CN108473584B - 特异性结合pd-1和tim-3的抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特异性结合PD‑1和TIM‑3的抗体、编码该抗体或片段的多核苷酸以及制备和使用前述物质的方法。

Description

特异性结合PD-1和TIM-3的抗体及其用途
序列表
本申请包含经由EFS-Web递交的序列表，其全部内容全文以引用方式并入本文。2016年10月28日创建的ASCII文本文件命名为“JBI5071WOPCT2_ST25.txt”，并且大小为418千字节。
技术领域
本发明涉及特异性结合PD-1和TIM-3的抗体、编码该抗体或片段的多核苷酸以及制备和使用前述物质的方法。
背景技术
免疫系统受共刺激和共抑制配体和受体的网络的严格控制。这些分子提供T细胞活化的次级信号，并提供正负信号的平衡网络以最大化针对感染和肿瘤的免疫应答，同时限制对自身的免疫(Wang等人，(2011年3月7日电子版)J Exp Med 208(3):577-92；Lepenies等人，(2008)Endocr Metab Immune Disord Drug Targets 8:279-288)。
免疫检查点疗法在T细胞中靶定共抑制途径来促进抗肿瘤免疫应答，已经在癌症患者临床护理中取得了进展。
PD-1是一种在肿瘤微环境(TME)中抑制CD4+和CD8+T细胞功能的阴性免疫检查点分子。PD-1与其配体(PD-L1和PD-L2)的接合通过抑制T细胞受体信号转导的多个途径下游而驱动肿瘤内T细胞无反应性和衰竭，从而导致T细胞存活率、生长和增殖降低，效应子功能受损并且新陈代谢改变。临床前研究示出PD-1途径阻断可逆转T细胞衰竭并且刺激抗肿瘤免疫性。
PD-1途径从而有助于经由免疫破坏使TME中的T细胞功能下调以及肿瘤逃逸。在TME中，除表达高水平的PD-1之外，衰竭的T细胞还表达其它抑制性受体，包括CTLA-4、TIM-3、LAG-3、CD244、TIGIT和CD160(参见例如Pauken&Wherry；2015,Trends in Immunology 36(4):265–276)。
TIM-3是一种表达于分泌IFN-γ的Th1(辅助T细胞1)CD4+细胞和细胞毒性CD8+T细胞上的跨膜受体。TIM-3通常不表达于原初T细胞，而是在活化的效应子T细胞上上调。TIM-3在调节体内免疫性和耐受性中起作用(参见Hastings等人，(2009)Eur J Immunol 39(9):2492-501)。
PD-1抗体已描述于例如：美国专利5,897,862和7,488,802，以及国际专利公布WO2004/004771、WO2004/056875、WO2006/121168、WO2008/156712、WO2010/029435、WO2010/036959、WO2011/110604、WO2012/145493、WO2014/194302、WO2014/206107、WO2015/036394、WO2015/035606、WO2015/085847、WO2015/112900和WO2015/112805中。
TIM-3抗体已描述于例如：Monney等人，Nature(2002)415(6871):536-41，以及国际专利公布WO2011/155607、WO2013/006490和WO2015/117002中。
与TIM-3抗体和PD-L1抗体组合已在例如国际专利公布WO2011/159877中有所评价。
虽然抗-PD-1/PD-L1抗体在患有多发性实体瘤的患者中表现出令人鼓舞的临床应答，但是应答率仍然相当低，在经预处理的患者中为约15％至20％(Swaika等人，(2015)MolImmunol doi:10.1016/j.molimm.2015.02.009)。
因此，需要抑制检查点抑制剂(诸如PD-1和TIM-3)的免疫抑制活性的新治疗剂，以用于癌症免疫疗法并且治疗将受益于增强免疫应答的其它病症，例如慢性感染。
发明内容
本发明提供一种分离的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体，包含特异性结合PD-1的第一域和特异性结合TIM-3的第二域，包含如本文所述的特定的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3、VH、VL、重链或轻链氨基酸序列。
本发明还提供一种分离的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体，包含特异性结合PD-1的第一域和特异性结合TIM-3的第二域，其中第一域包含分别为SEQ ID NO:10、14、17、23、26和32的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且第二域包含分别为SEQ ID NO:97、105、115、124、133和143的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本发明还提供一种分离的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体，包含特异性结合PD-1的第一域和特异性结合TIM-3的第二域，其中第一域包含分别为SEQ ID NO:10、14、17、23、26和32的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且第二域包含分别为SEQ ID NO:91、99、108、118、127和136的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本发明还提供一种分离的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体，包含特异性结合PD-1的第一域和特异性结合TIM-3的第二域，其中第一域包含分别为SEQ ID NO:66、67、68、69、70和71的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且第二域包含分别为SEQ ID NO:97、105、115、124、133和143的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本发明还提供一种分离的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体，包含特异性结合PD-1的第一域和特异性结合TIM-3的第二域，其中第一域包含分别为SEQ ID NO:66、67、68、69、70和71的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且第二域包含分别为SEQ ID NO:91、99、108、118、127和136的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本发明还提供一种分离的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体，包含特异性结合PD-1的第一域和特异性结合TIM-3的第二域，其中第一域包含分别为SEQ ID NO:10、14、16、723、26和32的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且第二域包含分别为SEQ ID NO:97、105、115、124、133和143的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本发明还提供一种包含特异性结合PD-1的第一域和特异性结合TIM-3的第二域的分离的拮抗性双特异性PD1/TIM-3抗体，其中所述第一域包含SEQ ID NO:48的重链可变区(VH)和SEQ ID NO:56的轻链可变区(VL)，并且第二域包含SEQ ID NO:153的VH和SEQ IDNO:162的VL。
本发明还提供一种包含特异性结合PD-1的第一域和特异性结合TIM-3的第二域的分离的拮抗性双特异性PD1/TIM-3抗体，其中所述第一域包含SEQ ID NO:48的VH和SEQ IDNO:56的VL，并且所述第二域包含SEQ ID NO:146的VH和SEQ ID NO:156的VL。
本发明还提供一种包含特异性结合PD-1的第一域和特异性结合TIM-3的第二域的分离的拮抗性双特异性PD1/TIM-3抗体，其中所述第一域包含SEQ ID NO:64的VH和SEQ IDNO:65的VL，并且所述第二域包含SEQ ID NO:153的VH和SEQ ID NO:162的VL。
本发明还提供一种包含特异性结合PD-1的第一域和特异性结合TIM-3的第二域的分离的拮抗性双特异性PD1/TIM-3抗体，其中所述第一域包含SEQ ID NO:64的VH和SEQ IDNO:65的VL，并且所述第二域包含SEQ ID NO:146的VH和SEQ ID NO:156的VL。
本发明还提供一种包含特异性结合PD-1的第一域和特异性结合TIM-3的第二域的分离的拮抗性双特异性PD1/TIM-3抗体，其中所述第一域包含SEQ ID NO:48的VH和SEQ IDNO:56的VL，并且所述第二域包含SEQ ID NO:172的VH和SEQ ID NO:173的VL。
本发明还提供一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含与治疗剂或成像剂连接的本发明的抗体或其抗原结合部分。
本发明还提供一种包含本发明的抗体以及药学上可接受的载体的药物组合物。
本发明还提供一种编码本发明的抗体VH、抗体VL、或抗体VH与抗体VL的多核苷酸。
本发明还提供一种包含编码本发明的抗体VH、抗体VL、或抗体VH与VL的多核苷酸的载体。
本发明还提供一种包含本发明的载体的宿主细胞。
本发明还提供一种制备本发明的抗体的方法，该方法包括在表达抗体的条件下培养本发明的宿主细胞，并且回收由宿主细胞产生的抗体。
本发明还提供一种治疗受试者的癌症的方法，该方法包括以足以治疗癌症的时间向对其有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的分离的抗体。
本发明还提供一种增强受试者中的免疫应答的方法，该方法包括以足以增强免疫应答的时间向对其有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的分离的抗体。
本发明还提供一种结合本发明的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供一种包含本发明的抗体的试剂盒。
附图说明
图1A示出用抗-PD-1抗体治疗后，肿瘤中的TIM-3表面表达有所升高。每两周用抗-PD-1抗体或载体治疗具有形成CT26结肠癌肿瘤的Balb/c小鼠一次。在第22天收获肿瘤，并且用流式细胞术在肿瘤浸润T细胞上评价TIM-3表达。MFI：平均荧光强度。PBS：对照
图1B示出用抗-PD-1抗体治疗后，浸润于肿瘤的淋巴细胞(TIL)上TIM-3的表面表达有所升高。每两周用抗-PD-1抗体或载体治疗具有形成MC38结肠癌肿瘤的Balb/c小鼠一次。总CD8TIL群体上TIM-3表达的几何平均荧光强度(gMFI)示于载体治疗的(PBS)或抗-PD-1抗体治疗的(PD-1)动物中。p＝0.003载体对比抗-PD-1抗体治疗组。
图1C示出从经载体(PBS)或抗-PD-1抗体(PD-1)治疗的小鼠收获的MC38肿瘤中总CD8+TIL的TIM-3+CD8细胞的相对频率。p＝0.045载体对比抗-PD-1抗体治疗组。
图2A示出在相比于载体治疗(PBS)的组时，用抗-PD-1抗体(PD-1组)治疗的动物的MC38结肠癌肿瘤中TIL上的CD137表面表达(gMFI)有所升高。p＝0.005载体对比抗-PD-1抗体治疗组。每个点代表一只小鼠。数据表示至少2次独立实验。
图2B示出在相比于载体治疗(PBS)的组时，用抗-PD-1抗体(PD-1组)治疗的动物的MC38结肠癌肿瘤中的总CD8+TIL的CD137+CD8细胞的相对频率有所升高。p＝0.0475载体对比抗-PD-1抗体治疗组。每个点代表一只小鼠。数据表示至少2次独立实验。
图3A示出在相比于载体治疗(PBS)的组时，用抗-PD-1抗体(PD-1组)治疗的动物的MC38结肠癌肿瘤中TIL上的OX40表面表达(gMFI)有所升高。p＝0.0013载体对比抗-PD-1抗体治疗组。每个点代表一只小鼠。数据表示至少2次独立实验。
图3B示出在相比于载体治疗(PBS)的组时，用抗-PD-1抗体(PD-1组)治疗的动物的MC38结肠癌肿瘤中的总CD8+TIL的OX40+CD8细胞的相对频率有所升高。p＝0.03载体对比抗-PD-1抗体治疗组。每个点代表一只小鼠。数据表示至少2次独立实验。
图4A示出在相比于载体治疗(PBS)的组时，用抗-PD-1抗体(PD-1组)治疗的动物的MC38结肠癌肿瘤中TIL上的GITR表面表达(gMFI)有所升高。p＝0.0004载体对比抗-PD-1抗体治疗组。每个点代表一只小鼠。数据表示至少2次独立实验。
图4B示出在相比于载体治疗(PBS)的组时，用抗-PD-1抗体(PD-1组)治疗的动物的MC38结肠癌肿瘤中的总CD8+TIL的GITR+CD8细胞的相对频率有所升高。p＝0.0015载体对比抗-PD-1抗体治疗组。每个点代表一只小鼠。数据表示至少2次独立实验。
图5示出在抗-PD-1抗体治疗后，用抗-TIM-3抗体治疗进一步诱导抗原特异性免疫应答。使用得自CMV阳性供体的PBMC在CMV测定中对抗体进行测试，其中抗原特异性免疫应答通过pp65肽库诱导。将细胞用抗-PD-1抗体PD1B244处理5天，再刺激，并用抗-TIM-3抗体TM3B105处理24小时。免疫应答通过测定IFN-γ分泌的增加来确定。IgG2s Iso：IgG2σ同种型对照。CMV：在不存在抗体时用细胞巨化病毒p65肽处理的样本。
图6示出所选抗-PD-1抗体的HCDR1序列和HCDR1属序列。
图7示出所选抗-PD-1抗体的HCDR2序列和HCDR2属序列。
图8示出所选抗-PD-1抗体的HCDR3序列和第一HCDR3属序列。
图9示出所选抗-PD-1抗体的HCDR3序列和第二HCDR3属序列。
图10示出所选抗-PD-1抗体的LCDR1序列和LCDR1属序列。
图11示出所选抗-PD-1抗体的LCDR2序列和LCDR2属序列。
图12示出所选抗-PD-1抗体的LCDR3序列和LCDR3属序列。
图13示出所选抗-TIM-3抗体的HCDR1序列和HCDR1属序列。使用抗体建模的默认协议，通过在MOE(CCG,Montreal)中对所有Fv(VH/VL对)生成分子模型来测定属序列。对于具有不同长度的CDR，基于结构保守区来比对这些结构模型，并且鉴定结构等同的CDR位置。
图14示出所选抗-TIM-3抗体的HCDR2序列和HCDR2属序列。HCDR2属序列如图10所述产生。
图15示出所选抗-TIM-3抗体的HCDR3序列和第一HCDR3属序列。HCDR3属序列如图10所述产生。
图16示出所选抗-TIM-3抗体的LCDR1序列和LCDR1属序列。LCDR1属序列如图10所述产生。
图17示出所选抗-TIM-3抗体的LCDR2序列和LCDR2属序列。LCDR2属序列如图10所述产生。
图18示出所选抗-TIM-3抗体的LCDR3序列和LCDR3属序列。LCDR3属序列如图10所述产生。
图19A示出在相比于载体治疗(PBS)的组时，用抗-TIM-3抗体(TIM-3组)治疗的动物的MC38结肠癌肿瘤中TIL上的TIGIT表面表达(gMFI)有所升高。p＝0.0181载体对比抗-TIM-3抗体治疗组。每个点代表一只小鼠。数据表示至少2次独立实验。
图19B示出在相比于载体治疗(PBS)的组时，用抗-TIM-3抗体(TIM-3组)治疗的动物的MC38结肠癌肿瘤中的总CD8+TIL的TIGIT+CD8细胞的相对频率有所升高。p＝0.0475载体对比抗-TIM-3抗体治疗组。每个点代表一只小鼠。数据表示至少2次独立实验。
图20A示出在相比于载体治疗(PBS)的组时，用抗-TIM-3抗体(TIM-3组)治疗的动物的CT26结肠癌肿瘤中TIL上的TIGIT表面表达(gMFI)有所升高。p<0.001载体对比抗-TIM-3抗体治疗组。每个点代表一只小鼠。数据表示至少2次独立实验。
图20B示出在相比于载体治疗(PBS)的组时，用抗-TIM-3抗体(TIM-3组)治疗的动物的CT26结肠癌肿瘤中的总CD8+TIL的TIGIT+CD8细胞的相对频率有所升高。p＝0.0105载体对比抗-TIM-3抗体治疗组。每个点代表一只小鼠。数据表示至少2次独立实验。
图21示出在存在或不存在抗-PD-1或抗-TIM-3功能阻断性抗体时，TIM-3表达在来自经黑色素瘤抗原肽库(NY-ESO，gp100，MART-1)刺激的初次用药黑色素瘤患者的黑色素瘤患者PBMC中外周T细胞上有所上调。在第6天，通过流式细胞术在重刺激的细胞上测定TIM-3的表达。
图22A示出TM3B403治疗增大了IL-2刺激的人PBMC中活化NK细胞的频率。IgG2s：同种型对照。NK细胞活化评估为刺激的PBMC中表达CD69的细胞的百分比(％)。
图22B示出TM3B403治疗增大了IL-2刺激的人PBMC中活化NK细胞的频率。IgG2s：同种型对照。NK细胞活化评估为刺激的PBMC中表达CD25的细胞的百分比(％)。
具体实施方式
本说明书中所引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请均以引用方式并入本文，如同在本文中完整给出。
应当了解，本文所用的术语只是为了描述具体实施方案的目的，并非旨在进行限制。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。
虽然与本文所述的那些方法和材料相似或等效的任意方法和材料都可以用于检验本发明的实践中，然而本文中描述示例性材料和方法。在描述和要求保护本发明时，将使用以下术语。
如本说明书和所附权利要求中所用，除非内容另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代。因此，例如，对“一个细胞”的提及包括两个或更多个细胞的组合等等。
“特异性结合”、“特异性地结合”或“结合”是指抗体以比针对其它抗原更高的亲和力结合至某个抗原或该抗原内的表位。通常，抗体以约1×10-8M或更小(例如约1×10-9M或更小、约1×10-10M或更小、约1×10-11M或更小、或者约1×10-12M或更小)的平衡解离常数(KD)结合至抗原或抗原内的表位，通常该KD为该抗体结合至非特异性抗原(如BSA、酪蛋白)的KD的至少百分之一。可使用标准程序来测量解离常数。然而，特异性地结合至抗原或抗原内的表位的抗体可能对其它相关的抗原具有交叉反应性，例如，对来自其它物种(同源)(诸如人或猴，例如食蟹猕猴(Macaca fascicularis)(cynomolgus,cyno)、黑猩猩(Pantroglodytes)(chimpanzee,chimp))或狨猴(Callithrix jacchus)(common marmoset,marmoset)的相同抗原具有交叉反应性。虽然单特异性抗体特异性地结合一个抗原或一个表位，而双特异性抗体特异性地结合两个不同的抗原或两个不同的表位。
“抗体”广义上是指并包括免疫球蛋白分子，具体包括单克隆抗体(包括鼠科动物单克隆抗体、人单克隆抗体、人源化单克隆抗体和嵌合单克隆抗体)，抗原结合片断，双特异性或多特异性抗体，二聚、四聚或多聚抗体，单链抗体，域抗体，以及包含具有所需特异性的抗原结合位点的免疫球蛋白分子的任何其它经修饰构型。“全长抗体”包含由二硫键互连的两条重链(H)与两条轻链(L)以及它们的多聚体(例如IgM)。每条重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区(包含域CH1、铰链CH2和CH3)。每条轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。VH和VL区可进一步细分为称作互补决定区(CDR)的超变区，间插有框架区(FR)。各个VH和VL由三个CDR和四个FR片段构成，并按以下顺序从氨基末端至羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
“互补决定区(CDR)”为抗体中的“抗原结合位点”。可使用不同的术语来定义CDR：(i)三个在VH中(HCDR1、HCDR2、HCDR3)且三个在VL中(LCDR1、LCDR2、LCDR3)的互补决定区(CDR)是基于序列变异性(Wu和Kabat,(1970)J Exp Med 132:211-50；Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。(ii)三个在VH(H1、H2、H3)中并且三个在VL(L1、L2、L3)中的“超变区”、“HVR”或“HV”是指抗体可变域中的在结构上超变的区域，如Chothia和Lesk所定义(Chothia和Lesk,(1987)Mol Biol 196:901-17)。国际免疫遗传学(IMGT)数据库(http://www_imgt_org)提供了抗原结合位点的标准化编号和定义。CDR、HV和IMGT描述之间的对应关系在Lefranc等人，(2003)Dev Comparat Immunol 27:55-77中有所描述。除非在说明书中另有明确说明，如本文所用，术语“CDR”、“HCDR1”、“HCDR2”、“HCDR3”、“LCDR1”、“LCDR2”和“LCDR3”包括上文所述的任何方法(Kabat、Chothia或IMGT)所定义的CDR。
免疫球蛋白可根据重链恒定域氨基酸序列被指定为五种主要种类IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgA和IgG进一步亚分类为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。基于其恒定域的氨基酸序列，可将任何脊椎物种的抗体轻链指定为两种完全不同的类型即κ和λ中的一种。
“抗体片段”或“抗原结合部分”是指免疫球蛋白分子的保留亲本全长抗体的抗原结合特性的部分。示例性的抗原结合部分为重链互补决定区(HCDR)1、2和3、轻链互补决定区(LCDR)1、2和3、重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)、Fab、F(ab')2、Fd和Fv片段以及由一个VH或VL域组成的域抗体(dAb)。VH和VL域可经由合成接头连接在一起以形成各种类型的单链抗体设计，其中在VH和VL域由单独的单链抗体构建体表达的情况下，VH/VL域可在分子内或分子间配对，以形成单价抗原结合位点，诸如单链Fv(scFv)或双价抗体；例如在国际专利公布WO1998/44001、WO1988/01649、WO1994/13804和WO1992/01047中有所描述。
“单克隆抗体”是指在每条重链和每条轻链中具有单一氨基酸组成的抗体群，除了可能的熟知改变，诸如从抗体重链中除去C末端赖氨酸之外。除了多特异性单克隆抗体结合两个或更多个不同的抗原或表位之外，单克隆抗体通常结合一个抗原表位。双特异性单克隆抗体结合两个不同的抗原表位。单克隆抗体可在抗体群内具有异质糖基化。单克隆抗体可以是单特异性的或多特异性的，或者是单价的、二价的或多价的。多特异性抗体，诸如双特异性抗体或三特异性抗体包括在术语单克隆抗体之中。
“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体或抗体片段(例如，特异性结合PD-1的分离的抗体基本上不含特异性结合PD-1之外的抗原的抗体)。特异性结合TIM-3的分离的抗体基本上不含特异性结合除TIM-3之外的抗原的抗体。就双特异性PD-1/TIM-3抗体而言，双特异性抗体特异性结合PD-1和TIM-3两者，并且基本上不含特异性结合除PD-1和TIM-3以外的抗原的抗体。“分离的抗体”涵盖分离至更高纯度的抗体，诸如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯度的抗体。
“人源化抗体”是指其中至少一个CDR来源于非人物种并且可变区框架来源于人免疫球蛋白序列的抗体。人源化抗体在框架区中可包括特意引入的突变，使得该框架可能不是表达的人免疫球蛋白序列或种系基因序列的精确拷贝。
“人抗体”是指具有重链可变区和轻链可变区的抗体，其中框架和全部6个CDR均来源于人起源的序列。如果抗体包含恒定区或恒定区的一部分，则该恒定区也来源于人起源的序列。
如果人抗体的可变区来源于使用人种系免疫球蛋白或重排免疫球蛋白基因的系统，则人抗体包含“来源于”人起源序列的重链可变区或轻链可变区。此类示例性系统为在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库，以及转基因非人动物，诸如携带如本文所述的人免疫球蛋白基因座的小鼠或大鼠。在与人种系免疫球蛋白基因或重排免疫球蛋白基因进行比较时，“人抗体”可包含由于例如天然存在的体细胞突变或者在框架或抗原结合位点中特意引入置换或两者所引起的氨基酸差异。通常，“人抗体”的氨基酸序列与由人种系免疫球蛋白基因或重排免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些情况下，“人抗体”可包含由人框架序列分析得到的共有框架序列(例如Knappik等人，(2000)J Mol Biol 296:57-86中所述)；或结合到展示在噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库中的合成HCDR3(例如Shi等人，(2010)J Mol Biol 397:385-96和国际专利公布WO2009/085462中所述)。
来源于人免疫球蛋白序列的人抗体可使用系统诸如噬菌体展示结合合成的CDR和/或合成的框架来生成，或者可对其进行体外诱变以改善抗体特性，从而得到不由体内整套人抗体种系表达的抗体。
“重组体”是指以重组手段制备、表达、创建或分离的抗体及其它蛋白质。
“表位”是指抗原的与抗体特异性结合的部分。表位通常由部分诸如氨基酸或多糖侧链的化学活性(诸如，极性、非极性或疏水性)表面基团组成，并且可具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。表位可由形成构象空间单元的连续和/或不连续氨基酸构成。对于不连续表位，来自抗原的线性序列的不同部分的氨基酸因蛋白质分子的折叠而在三维空间上靠近。抗体“表位”取决于用来鉴定表位的方法。
“多特异性”是指特异性结合至少两个不同抗原或抗原内两个不同表位，例如三个、四个或五个不同的抗原或表位的抗体。
“双特异性”是指特异性结合两个不同抗原或同一抗原内的两个不同表位的抗体。双特异性抗体可能对其它相关的抗原具有交叉反应性，例如，对来自其它物种(同源)(诸如人或猴，例如食蟹猕猴(Macaca fascicularis)(cynomolgus,cyno)、黑猩猩(Pantroglodytes)(chimpanzee,chimp)或狨猴(Callithrix jacchus)(common marmoset,marmoset))的相同抗原具有交叉反应性，或者可结合两个或更多个抗原之间所共享的表位。
“变体”是指因一处或多处修饰(例如，置换、插入或缺失)而不同于参考多肽或参考多核苷酸的多肽或多核苷酸。
“载体”是指能够在生物系统内复制或可在这类系统之间移动的多核苷酸。载体多核苷酸通常含有诸如复制起点、聚腺苷酸化信号或选择标记的元件，其功能是促进这些多核苷酸在生物系统中的复制或保持。此类生物系统的示例可包括细胞、病毒、动物、植物和用能够复制载体的生物组分再造的生物系统。包含载体的多核苷酸可为DNA或RNA分子或这些分子的杂合分子。
“表达载体”是指可用于在生物系统或再造生物系统中以指导由存在于表达载体中的多核苷酸序列所编码的多肽进行翻译的载体。
“多核苷酸”是指包含磷酸糖类主链共价连接的核苷酸链或其它等同共价化学物的合成分子。cDNA是多核苷酸的典型示例。
“多肽”或“蛋白质”是指包含由肽键连接以形成多肽的至少两个氨基酸残基的分子。少于50个氨基酸的小多肽可以称作“肽”。
PD-1是指人程序性细胞死亡蛋白1，即PD-1。PD-1也称为CD279或PDCD1。成熟的人PD-1(无信号序列)的氨基酸序列示于SEQ ID NO:1中。胞外域跨越SEQ ID NO:1的残基1-150，跨膜域跨越残基151-171，并且胞质域跨越残基172-268。在整个说明书，“人PD-1的胞外域huPD1-ECD”是指具有SEQ ID NO:1的残基1-149的氨基酸序列的蛋白质，并且示于SEQID NO:2中。除非明确相反地提及，否则在说明书中，“PD-1”是指人成熟PD-1。
TIM-3是指人甲型肝炎病毒细胞受体2，也称为HAVCR2。成熟的人TIM-3(无信号序列)的氨基酸序列示于SEQ ID NO:138中。胞外域跨越SEQ ID NO:138的残基1-181，跨膜域跨越残基182-202，并且胞质域跨越残基203-280。在整个说明书，“人TIM-3的胞外域huTIM-3-ECD”是指具有SEQ ID NO:138的残基1-179的氨基酸序列的蛋白质，并且示于SEQ ID NO:89中。除非明确相反地提及，否则在说明书中，TIM-3是指人成熟TIM-3。
“与……组合”意指将两种或更多种治疗剂以混合物一起、作为单一药剂同时或作为单一药剂以任何顺序依次施用给受试者。
“过表达”、“过度表达”和“超表达”可互换使用，并且指在相比于参考样本时，如癌细胞、恶性细胞或癌组织之类的样本具有可测量的较高水平的PD-1、TIM-3、PD-L1、PD-L2或TIM-3配体。过表达可通过基因扩增或通过增加转录或翻译而引起。样本中蛋白质的表达和过表达可在活细胞或裂解细胞上使用熟知的测定法(例如，使用ELISA、免疫荧光法、流式细胞术或放射免疫测定法)来测量。样本中多核苷酸的表达和过表达可例如使用荧光原位杂交法、Southern印迹、或PCR技术来测量。当样本中的蛋白质或多核苷酸水平相比于参考样本高至少1.5倍或有统计意义上的显著性时，蛋白质或多核苷酸是过表达的。选择的参考样本是已知的。
“样本”是指从受试者分离的类似流体、细胞、或组织的采集物，以及存在于受试者体内的流体、细胞或组织。示例性样本为生物流体，诸如血液、血清和浆膜液、血浆、淋巴液、尿液、唾液、囊液、泪液、排泄物、痰、分泌组织和器官的粘膜分泌物、阴道分泌物、腹水(例如与非实体瘤相关联的那些)，胸膜、心包、腹膜、腹腔和其它体腔的流体，由支气管灌洗液收集的流体，与受试者或生物来源接触的液体溶液，例如细胞和器官培养基(包括细胞或器官条件培养基)、灌洗液等，组织活检样本、细针穿剌或手术切除的肿瘤组织。
“癌细胞”或“肿瘤细胞”是指在体内、离体、或组织培养物中的癌性、癌前或转化的细胞，其具有自发或诱导的表型变化。这些变化未必涉及新遗传物质的摄取。然而转化可由感染转化病毒以及结合新基因组核酸、摄取外源核酸而发生，或者其也可自发地发生或在暴露于致癌物之后发生，从而使内源基因突变。转化/癌症示例为合适的动物宿主(诸如裸小鼠等)中体外、体内和离体的形态变化、细胞永生、异常生长控制、病灶形成、增殖、恶性肿瘤、肿瘤特异性标记物水平调节、侵入、肿瘤生长(Freshney,Culture of Animal Cells:AManual of Basic Technique(第3版，1994))。
术语“约”意指如由本领域的普通技术人员所确定，在特定值的可接受误差范围内，其部分地取决于如何测量或确定该值，即测量体系的限制。在特定测定、结果或实施方案的上下文中，除非实施例或说明书其它地方内另有明确说明，否则“约”意指在根据本领域惯例的一个标准偏差之内、或多至5％的范围(无论哪个更大)。
“双特异性PD-1/TIM-3抗体”、“PD-1/TIM-3抗体”、“双特异性抗-PD-1/TIM-3抗体”或“抗-PD-1/TIM-3抗体”是指包含至少一个特异性结合PD-1的结合域和至少一个特异性结合TIM-3的结合域的分子。特异性结合PD-1和TIM-3的域通常为VH/VL对。双特异性抗-PD-1/TIM-3抗体就其与PD-1或TIM-3的结合而言可为单价。
“价”是指在分子中存在对于抗原为特异性的结合位点的指定数目。因此，术语“单价”、“二价”、“四价”和“六价”分别是指在分子中存在对于抗原为特异性的一个、两个、四个和六个结合位点。
“抗原特异性CD4+或CD8+T细胞”是指被特异性抗原或其免疫刺激表位活化的CD4+或CD8+T细胞。
“CD137”(也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员9，TNFRSF9，4-1BBL)是指具有如SEQ ID NO:281所示的氨基酸序列的人CD137分子。
SEQ ID NO:281
MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
“TIGIT”(也称为T细胞免疫受体，具有Ig和ITIM域)是指具有如SEQ ID NO:301所示的氨基酸序列的人TIGIT分子。
SEQ ID NO:301
MMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPLLGAMAATLVVICTAVIVVVALTRKKKALRIHSVEGDLRRKSAGQEEWSPSAPSPPGSCVQAEAAPAGLCGEQRGEDCAELHDYFNVLSYRSLGNCSFFTETG
“激动剂”是指当与细胞蛋白质结合时诱导由蛋白质的天然配体诱导的至少一种反应或活性的分子。当至少一种反应或活性被诱导超过在不存在激动剂的情况下(例如，阴性对照)被诱导的至少一种反应或活性的至少约30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％时或当与不存在激动剂情况下的诱导相比诱导具有统计意义上的显著性时，分子为激动剂。激动剂可为抗体、可溶性配体、或小分子。示例性激动剂是结合T细胞活化分子的激动性抗体。
“拮抗剂”是指当与细胞蛋白质结合时抑制由蛋白质的天然配体诱导的至少一种反应或活性的分子。当至少一种反应或活性被抑制超过在不存在拮抗剂的情况下(例如，阴性对照)被抑制的至少一种反应或活性的至少约30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％时或当与不存在拮抗剂情况下的抑制相比抑制具有统计意义上的显著性时，分子为拮抗剂。拮抗剂可以是抗体、可溶性配体、小分子、DNA或RNA(诸如siRNA)。示例性拮抗剂是特异性结合PD-1的拮抗性抗体、特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体或特异性结合T细胞抑制性分子的拮抗性抗体。由PD-1与其受体PD-L1或PD-L2结合诱导的典型反应或活性可减少T细胞的抗原特异性CD4+或CD8+细胞的增殖或者减少T细胞产生的干扰素-γ(IFN-γ)，从而抑制针对例如肿瘤的免疫应答。由TIM-3与其受体(诸如半乳糖凝集素-9)结合诱导的典型反应或活性可减少抗原特异性CD4+或CD8+细胞的增殖、减少T细胞产生的IFN-γ或者减少CD4+或CD8+细胞上的CD137表面表达，从而抑制针对例如肿瘤的免疫应答。类似的，由T细胞抑制性分子诱导的典型反应或活性为免疫抑制。从而，特异性结合PD-1的拮抗性PD-1抗体、特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体、或特异性结合T细胞抑制性分子的拮抗性抗体通过对抑制通路抑制来诱导免疫应答。
“受试者”包括任何人类或非人类动物。“非人动物”包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。除非另外指出，术语“患者”或“受试者”可互换使用。
除非另有明确说明，否则贯穿本说明书，抗体恒定区中氨基酸残基根据EU索引编号，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)中有所描述。
本文使用如表1中所示的常规单字母和三字母氨基酸代码。
表1：
氨基酸 三字母代码 单字母代码
丙氨酸 Ala A
精氨酸 Arg R
天冬酰胺 Asn N
天冬氨酸 Asp D
半胱氨酸 Cys C
谷氨酸 Gln E
谷氨酰胺 Glu Q
甘氨酸 Gly G
组氨酸 His H
异亮氨酸 Ile I
赖氨酸 Lys K
甲硫氨酸 Met M
苯丙氨酸 Phe F
脯氨酸 Pro P
丝氨酸 Ser S
苏氨酸 Thr T
色氨酸 Trp W
酪氨酸 Tyr Y
缬氨酸 Val V
物质的组成
本发明提供特异性结合PD-1的拮抗性抗体、特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、以及拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体。本发明提供了多肽和编码本发明抗体的多核苷酸或其互补核酸、载体、宿主细胞以及制备和使用它们的方法。
特异性结合PD-1的拮抗性抗体
PD-1在接合配体时通过多个机制抑制T细胞功能(Pauken&Wherry(2015)Trendsin Immunology 36(4):265–276)。PD-1接合通过与TCR共定位并随后诱导TCR近端信号分子的去磷酸化、抑制Ras/MEK/ERK途径来直接抑制T细胞受体(TCR)信号转导，从而通过抑制PI3K/AKT途径而致使细胞周期进展和T细胞增殖受抑制、细胞生长和存活受抑制以及T细胞代谢重编程，使得BATF转录因子上调，并且调节了调节性T细胞的发育、维持和功能。PD-1也被提出提高T细胞运动性并限制T细胞与靶细胞之间相互作用的持续时间，从而降低T细胞活化程度(Honda等人，(2014)Immunity 40(2):235-47)。
肿瘤增补了PD-1途径来下调肿瘤微环境(TME)中的T细胞功能并且逃避免疫破坏。在TME中，在持续性抗原和炎症条件下，T细胞衰竭或机能失调，并且逐渐失去其效应子功能和增殖能力。衰竭的T细胞表达高水平的PD-1，通常也表达其它抑制剂受体，如TIM-3或LAG-3(Pauken&Wherry(2015)Trends in Immunology 36(4):265–276)。PD-1配体之一即PD-L1也在各种肿瘤中上调。PD-L1表达发生于癌细胞自身和/或浸润性免疫细胞，包括肿瘤相关的巨噬细胞、树突状细胞、成纤维细胞和活化的T细胞中(Chen等人，2012Clin Cancer Res18(24):6580-7)。在这种情况中，PD-1接合被假定为限制抗-肿瘤T细胞响应并导致免疫逃避。最近研究示出，较高频率和水平的PD-1表达发生于多种实体瘤的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)上。重要地，这些PD-1+TIL功能性受损，如由较低增殖和效应子功能所证实的那样(Pauken&Wherry；2015,Trends in Immunology 36(4):265–276)。这些数据支持了PD-1在TME中介导免疫抑制的假说。
经由PD-1途径阻断，肿瘤中的T细胞衰竭至少部分可逆。抗-PD-1/PD-L1抗体已示出增强T细胞功能并导致多个临床前肿瘤模型中改善的抗肿瘤免疫。PD-1/PD-L1抗体也示出激励多种实体瘤中的临床反应，在黑色素瘤中总缓解率(ORR)为20-40％，非小细胞肺癌(NSCLC)为10-24％，肾细胞癌(RCC)中为12-31％，膀胱癌中为24-52％，并且在头颈癌中为20％(Swaika等人，(2015)Mol Immunol 67(2Pt A):4-17)。
本发明提供一种特异性结合PD-1的分离的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:82、83和84或分别为SEQ ID NO:82、83和85的重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3。
本发明还提供一种特异性结合PD-1的分离的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:86、87和88的轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3。
本发明还提供一种特异性结合PD-1的分离的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:82、83和84的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及分别为SEQ ID NO:86、87和88的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本发明还提供一种特异性结合PD-1的分离的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:82、83和85的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及分别为SEQ ID NO:86、87和88的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
SEQ ID NO:82、83、84、85、86、87和88表示具有类似HCDR1、HCDR2、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列、以及两组类似HCDR3序列的特异性结合PD-1的拮抗性抗体的亲和力成熟的变体的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3属序列。所述属之内的抗体以小于约1×10-7M，诸如小于约1×10-8M，例如小于约1×10-9M，或例如小于约1×10-10M的KD结合PD-1。示例性此类抗体为具有如本文所述的抗体PD1B114、PD1B149、PD1B160、PD1B162、PD1B164、PD1B11、PD1B183、PD1B184、PD1B185、PD1B187、PD1B71、PD1B177、PD1B70、PD1B175、PD1B194、PD1B195、PD1B196、PD1B197、PD1B198、PD1B199、PD1B200、PD1B201和PD1B244的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列的抗体。
SEQ ID NO:82
X1YX2IX3，
其中
X1为S或D；
X2为V或A；并且
X3为H或S。
SEQ ID NO:83
GIIPIX4X5TANYAQKFQG，
其中
X4为Y或F；并且
X5为G或D。
SEQ ID NO:84
PGLAAAYDTGX6LDY，
其中
X6为N或S。
SEQ ID NO:85
GX7X8X9X10TGX11LDY，
其中
X7为T或Y；
X8为L或V；
X9为D或R；
X10为R或A；并且
X11为H或M。
SEQ ID NO:86
RASQSVX12X13YLA，
其中
X12为S、R或D；并且
X13为S或N。
SEQ ID NO:87
DASX14RAT，
其中
X14为N、D、Y、S或T。
SEQ ID NO:88
QQRX15X16WPLT，
其中
X15为S、N、G、E、D、W或A；并且
X16为N、Y、E或A。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的分离的拮抗性抗体或其抗原结合部分具有以下特性中的一个、两个、三个、四个或五个：
a)以剂量依赖性方式增强抗原特异性CD4+或CD8+T细胞活化，其中所述活化使用如实施例1中所述的细胞巨化病毒抗原回忆测定(CMV测定)进行测量；
b)以小于约100nM的平衡解离常数(KD)结合人PD-1，其中所述KD使用ProteOnXPR36系统在+25℃下进行测量；
c)以小于约1nM的KD结合人PD-1，其中所述KD使用ProteOn XPR36系统在+25℃下进行测量；
d)以小于约100nM的KD结合猕猴PD-1，其中所述KD使用ProteOn XPR36系统在+25℃下进行测量，或者
e)以小于约1nM的KD结合猕猴PD-1，
其中所述KD使用ProteOn XPR36系统在+25℃下进行测量。
示例性此类抗体为如本文所述的PD-1抗体PD1B114、PD1B149、PD1B160、PD1B162、PD1B164、PD1B11、PD1B183、PD1B184、PD1B185、PD1B187、PD1B71、PD1B177、PD1B70、PD1B175、PD1B194、PD1B195、PD1B196、PD1B197、PD1B198、PD1B199、PD1B200、PD1B201和PD1B244。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的分离的拮抗性抗体或其抗原结合部分以剂量依赖性方式增强抗原特异性CD4+或CD8+T细胞活化，其中所述活化使用如实施例1中所述的细胞巨化病毒抗原回忆测定(CMV测定)进行测量；并且以小于约100nM的平衡解离常数(KD)结合人PD-1，其中所述KD使用ProteOn XPR36系统在+25℃下进行测量。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的分离的拮抗性抗体或其抗原结合部分以剂量依赖性方式增强抗原特异性CD4+或CD8+T细胞活化，其中所述活化使用如实施例1中所述的细胞巨化病毒抗原回忆测定(CMV测定)进行测量；并且以小于约10nM的平衡解离常数(KD)结合人PD-1，其中所述KD使用ProteOn XPR36系统在+25℃下进行测量。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的分离的拮抗性抗体或其抗原结合部分以剂量依赖性方式增强抗原特异性CD4+或CD8+T细胞活化，其中所述活化使用如实施例1中所述的细胞巨化病毒抗原回忆测定(CMV测定)进行测量；并且以小于约100nM的平衡解离常数(KD)结合猕猴PD-1，其中所述KD使用ProteOn XPR36系统在+25℃下进行测量。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的分离的拮抗性抗体或其抗原结合部分以剂量依赖性方式增强抗原特异性CD4+或CD8+T细胞活化，其中所述活化使用如实施例1中所述的细胞巨化病毒抗原回忆测定(CMV测定)进行测量；并且以小于约10nM的平衡解离常数(KD)结合猕猴PD-1，其中所述KD使用ProteOn XPR36系统在+25℃下进行测量。
抗原特异性CD4+或CD8+T细胞的活化可使用已知方案和实施例1中所述的那些通过如下方式评估：在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中测量增加的T细胞增殖，在MLR测定中测量增加的干扰素-γ(IFN-γ)分泌，在MLR测定中测量增加的TNF-α分泌，在细胞巨化病毒抗原测定(CMV测定)中测量增加的IFN-γ分泌或在CMV测定中测量增加的TNF-α分泌。当通过本发明的抗体以剂量依赖性方式增大所测的T细胞功能性时，本发明的抗体增强抗原特异性CD4+或CD8+T的活化。
抗体对人或猕猴PD-1的亲和力可使用任何合适的方法通过实验测定。这类方法可以采用本领域技术人员已知的ProteOn XPR36、Biacore 3000或KinExA仪器、ELISA或竞争结合测定。如果在不同的条件(例如，同渗容摩、pH)下测量，特定抗体/PD-1相互作用的测量亲和力可变化。因此，亲和力和其他结合参数(例如，KD、Kon、Koff)的测量通常用标准化条件和标准化缓冲液(诸如本文所述的缓冲液)进行。本领域技术人员将理解，使用例如Biacore3000或ProteOn进行亲和力测量的内部误差(测量为标准偏差，SD)通常可在典型检出限内的测量值的5％-33％内。因此，KD背景下的术语“约”反映测定中的典型标准偏差。例如，1×10-9M的KD的典型SD为至多±0.33×10-9M。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分包含SEQ IDNO:41、42、43、44、45、46、47或48的重链可变区(VH)内所含的HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3由Chothia、Kabat或IMGT定义。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61或62的轻链可变区(VL)内所含的LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述LCDR1、LCDR2和LCDR由Chothia、Kabat、或IMGT定义。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分包含：
SEQ ID NO:10、11或12的HCDR1；
SEQ ID NO:13、14或15的HCDR2；以及
SEQ ID NO:16、17、18或19的HCDR3。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分包含：
SEQ ID NO:20、21、22、23、24或25的LCDR1；
SEQ ID NO:26、27、28、29或30的LCDR2；以及
SEQ ID NO:31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40的LCDR3。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分包含：
SEQ ID NO:10、11或12的HCDR1；
SEQ ID NO:13、14或15的HCDR2；
SEQ ID NO:16、17、18或19的HCDR3；
SEQ ID NO:20、21、22、23、24或25的LCDR1；
SEQ ID NO:26、27、28、29或30的LCDR2；以及
SEQ ID NO:31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40的LCDR3。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分包含下列的HCDR1、HCDR2和HCDR3：
分别为SEQ ID NO:10、13和16；
分别为SEQ ID NO:10、14和16；
分别为SEQ ID NO:10、13和17；
分别为SEQ ID NO:10、13和18；
分别为SEQ ID NO:11、15和18；
分别为SEQ ID NO:10、13和19；
分别为SEQ ID NO:10、14和17；或者
