한 비-감염 SMC-처리 세포의 방관자 사멸에 요인이다.
TNFα의 non-canonical 유도를 더욱 조사하기 위해, 재조합 IFNβ로 처리된 SNB75 세포에서 TRAIL 및 TNFα의 mRNA 발현 수준을 측정하였다. 이들 2종의 사이토카인 모두 IFNβ 처리에 의해 유도되었으며 (도 3f), ELISA 실험에서 세포 배양 배지에서 각 해당 단백질 산물의 생산이 검증되었다 (도 3g). 흥미롭게도, TRAIL 유도 시기와 TNFα 유도 시기 사이에 현저한 시간 지연이 존재하였다. TRAIL은 bona fide ISG이고, TNFα는 그렇지 않기 때문에, 이 결과는 TNFα가 IFNβ에 의해 직접 유도되지 않고, IFNβ에 의해 상향 조절된 하류 ISG에 반응하였을 가능성을 제기하였다. 이에, SNB75 세포에서 176종의 사이토카인에 대해 정량적인 RT-PCR을 수행하였으며, IFNβ에 의해 현저하게 상향 조절된 70종이 파악되었다 (표 5). IFNβ에 의한 TNFα의 유도에 있어 이들 ISG의 역할은 현재 조사 중에 있다. SMC 처리는 SNB75 세포에서 TRAIL 및 TNFα의 유도를 강화한다는 것 또한 흥미롭다 (도 3f 및 3g). 아울러, IKK의 도미넌트-네거티브 구조체 (dominant-negative construct)를 사용해, 이러한 IFNβ의 하류 염증성 사이토카인의 생산이, 적어도 부분적으로 고전적인 NF-κB 신호전달에 의존적임을 확인하였다 (도 3h). EMT6 세포에서, SMC 처리가 VSV 감염시 TNFα의 세포 생산을 증가 (5-7배 % 증가)시키는 것으로 나타났다 (도 16). 마지막으로, 또한, (항체 또는 siRNA를 이용한) TNF-R1 신호전달 차단이 SMC 및 VSVΔ51 또는 IFNβ의 존재 하에 EMT6 세포의 사멸을 방지하는 것도 입증되었다 (도 17a-17c 및 24h). 타입 I IFN과 TNFα 간의 관계는 복합적이며, 생물학적 환경에 따라 상보적 (complimentary)이거나 또는 저해 효과를 가진다. 그러나, 본 발명을 임의의 특정 작용 기전으로 제한하고자 하는 것은 아니나, 단순한 작동 모델을 다음과 같이 제안할 수 있다: 종양 용해성 RNA 바이러스에 의해 감염된 종양 세포가 타입 I IFN을 상향 조절하며, 이 과정은 IAP 단백질의 SMC 길항효과에 의해 영향을 받지 않는다. 이후, IFN이 이웃한 비-감염 암 세포에 TNFα와 TRAIL을 발현 및 분비하도록 신호를 보내게 되는데, 이 과정이 SMC 처리에 의해 강화되고, 결과적으로 SMC에 노출된 비-감염된 종양 세포에서 오토크린 및 파라크린 프로그래밍된 세포 사멸이 유도된다 (도 18a 및 18B).
VSV IFNβ 유전자 명 유전자 식별
25465.4 1017.8 CCL8 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 8
13388.9 44.9 IL29 인터루킨 29 (인터페론, λ1)
5629.3 24.3 IFNB1 인터페론, β 1, 섬유모세포
1526.8 16.2 TNFSF15 종양 괴사 인자 (리간드) 슈퍼패밀리, 멤버 15
847 24.6 CCL5 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 5
747.7 17.2 CCL3 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 3
650.9 60.6 TNFSF10 종양 괴사 인자 (리간드) 슈퍼패밀리, 멤버 10
421.3 296.1 IL12A 인터루킨 12A
289.3 10.7 TNFSF18 종양 괴사 인자 (리간드) 슈퍼패밀리, 멤버 18
255.3 18.8 CCL7 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 7
154.2 19.2 IL6 인터루킨 6 (인터페론, β 2)
150.8 12.9 IL1RN 인터루킨 1 수용체 길항제
108.1 25.5 CCL20 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 20
78.6 6.2 CXCL1 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 1
64.7 14.8 CCL2 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 2
62.5 14.5 CCL4 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 4
55.6 1.2 CXCL3 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 3
55.2 4.3 TNF 종양 괴사 인자 (TNF 슈퍼패밀리, 멤버 2)
48.8 4.3 IGF1 인슐린-유사 성장인자 1 (소마토메딘 C)
48.4 2.8 CXCL2 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 2
38.5 3.8 CCL11 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 11
37.5 3.8 HGF 간세포 성장인자
36.5 75.1 NGFB 신경 성장인자, beta 폴리펩타이드
32.9 4 FGF14 섬유모세포 성장인자 14
24.7 25.6 FGF20 섬유모세포 성장인자 20
21.5 16.4 IL1B 인터루킨 1, beta
20 36.3 CSF2 콜로니 자극 인자 2 (과립구-대식세포)
18.3 2.6 GDF3 성장 분화 인자 3
17.2 2 CCL28 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 28
12 2.1 CCL22 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 22
11.3 2.5 CCL17 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 17
10.5 2 CCL13 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 13
10.5 15.3 IL20 인터루킨 20
9.7 22.8 FGF16 섬유모세포 성장인자 16
8.8 3.6 TNFSF14 종양 괴사 인자 (리간드) 슈퍼패밀리, 멤버 14
8.2 2.7 FGF2 섬유모세포 성장인자 2 (염기성)
7.1 8.1 BDNF 뇌-유래 신경영양 인자
7.1 9.7 IL1A 인터루킨 1, alpha
7.1 10.9 ANGPT4 안지오포이에틴 4
7 1.5 TGFB3 형질변환 성장인자, beta 3
7 5.8 IL22 인터루킨 22
6.9 9.7 IL1F5 인터루킨 1 패밀리, 멤버 5 (delta)
6.7 2.4 IFNW1 인터페론, omega 1
6.6 12.6 IL11 인터루킨 11
6.6 25.1 IL1F8 인터루킨 1 패밀리, 멤버 8 (eta)
6.3 -1.3 EDA 엑토디스플라신 A
5.9 8 FGF5 섬유모세포 성장인자 5
5.8 5 VEGFC 혈관 내피세포 성장인자 C
5.2 4.9 LIF 백혈병 저해 인자
5 1.3 CCL25 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 25
4.9 8.3 BMP3 골 형태형성 단백질 3
4.9 1.6 IL17C 인터루킨 17C
4.8 -2.3 TNFSF7 CD70 분자
4.3 2.5 TNFSF8 종양 괴사 인자 (리간드) 슈퍼패밀리, 멤버 8
4.3 2.5 FASLG Fas 리간드 (TNF 슈퍼패밀리, 멤버 6)
4.2 2.7 BMP8B 골 형태형성 단백질 8b
4.2 6 IL7 인터루킨 7
4.1 5.2 CCL24 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 24
4 -2.2 INHBE 인히빈, beta E
4 5.8 IL23A 인터루킨 23, alpha 서브유닛 p19
3.8 -1.1 IL17F 인터루킨 17F
3.7 2.9 CCL21 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 21
3.5 8.5 CSF1 콜로니 자극 인자 1 (대식세포)
3.5 3 IL15 인터루킨 15
3.4 5.7 NRG2 뉴레굴린 2
3.3 N/A INHBB 인히빈, beta B
3.3 N/A LTB 림포톡신 beta (TNF 슈퍼패밀리, 멤버 3)
3.3 N/A BMP7 골 형태형성 단백질 7
3 -3.8 IL1F9 인터루킨 1 패밀리, 멤버 9
2.9 6.1 IL12B 인터루킨 12B
2.8 6.2 FLT3LG Fms-관련 티로신 키나제 3 리간드
2.7 3 FGF1 섬유모세포 성장인자 1 (산성)
2.5 -2 CXCL13 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 13
2.4 2.2 IL17B 인터루킨 17B
2.3 7.8 GDNF 교세포 유래 신경영양 인자
2.3 -1.7 GDF7 성장 분화 인자 7
2.3 -2.4 LTA 림포톡신 alpha (TNF 슈퍼패밀리, 멤버 1)
2.2 1.7 LEFTY2 좌-우 결정 인자 2
2.1 5 FGF19 섬유모세포 성장인자 19
2.1 9.8 FGF23 섬유모세포 성장인자 23
2.1 4.8 CLC 카르디오트로핀-유사 사이토카인 인자 1
2.1 3 ANGPT1 안지오포이에틴 1
2 10.6 TPO 티로이드 퍼옥시다제
2 2.1 EFNA5 Ephrin-A5
1.9 6.4 IL1F10 인터루킨 1 패밀리, 멤버 10 (theta)
1.9 7.6 LEP 렙틴 (비만 상동체, 마우스)
1.8 3 IL5 인터루킨 5 (콜로니-자극 인자, 호산구)
1.8 5.7 IFNE1 인터페론 epsilon 1
1.8 2.7 EGF 상피 성장인자 (beta-urogastrone)
1.7 3.4 CTF1 카르디오프로틴 1
1.7 -1.9 BMP2 골 형태형성 단백질 2
1.7 3 EFNB2 Ephrin-B2
1.6 1 FGF8 섬유모세포 성장인자 8 (안드로겐-유도)
1.6 -2 TGFB2 형질변환 성장인자, beta 2
1.5 -1.6 BMP8A 골 형태형성 단백질 8a
1.5 3.3 NTF5 뉴로트로핀 5 (뉴로트로핀 4/5)
1.5 1 GDF10 성장 분화 인자 10
1.5 1.5 TNFSF13B 종양 괴사 인자 (리간드) 슈퍼패밀리, 멤버 13b
1.5 2.5 IFNA1 인터페론, alpha 1
1.4 -1.3 INHBC 인히빈, beta C
1.4 2.8 FGF7 갈락토키나제 2
1.4 3.3 IL24 인터루킨 24
1.4 -1.1 CCL27 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 27
1.3 1.9 FGF13 섬유모세포 성장인자 13
1.3 1.4 IFNK 인터페론, kappa
1.3 2 ANGPT2 안지오포이에틴 2
1.3 7.6 IL18 인터루킨 18 (인터페론-gamma-유도성 인자)
1.3 7 NRG1 뉴레굴린 1
1.3 4.9 NTF3 뉴로트로핀 3
1.2 15 FGF10 섬유모세포 성장인자 10
1.2 1.9 KITLG KIT 리간드
1.2 -1.3 IL17D 인터루킨 17D
1.2 1.1 TNFSF4 종양 괴사 인자 (리간드) 슈퍼패밀리, 멤버 4
1.2 1.3 VEGFA 혈관 내피세포 성장인자
1.1 2.4 FGF11 섬유모세포 성장인자 11
1.1 -1.4 IL17E 인터루킨 17E
1.1 -2.1 TGFB1 형질변환 성장인자, beta 1
1 3.1 GH1 성장 호르몬 1
-1 6.1 IL9 인터루킨 9
-1 -2.5 EFNB3 Ephrin-B3
-1 1.8 VEGFB 혈관 내피세포 성장인자 B
-1 -1.2 IL1F7 인터루킨 1 패밀리, 멤버 7 (zeta)
-1 -2.1 GDF11 성장 분화 인자 11
-1.1 1.3 ZFP91 징커 핑거 단백질 91 상동체 (마우스)
-1.2 -1.1 BMP6 골 형태형성 단백질 6
-1.2 -1.2 AMH Anti-Mullerian 호르몬
-1.3 -1 LEFTY1 좌-우 결정 인자 1
-1.3 2.4 EFNA3 Ephrin-A3
-1.3 -1.3 LASS1 LAG1 장수 보장 상동체 1
-1.5 1 EFNA4 Ephrin-A4
-1.8 1.3 PDGFD DNA-손상 유도성 단백질 1
-1.8 1.8 IL10 인터루킨 10
-1.9 1.6 GDF5 성장 분화 인자 5
-1.9 1.3 EFNA2 Ephrin-A2
-1.9 -1.5 EFNB1 Ephrin-B1
-1.9 -1.4 GDF8 성장 분화 인자 8
-1.9 1.6 PDGFC 혈소판 성장인자 C
-2.2 2.4 TSLP 흉전 기질 림포포이에틴
-2.3 -1.5 BMP10 골 형태형성 단백질 10
-2.4 -4.6 CXCL12 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 12
-2.5 4 IFNG 인터페론, gamma
-2.6 1.2 EPO 에리트로포이에틴
-2.7 -2.1 GAS6 성장 정지-특이적 6
-2.9 2.9 PRL 프롤액틴
-2.9 -2.1 BMP4 골 형태형성 단백질 4
-2.9 -5.7 INHA 인히빈, alpha
-3 -1.3 GDF9 성장 분화 인자 9
-3.1 -1.5 FGF18 섬유모세포 성장인자 18
-3.2 N/A IL17 인터루킨 17
-3.2 -1.1 IL26 인터루킨 26
-3.4 1.2 EFNA1 Ephrin-A1
-3.8 -1.1 FGF12 섬유모세포 성장인자 12
-4 -2.3 FGF9 섬유모세포 성장인자 9 (교세포-활성화 인자)
-4.5 1.4 CCL26 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 26
-8 9.7 CCL19 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 19
N/A N/A BMP15 골 형태형성 단백질 15
N/A N/A CCL15 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 14
N/A N/A CCL16 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 16
N/A N/A CCL18 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 18
N/A N/A CCL23 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 23
N/A N/A CD40LG CD40 리간드 (TNF 슈퍼패밀리)
N/A N/A CSF3 콜로니 자극 인자 3 (과립구)
N/A N/A CXCL5 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 5
N/A N/A FGF4 섬유모세포 성장인자 4
N/A N/A FGF6 섬유모세포 성장인자 6
N/A N/A GH2 성장 호르몬 2
N/A N/A IL2 인터루킨 2
N/A N/A IL21 인터루킨 21
N/A N/A IL28A 인터루킨 28A (인터페론, lambda 2)
N/A N/A INHBA 인히빈, beta A
N/A N/A NRG3 뉴레굴린 3
N/A N/A TNFSF11 종양 괴사 인자 (리간드) 슈퍼패밀리, 멤버 11
N/A N/A TNFSF13 종양 괴사 인자 (리간드) 슈퍼패밀리, 멤버 13
N/A 6.5 NRG4 뉴레굴린 4
N/A 6.1 IL3 인터루킨 3 (콜로니-자극 인자, multiple)
N/A 1.8 TNFSF9 종양 괴사 인자 (리간드) 슈퍼패밀리, 멤버 9
종양 용해성 VSV는 전임상 동물 암 모델에서 SMC 요법을 강화한다
SMC 및 종양 용해성 VSV 병용-요법을 생체내에서 평가하기 위해, EMT6 유방 암종을 동계 정위 모델 (syngeneic, orthotopic model)로서 사용하였다. 예비 안전성 및 약력학 실험에서, 입을 통한 위관 영양법에 의해 전달되는 LCL161 용량 50 mg/kg은 허용성이 우수하였으며, 일부 경우 적어도 24시간 동안, 최대 48-72시간에 종양에서 cIAP1/2 넉다운을 유도하였다 (도 19a, 19b 및 24g). 종양이 ~100 mm3에 도달하면, 매주 2회로 SMC 및 VSVΔ51을 전신 전달하는 처리를 개시하였다. 단독 물질로서, SMC 요법은 종양 증식 속도 감소 및 보통 수준의 생존성을 유도한 반면, VSVΔ51 처리는 종양 크기 또는 생존성과 관련 없었다 (도 4a 및 4b). 특히 대조적으로, SMC 및 VSVΔ51의 조합 처리는 현저한 종양 퇴행를 유도하였으며, 처리 마우스의 40%에서 영구적인 치유를 도출하였다. 시험관내에서 밝혀진 방관자 사멸 기전과 일관되게, 면역형광 분석 결과, VSVΔ51의 감염성은 일시적이었으며, 종양 내 작은 부위들로 한정되는 것으로 드러난 (도 4c) 반면, 카스파제-3 활성화는 SMC 및 VSVΔ51 공동-처리 종양들에 만연되어 있었다 (도 4d). 아울러, 종양 용해물을 이용한 면역블롯에서 이중 처리된 종양에서 카스파제-8 및 -3의 활성화도 확인되었다 (도 4e, 24b 및 24g). 조합 치료시 동물에서 체중 감소가 나타났지만, 마지막 처리 후 마우스는 완전히 회복되었다 (도 20a).