分别为SEQ ID NO:12、13和19。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分包含下列的LCDR1、LCDR2和LCDR3：
分别为SEQ ID NO:20、26和31；
分别为SEQ ID NO:21、26和32；
分别为SEQ ID NO:22、27和33；
分别为SEQ ID NO:22、26和34；
分别为SEQ ID NO:23、28和35；
分别为SEQ ID NO:20、26和36；
分别为SEQ ID NO:21、27和37；
分别为SEQ ID NO:23、26和32；
分别为SEQ ID NO:22、26和32；
分别为SEQ ID NO:24、26和38；
分别为SEQ ID NO:20、29和39；
分别为SEQ ID NO:20、30和32；
分别为SEQ ID NO:25、26和40；或者
分别为SEQ ID NO:24、26和32。
本发明还提供一种特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:10、14、17、23、26和32的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分以小于约100nM，任选地小于约10nM，例如小于约1nM(诸如小于约500pM)的平衡解离常数(KD)结合人PD-1，其中所述KD使用ProteOn XPR36系统在+25℃下进行测量。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分以小于约100nM，任选地小于约10nM，例如小于约1nM(诸如小于约500pM)的平衡解离常数(KD)结合食蟹猕猴PD-1，其中所述KD使用ProteOn XPR36系统在+25℃下进行测量。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:56的VL。
在一些实施方案中，VH和VL分别由SEQ ID NO:196和197的多核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时任选地包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG4/κ同种型，在相比于野生型IgG4时任选地包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:56的VL并且是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时任选地包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:56的VL并且是IgG4κ同种型，在相比于野生型IgG4时包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:72的重链(HC)和SEQ ID NO:73的轻链(LC)。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，在相比于野生型IgG2时任选地包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG2/κ同种型，在相比于野生型IgG2时任选地包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:56的VL并且为IgG2/κ同种型，在相比于野生型IgG2时任选地包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:56的VL并且为IgG2/κ同种型，在相比于野生型IgG2时包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体，诸如双特异性PD-1/TIM-3抗体。
该抗体适用于治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于治疗，例如治疗实体瘤。
该抗体适用于治疗，例如治疗黑色素瘤。
该抗体适用于治疗，例如治疗肺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗非小细胞肺癌(NSCLC)。
该抗体适用于治疗，例如治疗鳞状NSCLC。
该抗体适用于治疗，例如治疗非鳞状NSCLC。
该抗体适用于治疗，例如治疗肺腺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗肾细胞癌(RCC)。
该抗体适用于治疗，例如治疗间皮瘤。
该抗体适用于治疗，例如治疗鼻咽癌(NPC)。
该抗体适用于治疗，例如治疗结肠直肠癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗前列腺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗阉割抗性前列腺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗胃部癌症。
该抗体适用于治疗，例如治疗卵巢癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗胃癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗肝癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗胰腺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗甲状腺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗头颈部鳞状上皮细胞癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗食道癌或胃肠道癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗乳腺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗输卵管癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗脑癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗尿道癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗子宫内膜异位症。
该抗体适用于治疗，例如治疗宫颈癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗癌症的转移性病变。
该抗体适用于治疗，例如治疗血液恶性肿瘤。
该抗体适用于治疗，例如治疗非霍奇金淋巴瘤。
该抗体适用于治疗，例如治疗慢性淋巴细胞白血病。
该抗体适用于与特异性结合TIM-3的拮抗性抗体联合治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于与包含SEQ ID NO:146的VH和SEQ ID NO:156的VL的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体联合治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于与包含SEQ ID NO:145的VH和SEQ ID NO:155的VL的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体联合治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于与包含SEQ ID NO:172的VH和SEQ ID NO:173的VL的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体联合治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于与FGFR抑制剂联合治疗，例如治疗癌症，诸如实体瘤。
该抗体适用于与疫苗联合治疗，例如治疗癌症，诸如实体瘤。
该抗体适用于与特异性结合GITR(SEQ ID NO:271)的激动性抗体联合治疗，例如治疗癌症，诸如实体瘤。
该抗体适用于与特异性结合CD137(SEQ ID NO:281)的激动性抗体联合治疗，例如治疗癌症，诸如实体瘤。
该抗体适用于与特异性结合OX-40(SEQ ID NO:279)的激动性抗体联合治疗，例如治疗癌症，诸如实体瘤。
本发明还提供一种特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:66、67、68、69、70和71的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:64的VH和SEQ ID NO:65的VL。
在一些实施方案中，VH和VL分别由SEQ ID NO:198和199的多核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:63的VH和SEQ ID NO:65的VL。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分以小于约100nM，任选地小于约10nM，例如小于约1nM(诸如小于约100pM)的平衡解离常数(KD)结合人PD-1，其中所述KD使用ProteOn XPR36系统在+25℃下进行测量。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时任选地包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG4/κ同种型，在相比于野生型IgG4时任选地包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:64的VH和SEQ ID NO:65的VL并且是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时任选地包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:64的VH和SEQ ID NO:65的VL并且是IgG4κ同种型，在相比于野生型IgG4时包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:74的HC和SEQ ID NO:75的LC。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，在相比于野生型IgG2时任选地包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG2/κ同种型，在相比于野生型IgG2时任选地包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:64的VH和SEQ ID NO:65的VL并且为IgG2/κ同种型，在相比于野生型IgG2时任选地包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:64的VH和SEQ ID NO:65的VL并且为IgG2/κ同种型，在相比于野生型IgG2时包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体，诸如双特异性PD-1/TIM-3抗体。
该抗体适用于治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于治疗，例如治疗实体瘤。
该抗体适用于治疗，例如治疗黑色素瘤。
该抗体适用于治疗，例如治疗肺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗非小细胞肺癌(NSCLC)。
该抗体适用于治疗，例如治疗鳞状NSCLC。
该抗体适用于治疗，例如治疗非鳞状NSCLC。
该抗体适用于治疗，例如治疗肺腺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗肾细胞癌(RCC)。
该抗体适用于治疗，例如治疗间皮瘤。
该抗体适用于治疗，例如治疗鼻咽癌(NPC)。
该抗体适用于治疗，例如治疗结肠直肠癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗前列腺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗阉割抗性前列腺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗胃部癌症。
该抗体适用于治疗，例如治疗卵巢癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗胃癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗肝癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗胰腺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗甲状腺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗头颈部鳞状上皮细胞癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗食道癌或胃肠道癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗乳腺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗输卵管癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗脑癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗尿道癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗子宫内膜异位症。
该抗体适用于治疗，例如治疗宫颈癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗癌症的转移性病变。
该抗体适用于治疗，例如治疗血液恶性肿瘤。
该抗体适用于治疗，例如治疗非霍奇金淋巴瘤。
该抗体适用于治疗，例如治疗慢性淋巴细胞白血病。
该抗体适用于与特异性结合TIM-3的拮抗性抗体联合治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于与包含SEQ ID NO:146的VH和SEQ ID NO:156的VL的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体联合治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于与包含SEQ ID NO:145的VH和SEQ ID NO:155的VL的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体联合治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于与包含SEQ ID NO:172的VH和SEQ ID NO:173的VL的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体联合治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于与FGFR抑制剂联合治疗，例如治疗癌症，诸如实体瘤。
该抗体适用于与疫苗联合治疗，例如治疗癌症，诸如实体瘤。
该抗体适用于与特异性结合GITR(SEQ ID NO:271)的激动性抗体联合治疗，例如治疗癌症，诸如实体瘤。
该抗体适用于与特异性结合CD137(SEQ ID NO:281)的激动性抗体联合治疗，例如治疗癌症，诸如实体瘤。
该抗体适用于与特异性结合OX-40(SEQ ID NO:279)的激动性抗体联合治疗，例如治疗癌症，诸如实体瘤。
本发明还提供一种特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:12、13、19、24、26和38的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:47的VH和SEQ ID NO:58的VL。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，在相比于野生型IgG2时包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体，诸如双特异性PD-1/TIM-3抗体。
该抗体适用于治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于治疗，例如治疗实体瘤。
本发明还提供一种特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:11、15、18、20、30和32的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:60的VL。
在一些实施方案中，VH和VL分别由SEQ ID NO:202和203的多核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，在相比于野生型IgG2时包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:76的HC和SEQ ID NO:77的LC。
在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体，诸如双特异性PD-1/TIM-3抗体。
该抗体适用于治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于治疗，例如治疗实体瘤。
本发明还提供一种特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:10、13、16、20、26和31的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:41的VH和SEQ ID NO:49的VL。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，在相比于野生型IgG2时包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:212的HC和SEQ ID NO:213的LC。
在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体，诸如双特异性PD-1/TIM-3抗体。
该抗体适用于治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于治疗，例如治疗实体瘤。
本发明还提供一种特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:10、13、16、21、26和32的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:41的VH和SEQ ID NO:50的VL。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，在相比于野生型IgG2时包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:214的HC和SEQ ID NO:215的LC。
在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体，诸如双特异性PD-1/TIM-3抗体。
该抗体适用于治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于治疗，例如治疗实体瘤。
本发明还提供一种特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:10、14、16、22、27和33的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:42的VH和SEQ ID NO:51的VL。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，在相比于野生型IgG2时包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:216的HC和SEQ ID NO:217的LC。
在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体，诸如双特异性PD-1/TIM-3抗体。
该抗体适用于治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于治疗，例如治疗实体瘤。
本发明还提供一种特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:10、14、16、22、26和34的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:42的VH和SEQ ID NO:52的VL。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，在相比于野生型IgG2时包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:218的HC和SEQ ID NO:219的LC。
在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体，诸如双特异性PD-1/TIM-3抗体。
该抗体适用于治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于治疗，例如治疗实体瘤。
本发明还提供一种特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:10、14、16、23、28和35的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:42的VH和SEQ ID NO:53的VL。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，在相比于野生型IgG2时包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:220的HC和SEQ ID NO:221的LC。
在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体，诸如双特异性PD-1/TIM-3抗体。
该抗体适用于治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于治疗，例如治疗实体瘤。
本发明还提供一种特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:10、13、17、20、26和31的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:43的VH和SEQ ID NO:49的VL。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，在相比于野生型IgG2时包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体，诸如双特异性PD-1/TIM-3抗体。
该抗体适用于治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于治疗，例如治疗实体瘤。
本发明还提供一种特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:10、13、17、20、26和36的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:43的VH和SEQ ID NO:54的VL。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，在相比于野生型IgG2时包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:222的HC和SEQ ID NO:223的LC。
在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体，诸如双特异性PD-1/TIM-3抗体。
该抗体适用于治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于治疗，例如治疗实体瘤。
本发明还提供一种特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:10、13、17、21、26和32的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:43的VH和SEQ ID NO:50的VL。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，在相比于野生型IgG2时包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:224的HC和SEQ ID NO:225的LC。
在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体，诸如双特异性PD-1/TIM-3抗体。
该抗体适用于治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于治疗，例如治疗实体瘤。
本发明还提供一种特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:10、13、17、21、27和37的HCDR1、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:43的VH和SEQ ID NO:55的VL。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，在相比于野生型IgG2时包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:226的HC和SEQ ID NO:227的LC。
在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体，诸如双特异性PD-1/TIM-3抗体。
该抗体适用于治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于治疗，例如治疗实体瘤。
本发明还提供一种特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:10、13、17、23、26和32的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:43的VH和SEQ ID NO:56的VL。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，在相比于野生型IgG2时包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体，诸如双特异性PD-1/TIM-3抗体。
该抗体适用于治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于治疗，例如治疗实体瘤。
本发明还提供一种特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:10、13、17、22、26和32的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:43的VH和SEQ ID NO:57的VL。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，在相比于野生型IgG2时包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:228的HC和SEQ ID NO:229的LC。
在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体，诸如双特异性PD-1/TIM-3抗体。
该抗体适用于治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于治疗，例如治疗实体瘤。
本发明还提供一种特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:10、13、18、20、26和31的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:44的VH和SEQ ID NO:49的VL。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，在相比于野生型IgG2时包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体，诸如双特异性PD-1/TIM-3抗体。
该抗体适用于治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于治疗，例如治疗实体瘤。
本发明还提供一种特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:11、15、18、20、26和40的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:49的VL。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，在相比于野生型IgG2时包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体，诸如双特异性PD-1/TIM-3抗体。
该抗体适用于治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于治疗，例如治疗实体瘤。
本发明还提供一种特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:10、13、19、20、26和31的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:43的VH和SEQ ID NO:50的VL。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，在相比于野生型IgG2时包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体，诸如双特异性PD-1/TIM-3抗体。
该抗体适用于治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于治疗，例如治疗实体瘤。
本发明还提供一种特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:12、13、19、20、26和31的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:47的VH和SEQ ID NO:49的VL。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，在相比于野生型IgG2时包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体，诸如双特异性PD-1/TIM-3抗体。
该抗体适用于治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于治疗，例如治疗实体瘤。
本发明还提供一种特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:10、14、17、23、28和35的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:53的VL。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，在相比于野生型IgG2时包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体，诸如双特异性PD-1/TIM-3抗体。
该抗体适用于治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于治疗，例如治疗实体瘤。
本发明还提供一种特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:10、14、17、22、26和34的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:52的VL。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，在相比于野生型IgG2时包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体，诸如双特异性PD-1/TIM-3抗体。
该抗体适用于治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于治疗，例如治疗实体瘤。
本发明还提供一种特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:12、13、19、20、29和39的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:47的VH和SEQ ID NO:59的VL。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，在相比于野生型IgG2时包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体，诸如双特异性PD-1/TIM-3抗体。
该抗体适用于治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于治疗，例如治疗实体瘤。
本发明还提供一种特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:11、15、18、25、26和40的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:61的VL。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，在相比于野生型IgG2时包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体，诸如双特异性PD-1/TIM-3抗体。
该抗体适用于治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于治疗，例如治疗实体瘤。
本发明还提供一种特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:11、15、18、24、26和32的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:62的VL。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，在相比于野生型IgG2时包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体，诸如双特异性PD-1/TIM-3抗体。
该抗体适用于治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于治疗，例如治疗实体瘤。
本发明还提供一种特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含SEQ IDNO:41、42、43、44、45、46、47、48、63或64的VH。
本发明还提供一种特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含SEQ IDNO:49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或65的VL。
本发明还提供一种特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含SEQ IDNO:41、42、43、44、45、46、47、48、63或64的VH以及SEQ ID NO:49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或65的VL。
示例性的本发明特异性结合PD-1的拮抗性抗体的VH、VL、HCDR和LCDR序列示于表2中。
尽管实施例中所示的实施方案包括成对的可变区，一个来自重链并且一个来自轻链，但本领域技术人员将认识到另选实施方案可包括单一重链可变区或单一轻链可变区。单一可变区可用于筛选能够形成能够例如结合人PD-1的二域特异性抗原结合片段的可变域。筛选可通过噬菌体展示筛选方法来完成，其中使用例如在国际专利公布WO1992/01047中所公开的分级双组合方法。在此方法中，包含VH或VL链克隆的单个菌落被用来感染编码另一链(VL或VH)的克隆的完全文库，并且所得的双链特异性抗原结合域根据噬菌体展示技术使用已知方法和本文所述的那些来选择。因此，单独的VH和VL多肽链可用于通过国际专利公布WO1992/01047所公开的方法鉴定特异性结合人PD-1的附加抗体。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的拮抗性抗体是多特异性抗体。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的拮抗性抗体是双特异性抗体。
在一些实施方案中，特异性结合PD-1的拮抗性双特异性抗体结合PD-L1(SEQ IDNO:5)、PD-L2(SEQ ID NO:8)、LAG-3(SEQ ID NO:293)、TIM-3(SEQ ID NO:138)、CEACAM-1(SEQ ID NO:296)、CEACAM-5(SEQ ID NO:307)、OX-40(SEQ ID NO:279)、GITR(SEQ ID NO:271)、CD27(SEQ ID NO:280)、VISTA(SEQ ID NO:286)、CD137(SEQ ID NO:281)、TIGIT(SEQID NO:301)或CTLA-4(SEQ ID NO:292)。双特异性和多特异性抗体可使用本文所述的方法产生。
表2：
Figure BDA0001717945540000431
Figure BDA0001717945540000441
同源抗体
包含表2、表21和表22所示VH、VL、或VH与VL氨基酸序列的本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分的变体在本发明的范围之内。例如，变体可在VH和/或VL中包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换，只要同源抗体在相比于亲本抗体时保持或具有改善的功能特性即可。在一些实施方案中，对本发明的VH或VL氨基酸序列的序列同一性可为约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。任选地，变体相比于亲本抗体的任何变化不在变体的CDR之内。
本发明还提供特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含SEQ ID NO:41、42、43、44、45、46、47、48、63或64的VH，所述VH任选地具有一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。任选地，任何置换不在CDR之内。
本发明还提供特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含SEQ ID NO:49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或65的VL，所述VL任选地具有一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。任选地，任何置换不在CDR之内。
本发明还提供特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:56的VL，其中所述VH、VL、或VH与VL两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。任选地，任何置换不在CDR之内。
本发明还提供特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含SEQ ID NO:64的VH和SEQ ID NO:65的VL，其中所述VH、VL、或VH与VL两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。任选地，任何置换不在CDR之内。
本发明还提供一种特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含：
SEQ ID NO:41的VH和SEQ ID NO:49的VL；
SEQ ID NO:41的VH和SEQ ID NO:50的VL；
SEQ ID NO:42的VH和SEQ ID NO:51的VL；
SEQ ID NO:42的VH和SEQ ID NO:52的VL；
SEQ ID NO:42的VH和SEQ ID NO:53的VL；
SEQ ID NO:43的VH和SEQ ID NO:49的VL；
SEQ ID NO:43的VH和SEQ ID NO:54的VL；
SEQ ID NO:43的VH和SEQ ID NO:50的VL；
SEQ ID NO:43的VH和SEQ ID NO:55的VL；
SEQ ID NO:43的VH和SEQ ID NO:56的VL；
SEQ ID NO:43的VH和SEQ ID NO:57的VL；
SEQ ID NO:44的VH和SEQ ID NO:49的VL；
SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:49的VL；
SEQ ID NO:46的VH和SEQ ID NO:49的VL；
SEQ ID NO:47的VH和SEQ ID NO:49的VL；
SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:53的VL；
SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:52的VL；
SEQ ID NO:47的VH和SEQ ID NO:58的VL；
SEQ ID NO:47的VH和SEQ ID NO:59的VL；
SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:60的VL；
SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:61的VL；
SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:62的VL；或者
SEQ ID NO:63的VH和SEQ ID NO:65的VL，其中所述VH、VL、或VH与VL两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。任选地，任何置换不在CDR之内。
本发明还提供特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含氨基酸序列与SEQ ID NO:41、42、43、44、45、46、47、48、64或65的VH有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH。任选地，SEQ ID NO的序列的任何变化不在CDR之内。
本发明还提供特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含氨基酸序列与SEQ ID NO:49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或65的VL有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL。任选地，SEQ ID NO的序列的任何变化不在CDR之内。
本发明还提供特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含氨基酸序列与SEQ ID NO:41、42、43、44、45、46、47、48、63或64的VH有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH，以及氨基酸序列与SEQ ID NO:49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或65的VL有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL。任选地，SEQ ID NO的序列的任何变化不在CDR之内。
本发明还提供特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含氨基酸序列与SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:56的VL有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH和VL。任选地，SEQ ID NO的序列的任何变化不在CDR之内。
本发明还提供特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含氨基酸序列与SEQ ID NO:64的VH和SEQ ID NO:65的VL有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH和VL。任选地，SEQ ID NO的序列的任何变化不在CDR之内。
本发明还提供特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含氨基酸序列与下列的VH和VL有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH和VL：
分别为SEQ ID NO:41和49；
分别为SEQ ID NO:41和50；
分别为SEQ ID NO:42和51；
分别为SEQ ID NO:42和52；
分别为SEQ ID NO:42和53；
分别为SEQ ID NO:43和49；
分别为SEQ ID NO:43和54；
分别为SEQ ID NO:43和50；
分别为SEQ ID NO:43和55；
分别为SEQ ID NO:43和56；
分别为SEQ ID NO:43和57；
分别为SEQ ID NO:44和49；
分别为SEQ ID NO:45和49；
分别为SEQ ID NO:46和49；
分别为SEQ ID NO:47和49；
分别为SEQ ID NO:48和53；
分别为SEQ ID NO:48和52；
分别为SEQ ID NO:47和58；
分别为SEQ ID NO:47和59；
分别为SEQ ID NO:45和60；
分别为SEQ ID NO:45和61；
分别为SEQ ID NO:45和62；或者
分别为SEQ ID NO:63和65。任选地，SEQ ID NO的序列的任何变化不在CDR之内。
本发明的特异性结合PD-1的同源拮抗性抗体或其抗原结合部分具有以下特性中的一个、两个、三个、四个或五个：
a)以剂量依赖性方式增强抗原特异性CD4+或CD8+T细胞活化，其中所述活化使用如实施例1中所述的细胞巨化病毒抗原回忆测定(CMV测定)进行测量；
b)以小于约100nM的平衡解离常数(KD)结合人PD-1，其中所述KD使用ProteOnXPR36系统在+25℃下进行测量；
c)以小于约1nM的KD结合人PD-1，其中所述KD使用ProteOn XPR36系统在+25℃下进行测量；
d)以小于约100nM的KD结合SEQ ID NO:3的猕猴PD-1，其中所述KD使用ProteOnXPR36系统在+25℃下进行测量；
e)以小于约1nM的KD结合SEQ ID NO:3的猕猴PD-1，
其中所述KD使用ProteOn XPR36系统在+25℃下进行测量。
在一些实施方案中，抗体以剂量依赖性方式增强抗原特异性CD4+或CD8+T细胞活化，其中所述活化使用如实施例1中所述的细胞巨化病毒抗原回忆测定(CMV测定)进行测量；并且以小于约100nM的平衡解离常数(KD)结合人PD-1，其中所述KD使用ProteOn XPR36系统在+25℃下进行测量。
在一些实施方案中，抗体以剂量依赖性方式增强抗原特异性CD4+或CD8+T细胞活化，其中所述活化使用如实施例1中所述的细胞巨化病毒抗原回忆测定(CMV测定)进行测量；并且以小于约10nM的平衡解离常数(KD)结合人PD-1，其中所述KD使用ProteOn XPR36系统在+25℃下进行测量。
两个序列之间的百分比同一性是序列所共有的相同位置数目的函数(即，同一性％＝相同位置的数目/位置总数×100)，考虑到空位的数目和每个空位的长度，需要引入这些参数用于两个序列的最佳比对。
两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以采用E.Meyers和W.Miller(ComputAppl Biosci 4:11-17(1988))的算法(该算法已经并入ALIGN程序(版本2.0)中)，使用PAM120加权残基表、空位长度罚分12和空位罚分4来确定。此外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用Needleman和Wunsch(J Mol Biol 48:444-453(1970))的算法(该算法已并入GCG软件包(可在http://_www_gcg_com获得)的GAP程序中)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵、以及16、14、12、10、8、6、或4的缺口权重和1、2、3、4、5、或6的长度权重来确定。
具有保守修饰的抗体
本发明还提供包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH和含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL的特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，其中一种或多种CDR序列包含基于本文所述抗体(例如表2、表21和表22所示抗体)的特定氨基酸序列或它们的保守修饰，并且其中所述抗体保留了本发明的特异性结合PD-1的亲本拮抗性抗体的期望功能特性。
具有保守修饰的抗体具有以下特性中的一个、两个、三个、四个或五个：
a)以剂量依赖性方式增强抗原特异性CD4+或CD8+T细胞活化，其中所述活化使用如实施例1中所述的细胞巨化病毒抗原回忆测定(CMV测定)进行测量；
b)以小于约100nM的平衡解离常数(KD)结合人PD-1，其中所述KD使用ProteOnXPR36系统在+25℃下进行测量；
c)以小于约1nM的KD结合人PD-1，其中所述KD使用ProteOn XPR36系统在+25℃下进行测量；
d)以小于约100nM的KD结合SEQ ID NO:3的猕猴PD-1，其中所述KD使用ProteOnXPR36系统在+25℃下进行测量；
e)以小于约1nM的KD结合SEQ ID NO:3的猕猴PD-1，
其中所述KD使用ProteOn XPR36系统在+25℃下进行测量。
在一些实施方案中，抗体以剂量依赖性方式增强抗原特异性CD4+或CD8+T细胞活化，其中所述活化使用如实施例1中所述的细胞巨化病毒抗原回忆测定(CMV测定)进行测量；并且以小于约100nM的平衡解离常数(KD)结合人PD-1，其中所述KD使用ProteOn XPR36系统在+25℃下进行测量。
在一些实施方案中，抗体以剂量依赖性方式增强抗原特异性CD4+或CD8+T细胞活化，其中所述活化使用如实施例1中所述的细胞巨化病毒抗原回忆测定(CMV测定)进行测量；并且以小于约10nM的平衡解离常数(KD)结合人PD-1，其中所述KD使用ProteOn XPR36系统在+25℃下进行测量。
本发明还提供一种特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:10、14、17、23、26和32以及它们的保守修饰的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本发明还提供一种特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:66、67、68、69、70和71以及它们的保守修饰的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本发明还提供一种特异性结合PD-1的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含下列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：
分别为SEQ ID NO:10、13、16、20、26和31；
分别为SEQ ID NO:10、13、16、21、26和32；
分别为SEQ ID NO:10、14、16、22、27和33；
分别为SEQ ID NO:10、14、16、22、26和34；
分别为SEQ ID NO:10、14、16、23、28和35；
分别为SEQ ID NO:10、13、17、20、26和31；
分别为SEQ ID NO:10、13、17、20、26和36；
分别为SEQ ID NO:10、13、17、21、26和32；
分别为SEQ ID NO:10、13、17、21、27和37；
分别为SEQ ID NO:10、13、17、23、26和32；
分别为SEQ ID NO:10、13、17、22、26和32；
分别为SEQ ID NO:10、13、18、20、26和31；
分别为SEQ ID NO:11、15、18、20、26和31；
分别为SEQ ID NO:10、13、19、20、26和31；
分别为SEQ ID NO:12、13、19、20、26和31；
分别为SEQ ID NO:10、14、17、23、28和35；
分别为SEQ ID NO:10、14、17、22、26和34；
分别为SEQ ID NO:12、13、19、24、26和38；
分别为SEQ ID NO:12、13、19、20、29和39；
分别为SEQ ID NO:11、15、18、20、30和32；
分别为SEQ ID NO:11、15、18、25、26和40；
分别为SEQ ID NO:11、15、18、24、26和32，以及它们的保守修饰。
“保守修饰”是指不会显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。保守修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。保守置换是其中氨基酸被具有相似侧链的氨基酸残基替换的置换。具有相似侧链的氨基酸残基家族是明确定义的，包括具有如下侧链的氨基酸：酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸)、芳香族侧链(例如，苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸)、脂肪族侧链(例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸)、酰胺(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及含硫侧链(半胱氨酸、甲硫氨酸)。此外，多肽中的任何天然残基还可以用丙氨酸来置换，如此前对于丙氨酸扫描诱变所述(MacLennan等人，Acta Physiol.Scand.Suppl.643:55-67，1998；Sasaki等人，Adv.Biophys.35:1-24，1998)。对本发明的抗体的氨基酸置换可通过公知的方法进行，例如通过PCR诱变(美国专利4,683,195)进行。另选地，可使用已知的方法，例如使用随机(NNK)或非随机密码子(例如DVK密码子，其编码11个氨基酸(Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、Lys、Asn、Arg、Ser、Tyr、Trp))产生变体文库。可使用本文所述的测定法来测试所得抗体变体的特征。
特异性结合TIM-3的拮抗性抗体
T-细胞免疫球蛋白域和粘蛋白域3(TIM-3，也称为甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2))是一种被提出负调节适应性及先天性免疫应答两者的共抑制免疫检查点受体。TIM-3表达于特异性CD4+和CD8+T细胞亚型，并且用于限制T细胞应答的持续时间和强度。
多条证据支持TIM-3在调节T细胞应答中的抑制作用。Tim-3-缺陷型小鼠表现出诱导抗原特异性和移植耐受性的缺陷，与在正常免疫应答期间TIM-3抑制效应子T细胞相一致(Sabatos等人，(2003)Nat Immunol4(11):1102-1110，Sanchez-Fueyo等人，(2003)NatImmunol 4(11):1093-1101)。抗-TIM-3抗体加剧了动物模型中的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)(Monney等人，(2002)Nature 415(6871):536-541)。TIM-3已被示出是慢性感染和癌症中发生的机能失调或衰竭T细胞态的关键驱动物(Sakuishi,K.和A.C.Anderson(2014).Tim-3Regulation of Cancer Immunity.Tumor-Induced ImmuneSuppression.D.I.Gabrilovich和A.A.Hurwitz,Springer New York:239-261)。
TIM-3的阻断已示出恢复效应细胞的活性，诸如细胞因子分泌和增殖。在经病毒衰竭的细胞群中(例如被HCV感染的细胞)，相比于TIM-3阴性细胞，表达TIM-3的细胞(TIM-3+细胞)在两种效应细胞群即CD4+和CD8+T细胞中表达较少的TNF-α和IFN-γ细胞因子(Golden-Mason等人，(2009)J Virol 83:9122)。TIM-3的阻断恢复了来自HIV患者的CD8+T细胞，或使病毒衰竭重现(Jones等人，(2008)J Exp Med 205:2763)的细胞的增殖，或者来自转移性患者PBMC的NY-ESO-1特异性T细胞的增殖和IFN-γ和/或TNF-α分泌(Fourcade等人，(2010)J Exp Med 207:2175)。已发现TIM-3+T细胞在肿瘤中浓缩，并且对免疫抑制肿瘤环境作出贡献(Sakuishi等人，(2013)Oncoimmunology,2:e23849)。
TIM-3的阻断(部分单独地以及与PD-1途径阻断加合或协同地组合)已在若干临床前癌症模型中示出抗-肿瘤功效，包括CT26结肠癌(Sakuishi等人，(2010)J Exp Med 207(10):2187-94)、WT3肉瘤和TRAMP-C1前列腺癌(Ngiow等人，(2011)Cancer Res 71(10):3540-3551)。
TIM-3经由其抑制T细胞应答的机制尚未充分理解。TIM-3的胞质尾部包含多个酪氨酸残基(Ferris等人，(2014)J Immunol 193(4):1525-1530)，但缺乏抑制性信号基序，例如存在于PD-1胞内尾部的ITIM或ITSM。Src家族酪氨酸激酶Fyn和Lck已示出结合TIM-3，但这些相互作用的确切结果仍要在体内得到证实。就TIM-3如何调节T细胞信号转导而言，已提出两种相对模型。一方面，假定TIM-3通过使磷酸酶募集于免疫突触和使Lck去磷酸化来负调节TCR信号转导(Clayton等人，(2014)J Immunol 192(2):782-791)。相比之下，还提出TIM-3通过提高NFAT活性的活化和NFκB信号转导，增强TCR信号转导并反常地驱动T细胞向更衰竭的状态。
除在效应T细胞上表达之外，TIM-3还表达于调节性T细胞(T-reg)，并且已示出标记肿瘤中抑制性T-reg亚群。使用原代人细胞和小鼠临床前模型两者的分析示出，TIM-3+T-reg比TIM-3-T-reg更有效地抑制辅助T细胞1(Th1)和辅助T细胞17(Th17)的T细胞应答(Gautron等人，(2014)Eur J Immunol 44(9):2703-2711；Sakuishi等人，(2013)Oncoimmunology,2:e23849)。因为TIM-3表达于高度抑制性Treg上，其可直接抑制CD4+和CD8+T细胞应答。此外，TIM-3+Treg表达高水平的IL-10，其已被提出在TME中作为抑制抗-肿瘤免疫应答的附加间接机制来驱动效应T细胞衰竭(Sakuishi等人，(2013)Oncoimmunology,2:e23849)。
TIM-3表达于几种先天性免疫细胞类型，包括单核细胞/巨噬细胞、树突状细胞和NK细胞。现有数据与TIM-3在这些不同细胞类型中的抑制作用相一致。
TIM-3由健康供体中的循环CD14+单核细胞组成性地表达，并且其在外周血单核细胞上的表达在患有慢性炎症和癌症的患者中显著提高(Rong等人，(2014)Tissue Antigens83(2):76-81)。相比于来自邻近组织的巨噬细胞，TIM-3水平也在浸润肝细胞癌(HCC)肿瘤的巨噬细胞上有所上调，并且被提出在驱动巨噬细胞极化为M2肿瘤-促进表型中发挥作用。
最近，TIM-3被报道表达于浸润小鼠肿瘤的树突状细胞上。在这种情况中，已提出TIM-3与HMBG1的相互作用通过干扰对免疫刺激性核酸的识别和响应来抑制先天性免疫(Chiba等人，(2012)Immunol 13(9):832-842)。TIM-3还组成性地表达于外周血的NK细胞上。最近研究显示，晚期黑色素瘤患者的NK细胞在外周NK细胞上表达高水平的TIM-3。重要地，TIM-3+NK细胞在功能上衰竭并且抗-TIM-3阻断能够逆转该衰竭并增强NK细胞功能(daSilva等人，(2014)Cancer Immunol Res 2(5):410-422)。
TIM-3结合配体半乳糖凝集素-9(Gal-9)、磷脂酰丝氨酸(PtdSer)、HMGB1和CEACAM-1。S-型凝集素半乳糖凝集素-9可抑制TIM-3-相关的Th1效应子功能，并且诱导小鼠模型中表达TIM-3的T细胞凋亡。PtdSer通常位于质膜的细胞内侧，但在细胞凋亡期间翻转于细胞外侧。PtdSer结合所有人TIM家族成员(TIM-1，3，4)中的保留V形凹陷(preservedcleft)。抑制PtdSer与TIM-3的结合可激活T-细胞应答。半乳糖凝集素-9由肿瘤细胞分泌并且可有助于免受抗-肿瘤免疫。TIM-3可充当“槽(sink)”的DNA警报素HMGB1能够抑制刺激先天性免疫的HMGB1/RAGE相互作用。CEACAM-1可在T细胞上以顺式作为异源二聚体和以反式作为配体与TIM-3相互作用。CEACAM-1与TIM-3之间的相互作用可有助于介导阻断免疫应答信号转导。TIM-3与CEACAM-1在CT26结肠癌中的共阻断示出与所见于PD-L1与TIM-3的共阻断类似的功效。
因此，使用抑制TIM-3功能的本文所述的本发明抗体阻断TIM-3可改善针对感染和抗肿瘤免疫的免疫应答。
本发明还提供特异性结合TIM-3的分离的拮抗性抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体抑制TIM-3与半乳糖凝集素-9结合。
本发明的抗体对TIM-3与半乳糖凝集素-9结合的抑制可用竞争性ELISA进行评估。在示例性测定中，使1μg/ml重组人Fc-TIM-3结合于微量滴定板的孔，将孔洗涤并封闭，并且添加10μg/ml的测试抗体。在不洗涤情况下，将7.5μg/ml半乳糖凝集素-9添加到孔中并温育30min，然后添加0.5μg/ml抗-半乳糖凝集素-9-生物素抗体并温育30min。洗涤板并添加0.5μg/mL中和亲和素-HRP缀合物多克隆抗体并温育30分钟。在临读取发光信号之前，洗涤板并添加POD化学发光底物。使用本文和实施例1中所述的测定，当半乳糖凝集素-9的结合降低至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％时，本发明的抗体抑制TIM-3与半乳糖凝集素-9结合。抑制TIM-3与半乳糖凝集素-9结合的示例性抗体是抗体TM3B103、TM3B105、TM3B107、TM3B108、TM3B109、TM3B113、TM3B189、TM3B190和TM3B196。
在一些实施方案中，特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分增强抗原特异性CD4+或CD8+T细胞的活化。
在一些实施方案中，特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分增强抗原特异性CD4+或CD8+T细胞的活化，其中根据实施例14所述的方法，通过测量抗原特异性CD4+或CD8+T细胞上CD137表面表达的统计意义上的显著增强来评估抗原特异性CD4+或CD8+T细胞的活化。
响应于CMV抗原刺激而扩增的用作抗原特异性CD8+和CD4+T细胞标记的CD137允许检测本发明拮抗性TIM-3抗体的功能效应。
在一些实施方案中，特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分在TIM-3残基32-47(WGKGACPVFECGNVVL)(SEQ ID NO:261)之内结合TIM-3。
在一些实施方案中，特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分在TIM-3残基32-47(WGKGACPVFECGNVVL)(SEQ ID NO:261)和残基50-56(DERDVNY)(SEQ ID NO:262)之内结合TIM-3。
在一些实施方案中，特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分在TIM-3残基90-102(RIQIPGIMNDEKF)(SEQ ID NO:263)之内结合TIM-3。
在一些实施方案中，特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分在TIM-3残基90-102(RIQIPGIMNDEKF)(SEQ ID NO:263)和残基50-56(DERDVNY)(SEQ ID NO:262)之内结合TIM-3。
“在...之内”意指该抗体结合的80％或更多的表位残基位于所述氨基酸段之内，并且该抗体结合的多至20％的表位残基位于所述氨基酸段之外。
抗体结合的Tim-3表位可例如使用氢/氘化交换(H/D交换)或通过分析与TIM-3复合的抗体的晶体结构来解析。表位残基是经过H/D交换氘化水平差异为至少5％的受抗体保护的那些，或者在抗体与TIM-3的复合物的晶体结构中被测定结合抗体的那些表面暴露的氨基酸残基。在抗体与TIM-3的复合物的晶体结构中，表位残基是位于距任何抗体CDR残基
Figure BDA0001717945540000551
距离之内或更小的那些TIM-3残基。
在H/D交换测定中，将TIM-3蛋白在存在或不存在抗体情况下于氘化水中温育预定时间，从而导致氘在不受抗体保护的可交换氢原子处引入，之后使蛋白酶消化蛋白质并使用LC-MS分析肽片段。在一个示例性测定中，将5μL的测试抗体(10μg)或5μL的TIM-3与测试抗体的复合物(分别10μg和7.35μg)用120μL氧化氘标记缓冲液(50mM磷酸盐、100mM氯化钠，pH 7.4)温育0秒、60秒、300秒、1800秒、7200秒和14400秒。通过添加63μL的5M盐酸胍对氘交换进行淬火，并且最终pH为2.5。使淬灭的样本经受柱上胃蛋白酶/蛋白酶XIII型消化和LC-MS分析。对于胃蛋白酶/蛋白酶XIII型消化，通过加入63μL的5M盐酸胍(最终pH为2.5)使含5μg样本的125μL对照缓冲液(50mM磷酸盐、100mM氯化钠，pH 7.4)变性并温育混合物3分钟。然后，使混合物经受柱上胃蛋白酶/蛋白酶XIII型消化并且用UPLC-MS系统分析所得的肽，该系统由连接于Q ExactiveTM混合四极-轨道陷阱质谱议(Thermo)的Waters Acquity UPLC组成。用HDX WorkBench软件处理原始MS数据，以分析H/D交换MS数据。使用氘化肽与其天然形式(t0)之间的平均质量差来计算氘水平。通过采用Mascot，针对TIM-3搜索MS/MS数据进行肽鉴定。前体和产物离子的质量容差分别为20ppm和0.05Da。
对于X射线结晶学，使用标准规程对TIM-3和测试抗体进行表达和纯化。将TIM-3/测试抗体复合物在4℃下温育过夜，浓缩，并采用尺寸排阻色谱法从未复合的物类中分离。通过蒸气扩散法从各种已知的测试溶液，例如包含PEG3350、柠檬酸铵和2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)的溶液中结晶该复合物。
在Tim-3残基32-47(WGKGACPVFECGNVVL)(SEQ ID NO:261)、90-102(RIQIPGIMNDEKF)(SEQ ID NO:263)和/或50-56(DERDVNY)(SEQ ID NO:262)之内结合的抗体可如下产生：利用噬菌体展示文库分离出结合TIM-3的抗体，选择与参考抗体TM3B105(SEQ ID NO:146的VH和SEQ ID NO:156的VL)或TM3B291(SEQ ID NO:172的VH和SEQ ID NO:173的VL)100％竞争结合TIM-3的那些抗体，并且通过解析抗体/TIM-3复合物的晶体结构来确认所产生抗体的表位。另选地，可使用包含TIM-3的残基32-47、90-102和/或50-56的肽对小鼠、大鼠或兔子进行免疫，并且可对所产生抗体在所述区域内的结合进行评价。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:164、165和166的重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:167、168和169的轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:164、165和166的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及分别为SEQ ID NO:167、168和169的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
SEQ ID NO:164、165、166、167、168和169表示来源于噬菌体展示文库的TIM-3拮抗剂的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3属序列。属序列基于产生图13、图14、图15、图16、图17和图18所给出和本文所汇总的序列比对的结构模型而生成。
SEQ ID NO:164
X17YX18MX19，
其中
X17为N、S、G或D；
X18为W或A；并且
X19为S或H。
SEQ ID NO:165
X20IX21X22SGGSX23YYADSVKG，
其中
X20为A或V；
X21为S或K；
X22为G或Y；并且
X23为T或K。
SEQ ID NO:166
X24X25X26X27X28X29X30X31DY，
其中
X24为D、S、N、G或E；
X25为H、P、E、T或L；
X26为W、E、N或缺失；
X27为D、P或缺失；
X28为P、Y、D或缺失；
X29为N、A、D、G或缺失；
X30为F、P、R、W或V；并且
X31为L或F。
SEQ ID NO:167
X32X33SQSVX34X35X36X37X38X39X40X41X42LA，
其中
X32为R或K；
X33为A或S；
X34为S、N或L；
X35为S、A、N或缺失；
X36为S或缺失；
X37为S或缺失；
X38为N或缺失；
X39为N或缺失；
X40为K或缺失；
X41为S、D或N；并且
X42为Y或T。
SEQ ID NO:168
X43ASX44RX45X46，
其中
X43为G、D、W或T；
X44为S、N或T；
X45为A或E；并且
X46为T或S。
SEQ ID NO:169
QQX47X48X49X50PX51T(SEQ ID NO:169)，
其中
X47为Y、G或S；
X48为G或Y；
X49为S、H或T；
X50为S、A或T；并且
X51为L、I或W。
本发明提供了一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含SEQID NO:145、146、147、148或149的重链可变区(VH)内所含的HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3由Chothia、Kabat或IMGT定义。
本发明提供了一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含SEQID NO:155、156、157或158的轻链可变区(VL)内所含的LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述LCDR1、LCDR2和LCDR3由Chothia、Kabat或IMGT定义。
在一些实施方案中，特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分包含：
SEQ ID NO:90、91、92或93的HCDR1；
SEQ ID NO:99、100或101的HCDR2；以及
SEQ ID NO:107、108、109、110或111的HCDR3。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分包含：
SEQ ID NO:117、118、119或120的LCDR1；
SEQ ID NO:126、127、128或129的LCDR2；以及
SEQ ID NO:135、136、137或139的LCDR3。
在一些实施方案中，特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分包含：
SEQ ID NO:90、91、92或93的HCDR1；
SEQ ID NO:99、100或101的HCDR2；
SEQ ID NO:107、108、109、110或111的HCDR3；
SEQ ID NO:117、118、119或120的LCDR1；
SEQ ID NO:126、127、128或129的LCDR2；或者
SEQ ID NO:135、136、137或139的LCDR3。
在一些实施方案中，特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分包含下列的HCDR1、HCDR2和HCDR3：
分别为SEQ ID NO:90、99和107；
分别为SEQ ID NO:91、99和108；
分别为SEQ ID NO:91、99和109；
分别为SEQ ID NO:92、100和110；或者
分别为SEQ ID NO:93、101和111。
在一些实施方案中，特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分包含下列的LCDR1、LCDR2和LCDR3：
分别为SEQ ID NO:117、126和135；
分别为SEQ ID NO:118、127和136；
分别为SEQ ID NO:119、128和137；或者
SEQ ID NO:120、129和139。
在一些实施方案中，特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分包含下列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：
分别为SEQ ID NO:90、99、107、117、126和135；
分别为SEQ ID NO:91、99、108、118、127和136；
分别为SEQ ID NO:91、99、109、119、128和137；
分别为SEQ ID NO:92、100、110、117、126和135；或者
分别为SEQ ID NO:93、101、111、120、129和139。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的分离的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:164、165和108的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及分别为SEQ ID NO:118、168和169的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:91、99、108、118、127和136的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，特异性结合TIM-3的抗体或其抗原结合部分在TIM-3残基32-47(WGKGACPVFECGNVVL)(SEQ ID NO:261)之内结合TIM-3。
在一些实施方案中，特异性结合TIM-3的抗体或其抗原结合部分在TIM-3残基32-47(WGKGACPVFECGNVVL)(SEQ ID NO:261)和残基50-56(DERDVNY)(SEQ ID NO:262)之内结合TIM-3。
在一些实施方案中，特异性结合TIM-3的抗体或其抗原结合部分抑制TIM-3与半乳糖凝集素-9结合。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含来源于IGHV3-23(SEQ ID NO:174)的重链框架和来源于IGKV3-11(SEQ ID NO:171)的轻链框架。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:146的VH和SEQ IDNO:156的VL。
在一些实施方案中，VH和VL分别由SEQ ID NO:204和205的多核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分增强抗原特异性CD4+或CD8+T细胞的活化，其中根据实施例14所述的方法，通过测量抗原特异性CD4+或CD8+T细胞上CD137表面表达的统计意义上的显著增强来评估抗原特异性CD4+或CD8+T细胞的活化。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时任选地包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG4/κ同种型，在相比于野生型IgG4时任选地包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:146的VH和SEQ ID NO:156的VL并且是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时任选地包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:146的VH和SEQ ID NO:156的VL并且是IgG4κ同种型，在相比于野生型IgG4时包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，在相比于野生型IgG2时任选地包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG2/κ同种型，在相比于野生型IgG2时任选地包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:146的VH和SEQ ID NO:156的VL并且为IgG2/κ同种型，在相比于野生型IgG2时任选地包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:146的VH和SEQ ID NO:156的VL并且为IgG2/κ同种型，在相比于野生型IgG2时包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:78的HC和SEQ ID NO:79的LC。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:240的HC和SEQ ID NO:79的LC。
SEQ ID NO:78
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPYAPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:79
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVNDYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQGGHAPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:240
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPYAPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体，诸如双特异性PD-1/TIM-3抗体。
该抗体适用于治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于治疗，例如治疗实体瘤。
该抗体适用于治疗，例如治疗黑色素瘤。
该抗体适用于治疗，例如治疗肺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗非小细胞肺癌(NSCLC)。
该抗体适用于治疗，例如治疗鳞状NSCLC。
该抗体适用于治疗，例如治疗非鳞状NSCLC。
该抗体适用于治疗，例如治疗肺腺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗肾细胞癌(RCC)。
该抗体适用于治疗，例如治疗间皮瘤。
该抗体适用于治疗，例如治疗鼻咽癌(NPC)。
该抗体适用于治疗，例如治疗结肠直肠癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗前列腺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗阉割抗性前列腺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗胃部癌症。
该抗体适用于治疗，例如治疗卵巢癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗胃癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗肝癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗胰腺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗甲状腺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗头颈部鳞状上皮细胞癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗食道癌或胃肠道癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗乳腺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗输卵管癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗脑癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗尿道癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗子宫内膜异位症。
该抗体适用于治疗，例如治疗宫颈癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗癌症的转移性病变。
该抗体适用于与特异性结合PD-1的拮抗性抗体联合治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于与包含SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:56的VL的特异性结合PD-1的拮抗性抗体联合治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于与包含SEQ ID NO:47的VH和SEQ ID NO:58的VL的特异性结合PD-1的拮抗性抗体联合治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于与包含SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:60的VL的特异性结合PD-1的拮抗性抗体联合治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于与包含SEQ ID NO:64的VH和SEQ ID NO:65的VL的特异性结合PD-1的拮抗性抗体联合治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于与特异性结合TIGIT(SEQ ID NO:301)的拮抗性抗体联合治疗，例如治疗癌症，诸如实体瘤。
该抗体适用于与FGFR抑制剂联合治疗，例如治疗癌症，诸如实体瘤。
该抗体适用于与疫苗联合治疗，例如治疗癌症，诸如实体瘤。
该抗体适用于与特异性结合GITR(SEQ ID NO:271)的激动性抗体联合治疗，例如治疗癌症，诸如实体瘤。
该抗体适用于与特异性结合CD137(SEQ ID NO:281)的激动性抗体联合治疗，例如治疗癌症，诸如实体瘤。
该抗体适用于与特异性结合OX-40(SEQ ID NO:279)的激动性抗体联合治疗，例如治疗癌症，诸如实体瘤。
该抗体适用于治疗正在用包含SEQ ID NO:230的VH和SEQ ID NO:231的VL的特异性结合PD-1的拮抗性抗体治疗或已经用其治疗过的受试者。(例如
Figure BDA0001717945540000641
(派姆单抗))。
该抗体适用于治疗正在用包含SEQ ID NO:232的VH和SEQ ID NO:233的VL的特异性结合PD-1的拮抗性抗体治疗或已经用其治疗过的受试者。(例如
Figure BDA0001717945540000651
(纳武单抗))。
该抗体适用于治疗难以用包含SEQ ID NO:230的VH和SEQ ID NO:231的VL的特异性结合PD-1的拮抗性抗体治疗的受试者。(例如
Figure BDA0001717945540000652
(派姆单抗))。
该抗体适用于治疗难以用包含SEQ ID NO:232的VH和SEQ ID NO:233的VL的特异性结合PD-1的拮抗性抗体治疗的受试者。(例如
Figure BDA0001717945540000653
(纳武单抗))
该抗体适用于治疗在用包含SEQ ID NO:230的VH和SEQ ID NO:231的VL的特异性结合PD-1的拮抗性抗体治疗后肿瘤复发的受试者。(例如
Figure BDA0001717945540000654
(派姆单抗))。
该抗体适用于治疗在用包含SEQ ID NO:232的VH和SEQ ID NO:233的VL的特异性结合PD-1的拮抗性抗体治疗后肿瘤复发的受试者。(例如
Figure BDA0001717945540000655
(纳武单抗))。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:97、105、115、124、133和143的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含来源于IGHV5-51(SEQ ID NO:179)的重链框架和来源于IGKV1-39(SEQ ID NO:182)的轻链框架。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:172的VH和SEQ ID NO:173的VL。
在一些实施方案中，VH和VL分别由SEQ ID NO:206和207的多核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分增强抗原特异性CD4+或CD8+T细胞的活化，其中根据实施例14所述的方法，通过测量抗原特异性CD4+或CD8+T细胞上CD137表面表达的统计意义上的显著增强来评估抗原特异性CD4+或CD8+T细胞的活化。
在一些实施方案中，特异性结合TIM-3的抗体或其抗原结合部分在TIM-3残基90-102(RIQIPGIMNDEKF)(SEQ ID NO:263)之内结合TIM-3。
在一些实施方案中，特异性结合TIM-3的抗体或其抗原结合部分在TIM-3残基90-102(RIQIPGIMNDEKF)(SEQ ID NO:263)和残基50-56(DERDVNY)(SEQ ID NO:262)之内结合TIM-3。
在一些实施方案中，特异性结合TIM-3的抗体或其抗原结合部分抑制TIM-3与半乳糖凝集素-9结合。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时任选地包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG4/κ同种型，在相比于野生型IgG4时任选地包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:172的VH和SEQ ID NO:173的VL并且是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时任选地包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:172的VH和SEQ ID NO:173的VL并且是IgG4κ同种型，在相比于野生型IgG4时包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，在相比于野生型IgG2时任选地包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG2/κ同种型，在相比于野生型IgG2时任选地包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:172的VH和SEQ ID NO:173的VL并且为IgG2/κ同种型，在相比于野生型IgG2时任选地包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:172的VH和SEQ ID NO:173的VL并且为IgG2/κ同种型，在相比于野生型IgG2时包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:80的HC和SEQ ID NO:81的LC。
SEQ ID NO:80
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWMQWVRQMPGKGLEWMGAIYPGDGDIRYTQNFKGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARWEKSTTVVQRNYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ IN NO:81
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASENVGTFVSWYQQKPGKAPKLLIYGASNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGQSYSYPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体，诸如双特异性PD-1/TIM-3抗体。
该抗体适用于治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于治疗，例如治疗实体瘤。
该抗体适用于治疗，例如治疗黑色素瘤。
该抗体适用于治疗，例如治疗肺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗非小细胞肺癌(NSCLC)。
该抗体适用于治疗，例如治疗鳞状NSCLC。
该抗体适用于治疗，例如治疗非鳞状NSCLC。
该抗体适用于治疗，例如治疗肺腺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗肾细胞癌(RCC)。
该抗体适用于治疗，例如治疗间皮瘤。
该抗体适用于治疗，例如治疗鼻咽癌(NPC)。
该抗体适用于治疗，例如治疗结肠直肠癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗前列腺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗阉割抗性前列腺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗胃部癌症。
该抗体适用于治疗，例如治疗卵巢癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗胃癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗肝癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗胰腺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗甲状腺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗头颈部鳞状上皮细胞癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗食道癌或胃肠道癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗乳腺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗输卵管癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗脑癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗尿道癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗子宫内膜异位症。
该抗体适用于治疗，例如治疗宫颈癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗癌症的转移性病变。
该抗体适用于治疗，例如治疗血液恶性肿瘤。
该抗体适用于治疗，例如治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)。
该抗体适用于与特异性结合PD-1的拮抗性抗体联合治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于与包含SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:56的VL的特异性结合PD-1的拮抗性抗体联合治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于与包含SEQ ID NO:47的VH和SEQ ID NO:58的VL的特异性结合PD-1的拮抗性抗体联合治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于与包含SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:60的VL的特异性结合PD-1的拮抗性抗体联合治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于与包含SEQ ID NO:65的VH和SEQ ID NO:65的VL的特异性结合PD-1的拮抗性抗体联合治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于与特异性结合TIGIT(SEQ ID NO:301)的拮抗性抗体联合治疗，例如治疗癌症，诸如实体瘤。
该抗体适用于与FGFR抑制剂联合治疗，例如治疗癌症，诸如实体瘤。
该抗体适用于与疫苗联合治疗，例如治疗癌症，诸如实体瘤。
该抗体适用于与特异性结合GITR(SEQ ID NO:271)的激动性抗体联合治疗，例如治疗癌症，诸如实体瘤。
该抗体适用于与特异性结合CD137(SEQ ID NO:281)的激动性抗体联合治疗，例如治疗癌症，诸如实体瘤。
该抗体适用于与特异性结合OX-40(SEQ ID NO:279)的激动性抗体联合治疗，例如治疗癌症，诸如实体瘤。
该抗体适用于治疗正在用包含SEQ ID NO:230的VH和SEQ ID NO:231的VL的特异性结合PD-1的拮抗性抗体治疗或已经用其治疗过的受试者。(例如
Figure BDA0001717945540000691
(派姆单抗))。
该抗体适用于治疗正在用包含SEQ ID NO:232的VH和SEQ ID NO:233的VL的特异性结合PD-1的拮抗性抗体治疗或已经用其治疗过的受试者。(例如
Figure BDA0001717945540000692
(纳武单抗))。
该抗体适用于治疗难以用包含SEQ ID NO:230的VH和SEQ ID NO:231的VL的特异性结合PD-1的拮抗性抗体治疗的受试者。(例如
Figure BDA0001717945540000693
(派姆单抗))。
该抗体适用于治疗难以用包含SEQ ID NO:232的VH和SEQ ID NO:233的VL的特异性结合PD-1的拮抗性抗体治疗的受试者。(例如
Figure BDA0001717945540000694
(纳武单抗))。
该抗体适用于治疗在用包含SEQ ID NO:230的VH和SEQ ID NO:231的VL的特异性结合PD-1的拮抗性抗体治疗后肿瘤复发的受试者。(例如
Figure BDA0001717945540000695
(派姆单抗))。
该抗体适用于治疗在用包含SEQ ID NO:232的VH和SEQ ID NO:233的VL的特异性结合PD-1的拮抗性抗体治疗后肿瘤复发的受试者。(例如
Figure BDA0001717945540000701