다른 모델 시스템에서 이러한 생체내 데이터를 검증하기 위해, 누드 마우스 (흉선이 없는)에서 인간 HT-29 결장직장 선암종 이종 모델을 테스트하였다. HT-29는 시험관내에서 SMC 및 VSVΔ51 공동-처리에 의한 방관자 사멸에 반응성이 매우 높은 세포주이다 (도 21a 및 21b). EMT6 모델 시스템에서 확인한 결과와 마찬가지로, SMC 및 VSVΔ51을 이용한 조합 요법은 종양 퇴행 밍 현저한 마우스 생존 연장을 유도하였다 (도 21c). 반면에서, 단일요법은 HT-29 종양에 어떠한 효과도 없었다. 또한, SMC 처리 마우스와 비교해, 이중 처리된 마우스에서 부가적인 체중 감소가 존재하였다 (도 21d). 이러한 결과는, 상승작용이 난치성 이종이식 모델에서 매우 효과적이며, 획득 면역 반응이 SMC 및 OV 병용-요법의 효능에 일차적으로 주된 역할을 하지 않는다는 것을, 의미한다.
공동-처리 상승작용에서 선천적인 항바이러스 반응과 면역 작동자의 역할
다음으로, SMC 처리와 커플링된 종양 용해성 VSV 감염이 생체내에서 TNFα- 또는 IFNβ-매개 세포 사멸을 유발하는 지를 확인하였다. 중화 항체를 통한 TNFα 신호전달의 차단이 EMT6 종양 모델에서 SMC와 VSVΔ51의 상승작용에 영향을 미치는 지를 조사하였다. 이소형 매칭된 항체 대조군과 비교해, TNFα 중화 항체를 적용한 결과 종양 퇴행이 회복되었으며, 생존율은 대조군 및 단일 처리군에 가까운 수준으로 감소하였다 (도 4f 및 4g). 이는, TNFα가 생체내에서 SMC 및 종양 용해성 VSV의 항종양 조합 효과에 필요하다는 것을, 입증해준다.
SMC 및 OV 조합 패러다임에서 IFNβ 신호전달의 역할을 조사하기 위해, EMT6 종양을 가진 Balb/c 마우스에 IFNAR1 차단 항체를 처리하였다. IFNAR1 차단 항체로 처리된 마우스는 감염 후 24-48시간 이내에 바이러스 혈증으로 사망하였다. 사망하기 전에, 바이러스 감염 후 18-20시간째에 종양을 수집하였으며, 종양에서 카스파제 활성을 분석하였다. 타입 I IFN 신호전달에 결함을 가진 이들 동물은 높은 바이러스 부하 (viral burden)로 인해 병에 걸렸지만, 적출된 종양에서는 카스파제-8 활성이 확인되지 않았고, 카스파제-3 활성 신호만 약하게 나타났으나 (도 22), 반면 대조군에서는 종양에서 예상된 카스파제 활성화가 나타났다 (도 22). 이러한 결과들은, 온전한 타입 I IFN 신호전달이 조합 방식에 따른 항종양 효과를 매개하는데 필요하다는 가설을 뒷받침해준다.
선천적인 면역 세포 또는 그외 면역 매개인자들이 OV/SMC 조합 요법의 효과에 기여하는 지를 평가하기 위해, 면역결핍 NOD-scid 또는 NSG (NOD-scid-IL2Rgammanull) 마우스에서 EMT6 종양 치료를 먼저 시도하였다. 그러나, IFNAR1 고갈 신호전달 실험에서와 마찬가지로, 이들 마우스는 바이러스 혈증으로 인해 빨리 사망하였다. 따라서, 생체외 비장 세포 배양 시스템을 서로게이트 모델로 사용해 선천적인 면역 세포의 기여를 해명하였다. TNFα를 생산할 수 있는 생산력을 가진 선천적인 면역 집단들을 양성으로 선별하고, 나이브 비장 세포로부터 추가로 분류하였다. 대식세포 (CD11b+ F4/80+), 호중구 (CD11b+ Gr1+), NK 세포 (CD11b- CD49b+) 및 골수-음성 (lymphoid) 집단 (CD11b- CD49-)을 VSVΔ51로 자극하고, 컨디셔닝화된 배지를 EMT6 세포에 첨가하여 SMC 존재 하에 세포독성을 측정하였다. 그 결과, VSVΔ51-자극된 대식세포 및 호중구는 SMC의 존재 하에 암 세포 사멸을 유도하는 인자들을 생산할 수 있는데 반해 NK 세포는 그렇지 않은 것으로 나타났다 (도 23a). 골수 유래 일차 대식세포를 또한 분리하였으며, 이 대식세포 역시 용량-의존적인 방식으로 종양 용해성 VSV 감염에 반응하여 EMT6 세포를 죽이는 인자들을 생산하였다 (도 23b). 요컨대, 이러한 결과들은, 여러가지 선천적인 면역 세포 집단들이 반응하여 관찰된 항종양 효과를 매개할 수 있으며, 대식세포가 이러한 반응에 가장 가능성이 높은 작동자라는 것을 입증해준다.
면역 보강제 폴리(I:C) 및 CpG는 생체내에서 SMC 요법을 강화한다
다음으로, 선천적인 전염증성 반응을 유도하는 것으로 알려진 합성 TLR 작용제가 SMC 요법과 상승작용할 것인지를 조사하였다. EMT6 세포를 트랜스웰 인서트 시스템에서 마우스 비장 세포와 공-배양한 다음 비장 세포에 SMC와 작용제 TLR 3, 4, 7 또는 9를 처리하였다. 처리한 TLR 작용제 모두 SMC 처리된 EMT6 세포의 방관자 사멸을 유도하는 것으로 나타났다 (도 5a). TLR4, 7 및 9 작용제 각각 LPS, 이미퀴모드 및 CpG는, 추측컨대, 이들의 타겟 TLR 수용체가 EMT6 세포에서 발현되지 않기 때문에, EMT6 세포의 방관자 사멸을 유도하기 위해 비장 세포가 필요하였다. 그러나, TLR3 작용제 폴리(I:C)는 SMC의 존재 하에 직접 EMT6 세포의 사멸을 유도하였다. 다음으로, 폴리(I:C)와 CpG를 생체내에서 SMC 요법과 조합하여 테스트하였다. 이들 작용제는 인간에서 안전한 것으로 입증되어 있어 선택하였으며, 현재 암에 대한 여러가지 중기 내지 후기 임상 실험 중에 있다. EMT6 종양을 전술한 바와 같이 확립하여 처리하였다. 폴리(I:C) 처리는 단일 제제로서 종양 증식에 영향을 미치지 않았지만, SMC와 조합시 실질적인 종양 퇴행을 유도하였으며, 복막내 전달한 경우 처리된 마우스의 60%에서 영구적인 치유를 달성하였다 (도 5b 및 5c). 마찬가지로, CpG 단일요법은 종양 크기 또는 생존율에 영향을 미치지 않았지만, SMC 요법과 조합한 경우에는 처리된 마우스의 88%에서 종양 퇴행 및 영구적인 치유가 달성되었다 (도 5d 및 5e). 중요하게도, 이들 조합 요법은 마우스에 허용성이 우수하였으며, 마우스의 체중이 요법 중지 후 빠르게 처리 전 수준으로 회복되었다 (도 20b 및 20c). 종양 용해성 VSV 결과와 종합하면, 이들 데이터는 임상적인 최신의 선천 면역 보강제 시리즈들이 생체내에서 SMC 요법과 강력하고 안전적으로 상승작용하여, 수종의 난치성의 공격적인 마우스 암 모델에서 종양 퇴행 및 영구적인 치유를 유도함을 입증해준다.
실시예 2: 불활화 바이러스 입자, 암 백신 및 자극성 사이토카인은 SMC와 상승작용하여 종양을 사멸시킨다.
현행 암 면역요법, 예를 들어, BCG (Bacillus Calmette-Guerin), 재조합 인터페론 (예, IFNα), 및 재조합 종양 괴사 인자 (예, 고립된 사지 관류에 사용되는 TNFα)의 사용, 및 면역 시스템의 종양-매개 억제를 극복하는 면역 체크포인트 저해제에 대한 현 임상 생물제제 (예, 차단 항체) (예, anti-CTLA-4 및 anti-PD-1 또는 PDL-1 단일클론 항체)의 사용은, 효과적인 치료법으로서 '암 면역요법'의 가능성을 부각시켜준다. 실시예 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 비-바이러스성 면역 자극제가 SMC와 상승작용하는 확고한 잠재성을 확인하였다 (도 5). 이러한 연구 결과를 확장하기 위해, 본 발명자들은 또한 비-복제성 랍도바이러스-유래 입자 (NRRP로 지칭됨)와 SMC의 상승작용 가능성을 조사하였는데, 이 입자는 복제 및 전파 능력이 없고 감염성과 면역자극성만 유지하는 UV-조사된 VSV 입자이다. NRRP가 직접 SMC와 상승작용하는 지를 분석하기 위해, 다양한 암 세포주 EMT6, DBT 및 CT-2A에 SMC를 다양한 수준의 NRRP와 공동-처리하고, 알라마르 블루에 의해 세포 생존성을 분석하였다. 본 발명자들은, NRRP가 이들 암 세포주들에서 SMC와 상승작용함을 관찰하였다 (도 25a). NRRP가 강력한 전염증성 반응을 유발할 수 있는 지를 분석하기 위해, 분획화된 마우스 비장 세포에 NRRP (또는 양성 대조군으로서 합성 CpG ODN 2216)를 처리하고, 세포 배양 상층액을 EMT6 세포에 첨가하여 용량-반응 방식으로 배양하였으며, 세포에 비히클 또는 SMC를 처리하였다. 본 발명자들은, 상당한 전염증성 반응이 존재하며, NRRP의 면역원성이 CpG와 비슷한 수준이며, 그래서 SMC의 존재 하에 EMT6 세포 사멸이 상당 수준으로 유발됨을 관찰하였다 (도 25b). EMT6 종양 모델에서 CpG 및 SMS 처리가 88%의 치유율을 달성하였으므로 (도 5d), 이러한 결과는 SMC와 NRRP의 조합이 생체내에서 높은 수준으로 상승작용할 수 있음을 시사한다.
SMC와 살아있는 또는 불활화된 단일 가닥 RNA 종양 용해성 랍도바이러스 (예, VSVΔ51, Maraba-MG1 및 NRRP) 간의 상승작용이 성공적으로 확인된 바, 임상적으로 승인된 약독화 백신은 SMC와 상승작용할 수 있을 것으로 시사되었다. 이 가능성을 조사하기 위해, SMC를, 암 생물제제, 즉 TNFα를 국소 높은 수준으로 생산하여 방광암을 인 시추에서 치료하기 위해 전형적으로 사용되는 결핵 마이코박테리움 백신, BCG와 상승작용하는 능력에 대해 조사하였다. 실제, SMC와 BCG의 조합은 강하게 상승작용하여, EMT6 세포를 시험관내에서 사멸시켰다 (도 26a). 이러한 사실을 마찬가지로 생체내에 확장시켰으며; 본 발명자들은 (해당 종양내 또는 복막내 각각) 경구 SMC와 국소 또는 전신 투여된 BCG의 조합 치료를 사용해 현저한 종양 퇴행을 관찰하였다 (도 26b). 이러한 사실은 SMC와의 조합 암 면역요법에 승인된 백신의 이용성을 입증해준다.
타입 I IFN는 생체내에서 SMC와 상승작용한다
바이러스, 및 아마 다른 TLR 작용제 및 백신의 효과는, 부분적으로는 mRNA 번역 등의 다양한 신호전달 기전에 의해 조절되는, 타입 I IFN 생산에 의해 매개되는 것으로 보인다. 본 발명의 결과는, 암을 치료하기 위한 효과적인 방법으로서 SMC 처리를 기존 면역요법, 예를 들어 재조합 IFN과의 명백한 조합 가능성을 제기하였다. 이 조합 가능성을 조사하기 위해, 본 발명자들은 2가지 치료 용법, 즉, 복막내 또는 종양내 재조합 IFNα 주사와 SMC의 치료 용법을 동계 정위 EMT6 유방암 모델에서 수행하였다. IFNα 처리는 EMT6 종양 증식 또는 전체 생존율에 영향이 없었으며, SMC 처리는 마우스 생존을 약간 연장시켰으며, 17% 치유율을 나타내었다 (도 27). 그러나, 복막내 또는 종양내 IFNα 주사와 SMC의 조합 치료는 종양 증식을 상당히 지연시켰으며, 종양-보유 마우스의 생존성을 연장시켰으며, 치유율이 각각 57% 및 86%에 달하였다 (도 27). 이러한 결과는 타입 I IFN을 이용한 직접 자극이 SMC와 상승작용하여 생체내에서 종양을 근절한다는 가설을 뒷받침해준다.
추가의 종양 용해성 랍도바이러스와 SMC의 상승작용 가능성 조사
VSVΔ51은 전임상 후보물질이고, 종양 용해성 랍도바이러스 VSV-IFNβ 및 Maraba-MG1은 현재 암 환자에서 임상 실험 중에 있는 물질이다. 실시예 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 Maraba-MG1이 시험관내에서 SMC와 상승작용함을 입증하였다 (도 9). 또한, 본 발명자들은, SMC가 임상 후보물질 (이미징 유전자, NIS, 소듐 아이오다이드 심포터를 운반하는) VSV-IFNβ 및 VSV-NIS-IFNβ와 EMT6 세포에서 상승작용한다는 것을, 검증하였다 (도 28). 이들 바이러스가 전염증성 상태를 생체내에서 유도할 수 있는 지를 확인하기 위해, 감염된 마우스에 VSVΔ51, VSV-IFNβ 및 Maraba-MG1을 5x108 PFU로 i.v. 처리하고, 감염된 마우스의 혈청에서 TNFα 수준을 측정하였다. 모든 경우들에서, 감염 후 12시간에 종양 용해성 바이러스 감염으로부터 일시적이었지만, 확고한 TNFα 증가가 존재하였으며, 24시간까지 검출가능하였다 (도 29). 이는, 이러한 감염이 면역적격 숙주에 자기-한정적이라는 점에서 타당하다. 이러한 결과는, 임상 후보인 종양 용해성 랍도바이러스가 VSVΔ51과 비슷한 양상으로 SMC와 상승작용할 가능성이 있다는 것을, 시사해준다.
실시예 1에 나타낸 바와 같이, 전장 TNFα를 발현하도록 조작된 VSVΔ51 형태가 SMC의 존재 하에 종양 용해성 바이러스 유발성 사멸을 강화할 수 있는 것으로, 입증되었다 (도 15). 이러한 사실을 확장시키기 위해, 인간 혈청 알부민의 분비 신호로 치환된 자신의 세포내 및 막관통 요소를 가진 TNFα 형태를 발현하도록 VSVΔ51을 조작하였다 (VSVΔ51-solTNFα). 전장 TNFα (memTNFα)와 비교해, solTNFα는 숙주 세포로부터 구성적으로 분비되는 반면, memTNFα 형태는 원형질막 상에 고정될 수 있거나 (그리고 여전히 직접 접촉하는 방식 (juxtacrine)으로 세포 사멸을 유도할 수 있음) 또는 메탈로프로테아제 (예, ADAM17)에 의해 내인적으로 처리되기 때문에 분비되어 근거리 분비 (paracrine) 방식으로 세포를 사멸시킬 수 있다. 본 발명자들은, 종양 용해성 VSV 감염 세포로부터 유래된 TNFα 형태가 정위 동계 유방암 모델 EMT6에서 SMC와 상승작용하는 지를 평가하였다. 예상된 바와 같이, SMC 처리는 EMT6 종양의 증식 속도를 약간 지연시켰으며, 종양 보유 마우스의 생존성을 약간 연장시킨 반면, 비히클과 VSVΔ51-memTNFα 또는 VSVΔ51-solTNFα의 조합은 종양 증식 속도 또는 전제 생존 기간에 영향을 미치지 않았다 (도 30a 및 30b). 한편, 바이러스에서 발현된 TNFα는 종양의 증식 속도를 현저하게 늦추었으며, 생존율을 각각 30% 및 70%로 증가시켰다. 특히, SMC 및 VSVΔ51 조합시 40%의 종양 치유율에는 4가지 처리제와 VSVΔ51 5x108 PFU의 용량이 필요하였다 (도 4a). 그러나, TNFα를 발현하는 종양 용해성 VSV와 SMC의 조합에서는 더 높은 치유율이 달성되었으며, 바이러스 용량 1x108 PFU에서 2가지 치료 용법으로 수행되었다. 이러한 치료 전략을 다른 난치성 동계 모델에 적용될 수 있는 지를 확인하기 위해, 마우스의 결장암 세포주의 피하 모델 CT-26에서 VSVΔ51-solTNFα가 SMC와 상승작용하는 지를 평가하였다. 예상된 바와 같이, VSVΔ51-solTNFα에 의한 종양 증식 속도 또는 생존성 효과는 관찰되지 않았으며, 보통 수준의 종양 증식 속도 감소와 약간의 생존성 연장이 관찰되었다 (도 30c). 그러나, SMC와 VSVΔ51-solTNFα의 조합 처리시, 종양 보유 마우스의 생존성을 연장하고 종양 증식을 더욱 지연시킬 수 있었다. 그래서, 종양 용해성 바이러스에 TNFα 전이유전자를 포함시키는 것이 SMC의 조합에 매우 유익하다. SMC와 상승작용하기 위해 바이러스에 TRAIL, FasL 또는 림포톡신과 같은 다른 사멸 리간드 전이유전자를 포함시키는 것도 쉽게 예상할 수 있다.
SMC의 뇌암 근절 가능성 조사
SMC와 면역 자극제의 조합은 효과적인 요법이 부족하고 면역요법이 유망한 뇌 악성 등의 다수의 여러 타입의 암에 적용가능하다. 첫번째 단계로서, 본 발명자들은 SMC가 마우스 뇌암 모델에서 혈액-뇌-장벽 (BBB)이 약물이 뇌로 들어가는데 중요한 장벽이기 때문에 이 BBB를 통과할 수 있는 지를 확인하였다. 본 발명자들은 약물 투여 후 수시간 후 두개강내 CT-2A 종양에서 SMC-유발성 cIAP1/2 단백질 분해를 관찰하였는데, 이는 SMC가 BBB를 통과하여 뇌암내 cIAP1/2를, 잠재적으로는 XIAP를 길항할 수 있다는 것을 의미한다 (도 31a). 또한, 본 발명자들은, 두개강내 SMC의 직접 주사 (100 μM 용액 10 ㎕)가 cIAP1/2 및 XIAP 단백질을 강하게 하향-조절할 수 있다는 것을 확인하였으며 (도 31b), 이는 SMC-유발성 IAP의 오토-유비퀴틴화의 직접적인 결과이거나 또는 XIAP 감소의 경우 종양 세포 사멸 유도의 결과이다. 2번째 단계로, 본 발명자들은 면역 자극제의 전신 자극이 나이브 마우스의 뇌에서 전염증성 반응을 이끌 수 있는 지를 확인하고자 하였다. 실제, 본 발명자들은 바이러스 모방체인 폴리(I:C), 즉 TLR3 작용제를 복막내 주사한 마우스의 뇌에서 TNFα 수준이 현저하게 상향 조절된 것을 관찰하였다 (도 32a). 본 발명자들은, 폴리(I:C) 또는 임상 후보물질 종양 용해성 랍도바이러스 VSVΔ51, VSV-IFNβ 또는 Maraba-MG1을 처리한 다음 이 세포용해물을 SMC의 존재 하에 CT-2A 또는 K1580 교모세포종 세포에 적용한, 마우스의 뇌로부터 단백질 라이세이트 조산물을 추출함으로써, 이러한 사실을 도출하였다. 본 발명자들은, 선천적인 면역 반응을 비-바이러스성의 합성 또는 생물학적 바이러스 물질로 자극하면, SMC의 존재 하에 세포 사멸이 이들 2종의 교모세포종 세포주에서 강화됨을 관찰하였다 (도 32b). 3번째 단계로, 본 발명자들은, 또한, 폴리(I:C)가 과도한 독성없이 두개강내 직접 투여될 수 있다는 것을 확인하였으며, 이는 종양 부위에서 심지어 증가된 사이토카인 유도를 제공할 수 있다 (도 32c). 마지막으로, 본 발명자들은, 뇌 자극 또는 전신 자극에서 직접 면역 자극이 SMC-처리된 마우스 뇌암 모델에서 영구적인 치유를 유발하는 지를 평가하였다. 경구 SMC와 두개강내 폴리(I:C) 또는 정맥내 VSVΔ51의 조합은 CT-2A를 가진 신경교종 마우스에서 거의 완전한 생존성을 달성하였으며 (도 32d 및 32e), 예상된 생존율은 각각 86 및 100%이었다. SMC와 두개강내 폴리(I:C) 처리 간에 관찰된 상승작용에 대한 추적으로서, 본 발명자들은 SMC와 재조합 인간 IFNα (B/D)의 직접적이고 동시적인 두개강내 주사로 CT-2A 신경교종의 치료 잠재성을 조사하였다. 실제, 본 발명자들은 조합 치료시 마우스 생존성에 상당히 긍정적인 효과를 관찰하였으며, 치유율은 50%이었다 (도 33). 중요한 사실은, SMC 또는 IFNα의 단독 또는 조합 처리는 이러한 종양 보유 마우스에서 어떠한 과도한 신경독성을 야기하지 않았다는 것이다. 전체적으로, 이러한 결과는, 여러가지 방식의 SMC가 국소 또는 전신 투여된 다수의 선천적인 면역자극제와 상승작용하여 시험관내에서 암 세포를 사멸시킬 수 있으며, 동물 암 모델에서 종양을 근절시킬 수 있다는 것을 보여준다.
방법
시약
노바르티스에서 LCL161을 공급받았다 (Houghton, P. J. et al. Initial testing (stage 1) of LCL161, a SMAC mimetic, by the Pediatric Preclinical Testing Program. Pediatr Blood Cancer 58: 636-639 (2012); Chen, K. F. et al. Inhibition of Bcl-2 improves effect of LCL161, a SMAC mimetic, in hepatocellular carcinoma cells. Biochemical Pharmacology 84: 268-277 (2012)). SM-122 및 SM-164는 샤오멩 왕 박사 (미국 미시간 대학)로부터 제공받았다 (Sun, H. et al. Design, synthesis, and characterization of a potent, nonpeptide, cellpermeable, bivalent Smac mimetic that concurrently targets both the BIR2 and BIR3 domains in XIAP. J Am Chem Soc 129: 15279-15294 (2007)). AEG40730 (Bertrand, M. J. et al. cIAP1 and cIAP2 facilitate cancer cell survival by functioning as E3 ligases that promote RIP1 ubiquitination. Mol Cell 30: 689-700 (2008))은 Vibrant Pharma Inc (캐나다 브렌트포드)에서 합성하였다. OICR720은 온타리오 암 연구소 (캐나다 토론토)에서 합성하였다 (Enwere, E. K. et al. TWEAK and cIAP1 regulate myoblast fusion through the noncanonical NF-kappaB signalling pathway. Sci Signal 5: ra75 (2013)). IFNα, IFNβ, IL28 및 IL29는 PBL Interferonsource (미국 피스캐타웨이)에서 입수하였다. 모든 siRNA는 Dharmacon (캐나다 오타와; ON TARGETplus SMARTpool)에서 구입하였다. CpG-ODN 2216은 IDT (5'- gggGGACGATCGTCgggggg-3' (서열번호 1), 소문자는 뉴클레오티드 사이의 포스포로티오에이트 결합을 의미하며, 이탤릭체는 포스포다이에스테르 결합을 가진 CpG 모티프 3개를 표시함)에서 합성하였다. 이미퀴모드는 BioVision Inc. (미국 밀피타스)에서 구입하였다. 폴리(I:C)는 InvivoGen 사 (미국 샌디에고)에서 구입하였다. LPS는 Sigma 사 (캐나다 오크빌)에서 구입하였다.
세포 배양
세포는 10% 열에 의해 불활화된 소 태아 혈청, 페니실린, 스트렙토마이신 및 1% 비-필수 아미노산 (Invitrogen, Burlington, USA)이 첨가된 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO2 하에 유지시켰다. 세포주들은 하기를 제외하고는 모두 ATCC에서 입수하였다: SNB75 (Dr. D. Stojdl, Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute) 및 SF539 (UCSF Brain Tumor Bank). 세포주는 주기적으로 마이코플라스마 오염에 대해 검사하였다. siRNA 형질감염의 경우, 세포는 Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) 또는 DharmaFECT I (Dharmacon)를 제조사의 프로토콜에 따라 48시간 동안 사용해 형질감염시켰다.
바이러스
인디애나 혈청형의 VSVΔ51 (Stojdl, D. F. et al. VSV strains with defects in their ability to shutdown innate immunity are potent systemic anti-cancer agents. Cancer Cell 4(4), 263-275 (2003))을 본 실험에 사용하였으며, Vero 세포에서 증식시켰다. VSVΔ51-GFP는 해파리 그린 형광 단백질을 발현하는 VSVΔ51의 재조합 유도체이다. VSVΔ51-Fluc는 반딧불이 루시퍼라제를 발현한다. 당단백질 코딩 유전자가 결손된 VSVΔ51 (VSVΔ51ΔG)은 Lipofectamine2000 (Invitrogen)을 사용해 pMD2-G에 형질감염시켰다. VSVΔ51-TNFα 구조체를 구축하기 위해, 전장 인간 TNFα 유전자를 G와 L 바이러스 유전자 사이에 삽입하였다. 모든 VSVΔ51 바이러스는 슈크로스 쿠션에서 정제하였다. Maraba-MG1, VVDD-B18R-, 레오바이러스 및 HSV1 ICP34.5를 전술한 바와 같이 구축하였다 (Brun, J. et al. Identification of genetically modified Maraba virus as an oncolytic rhabdovirus. Mol Ther 18, 1440-1449 (2010); Le Boeuf, F. et al. Synergistic interaction between oncolytic viruses augments tumor killing. Mol Ther 18, 888-895 (2011); Lun, X. et al. Efficacy and safety/toxicity study of recombinant vaccinia virus JX-594 in two immunocompetent animal models of glioma. Mol Ther 18, 1927-1936 (2010). GFP를 발현하거나 또는 GFP와 도미넌트 네거티브 IKKβ를 공동 발현하는 아데노바이러스 벡터의 구축 방법은 기존에 공지되어 있다16.
시험관내 생존성 분석
세포주를 96웰 플레이트에 접종하여, 밤새 인큐베이션하였다. 세포에 비히클 (0.05% DMSO) 또는 5 μM LCL161을 처리하고, 지정된 MOI의 OV를 감염시키거나 또는 250 U/mL IFNβ, 500 U/mL IFNα, 500 U/mL IFNγ, 10 ng/mL IL28 또는 10 ng/mL IL29를 48시간 처리하였다. 세포 생존성은 알라마르 블루에 의해 확인하고 (레사주린 소듐 염 (Sigma)), 데이터를 비히클 처리에 대해 정규화하였다. 선택한 샘플 크기는 생존성 분석에 대해 비슷한 분석을 이용한 이전의 리포트와 동일하다. 조합 지표로서, 세포를 밤새 접종하고, VSVΔ51 및 LCL161의 고정된 조합 혼합물 (PFU VSVΔ51: μM LCL161 5000:1, 1000:1 및 400:1)을 연속 희석하여 48시간 처리하고, 세포 생존성을 알라마르 블루에 의해 분석하였다. 조합 지표 (CI)는 Calcusyn을 사용해 Chou 및 Talalay 방법에 따라 계산하였다 (Chou, T. C. & Talaly, P. A simple generalized equation for the analysis of multiple inhibitions of Michaelis-Menten kinetic systems. J Biol Chem 252, 6438-6442 (1977)). 생물학적 레플리케이트를 n=3으로 사용해 통계 측정값을 결정하였다 (평균 + 표준 편차 또는 표준오차).
전파 분석
786-0 세포의 컨플루언트 단일층에 완전 배지 중의 0.7% 아가로스를 적층하였다. 웰의 중앙에 아가로스 적층에서 파이펫으로 작은 구멍을 만들고, VSVΔ51-GFP 5x103 PFU를 접종하였다. 비히클 또는 5 μM LCL161이 함유된 배지를 적층 위에 첨가하고, 세포를 4일간 배양하였으며, 형광 사진을 촬영하고, 크리스탈 바이올렛으로 세포를 염색하였다.
비장 세포 공-배양
EMT6 세포를 멀티웰 플레이트에서 배양하고, 분획화하지 않은 비장 세포가 포함된 세포 배양 인서트를 적층하였다. 간략하게는, 마우스 비장을 70 ㎛ 나일론 메쉬를 통과시켜 단일-세포 현탁물을 수득하고, 적혈구 세포를 ACK 세포용해 완충제로 세포용해 처리하였다. 비장 세포에, 1 μM LCL161에 앞서, 0.1 MOI의 VSVΔ51ΔG, 1 ㎍/mL 폴리(I:C), 1 ㎍/mL LPS, 2 μM 이미퀴모드 또는 0.25 μMCpG를 24시간 처리하였다. EMT6 세포 생존성을 크리스탈 바이올렛 염색으로 측정하였다. 생물학적 레플리케이트 n=3를 사용해 통계 측정값을 구하였다 (평균, 표준 편차).
사이토카인 반응성 생물분석
세포에 지정된 MOI의 VSVΔ51을 24시간 감염시키고, 세포 배양 상층액을 1시간 동안 UV 광에 노출시켜, VSVΔ51 입자를 불활화하였다. 그런 후, UV-불활화된 상층액을 5 μM LCL161의 존재 하에 나이브 세포에 적용하여 48시간 두었다. 세포 생존성은 알라마르 블루에 의해 분석하였다. 생물학적 레플리케이트 n=3를 사용해 통계 측정값을 구하였다 (평균, 표준 편차).