(纳武单抗))。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:90、99、107、117、126和135的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含来源于IGHV3-23(SEQ ID NO:174)的重链框架和来源于IGKV3-20(SEQ ID NO:180)的轻链框架。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:145的VH和SEQ IDNO:155的VL。
在一些实施方案中，VH和VL分别由SEQ ID NO:208和209的多核苷酸序列编码。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含SEQID NO:91、99、109、119、128和137的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含来源于IGHV3-23(SEQ ID NO:174)的重链框架和来源于IGKV4-1(SEQ ID NO:181)的轻链框架。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:148的VH和SEQ IDNO:157的VL。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:92、100、110、117、126和135的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含来源于IGHV3-23(SEQ ID NO:174)的重链框架和来源于IGKV3-20(SEQ ID NO:180)的轻链框架。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:147的VH和SEQ IDNO:155的VL。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:93、101、111、120、129和139的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含来源于IGHV3-23(SEQ ID NO:174)的重链框架和来源于IGKV3-20(SEQ ID NO:180)的轻链框架。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:149的VH和SEQ IDNO:158的VL。
在一些实施方案中，VH和VL分别由SEQ ID NO:201和211的多核苷酸序列编码。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:94、102、112、121、130和140的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含来源于IGHV1-02(SEQ ID NO:175)的重链框架和来源于IGKV4-1(SEQ ID NO:181)的轻链框架。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:150的VH和SEQ IDNO:159的VL。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:95、103、113、122、131和141的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含来源于IGHV4-30-4(SEQ ID NO:176)的重链框架和来源于IGKV1-39(SEQ ID NO:182)的轻链框架。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:151的VH和SEQ IDNO:160的VL。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:96、104、114、123、132和142的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含来源于IGHV1-03(SEQ ID NO:177)的重链框架和来源于IGKV1-33(SEQ ID NO:183)的轻链框架。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:152的VH和SEQ IDNO:161的VL。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:97、105、115、124、133和143的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含来源于IGHV1-03(SEQ ID NO:177)的重链框架和来源于IGKV1-39(SEQ ID NO:182)的轻链框架。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:153的VH和SEQ IDNO:162的VL。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:98、106、116、125、134和144的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含来源于IGHV2-26(SEQ ID NO:178)的重链框架和来源于IGKV4-1(SEQ ID NO:181)的轻链框架。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:154的VH和SEQ IDNO:163的VL。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分增强抗原特异性CD4+或CD8+T细胞的活化，其中根据实施例14所述的方法，通过测量抗原特异性CD4+或CD8+T细胞上CD137表面表达的统计意义上的显著增强来评估抗原特异性CD4+或CD8+T细胞的活化。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时任选地包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，在相比于野生型IgG2时任选地包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
示例性的本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体的VH、VL、HCDR和LCDR序列示于表3中。
尽管实施例中所示的实施方案包括成对的可变区，一个来自重链并且一个来自轻链，但本领域技术人员将认识到另选实施方案可包括单一重链可变区或单一轻链可变区。单一可变区可用于筛选能够形成能够例如结合人TIM-3的二域特异性抗原结合片段的可变域。筛选可以通过使用类似于本文所述的噬菌体展示筛选方法来完成。
在一些实施方案中，特异性结合TIM-3的拮抗性抗体是多特异性抗体。
在一些实施方案中，特异性结合TIM-3的拮抗性抗体是双特异性抗体。
在一些实施方案中，双特异性或多特异性抗体结合PD-1(SEQ ID NO:1)、PD-L1(SEQ ID NO:5)、PD-L2(SEQ ID NO:8)、LAG-3(SEQ ID NO:293)、CEACAM-1(SEQ ID NO:296)、CEACAM-5(SEQ ID NO:307)、NKG2D(SEQ ID NO:282)、或TIGITI(SEQ ID NO:301)。双特异性和多特异性抗体可使用本文所述的方法产生。
表3：
Figure BDA0001717945540000731
同源抗体
包含表3、表36和表37中所示VH或VL氨基酸序列的本发明特异性结合TIM-3的拮抗性抗体的变体在本发明的范围之内。例如，变体可在VH和/或VL中包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换，只要同源抗体在相比于亲本抗体时保持或具有改善的功能特性即可。在一些实施方案中，对本发明的VH或VL氨基酸序列的序列同一性可为约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
本发明还提供特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含SEQ IDNO:145的VH和SEQ ID NO:155的VL，其中所述VH、VL、或VH与VL两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。任选地，任何置换不在CDR之内。
本发明还提供特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含SEQ IDNO:146的VH和SEQ ID NO:156的VL，其中所述VH、VL、或VH与VL两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。任选地，任何置换不在CDR之内。
本发明还提供特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含SEQ IDNO:148的VH和SEQ ID NO:157的VL，其中所述VH、VL、或VH与VL两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。任选地，任何置换不在CDR之内。
本发明还提供特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含SEQ IDNO:147的VH和SEQ ID NO:155的VL，其中所述VH、VL、或VH与VL两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。任选地，任何置换不在CDR之内。
本发明还提供特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含SEQ IDNO:149的VH和SEQ ID NO:158的VL，其中所述VH、VL、或VH与VL两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。任选地，任何置换不在CDR之内。
本发明还提供特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含SEQ IDNO:150的VH和SEQ ID NO:159的VL，其中所述VH、VL、或VH与VL两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。任选地，任何置换不在CDR之内。
本发明还提供特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含SEQ IDNO:151的VH和SEQ ID NO:160的VL，其中所述VH、VL、或VH与VL两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。任选地，任何置换不在CDR之内。
本发明还提供特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含SEQ IDNO:152的VH和SEQ ID NO:161的VL，其中所述VH、VL、或VH与VL两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。任选地，任何置换不在CDR之内。
本发明还提供特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含SEQ IDNO:153的VH和SEQ ID NO:162的VL，其中所述VH、VL、或VH与VL两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。任选地，任何置换不在CDR之内。
本发明还提供特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含SEQ IDNO:154的VH和SEQ ID NO:163的VL，其中所述VH、VL、或VH与VL两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。任选地，任何置换不在CDR之内。
本发明还提供特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含SEQ IDNO:172的VH和SEQ ID NO:173的VL，其中所述VH、VL、或VH与VL两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。任选地，任何置换不在CDR之内。
本发明还提供特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含氨基酸序列与SEQ ID NO:145、146、147、148、149、150、151、152、153、154或172的VH有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH。任选地，SEQ ID NO的序列的任何变化不在CDR之内。
本发明还提供特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含氨基酸序列与SEQ IS NO:155、156、157、158、159、160、161、162、163或173的VL有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL。任选地，SEQ ID NO的序列的任何变化不在CDR之内。
本发明还提供特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含氨基酸序列与SEQ ID NO:145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、172的VH有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH，以及氨基酸序列与SEQ ID NO:155、156、157、158、159、160、161、162、163或173的VL有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL。任选地，SEQ ID NO的序列的任何变化不在CDR之内。
本发明还提供特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含氨基酸序列与SEQ ID NO:145的VH和SEQ ID NO:155的VL有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH和VL。任选地，SEQ ID NO的序列的任何变化不在CDR之内。
本发明还提供特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含氨基酸序列与SEQ ID NO:146的VH和SEQ ID NO:156的VL有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH和VL。任选地，SEQ ID NO的序列的任何变化不在CDR之内。
本发明还提供特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含氨基酸序列与SEQ ID NO:148的VH和SEQ ID NO:157的VL有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH和VL。任选地，SEQ ID NO的序列的任何变化不在CDR之内。
本发明还提供特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含氨基酸序列与SEQ ID NO:147的VH和SEQ ID NO:155的VL有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH和VL。任选地，SEQ ID NO的序列的任何变化不在CDR之内。
本发明还提供特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含氨基酸序列与SEQ ID NO:149的VH和SEQ ID NO:158的VL有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH和VL。任选地，SEQ ID NO的序列的任何变化不在CDR之内。
本发明还提供特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含氨基酸序列与SEQ ID NO:150的VH和SEQ ID NO:159的VL有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH和VL。任选地，SEQ ID NO的序列的任何变化不在CDR之内。
本发明还提供特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含氨基酸序列与SEQ ID NO:151的VH和SEQ ID NO:160的VL有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH和VL。任选地，SEQ ID NO的序列的任何变化不在CDR之内。
本发明还提供特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含氨基酸序列与SEQ ID NO:152的VH和SEQ ID NO:161的VL有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH和VL。任选地，SEQ ID NO的序列的任何变化不在CDR之内。
本发明还提供特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含氨基酸序列与SEQ ID NO:153的VH和SEQ ID NO:162的VL有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH和VL。任选地，SEQ ID NO的序列的任何变化不在CDR之内。
本发明还提供特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含氨基酸序列与SEQ ID NO:154的VH和SEQ ID NO:163的VL有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH和VL。任选地，SEQ ID NO的序列的任何变化不在CDR之内。
本发明还提供特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含氨基酸序列与SEQ ID NO:172的VH和SEQ ID NO:173的VL有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH和VL。任选地，SEQ ID NO的序列的任何变化不在CDR之内。
本文所述的本发明同源抗体在相比于亲本TIM-3抗体时具有基本上类似的功能性。
具有保守修饰的本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体
本发明还提供一种包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH和含有LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，其中一种或多种CDR序列包含基于本文所述抗体(例如表3、表36或表37所示抗体)的特定氨基酸序列或它们的保守修饰，并且其中所述抗体保留了本发明的特异性结合TIM-3的亲本拮抗性抗体的期望功能特性。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:90、99、107、117、126和135以及它们的保守修饰的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:91、99、108、118、127和136以及它们的保守修饰的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:91、99、109、119、128和137以及它们的保守修饰的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:92、100、110、117、126和135以及它们的保守修饰的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:93、101、111、120、129和139以及它们的保守修饰的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:94、102、112、121、130和140以及它们的保守修饰的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:95、103、113、122、131和141以及它们的保守修饰的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:96、104、114、123、132和142以及它们的保守修饰的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:97、105、115、124、133和143以及它们的保守修饰的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含分别为SEQ ID NO:98、106、116、125、134和144以及它们的保守修饰的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
“保守修饰”是指如本文所述的修饰。
具有特定框架序列的本发明特异性结合TIM-3的拮抗性抗体
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含来源于特定人种系免疫球蛋白序列的VH和VL。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含来源于IGHV3-23(SEQ ID NO:174)、IGHV1-02(SEQ ID NO:175)、IGHV4-30-4(SEQ ID NO:176)、IGHV1-03(SEQ ID NO:177)、IGHV2-26(SEQ ID NO:178)或IGHV5-51(SEQ ID NO:179)的VH框架。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含来源于IGKV3-20(A27)(SEQ ID NO:180)、IGKV3-11(L6)(SEQ ID NO:171)、IGKV4-1(B3)(SEQ IDNO:181)、IGKV1-39)(O12)(SEQ ID NO:182)或IGKV1-33(O18)(SEQ ID NO:183)的VL框架。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含来源于IGHV3-23(SEQ ID NO:174)的VH框架和来源于IGKV3-20(SEQ ID NO:180)的VL框架。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含来源于IGHV3-23(SEQ ID NO:174)的VH框架和来源于IGKV3-11(SEQ ID NO:171)的VL框架。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含来源于IGHV3-23(SEQ ID NO:174)的VH框架和来源于IGKV4-1(SEQ ID NO:181)的VL框架。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含来源于IGHV1-02(SEQ ID NO:175)的VH框架和来源于IGKV4-1(SEQ ID NO:181)的VL框架。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含来源于IGHV4-30-4(SEQ ID NO:176)的VH框架和来源于IGKV1-39(SEQ ID NO:182)的VL框架。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含来源于IGHV1-03(SEQ ID NO:177)的VH框架和来源于IGKV1-33(SEQ ID NO:183)的VL框架。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含来源于IGHV1-03(SEQ ID NO:177)的VH框架和来源于IGKV1-39(SEQ ID NO:182)的VL框架。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含来源于IGHV2-26(SEQ ID NO:178)的VH框架和来源于IGKV4-1(SEQ ID NO:181)的VL框架。
本发明还提供一种特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或其抗原结合部分，包含来源于IGHV5-51(SEQ ID NO:179)的VH框架和来源于IGKV1-39(SEQ ID NO:182)的VL框架。
包含“来源于”特定框架或种系序列的重链或轻链可变区的本发明抗体是指从使用人种系免疫球蛋白基因的系统获得的抗体，诸如从转基因小鼠或如本文讨论的噬菌体展示文库获得的抗体。“来源于”特定框架或种系序列的抗体相比于其所来源的序列，可能由于例如天然存在的体细胞突变或特意置换而包含一些氨基酸差异。
示例性的具有特定VH和VL框架序列的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体示于表38中。
双特异性抗-PD-1/TIM-3抗体
本发明还提供拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体。
本发明还提供一种包含特异性结合PD-1的第一域和特异性结合TIM-3的第二域的分离的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体。
在一些实施方案中，本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体增强抗原特异性CD4+或CD8+T细胞的活化。
在一些实施方案中，本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体增强抗原特异性CD4+或CD8+T细胞的活化，其中增强的抗原特异性CD4+或CD8+T细胞的活化通过测量抗原特异性CD4+或CD8+T细胞上CD137表面表达的统计意义上的显著提高来评估。
在一些实施方案中，本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体抑制TIM-3与半乳糖凝集素-9结合。
在一些实施方案中，本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体
以小于约100nM的平衡解离常数(KD)结合人PD-1，其中所述KD使用ProteOn XPR36系统在+25℃下进行测量；
以小于约1nM的KD结合人PD-1，其中所述KD使用ProteOn XPR36系统在+25℃下进行测量；
以小于约100nM的KD结合猕猴PD-1，其中所述KD使用ProteOn XPR36系统在+25℃下进行测量；或者
以小于约1nM的KD结合猕猴PD-1；
其中所述KD使用ProteOn XPR36系统在+25℃下进行测量。
在一些实施方案中，本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体增强抗原特异性CD4+或CD8+T细胞的活化，其中抗原特异性CD4+或CD8+T细胞的活化通过测量抗原特异性CD4+或CD8+T细胞上CD137表面表达的统计意义上的显著提高来评估；并且以小于约100nM的平衡解离常数(KD)结合人PD-1，其中所述KD使用ProteOn XPR36系统在+25℃下进行测量。
在一些实施方案中，本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体增强抗原特异性CD4+或CD8+T细胞的活化，其中抗原特异性CD4+或CD8+T细胞的活化通过测量抗原特异性CD4+或CD8+T细胞上CD137表面表达的统计意义上的显著提高来评估；并且以小于约1nM的平衡解离常数(KD)结合人PD-1，其中所述KD使用ProteOn XPR36系统在+25℃下进行测量。
在一些实施方案中，本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体增强抗原特异性CD4+或CD8+T细胞的活化，其中抗原特异性CD4+或CD8+T细胞的活化通过测量抗原特异性CD4+或CD8+T细胞上CD137表面表达的统计意义上的显著提高来评估；并且以小于约100nM的平衡解离常数(KD)结合猕猴PD-1，其中所述KD使用ProteOn XPR36系统在+25℃下进行测量。
在一些实施方案中，本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体增强抗原特异性CD4+或CD8+T细胞的活化，其中抗原特异性CD4+或CD8+T细胞的活化通过测量抗原特异性CD4+或CD8+T细胞上CD137表面表达的统计意义上的显著提高来评估；并且以小于约1nM的平衡解离常数(KD)结合猕猴PD-1，其中所述KD使用ProteOn XPR36系统在+25℃下进行测量。
可评价本文所述的本发明拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体增强抗原特异性CD4+或CD8+T细胞活化、抑制TIM-3与半乳糖凝集素-9结合的能力，并且可使用本文所述的方法来评估对人或猕猴PD-1或TIM-3的结合动力学。
例如，CD137可作为用于抗原特异性CD4+或CD8+T细胞活化的标记使用。使用例如缀合于荧光染料的抗-CD137抗体和二抗，在存在或不存在测试抗体(例如双特异性PD-1/TIM-3抗体)情况下所培养的T细胞上测量CD137表面表达。对在存在或不存在测试抗体情况下培养的T细胞上所获信号的统计意义上的显著差异进行评价。
在一些实施方案中，本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体在TIM-3残基32-47(WGKGACPVFECGNVVL)(SEQ ID NO:261)之内结合TIM-3。
在一些实施方案中，本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体在TIM-3残基32-47(WGKGACPVFECGNVVL)(SEQ ID NO:261)和残基50-56(DERDVNY)(SEQ ID NO:262)之内结合TIM-3。
在一些实施方案中，本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体在TIM-3残基90-102(RIQIPGIMNDEKF)(SEQ ID NO:263)之内结合TIM-3。
在一些实施方案中，本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体在TIM-3残基90-102(RIQIPGIMNDEKF)(SEQ ID NO:263)和残基50-56(DERDVNY)(SEQ ID NO:262)之内结合TIM-3。
在一些实施方案中，第一域包含分别为SEQ ID NO:82、83和84的重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3。
在一些实施方案中，第一域包含包含分别为SEQ ID NO:82、83和85的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些实施方案中，第一域包含分别为SEQ ID NO:86、87和88的轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，第一域包含分别为SEQ ID NO:82、83和84的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及分别为SEQ ID NO:86、87和88的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，第一域包含分别为SEQ ID NO:82、83和85的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及分别为SEQ ID NO:86、87和88的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，第二域包含包含分别为SEQ ID NO:164、165和166的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列。
在一些实施方案中，第二域包含包含分别为SEQ ID NO:167、168和169的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一些实施方案中，第二域包含分别为SEQ ID NO:164、165和166的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列，以及分别为SEQ ID NO:167、168和169的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一域包含下列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：
分别为SEQ ID NO:10、13、16、20、26和31；
分别为SEQ ID NO:10、13、16、21、26和32；
分别为SEQ ID NO:10、14、16、22、27和33；
分别为SEQ ID NO:10、14、16、22、26和34；
分别为SEQ ID NO:10、14、16、23、28和35；
分别为SEQ ID NO:10、13、17、20、26和31；
分别为SEQ ID NO:10、13、17、20、26和36；
分别为SEQ ID NO:10、13、17、21、26和32；
分别为SEQ ID NO:10、13、17、21、27和37；
分别为SEQ ID NO:10、13、17、23、26和32；
分别为SEQ ID NO:10、13、17、22、26和32；
分别为SEQ ID NO:10、13、18、20、26和31；
分别为SEQ ID NO:11、15、18、20、26和31；
分别为SEQ ID NO:10、13、19、20、26和31；
分别为SEQ ID NO:12、13、19、20、26和31；
分别为SEQ ID NO:10、14、17、23、28和35；
分别为SEQ ID NO:10、14、17、22、26和34；
分别为SEQ ID NO:10、14、17、23、26和32；
分别为SEQ ID NO:12、13、19、24、26和38；
分别为SEQ ID NO:12、13、19、20、29和39；
分别为SEQ ID NO:11、15、18、20、30和32；
分别为SEQ ID NO:11、15、18、25、26和40；
分别为SEQ ID NO:11、15、18、24、26和32；或者
分别为SEQ ID NO:66、67、68、69、70和71。
在一些实施方案中，第二域包含下列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：
分别为SEQ ID NO:90、99、107、117、126和135；
分别为SEQ ID NO:91、99、108、118、127和136；
分别为SEQ ID NO:91、99、109、119、128和137；
分别为SEQ ID NO:92、100、110、117、126和135；
分别为SEQ ID NO:93、101、111、120、129和139；
分别为SEQ ID NO:94、102、112、121、130和140；
分别为SEQ ID NO:95、103、113、122、131和141；
分别为SEQ ID NO:96、104、114、123、132和142；
分别为SEQ ID NO:97、105、115、124、133和143；或者
分别为SEQ ID NO:98、106、116、125、134和144。
在一些实施方案中，第一域包含SEQ ID NO:41、42、43、44、45、46、47、48、63或64的VH，所述VH任选地具有一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个保守氨基酸置换。任选地，任何置换不在CDR之内。
在一些实施方案中，第一域包含SEQ ID NO:49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或65的VL，所述VL任选地具有一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个保守氨基酸置换。任选地，任何置换不在CDR之内。
在一些实施方案中，第一域包含SEQ ID NO:41、42、43、44、45、46、47、48、63或64的VH以及SEQ ID NO:49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62和65的VL，所述VH、VL、或VH与VL任选地具有一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个保守氨基酸置换。任选地，任何置换不在CDR之内。
在一些实施方案中，第二域包含SEQ ID NO:145、146、147、148、149、150、151、152、153、154或172的VH，所述VH任选地具有一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个保守氨基酸置换。任选地，任何置换不在CDR之内。
在一些实施方案中，第二域包含SEQ IS NO:155、156、157、158、159、160、161、162、163或173的VL，所述VL任选地具有一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个保守氨基酸置换。任选地，任何置换不在CDR之内。
在一些实施方案中，第二域包含SEQ ID NO:145、146、147、148、149、150、151、152、153、154或172的VH以及SEQ ID NO:155、156、157、158、159、160、161、162、163或173的VL，所述VH和VL任选地具有一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个保守氨基酸置换。任选地，任何置换不在CDR之内。
在一些实施方案中，第一域包含SEQ ID NO:41的VH和SEQ ID NO:49的VL。
在一些实施方案中，第一域包含SEQ ID NO:41的VH和SEQ ID NO:50的VL。
在一些实施方案中，第一域包含SEQ ID NO:42的VH和SEQ ID NO:51的VL。
在一些实施方案中，第一域包含SEQ ID NO:42的VH和SEQ ID NO:52的VL。
在一些实施方案中，第一域包含SEQ ID NO:42的VH和SEQ ID NO:53的VL。
在一些实施方案中，第一域包含SEQ ID NO:43的VH和SEQ ID NO:49的VL。
在一些实施方案中，第一域包含SEQ ID NO:43的VH和SEQ ID NO:54的VL。
在一些实施方案中，第一域包含SEQ ID NO:43的VH和SEQ ID NO:50的VL。
在一些实施方案中，第一域包含SEQ ID NO:43的VH和SEQ ID NO:55的VL。
在一些实施方案中，第一域包含SEQ ID NO:43的VH和SEQ ID NO:56的VL。
在一些实施方案中，第一域包含SEQ ID NO:43的VH和SEQ ID NO:57的VL。
在一些实施方案中，第一域包含SEQ ID NO:44的VH和SEQ ID NO:49的VL。
在一些实施方案中，第一域包含SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:49的VL。
在一些实施方案中，第一域包含SEQ ID NO:46的VH和SEQ ID NO:49的VL。
在一些实施方案中，第一域包含SEQ ID NO:47的VH和SEQ ID NO:49的VL。
在一些实施方案中，第一域包含SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:53的VL。
在一些实施方案中，第一域包含SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:52的VL。
在一些实施方案中，第一域包含SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:56的VL。
在一些实施方案中，第一域包含SEQ ID NO:47的VH和SEQ ID NO:58的VL。
在一些实施方案中，第一域包含SEQ ID NO:47的VH和SEQ ID NO:59的VL。
在一些实施方案中，第一域包含SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:60的VL。
在一些实施方案中，第一域包含SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:61的VL。
在一些实施方案中，第一域包含SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:62的VL。
在一些实施方案中，第一域包含SEQ ID NO:63的VH和SEQ ID NO:65的VL。
在一些实施方案中，第一域包含SEQ ID NO:64的VH和SEQ ID NO:65的VL。
在一些实施方案中，第二域包含SEQ ID NO:145的VH和SEQ ID NO:155的VL。
在一些实施方案中，第二域包含SEQ ID NO:146的VH和SEQ ID NO:156的VL。
在一些实施方案中，第二域包含SEQ ID NO:148的VH和SEQ ID NO:157的VL。
在一些实施方案中，第二域包含SEQ ID NO:147的VH和SEQ ID NO:155的VL。
在一些实施方案中，第二域包含SEQ ID NO:149的VH和SEQ ID NO:158的VL。
在一些实施方案中，第二域包含SEQ ID NO:150的VH和SEQ ID NO:159的VL。
在一些实施方案中，第二域包含SEQ ID NO:151的VH和SEQ ID NO:160的VL。
在一些实施方案中，第二域包含SEQ ID NO:152的VH和SEQ ID NO:161的VL。
在一些实施方案中，第二域包含SEQ ID NO:153的VH和SEQ ID NO:162的VL。
在一些实施方案中，第二域包含SEQ ID NO:154的VH和SEQ ID NO:163的VL。
在一些实施方案中，第二域包含SEQ ID NO:172的VH和SEQ ID NO:173的VL。
本发明还提供一种分离的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体，包含特异性结合PD-1的第一域和特异性结合TIM-3的第二域，其中第一域包含分别为SEQ ID NO:10、14、17、23、26和32的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且第二域包含分别为SEQ ID NO:91、99、108、118、127和136的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体在TIM-3残基32-47(WGKGACPVFECGNVVL)(SEQ ID NO:261)之内结合TIM-3。
在一些实施方案中，拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体在TIM-3残基32-47(WGKGACPVFECGNVVL)(SEQ ID NO:261)和残基50-56(DERDVNY)(SEQ ID NO:262)之内结合TIM-3。
在一些实施方案中，拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体抑制TIM-3与半乳糖凝集素-9结合。
在一些实施方案中，第一域包含SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:56的VL，并且第二域包含SEQ ID NO:146的VH和SEQ ID NO:156的VL。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，其包含F405L和/或K409R置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，在相比于野生型IgG2时任选地包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时任选地包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，其包含F405L和K409R置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时包含重链置换S228P。
在一些实施方案中，分离的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体包含分别为SEQ IDNO:241、188、245或194的第一重链(HC1)、第一轻链(LC1)、第二重链(HC2)和第二轻链(LC2)。
在一些实施方案中，分离的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体包含分别为SEQ IDNO:186、188、191或194的HC1、LC1、HC2和LC2。
在一些实施方案中，分离的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体包含分别为SEQ IDNO:186、188、248或194的HC1、LC1、HC2和LC2。
在一些实施方案中，分离的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体包含分别为SEQ IDNO:243、188、246或194的HC1、LC1、HC2和LC2。
该抗体适用于治疗，例如治疗癌症。
该抗体适用于治疗，例如治疗实体瘤。
该抗体适用于治疗，例如治疗黑色素瘤。
该抗体适用于治疗，例如治疗肺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗非小细胞肺癌(NSCLC)。
该抗体适用于治疗，例如治疗鳞状NSCLC。
该抗体适用于治疗，例如治疗非鳞状NSCLC。
该抗体适用于治疗，例如治疗肺腺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗肾细胞癌(RCC)。
该抗体适用于治疗，例如治疗间皮瘤。
该抗体适用于治疗，例如治疗鼻咽癌(NPC)。
该抗体适用于治疗，例如治疗结肠直肠癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗前列腺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗阉割抗性前列腺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗胃部癌症。
该抗体适用于治疗，例如治疗卵巢癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗胃癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗肝癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗胰腺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗甲状腺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗头颈部鳞状上皮细胞癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗食道癌或胃肠道癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗乳腺癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗输卵管癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗脑癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗尿道癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗子宫内膜异位症。
该抗体适用于治疗，例如治疗宫颈癌。
该抗体适用于治疗，例如治疗癌症的转移性病变。
该抗体适用于治疗正在用包含SEQ ID NO:230的VH和SEQ ID NO:231的VL的抗-PD-1抗体治疗或已经用其治疗过的受试者。(例如
Figure BDA0001717945540000901
(派姆单抗))。
该抗体适用于治疗正在用包含SEQ ID NO:232的VH和SEQ ID NO:233的VL的抗-PD-1抗体治疗或已经用其治疗过的受试者。(例如
Figure BDA0001717945540000902
(纳武单抗))。
该抗体适用于治疗难以用包含SEQ ID NO:230的VH和SEQ ID NO:231的VL的抗-PD-1抗体治疗的受试者。(例如
Figure BDA0001717945540000903
(派姆单抗))。
该抗体适用于治疗难以用包含SEQ ID NO:232的VH和SEQ ID NO:233的VL的抗-PD-1抗体治疗的受试者。(例如
Figure BDA0001717945540000904
(纳武单抗))。
该抗体适用于治疗在用包含SEQ ID NO:230的VH和SEQ ID NO:231的VL的抗-PD-1抗体治疗后肿瘤复发的受试者。(例如
Figure BDA0001717945540000905
(派姆单抗))。
该抗体适用于治疗在用包含SEQ ID NO:232的VH和SEQ ID NO:233的VL的抗-PD-1抗体治疗后肿瘤复发的受试者。(例如
Figure BDA0001717945540000906
(纳武单抗))。
本发明还提供一种分离的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体，包含特异性结合PD-1的第一域和特异性结合TIM-3的第二域，其中第一域包含分别为SEQ ID NO:66、67、68、69、70和71的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且第二域包含分别为SEQ ID NO:97、105、115、124、133和143的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体在TIM-3残基90-102(RIQIPGIMNDEKF)(SEQ ID NO:263)之内结合TIM-3。
在一些实施方案中，双特异性PD-1/TIM-3抗体在TIM-3残基90-102(RIQIPGIMNDEKF)(SEQ ID NO:263)和残基50-56(DERDVNY)(SEQ ID NO:262)之内结合TIM-3。
在一些实施方案中，双特异性PD-1/TIM-3抗体抑制TIM-3与半乳糖凝集素-9结合。
在一些实施方案中，第一域包含SEQ ID NO:64的VH和SEQ ID NO:65的VL，并且第二域包含SEQ ID NO:153的VH和SEQ ID NO:162的VL。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，其包含F405L和/或K409R置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，在相比于野生型IgG2时任选地包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时任选地包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，其包含F405L和K409R置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时包含重链置换S228P。
在一些实施方案中，分离的双特异性PD-1/TIM-3抗体包含分别为SEQ ID NO:187、189、190和193的HC1、LC1、HC2和LC2。
本发明还提供一种分离的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体，包含特异性结合PD-1的第一域和特异性结合TIM-3的第二域，其中第一域包含分别为SEQ ID NO:66、67、68、69、70和71的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且第二域包含分别为SEQ ID NO:91、99、108、118、127和136的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，第一域包含SEQ ID NO:64的VH和SEQ ID NO:65的VL，并且第二域包含SEQ ID NO:146的VH和SEQ ID NO:156的VL。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，其包含F405L和/或K409R置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，在相比于野生型IgG2时任选地包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时任选地包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，其包含F405L和K409R置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时包含重链置换S228P。
在一些实施方案中，分离的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体包含分别为SEQ IDNO:187、189、191和194的HC1、LC1、HC2和LC2。
在一些实施方案中，分离的双特异性PD-1/TIM-3抗体包含分别为SEQ ID NO:242、189、246和194的HC1、LC1、HC2和LC2。
本发明还提供一种分离的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体，包含特异性结合PD-1的第一域和特异性结合TIM-3的第二域，其中第一域包含分别为SEQ ID NO:10、14、17、23、26和32的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且第二域包含分别为SEQ ID NO:97、105、115、124、133和143的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，第一域包含SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:56的VL，并且第二域包含SEQ ID NO:172的VH和SEQ ID NO:173的VL。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，其包含F405L和/或K409R置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，在相比于野生型IgG2时任选地包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时任选地包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，其包含F405L和K409R置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时包含重链置换S228P。
在一些实施方案中，分离的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体包含分别为SEQ IDNO:186、188、192和195的HC1、LC1、HC2和LC2。
在一些实施方案中，分离的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体包含分别为SEQ IDNO:241、188、244和195的HC1、LC1、HC2和LC2。
在一些实施方案中，分离的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体包含分别为SEQ IDNO:243、188、247和195的HC1、LC1、HC2和LC2。
在一些实施方案中，抗体增强抗原特异性CD4+或CD8+T细胞的活化，其中根据实施例14所述的方法，通过测量抗原特异性CD4+或CD8+T细胞上CD137表面表达的统计意义上的显著增强来评估抗原特异性CD4+或CD8+T细胞的活化。
本发明还提供一种分离的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体，包含特异性结合PD-1的第一域和特异性结合TIM-3的第二域，其中第一域包含分别为SEQ ID NO:10、14、17、23、26和32的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且第二域包含分别为SEQ ID NO:97、105、115、124、133和143的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，第一域包含SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:56的VL，并且第二域包含SEQ ID NO:153的VH和SEQ ID NO:156的VL。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，其包含F405L和/或K409R置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，在相比于野生型IgG2时任选地包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时任选地包含S228P置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，其包含F405L和K409R置换。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，在相比于野生型IgG4时包含重链置换S228P。
在一些实施方案中，分离的双特异性PD-1/TIM-3抗体包含分别为SEQ ID NO:186、188、190和193的HC1、LC1、HC2和LC2。
示例性的具有特定VH、VL、HCDR和LCDR序列的本发明拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体如表4和表5所示。
表4：
Figure BDA0001717945540000941
Figure BDA0001717945540000951
表5：
Figure BDA0001717945540000952
工程化和修饰抗体
本发明的抗体可被进一步工程化以产生修饰抗体，在相比于亲本抗体时具有类似或改变的特性。可在本发明的抗体中工程化VH、VL、VH和VL、恒定区、VH框架、VL框架、或任意或全部六个CDR。
如本文所用，“本发明的抗体”是指如本文所述的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、以及包含特异性结合PD-1的第一域和特异性结合TIM-3的第二域的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体(例如双特异性PD-1/TIM-3抗体)。
本发明的抗体可通过CDR接枝进行工程化。可将本文所述的本发明抗体中的一个或多个CDR序列接枝到不同的框架序列上。CDR接枝可使用已知方法和本文所述的方法进行。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体或双特异性PD-1/TIM-3抗体包含：VH，所述VH包含SEQ ID NO:10、11或12的HDCR1，SEQ ID NO:13、14或15的HCDR2，SEQ ID NO:16、17、18或19的HCDR3；以及VL，所述VL包含SEQ ID NO:20、21、22、23、24或25的LCDR1，SEQ ID NOs:26、27、28、29或30的LCDR2，和/或SEQ ID NO:31、32、33、34、35、36、37、38、39或40的LCDR3，其中VH框架来源于除VH1-69(SEQ ID NO:170)之外的VH框架并且VL框架来源于除IGKV3-11(SEQ ID NO:171)之外的VL框架。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或双特异性PD-1/TIM-3抗体包含：SEQ ID NO:90、91、92、93、94、95、96、97或98的HDCR1，SEQ ID NO:99、100、101、102、10、104、105或106的HCDR2，SEQ ID NO:107、108、109、110、111、112、113、114、115或116的HCDR3；以及VL，包含SEQ ID NO:117、118、119、120、121、122、123、124或125的LCDR1，SEQ ID NO:126、127、128、129、130、131、132、133或134的LCDR2，和/或SEQ ID NO:135、136、137、139、140、141、142、143或144的LCDR3，其中VH框架来源于除IGHV3-23(SEQ IDNO:174)、IGHV1-02(SEQ ID NO:175)、IGHV4-30-4(SEQ ID NO:176)、IGHV1-03(SEQ ID NO:177)、IGHV2-26(SEQ ID NO:178)或IGHV5-51(SEQ ID NO:179)的那些之外的人VH种系基因序列，并且VL框架来源于除IGKV3-20(A27)(SEQ ID NO:180)、IGKV3-11(L6)(SEQ ID NO:171)、IGKV4-1(B3)(SEQ ID NO:181)、IGKV1-39(O12)(SEQ ID NO:182)或IGKV1-33(O18)(SEQ ID NO:183)的那些之外的人VL种系基因序列。
待使用的框架序列可获自公共DNA数据库或包括种系抗体基因序列的已出版参考文献。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA和编码蛋白质序列可见于
Figure BDA0001717945540000961
theinternational ImMunoGeneTics information
Figure BDA0001717945540000962
(http://_www-imgt_org)。能够被用来置换本发明抗体中现有框架序列的框架序列可为显示在VH或VL的整个长度上、或在FR1、FR2、FR3和FR4的长度上与亲本框架的百分比同一性最高的那些。此外，合适的框架可基于VH和VL CDR1以及CDR2长度或相同的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1和HCDR2规范结构来进一步选择。合适的框架可使用已知的方法进行选择，例如美国专利8,748,356所述的人框架改型或美国专利7,709,226的超人源化。
亲本和工程化抗体的框架序列还可例如通过回复突变来修饰，以恢复和/或改善所产生抗体对抗原的结合，如例如在美国专利6,180,370中有所描述。亲本或工程化抗体的框架序列还可通过使框架区内，或一个或多个CDR区内的一个或多个残基突变来修饰，以移除T-细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。该方法也被称为“去免疫化”并且在美国专利公布US20070014796中进一步详述。
可使本发明抗体的CDR残基突变，以改善抗体与PD-1、TIM-3或PD-1和TIM-3的亲和力。
可使本发明抗体的CDR残基突变，以例如使翻译后修饰的风险最小化。脱氨基化(NS)、酸催化的水解(DP)、异构化(DS)或氧化(W)中的推定基序的氨基酸残基可被任何天然存在的氨基酸取代以诱变基序，并且可使用本文所述的方法测定所得抗体的功能性和稳定性。
可对本发明的抗体进行Fc置换，以调节抗体效应子功能和药代动力学特性。在传统免疫功能中，抗体-抗原复合物与免疫系统的细胞的相互作用产生多种反应，范围从效应子功能例如抗体依赖的细胞毒性、肥大细胞脱颗粒和噬菌作用，到免疫调节信号例如调节淋巴细胞增殖与抗体分泌。所有这些相互作用是通过抗体的Fc域或者免疫复合物与造血细胞上的特异细胞表面受体结合而起始的。由抗体和免疫复合物触发的细胞应答的多样性是如下三种Fc受体的结构异质性造成的：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32A)和FcγRIII(CD16)是“活化Fcγ受体”(即免疫系统增强)；FcγRIIB(CD32B)“是抑制Fcγ受体”(即免疫系统抑制)。结合FcRn受体调节了抗体半衰期。
在一些实施方案中，本发明的拮抗性抗体在Fc区中包含至少一个置换。
在一些实施方案中，本发明的拮抗性抗体在Fc区中包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、或
可被置换以调节抗体半衰期的Fc位置是描述于例如Dall’Acqua等人，(2006)JBiol Chem 281:23514–240；Zalevsky等人，(2010)Nat Biotechnol28:157-159；Hinton等人，(2004)J Biol Chem 279(8):6213-6216；Hinton等人，(2006)J Immunol 176:346-356；Shields等人.(2001)J Biol Chem276:6591-6607；Petkova等人，(2006)Int Immunol 18:1759-1769；Datta-Mannan等人，(2007)Drug Metab Dispos,35:86-94,2007；Vaccaro等人，(2005)Nat Biotechnol 23:1283-1288；Yeung等人，(2010)Cancer Res,70:3269-3277和Kim等人，(1999)Eur J Immunol 29:2819中的那些，并且包括位置250、252、253、254、256、257、307、376、380、428、434和435。可单独地或组合进行的示例性置换为置换T250Q、M252Y、I253A、S254T、T256E、P257I、T307A、D376V、E380A、M428L、H433K、N434S、N434A、N434H、N434F、H435A和H435R。可用于增长抗体半衰期的示例性单独或组合置换为置换M428L/N434S、M252Y/S254T/T256E、T250Q/M428L、N434A和T307A/E380A/N434A。可用于减小抗体半衰期的示例性单独或组合置换为置换H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A和H435R。
在一些实施方案中，本发明的抗体在抗体Fc中的氨基酸位置250、252、253、254、256、257、307、376、380、428、434或435处包含至少一个置换。
在一些实施方案中，本发明的抗体在抗体Fc中包含选自以下的至少一个置换：T250Q、M252Y、I253A、S254T、T256E、P257I、T307A、D376V、E380A、M428L、H433K、N434S、N434A、N434H、N434F、H435A和H435R。
在一些实施方案中，本发明的抗体在抗体Fc中包含选自以下的至少一个置换：M428L/N434S、M252Y/S254T/T256E、T250Q/M428L、N434A、T307A/E380A/N434A、H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A和H435R。
在一些实施方案中，本发明的抗体在抗体Fc区中包含至少一个置换，所述置换降低抗体与活化Fcγ受体(FcγR)的结合并且/或者降低Fc效应子功能，诸如C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或吞噬作用(ADCP)。
可被置换以降低抗体与活化FcγR结合并随后降低效应子功能的Fc位置是描述于例如Shields等人，(2001)J Biol Chem 276:6591-6604；国际专利公布WO2011/066501；美国专利6,737,056和5,624,821；Xu等人，(2000)Cell Immunol,200:16-26；Alegre等人，(1994)Transplantation 57:1537-1543；Bolt等人，(1993)Eur J Immunol 23:403-411；Cole等人，(1999)Transplantation,68:563-571；Rother等人，(2007)Nat Biotechnol 25:1256-1264；Ghevaert等人，(2008)J Clin Invest 118:2929-2938；An等人，(2009)mAbs,1:572-579)中的那些，并且包括位置214、233、234、235、236、237、238、265、267、268、270、295、297、309、327、328、329、330、331和365。可单独地或组合进行的示例性置换为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的置换K214T、E233P、L234V、L234A、G236缺失、V234A、F234A、L235A、G237A、P238A、P238S、D265A、S267E、H268A、H268Q、Q268A、N297A、A327Q、P329A、D270A、Q295A、V309L、A327S、L328F、A330S和P331S。导致ADCC减小的抗体的示例性组合置换为IgG1上的置换L234A/L235A、IgG2上的V234A,/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、IgG4上的F234A/L235A、IgG4上的S228P/F234A/L235A、所有Ig同种型上的N297A、IgG2上的V234A/G237A、IgG1上的K214T/E233P/L234V/L235A/G236-缺失/A327G/P331A/D365E/L358M、IgG2上的H268Q/V309L/A330S/P331S、IgG1上的S267E/L328F、IgG1上的L234F/L235E/D265A、IgG1上的L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、IgG4上的S228P/F234A/L235A/G237A/P238S、以及IgG4上的S228P/F234A/L235A/G236-deleted/G237A/P238S。还可使用杂合IgG2/4Fc域，例如具有来自IgG2的残基117-260和来自IgG4的残基261-447的Fc。
公知的S228P置换可在IgG4抗体中进行，以增强IgG4稳定性。
在一些实施方案中，本发明的抗体在至少一个残基位置214、233、234、235、236、237、238、265、267、268、270、295、297、309、327、328、329、330、331或365处包含置换，其中残基根据EU索引进行编号。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含选自以下的至少一个置换：K214T、E233P、L234V、L234A、deletion of G236、V234A、F234A、L235A、G237A、P238A、P238S、D265A、S267E、H268A、H268Q、Q268A、N297A、A327Q、P329A、D270A、Q295A、V309L、A327S、L328F、A330S和P331S，其中残基根据EU索引进行编号。
在一些实施方案中，本发明的抗体在至少一个残基位置228、234、235、237、238、268、330或331处包含置换，其中残基根据EU索引进行编号。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含S228P置换，其中残基根据EU索引进行编号。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含V234A置换，其中残基根据EU索引进行编号。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含F234A置换，其中残基根据EU索引进行编号。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含G237A置换，其中残基根据EU索引进行编号。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含P238S置换，其中残基根据EU索引进行编号。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含H268A置换，其中残基根据EU索引进行编号。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含Q268A置换，其中残基根据EU索引进行编号。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含A330S置换，其中残基根据EU索引进行编号。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含P331S置换，其中残基根据EU索引进行编号。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含L234A、L235A、G237A、P238S、H268A、A330S和P331S置换，其中残基根据EU索引进行编号。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换，其中残基根据EU索引进行编号。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含F234A、L235A、G237A、P238S和Q268A置换，其中残基根据EU索引进行编号。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含L234A、L235A或L234A和L235A置换，其中残基根据EU索引进行编号。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含F234A、L235A或F234A和L235A置换，其中残基根据EU索引进行编号。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含S228P、F234A和L235A置换，其中残基根据EU索引进行编号。
在一些实施方案中，本发明的抗体在抗体Fc区中包含至少一个置换，所述置换增强抗体与Fcγ受体(FcγR)的结合并且/或者增强Fc效应子功能，诸如C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或吞噬作用(ADCP)。
除其免疫调节活性之外，本发明的PD-1或TIM-3抗体还可直接经由抗体-介导的效应子功能，例如通过ADCC、ADCP或CDC杀死表达PD-1和/或TIM-3的肿瘤细胞。
可被置换以增加抗体与活化Fcγ的结合和/或增强抗体效应子功能的Fc位置是例如描述于美国专利6,737,056；美国专利公布2015/0259434；Shields等人，(2001)J BiolChem 276:6591-6604；Lazar等人，(2006)Proc Natal Acad Sci,103:4005-4010；Stavenhagen等人，(2007)Cancer Res67:8882-8890；Richards等人，(2008)Mol CancerTher 7:2517-2527,Diebolder等人，Science；2014年3月13日在线发表；doi:10.1126/science.1248943中的那些，并且包括位置236、239、243、256、290、292、298、300、305、312、326、330、332、333、334、345、360、339、378、396或430(残基根据EU索引进行编号)。可单独地或组合进行的示例性置换为G236A、S239D、F243L、T256A、K290A、R292P、S298A、Y300L、V305L、K326A、A330K、I332E、E333A、K334A、A339T和P396L。导致ADCC或ADCP增大的抗体的示例性组合置换为IgG1上的置换S239D/I332E、S298A/E333A/K334A、F243L/R292P/Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L和G236A/S239D/I332E。
可被置换以增强抗体CDC的Fc位置是描述于例如国际专利申请WO2014/108198、Idusogie等人，(2001)J Immunol 166:2571-2575以及Moore等人，(2010)Mabs,2:181-189中的那些，并且包括位置267、268、324、326、333、345和430。可单独地或组合进行的示例性置换为置换S267E、H268F、S324T、K326A、K326W、E333A、E345K、E345Q、E345R、E345Y、E430S、E430F和E430T。导致CDC增大的抗体的示例性组合置换为IgG1上的置换K326A/E333A、K326W/E333A、H268F/S324T、S267E/H268F、S267E/S324T和S267E/H268F/S324T。
“抗体依赖性细胞的细胞毒性”、“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是诱导细胞死亡的机制，该机制依赖于抗体包被靶细胞与具有裂解活性的效应细胞(诸如自然杀伤细胞、单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞)经由效应细胞上表达的Fcγ受体(FcγR)发生的相互作用。例如，NK细胞表达FcγRIIIa，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIIIa。效应细胞通过分泌膜孔形成蛋白和蛋白酶而具有的活性会导致抗体包被靶细胞诸如表达PD-1或TIM-3的细胞发生死亡。为评估本文所述的本发明抗体的ADCC活性，可将抗体与免疫效应细胞联合加入到表达TIM-3或PD-1的细胞中，该免疫效应细胞可被抗原抗体复合物激活，从而使靶细胞发生细胞裂解。根据从裂解的细胞中释放的标记物(例如放射性底物、荧光染料或天然胞内蛋白)来检测细胞裂解。用于此类测定法的示例性效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和NK细胞。示例性靶细胞包括内源性或重组表达TIM-3或PD-1的细胞。在示例性测定中，可以按1个靶细胞与50个效应细胞的比率使用靶细胞。将靶细胞用BATDA(PerkinElmer)在37℃预标记20分钟，洗涤两次并重悬浮于DMEM、10％热灭活的FBS、2mM L-谷氨酰胺(均来自Invitrogen)中。组合靶(1×104细胞)和效应细胞(0.5×106细胞)，并且将100μl细胞加入96孔U形底部板的孔中。在具有或不具有测试抗体情况下添加另外100μl。将板以200g离心3分钟，在37℃温育2小时，随后再次以200g离心3分钟。从每个孔中取出总共20μl的上清液，然后加入200μl基于DELPHIA Europium的试剂(PerkinElmer)并测定细胞溶解。使数据针对使用0.67％Triton X-100(Sigma Aldrich)的最大细胞毒性和通过在不存在任何抗体的情况下来自靶细胞的BATDA自发释放测定的最小对照标准化。本发明的抗体可诱导ADCC达约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
“抗体依赖性细胞吞噬作用”(“ADCP”)是指通过吞噬细胞(诸如巨噬细胞或树突状细胞)的内化作用消除抗体包被的靶细胞的机制。ADCP可通过如下方式评估：使用单核细胞来源的巨噬细胞作为效应细胞，并使用表达TIM-3或PD-1的Daudi细胞(
Figure BDA0001717945540001031
CCL-213TM)或者B细胞白血病或淋巴瘤或肿瘤细胞作为被工程化为表达GFP或其它标记分子的靶细胞。效应细胞:靶细胞比例可为例如4:1。可在含或不含本发明抗体的情况下，将效应细胞与靶细胞一起温育4小时。在温育后，可使用细胞消化液(accutase)分离细胞。可使用偶联至荧光标记的抗-CD11b抗体和抗-CD14抗体鉴定巨噬细胞，并且可使用标准方法基于CD11+CD14+巨噬细胞中的GFP荧光％确定吞噬百分比。本发明的抗体可诱导ADCP达约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指诱导细胞死亡的机制，其中靶结合抗体的Fc效应域结合并激活补体成分C1q，C1q继而激活补体级联，从而导致靶细胞死亡。补体的激活也可导致补体成分沉积在靶细胞表面上，这些补体成分通过结合白细胞上的补体受体(例如，CR3)来促进ADCC。可例如通过如下方式测量表达TIM-3或PD-1的细胞的CDC：将Daudi细胞以1×105个细胞/孔(50μl/孔)接种到RPMI-B(补充有1％BSA的RPMI)中，将50μl测试抗体以0-100μg/ml之间的最终浓度加入到孔中，将反应在室温下温育15分钟，将11μl的混合人血清加入到孔中，然后将反应在37℃下温育45分钟。可使用标准方法在FACS测定法中检测碘化丙啶染色细胞％作为裂解细胞百分比(％)。本发明的抗体可诱导CDC达约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
本文所述的本发明抗体诱导ADCC的能力可通过工程化其低聚糖组分来增强。人IgG1或IgG3在Asn297处被熟知的双分枝G0、G0F、G1、G1F、G2或G2F形式的大多数聚糖N-糖基化。未工程化的CHO细胞所产生的抗体通常具有约至少85％的聚糖岩藻糖含量。从连接到Fc区的双分枝复合物型低聚糖去除核心岩藻糖，可经由改善的FcγRIIIa结合来增强抗体的ADCC，而不会改变抗原结合或CDC活性。
在一些实施方案中，本发明的抗体在抗体Fc中包含增强抗体效应子功能的至少一个置换。
在一些实施方案中，本发明的抗体在抗体Fc中的氨基酸位置236、239、243、256、267、268、290、292、298、300、305、312、324、326、330、332、333、334、345、360、339、378、396或430处包含至少一个置换。
在一些实施方案中，本发明的抗体在抗体Fc中包含选自以下的至少一个置换：G236A、S239D、F243L、T256A、K290A、R292P、S298A、Y300L、V305L、K326A、A330K、I332E、E333A、K334A、A339T、P396L、S267E、H268F、S324T、K326A、K326W、E333A、E345K、E345Q、E345R、E345Y、E430S、E430F和E430T。
在一些实施方案中，本发明的抗体在抗体Fc中包含选自以下的至少一个置换：S239D/I332E、S298A/E333A/K334A、F243L/R292P/Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L、G236A/S239D/I332E、K326A/E333A、K326W/E333A、H268F/S324T、S267E/H268F、S267E/S324T和S267E/H268F/S324T。
在一些实施方案中，本发明的抗体具有岩藻糖含量为约0％至约15％(例如15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0％)的双分枝聚糖结构。
在一些实施方案中，本发明的抗体具有岩藻糖含量为约50％、40％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0％的双分枝聚糖结构。
Fc中的置换和减少的岩藻糖含量可增强本发明的特异性结合TIM-3或PD-1的拮抗性抗体的ADCC活性。ADCC、ADCP和/或CDC活性增强的TIM-3或PD-1抗体可用于治疗具有表达TIM-3和/或PD-1的肿瘤(包括血红素恶性肿瘤)的患者。
“岩藻糖含量”意指Asn297处糖链内的岩藻糖单糖的量。岩藻糖的相对量为含岩藻糖的结构相对于所有糖结构的百分比。这些可通过多种方法进行表征和定量，例如：1)使用经N-糖苷酶F处理的样本(例如，复合结构、混合结构及低聚甘露糖结构和高甘露糖结构)的MALDI-TOF，如国际专利公布WO2008/077546中所描述；2)通过酶促释放Asn297聚糖，随后衍生化并通过具有荧光检测的HPLC(UPLC)和/或HPLC-MS(UPLC-MS)进行检测/定量；3)在用或不用Endo S或其它酶处理Asn297聚糖的情况下，对天然或还原后的mAb进行完整蛋白分析，所述其它酶在第一GlcNAc单糖和第二GlcNAc单糖之间进行裂解，留下连接至第一GlcNAc的岩藻糖；4)通过酶消化(例如，胰蛋白酶或肽链内切酶Lys-C)将mAb消化为成分肽，随后通过HPLC-MS(UPLC-MS)进行分离、检测和定量；或5)用PNGase F在Asn 297处进行特异性酶促去糖基化，从而将mAb低聚糖与mAb蛋白分离。可通过各种互补技术对释放的低聚糖进行荧光团标记、分离并鉴定，这些技术允许：采用基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱法，通过比较实验质量与理论质量来对聚糖结构进行精细表征；通过离子交换HPLC(GlycoSep C)确定唾液酸化程度；通过正相HPLC(GlycoSep N)，根据亲水性标准分离和定量低聚糖形式；以及通过高效毛细管电泳激光诱导荧光(HPCE-LIF)分离和定量低聚糖。
“低岩藻糖”或“低岩藻糖含量”是指抗体的岩藻糖含量为约0％至15％。
“正常岩藻糖”或“正常岩藻糖含量”是指抗体的岩藻糖含量大约高于50％，通常大约高于60％、70％、80％或高于85％。
本发明的抗体可通过诸如糖基化、异构化、去糖基化或非天然存在的共价修饰(例如添加聚乙二醇部分(聚乙二醇化)和脂质化)等过程进行翻译后修饰。此类修饰可在体内或体外进行。例如，本文所述的本发明的抗体可缀合至聚乙二醇(聚乙二醇化的)以改善其药代动力学特性。缀合可通过本领域技术人员已知的技术来实施。治疗抗体与PEG的缀合已示出增强药效学，同时不干扰功能(Knigh等人，(2004)Platelets 15:409-18；Leong等人，(2001)Cytokine 16:106-19；Yang等人，(2003)Protein Eng16:761-70)。
可经修饰以改善稳定性、选择性、交叉反应性、亲和力、免疫原性或其它所需生物学或生物物理学特性的本发明的抗体在本发明的范围之内。抗体的稳定性受许多因素影响，包括(1)影响其内在稳定性的单独域的核心堆叠，(2)对HC和LC配对具有影响的蛋白质/蛋白质界面相互作用，(3)极性和带电残基的包埋，(4)极性和带电残基的H键网络；以及(5)其它分子内力和分子间力中的表面电荷和极性残基分布(Worn等人，(2001)J MolBiol305:989-1010)。潜在的结构不稳定残基可根据该抗体的晶体结构或在某些情况下通过分子建模来鉴定，并且所述残基对于抗体稳定性的影响可通过生成并评估在所鉴定残基中携带突变的变体来测试。一种增加抗体稳定性的方法是升高由差示扫描量热法(DSC)测量的热转变中间点(Tm)。一般来讲，蛋白质的Tm与其稳定性相关联并且与其对溶液中的解折叠和变性以及依赖于该蛋白质解折叠倾向的降解过程的易感性成反向相关(Remmele等人，(2000)Biopharm 13:36-46)。大量的研究已经发现了通过DSC以热稳定性而测量的制剂物理稳定性的级别与通过其它方法测量的物理稳定性之间的相关性(Gupta等人，(2003)AAPSPharmSci 5E8；Zhang等人，(2004)J Pharm Sci 93:3076-89；Maa等人，(1996)Int JPharm140:155-68；Bedu-Addo等人，(2004)Pharm Res 21:1353-61；Remmele等人，(1997)Pharm Res 15:200-8)。制剂研究提示，Fab Tm对相应mAb的长期物理稳定性有影响。
可通过在血流中内源性循环羧肽酶从注射的抗体中移除C-末端赖氨酸(CTL)(Cai等人，(2011)Biotechnol Bioeng 108:404-412)。在制备期间，可通过控制细胞外Zn2+、EDTA或EDTA–Fe3+的浓度，将CTL移除控制到小于最大水平，如美国专利公布US20140273092中有所描述。抗体中的CTL含量可使用已知方法测定。
在一些实施方案中，本发明的抗体具有约10％至约90％、约20％至约80％、约40％至约70％、约55％至约70％、或约60％的C-末端赖氨酸含量。
在一些实施方案中，本发明的抗体具有约0％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的C-末端赖氨酸含量。
产生同源抗体、具有保守修饰的抗体、以及工程化和修饰抗体的方法
在相比于亲本抗体时氨基酸序列有改变的本发明抗体可使用标准克隆和表达技术产生。例如，可进行定点诱变或PCR介导的诱变以引入突变，并可使用公知的方法和实施例中本文所述的方法评估对抗体结合或其它感兴趣的特性的影响。
抗体同种异型
本发明的抗体可为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
在一些实施方案中，本发明的抗体为IgG1同种型。
在一些实施方案中，本发明的抗体为IgG2同种型。
在一些实施方案中，本发明的抗体为IgG3同种型。
在一些实施方案中，本发明的抗体为IgG4同种型。
治疗性抗体的免疫原性与增大的输液反应风险和减小的治疗反应持续时间相关联(Baert等人，(2003)N Engl J Med 348:602-08)。治疗性抗体在宿主中诱导免疫应答的程度可部分通过抗体的同种异型来测定(Stickler等人，(2011)Genes and Immunity 12:213-21)。抗体同种异型与抗体的恒定区序列中特定位置的氨基酸序列变异相关。
表6示出选择的IgG1、IgG2和IgG4同种异型。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体为G2m(n)、G2m(n-)、G2m(n)/(n-)、nG4m(a)、G1m(17)或G1m(17,1)同种异型。
在一些实施方案中，本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体为G2m(n)、G2m(n-)、G2m(n)/(n-)、nG4m(a)、G1m(17)或G1m(17,1)同种异型。
在一些实施方案中，本发明的双特异性PD-1/TIM-3抗体为G2m(n)、G2m(n-)、G2m(n)/(n-)、nG4m(a)、G1m(17)或G1m(17,1)同种异型。
表6：
Figure BDA0001717945540001071
Figure BDA0001717945540001081
抗独特型抗体
本发明提供结合本发明抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合本发明的抗-PD-1抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:41的VH和SEQ ID NO:49的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:41的VH和SEQ ID NO:50的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:42的VH和SEQ ID NO:51的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:42的VH和SEQ ID NO:52的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:42的VH和SEQ ID NO:53的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:43的VH和SEQ ID NO:49的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:43的VH和SEQ ID NO:54的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:43的VH和SEQ ID NO:50的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:43的VH和SEQ ID NO:55的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:43的VH和SEQ ID NO:56的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:43的VH和SEQ ID NO:57的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:44的VH和SEQ ID NO:49的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:49的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:46的VH和SEQ ID NO:49的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:47的VH和SEQ ID NO:49的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:53的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:52的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:56的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:47的VH和SEQ ID NO:58的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:47的VH和SEQ ID NO:59的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:60的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:61的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:62的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:63的VH和SEQ ID NO:65的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:64的VH和SEQ ID NO:65的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:145的VH和SEQ ID NO:155的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:146的VH和SEQ ID NO:156的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:148的VH和SEQ ID NO:157的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:147的VH和SEQ ID NO:155的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:149的VH和SEQ ID NO:158的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:150的VH和SEQ ID NO:159的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:151的VH和SEQ ID NO:160的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:152的VH和SEQ ID NO:161的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:153的VH和SEQ ID NO:162的VL的抗体的抗独特型抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:154的VH和SEQ ID NO:163的VL的抗体的抗独特型抗体。
在一些实施方案中，试剂盒包含含有SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:56的VL的特异性结合PD-1的拮抗性抗体。
在一些实施方案中，试剂盒包含含有SEQ ID NO:64的VH和SEQ ID NO:65的VL的特异性结合PD-1的拮抗性抗体。
本发明还提供特异性结合包含SEQ ID NO:172的VH和SEQ ID NO:173的VL的抗体的抗独特型抗体。
在一些实施方案中，抗独特型抗体用于检测样本中治疗性抗体(例如，本文所述的本发明抗-PD-1、抗-TIM-3或双特异性PD-1/TIM-3抗体)的水平。
抗独特型(Id)抗体是识别抗体的抗原决定簇(例如互补位或CDR)的抗体。Id抗体可为抗原封闭性或非封闭性的。抗原封闭性Id可用于检测样本中的游离抗体(例如，本文所述的本发明抗-PD-1、抗-TIM-3或双特异性PD-1/TIM-3抗体)。非封闭性Id可用于检测样本中的总抗体(游离，部分结合于抗原，或完全结合于抗原的抗体)。Id抗体可通过用抗体对正在制备抗Id的动物免疫来制备。