현미경
카스파제-3/7 활성화를 측정하기 위해, 5 μM LCL161, 지정된 MOI의 VSVΔ51 및 5 μM CellPlayer 세포자살 카스파제-3/7 시약 (Essen Bioscience, Ann Arbor, USA)을 세포에 첨가하였다. 세포를 10X 대물렌즈가 장착된 IncuCyte Zoom 현미경이 갖춰진 인큐베이터에 넣고, 위상차 사진 및 형광 사진을 48시간에 걸쳐 수득하였다. 다른 예로, 세포에 5 μM LCL161 및 0.1 MOI의 VSVΔ51-GFP 및 SMC를 36시간 처리하고, 매직 레드 카스파제-3/7 분석 키트 (ImmunoChemsitry Technologies, Bloomington, USA)로 표지하였다. 세포자살 세포의 비율을 측정하기 위해, 1 ㎍/mL Annexin V-CF594 (Biotium, Hayward, USA)과 0.2 μM YOYO-1 (Invitrogen)을 SMC 및 VSVΔ51 처리 세포에 처리하였다. 처리 후 24시간 동안 IncuCyte Zoom으로 이미지를 입수하였다. IncuCyte Zoom 소프트웨어에 포함된 통합된 객체 카운팅 알고리즘을 사용해 복수의 형광 신호를 처리하였다. 생물학적 레플리케이트 n=12 (카스파제-3/7) 또는 n=9 (Annexin V, YOYO-1)를 사용해, 통계 측정값을 구하였다 (평균, 표준 편차).
다단계 증식 곡선
세포에 비히클 또는 5 μM LCL161을 2시간 처리한 다음 지정된 MOI의 VSVΔ51을 1시간 감염시켰다. 세포를 PBS로 헹구고, 세포에 비히클 또는 5 μM LCL161을 보충하여 37℃에서 인큐베이션하였다. 지정된 시간에 분액을 취하여, 아프리카 그린 원숭이 VERO 세포를 이용한 표준 플라그 분석으로 바이러스 역가를 분석하였다.
웨스턴 면역블롯팅
세포를 긁어내고, 원심분리에 의해 수집한 다음 프로테아제 저해제 칵테일 (Roche, Laval, Canada)이 함유된 RIPA 세포용해 완충제에서 세포용해 처리하였다. 폴리아크릴아미드 겔에서 동량의 용해성 단백질로 분리한 다음 니트로셀룰로스 막으로 이동시켰다. 각 단백질을 다음과 같은 항체를 사용해 웨스턴 면역블롯팅에 의해 검출하였다: Cell Signalling Technology (Danvers, USA) 사의, pSTAT1 (9171), 카스파제-3 (9661), 카스파제-8 (9746), 카스파제-9 (9508), DR5 (3696), TNF-R1 (3736), cFLIP (3210) 및 PARP (9541); Enzo Life Sciences (Farmingdale, USA) 사의 카스파제-8 (1612); Abcam (Cambridge, USA) 사의 IFNAR1 (EP899) 및 TNF-R1 (19139); Invitrogen 사의 카스파제-8 (AHZ0502); Alexis Biochemicals (Lausen, Switzerland) 사의 cFLIP (clone NF6); BD Biosciences (Franklin Lakes, USA) 사의 RIP1 (clone 38); Developmental Studies Hybridoma Bank (Iowa City, USA) 사의 E7. 토끼 항-랫 IAP1 및 IAP3 다클론 항체를 사용해 인간 및 마우스 cIAP1/2 및 XIAP를 각각 검출하였다. AlexaFluor680 (Invitrogen) 또는 IRDye800 (Li-Cor, Lincoln, USA)을 사용해 일차 항체를 검출하였으며, 적외선 형광 신호를 Odyssey Infrared Imaging System (Li-Cor)으로 검출하였다.
RT-qPCR
RNAEasy Mini Plus kit (Qiagen, Toronto, Canada)를 사용해 전체 RNA를 분리하였다. 2 단계 RT-qPCR을 Superscript III (Invitrogen) 및 SsoAdvanced SYBR Green supermix (BioRad, Mississauga, Canada)를 사용해 Mastercycler ep realplex (Eppendorf, Mississauga, Canada)에서 수행하였다. 프라이머는 모두 realtimeprimers.com에서 입수하였다. 생물학적 레플리케이트 n=3를 사용해 통계 측정값을 구하였다 (평균, 표준 편차).
ELISA
세포를 바이러스를 지정된 MOI로 감염시키거나 또는 24시간 IFNβ 처리한 다음 Amicon Ultra 여과 유닛을 사용해 청징된 세포 배양 상층액을 농축하였다. 사이토카인을 TNFα Quantikine high sensitivity, TNFα DuoSet, TRAIL DuoSet (R&D Systems, Minneapolis, USA) 및 VeriKine IFNβ (PBL Interferonsource) 분석 키트로 측정하였다. 생물학적 레플리케이트 n=3를 사용해 통계 분석을 수행하였다.
EMT6 유방 종양 모델
1x105 야생형 EMT6 또는 반딧불이 루시퍼라제-테깅된 EMT6 (EMT6-Fluc) 세포를, 6주령 BALB/c 암컷 마우스의 유방 지방 패드에 주사하여, 유방 종양을 확립하였다. 촉진가능한 종양 (~100 mm3)이 생긴 마우스에, 비히클 (30% 0.1 M HCl, 70% 0.1 M NaOAc pH 4.63) 또는 50 mg/kg LCL161을 경구로, 그리고 PBS 또는 5x108 PFU의 VSVΔ51 중 하나를 i.v. 주사로, 주당 2회로 2주간 공동-처리하였다. 폴리(I:C) 25 및 SMC 처리의 경우, 동물에 LCL161을 주당 2회로, 그리고 BSA (i.t.), 20 ug 폴리(I:C) i.t. 또는 2.5 mg/kg 폴리(I:C) i.p.를 주당 4회 처리하였다. SMC 및 CpG 그룹에는 2 mg/kg CpG (i.p.)을 주사하고, 다음날 CpG 및 SMC 처리를 실시하였다. 4일 후 CpG 및 SMC 처리를 반복하였다. 처리군들을 케이지별로 배정하고, 각 군은 통계 측정을 위해 최소 n=4-8로 하였다 (평균, 표준오차; 카플란-마이어 및 로그 순위 분석). 샘플 크기는 암 치료 후 마우스 생존 및 종양 증식을 측정한 이전의 실험과 동일하다. 맹검 검사는 불가능하였다. 종양이 복막으로 전이되거나 또는 종양의 크기가 2000 mm3를 초과하면, 동물을 안락사시켰다. 종양 체적을 (π)(W)2(L)/4로 계산하였으며, 여기서 W = 종양 너비이고, L = 종양 길이이다. 4 mg 루시페린 (Gold Biotechnology, St. Louis, USA)을 i.p. 주사한 후, 종양 생발광 이미지를 Xenogen 2000 IVIS CCD-카메라 시스템 (Caliper Life Sciences Massachusetts, USA)으로 포착하였다.
HT-29 피하 종양 모델
6주령 암컷 Cd-1 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 3x106 HT-29 세포를 주사하여 피하 종양을 확립하였다. 촉진가능한 종양 (~200 mm3)에 PBS 또는 VSVΔ51 1x108 PFU를 종양내 주사 (i.t.)하여 처리하였다. 4시간 후, 마우스에 비히클 또는 50 mg/kg LCL161을 경구 투여하였다. 처리군을 케이지별로 배정하고, 각 군은 통계 측정을 위해 최소 n=5-7로 하였다 (평균, 표준오차; 카플란-마이어 및 로그 순위 분석). 샘플 크기는 암 치료 후 마우스 생존 및 종양 증식을 측정한 이전의 실험과 동일하다. 맹검 검사는 불가능하였다. 종양의 크기가 2000 mm3를 초과하면, 동물을 안락사시켰다. 종양 체적을 (π)(W)2(L)/4로 계산하였으며, 여기서 W = 종양 너비이고, L = 종양 길이이다.
모든 동물 실험은 캐나다 동물 관리 위원회에서 확립된 가이드라인에 준하여 오타와 대학의 동물 관리 및 수의학 연구소로부터 승인받아 수행하였다.
항체-매개 사이토카인 중화
시험관내 TNFα 신호전달을 중화하기 위해, α-TNFα (XT3.11) 또는 이소형 대조군 (HRPN) 25 ㎍/mL을 EMT6 세포에 1시간 첨가한 다음 LCL161 및 VSVΔ51 또는 IFNβ를 48시간 공동-처리하였다. 생존성을 알라마르 블루에 의해 분석하였다. EMT6-Fluc 종양 모델에서 TNFα를 중화하기 위해, α-TNFα 또는 α-HRPN 0.5 mg을 이식 후 8일, 10일 및 12일에 투여하였다. 이식 후 8일, 10일 및 12일에 50 mg/kg LCL161 (p.o.)을 처리하고, 9일, 11일 및 13일에 5x108 PFU VSVΔ51을 i.v.로 감염시켰다. 타입 I IFN 신호전달을 중화하기 위해, EMT6-종양 보유 마우스에 α-IFNAR1 (MAR1-5A3) 또는 이소형 대조군 (MOPC-21) 2.5 mg을 주사하고, 50 mg/kg LCL161 (p.o.)을 20시간 처리하였다. 마우스에 5x108 PFU VSVΔ51 (i.v.)을 18-20시간 감염시키고, 종양을 웨스턴 블롯팅으로 처리하였다. 모든 항체는 BioXCell (West Lebanon, USA)에서 구입하였다.
유세포 측정 및 분류
EMT6 세포에 VSVΔ51-GFP 0.1 MOI 및 5 μM LCL161을 20시간 동안 공동-처리하였다. 세포에 트립신을 처리하고, CytoFix/CytoPerm kit (BD Biosciences)로 투과화한 다음 APC-TNFα (MP6-XT22) (BD Biosciences)로 염색하였다. 세포를 Cyan ADP 9 유세포 측정기 (Beckman Coulter, Mississauga, Canada)에서 분석하고, 데이터를 FlowJo (Tree Star, Ashland, USA)로 분석하였다.
EasySep CD11b 파지티브 선별 키트 (StemCell Technologies, Vancouver, Canada)를 사용해 비장 세포를 CD11b에 대해 농화하였다. CD49+ 세포를 EasySep CD49b 파지티브 선별 키트 (StemCell Technologies)를 사용해 CD11b- 분획으로부터 농화하였다. CD11b+ 세포를 F4/80-PE-Cy5 (BM8, eBioscience) 및 Gr1-FITC (RB6-8C5, BD Biosciences)로 염색하고, MoFlo Astrios (Beckman Coulter)로 추가로 분류하였다. 분리한 세포에 VSVΔ51을 24시간 감염시키고, 청징처리한 세포 배양 상층액을 EMT6 세포에 5 μM LCL161의 존재 하에 24시간 적용하였다.
골수 유래 대식세포
마우스 대퇴골과 요골을 취하고, 세척하여 골수를 분리하였다. 세포는 8% FBS 및 5 ng/ml M-CSF를 첨가하여 RPMI에서 7일간 배양하였다. 유세포 측정을 사용해 대식세포 (F4/80+ CD11b+)의 순도를 검증하였다.
면역조직화학
적출한 종양을 4% PFA에 고정하고, OCT 화합물 및 30% 슈크로스 1:1 혼합물에 포매한 다음 저온유지 장치 상에서 12 ㎛로 절단하였다. 절편을 차단 용액 (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 100 mM L-라이신, 145 mM NaCl 및 1% BSA, 10% 염소 혈청) 중의 0.1% Triton X-100을 처리하여 투과화하였다. α-절단된 카스파제 3 (C92-605, BD Pharmingen, Mississauga, Canada)와 다클론 항-혈청 VSV (Dr. Earl Brown, University of Ottawa, Canada)을 밤새 인큐베이션한 다음 AlexaFluor-커플링된 이차 항체 (Invitrogen)와 함께 2차 인큐베이션하였다.
통계 분석
로그-순위 분석에 의해 카플란-마이어 생존 플롯들을 비교하고, 이후 쌍별 다중 비교를 Holm-Sidak 방법 (SigmaPlot, San Jose, USA)을 사용해 수행하였다. EC50 값 계산은 정규화 비-선형 회귀 분석을 사용해 GraphPad Prism에서 수행하였다. 비히클 처리 및 VSVΔ51-감염된 세포의 log10 EC50에서 SMC-처리 및 VSVΔ51-감염된 감염 세포의 log10 EC50을 제하여, EC50 쉬프트를 계산하였다. SMC 상승작용 정도를 정규화하기 위해, EC50 값을 100%에 대해 정규화하여, SMC 단독 처리에 의해 유도되는 세포 사멸을 보완하였다.
실시예 3: SMC-포함 면역요법은 항-골수종 활성을 나타낸다
면역 체크포인트 차단은 SMC와 상승작용하여 MM에서 질환 진행을 지연시킨다
루시퍼라제 전이유전자를 안정적으로 발현하는 MPC-11 세포를 정맥내 주사를 통해 BALB/c 마우스에 이식하였다. 이 생체내 MM 모델은 인간 질환을 잘 모방하며, 예측가능한 질환 진행에 따라 진행된다. MPC-11 세포를 뮤라인 형질세포종에서 수득하였다. PD-1 또는 CTLA-4에 대한 단일클론 항체 및 SMC 처리를 2회 수행한 후, 항-PD-1에 기반한 처리만 질환 진행을 지연시키는 반응을 나타내었다. anti-PD-1과 SMC의 조합으로 처리된 마우스에서 최상의 반응이 나타났으며, 발광 신호에 의해 측정된 바에 따라 종양 부하가 거의 없었다 (도 35). 이 조합은 또한 대조군 (p=0.01) 및 PD-1 단독 처리군 (p=0.0163)과 비교해 마우스의 생존성을 현저하게 연장하였다.
타입 I 인터페론은 SMC와 상승작용하여 MM 세포 사멸을 유발한다.
다양한 사이토카인의 SMC와의 조합 효과를 조사한 시험관내 실험에서 타입 I IFN의 잠재력이 부각되었다. 특히, IFNα 및 IFNβ는 테스트한 대부분의 세포주들에서 MM 세포를 사멸시키는데 있어 SMC와 매우 강력한 상승작용을 나타내었다 (도 36A). 동일한 MPC-11 마우스 모델을 사용해, 마우스에 재조합 IFNα와 SMC를 여러 시점에 처리하였다 (도 37).
종양 용해성 바이러스는 SMC와 상승작용하여, MM 세포의 사멸을 유발한다.
수포성 구내염 바이러스 (vesicular somatic virus)로부터 유래된 종양 용해성 바이러스 VSVΔ51은 시험관내에서 SMC와 상승작용하여 MPC-11 세포에서 세포 사멸을 유발한다 (도 36b 및 36c). SMC-함유 조합물들을 MPC-11 동계 마우스 모델에서 테스트하였다. 조합 처리는 VSVΔ51 단독 만큼 효과적으로 종양 부하를 감소시키지 않았으며, 마우스에 잘 허용되지 않았다. 그러나, VSVΔ51 단독 처리는 질환 진행을 지연시켰으며, 생존성 증가가 무처리 대조군과 비교해 유의한 수준이었다 (p=0.0379, 로그 순위 분석) (도 38).
SMC는 표준적인 MM 치료제와 상승작용한다.
시험관내 생존성 분석에서, SMC에 기반한 합성 글루코코르티코이드 덱사메타손 (Dex)의 조합에서 MM 세포의 상승적인 세포 사멸이 관찰되었다 (도 39b). SMC를 글루코코르티코이드 수용체 길항제 RU486과 조합한 경우, 비슷한 수준의 세포 사멸이 관찰되었으며, 이는 상승작용이 GCR의 활성화로 인한 것이 아니라, NF-κB에 대한 저해 효과 때문일 수 있음을 의미한다.
SMC 기반의 조합 처리는 NF - κB 신호전달을 활성화하여, MM 세포에서 세포자살을 유발한다.