抗Id抗体还可以用作免疫原以在另一动物中诱导免疫应答，从而产生所谓的抗-抗Id抗体。抗-抗-Id抗体可与诱导抗-Id的初始单克隆抗体在表位上相同。因此，通过使用针对单克隆抗体的独特型决定簇的抗体，可以识别出表达相同特异性抗体的其它克隆。抗Id抗体可以改变(从而产生抗Id抗体变体)并且/或者通过任何合适的技术衍生化，例如在本文其它地方针对特异性结合PD-1或TIM-3的抗体、或双特异性PD-1/TIM-3抗体所述的那些。
免疫缀合物
“免疫缀合物”是指缀合至一个或多个异源分子的本发明的抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗体缀合至一种或多种细胞毒素剂或成像剂。
示例性细胞毒素剂包括化疗剂或化疗药、生长抑制剂、毒素(例如蛋白毒素，细菌、真菌、植物、或动物来源的酶活性毒素或其片段)、以及和放射性核素。
细胞毒素剂可为一种或多种药物，诸如mayatansinoid(参见例如美国专利5,208,020、5,416,06)，奥瑞斯他汀诸如一甲基澳瑞他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见例如美国专利5,635,483和5,780,588、以及7,498,298)、多拉司它汀、卡里奇霉素或它们的衍生物(参见例如美国专利5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296；Hinman等人，(1993)Cancer Res53:3336-3342；和Lode等人，(1998)Cancer Res 58:2925-2928)；蒽环类抗生素诸如道诺霉素或多柔比星(参见例如Kratz等人，(2006)Current Med.Chem 13:477-523；Jeffrey等人，(2006)Bioorganic&MedChem Letters16:358-362；Torgov et等人，(2005)Bioconj Chem 16:717-721；Nagy等人，(2000)Proc Natl Acad Sci USA 97:829-834；Dubowchik等人，Bioorg.&Med.Chem.Letters 12:1529-1532(2002)；King等人，(2002)J Med Chem 45:4336-4343；和美国专利6,630,579)、甲氨蝶呤、长春地辛、紫杉烷诸如多西他赛、紫杉醇、拉洛他赛、tesetaxel和奥他赛。
细胞毒素剂也可为酶促活性毒素或其片段，诸如白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白质、香石竹毒蛋白、美洲商陆(Phytolacca americana)蛋白质(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒素、巴豆毒素、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、迈托毒素、局限曲霉素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯族化合物。
细胞毒素剂或成像剂也可为放射性核素。示例性放射性核素包括Ac-225、At-211、1-131、I-125、Y-90、Re-186、Re-188、Sm-153、Bi-212、P-32、Pb-212和Lu的放射性同位素。当使用放射性缀合物进行检测时，其可包含用于闪烁成像研究的放射性原子，例如Tc-99m或I-123，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记物，诸如I-123、I-131、In-111、F-19、C-13、N-15或O-17。
本发明的抗体和异源分子的缀合可使用多种双功能蛋白偶联剂进行，所述双功能蛋白偶联剂为诸如N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-l-羧酸酯(SMCC)、亚氨基噻吩(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(诸如，二甲基己二酰亚胺盐HQ)、活性酯(诸如，双琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(诸如，戊二醛)、双-叠氮化合物(诸如，双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如，双(对重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如，甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如，l,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如VVitetta等人，(1987)Science238:1098中所述制备。C14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二乙烯三氨五乙酸(MX-DTPA)是使放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂。参见，例如，W094/11026。接头可为“可裂解接头”，从而促进细胞毒性药物在细胞中释放。例如，可使用酸不稳定性接头、肽酶敏感性接头、光不稳定性接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Chari等人，(1992)Cancer Res 52:127-131；美国专利5,208,020)。
本发明的抗体与异源分子的缀合物可使用可商购获得(例如得自PierceBiotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)的交联剂诸如BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、硫代-EMCS、硫代-GMBS、硫代-KMUS、硫代-MBS、硫代-SIAB、硫代-SMCC、和硫代-SMPB、以及SVSB(琥珀酰亚胺-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)进行制备。
本发明还提供一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含与治疗剂或成像剂连接的本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体。
本发明还提供一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含与治疗剂或成像剂连接的本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体。
本发明还提供一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含与治疗剂或成像剂连接的本发明的双特异性PD-1/TIM-3抗体。
本发明的单特异性抗体的产生
在一些实施方案中，本发明的抗体是人的。
在一些实施方案中，本发明的抗体是人源化的。
本文所述的本发明的单特异性抗体(例如特异性结合PD-1或TIM-3的抗体)可使用各种技术产生。例如，可使用Kohler和Milstein,Nature256:495,1975所述的杂交瘤方法来产生单克隆抗体。在杂交瘤方法中，用PD-1或TIM-3的人或cyno PD-1或TIM-3片段(诸如PD-1或TIM-3的胞外域)来免疫小鼠或其它宿主动物(诸如仓鼠、大鼠或猴)，之后使用标准方法将来自免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding,MonoclonalAntibodies:Principles and Practice，第59-103页(Academic Press,1986))。筛选出由单个永生化杂交瘤细胞产生的菌落，用以制备具有所需特性(诸如结合特异性、交叉反应性或缺乏结合特异性、缺乏交叉反应性，以及抗原的亲和力)的抗体。
可使用各种宿主动物来产生本发明的抗体。例如，可使用Balb/c小鼠来产生小鼠抗人PD-1或TIM-3抗体。可使用各种技术来人源化由Balb/c小鼠和其它非人动物制备的抗体，从而产生更类似人的序列。
包括选择人受体框架的示例性人源化技术是已知的，并且包括CDR接枝(美国专利5,225,539)、SDR接枝(美国专利6,818,749)、表面重塑(Padlan,(1991)Mol Immunol 28:489-499)、特异性决定残基表面重塑(美国专利公布2010/0261620)、人框架改型(美国专利8,748,356)或超人源化(美国专利7,709,226)。在这些方法中，亲本抗体的CDR被转移到人框架上，该人框架可基于其与亲本框架的总体同源性，基于CDR长度的相似性、或规范结构同一性、或它们的组合进行选择。
可通过如下过程进一步优化人源化抗体以改善其对所需抗原的选择性或亲和力：通过采用诸如国际专利公布WO1090/007861和WO1992/22653中所述的技术，引入修改的框架支持残基来保持结合亲和力(回复突变)，或者通过在任何CDR处引入变体例如来改善抗体的亲和力。
基因组中携带人免疫球蛋白(Ig)基因座的转基因动物(诸如小鼠或大鼠)可用于生成抗目标蛋白质的人抗体，这在例如美国专利6,150,584、国际专利公布WO99/45962、国际专利公布WO2002/066630、WO2002/43478、WO2002/043478和WO1990/04036,Lonberg等人(1994)Nature 368:856-9；Green等人(1994)Nature Genet.7:13-21；Green&Jakobovits(1998)Exp.Med.188:483-95；Lonberg和Huszar(1995)Int Rev Immunol 13:65-93；Bruggemann等人，(1991)Eur J Immunol 21:1323-1326；Fishwild等人，(1996)NatBiotechnol 14:845-851；Mendez等人，(1997)Nat Genet 15:146-156；Green(1999)JImmunol Methods 231:11-23；Yang等人，(1999)Cancer Res 59:1236-1243；Brüggemann和Taussig(1997)Curr Opin Biotechnol 8:455-458中有所描述。可破坏此类动物中的内源性免疫球蛋白基因座或使该基因座缺失，并且可使用转染色体或微小基因，通过同源或非同源重组将至少一种完整或部分的人免疫球蛋白基因座插入动物基因组中。可邀请诸如Regeneron(http://_www_regeneron_com)、Harbour Antibodies(http://_www_harbourantibodies_com)、Open Monoclonal Technology,Inc.(OMT)(http://_www_omtinc_net)、KyMab(http://_www_kymab_com)、Trianni(http://_www.trianni_com)和Ablexis(http://_www_ablexis_com)等公司使用上述技术以提供抗所选抗原的人抗体。
人抗体可选自噬菌体展示文库，其中噬菌体被工程化以表达人免疫球蛋白或其部分，诸如Fab、单链抗体(scFv)或者未配对或配对抗体可变区(Knappik等人，(2000)J MolBiol 296:57-86；Krebs等人，(2001)J Immunol Meth 254:67-84；Vaughan等人，(1996)Nature Biotechnology14:309-314；Sheets等人，(1998)PITAS(USA)95:6157-6162；Hoogenboom和Winter(1991)J Mol Biol 227:381；Marks等人，(1991)J Mol Biol222:581)。可例如用噬菌体pIX外壳蛋白从将抗体重链和轻链可变区表达为融合蛋白的噬菌体展示文库中分离出本发明的抗体，如Shi等人，(2010)J Mol Biol 397:385-96和国际专利公布WO09/085462中所述。可从文库中筛选结合到人和/或cyno PD-1或TIM-3的噬菌体，并可进一步表征所获得的阳性克隆，从克隆裂解物中分离Fab，并将其表达为全长IgG。用于分离人抗体的此类噬菌体展示方法描述于例如：美国专利5,223,409、5,403,484、5,571,698、5,427,908、5,580,717、5,969,108、6,172,197、5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。
免疫源性抗原的制备以及单克隆抗体的产生可用任何合适的技术诸如重组蛋白产生来进行。免疫原性抗原可以纯化蛋白质或蛋白质混合物(包括全细胞或细胞提取物或组织提取物)的形式施用于动物，或抗原可在动物体内由编码所述抗原或其部分的核酸从头形成。
本发明的双特异性PD-1/TIM-3抗体的产生
本发明的双特异性PD-1/TIM-3抗体(例如包含特异性结合PD-1的第一域和特异性结合TIM-3的第二域的双特异性抗体)可通过使本文分离和表征的PD-1结合VH/VL域与TIM-3结合VH/VL域相结合来产生。另选地，双特异性PD-1/TIM-3抗体可如下进行工程改造：使用得自可公开获得的单特异性抗-PD-1和抗-TIM-3抗体的VH/VL域，并且/或者通过将本文鉴定的PD-1或TIM-3结合VH/VL域与可公开获得的PD-1或TIM-3结合VH/VL域进行混合-匹配。
可用于工程化双特异性PD-1/TIM-3分子的示例性抗-PD-1抗体是描述于例如美国专利5,897,862和7,488,802、以及国际专利公布WO2004/004771、WO2004/056875、WO2006/121168、WO2008/156712、WO2010/029435、WO2010/036959、WO2011/110604、WO2012/145493、WO2014/194302、WO2014/206107、WO2015/036394、WO2015/035606、WO2015/085847、WO2015/112900和WO2015/112805中的那些。例如，可使用
Figure BDA0001717945540001151
(派姆单抗)和
Figure BDA0001717945540001152
(纳武单抗)的VH/VL域。可将这些PD-1VH/VL域并入包含本文和表3中所述的TIM-3结合VH/VL域的双特异性抗体中。例如，本文所述的TIM-3抗体TM3B103、TM3B105、TM3B107、TM3B108、TM3B109、TM3B113、TM3B189、TM3B190和TM3B196的VH/VL域可用于产生双特异性TIM-3/TIM-3抗体。
相似地，可用于工程化双特异性PD-1/TIM-3分子的示例性抗-TIM-3抗体是描述于例如国际专利公布WO2011/155607、WO2013/006490和WO2015/117002中的那些。可将这些TIM-3VH/VL域并入包含本文和表2中所述的PD-1结合VH/VL域的双特异性抗体中。例如，本文所述的PD-1抗体PD1B114、PD1B149、PD1B160、PD1B162、PD1B164、PD1B11、PD1B183、PD1B184、PD1B185、PD1B187、PD1B192、PD1B71、PD1B177、PD1B70、PD1B175、PD1B194、PD1B195、PD1B196、PD1B197、PD1B198、PD1B199、PD1B200、PD1B201、PD1B131和PD1B132的VH/VL域可用于产生双特异性PD-1/TIM-3抗体。
可使用本文所述的方法测试所产生的双特异性PD-1/TIM-3抗体与PD-1和TIM-3的结合、其期望的功能特征，诸如抗原特异性CD4+和CD4+T细胞活化的增强。
本发明的双特异性抗体包括具有全长抗体结构的抗体。
全长双特异性抗体可以例如使用两个单特异性二价抗体之间的Fab臂交换(或半分子交换，在重链-轻链对上交换)通过下列方式产生：在每个半分子中的重链CH3交界处引入突变以促成两个在体外无细胞环境中或使用共表达而具有不同特异性的抗体半分子的异源二聚体形成。Fab臂交换反应是二硫键异构化反应和CH3域解离-缔合的结果。亲本单特异性抗体的铰链区中的重链二硫键减少。亲本单特异性抗体之一的所得游离半胱氨酸与第二亲本单特异性抗体分子的半胱氨酸残基形成重链间二硫键，同时亲本抗体的CH3域通过解离-缔合而释放和重新形成。可以将Fab臂的CH3域改造成促成异源二聚化而非同源二聚化。所得产物是具有两个Fab臂或半分子的双特异性抗体，这两个Fab臂或半分子各自结合不同的表位。就IgG1抗体而言，可使用一个重链中的突变F405L和另一个重链中的K409R。就IgG2抗体而言，可使用野生型IgG2和具有F405L和R409K置换的IgG2抗体。为了产生双特异性抗体，将第一单特异性二价抗体和第二单特异性二价抗体被工程化为在Fc区中具有F405L或K409R突变，使抗体在足以允许半胱氨酸在铰链区发生二硫键异构化的还原条件下一起温育；从而通过Fab臂交换产生双特异性抗体。温育条件最理想地可恢复到非还原条件。可使用的示例性还原剂为2-巯基乙胺(2-MEA)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、谷胱甘肽、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱氨酸和β-巯基乙醇。例如，可使用如下条件：在至少25mM 2-MEA的存在下或至少0.5mM二硫苏糖醇的存在下，在5-8的pH例如pH7.0或pH7.4，至少20℃的温度下，温育至少90分钟。
双特异性抗体也可使用诸如钮扣(Genentech)、CrossMAbs(Roche)和静电匹配(Chugai,Amgen,NovoNordisk,Oncomed)、LUZ-Y(Genentech)、Strand ExchangeEngineered Domain body(SEEDbody)(EMD Serono)、以及Biclonic(Merus)的设计产生。
“钮扣”策略(参见，例如国际公布WO 2006/028936)可用于产生本发明的全长双特异性抗体。简而言之，在人IgG中形成CH3域的交界的选定氨基酸可在影响CH3域相互作用的位置处突变，从而促进异源二聚体形成。将具有小侧链(扣)的氨基酸引入特异性地结合第一抗原的抗体的重链中，并将具有大侧链(钮)的氨基酸引入特异性地结合第二抗原的抗体的重链中。在两种抗体共表达后，由于具有“扣”的重链与具有“钮”的重链的优先相互作用而形成异源二聚体。形成钮和扣的示例性CH3置换对(表示为第一重链的第一CH3域中的修饰位置/第二重链的第二CH3域中的修饰位置)是：T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S和T366W/T366S_L368A_Y407V。
CrossMAb技术可用于产生本发明的全长双特异性抗体。除利用“钮扣”策略促进Fab壁交换之外，CrossMAb在半臂之一中具有交换的CH1和CL域，以确保所得的双特异性抗体正确的轻链配对(参见例如美国专利8,242,247)。
可使用其它交换策略如下产生本发明的全长双特异性抗体：在双特异性抗体的一个或两个臂中，在重链与轻链之间或重链之内交换可变域或恒定域、或这两种域。这些交换包括例如VH-CH1与VL-CL、VH与VL、CH3与CL以及CH3与CH1，如在国际专利公布WO2009/080254、WO2009/080251、WO2009/018386和WO2009/080252中有所描述。
还可使用其它技术，诸如通过在一个CH3表面置换带正电荷的残基并在另一CH3表面置换带负电荷的残基使用静电相互作用促进重链异源二聚化，如美国专利公布US2010/0015133；美国专利公布US2009/0182127；美国专利公布US2010/028637或美国专利公布US2011/0123532。在其它技术中，可通过下面的置换(表示为第一重链的第一CH3域中的修饰位置/第二重链的第二CH3域中的修饰位置)促进异源二聚化：L351Y_F405A_Y407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、Y407A/T366A_K409F、或T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W，如美国专利公布US2012/0149876或美国专利公布US2013/0195849中有所描述。
LUZ-Y技术可用于产生本发明的双特异性抗体。在该技术中，将亮氨酸拉链加入CH3域的C末端，以驱动由亲本单克隆抗体装配异源二聚体，该亲本单克隆抗体经后纯化移除，如Wranik等人，(2012)J Biol Chem287(52):42221-9中有所描述。
SEEDbody技术可用于产生本发明的双特异性抗体。SEEDbodies在其恒定域中具有所选择的经IgA残基取代的IgG残基，以促进异源二聚化，如在美国专利US20070287170中有所描述。
通常使用标准方法以DNA水平到分子水平(诸如抗体的恒定域)上进行突变。
本发明的抗体可被工程为各种公知的抗体形式。
在一些实施方案中，双特异性抗体包含：重组IgG样双靶向分子，其中该分子的两侧各自含有至少两种不同抗体的Fab片段或Fab片段的一部分；IgG融合分子，其中全长IgG抗体与额外的Fab片段或Fab片段的部分融合；Fc融合分子，其中单链Fv分子或稳定的双体抗体与重链恒定域、Fc区或其部分融合；Fab融合分子，其中不同的Fab片段融合在一起；基于ScFv和双体抗体的重链抗体(例如域抗体、纳米抗体)，其中不同的单链Fv分子或不同的双体抗体或不同的重链抗体(例如域抗体、纳米抗体)彼此融合或与另一蛋白或载体分子融合。
多核苷酸、载体和宿主细胞
本发明还提供具有特定VH和VL序列的特异性结合PD-1、TIM-3、或PD-1与TIM-3的拮抗性抗体，其中抗体VH由第一多核苷酸编码并且抗体VL由第二多核苷酸编码。多核苷酸可为互补脱氧核酸(cDNA)，并且可经密码子优化以在合适的宿主中表达。密码子优化是公知的技术。
本发明还提供编码本发明抗体的VH、本发明抗体的VL、本发明抗体的重链或本发明抗体的轻链的分离的多核苷酸。
本发明还提供编码本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体的VH、VL、或VH与VL的分离的多核苷酸。
本发明还提供编码SEQ ID NO:41、42、43、44、45、46、47、48、63或64的VH的分离的多核苷酸。
本发明还提供编码SEQ ID NO:49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或65的VL的分离的多核苷酸。
本发明还提供包含SEQ ID NO:196、197、198、199、200、201、202或203的多核苷酸序列的分离的多核苷酸。
本发明还提供编码本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体的VH、VL、或VH与VL的分离的多核苷酸。
本发明还提供编码SEQ ID NO:145、146、147、148、149、150、151、152、153、154或172的VH的分离的多核苷酸。
本发明还提供编码SEQ ID NO:155、156、157、158、159、160、161、162、163或173的VL的分离的多核苷酸。
本发明还提供包含SEQ ID NO:204、205、206、207、208、209、210或211的多核苷酸序列的分离的多核苷酸。
本发明还提供编码本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体的HC1、LC1、或HC2或LC2的分离的多核苷酸。
本发明还提供编码SEQ ID NO:186、187、241、242或243的HC1的分离的多核苷酸。
本发明还提供编码SEQ ID NO:188或189的LC1的分离的多核苷酸。
本发明还提供编码SEQ ID NO:190、191、192、244、245、246、247或248的HC2的分离的多核苷酸。
本发明还提供编码SEQ ID NO:193、194或195的LC2的分离的多核苷酸。
本发明还提供包含SEQ ID NO:253、254、255、256、257、258、259和260的多核苷酸序列的分离的多核苷酸。
SEQ ID NO:196(PD1H170)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCAGCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCGGCACCTTTAGCAGCTATGCGATTAGCTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCGGCATTATTCCGATTTTTGACACCGCGAACTATGCGCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATTACCGCGGATGAAAGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCCCTGGTCTCGCTGCGGCTTATGATACTGGTTCCTTGGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
SEQ ID NO:197(PD1L148)
GAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGAGCCCGGGCGAACGCGCGACCCTGAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCGTTCGCTCCTACCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCAGGCGCCGCGCCTGCTGATCTACGACGCGAGCAATCGTGCGACCGGCATTCCGGCGCGCTTTAGCGGCTCCGGTAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCGGAAGATTTTGCGGTGTATTATTGCCAGCAACGTAATTATTGGCCGCTGACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAAATTAAA
SEQ ID NO:198(PD1H129)
GAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCGCCTTCAGCAGATACGACATGAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAAAGCGTGGCCTACATCTCTGGCGGAGGCGCCAACACCTACTACCTGGACAACGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCTCCCCCTACCTGAGCTACTTCGACGTGTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGTGTCATCT
SEQ ID NO:199(PD1L62)
GAGATCGTGATGACCCAGAGCCCTGCCACCCTGTCCGTGTCTCCAGGCGAAAGAGCCACCCTGAGCTGCAGAGCCAGCCAGAGCCTGAGCGACTACCTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGACTGCTGATCAAGTCTGCCAGCCAGTCCATCAGCGGCATCCCCGCCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGAGTTCACCCTGACAATCAGCAGCCTGCAGAGCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGAACGGCCACAGCTTCCCTTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
SEQ ID NO:200(PD1H163)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCAGCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCGGCACCTTCAAGTCCTATGTGATTCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCGGTATTATCCCAATTTTTGGCACCGCCAATTATGCGCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATTACCGCTGATGAAAGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGGTTATGTGCGGGCTACGGGCATGTTGGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
SEQ ID NO:201(PD1L185)
GAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGAGCCCGGGCGAACGCGCGACCCTGAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCGTTAGCAATTATCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCAGGCGCCGCGCCTGCTGATCTACGACGCCAGCAATCGCGCGACCGGCATTCCGGCGCGCTTTAGCGGCTCCGGTAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCGGAAGATTTTGCGGTGTATTATTGCCAGCAACGTGCATATTGGCCGCTGACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAAATTAAA
SEQ ID NO:202(PD1H164)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCAGCAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCGGCACCTTCAGCGATTATGTGATTTCCTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCGGTATTATCCCGATTTACGGGACCGCTAACTATGCGCAGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATTACCGCTGATGAAAGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGGTACCCTCGACCGGACCGGGCATTTGGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
SEQ ID NO:203(PD1L86)
GAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGAGCCCGGGCGAACGCGCGACCCTGAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCGTCTCCTCCTACCTTGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCAGGCGCCGCGCCTGCTGATCCACGACGCCTCTACGCGTGCGACCGGCATTCCGGCGCGCTTTAGCGGCTCCGGTAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCGGAAGATTTTGCGGTGTATTATTGCCAGCAACGTAATTATTGGCCGCTCACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAAATTAAA
SEQ ID NO:204(TM3H24)
GAAGTGCAGCTGCTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCGGGCGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCGGCAAGCGGCTTTACCTTTAGCAGCTATGCGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGAGCGCGATTAGCGGCAGCGGCGGCAGCACCTATTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGCTTTACCATTAGCCGCGATAACAGCAAAAACACCCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCGGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGAAATCCCCGTACGCGCCCTTGGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
SEQ ID NO:205(TM3L33)
GAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGAGCCCGGGCGAACGCGCGACCCTTAGCTGCCGTGCAAGTCAGAGTGTGAACGACTACCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCAGGCGCCGCGCCTGCTGATTTATGATGCGAGCAACCGCGCGACCGGCATTCCGGCGCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCGGAAGATTTTGCGGTGTATTATTGCCAGCAGGGTGGTCACGCGCCGATCACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAAATTAAA
SEQ ID NO:206(TM3H162)
GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAGCCTGGCGAGAGCCTGAAGATCAGCTGCAAGGGCAGCGGCTACAGCTTCACCAGCTACTGGATGCAGTGGGTGCGCCAGATGCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGATGGGCGCCATCTATCCCGGCGACGGCGACATCAGATACACCCAGAACTTCAAGGGCCAAGTGACCATCAGCGCCGACAAGAGCATCAGCACCGCCTACCTGCAGTGGTCCAGCCTGAAGGCCAGCGACACCGCCATGTACTACTGTGCCAGATGGGAGAAGTCCACCACCGTGGTGCAGCGGAACTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACCGTGTCTAGT
SEQ ID NO:207(TM3L85)
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACATGCAAGGCCAGCGAGAACGTGGGCACCTTCGTGTCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGGCGCCAGCAACAGATACACCGGCGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCTAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCGGCCAGAGCTACAGCTACCCCACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAG
SEQ ID NO:208(TM3H21)
GAAGTGCAGCTGCTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCGGGCGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCGGCGAGCGGCTTTACCTTTAGCAACTATTGGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGAGCGCGATTAGCGGCAGCGGCGGCAGCACCTATTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGCTTTACCATTAGCCGCGATAACAGCAAAAACACCCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCGGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGAAAGATCATTGGGATCCCAATTTTTTGGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
SEQ ID NO:209(PH9L1)
GAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGGCACCCTGAGCCTGAGCCCGGGCGAACGCGCGACCCTGAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCGTGAGCAGCAGCTATCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCAGGCGCCGCGCCTGCTGATTTATGGCGCGAGCAGCCGCGCGACCGGCATTCCGGATCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCCGCCTGGAACCGGAAGATTTTGCGGTGTATTATTGCCAGCAGTATGGCAGCAGCCCGCTGACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAAATTAAA
SEQ ID NO:210(TM3H65)
GAAGTGCAGCTGCTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCGGGCGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCGGCGAGCGGCTTTACCTTTAGCGACTATTGGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGGTGAGCGTGATCAAGTATAGCGGTGGCTCCAAATATTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGCTTTACCATTAGCCGCGATAACAGCAAAAACACCCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCGGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGAAAGAGCTGGAGGGGGTGTTCGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
SEQ ID NO:211(TM3L12)
GAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGGCACCCTGAGCCTGAGCCCGGGCGAACGCGCGACCCTGAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCGTTAGCAATAGCACTCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCCAGGCGCCGCGCCTGCTGATTTATACTGCGAGCAGCCGCGCGACCGGCATTCCGGATCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCCGCCTGGAACCGGAAGATTTTGCGGTGTATTATTGCCAGCAGTCTTACACATCTCCGTGGACTTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAAATTAAA
编码本发明抗体的VH或VL或其抗原结合片段、或本发明抗体的重链和轻链的多核苷酸序列能够有效连接至一个或多个调控元件，诸如启动子或增强子，该调控元件允许核苷酸序列在预期宿主细胞中的表达。多核苷酸可为cDNA。
本发明还提供了包含本发明的多核苷酸的载体。此类载体可以是质粒载体、病毒载体、用于杆状病毒表达的载体、基于转座子的载体或任何其它适于通过任何手段将本发明的合成多核苷酸引入给定生物体或遗传背景的载体。例如，将可任选地与恒定区连接的编码本发明抗体的轻链可变区和/或重链可变区的多核苷酸插入表达载体中。轻链和/或重链可被克隆在相同或不同的表达载体中。可将编码免疫球蛋白链的DNA片段可操作地连接到确保免疫球蛋白多肽表达的一个或多个表达载体中的对照序列。对此类对照序列包括信号序列、启动子(例如，天然相关联的或异源的启动子)、增强子元件和转录终止子序列进行选择，以使其与选择用于表达抗体的宿主细胞相容。载体被结合到适当的宿主后，将宿主保持在适于蛋白质的高水平表达的条件下，所述蛋白质由结合的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:196和197的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:198和199的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:200和201的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:202和203的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:204和205的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:206和207的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:208和209的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:210和211的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:253和254的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:255和256的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:257和258的多核苷酸。
在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:259和260的多核苷酸。
合适的表达载体通常可以在宿主生物体中作为游离基因或宿主染色体DNA的一部分进行复制。通常，表达载体包含选择标记，诸如氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性、卡那霉素抗性或新霉素抗性，以便对那些转化了所需DNA序列的细胞进行检测。
合适的启动子和增强子元件是本领域已知的。为了在真核细胞中表达，示例性启动子包括轻链和/或重链免疫球蛋白基因启动子和增强子元件；巨细胞病毒立即早期启动子；单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；早期和晚期SV40启动子；逆转录病毒长末端重复序列中存在的启动子；小鼠金属硫蛋白-I启动子；以及各种已知的组织特异性启动子。选择适当的载体和启动子在本领域普通技术人员的水平范围内。
可使用的示例性载体为细菌：pBs、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBsKS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene,La Jolla,Calif.,USA)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540和pRIT5(Pharmacia,Uppsala,Sweden)。真核：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(Pharmacia)、pEE6.4(Lonza)和pEE12.4(Lonza)。
本发明还提供包含本发明的一个或多个载体的宿主细胞。“宿主细胞”是指已引入载体的细胞。应该理解，术语宿主细胞不仅旨在指特定的主体细胞，还指此类细胞的子代，并且也指特定主体细胞所产生的稳定细胞系。因为由于突变或者由于环境影响，在后代中可发生某些修饰，因此这种子代可与母体细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。此类宿主细胞可以是真核细胞、原核细胞、植物细胞或古菌细胞。原核宿主细胞的示例是大肠杆菌(Escherichia coli)、杆菌属(bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和其它肠杆菌科(enterobacteriaceae)诸如沙门氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)以及各种假单胞菌属(Pseudomonas)物种。其他微生物诸如酵母也可用于表达。酵母属(Saccharomyces)(例如，酿酒酵母(S.Cerevisiae))和毕赤酵母是合适的酵母宿主细胞的示例。示例性真核细胞可以是哺乳动物、昆虫、禽类或其它动物来源。哺乳动物真核细胞包括无限增殖化细胞系，诸如杂交瘤或骨髓瘤细胞系，诸如SP2/0(美国典型培养物保藏中心(ATCC),Manassas,VA,CRL-1581)、NS0(欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC),Salisbury,Wiltshire,UK,ECACC No.85110503)、FO(ATCC CRL-1646)和Ag653(ATCC CRL-1580)鼠细胞系。一种示例性人骨髓瘤细胞系是U266(ATTC CRL-TIB-196)。其它可用的细胞系包括衍生自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的那些细胞系，诸如CHOK1SV(Lonza Biologics,Walkersville,MD)、
Figure BDA0001717945540001261
CHOK2SV(Lonza)、CHO-K1(ATCC CRL-61)或DG44。
本发明还提供一种制备本发明的抗体的方法，该方法包括在表达抗体的条件下培养本发明的宿主细胞，并且回收由宿主细胞产生的抗体。制备抗体并将其纯化的方法是本领域所熟知的。一旦被合成(以化学方式或重组方式)后，全部抗体、其二聚体、单个轻链和/或重链、或者其它抗体片段诸如VH和/或VI，可以根据标准程序进行纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和色谱柱、柱层析法、高效液相色谱(HPLC)纯化、凝胶电泳等等(参见generally Scopes,Protein Purification(Springer-Verlag,N.Y.,(1982))。受试者抗体可以基本上是纯净的，例如，至少约80％至85％纯净、至少约85％至90％纯净、至少约90％至95％纯净、或者至少约98％至99％纯净，或者更加纯净，例如，不含污染物，诸如细胞碎片、除受试者抗体之外的大分子等。
可使用标准分子生物方法将本发明的多核苷酸序列结合到载体中。使用熟知的方法完成宿主细胞转化、培养、抗体表达和纯化。本发明的另一个实施方案是制备本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体的方法，该方法包括：
将编码抗体的VH的第一多核苷酸和编码抗体的VL的第二多核苷酸引入表达载体中；
用表达载体转化宿主细胞；
在使VL和VH表达并形成抗体的条件下，将宿主细胞在培养基中进行培养；以及
从宿主细胞或培养基中回收抗体。
本文所述的本发明的另一个实施方案是制备本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体的方法，该方法包括：
将编码抗体的VH的第一多核苷酸和编码抗体的VL的第二多核苷酸引入表达载体中；
用表达载体转化宿主细胞；
在使VL和VH表达并形成抗体的条件下，将宿主细胞在培养基中进行培养；以及
从宿主细胞或培养基中回收抗体。
本文所述的本发明的以及下文所列所有带编号的实施方案的一些实施方案中的编码特定VH或VL序列的多核苷酸可使用标准分子生物学方法引入到载体中。使用熟知的方法完成宿主细胞转化、培养、抗体表达和纯化。
药物组合物/施用
本发明提供包含本发明的抗体以及药学上可接受的载体的药物组合物。就治疗性用途而言，可将本发明的抗体制备为药物组合物，该药物组合物含有有效量的抗体作为药学可接受的载体中的活性成分。“载体”指本发明抗体与之一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类媒介物可以是液体，诸如水和油，包括来源于石油、动物、植物的油或合成的那些油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。例如，可使用0.4％盐水和0.3％甘氨酸。这些溶液是无菌的，并且通常不含颗粒物。它们可通过熟知的常规灭菌技术(例如过滤)进行灭菌。组合物可根据需要含有药学可接受的辅助物质，以接近生理条件，例如pH调节剂和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。在此类药物制剂中本发明的抗体的浓度可从按重量计小于约0.5％，通常到至少约1％到多达15或20％改变，且可根据所选择的具体施用方式，主要基于所需剂量、流体体积、粘度等进行选择。包含其它人蛋白(例如，人血清白蛋白)在内的合适的媒介物和制剂在例如Remington:The Science and Practice ofPharmacy，第21版，Troy,D.B.编辑，Lipincott Williams and Wilkins,Philadelphia,PA2006，第5部分，Pharmaceutical Manufacturing，第691-1092页(特别参见第958-989页)中有所描述。
用于本发明的抗体的治疗性用途的施用模式可以是将抗体递送至宿主的任何合适途径，诸如胃肠外施用，例如真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下、肺部，经粘膜(口腔、鼻内、阴道内、直肠)，使用片剂、胶囊、溶液、粉末、凝胶、颗粒形式的制剂；以及包含在注射器、植入装置、渗透泵、盒、微型泵中；或本领域中熟知的技术人员理解的其它方式。可通过例如以下方式实现位点特异性施用：瘤内、胃肠外、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈管内、胃内、肝内、心脏内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、血管内、膀胱内、病灶内、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或经皮递送。
本发明的抗体可通过任何合适的途径施用给受试者，例如通过静脉内(i.v.)输注或弹丸式注射以非肠道方式、以肌肉内方式或皮下方式或腹膜内方式。可在例如15分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、180分钟或240分钟内，或1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时或12小时内给予静脉内输注。
向受试者给予的剂量足以缓解或至少部分地遏止正在治疗的疾病(“治疗有效量”)，并且有时可为0.005mg/kg至约100mg/kg，例如约0.05mg/kg至约30mg/kg，或约5mg/kg至约25mg/kg，或约4mg/kg，约8mg/kg，约16mg/kg或约24mg/kg，或例如约1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg，但可甚至更高，例如约15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、21mg/kg、22mg/kg、23mg/kg、24mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg或100mg/kg。
也可以给予固定的单位剂量，例如50mg、100mg、200mg、500mg或1000mg，或者剂量可基于患者的表面积，例如500mg/m2、400mg/m2、300mg/m2、250mg/m2、200mg/m2或100mg/m2。通常可施用介于1和8次之间(例如，1、2、3、4、5、6、7或8次)的剂量来治疗患者，但可给予9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多次的剂量。
可在一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周、三周、一个月、五周、六周、七周、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或更长时间之后重复施用本发明抗体。也可以重复治疗过程，按照慢性施用一样。重复施用可为相同剂量或不同剂量。例如，本发明的抗体可通过静脉内输注以8mg/kg或以16mg/kg按一周的时间间隔施用8周，接着以8mg/kg或以16mg/kg按每两周一次的方式再施用16周，然后以8mg/kg或以16mg/kg按每四周一次的方式施用。
例如，本发明的抗体可在治疗开始后第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天中的至少一天，或者另选地，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周中的至少一周，或其任何组合，使用单次剂量或者每24、12、8、6、4或2小时一次的分次剂量或其任何组合，以约0.1-100mg/kg的量作为日剂量提供，诸如0.5mg/kg/天、0.9mg/kg/天、1.0mg/kg/天、1.1mg/kg/天、1.5mg/kg/天、2mg/kg/天、3mg/kg/天、4mg/kg/天、5mg/kg/天、6mg/kg/天、7mg/kg/天、8mg/kg/天、9mg/kg/天、10mg/kg/天、11mg/kg/天、12mg/kg/天、13mg/kg/天、14mg/kg/天、15mg/kg/天、16mg/kg/天、17mg/kg/天、18mg/kg/天、19mg/kg/天、20mg/kg/天、21mg/kg/天、22mg/kg/天、23mg/kg/天、24mg/kg/天、25mg/kg/天、26mg/kg/天、27mg/kg/天、28mg/kg/天、29mg/kg/天、30mg/kg/天、40mg/kg/天、45mg/kg/天、50mg/kg/天、60mg/kg/天、70mg/kg/天、80mg/kg/天、90mg/kg/天或100mg/kg/天。
还可以预防性地施用本发明的抗体，以便降低罹患癌症的风险、延迟癌症进展中事件的发作和/或在癌症缓解后降低复发的风险。
可将本发明的抗体低压冻干用于贮存，并在使用前在合适的载体中复原。此项技术已被证实对常规的蛋白制剂有效，并且可采用熟知的冻干和复原技术。
方法和用途
本发明的抗体具有在体外和体内进行诊断，以及治疗和预防的用途。例如，本发明的抗体可被施用于体外或离体培养的细胞，或者待治疗的受试者，预防和/或诊断各种疾病，诸如癌症和感染性疾病。
本发明提供一种改变受试者中的免疫应答的方法，该方法包括以足以改变免疫应答的时间向受试者施用本发明抗体。
在一些实施方案中，免疫应答是增强、刺激或上调的。
在本文所述的一些实施方案中，受试者是人患者。
在本文所述的一些实施方案中，受试者是需要增强免疫应答的人患者。
在一些实施方案中，受试者是免疫失能的。
在一些实施方案中，受试者处于免疫失能的风险。免疫失能的受试者可能正在经历，或已经经历化疗或放射治疗。
在一些实施方案中，受试者因感染而免疫失能或处于免疫失能的风险中。
本发明的抗体适于治疗患有可经由增强T-细胞介导的免疫应答治疗的疾病的受试者。
在一些实施方案中，用于本文所述的本发明方法的特异性结合PD-1的拮抗性抗体是PD1B114、PD1B149、PD1B160、PD1B162、PD1B164、PD1B11、PD1B183、PD1B184、PD1B185、PD1B187、PD1B71、PD1B177、PD1B70、PD1B175、PD1B194、PD1B195、PD1B196、PD1B197、PD1B198、PD1B199、PD1B200、PD1B201、PD1B243、PD1B244、PD1B131或PD1B132。这些抗体的VH和VL氨基酸序列示于表2中。
在一些实施方案中，用于本文所述的本发明方法的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体是TM3B103、TM3B105、TM3B109、TM3B108、TM3B113、TM3B189、TM3B190、TM3B193、TM3B195、TM3B196或TM3B291。这些抗体的VH和VL氨基酸序列示于表3中。
在一些实施方案中，用于本发明方法的双特异性PD-1/TIM-3抗体是PTBB14、PTBB15、PTBB16、PTBB17、PTBB24、PTBB30、PTBB27、PTBB28、PTBB18、PTBB20或PTBB21。这些抗体的HC1、LC1、HC2和LC2氨基酸序列示于表41和表42中。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的特异性结合PD-1的拮抗性抗体包含SEQID NO:41的VH和SEQ ID NO:49的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的特异性结合PD-1的拮抗性抗体包含SEQID NO:41的VH和SEQ ID NO:50的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的特异性结合PD-1的拮抗性抗体包含SEQID NO:42的VH和SEQ ID NO:51的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的特异性结合PD-1的拮抗性抗体包含SEQID NO:42的VH和SEQ ID NO:52的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的特异性结合PD-1的拮抗性抗体包含SEQID NO:42的VH和SEQ ID NO:53的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的特异性结合PD-1的拮抗性抗体包含SEQID NO:43的VH和SEQ ID NO:49的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的特异性结合PD-1的拮抗性抗体包含SEQID NO:43的VH和SEQ ID NO:54的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的特异性结合PD-1的拮抗性抗体包含SEQID NO:43的VH和SEQ ID NO:50的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的特异性结合PD-1的拮抗性抗体包含SEQID NO:43的VH和SEQ ID NO:55的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的特异性结合PD-1的拮抗性抗体包含SEQID NO:43的VH和SEQ ID NO:56的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的特异性结合PD-1的拮抗性抗体包含SEQID NO:43的VH和SEQ ID NO:57的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的特异性结合PD-1的拮抗性抗体包含SEQID NO:44的VH和SEQ ID NO:49的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的特异性结合PD-1的拮抗性抗体包含SEQID NO:45的VH和SEQ ID NO:49的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的特异性结合PD-1的拮抗性抗体包含SEQID NO:46的VH和SEQ ID NO:49的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的特异性结合PD-1的拮抗性抗体包含SEQID NO:47的VH和SEQ ID NO:49的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的特异性结合PD-1的拮抗性抗体包含SEQID NO:48的VH和SEQ ID NO:53的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的特异性结合PD-1的拮抗性抗体包含SEQID NO:48的VH和SEQ ID NO:52的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的特异性结合PD-1的拮抗性抗体包含SEQID NO:48的VH和SEQ ID NO:56的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的特异性结合PD-1的拮抗性抗体包含SEQID NO:47的VH和SEQ ID NO:58的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的特异性结合PD-1的拮抗性抗体包含SEQID NO:47的VH和SEQ ID NO:59的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的特异性结合PD-1的拮抗性抗体包含SEQID NO:45的VH和SEQ ID NO:60的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的特异性结合PD-1的拮抗性抗体包含SEQID NO:45的VH和SEQ ID NO:61的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的特异性结合PD-1的拮抗性抗体包含SEQID NO:45的VH和SEQ ID NO:62的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体包含SEQID NO:145的VH和SEQ ID NO:155的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体包含SEQID NO:146的VH和SEQ ID NO:156的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体包含SEQID NO:148的VH和SEQ ID NO:157的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体包含SEQID NO:147的VH和SEQ ID NO:155的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体包含SEQID NO:149的VH和SEQ ID NO:158的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体包含SEQID NO:150的VH和SEQ ID NO:159的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体包含SEQID NO:151的VH和SEQ ID NO:160的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体包含SEQID NO:152的VH和SEQ ID NO:161的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体包含SEQID NO:153的VH和SEQ ID NO:162的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体包含SEQID NO:154的VH和SEQ ID NO:163的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体包含SEQID NO:172的VH和SEQ ID NO:173的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的包含特异性结合PD-1的第一域和特异性结合TIM-3的第二域的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体包含第一域中的SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:56的VL，以及第二域中的SEQ ID NO:153的VH和SEQ ID NO:162的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的包含特异性结合PD-1的第一域和特异性结合TIM-3的第二域的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体包含第一域中的SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:56的VL，以及第二域中的SEQ ID NO:146的VH和SEQ ID NO:156的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的包含特异性结合PD-1的第一域和特异性结合TIM-3的第二域的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体包含第一域中的SEQ ID NO:64的VH和SEQ ID NO:65的VL，以及第二域中的SEQ ID NO:153的VH和SEQ ID NO:162的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的包含特异性结合PD-1的第一域和特异性结合TIM-3的第二域的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体包含第一域中的SEQ ID NO:64的VH和SEQ ID NO:65的VL，以及第二域中的SEQ ID NO:146的VH和SEQ ID NO:156的VL。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的包含特异性结合PD-1的第一域和特异性结合TIM-3的第二域的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体包含第一域中的SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:56的VL，以及第二域中的SEQ ID NO:172的VH和SEQ ID NO:173的VL。
癌症
PD-1的阻断可增强对受试者中癌细胞的免疫应答。PD-1的配体即PD-L1大量表达于多种人癌症中(Dong等人，(2002)Nat Med 8:787-9)。PD-1与PD-L1之间的相互作用可导致肿瘤浸润淋巴细胞减少，T-细胞受体介导的增殖减少、和/或癌细胞免疫逃避(Dong等人，(2003)J Mol Med 81:281-7；Blank等人，(2005)Cancer Immunol Immunother 54:307-314；Konishi等人，(2004)Clin Cancer Res 10:5094-100)。免疫抑制可通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用来逆转；当PD-1与第二PD-1配体即PD-L2的相互作用也被阻断时，效应是加合的(Iwai等人，(2002)PorcNatl Acad Sci99:12293-7；Brown等人，(2003)JImmunol 170:1257-66)。因此，PD-1的抑制可导致增强免疫应答。
TIM-3是表达于分泌IFN-γ的活化辅助T细胞1(Thl)CD4+和细胞毒性CD8+T细胞上的共抑制性蛋白。TIM-3共表达于PD-1+衰竭T细胞上，如癌症和病毒衰竭临床前模型所示的那样。这些途径的共阻断可在若干模型和来源于转移性黑色素瘤患者和患有HIV或HCV的患者的人PBMC中恢复效应T细胞功能(例如IFN-γ分泌、增殖)。TIM-3也富集于Foxp3+调节性T细胞上，并且共表达TIM-3、LAG3和CTLA4的Treg已被示为效应T细胞(Teff)的高度有效抑制子(Galuton等人，(2014)Eur J Immunol44(9):2703-11)。TIM-3表达与NSCLC中的较差预后相关联(Zhuang等人，(2012)Am J Clin Pathol 137(6):978-85)。来自卵巢、结肠直肠、子宫颈和肝细胞癌患者的肿瘤组织的淋巴细胞表现出较高比例的TIM-3+CD4T细胞，该细胞产生ILF-γ的能力受损(Yan等人，(2013)PLoS One8(3):e58006)。
本发明还提供一种抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，包括以足以抑制肿瘤细胞生长的时间向受试者施用治疗有效量的本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体。
本发明还提供一种抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，包括以足以抑制肿瘤细胞生长的时间向受试者施用治疗有效量的本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体。
本发明还提供一种抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，包括以足以抑制肿瘤细胞生长的时间向受试者施用治疗有效量的本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体。
本发明还提供一种通过以足以治疗癌症的时间向对其有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体来治疗癌症的方法。
本发明还提供一种通过以足以治疗癌症的时间向对其有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体来治疗癌症的方法。
本发明还提供一种通过以足以治疗癌症的时间向对其有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的双特异性PD-1/TIM-3抗体来治疗癌症的方法。
可用的示例性抗体为具有如本文所述的VH和VL氨基酸序列和特征的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、以及拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体PD1B114、PD1B149、PD1B160、PD1B162、PD1B164、PD1B11、PD1B183、PD1B184、PD1B185、PD1B187、PD1B71、PD1B177、PD1B70、PD1B175、PD1B194、PD1B195、PD1B196、PD1B197、PD1B198、PD1B199、PD1B200、PD1B201、TM3B103、TM3B105、TM3B109、TM3B108、TM3B113、TM3B189、TM3B190、TM3B193、TM3B195、TM3B196、TM3B291、PTBB14、PTBB15、PTBB16、PTBB17、PTBB24、PTBB30、PTBB27、PTBB28、PTBB18、PTBB20和PTBB21。
癌症可为过增殖性病症或疾病、实体瘤、血液恶性肿瘤、软组织肿瘤、或转移性病变。
“癌症”旨在包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织、或器官，而不考虑组织病理学类型或侵入阶段。癌症的示例包括实体瘤、血液恶性肿瘤、软组织肿瘤和转移性病变。示例性实体瘤包括恶性肿瘤，例如各种器官系统的恶性毒瘤和癌(包括腺癌和鳞状上皮细胞癌)，例如侵袭肝、肺、乳房、淋巴、胃肠道(例如结肠)、泌尿生殖道(例如肾、尿道上皮细胞)、前列腺和咽的那些。腺癌包括诸如大多数结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌和食道癌之类的恶性肿瘤。鳞状上皮细胞癌包括例如肺、食道、皮肤、头颈部、口腔、肛门和子宫颈中的恶性肿瘤。
在一些实施方案中，癌症为黑色素瘤。
也可使用本文所述的本发明方法和抗体来治疗或预防前述癌症的转移性病变。
可用本发明的抗体抑制或减缓生长的示例性癌症包括可响应于免疫疗法的癌症。示例性此类癌症包括黑色素瘤、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、胃肠道癌、胃部癌症、食道癌、肺癌、转移性恶性黑色素瘤、透明细胞癌、激素难治的前列腺腺癌、非小细胞肺癌或头颈癌。可用本文所述的本发明抗体治疗顽固性和复发性恶性肿瘤。
可用本发明的抗体治疗的示例性其它癌症为肛门癌、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑癌和CNS癌症、输卵管癌、阴道癌、外阴癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、胃食管(astro-esophageal)癌、睾丸癌、卵巢癌、胰腺癌、直肠癌、子宫癌、原发性CNS淋巴瘤；中枢神经系统(CNS)肿瘤、宫颈癌、绒毛膜癌、直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌、子宫内膜癌、眼癌；上皮内肿瘤、肾癌、喉癌、肝癌；小细胞肺癌、成神经细胞瘤、口腔癌(例如唇、舌、口和咽)、鼻咽癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、呼吸系统癌、肉瘤、甲状腺癌、泌尿系统癌、肝癌、肛区癌、输卵管癌、阴道癌、外阴癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童期实体瘤、肿瘤血管生成、脊轴肿瘤、脑干胶质细胞瘤、垂体腺瘤、卡波济氏肉瘤、默克尔细胞癌、表皮癌、鳞状细胞癌、环境诱导的癌症(包括石棉诱导的那些)和其它癌和肉瘤、以及它们的组合。
可用本发明的抗体治疗的示例性血液恶性肿瘤包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤，例如前体B-细胞淋巴细胞白血病/淋巴瘤和B-细胞非霍奇金淋巴瘤、急性早幼粒细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、B-细胞急性淋巴细胞性白血病、B-细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)(包括低级、中级、或高级FL)、皮肤滤泡中心淋巴瘤、外边缘区B细胞淋巴瘤(MALT型、结节型和脾型)、毛细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、伯基特淋巴瘤(BL)、浆细胞瘤、多发性骨髓瘤(MM)、浆细胞白血病、移植后淋巴组织增生性疾病、沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症、浆细胞病、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、T细胞急性淋巴细胞白血病、原发性系统性淀粉样变性(例如轻链淀粉样变性)、幼淋巴细胞白血病/髓细胞性白血病、急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、大颗粒淋巴细胞(LGL)白血病、自然杀伤细胞白血病和霍奇金淋巴瘤。
“浆细胞疾病”是指以克隆性浆细胞为特征的疾病，并且包括多发性骨髓瘤、轻链淀粉样变性和华氏巨球蛋白血症。轻链淀粉样变性和沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症可独立于多发性骨髓瘤而产生。它们也可与多发性骨髓瘤同时存在，并在多发性骨髓瘤发展之前或之后发展。
示例性B细胞非霍奇金淋巴瘤是淋巴瘤样肉芽肿病、原发性渗出性淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、纵隔大B细胞淋巴瘤、重链病(包括γ重链病、μ重链病和α重链病)、免疫抑制剂治疗所诱导的淋巴瘤(诸如环孢菌素诱导的淋巴瘤和氨甲蝶呤诱导的淋巴瘤)。
患有表达PD-L1的癌症(包括转移癌)的患者可用本发明的抗体进行治疗。所述癌症可为黑色素瘤、肾细胞癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非鳞状NSCLC、结直肠癌、阉割抗性前列腺癌、卵巢癌、胃癌、腺癌(ACA)、鳞状细胞癌(SCC)、肝细胞癌(HCC)、胰腺癌、头颈部的鳞状细胞癌、食道癌、胃肠道癌和乳腺癌。
患有表达TIM-3的癌症的患者可用本发明的抗体进行治疗。表达TIM-3的癌症包括宫颈癌、肺癌、NSCLC、急性髓性白血病(AML)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、黑色素瘤、肾癌、肾细胞癌(RCC)、肾透明细胞癌、乳头状肾细胞癌、转移性肾细胞癌、鳞状细胞癌、食管鳞状细胞癌、鼻咽癌、结直肠癌、乳腺癌(例如不表达雌激素受体、孕酮受体或Her2/neu中的一者、两者或全部的乳腺癌，例如三阴性乳腺癌)、间皮瘤、肝细胞癌和卵巢癌。表达TIM-3-的癌症可为转移癌。
在一些实施方案中，受试者患有实体瘤。
在一些实施方案中，受试者患有血液恶性肿瘤。
在一些实施方案中，实体瘤为黑色素瘤。
在一些实施方案中，实体瘤为肺癌。
在一些实施方案中，实体瘤为非小细胞肺癌(NSCLC)。
在一些实施方案中，实体瘤为鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)。
在一些实施方案中，实体瘤为非鳞状NSCLC。
在一些实施方案中，实体瘤为肺腺癌。
在一些实施方案中，实体瘤为肾细胞癌(RCC)。
在一些实施方案中，实体瘤为间皮瘤。
在一些实施方案中，实体瘤为鼻咽癌(NPC)。
在一些实施方案中，实体瘤为结直肠癌。
在一些实施方案中，实体瘤为前列腺癌。
在一些实施方案中，实体瘤为阉割抗性前列腺癌。
在一些实施方案中，实体瘤为胃部癌症。
在一些实施方案中，实体瘤为卵巢癌。
在一些实施方案中，实体瘤为胃癌。
在一些实施方案中，实体瘤为肝癌。
在一些实施方案中，实体瘤为腺癌。
在一些实施方案中，实体瘤为甲状腺癌。
在一些实施方案中，实体瘤为头颈部的鳞状细胞癌。
在一些实施方案中，实体瘤为食道或胃肠道的癌。
在一些实施方案中，实体瘤为乳腺癌。
在一些实施方案中，实体瘤为输卵管癌。
在一些实施方案中，实体瘤为脑癌。
在一些实施方案中，实体瘤为尿道癌。
在一些实施方案中，实体瘤为泌尿生殖系统癌。
在一些实施方案中，实体瘤为子宫内膜异位症。
在一些实施方案中，实体瘤为宫颈癌。
在一些实施方案中，实体瘤为癌症的转移性病变。
在一些实施方案中，血液恶性肿瘤为淋巴瘤、骨髓瘤或白血病。
在一些实施方案中，血液恶性肿瘤为B细胞淋巴瘤。
在一些实施方案中，血液恶性肿瘤为伯基特淋巴瘤。
在一些实施方案中，血液恶性肿瘤为霍奇金淋巴瘤。
在一些实施方案中，血液恶性肿瘤为非霍奇金淋巴瘤。
在一些实施方案中，血液恶性肿瘤为骨髓增生异常综合征。
在一些实施方案中，血液恶性肿瘤为急性髓性白血病(AML)。
在一些实施方案中，血液恶性肿瘤为慢性髓性白血病(CML)。
在一些实施方案中，血液恶性肿瘤为慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)。
在一些实施方案中，血液恶性肿瘤为多发性骨髓瘤(MM)。
在一些实施方案中，血液恶性肿瘤为浆细胞瘤。
在一些实施方案中，受试者具有表达PD-L1的肿瘤。
在一些实施方案中，受试者在肿瘤组织中具有肿瘤浸润T淋巴细胞(TIL)。
在一些实施方案中，受试者在肿瘤组织中具有PD-1+TIM-3+TIL。
在一些实施方案中，受试者在肿瘤组织中的PD-1+TIM-3+肿瘤浸润T淋巴细胞(TIL)数目增大。
“数目增大”是相比于对照时指受试者中的统计意义上的显著增大。“数目增大”例如是指在用PD-1抗体或其它治疗剂治疗前或治疗后受试者(例如患者)中TIL的数目在统计意义上显著增大。
在一些实施方案中，受试者具有提高的干扰素-γ(IFN-γ)表达或活性。
在一些实施方案中，受试者已用抗-PD-1抗体治疗。
在一些实施方案中，受试者难以用抗-PD-1抗体治疗。
在一些实施方案中，受试者在用抗-PD-1抗体治疗后肿瘤复发。
在一些实施方案中，受试者已用包含SEQ ID NO:230的VH和SEQ ID NO:231的VL的抗-PD-1抗体(例如
Figure BDA0001717945540001391
(派姆单抗))治疗。
在一些实施方案中，受试者已用包含SEQ ID NO:232的VH和SEQ ID NO:233的VL的抗-PD-1抗体(例如
Figure BDA0001717945540001392
(纳武单抗))治疗。
在一些实施方案中，受试者难以用包含SEQ ID NO:230的VH和SEQ ID NO:231的VL的抗-PD-1抗体(例如
Figure BDA0001717945540001393
(派姆单抗))治疗。
在一些实施方案中，受试者难以用包含SEQ ID NO:232的VH和SEQ ID NO:233的VL的抗-PD-1抗体(例如
Figure BDA0001717945540001394
(纳武单抗))治疗。
在一些实施方案中，受试者在用包含SEQ ID NO:230的VH和SEQ ID NO:231的VL的抗-PD-1抗体(例如
Figure BDA0001717945540001401
(派姆单抗))治疗后肿瘤复发。
在一些实施方案中，受试者在用包含SEQ ID NO:232的VH和SEQ ID NO:233的VL的抗-PD-1抗体(例如
Figure BDA0001717945540001402
(纳武单抗))治疗后肿瘤复发。
SEQ ID NO:230
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGG
INPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:231
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:232
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:233
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK
在一些实施方案中，受试者已经用或正在用PD-L1抗体治疗。
在一些实施方案中，受试者难以用PD-L1抗体治疗。
在一些实施方案中，受试者在用PD-L1抗体治疗后肿瘤复发。
在一些实施方案中，受试者难以用PD-L1抗体度伐鲁单抗(MEDI-4736)治疗或用该抗体治疗后肿瘤复发。度伐鲁单抗包含SEQ ID NO:234的VH和SEQ ID NO:235的VL。
SEQ ID NO:234
EVQLVESGGG
LVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVAN
IKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:235
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSYLAWYQQK PGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPWTFGQGTKVEIK
在一些实施方案中，受试者难以用PD-L1抗体阿特珠单抗治疗或用该抗体治疗后肿瘤复发。
阿特珠单抗包含SEQ ID NO:236的VH和SEQ ID NO:237的VL。
SEQ ID NO:236
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:237
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIK
在一些实施方案中，受试者难以用PD-L1抗体阿维单抗治疗或用该抗体治疗后肿瘤复发。
阿维单抗包含SEQ ID NO:238的VH和SEQ ID NO:239的VL。
SEQ ID NO:238
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:239
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVL
在一些实施方案中，受试者难以用PD-L1抗体MDX-1105治疗或用该抗体治疗后肿瘤复发。
在一些实施方案中，受试者已经用或正在用PD-L2抗体治疗。
在本文所述的一些实施方案中，受试者难以用PD-L2抗体治疗。
在一些实施方案中，受试者在用PD-L2抗体治疗后肿瘤复发。
可以使用各种定性和/或定量的方法来确定疾病的复发或难治性质。可能与复发或抗性相关联的症状为例如患者的健康状况下降或平稳、或与实体瘤相关联的各种症状的重建或恶化、和/或体内癌细胞从一个部位扩散到其它器官、组织或细胞。
本文发现在抗-PD-1抗体治疗后，TIM-3表达在从肿瘤分离的CD8+T细胞中有所升高。因此，向已经接受或正在接受抗-PD-1抗体治疗、抗-PD-1抗体治疗难于治愈或在抗-PD-1抗体治疗之后或期间复发的受试者治疗性施用本文所述的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体可改善患者的临床结果。
本发明还提供一种治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体，其中受试者正在用或已经用抗-PD-1抗体治疗。
在一些实施方案中，特异性结合TIM-3的拮抗性抗体包含SEQ ID NO:146的VH和SEQ ID NO:156的VL。
本发明还提供一种治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的包含SEQ ID NO:146的VH和SEQ ID NO:156的VL的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体，其中受试者正在用或已经用包含SEQ ID NO:230的VH和SEQ ID NO:231的VL的抗-PD-1抗体
Figure BDA0001717945540001421
(派姆单抗)治疗。
本发明还提供一种治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的包含SEQ ID NO:146的VH和SEQ ID NO:156的VL的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体，其中受试者正在用或已经用包含SEQ ID NO:232的VH和SEQ ID NO:233的VL的抗-PD-1抗体
Figure BDA0001717945540001422
(纳武单抗)治疗。
本发明还提供一种治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体，其中受试者正在用或已经用抗-PD-L1抗体治疗。
本发明还提供一种治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体，其中受试者正在用或已经用抗-PD-L2抗体治疗。
本发明还提供一种治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体，其中受试者正在用或已经用抗-PD-1抗体治疗。
本发明还提供一种治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体，其中受试者正在用或已经用抗-PD-L1抗体治疗。
本发明还提供一种治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体，其中受试者正在用或已经用抗-PD-L2抗体治疗。
本发明还提供一种治疗受试者的癌症的方法，该方法包括以足以治疗癌症的时间向受试者施用治疗有效量的包含SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:56的VL的特异性结合PD-1的拮抗性抗体。
本发明还提供一种治疗受试者的癌症的方法，该方法包括以足以治疗癌症的时间向受试者施用治疗有效量的包含SEQ ID NO:64的VH和SEQ ID NO:65的VL的特异性结合PD-1的拮抗性抗体。
任何本文所述的本发明的PD-1、TIM-3或双特异性PD-1/TIM-3抗体均可用于本发明的方法。
“治疗”或“诊疗”是指治疗剂治疗，其中治疗对象将减慢(减轻)非期望的生理改变或疾病诸如肿瘤或肿瘤细胞的发展或扩散，或者用于在治疗期间提供有益或期望的临床结果。有益或期望的临床结果包括症状减轻、疾病程度减弱、疾病状态稳定(即未恶化)、疾病进展延迟或减慢、未转移、疾病状态改善或缓和，以及缓解(不论是部分缓解还是完全缓解)，不论是可检测的还是不可检测的。“治疗”也可意指与受试者未接受治疗时的预期生存期相比延长生存期。需要治疗的那些受试者包括已经患有非期望的生理改变或疾病的那些受试者、以及倾向于患有生理改变或疾病的那些受试者。
“治疗有效量”是指在所需剂量和时间段有效实现期望的治疗结果的量。本发明抗体的治疗有效量可根据因素诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及本发明抗体在个体中引发所需应答的能力而变化。有效治疗剂或治疗剂组合的示例性指标包括，例如：患者健康状况的改善、肿瘤负荷的减少、肿瘤生长的遏止或减慢和/或癌细胞没有向身体其它部位转移的情况。
用于癌症治疗的联合疗法
本发明的抗体可与第二治疗剂联合施用。
本发明的抗体可与一、二、三、四、五或六种附加治疗剂联合施用。
任何本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体均可与第二治疗剂联合使用。
任何本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、特异性结合TIM-3的拮抗性抗体或拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体均可与一、二、三、四、五或六种附加治疗剂联合使用。
“与...联合”是指将本发明的抗体与至少一种第二治疗剂作为单一试剂同时或作为单一试剂以任何次序依次施用。一般来讲，每种药剂将按针对该药剂确定的剂量和/或时间计划表进行施用。
在一些实施方案中，第二治疗剂调节参与癌症免疫循环的分子的活性，例如参与用于癌细胞抗原释放、癌抗原呈递、T细胞致敏和活化、T细胞向肿瘤的运输、T细胞在肿瘤中的浸润、T细胞对癌细胞的识别，以及杀死癌细胞的刺激或抑制途径的分子。癌症免疫循环在Chen和Mellman(2013)Immunity 39:1-10中有所描述。在一些实施方案中，第二治疗剂调节在肿瘤微环境中参与调节T调节性细胞(Treg)、表达于肿瘤的共刺激性或共抑制性配体、自然杀伤(NK)细胞上的活化或抑制性受体、或免疫抑制因子的活性的分子的活性。联合癌症免疫疗法在Manoney等人，(2015)Nature Reviews 14:561-584中有所描述。
如所公知，第二治疗剂通常增强刺激性分子的活性并抑制抑制性分子的活性。因此，“调节”是指通过第二治疗剂增强免疫应答，而试剂本身是特定分子的激动剂或拮抗剂。
在一些实施方案中，将本发明的抗体与T细胞抑制性分子的抑制剂联合施用。
在一些实施方案中，本发明的抗体与T细胞抑制性分子PD-1、PD-L1、PD-L2、VISTA、BTNL2、B7-H3、B7-H4、HVEM、HHLA2、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、BTLA、CD160、CEACAM-1、LAIR1、TGFβ、IL-10、Siglec家族蛋白、KIR、CD96、TIGIT、NKG2A、CD112、CD47、SIRPA或CD244的抑制剂联合施用。
在一些实施方案中，KIR是KIR2DL1、KIR2DL2或KIR2DL3。
抑制性分子的抑制可通过以DNA、RNA或蛋白质水平抑制来进行。在一些实施方案中，抑制性核酸(例如dsRNA、siRNA或shRNA)用于抑制抑制性分子的表达。
在一些实施方案中，抑制性分子的抑制剂是抑制性分子的可溶性配体。
在一些实施方案中，抑制性分子的抑制剂是特异性结合抑制性分子的拮抗性抗体。
在一些实施方案中，抑制性分子的抑制剂是CTLA-4-Fc或TIM-3-Fc融合蛋白。
在一些实施方案中，抑制分子的抑制剂是结合PD-1、PD-L1、PD-L2、VISTA、BTNL2、B7-H3、B7-H4、HVEM、HHLA2、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、BTLA、CD160、CEACAM-1、LAIR1、TGFβ、IL-10、Siglec家族蛋白、KIR、CD96、TIGIT、NKG2A、CD112、CD47、SIRPA或CD244的抗体或抗体片段。
可用于本发明方法的示例性抗-PD-1抗体是本文和美国专利5,897,862和7,488,802、以及国际专利公布WO2004/004771、WO2004/056875、WO2006/121168、WO2008/156712、WO2010/029435、WO2010/036959、WO2011/110604、WO2012/145493、WO2014/194302、WO2014/206107、WO2015/036394、WO2015/035606、WO2015/085847、WO2015/112900和WO2015/112805中所述的那些。示例性抗-PD1抗体包括
Figure BDA0001717945540001461
(派姆单抗)和
Figure BDA0001717945540001462
(纳武单抗)。
在一些实施方案中，将本发明的抗体与可溶性PD-1配体联合施用。
在一些实施方案中，可溶性PD-1配体是融合于Fc的可溶性PD-L1或可溶性PD-L2。
在一些实施方案中，可溶性PD-1配体是AMP-224。
在一些实施方案中，将本发明的抗体与抗-PD-L1抗体或其抗原结合片段联合施用。
可用于本发明方法的示例性PD-L1抗体是抗体MDPL3280A(Genentech/Roche)以及美国专利7,943,743和美国专利公布20120039906中所公开的其它人单克隆抗体。其它抗-PD-L1结合剂包括YW243.55.S70(重链和轻链可变区示于WO2010/077634的SEQ ID NO 20和21)和MDX-1105(也称为BMS-936559，并且例如公开于WO2007/005874的抗-PD-L1结合剂)。本文公开了可使用的抗-PD-L1抗体度伐鲁单抗、阿特珠单抗和阿维单抗的VH和VL序列。
可用于本发明方法的示例性PD-L2抗体是美国专利8,080,636、8,188,238、美国专利公布20110271358和国际专利公布WO2012145493中所述的那些。
可用于本发明方法的示例性B7-H4抗体是美国专利7,888,477、8,609,816、7,931,896、欧洲专利1817055、美国专利公布US20140037551和US2014029486，以及国际专利公布WO2014/100483和WO2014/159835中所述的那些。
可用于本发明方法的示例性抗-CTLA-4抗体是易普利姆玛(MDX-010，CASNo.477202-00-9)和阿斯利康(IgG2单克隆抗体，购自Pfizer，以前称为ticilimumab，CP-675,206)。
可用于本发明方法的示例性抗-LAG-3抗体是例如国际专利公布WO2008/132601和WO2010/019570中所述的那些。
可用于本发明方法的示例性抗CEACAM-1抗体是在美国专利8,598,322和美国专利公布US2004/0047858、US20140271618和US20120100158中所述的那些。不受任何特定理论的束缚，CEACAM-1被描述为TIM-3的配体和配偶体(参见例如国际专利公布WO2014/022332)。在异种移植癌症模型中检测了抗-TIM-3与抗-CEACAM-1抗体组合的协同体内效应(参见例如国际专利公布WO2014/022332)。肿瘤可利用CEACAM-1来抑制免疫系统。因此，可将抗CEACAM-1抗体与本文所述的本发明抗体联合使用。
可用于本发明方法的示例性抗-LAIR1抗体是美国专利6,479,638和国际专利公布WO2010/078580中所述的那些。
可用于本发明方法的示例性抗-CD96抗体是国际专利公布WO2015/024060中所述的那些。
可用于本发明方法的示例性抗-TIM-3抗体是例如本文和国际专利公布WO2011/155607、WO2013/006490和WO2015/117002中所述的那些。
可用于本发明方法的示例性抗-TIGIT抗体是美国专利公布US20140056890和US20150216970中所述的那些。示例性抗-TIGIT抗体是RG-6058(MTIG-7192A)。
本文发现在癌症动物模型中抗-TIM-3抗体治疗后，TIGIT表达在从肿瘤分离的CD8+T细胞中有所升高。因此，向已经接受或正在接受抗-TIM-3抗体治疗、抗-TIM-3抗体治疗难于治愈或在抗-TIM-3抗体治疗之后或期间复发的受试者治疗性施用特异性结合TIGIT的拮抗性抗体可改善患者的临床结果。
本发明还提供一种治疗受试者的癌症的方法，包括以足以治疗癌症的时间向对其有需要的受试者施用治疗有效量的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体和特异性结合TIGIT的拮抗性抗体。
在一些实施方案中，在施用特异性结合TIM-3的拮抗性抗体之后，施用特异性结合TIGIT的拮抗性抗体。
在一些实施方案中，将特异性结合TIGIT的拮抗性抗体和特异性结合TIM-3的拮抗性抗体作为单一试剂同时施用或作为单一试剂以任何次序施用。
可用于本发明方法的示例性抗-BTLA抗体是美国专利8,546,541、7,479,544、8,188,232、8,247,537、8,563,694和国际专利公布WO2014184360中所述的那些。
可用于本发明方法的示例性抗-HVEM抗体是美国专利公布US20110280866中所述的那些。
可用于本发明方法的示例性CD47抗体是美国专利8,101,719中描述的那些。