SMC 처리는 cIAP1 및 cIAP2의 신속한 분해를 효과적으로 유발하였다 (도 40a). 단독 물질로서, SMC 처리가 NF-κB 신호전달을 증가시켰으며; 더 높은 인산화-p65 : p65 비율로 확인되는 바와 같이, 고전적인 경로에서 약간의 단기 부스트로 시작하여, 이후 장기간 감소되었다 (도 40b). 고전적인 경로의 활성화가 약화됨에 따라, p52 : p100의 비율 증가에 의해 확인된 바와 같이 얼터너티브 NF-κB 경로가 매우 강하게 활성화되었다 (도 40c). 세포내 세포자살은 절단된 폴리 (ADP-리보스)중합효소 (PARP)의 존재에 의해 검증되었다. PARP 절단은 종종 세포자살 마커로서 사용되는데, 그 이유는 이 물질이 세포자살 초기 단계에서 카스파제의 기질이기 때문이다.
SMC를 IFNβ (도 41) 또는 VSVΔ5 또는 VSVmIFN (뮤라인 IFNβ의 삽입 유전자 포함)(도 42)와 조합하면, SMC 처리 단독과 동일한 특징들이 다수 나타났다. 예를 들어, 고전적인 경로는 궁극적으로 하향 조절되며, 얼터너티브 경로는 상향 조절되었다. 또한, PARP 절단 및 카스파제 8 절단에 의해 확인되는 바와 같이, 세포자살이 발생하였다. IFN 수용체, IFNAR1 역시 IFN 처리로 하향 조절되었는데, 이는 IFNβ에 대한 지속적인 반응에 필연적이므로, 흥미로운 점이었다. VSV 처리시, RIP1은 후기 시점에 거의 완전히 분해되었으며; 이는 리폽토솜이 형성된 후 카스파제 8에 의해 분해되므로 세포자살의 또 다른 신호이다.
MM1R 및 MM1S에서 SMC에 대한 민감성은 글루코코르티코이드 수용체의 발현과 관련있다.
동일한 부모 세포주로부터 유래되고 GCR의 발현에만 차이가 있는 관련 인간 MM 세포주 MM1R 및 MM1S들은 SMC-매개 세포 사멸에 대한 반응성이 매우 다르다. 검출가능한 수준의 GCR 발현이 없는 MM1R (도 39a)은 SMC에 매우 민감하지만 (도 39c), GCR을 다량 발현하는 MMIS는 내성을 나타내었다. Dex 또는 GCR 길항제 RU486와 함께 처리하는 경우, MM1S는 SMC에 민감해질 수 있다 (도 39b).
선천적인 면역 자극제는 획득 면역 반응의 저해인자들을 상향 조절한다.
인간 MM 세포주 U266, MM1R 및 MM1S는 IFNβ 처리에 반응하여 PD-L1을 강하게 상향 조절하였다. 비슷한 상향 조절은 또한 SMC와 IFNβ의 조합에서도 볼 수 있었다. PD-1에 대한 다른 리간드인 PD-L2는 IFNβ-기반한 치료시 마찬가지로 상향 조절되었다. 이러한 효과는 양쪽 단백질에서 초기 및 후기 시점에 현저하였다 (도 43). 이는 타입 I IFN을 활성화하는 임의의 면역 자극제가 T 세포 공동-저해 분자를 상향 조절함을 시사한다.
SMC와 면역조절제의 조합은 CD8+ T 세포를 또한 수반하는 암 세포 사멸을 유발한다.
도 44a 및 44b는, 더블 처리에 의해 치유된 마우스 EMT6 세포를 유방 지방 패드에 재-주사하거나 (일차 이식 후 180일), 또는 CT-2A 세포를 두개강내 재-주사 (일차 이식 후 190일)한, 실험의 데이터를 도시한 그래프이다. 도 44c는 CT-2A 신경교종 또는 EMT6 유방암 세포에 트립신을 처리하고, 표면을 접합된 이소형 대조군 IgG 또는 anti-PD-L1으로 염색한 다음 유세포 측정을 위해 처리한, 실험의 데이터를 나타낸 그래프이다. 도 44d는, CD8+ T-세포를 CD8 T-세포 양성 자기 선별 키트를 이용해 (naive 마우스 또는 사전에 EMT6 종양이 치유된 마우스의) 비장 세포로부터 농화한 다음 IFNγ 및 Granzyme B 검출을 위해 ELISpot 분석을 수행한, 실험의 데이터를 나타낸 그래프이다. CD8+ T-세포를 배지 또는 암 세포 (암 세포 : CD8+ T-세포 12:1) 및 대조군 IgG 또는 anti-PD-1 10 mg과 48시간 동안 공-배양하였다. 마우스 3마리를 독립적인 생물학적 레플리케이트로 사용하였다 (이전에 EMT6 종양이 치유됨). 4T1 및 EMT6 세포는 동일한 주 조직적합성 항원을 가지고 있어, 4T1 세포가 음성 대조군으로 사용된다.
SMC는 정위 마우스 암 모델에서 면역 체크포인트 저해제와 상승작용한다.
도 45a는 EMT6 유방 종양 보유 마우스에 PBS 또는 1x108 PFU VSVD51을 종양 내로 1회 처리하고, 5일 후 마우스에 비히클 또는 50 mg/kg LCL161 (SMC) (경구) 및 250 mg의 anti-PD (복막내, i.p.)를 조합 처리한 실험의 데이터를 나타낸 그래프이다. 도 45b 및 45c는 두개강내 CT-2A 또는 GL261 종양을 가진 마우스에 비히클 또는 75 mg/kg LCL161 (경구) 및 250 mg (i.p.)의 대조군 IgG, anti-PD-1 또는 anti-CTLA-4를 4번 처리한 실험의 데이터를 나타낸 그래프이다. 도 45d는, CT-2A 두개강내 종양을 가진 무-흉선 CD-1 누드 마우스에 75 mg/kg LCL161 (경구) 및 250 mg (i.p.) anti-PD-1을 처리한 실험의 데이터를 나타낸 그래프이다.
실시예 4: Smac 모방체는 면역 체크포인트 저해제와 상승작용하여 종양 면역을 촉진한다.
세포 배양
세포주 RPMI-8226, U266, MM1R, MM1S, MPC-11을 ATCC에서 입수하였다. MPC-11은 10% FBS (Hyclone)가 첨가된 DMEM (Hyclone)에서 배양하고, U266은 15% FBS가 첨가된 RPMI-1640 (Hyclone)에서 배양하였으며, 그외 세포주는 모두 10% FBS가 첨가된 RPMI-1640에서 배양하였다.
세포는 10% 열에 의해 불활화된 소 태아 혈청 및 1% 비-필수 아미노산 (Invitrogen)이 첨가된 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO2 하에 유지시켰다. 세포주들은 하기를 제외하고는 모두 ATCC에서 입수하였다: SNB75 (Dr. D. Stojdl, Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute) 및 SF539 (UCSF Brain Tumor Bank). 일차 NF1-/+p53-/+ 세포는 C57Bl/6J p53+/-/NF1+/- 마우스로부터 유래되었다. 세포주는 주기적으로 마이코플라스마 오염에 대해 검사하였다. BTIC는 EGF와 FGF-250이 첨가된 무혈청 배양 배지에서 배양하였다. siRNA 형질감염의 경우, 세포는 Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen)을 사용해 제조사의 프로토콜에 따라 48시간 동안 리버스 형질감염시켰다. 세포주는 주기적으로 마이코플라스마 오염에 대해 검사하였다. BTIC는 EGF와 FGF-2가 첨가된 무혈청 배양 배지에서 배양하였다. siRNA 형질감염의 경우, 세포는 Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용해 48시간 동안 리버스 형질감염시켰다.
항체 및 시약
생체내: LCL161은 노바르티스로부터 선물로 제공받았다. Anti-PD-1 (clone J43)은 BioXcell 사에서 구입하였다. 폴리(I:C) (HMW vaccigrade, Invivogen). IFNα (생체내 용도)는 독일의 Dr Peter Staeheli로부터 선물로 제공받았다. Tetralogic Pharmaceuticals 사에서 Birinapant를 공급받았다.
시험관내: IFN은 PBL assay science 사로부터 수득하였으며; 덱사메타손 및 RU486은 Sigma Aldrich 사에서 구입하였다.
사용 항체로는 RIAP1 (in house), PD-L1 (Abcam), PD-L2 (R&D Systems), GCR (Santa Cruz), P100 (Cell Signalling), P65 (cell signalling), p-P65 (cell signalling), IFNAR1 (Abcam), PARP (Cell Signalling), 투불린 (Developmental Studies Hybridoma Bank), RIP1 (R&D Systems), capsase 8 (R&D Systems)을 포함한다.
AT-406, GDC-0917 및 AZD-5582는 Active Biochem 사에서 구입하였다. TNF-α는 Enzo 사에서 구입하였다. IFN-β는 PBL Assay Science 사에서 입수하였다. 숙주 광 범위 (Broad host range) IFN-αB/D는 효모에서 생산하여, 친수성 면역크로마토그래피에 의해 정제하였다. 비-타겟팅 siRNA 또는 siRNA 타겟팅 cFLIP는 Dharmacon (ON-TARGETplus SMARTpool) 사에서 입수하였다. 고 분자량 폴리(I:C)는 Invivogen 사에서 입수하였다.
동물 실험
4-5주령의 BALB/c 마우스를 Charles River 사에서 구입하여, 반딧불이 루시퍼라제 (Fluc) 전이유전자를 안정적으로 발현하는 MPC-11 Fluc 세포 1x106개를 IV 주사하였다. 처리는 50mg/kg LCL161, 250 ㎍ anti-PD-1, 250 ㎍ anti-CTLA4, 25㎍ 폴리(I:C), 5x108 pfu VSVΔ51, 1 ug IFNα를 포함한다. 발광을 측정하기 위해 루시페린 200 ㎕를 IP 주사한 후 생체내 이미징 시스템 IVIS를 사용해 마우스 사진을 촬영하였다.
바이러스
인디애나 혈청형의 VSV를 본 실험에 사용하였다. VSV-EGFP, VSVΔ51 (M 유전자에 아미노산 51 결손) 및 Maraba-MG1을 Vero 세포에서 증폭시키고, OptiPrep 구배에서 정제하였다. 당단백질 코딩 유전자가 결손된 VSVΔ51 (VSVΔ51ΔG)은 Lipofectamine2000 (Invitrogen)을 사용해 pMD2-G으로 형질감염된 HEK293T-세포에서 증폭시키고, 슈크로스 쿠션에서 정제하였다. XL-1000 UV crosslinker (Spectrolinker)를 사용해 VSV-EGFP를 UV (250mJ cm-2)에 노출시켜, NRRP를 구축하였다.
시험관내 생존성 분석
세포주를 96웰 플레이트에 접종하여 밤새 배양하였다. 세포에 비히클 (0.05% DMSO) 또는 LCL161을 처리하고, 지정된 MOI의 바이러스를 감염시키거나, 또는 1 ㎍/mL IFN-αB/D, 0.1 ng/mL TNF-α 또는 지정된 NRRP를 48시간 처리하였다. 세포 생존성은 알라마르 블루에 의해 확인하였으며 (레사주린 소듐 염 (Sigma)), 데이터를 비히클 처리에 대해 정규화하였다. 선정한 샘플 크기는 생존성 분석에 대해 비슷한 분석을 이용한 이전의 리포트와 동일하지만, 샘플 크기 결정에 통계학적 방법을 적용하진 않았다.
웨스턴 블롯팅
세포를 긁어내고, 원심분리에 의해 수집한 다음 프로테아제 저해제 칵테일 (Roche)이 함유된 RIPA 세포용해 완충제에서 세포용해 처리하였다. 종양을 전술한 바와 같이 적출하여 잘게 자른 다음 세포용해 처리하였다. 폴리아크릴아미드 겔에 동량의 용해성 단백질을 분리시킨 다음 니트로셀룰로스 막으로 이동시켰다. 각 단백질을 cFLIP (7F10, 1:500, from Alexis Biochemicals) 및 β-tubulin (1:1000, E7, Developmental Studies Hybridoma Bank)을 이용한 웨스턴 면역블롯팅에 의해 검출하였다. 토끼 anti-rat IAP1 및 IAP3 다클론 항체를 사용해 인간 및 마우스 cIAP1/2 및 XIAP를 각각 검출하였다 (1:5000; Cyclex Co.). AlexaFluor680 (Invitrogen) 또는 IRDye800 (Li-Cor) (1:2500)을 사용해 일차 항체를 검출하였으며, 적외선 형광 신호를 Odyssey Infrared Imaging System (Li-Cor)으로 검출하였다. 블롯 전체를 도 68a-68d에 도시한다.
ELISA
TNF-α를 생체내에서 검출하기 위해, 마우스에 50 ㎍ 폴리(I:C) 복막내 (i.p.) 또는 VSVΔ51 5x108 PFU를 정맥내 (i.v.) 처리하였다. 뇌를 EDTA-프리 프로테아제 저해제 칵테일 (Roche)이 첨가된 20 mM HEPES-KOH (pH 7.4), 150 mM NaCl, 10% 글리세롤 및 1 mM MgCl2에서 균질화하였다. NP-40을 최종 농도 0.1%로 첨가하고, 원심분리를 통해 청징 처리하였다. 동량을 TNF-α Quantikine 분석 키트 (R&D Systems)를 사용해 TNF-α 검출을 위해 처리하였다.
획득 면역 반응을 분석하기 위해, SMC 및 anti-PD-1 처리에 의해 CT-2A 종양이 치유된 마우스와 나이-매칭된 대조군 (나이브) C57BL/6 암컷 마우스에 CT-2A 세포 1x106개를 피하 주사하였다. 7일 후, 비장 세포를 분리하여, 비히클 또는 5 μMSMC 또는 20 ㎍/mL 지정 항체의 존재 하에 CT-2A 세포와 48시간 공-배양하였다 (비장 세포:암세포 비율 20:1). IFN-γ, GrzB, TNF-α, IL-17, IL-6 및 IL-10의 분비를 ELISA에 의해 측정하였다 (키트는 R&D Systems사로부터 구입함).
CT-2a 및 GL261 뇌암 모델
5주령의 암컷 C57BL/6 또는 CD-1 누드 마우스를 이소플루오란으로 마취시키고, 수술 부위를 제모하여 70% 에탄올을 처리하여 준비하였다. 세포 5x104개를 1분간 좌측 선조체에 10 ㎕ 부피로 다음과 같은 좌표로 정위 주사하였다: 전방 0.5 mm, 브레그마에서 옆으로 2 mm 및 깊이 3.5 mm. 피부를 외과용 접착제로 덮었다. 마우스에 비히클 (30% 0.1 M HCl, 70% 0.1 M NaOAc pH 4.63) 또는 75 mg/kg LCL161을 경구로, 그리고 50 ㎍ 폴리(I:C)을 10 ㎕로 종양내 (i.t.), 5x108 VSVΔ51을 정맥내로 (i.v.) 또는 250 ㎍의 anti-CD4 (GK1.5), anti-CD8 (YTS169.4), anti-PD1 (J43) 또는 CTLA-4 (9H10)을 복막내 (i.p.) 처리하였다.
birinapant를 처리하기 위해, 마우스에 비히클 (12.5% Captisol) 또는 30 mg/kg birinapant (i.p.)를 처리하였다. 일부 경우에는, 동물에 anti-IFNAR1 (MAR1-5A3), anti-IFN-γ (R4-6A2) 또는 anti-TNF-α (XT3.11)를 처리하였다. 이소형 대조군 IgG 항체를 필요에 따라 사용하였다: BE0091, BE0087, BP0090, MOPC-21 또는 HPRN. 중화 항체 및 대조군 항체 모두 BioXCell 사에서 구입하였다. SMC 및 타입 I IFN을 두개강내 공동-처리하기 위해, 마우스에 비히클 (0.5% DMSO), 100 μM LCL161, 0.01% BSA 또는 1 ㎍ IFN-αB/D의 조합을 10 ㎕로 i.t.로 주사하였다. 다른 예로, 마우스에 비히클 또는 75 mg/kg LCL161을 경구로 그리고 1 ㎍ IFN-α B/D (i.p.)를 처리하였다. 동물에서 미리 정해진 신경 결함 신호 (보행 실패, 체중 감소가 체중의 >20%, 무기력, 구부린 자세)가 관찰되면, 안락사시켰다. 처리군을 케이지별로 배정하고, 통계 측정 (카플란-마이어 및 로그 순위 분석)을 위해 각 군당 마우스 5-9마리를 사용하였다. 랜덤 처리하지 않았으며, 평가자는 그룹 배정에 대해 맹검 처리하였다.
샘플 크기는 암 처리 후 마우스 생존성 및 종양 증식을 분석한 이전의 리포트와 동일하지만, 샘플 크기 결정에 통계학적 방법을 적용하진 않았다.
MRI
살아있는 마우스 뇌 MRI를 오타와 대학의 전임상 이미징 코어에서 7 Tesla GE/Agilent MR 901을 사용해 수행하였다. 이소플루란을 사용해 MRI 절차에 따라 마우스를 마취하였다. 2D 패스트 스핀 에코 시퀀스 (FSE) 펄스 시퀀스를 이미지 측정에 사용하였으며, 하기 파라미터를 적용하였다: 규정된 슬라이스 15개, 슬라이스 두께 = 0.7 mm, 스페이싱 = 0 mm, 관심영역 = 2 cm, 매트릭스 = 256x256, 에코 타임 = 25 ms, 반복 타임 = 3,000 ms, 에코 트레인 길이 = 8, 밴드폭 = 16 kHz, 1 평균 및 지방 포화 (fat saturation). FSE 시퀀스를 총 촬영 시간 5분간 가로면 및 관상면에서 수행하였다.
EMT6 유방 종양 모델
5주령의 BALB/c 암컷 마우스의 유방 지방 패드에 EMT6 세포 1x105개를 주사하여 유방 종양을 확립하였다. 촉진가능한 종양 (~100 mm3)이 생긴 마우스에, 비히클 (30% 0.1 M HCl, 70% 0.1 M NaOAc pH 4.63) 또는 50 mg/kg LCL161을 경구로, 그리고 VSVΔ51 5x108 PFU를 i.t. 주사로 또는 대조군 IgG (BE0091) 또는 anti-PD-1 (J43)을 i.p. 주사로, 공동-처리하였다. 종양이 복막내로 전이되거나 또는 종양 부하가 2,000 mm3를 초과하면 동물을 안락사시켰다. 종양 체적을 (π)(W)2(L)/4로 계산하였으며, 여기서 W = 종양 너비이고, L = 종양 길이이다. 처리군을 케이지별로 배정하고, 각 군은 통계 측정을 위해 마우스 4-5마리를 포함하였다 (평균, 표준오차; 카플란-마이어 및 로그 순위 분석). 랜덤 처리하지 않았으며, 평가자는 그룹 배정에 대해 맹검 처리하였다.
MPC-11 다발성 골수종 모델
4-5주령 BALB/c 암컷 마우스에 루시퍼라게-테깅된 MPC-11 세포 1x106를 주사(i.v.)하여 다발성 골수종 및 형질세포종의 마우스 모델을 확립하였다. 마우스에 비히클 (30% 0.1 M HCl, 70% 0.1 M NaOAc pH 4.63) 또는 75 mg/kg LCL161을 경구로, 그리고 대조군 IgG 또는 α-PD-1 항체 250 ㎍ (i.p)을 처리하였다. 루시페린 (Gold Biotechnology) 4 mg을 i.p. 주사한 후 생발광 이미지를 Xenogen2000 IVIS CCD-카메라 시스템 (Caliper Life Sciences)으로 포착하였다. 처리군을 케이지별로 배정하고, 각 군은 통계 측정을 위해 마우스 3-4마리를 포함하였다 (카플란-마이어 및 로그 순위 분석). 랜덤 처리하지 않았으며, 평가자는 그룹 배정에 대해 맹검 처리하였다.
종양 재이식
연령 매칭된 나이브 암컷 C57BL/6 마우스 또는 SMC-기반의 면역 자극제와의 조합 처리 (이식 후 최소 180일)에 의해 이미 두개강내 CT-2A가 치유된 마우스에 전술한 바와 같이 CT-2A 세포를 i.c.로 또는 세포 5x105를 피하로 재 주사하였다. 나이브 BALB/c 또는 SMC 및 VSVΔ51 조합 처리 (이식 후 90-120d)로 루시페린-테깅된 EMT6 유방 종양으로부터 이미 치유된 마우스에, 비-테깅된 EMT6 세포 5x105개를 지방 패드에 재 주사하였다. 동물을 전술한 바와 같이 안락사시켰다. 맹검 또는 랜덤 처리는 가능하지 않았다.
모든 동물 실험은 캐나다 동물 관리 위원회에서 확립된 가이드라인에 준하여 오타와 대학의 동물 관리 및 수의학 연구소로부터 승인받아 수행하였다.
유세포 측정
시험관내 분석을 위해, 세포에 비히클 (0.01% DMSO) 또는 5 μM LCL161 및 0.01% BSA, 1 ng/mL TNF-α, 250 U/mL IFN-β 또는 0.1 MOI의 VSVΔ51을 24시간 처리하였다. 세포를 효소-프리 해리 완충제 (Gibco)를 사용해 플레이트에서 해리시키고, Zombie Green과 지정된 항체로 염색하였다. 종양 면역 침윤물을 분석하기 위해, 두개강내 CT-2A 종양을 기계적으로 분리시키고, ACK 세포용해 완충제에서 RBC를 세포용해 후 Zombie Green과 지정된 항체로 염색하였다. 일부 경우에, 5 ng/ml PMa 및 500 ng/ml 이오노마이신을 Brefeldin A의 존재 하에 5시간 동안 세포를 자극하고, 세포내 항원을 BD Cytofix/Cytoperm 키트를 사용해 처리하였다. 항체는 Fc Block (101319, 1:500), PD-L1(10F.9G2, 1:250), PD-L2 (TY25, 1:100), I-A/I-E (M5/114.15.2, 1:200) 및 H-2Kd/H-2Dd- (34-1-2S, 1:200), CD45 (30-F11, 1:300), CD3 (17A2, 1:500), CD4 (GK1.5, 1:500), CD8 (53-6.7,1:500), PD-1 (29.1A12, 1:200), CD25 (PC61, 1:150), Gr1 (RB6-AC5, 1:200), F4/80 (BM8, 1:200), GrzB (GB11, 1:150) 및 IFN-γ (XMG1.2, 1:200)를 포함한다. 항체 TNF-α (MP6-XT22, 1:200) 및 CD11b (M1/70, 1:100)는 BD Biosciences에서 구입하고, 나머지 항체는 모두 BioLegend에서 구입하였다. 세포를 Cyan ADP 9 (Beckman Coulter) 또는 BD Fortessa (BD Biosciences)에서 분석하고, 데이터를 FlowJo (Tree Star)로 분석하였다.
현미경
mKate2-CT-2A 세포 검출은 10X 대물렌즈가 장착된 IncuCyte Zoom 현미경이 갖춰진 인큐베이터에서 수행하였다. IncuCyte Zoom에서 수득한 복수의 형광 신호를 Incucyte Zoom 소프트웨어에 포함된 통합 객체 카운팅 알고리즘을 사용해 처리하였다.
멀티플 ELISA
SMC 및 anti-PD-1 조합 처리 후 혈청 단백질의 검출을, 유세포 측정에 기반한 멀티플렉스 키트 (LEGENDplex inflammation panel from Biolegend)를 사용해 분석하였다. Morpheus (https://software.broadinstitute.org/morpheus)를 사용해 층화 분석을 수행하였다.
RT-qPCR
전체 RNA를 RNeasy mini prep kit (Qiagen)를 사용해 세포에서 추출하였다. Mastercycler ep realplex (Eppendorf)에서 iScript 및 SsoAdvanced SYBR Green supermix (BioRad)를 사용해 2 단계 RT-qPCR을 수행하였다. qPCR은 PD-L1 및 PD-L2 프라이머 (Qiagen) 및 SIBR green 시약 (Bio-Rad)으로 수행하였다. 상대적인 발현을 대조군으로서 RPL13A를 사용해 ΔΔCt로서 계산하였다.
사이토카인 및 케모카인 유전자들로 구성된 라이브러리 패널을 realtimeprimers.com에서 입수하였다. 각 처리 조건 당 n = 4로 수행하였으며, 8종의 서로 다른 기준 유전자에 대해 데이터를 정규화하고, 각 비히클 및 IgG 샘플과 비교하였다. 데이터를 Morpheus를 사용해 계층 분석으로 분석하였다.
ELISpot
나이 매칭된 나이브 암컷 마우스 또는 두개강내 CT-2A (이식 후 180일) 또는 EMT6 유방 종양 (이식 후 120일)으로부터 이미 치유된 마우스의 비장 세포를, CD8 자기 선별 키트 (Stemcell Technologies)를 사용해 CD8+ T-세포에 대해 농화하였다. CD8+ 세포는, IFN-γ 또는 Granzyme B ELISpot 키트 (R&D Systems)를 사용해, 암 세포 (LLC에 대해 1:20, EMT6 또는 4T1 세포에 대해 1:12.5) 및 10 ㎍/mL IgG (BE0091) 또는 anti-PD-1 (J43)와 함께 48시간 동안 공-배양하였다.
통계
전체 동물 실험에서, MM 세포 이식 후 경과 일수로부터 생존성을 계산하였으며, 카플란 마이어 곡선으로 작성하였다. 이로부터, 로그 순위 검정을 사용해 유의성을 결정하였다. 시험관내 생존성 분석에서, 오차는 표준 편차로 제시된다. 이후 Holm-Sidak 방법 (SigmaPlot)으로 쌍별 다중 비교를 수행하였다. 일원배치분산분석한 후 다중 비교를 위한 조정 (GraphPad)과 듀넷 다중 비교 검정을 이용한 사후 분석으로, 복수의 처리군들을 서로 비교하였다. 분산 추정 결과를 GraphPad로 분석하였다. 처리 쌍 비교는 양측 t-검정 (two-sided t-test) (GraphPad)으로 분석하였다.
실시예 5: 교모세포종 요법을 위한 면역자극제들의 조합
본 발명자들은, 배양한 일차 교모세포종 세포주가, 외인성 TNF-α, 종양 용해성 바이러스 VSVΔ51 또는 감염성이나 비-복제성인 바이러스 VSVΔ51ΔG와의 조합에 의한 SMC에 의해, 사멸됨을 확인하였다 (도 46a 및 46b). 본 발명자들은, TNF-α와 여러가지 SMC의 조합으로 교모세포종 세포의 사멸을 관찰한 바, SMC, LCL161 및 TNF-α 간의 상승적인 작용이 이러한 약물 클래스에서 전형적인 현상임을 검증하였다 (도 47). 또한, 본 발명자들은 인간 뇌암 개시 세포 (BTIC)에서 종양 용해성 랍도바이러스, VSVΔ51 또는 Maraba-MG1에 의한 SMC 효능의 강화를 관찰하였다 (도 46c). 복제력은 없으면서 자신의 감염성 면역자극 특성을 유지한 비-복제성 랍도바이러스 입자 (NRRP) 역시 마찬가지로 SMC와 상승작용하여 교모세포종 세포 사멸을 유도하는 것으로 확인되었다. 특히, SMC 및 TNF-α 또는 TNF-관련 세포자살-유도성 리간드 (TRAIL)의 조합 존재 시, 프로파일링한 암 세포주들 중 약 50%만 세포 사멸로 반응하였으며; 내성 세포주 대부분은 카스파제-8 저해제, cFLIP (세포성 FLICE-유사 저해 단백질)의 하향 조절로 사멸에 대해 추가로 반응하였다. 이러한 이전의 결과와 일관되게, SMC 및 TNF-α 또는 VSVΔ51ΔG의 조합 처리에 불치성인 2종의 교모세포종 세포주는, cFLIP의 침묵화시 사멸하였다 (도 48a 및 48b). 반면, 정상적인 이배체 인간 섬유모세포는 cFLIP의 하향 조절 및 조합 처리로 세포 사멸에 감수성화 되지 않았다. 이러한 사실은, IFN 및/또는 사이토카인 반응이 교모세포종 세포의 SMC-유발성 사멸에 원인이지만, 바이러스-유도성 세포용해를 지시하지 않는다는 것을, 시사한다.
VSVΔ51이 신경독성이고, '면역 특권' 뇌 미세환경 및 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 통과하는 약물의 침투와 관련된 문제가 남아있기 때문에, 본 발명자들은 전신 및 두개강내 면역요법 물질의 전달 효과에 대해 조사에 착수하였다. 두개강내 CT-2A 종양 (도 49a 및 49b)을 확립한 후, SMC, LCL161의 경구 위관 영양에 의한 전신 투여가 두개강내 뮤라인 종양에서 일차 타겟 단백질 cIAP1 및 cIAP2의 일시적인 분해를 유발할 수 있는 지를 조사하였다. 종양이 없는 마우스의 피질 또는 소뇌에서도 이웃한 비-종양성 뇌 조직에서도 cIAP의 하향 조절은 관찰되지 않았다 (도 51). 따라서, SMC는 BBB가 약화된 뇌내 종양에 도달할 수 있는 능력을 가지고 있다. 복막내 (i.p.) 주사된 합성 TLR3 작용제 폴리(I:C) 또는 정맥내 (i.v.) 주사된 종양 용해성 바이러스 VSVΔ51과 같은 면역자극제의 전신 투여가, 종양이 없는 마우스의 혈청 및 뇌에서 사이토카인 TNF-α의 생산을 유도하였다.
두개강내 CT-2A 교모세포종이 존재하는 마우스에 SMC (입을 통한 위관 영양법), VSVΔ51 (i.v.) 또는 폴리(I:C) (두개강내, i.c.)를 1회 처리하였을 때, 공격적인 암에서 마우스 생존 연장은 최소한의 수준이었다 (생존율 17%) (도 51c). 그러나, 전신 SMC와 면역자극 촉발제 VSVΔ51 또는 폴리(I:C)의 조합 적용시, 생존성이 현저하게 연장되었으며, 마우스에서 각각 71% 및 86%로 영구적인 치유가 달성되었다. (면역성 강화를 회피하기 위해 외래 단백질로 테깅되지 않은) 종양을 이식 후 40일에 MRI에 의해 촬영한 바, 관찰된 처리 결과가 검증되었다.
바이러스-유도성 면역 효과는 타입 I IFN에 의해 일부 매개된다. 본 발명자들은, CT-2A 세포가 시험관내에서 SMC 및 재조합 IFN-α 조합에 부분적으로 민감하게 반응함을 관찰하였다 (도 50a). 본 발명자들은, SMC를 두개강내 투여하면 CT-2A 뇌암에서 IAP 단백질이 현저하게 분해됨을 관찰하였다 (도 53). 생체내 실험에서, 광범위한 종들에서 강력한 항바이러스 활성을 나타내는, 인간 이소형 IFN-α B 및 IFN-α D의 하이브리드를 구성하는 재조합 IFN-α 형태를 사용하였다. SMC 및 IFN-α의 1회 공동-투여시, 마우스 생존성이 현저하게 연장되었으며, 영구적인 치유율 50%가 달성되었다. 장기 생존 동물에서 SMC, 폴리(I:C) 또는 IFN-α의 두개강내 단일 또는 조합 처리시 과도한 신체적 또는 행동적 문제는 관찰되지 않았다 (도 54). 또한, 전신성 VSVΔ51 감염 또는 폴리(I:C)의 처리 시, 뇌에서 두개강내 TNF-α가 일시적으로 증가한 것으로 관찰되어, SMC 처리와 더불어 재조합 IFN-α의 전신 투여가 CT-2A 교모세포종 모델에서 효과적인지를 확인하고자 하였다. SMC 및 VSVΔ51의 조합과 마찬가지로, IFN-α의 복막내 투여과 SMC의 경구 위관 영양에 의한 투여의 조합한 경우 마우스에서 55%의 영구적인 치유가 달성되었다 (도 50b). 이러한 결과는, 뇌내 일시적인 염증 환경이 허용적이며, 조합 처리의 간접 및 그외 직접 (두개강내) 투여가 실현가능함을, 시사해준다.
실시예 6: 치유된 마우스에서 장기 종양 면역 구축
선천적인 면역 시스템이 SMC-매개의 종양 세포 사멸에 주된 작용 요소이다. 그럼에도 불구하고, SMC 조합 방식에서 획득 면역 시스템의 기여 역할에 대해서는 기본적인 의문이 남아있다. 또한, 종양 용해성 바이러스 또는 다른 면역자극제를 SMC 처리와 조합하여 사용하는 제안된 용도의 잠재적인 위험은 암 세포 상의 체크포인트 저해제 리간드의 발현을 증가시켜, CTL-매개 종양 공격을 무효화할 수 있다는 것이다. 유세포 측정 분석에서, 신경교종 세포에 재조합 타입 I IFN 처리 또는 TNF-α 처리 없이 VSVΔ51을 처리한 경우, PD-L1과 주 조직적합성 복합체 (MHC) I 마커의 표면 발현 증가가 확인되었다. 또한, 이들 종양 표면 분자의 발현은 SMC 처리에 의해 유의한 영향을 받지 않았다 (도 52a 및 56).
흥미롭게도, SMC 조합 처리에 의해 정위 EMT6 유방암으로부터 이미 치유된 마우스는, EMT6 세포로 재 이식 시험을 수행하였을 때, 종양 생착에 완전한 내성을 나타내었다 (도 52b). 그러나, 주 조직접합성 단백질을 공유한 다른 동계 세포주는 이들 치유된 마우스로부터 거부되지 않았다. 본 발명자들은, 두개강내 CT-2A 종양으로부터 치유된 마우스 역시 피하 또는 두개강내 주사된 CT-2A 세포의 종양 생착에 내성을 나타냄을 확인하였다 (도 52c). 다음으로, 본 발명자들은 치유된 마우스에서 CD8 T 세포의 세포독성 잠재성을 ELISpot 분석을 평가하였다. 나이브 마우스에서 분리된 세포가 아닌 치유된 마우스 유래 CD8+ T-세포를 CT-2A 세포로 자극한 결과, IFN-γ 및 Granzyme B (GrzB) 생산 증가에 의해 확인된 바와 같이, 특이적인 반응성 T 세포의 존재가 확인되었다 (도 54a). anti-PD-1 차단 항체를 포함한 경우, IFN-γ 및 GrzB의 발현이 추가로 증가되었다. 비슷한 결과는 EMT6 종양으로부터 치유된 마우스에서도 관찰되었다 (도 44d). 요컨대, 이들 결과는 SMC 조합 요법을 이용한 견고하고 특이적인 장기적인 종양 면역의 구축이 가능함을 시사해준다.
실시예 7: 면역 체크포인트 저해제는 IAP 길항제와 상승작용한다.
다음으로, 본 발명자들은 면역 체크포인트 저해제 또는 ICI로 알려진 현행 암 면역요법 클래스가 SMC 효과를 강화할 수 있는 지를 조사하였다. 최근 들어, 마우스에서 교모세포종의 ICI 처리가 적어도 부분적으로 생존성을 연장하는 것으로 보고된 바 있다. 본 발명자들은, 먼저, SMC 처리가 CT-2A 뇌암 내 침윤성 면역 세포 아종에서 PD-1의 발현에 영향을 미치는 지를 확인하고자 하였다. 두개강내 CT-2A 종양에서 침윤성 CD3+ 또는 CD3+ CD8+ 세포 수준 간에 통계학적 차이가 존재하였으며, 면역 체크포인트 PD-1을 발현하는 CD3+ 또는 CD3+ CD8+ 세포의 명확한 증가가 관찰되었다 (도 54b 및 도 55). CD25- 세포, 주로 CT-2A 세포에서 PD-L1의 발현에 전체적인 증가가 존재하였지만, 그 추세는 통계학적 유의성에 이르진 않았다 (도 54c).
PD-1+ CD8 T-세포의 증가된 수준이 SMC 효과에 대한 네거티브 조절인자일 가능성을 확인하기 위해, 교모세포종 마우스 모델 2종에서 SMC와의 조합에 의한 체크포인트 타겟, PD-1 뿐만 아니라 CTLA-4의 차단을 조사하였다. anti-PD-1 또는 anti-CTLA4 항체의 전신 투여시 그 자체 활성은 관찰되지 않았다 (도 54d 및 54e). 이와는 대조적으로, anti-PD-1과 SMC의 조합은 생존성을 현저하게 연장하였으며, CT-2a 및 GL261 모델에서 영구적인 치유율 각각 71% 및 33%가 달성되었다. 또한, SMC와의 조합시, CT-2A 모델에서 anti-PD-1 생물제제가 anti-CTLA-4 생물제제 보다 우수하였다 (71% 대 43%; 도 54d).
SMC에는 2종의 구조 클래스가 존재한다: 모노머 및 다이머. 모노머형 SMC는 IAP의 BIR 도메인에 결합하는 하나의 화학 분자로 구성되고, 다이머형 SMC는 IAP의 협력적인 결합 (cooperative binding) 및/또는 테더링 (tethering)을 허용하는 링커에 의해 연결된 2개의 SMC 분자들로 구성된다. 임상적인 최신 SMC인 LCL161이 본 발명의 대부분 연구의 대상이며, 강력한 모노머이다. 다음으로, 본 발명자들은 다른 임상적인 최신 다이머 SMC가 교모세포종의 치료에 ICI와 유사하게 상승작용하는 지를 확인하고자 하였다. 본 발명자들은, anti-PD-1 및 다이머 SMC, Birinapant를 처리하였을 때, 두개강내 CT-2A 종양을 가진 마우스에서 생존성이 현저하게 증가됨을 관찰하였다 (도 54f). PD-1 또는 CTLA-4의 조합된 차단이 흑색종 환자에게 유리하므로, PD-1과 CTLA-4의 조합이 마찬가지로 SMC 요법을 유의하게 강화하는 지를 확인하고자 하였다. PD-1 및 CTLA-4를 타겟팅하는 항체의 조합은 마우스 암 모델에서 영구적인 치유를 유도하는데 효과적이었으며, 전체 생존율은 67%로 관찰되었다 (도 54g). 놀랍게도, SMC 처리를 anti-PD-1 및 anti-CTLA-4와 함께 적용하면, 100%의 영구적인 치유율이 달성되었다.
SMC와 ICI 간의 상승적인 작용은 뇌암으로 한정되지 않는다. 본 발명자들은 또한 MPC-11 세포를 이용하여 매우 공격적이며 난치성의 다발성 골수종 모델에서 마우스의 생존성이 유의하게 연장됨을 관찰하였다 (도 56a 및 56b). 또한, EMT6 유방 종양을 가진 마우스에서 75%의 영구적인 치유율이 달성되었으며, 이는 면역 자극제를 포함시킬 경우 100%까지 증가하였다 (도 57a-57d).
실시예 8: CD8+ T-세포는 SMS 및 ICI의 효능에 필수적이다.
세포성 작용 기전에 대한 일차적인 식견을 제공하기 위해, 본 발명자들은 SMC와 anti-PD-1의 조합 처리를 사용해, 두개강내 CT-2A 종양으로부터 치유된 마우스의 비장 세포와 공-배양한 CT-2A 세포에서 면역 인자들의 생산을 프로파일링하였다. 본 발명자들은 생존 마우스 유래 비장 세포와 공-배양한 CT-2A 세포에서 IFN-γ와 GrzB의 생산이 유의하게 증가된 것을 관찰하였다 (도 58a 및 59a). 특히, 인터루킨 17 (IL-17) 생산이 증가하였다. 또한, 본 발명자들은, IL-17이 NF-κB 경로를 자극하는 것으로 기존에 입증된 것을 감안하여, 예상치 못하게도, 전염증성 사이토카인 IL-6 및 TNF-α의 발현 감소를 관찰하였다.
그러나, 치유된 마우스에서 분리된 비장 세포에서의 IFN-γ 및 IL-17의 발현은 anti-PD-1 또는 PD-L1 처리에 따라 유의하게 증가하였는데, 이는 T 세포에 기반한 면역반응이 PD-1 축을 통해 체크포인트를 저해하는 경우에 증가될 수 있음을 시사한다. 다음으로, 이러한 유전자 반응이 SMC 처리에 의해 영향을 받지는 지를 확인하고자 하였다. 기존에 분석한 사이토카인들 중에서도, 이들 배양물에 ant-PD-1 차단과 함께 SMC를 첨가하면, IFN-γ, GrzB, IL-17 및 TNF-α의 분비가 증가되었다 (도 59b 및 59b). 특히, 상층액내 IL-6 수준은 SMC 처리에 영향을 받지 않았다. 또한, 면역억제 사이토카인 IL-10은 SMC와 anti-PD-1의 조합 처리시 분비가 감소하는 전체적인 경향성이 나타났다.
XIAP31-33 및 TNF-α에 의해 부분적으로 차단되는 세포독성 인자 GrzB의 수준이 증가되어, 다음으로 나이브 세포 또는 CT-2A 두개강내 종양으로부터 이미 치유된 마우스의 비장 세포와 교모세포종 세포의 공-배양이 CT-2A 세포 사멸을 유도하는 지를 조사하였다. 구조적으로 다양한 SMC를 사용해, SMC의 존재 시 CT-2A 세포의 사멸이 통계학적으로 유의하게 증가하였으며, 이런 반응이 anti-PD-1 항체를 포함시킬 경우 증가됨을 관찰하였다 (도 59c).
요컨대, 이들 결과는, 견고한 작동자 T 세포 반응이 ICI 및 SMC의 조합 처리시 발생됨을 보여준다. 세포 작동 기전을 추가로 해명하기 위해, 특이적인 CD4 또는 CD8 타겟 항체를 사용해 면역 세포를 고갈시켰다. 조합 요법에 의해 유도되는 치유율 71%는 CD8+ T-세포의 고갈시 완전히 상쇄되었다 (도 59d). 흥미롭게도, CD4+ T-세포의 고갈시, SMC 및 anti-PD-1의 조합으로 100% 치유율이 달성되었으며, 대조군의 경우 17%의 치유율이 달성되었다. 이러한 결과는, CD4+ 면역억제 세포 (예, 조절성 T 세포)의 제거가 종양 퇴행을 유도하는데 도움이 되며, CD4+ 세포가 조합 처리 방식의 효과에 필요하지 않다는 것을, 시사해준다. 2번째 방법으로, 기능적인 T 세포가 결핍된 CD1 누드 마우스에서 두개강내 CT-2A 종양을 확립한 다음, anti-PD-1 항체를 비히클 또는 SMC와 조합하여 처리하였다. SMC와 anti-PD-1의 조합에 의해 부여된 생존 이점이 이러한 T 세포 결핍 마우스에서 사라졌다 (도 59e). 전체적으로, SMC와 anti-PD-1 간의 상승작용은 기능적인 획득 면역 반응에 의존하며, 따라서 일차 면역 세포 매개인자로서 CD8+ T-세포를 시사해준다.
실시예 9: SMC 처리는 종양내 세포 침윤에 영향을 미친다.
SMC와 ICI 처리 간의 상승작용에 있어 면역 세포 측면을 이해하기 위해, 교모세포종을 가진 마우스에서 침윤성 CD45+ 면역 세포를 프로파일링하였다. 이들 연구에서, anti-PD-1 및 SMC를 공동 처리한 후 후기 교모세포종 종양의 침윤성 면역 세포를 조사하였다 (도 61a). 종양의 침윤성 T 세포에 대한 유세포 측정 결과, 비히클 및 IgG 대조군 처리군과 모든 단일 및 이중 처리된 마우스 간에 CD4+ 및 CD8+ T-세포 비율에 통계학적으로 미미한 경향성이 확인되었다 (도 61b). 그러나, 조절성 T 세포 (Treg) 집단을 의미하는 CD4+ 및 CD25+ T-세포를 분석한 결과, SMC 단독 처리 또는 SMC와 ICI의 조합 처리시, 이들 세포 집단의 유의한 감소가 확인되었다 (도 61c).
다음으로, 단독 및 조합 처리 후, T 세포에서 PD-1의 표면 제시를 규명하였다. 본 발명자들은 SMC 단독 처리된 마우스에서 PD-1을 발현하는 CD8+ T-세포의 유의한 증가를 관찰하였으며, anti-PD-1 처리 및 SMC와 anti-PD-1의 조합 처리시 PD-1의 표면 제시는 거의 검출되지 않았다 (도 61d). 또한, 본 발명자들은 SMC 또는 anti-PD-1 처리군에서 CD4+ T-세포에서 PD-1의 제시가 감소되는 경향성을 관찰하였다. 표면의 검출가능한 수준의 PD-1은 SMC 및 anti-PD-1의 조합 처리시 상쇄되었다 (도 61e).
두개강내 교모세포종 종양에서 T 세포 침윤 관찰과 더불어, 본 발명자들은, 다음으로 골수-유래 억제 세포 (MDSC) 및 성상 세포/미세아교세포의 존재를 조사하였다. 기존의 보고된 결과와 대조적으로, 모든 처리 코호트에서 MDSC 집단 (CD11b+ Gr1+)에 차이가 검출되지 않았다 (도 61f). 그러나, anti-PD-1이 포함된 치료 코호트에서 성상 세포/미세아교세포 집단이 유의하게 감소되었다 (도 61g). 요컨대, 이들 결과는, 조합 처리 결과가 면역억제 CD4 T 세포 집단의 감소이며, T 세포에서 PD-1 제시 감소 및 성상 세포 및/또는 미세아교세포의 감소가 동시에 발생함을, 시사해준다.
실시예 10: SMC는 TNF-α에 의존적인 ICI와 상승작용한다.
다음으로, SMC 및 anti-PD-1이 조합 처리된 두개강내 교모세포종 종양을 가진 마우스에서, 종양내 세포성 사이토카인과 케모카인의 프로파일을 분석하였다. 유세포 측정으로 분석한 결과, anti-PD-1 항체가 포함된 경우, GrzB를 발현하는 CD8+ 세포가 증가되었다. 세포독성 CD8+ (도 62a) 비율과 CD4+ Treg 비율 역시 anti-PD-1 및SMC 및 anti-PD-1 처리 코호트에서 또한 증가되었다 (도 62b). GrzB 발현 분석과 더불어, T 세포에서 IFN-γ와 TNF-α의 수준을 분석하였다. 예상치 못하게도, SMC 처리시 IFN-γ를 발현하는 CD4+ 세포의 비율이 (PD-1 타겟 항체를 포함시킨 경우에도) 감소되었지만, 모든 처리 코호트에서 CD8+ 세포내 IFN-γ 발현 수준에는 변화가 관찰되지 않았다 (도 62c). 이후, T 세포에서 TNF-α 발현 수준을 분석하였다. 이런 맥락에서, TNF-α를 발현하는 CD4+ 및 CD8+ T-세포의 유의한 증가가 관찰되었으며 (도 62d), 이는 이들 T 세포가 SMC-매개 종양 세포 사멸을 직접 유도할 수 있음을 시사한다.
또한, 본 발명자들은 두개강내 CT-2A 교모세포종 모델에서 사이토카인과 케모카인의 유전자 발현 수준과 혈청내 SMC 처리와 anti-PD-1 차단의 조합 효과를 평가하였다. 본 발명자들은, 전염증성 사이토카인 IFN- , IL-1-α, IL-1β 및 IL-17과 다면적인 (multifaceted) 사이토카인 IFN-γ, IL-27 및 GM-CSF (도 60 및 62e)에서 통계학적으로 유의한 증가를 검출하였다. 마찬가지로, SMC와 ICI을 조합 처리한 후, 두개강내 CT-2A 종양에서 사이토카인 및 케모타인 발현 프로파일을 분석한 결과, 전염증성 사이토카인과 케모카인의 클러스터링이 검출되었다 (도 62f 및 63). SMC 또는 SMC와 ICI 조합 처리로부터 파생되는 이들 후보물질은 전염증성 사이토카인 IFN-β, IL-1β, IL-17, Osm 및 TNF-α, 케모카인 Ccl2 (MCP-1이라고도 함), Ccl5, Ccl7, Ccl22, Cxcl9, Cscl10 및 Cxcl11, 그리고 다면적인 인자, 예를 들어 FasL, IL-2, IL-12 및 IFN-γ이다.
본 발명자들은 IFN-β 및 IFN-γ의 일관된 수준 증가를 관찰하였으며, 이에 다음으로 SMC 및 anti-PD-1가 처리된 두개강내 CT-2A 종양을 가진 마우스에서 차단/중화 항체를 사용해 이들 신호전달 문자들의 기능적인 역할을 규명하고자 하였다. IFNAR1 수용체를 차단하는 항체를 사용해 타입 I IFN 신호전달을 차단한 경우, SMC 및 anti-PD-1 조합 처리 후, 두개강내 CT-2A 종양을 가진 마우스의 생존성을 증가시키는 방향으로의 상승 작용이 무효화 되었다 (도 62g). 반면, anti-IFN-γ 항체를 사용해 IFN-γ 기능을 길항하면, SMC 및 ICI 조합 처리의 상승작용은 부분적으로 저해되었다. 요컨대, 이들 결과는, 조합 처리한 경우를 포함하여, 각 처리 물질에 따라 여러가지 유전자 및 단백질 시그니처가 생성되며, 전체적으로 온전한 타입 I IFN 신호전달에 의존한다는 것을, 의미한다.
전체적으로, 본 결과들은, SMC와 ICI 간의 상승작용이 교모세포종 세포에 대한 CTL-매개 공격을 강화하는 쪽으로 주로 기여할 수 있으며, 이는 타입 I IFN을 포함하는 전염증성 반응을 수반함을 시사한다. 두개강내 종양으로부터 이미 치유된 마우스로부터 분리된 CD8+ T 세포를 CT-2A 세포와 공-배양한 결과, GrzB 양성 CD8+ T-세포가 증가하였지만, SMC 단독 처리시에는 증가하지 않았다 (도 65a). 그러나, 동일한 CTL과 공-배양하는 경우, 심지어 PD-1/PD-L1 축이 무력화된 경우에도, 살아있는 CT-2A 세포는 매우 약간 감소하였다 (도 65b). 타입 I IFN 반응이 또한 TNF-α의 생산을 유발함을 기존에 확인한 바, 교모세포종 세포의 존재 하에 SMC 처리 후 TNF-α를 생산하는 T 세포 생산력을 조사하였다. 이에, 본 발명자들은 다음 단계로 TNF-α의 생산을 조사하였다.
SMC의 포함은, PD-1을 타겟팅하는 항체의 포함과 상관없이, TNF-α를 발현하는 CD8+ T 세포의 비율을 유의하게 증가시켰다 (도 65a). CD8 T-세포로부터 TNF-α의 발현 수준이 증가됨에 따라, CT-2A 세포와 치유된 마우스의 CD8 T 세포의 공-배양 시스템에서 CT-2A 세포는 유의하게 감소되었다 (도 65b). 특히, CT-2A 세포의 사멸을 유발하는 SMC-매개 효과는 대부분 TNF-α (SMC 유발성 종양 사멸의 일차 매개인자임) 의존적이었다. 다음으로, SMC 처리가 T 세포 증식을 강화하는 지를 조사하였다. 실제, 본 발명자들은, CT-2A 세포의 공-배양 후, 약하게 표지된 새로운 CFSE-세포 집단의 출현과 CFSE-탑재된 CD8+ T 세포의 유의한 감소를 관찰하였으며, 이러한 효과는 SMC 및 anti-PD-1을 포함한 경우 현저하였다 (도 64).
이들 결과는, 세포독성 T 세포가, SMC 및 anti-PD-1 처리에 반응하여, IAP의 길항작용을 통해 종양 세포 사멸을 유도하는 전-사멸 인자 GrzB과 TNF-α의 생산을 증가시킴으로써, 종양 세포의 사멸을 강화할 수 있다는 것을, 시사한다. 본 발명자들은, TNF-α를 타겟팅하는 차단 항체를 사용하여 TNF-α의 역할을 기능적으로 규명하였다. TNF-α의 전신 차단을 적용하면 SNC 및 ICI 조합 처리 효과가 완전히 반전되었는데 (도 65c), 이는 이들 개별 물질들의 상승작용에 TNF-α가 중요함을 강조하여 보여준다.
SMC의 면역조절성 항암 효과는 다중 방식이다 (도 66 및 67). SMC는 대식세포를 면역억제 M2 타입에서 멀어지고 염증성 TNF-α를 발현하는 M1 표현형이 되게 양극화시킬 수 있다. 또한, SMC 항암 효과는 전염증성 사이토카인에 의해 상당히 강화되며, 종양 미세환경 내 이들 사이토카인, 예를 들어 TNF-α 또는 TRAIL의 존재가 종양 세포 사멸을 유발한다. 특히, 암 세포에서 SMC 매개 CIAP 고갈은 TNF-α-매개 생존 반응을 사멸 경로로 전환한다.
본 발명의 연구를 통해, SMC가 anti-PD-1 또는 anti-CTLA4 항체 등의 ICI의 작용과 협력하며 극적으로 강화하므로, 공격적인 두개강내 종양을 가진 마우스의 영구적인 치유가 가능하다는 것을, 입증하였다. SMC 요법에 참여하는 기전의 다양성 및 복합성으로 인해, 조합적인 상승작용에서 다양한 면역 조절 작용에 대한 개개 역할을 구분해내긴 어렵다. 그러나, TNF-α 세포독성이 관여한다는 것은 명백하다. 또한, 본 연구에서, ICI와 SMC의 조합시 CD8+ T-세포가 항암 활성에 필요함을 추가로 확인하였다.
요컨대, 본 발명자들은 마우스 종양 모델에서 ICI의 활성을 SMC가 강화할 수 있다는 것을 최초로 입증하였다. 또한, 이러한 조합 효과가 CD8+ T 세포의 존재에 의존하며 동시에 면역억제 CD4+ T 세포, 그리고 I 및 II IFN 및 TNF-α가 동시에 감소되는데, 이는 마우스에서 SMC-매개 치유에 획득 면역의 역할을 명확하게 암시해준다. 즉, SMC-매개 T-세포 공동-자극 신호가 종양에 대해 형성된 획득 면역 반응에 구동 인자로서 작용하며, PD-1 또는 PD-L1과 같은 공동-저해 신호에 의해 부과되는 브레이크가 ICI로 제거되었을 때, 완전히 구현된다.
기타 구현예들
본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원 및 특허는 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 구체적인 구현예를 들어 기술되었지만, 추가적으로 수정할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 본 발명은, 당해 기술 분야의 공지된 또는 통상의 실무 내에 이루어지는 본원으로부터 기원한 것을 비롯하여, 일반적으로 본 발명의 원리에 따르는 본 발명에 대한 모든 변형, 용도 또는 적용을 포괄하는 것으로 의도된다.

Claims (46)

  1. 조성물로서,
    (i) 표 1의 SMC; 및
    (ii) 표 2 또는 표 3의 물질 (agent), 또는 면역 체크포인트 저해제 (ICI) 또는 STING 작용제 (agonist)인 물질을 포함하며,
    상기 SMC와 상기 물질은 이들을 필요로 하는 환자에게 투여시 함께 암을 치료하기에 충분한 양으로 제공되는, 조성물.
  2. 암으로 진단된 환자를 치료하는 방법으로서,
    상기 방법이, 상기 환자에게, (i) 표 1의 SMC; 및 (ii) 표 2 또는 표 3의 물질, 또는 면역 체크포인트 저해제 (ICI) 또는 STING 작용제인 물질을 투여하는 단계를 포함하며,
    상기 SMC와 상기 물질이, 이들이 함께 상기 암을 치료하기에 충분한 양으로 동시에 또는 서로 28일 이내에 투여되는, 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 SMC 및 상기 물질이 서로 14일 이내에 투여되는, 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 SMC 및 상기 물질이 서로 10일 이내에 투여되는, 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 SMC 및 상기 물질이 서로 5일 이내에 투여되는, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 SMC 및 상기 물질이 서로 24시간 이내에 투여되는, 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 SMC 및 상기 물질이 서로 6시간 이내에 투여되는, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 SMC 및 상기 물질이 실질적으로 동시에 투여되는, 방법.
  9. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 SMC가 1가 SMC (monovalent SMC)인 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 SMC가 LCL161인, 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 SMC가 GDC-0152/RG7419 또는 GDC-0917/CUDC-427인, 방법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 SMC가 SM-406/AT-406/Debio1143인, 방법.
  13. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 SMC가 2가 SMC (bivalent SMC)인, 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 SMC가 AEG40826/HGS1049인, 방법.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 SMC가 OICR720인, 방법.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 SMC가 TL32711인, 방법.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 SMC가 SM-1387/APG-1387인, 방법.
  18. 제2항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 물질이 표 2의 TLR 작용제인, 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 물질이 리포폴리사카라이드, 펩티도글리칸 또는 리포펩타이드인, 방법.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 물질이 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드인, 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 물질이 CpG-ODN 2216인, 방법.
  22. 제18항에 있어서,
    상기 물질이 이미퀴모드 (imiquimod)인, 방법.
  23. 제18항에 있어서,
    상기 물질이 폴리(I:C)인, 방법.
  24. 제18항에 있어서,
    상기 물질이 BCG인, 방법.
  25. 제2항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 물질이 표 3의 바이러스인, 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 물질이 수포성 구내염 바이러스 (vesicular stomatitis virus, VSV)인, 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 물질이 VSV-M51R, VSV-MΔ51, VSV-IFNβ 또는 VSV-IFNβ-NIS인, 방법.
  28. 제25항에 있어서,
    상기 물질이 아데노바이러스, 마라바 베지쿨로바이러스 (maraba vesiculovirus), 레오바이러스 (reovirus), 랍도바이러스 (rhabdovirus), 백시니아 바이러스 (vaccinia virus) 또는 이의 변이체인, 방법.
  29. 제25항에 있어서,
    상기 물질이 탈리모겐 라헤르파렙벡 (Talimogene laherparepvec)인, 방법.
  30. 제2항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 물질이 ICI인, 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 ICI이 이필리무맵 (ipilimumab), 트레멜리무맵 (tremelimumab), 펨브롤리주맵 (pembrolizumab), 니볼루맵 (nivolumab), 피딜리주맵 (pidilizumab), AMP-224, AMP-514, AUNP 12, PDR001, BGB-A317, REGN2810, 아벨루맵 (avelumab), BMS-935559, 아테졸리주맵 (atezolizumab), 두르발루맵 (durvalumab), BMS-986016, LAG525, IMP321, MBG453, 리릴루맵 (lirilumab) 또는 MGA271로 이루어진 리스트로부터 선택되는, 방법.
  32. 제2항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암이 상기 물질의 부재 하에서는 상기 SMC에 의한 치료에 난치성인, 방법.
  33. 제2항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 치료는 인터페론을 포함하는 치료제의 투여를 더 포함하는, 방법.
  34. 제33항에 있어서,
    인터페론이 타입 I 인터페론인, 방법.
  35. 제2항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암이 부신암, 기저세포암, 담관암, 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 융모암, 대장암, 결장직장암, 결합 조직암, 소화계 암, 자궁내막암, 상인두암, 식도암, 안구암, 담낭암, 위암 (gastric cancer), 두경부암, 간세포암, 상피내암종, 신장암, 후두암, 백혈병, 간암, 간 전이, 폐암, 림프종, 흑색종, 골수종, 다발성 골수종, 신경모세포종, 중피종, 신경교종, 골수이형성 증후군, 다발성 골수종, 구강암, 난소암, 소아암, 췌장암, 췌장 내분비 종양, 음경암, 형질세포 종양, 뇌하수체 선종, 흉선종, 전립선암, 신장 세포 암종, 호흡계 암, 횡문근육종, 침샘암, 육종, 피부암, 소장암, 위암 (stomach cancer), 고환암, 갑상선암, 요관암 및 비뇨계 암으로부터 선택되는, 방법.
  36. 조성물로서,
    표 1의 SMC 및 물질 (agent)을 포함하며,
    상기 물질이 바이러스 사균 (killed virus), 불활화된 바이러스 (inactivated virus) 또는 바이러스 백신을 포함하며,
    상기 SMC 및 상기 물질이 이들을 필요로 하는 환자에게 투여시 함께 암을 치료하기에 충분한 양으로 제공되는, 조성물.
  37. 제36항에 있어서,
    상기 물질이 NRRP 또는 광견병 백신인, 조성물.
  38. 조성물로서,
    표 1의 SMC 및 물질 (agent)을 포함하며,
    상기 물질이 면역 반응을 촉발 (priming)하는 제1 물질과, 상기 면역 반응을 부스팅 (boosting)하는 적어도 제2 물질을 포함하며,
    상기 SMC 및 상기 물질이 이들을 필요로 하는 환자에게 투여시 함께 암을 치료하기에 충분한 양으로 제공되는, 조성물.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 제1 물질 및 상기 제2 물질 중 하나 또는 둘다가 종양 용해성 바이러스 백신 (oncolytic virus vaccine)인, 조성물.
  40. 제39항에 있어서,
    상기 제1 물질이 종양 항원을 운반하는 아데노바이러스이고,
    상기 제2 물질이 베지쿨로바이러스 (vesiculovirus)인, 조성물.
  41. 제38항에 있어서,
    상기 베지쿨로바이러스가 상기 아데노바이러스와 동일한 종양 항원을 운반하는 Maraba-MG1 및 종양 항원을 운반하지 않는 Maraba-MG1으로부터 선택되는, 조성물.
  42. 조성물로서,
    SMC 및 ICI를 포함하며,
    상기 SMC 및 ICI는 이들을 필요로 하는 환자에게 투여시 함께 암을 치료하기에 충분한 양으로 제공되는, 조성물.
  43. 제42항에 있어서,
    상기 SMC가 표 1의 SMC인, 조성물.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서,
    상기 ICI가 표 4의 ICI인, 조성물.
  45. (ii) 표 1의 SMC 및
    (ii) 2종, 3종, 4종, 5종 또는 6종 이상의 물질 (agent)을 포함하며,
    상기 물질이 각각 독립적으로 ICI 또는 표 2의 물질 또는 표 3의 물질 또는 STING 작용제인, 조성물.
  46. 제45항에 있어서,
    ICI가 표 4의 ICI인, 조성물.
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