可用于本发明方法的示例性CD244抗体包括美国专利5,688,690中描述的那些。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-TIM-3抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-PD-L1抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-PD-L2抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-VISTA抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-BTNL2抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-B7-H3抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-B7-H4抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-HVEM抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-HLA2抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-LAG-3抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-TIM-3抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-BTLA抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-CD160抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-CEACAM-1抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-LAIR1抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗TGFβ抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-IL-10抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-TIGIT抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-KIR抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-CD112抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-CD47抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-SIRPA抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-CD244抗体或其抗原结合片段联合施用。
免疫抑制性分子可调节或协同调节T-细胞功能以促进肿瘤免疫逃逸。因此，在相比于单独的单一疗法时，采用两种或更多种抑制性分子的抑制剂的联合疗法可提供给患者改善的治疗。
在一些实施方案中，将本发明的抗体与活化分子的激活剂联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的抗体与活化分子CD86、CD80、CD28、ICOS、ICOS配体、TMIGD2、CD40、GITR配体、4-1BB配体、OX40配体、CD70、CD40L、TNFRSF25、LIGHT、GITR、OX-40、CD27、CD137、NKG2D、CD48、CD226或MICA的激活剂联合施用。
活化分子的激活使用例如活化分子的可溶性配体或配体衍生物、肽或激动性抗体来进行。
在一些实施方案中，活化分子的激活剂是T细胞活化分子的可溶性配体。
在一些实施方案中，活化分子的激活剂是特异性结合活化分子的激动性抗体。
可用于本发明方法的示例性抗-CD40抗体包括分别在美国专利7,288,251(抗体21.4.1)和美国专利8,303,955中所述的CP-870,893和人源化S2C6，以及国际专利公布WO2001/056603、WO2001/083755、WO2013/034904和WO2014/070934中所述的抗-CD40抗体。
示例性GITR激动剂包括例如GITR融合蛋白和抗-GITR抗体(例如二价抗-GITR抗体)，诸如美国专利6,111,090、欧洲专利090505B1、美国专利8,586,023、国际专利公布WO2010/003118和WO2011/090754所述的GITR融合蛋白，或美国专利7,025,962、7,812,135、8,388,967、8,591,886和7,618,632、欧洲专利1947183和1866339、或国际专利公布WO2011/028683、WO2013/039954、WO2005/007190、WO2007/133822、WO2005/055808、WO1999/40196、WO2001/03720、WO1999/20758、WO2006/083289、WO2005/115451和WO2011/051726中所述的抗-GITR抗体。
本文发现在癌症动物模型中抗-PD-1抗体治疗后，GITR表达在从肿瘤分离的CD8+T细胞中有所升高。抗-PD-1治疗恢复TIL上GITR的表达支持了用抗-GITR与抗-PD-l抗体联合治疗可改善患者的临床结果。
本发明还提供一种治疗受试者的癌症的方法，包括以足以治疗癌症的时间向对其有需要的受试者施用治疗有效量的特异性结合PD-1的拮抗性抗体和特异性结合GITR的激动性抗体。
在一些实施方案中，在施用特异性结合PD-1的拮抗性抗体之后，施用特异性结合GITR的激动性抗体。
在一些实施方案中，将特异性结合GITR的激动性抗体和特异性结合PD-1的拮抗性抗体作为单一试剂同时施用或作为单一试剂以任何次序施用。
可用于本发明方法的示例性OX40抗体包括在美国专利8,133,983、7,960,515、美国专利公布20130280275和国际专利公布WO2013028231和WO2014148895中所述的那些。
可用于本发明方法的示例性OX40抗体是包含SEQ ID NO:309的VH和SEQ ID NO:310的VL的抗体。
可用于本发明方法的另一种示例性OX40抗体是包含SEQ ID NO:311的VH和SEQ IDNO:312的VL的抗体。
本文发现在癌症动物模型中抗-PD-1抗体治疗后，OX40表达在从肿瘤分离的CD8+T细胞中有所升高。抗-PD-1治疗恢复TIL上OX40的表达支持了用抗-OX40与抗-PD-l抗体联合治疗可改善患者的临床结果。
本发明还提供一种治疗受试者的癌症的方法，包括以足以治疗癌症的时间向对其有需要的受试者施用治疗有效量的特异性结合PD-1的拮抗性抗体和特异性结合OX40的激动性抗体。
在一些实施方案中，在施用特异性结合PD-1的拮抗性抗体之后，施用特异性结合OX40的激动性抗体。
在一些实施方案中，将特异性结合OX40的激动性抗体和特异性结合PD-1的拮抗性抗体作为单一试剂同时施用或作为单一试剂以任何次序施用。
可用于本发明方法的示例性CD70抗体包括在美国专利公布US20130336976中所述的那些。
可用于本发明方法的示例性TNFRSF25抗体包括在美国专利7,708,996中所述的那些。
可用于本发明方法的示例性CD27抗体包括在美国专利公布US20130336976中描述的那些。
可用于本发明方法的示例性CD137抗体包括在美国专利6,974,863、6,303,121、7,138,500、7,288,638、8,716,452、8,821,867和美国专利公布US20130149301中所述的那些。
本文发现在癌症动物模型中抗-PD-1抗体治疗后，CD137表达在从肿瘤分离的CD8+T细胞中有所升高。抗-PD-1治疗恢复TIL上CD137的表达支持了用抗-CD137与抗-PD-l抗体联合治疗可改善患者的临床结果。
本发明还提供一种治疗受试者的癌症的方法，包括以足以治疗癌症的时间向对其有需要的受试者施用治疗有效量的特异性结合PD-1的拮抗性抗体和特异性结合CD137的激动性抗体。
在一些实施方案中，在施用特异性结合PD-1的拮抗性抗体之后，施用特异性结合CD137的激动性抗体。
在一些实施方案中，将特异性结合CD137的激动性抗体和特异性结合PD-1的拮抗性抗体作为单一试剂同时施用或作为单一试剂以任何次序施用。
可用于本发明方法的示例性NKG2D抗体包括在美国专利公布US20110150870中所述的那些。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-CD86抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-CD80抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-CD28抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-ICOS抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-ICOS配体抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-TMIGD2抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-CD40抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-GITR配体抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-4-1BB配体抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-OX40配体抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-CD70抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-CD40L抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-TNFRSF25抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-LIGHT抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-GITR抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-OX40抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-CD27抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-CD137抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-NKG2D抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-CD48抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-CD226抗体或其抗原结合片段联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与抗-MICA抗体或其抗原结合片段联合施用。
可将本文所述的抗体的组合例如作为独立抗体或连接抗体(例如作为双特异性或三特异性抗体分子)分开施用。
本文所述组合的功效可在本领域已知的动物模型中进行测试。
可将本文所述的本发明抗体与疫苗联合施用。
示例性疫苗是免疫原性试剂，诸如经由基因治疗、细胞、以及用编码免疫刺激细胞因子的基因转染的细胞递送到患者的癌细胞、纯化肿瘤抗原(包括重组蛋白、抗原表位、肽和碳水化合物分子)、肿瘤抗原。可使用的示例性疫苗包括黑色素瘤抗原的肽，诸如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1和/或酪氨酸酶的肽、或被转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞、基于DNA的疫苗、基于RNA的疫苗、和基于病毒转导的疫苗、前列腺抗原的肽或肺癌抗原的肽。癌症疫苗可以是预防性或治疗性的。
许多针对肿瘤进行接种的实验策略已经被研发(参见Rosenberg,S.,2000,Development of Cancer Vaccines,ASCO Educational Book Spring:60-62；Logothetis,C.,2000,ASCO Educational Book Spring:300-302；Khayat,D.2000,ASCO EducationalBook Spring:414-428；Foon,K.2000,ASCO Educational Book Spring:730-738；还可参见Restifo,N.和Sznol,M.,Cancer Vaccines，第61章，第3023-3043页，载于DeVita,V.等人(编辑),1997,Cancer:Principles and Practice of Oncology.第五版)。在这些策略之一中，使用自体同源或异源肿瘤细胞来制备疫苗。这些细胞疫苗已示出在肿瘤细胞被转导表达GM-CSF时最为有效。GM-CSF已示出是抗原呈递的有效激活剂以用于肿瘤接种(Dranoff等人，(1993)Proc Natl Acad Sci U.S.A.90：3539-43)。
可将本文所述的本发明抗体与表达于肿瘤内或肿瘤上的重组蛋白和/或肽的一种或集合联合施用，从而对这些蛋白质产生免疫应答。这些蛋白质通常被免疫系统认作自身抗原并因此对免疫系统产生耐受。肿瘤抗原也可包括蛋白端粒酶，其是合成染色体端粒酶所需的，并在超过85％的人癌症和仅仅有限数目的体细胞组织中表达(Kim等人，(1994)Science 266:2011-2013)。肿瘤抗原也可以是因改变蛋白质序列或在两种不相关序列间产生融合蛋白(例如费城染色体中的bcr-abl)的体细胞突变而在癌细胞内或上表达的“新生抗原”，或者是来自B细胞肿瘤的独特型。肿瘤抗原可为前列腺特异性抗原(PSA)、间皮素、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、滑膜肉瘤X2(SSX2)、NKX3.1、前列腺酸磷酸酶(PAP)、或表皮生长因子受体、或对EGFR变体特异性的肽的抗原表位，例如在肿瘤细胞上过表达的公知EGFRvIII。
其它肿瘤疫苗可包括来自与人癌症有关的病毒的蛋白质，诸如人乳头瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV和HCV)和卡波奇疱疹肉瘤病毒(Kaposi's Herpes Sarcoma Virus)(KHSV)以及埃-巴二氏病毒(EBV)。可与本文所述的本发明抗体联合使用的另一种形式肿瘤特异性抗原是从肿瘤组织自身分离的纯化热激蛋白(HSP)。HSP包含来自肿瘤细胞的蛋白质片段并且高度有效地递送至抗原呈递细胞以引发肿瘤免疫(Suot和Srivastava(1995)Science 269:1585-1588；Tamura等人，(1997)Science278:117-120)。
树突状细胞(DC)是可用于引发抗原特异性应答的有效抗原呈递细胞。DC可以离体产生，并可负载各种蛋白质和肽抗原以及肿瘤细胞提取物(Nestle等人，(1998)NatureMedicine 4:328-332)。DC也可通过遗传方法转导来表达这些肿瘤抗原。为了免疫目的，也可将DC直接与肿瘤细胞融合(Kugler等人，(2000)Nature Medicine 6:332-336)。作为疫苗接种的方法，可将DC免疫有效地与本文所述的本发明抗体结合以激活更强的抗-肿瘤应答。
在一些实施方案中，疫苗是表达于肿瘤细胞上的多肽或其片段、或编码多肽或其片段的DNA或RNA。
在一些实施方案中，表达于肿瘤细胞上的多肽或其片段是PSMA。
在一些实施方案中，表达于肿瘤细胞上的多肽或其片段是间皮素。
在一些实施方案中，表达于肿瘤细胞上的多肽或其片段是EGFR或EGFR变体，诸如EGFRvIII。
在一些实施方案中，表达于肿瘤细胞上的多肽或其片段是PAP。
在一些实施方案中，表达于肿瘤细胞上的多肽或其片段是滑膜肉瘤X2(SSX2)。
在一些实施方案中，表达于肿瘤细胞上的多肽或其片段是NKX3.1。
在一些实施方案中，肿瘤细胞是黑色素瘤、肺癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非鳞状NSCLC、结直肠癌、前列腺癌、阉割抗性前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、甲状腺癌、头颈部的鳞状细胞癌、食道癌或胃肠道癌或乳腺癌细胞。
在一些实施方案中，将本发明的抗体与肾癌(RCC)疫苗联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的抗体与肺癌疫苗联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的抗体与前列腺癌疫苗联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的抗体与肺癌疫苗联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与包含EGFR或EGFRvIII的肽片段、或编码EGFR或EGFRvIII的肽片段的载体的肿瘤疫苗联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与包含间皮素的肽片段、或编码间皮素的肽片段的载体的肿瘤疫苗联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体、本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体、或本发明的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体与包含前列腺特异抗原的肽片段、或编码前列腺特异抗原的肽片段的载体的肿瘤疫苗联合施用。
可用于本发明方法的合适载体是公知的，并且包括慢病毒载体、腺病毒载体、最小核酸载体(MNAV)、牛痘病毒、鸡痘病毒、α病毒-衍生的VRP、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、MVA、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria moonocytogenes)、pVAX-基质粒，参见例如Pol等人，(2014)Oncoimmunology 1(3):e28185。
可将本发明的抗体与标准护理癌症治疗联合施用。
可将本文所述的本发明抗体与标准护理癌症化疗方案联合施用。在这些实例中，可以减少所施用化疗剂的剂量(Mokyr等人，(1998)Cancer Research 58:5301-5304)。
在一些实施方案中，可将本发明的抗体与一种或多种其它抗体分子、化学疗法、其它抗癌疗法(例如靶向抗癌疗法、或溶瘤细胞药物)、细胞毒素剂、细胞因子、外科手术和/或放射法联合施用。
可与本发明的抗体联合施用的示例性细胞毒素剂包括抗微管剂、拓扑异构酶抑制剂、抗代谢药、有丝分裂抑制剂、烷基化剂、蒽环类抗生素、长春花生物碱、插入剂、能够干扰信号转导途径的试剂、促进细胞凋亡的试剂、蛋白酶体抑制剂、和放射(例如局部或全身放射)。
标准护理治疗剂包括阿那曲唑
Figure BDA0001717945540001581
比卡鲁胺
Figure BDA0001717945540001582
硫酸博莱霉素
Figure BDA0001717945540001583
白消安
Figure BDA0001717945540001584
白消安注射液
Figure BDA0001717945540001585
卡培他滨
Figure BDA0001717945540001586
N4-戊氧基羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂
Figure BDA0001717945540001587
卡莫司汀
Figure BDA0001717945540001588
瘤可宁
Figure BDA0001717945540001589
顺铂
Figure BDA00017179455400015810
克拉屈滨
Figure BDA00017179455400015811
环磷酰胺(
Figure BDA00017179455400015812
或
Figure BDA00017179455400015813
)、阿糖孢苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷
Figure BDA00017179455400015814
阿糖胞苷脂质体注射液
Figure BDA00017179455400015815
达卡巴嗪
Figure BDA00017179455400015816
更生霉素(放线菌素D，Cosmegan)、盐酸柔红霉素
Figure BDA00017179455400015817
柔红霉素柠檬酸盐脂质体注射液
Figure BDA00017179455400015818
地塞米松、多西他赛
Figure BDA00017179455400015819
盐酸阿霉素
Figure BDA00017179455400015820
依托泊苷
Figure BDA00017179455400015821
磷酸氟达拉滨
Figure BDA00017179455400015823
5-氟尿嘧啶(
Figure BDA00017179455400015824
Figure BDA00017179455400015825
)、氟他胺
Figure BDA00017179455400015826
tezacitibine、吉西他滨(双氟脱氧胞苷)、羟基脲
Figure BDA00017179455400015827
伊达比星
Figure BDA00017179455400015828
异环磷酰胺
Figure BDA00017179455400015829
伊立替康
Figure BDA00017179455400015830
L-天冬酰胺酶
Figure BDA00017179455400015831
亚叶酸钙、美法仑
Figure BDA00017179455400015832
6-巯嘌呤
Figure BDA00017179455400015833
甲氨蝶呤
Figure BDA0001717945540001591
米托蒽醌
Figure BDA0001717945540001592
Figure BDA0001717945540001593
Figure BDA0001717945540001594
phoenix(Yttrium90/MX-DTPA)、喷司他丁、以聚苯丙生20为载体的卡莫司汀植入膜剂(polifeprosan 20with carmustine implant)
Figure BDA0001717945540001595
枸橼酸它莫西芬
Figure BDA0001717945540001596
替尼泊苷
Figure BDA0001717945540001597
6-硫鸟嘌呤、噻替派、替拉扎明
Figure BDA0001717945540001598
注射用盐酸拓扑替康
Figure BDA0001717945540001599
长春花碱
Figure BDA00017179455400015910
长春新碱
Figure BDA00017179455400015911
长春瑞滨
Figure BDA00017179455400015912
依鲁替尼、艾德拉尼(idelalisib)以及色瑞替尼。
示例性烷基化剂包括氮芥子气、乙撑亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯：乌拉莫司汀(Aminouracil
Figure BDA00017179455400015913
Figure BDA00017179455400015914
Figure BDA00017179455400015915
UracilNitrogen
Figure BDA00017179455400015916
Figure BDA00017179455400015917
)、氮芥
Figure BDA00017179455400015918
环磷酰胺(
Figure BDA00017179455400015919
Figure BDA00017179455400015920
RevimmuneTM)、异环磷酰胺
Figure BDA00017179455400015921
美法仑
Figure BDA00017179455400015922
瘤可宁
Figure BDA00017179455400015923
胍血生
Figure BDA00017179455400015924
三乙撑蜜胺
Figure BDA00017179455400015925
三亚乙基硫代磷酰胺、替莫唑胺
Figure BDA00017179455400015926
噻替派
Figure BDA00017179455400015927
白消安
Figure BDA00017179455400015928
卡莫司汀
Figure BDA00017179455400015929
环己亚硝脲
Figure BDA00017179455400015930
和链脲菌素
Figure BDA00017179455400015931
附加示例性烷基化剂包括奥沙利铂
Figure BDA00017179455400015932
替莫唑胺(
Figure BDA00017179455400015933
和
Figure BDA00017179455400015934
)、更生霉素(也称为放线菌素D，
Figure BDA00017179455400015935
)、六甲蜜胺(也称为六甲三聚氰胺(HMM)，
Figure BDA00017179455400015936
)、苯达莫司汀
Figure BDA00017179455400015937
卡铂
Figure BDA00017179455400015938
环己亚硝脲(也称为CCNU，
Figure BDA00017179455400015939
)、顺铂(也称为CDDP，
Figure BDA00017179455400015940
和
Figure BDA00017179455400015941
-AQ)、瘤可宁
Figure BDA00017179455400015942
prednumustine、甲苄肼
Figure BDA00017179455400015943
以及噻替派(也称为三亚胺硫磷、TESPA和TSPA，
Figure BDA00017179455400015944
)。
示例性蒽环类抗生素包括例如多柔比星(
Figure BDA00017179455400015945
和
Figure BDA00017179455400015946
)；博莱霉素
Figure BDA00017179455400015947
柔红霉素(盐酸柔红霉素，道诺霉素和柔红霉素盐酸盐，
Figure BDA00017179455400015948
)、柔红霉素脂质体(柔红霉素柠檬酸盐脂质体，
Figure BDA00017179455400015949
)、米托蒽醌(DHAD，
Figure BDA00017179455400015950
)、表柔比星(EllenceTM)、伊达比星(
Figure BDA00017179455400015951
Idamycin
Figure BDA00017179455400015952
)、丝裂霉素C
Figure BDA00017179455400015953
格尔德霉素、除莠霉素、灰暗霉素和去乙酰基拉维霉素。
可与本发明的抗体联合使用的示例性长春花生物碱包括酒石酸长春瑞滨
Figure BDA0001717945540001601
长春新碱
Figure BDA0001717945540001602
以及长春地辛
Figure BDA0001717945540001603
长春花碱(也称为硫酸长春碱，长春质碱和VLB，Alkaban-
Figure BDA0001717945540001604
和
Figure BDA00017179455400016029
)和长春瑞滨
Figure BDA0001717945540001605
可与本发明的抗体联合使用的示例性蛋白酶体抑制剂是硼替佐米
Figure BDA0001717945540001606
卡非佐米
Figure BDA0001717945540001607
伊沙佐米
Figure BDA0001717945540001608
marizomib(NPI-0052)和delanzomib(CEP-18770)。
在一些实施方案中，将本发明的抗体与酪氨酸激酶抑制剂(例如受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂)联合施用。示例性酪氨酸激酶抑制剂包括表皮生长因子(EGF)途径抑制剂(例如表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂)、血管内皮生长因子(VEGF)途径抑制剂(例如血管内皮生长因子受体(VEGFR)抑制剂(例如VEGFR-1抑制剂、VEGFR-2抑制剂、VEGFR-3抑制剂)、血小板衍生生长因子(PDGF)途径抑制剂(例如血小板衍生生长因子受体(PDGFR)抑制剂(例如PDGFR-β抑制剂)、RAF-1抑制剂、KIT抑制剂和RET抑制剂。在一些实施方案中，第二治疗剂为阿西替尼(AG013736)、博舒替尼(SKI-606)、西地尼布(RECENTINTM，AZD2171)、达沙替尼(
Figure BDA0001717945540001609
BMS-354825)、埃罗替尼
Figure BDA00017179455400016010
吉非替尼
Figure BDA00017179455400016011
伊马替尼(
Figure BDA00017179455400016012
CGP57148B，STI-571)、拉帕替尼
Figure BDA00017179455400016013
来他替尼(CEP-701)、来那替尼(HKI-272)、尼罗替尼
Figure BDA00017179455400016014
司马沙尼(semaxinib，SU5416)、舒尼替尼(
Figure BDA00017179455400016015
SU11248)、托西尼布
Figure BDA00017179455400016016
凡德他尼(
Figure BDA00017179455400016017
ZD6474)、瓦他拉尼(PTK787，PTK/ZK)、曲妥单抗
Figure BDA00017179455400016018
贝伐单抗
Figure BDA00017179455400016019
利妥昔单抗
Figure BDA00017179455400016020
西妥昔单抗
Figure BDA00017179455400016021
帕尼单抗
Figure BDA00017179455400016022
兰尼单抗
Figure BDA00017179455400016023
尼罗替尼
Figure BDA00017179455400016024
索拉非尼
Figure BDA00017179455400016025
阿仑单抗
Figure BDA00017179455400016026
吉妥单抗
Figure BDA00017179455400016027
ENMD-2076、PCI-32765、AC220、多韦替尼乳酸盐(TKI258，CHIR-258)、BIBW 2992(TOVOKTM)、SGX523、PF-04217903、PF-02341066、PF-299804、BMS-777607、ABT-869、MP470、BIBF 1120
Figure BDA00017179455400016028
AP24534、JNJ-26483327、MGCD265、DCC-2036、BMS-690154、CEP-11981、替沃扎尼(AV-951)、OSI-930、MM-121、XL-184、XL-647、XL228、AEE788、AG-490、AST-6、BMS-599626、CUDC-101、PD153035、培利替尼(EKB-569)、凡德他尼(zactima)、WZ3146、WZ4002、WZ8040、ABT-869(利尼伐尼)、AEE788、AP24534(帕纳替尼)、AV-951(替沃扎尼)、阿西替尼、BAY 73-4506(瑞格拉非尼)、丙氨酸布立尼布(BMS-582664)、布立尼布(BMS-540215)、西地尼布(AZD2171)、CHIR-258(多韦替尼)、CP 673451、CYC116、E7080、Ki8751、马赛替尼(AB1010)、MGCD-265、二磷酸莫替沙尼(AMG-706)、MP-470、OSI-930、盐酸帕唑帕尼、PD173074、甲苯磺酸索拉非尼(Bay 43-9006)、SU5402、TSU-68(SU6668)、瓦他拉尼、XL880(GSK1363089，EXEL-2880)。所选择的酪氨酸激酶抑制剂选自舒尼替尼、埃罗替尼、吉非替尼、或索拉非尼。在一些实施方案中，EGFR抑制剂是包含SEQ ID NO:249、250、251和252的重链和轻链的双特异性EGFRc-Met抗体(EM-1mAb)(US2014/0141000)。
在一些实施方案中，将本发明的抗体与包括如下的血管内皮生长因子(VEGF)受体抑制剂联合施用：贝伐单抗
Figure BDA0001717945540001611
阿西替尼
Figure BDA0001717945540001612
丙氨酸布立尼布(BMS-582664，(S)—((R)-1-(4-(4-氟-2-甲基-1H-吲哚-5-基氧基)-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基氧基)丙-2-基)2-氨基丙酸酯)、索拉非尼
Figure BDA0001717945540001613
Pazopanib
Figure BDA0001717945540001614
苹果酸舒尼替尼
Figure BDA0001717945540001615
西地尼布(AZD2171，CAS 288383-20-1)、尼达尼布(BIBF1120，CAS 928326-83-4)、foretinib(GSK1363089)、替拉替尼(BAY57-9352，AS332012-40-5)、阿帕替尼(YN968D1，CAS 811803-05-1)、伊马替尼
Figure BDA0001717945540001616
帕纳替尼(AP24534,CAS 943319-70-8)、替沃扎尼(AV951，CAS 475108-18-0)、瑞格拉非尼(BAY73-4506，CAS 755037-03-7)、瓦他拉尼二盐酸盐(PTK787，CAS 212141-51-0)、布立尼布(BMS-540215，CAS 649735-46-6)、凡德他尼(
Figure BDA0001717945540001617
或AZD6474)、二磷酸莫替沙尼(AMG706，CAS 857876-30-3，N-(2,3-二氢-3,3-二甲基-1H-吲哚-6-基)-2-[(4-吡啶基甲基)氨基]-3-吡啶甲酰胺，描述于PCT公布WO 02/066470)、二乳酸多韦替尼(TKI258，CAS 852433-84-2)、linfanib(ABT869，CAS 796967-16-3)；卡博替尼(XL184，CAS849217-68-1)、来他替尼(CAS 111358-88-4)；N-[5-[[[5-(1,1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫代]-2-噻唑基]-4-哌啶甲酰胺(BMS38703，CAS345627-80-7)；(3R,4R)-4-氨基-1-((4-((3-甲氧苯基)氨基)吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-5-基)甲基)哌啶-3-醇(BMS690514)；N-(3,4-二氯-2-氟代苯基)-6-甲氧基-7-[[(3aα,5β,6aα)-八氢-2-甲基环戊二烯并[c]吡咯-5-基]甲氧基]-4-氨基喹唑啉(XL647，CAS 781613-23-8)；4-甲基-3-[[1-甲基-6-(3-吡啶基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基]氨基]-N-[3-(三氟甲基)苯基]-苯甲酰胺(BHG712，CAS940310-85-0)；以及阿柏西普
Figure BDA0001717945540001621
在一些实施方案中，将本发明的抗体与PI3K抑制剂联合施用。在一个实施方案中，PI3K抑制剂是PI3K的δ和γ同工型抑制剂。可使用的示例性PI3K抑制剂在例如WO 2010/036380、WO 2010/006086、WO 09/114870、WO 05/113556、GSK 2126458、GDC-0980、GDC-0941、Sanofi XL147、XL756、XL147、PF-46915032、BKM 120、CAL-101、CAL 263、SF1126、PX-886、以及双重PI3K抑制剂(例如Novartis BEZ235)中有所描述。
在一些实施方案中，将本发明的抗体与mTOR抑制剂联合施用，例如选自以下项中一者或多者的一种或多种mTOR抑制剂：雷帕霉素、西罗莫司脂化物
Figure BDA0001717945540001622
AZD8055、BEZ235、BGT226、XL765、PF-4691502、GDC0980、SF1126、OSI-027、GSK1059615、KU-0063794、WYE-354、Palomid 529(P529)、PF-04691502、或PKI-587、地磷莫司(通常称为deferolimus，(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧代-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基次膦酸酯，也称为AP23573和MK8669，并且在PCT公布WO 03/064383中有所描述)；依维莫司(
Figure BDA0001717945540001623
或RAD001)；雷帕霉素(AY22989，
Figure BDA0001717945540001624
)；simapimod(CAS 164301-51-3)；emsirolimus，(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502，CAS1013101-36-4)；以及N2-[1,4-二氧代基-4-[[4-(4-氧代基-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)吗啉鎓-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨酰甘氨酰基-L-α-天冬氨酰基L-丝氨酸-(SEQ ID NO:237)内盐(SF1126，CAS 936487-67-1)和XL765。
在一些实施方案中，将本发明的抗体与BRAF抑制剂例如GSK2118436、RG7204、PLX4032、GDC-0879、PLX4720和甲苯磺酸索拉非尼(Bay 43-9006)联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的抗体与MEK抑制剂联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的抗体与JAK2抑制剂例如CEP-701、INCB18424、CP-690550(tasocitinib)联合施用。
在一些实施方案中，将本发明的抗体与紫杉醇或紫杉醇试剂例如
Figure BDA0001717945540001631
蛋白结合紫杉醇(例如
Figure BDA0001717945540001632
)联合施用。示例性紫杉醇试剂包括纳米粒子白蛋白结合紫杉醇(ABRAXANE，由Abraxis Bioscience销售)、二十二碳六烯酸结合紫杉醇(DHA-紫杉醇，Taxoprexin，由Protarga销售)、聚谷氨酸酯结合紫杉醇(PG-紫杉醇，聚谷氨酸紫杉醇，CT-2103，XYOTAX，由Cell Therapeutic销售)、肿瘤活化的前药(TAP)、ANG105(与三个紫杉醇分子结合的血管肽-2，由ImmunoGen销售)、紫杉醇-EC-1(结合erbB2-识别肽EC-1的紫杉醇；参见Li等人，Biopolymers(2007)87:225-230)、以及葡萄糖缀合的紫杉醇(例如2'-紫杉醇甲基2-吡喃葡糖基琥珀酸酯，参见Liu等人，(2007)Bioorganic&Medicinal ChemistryLetters 17:617-620)。
在一些实施方案中，将本发明的抗体与细胞免疫治疗剂联合施用(例如普列威(Provenge)(例如西普鲁塞))，并且任选地与环磷酰胺联合施用。
可与本发明的抗体联合使用来治疗胰腺癌的示例性治疗剂包括化疗药，例如紫杉醇或紫杉醇试剂(例如紫杉醇制剂，诸如紫杉酚、白蛋白稳定的纳米颗粒紫杉醇制剂(例如ABRAXANE)或紫杉醇脂质体制剂)；吉西他滨(例如单独或与AXP107-11组合的吉西他滨)；其它化疗药，诸如奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、卡培他滨、鲁比替康、盐酸表柔比星、NC-6004、顺铂、多西他赛(例如TAXOTERE)、丝裂霉素C、异环磷酰胺；干扰素；酪氨酸激酶抑制剂(例如EGFR抑制剂(例如埃罗替尼、帕尼单抗、西妥昔单抗、尼妥珠单抗))；HER2/neu受体抑制剂(例如曲妥单抗)；双重激酶抑制剂(例如博舒替尼、塞卡替尼、拉帕替尼、凡德他尼)；多重激酶抑制剂(例如索拉非尼、舒尼替尼、XL184、帕唑帕尼)；VEGF抑制剂(例如贝伐单抗、AV-951、布立尼布)；放射免疫治疗剂(例如XR303)；癌症疫苗(例如GVAX，存活蛋白肽)；COX-2抑制剂(例如塞来考昔)；IGF-1受体抑制剂(例如AMG 479，MK-0646)；mTOR抑制剂(例如依维莫司，西罗莫司脂化物)、IL-6抑制剂(例如CNTO328)；细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(例如P276-00，UCN-01)；定向能量代谢改变(AEMD)的化合物(例如CPI-613)；HDAC抑制剂(例如伏立诺他)；TRAIL受体2(TR-2)激动剂(例如可那木单抗(conatumumab))；MEK抑制剂(例如AS703026、司美替尼、GSK1120212)；Raf/MEK双重激酶抑制剂(例如RO5126766)、Notch信号转导抑制剂(例如MK0752)、单克隆抗体-抗体融合蛋白(例如L19IL2)、姜黄素；HSP90抑制剂(例如坦螺旋霉素，STA-9090)、rIL-2；地尼白介素；拓扑异构酶1抑制剂(例如伊立替康，PEP02)；斯达汀(例如辛伐他汀)、因子VIIa抑制剂(例如PCI-27483)、AKT抑制剂(例如RX-0201)、低氧活化的前药(例如TH-302)、盐酸二甲双胍、γ-分泌酶抑制剂(例如R04929097)、核糖核苷酸还原酶抑制剂(例如3-AP)、免疫毒素(例如HuC242-DM4)、PARP抑制剂(例如KU-0059436，聚合酶抑制剂)CTLA-4抑制剂(例如CP-675,206，易普利姆玛)、AdV-tk治疗剂、蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米(万珂)、NPI-0052)、噻唑烷二酮(例如吡格列酮)、NPC-1C；光激酶抑制剂(例如R763/AS703569)、CTGF抑制剂(例如FG-3019)、siG12D LODER和放射疗法(例如螺旋断层放疗、立体定向放射、质子疗法)、外科手术，以及它们的组合。在某些实施方案中，可将紫杉醇或紫杉醇试剂、以及吉西他滨与本发明的抗体联合使用。
可与本发明的抗体联合使用来治疗小细胞肺癌(SCLC)的示例性治疗剂包括被批准用于治疗SCLC的药物，例如甲氨蝶呤
Figure BDA0001717945540001641
Figure BDA0001717945540001642
依维莫司
Figure BDA0001717945540001643
盐酸阿霉素、磷酸依托泊苷
Figure BDA0001717945540001644
盐酸拓扑替康
Figure BDA0001717945540001645
盐酸氮芥
Figure BDA0001717945540001646
盐酸拓扑替康。可使用的其它治疗剂是卡铂、顺铂、奥沙利铂、伊立替康、吉西他滨、脂质体SN-38、苯达莫司汀、替莫唑胺、贝洛替康、NK012、FR901228、flavopiridol)、酪氨酸激酶抑制剂(例如EGFR抑制剂(例如埃罗替尼、吉非替尼、西妥昔单抗、帕尼单抗)、多重激酶抑制剂(例如索拉非尼、舒尼替尼)、VEGF抑制剂(例如贝伐单抗、凡德他尼)、癌症疫苗(例如GVAX)；Bcl-2抑制剂(例如奥利默森钠，ABT-263)、蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米(万珂)，NPI-0052)、紫杉醇或紫杉醇试剂；多西他赛、IGF-1受体抑制剂(例如AMG 479)、HGF/SF抑制剂(例如AMG 102、MK-0646)、氯喹、极光激酶抑制剂(例如MLN8237)、放射治疗剂(例如TF2)、HSP90抑制剂(例如坦螺旋霉素，STA-9090)、mTOR抑制剂(例如依维莫司)、Ep-CAM/CD3-双特异性抗体(例如MT110)、CK-2抑制剂(例如CX-4945)、HDAC抑制剂(例如贝利司他)、SMO拮抗剂(例如BMS 833923)、肽癌症疫苗、以及放射治疗(例如调强放射疗法(IMRT)、大分割放疗、缺氧引导的放射疗法)、外科手术、以及它们的组合。
可与本发明的抗体联合使用来治疗非小细胞肺癌的示例性治疗剂包括被批准用于治疗NSCLC的药物，包括甲氨蝶呤
Figure BDA0001717945540001651
紫杉醇
Figure BDA0001717945540001652
阿法替尼
Figure BDA0001717945540001653
依维莫司
Figure BDA0001717945540001654
艾乐替尼
Figure BDA0001717945540001655
培美曲塞二钠
Figure BDA0001717945540001656
贝伐单抗
Figure BDA0001717945540001657
卡铂、色瑞替尼
Figure BDA0001717945540001658
克里唑蒂尼
Figure BDA0001717945540001659
雷莫芦单抗
Figure BDA00017179455400016510
多西他赛、依维莫司
Figure BDA00017179455400016511
吉非替尼
Figure BDA00017179455400016512
马来酸阿法替尼
Figure BDA00017179455400016513
盐酸吉西他滨
Figure BDA00017179455400016514
派姆单抗
Figure BDA00017179455400016515
盐酸氮芥
Figure BDA00017179455400016516
酒石酸长春瑞滨
Figure BDA00017179455400016517
耐昔妥珠单抗
Figure BDA00017179455400016518
纳武单抗
Figure BDA00017179455400016519
奥希替尼、紫杉醇
Figure BDA00017179455400016520
卡铂、培美曲塞二钠、雷莫芦单抗
Figure BDA00017179455400016521
奥希替尼
Figure BDA00017179455400016522
可使用的其它治疗剂是长春瑞滨、顺铂、多西他赛、培美曲塞二钠、依托泊苷、吉西他滨、卡铂、脂质体SN-38、TLK286、替莫唑胺、拓扑替康、培美曲塞二钠、阿扎胞苷、伊立替康、替加氟-吉莫斯特-氧嗪酸钾、sapacitabine)、酪氨酸激酶抑制剂(例如EGFR抑制剂(例如埃罗替尼、吉非替尼、西妥昔单抗、帕尼单抗、耐昔妥珠单抗、PF-00299804、尼妥珠单抗、RO5083945)、MET抑制剂(例如PF-02341066、ARQ 197)、PI3K激酶抑制剂(例如XL147、GDC-0941)、Raf/MEK双重激酶抑制剂(例如RO5126766)、PI3K/mTOR双重激酶抑制剂(例如XL765)、SRC抑制剂(例如达沙替尼)、双重抑制剂(例如BIBW 2992、GSK1363089、ZD6474、AZD0530、AG-013736、拉帕替尼、MEHD7945A、利尼伐尼)、多重激酶抑制剂(例如索拉非尼、舒尼替尼、帕唑帕尼、AMG 706、XL184、MGCD265、BMS-690514、R935788)、VEGF抑制剂(例如恩度、内皮抑素、贝伐单抗、西地尼布、BIBF 1120、阿西替尼、替沃扎尼、AZD2171)、癌症疫苗(例如BLP25脂质体疫苗、GVAX、表达L523S蛋白质的重组DNA和腺病毒)、Bcl-2抑制剂(例如奥利默森钠)、蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米、卡非佐米、NPI-0052、MLN9708)、紫杉醇或紫杉醇试剂、多西他赛、IGF-1受体抑制剂(例如西妥木单抗、MK-0646、OSI 906、CP-751,871、BIIB022)、羟化氯喹、HSP90抑制剂(例如坦螺旋霉素、STA-9090、AUY922、XL888)、mTOR抑制剂(例如依维莫司、西罗莫司脂化物、地磷莫司)、Ep-CAM/CD3-双特异性抗体(例如MT110)、CK-2抑制剂(例如CX-4945)、HDAC抑制剂(例如MS275、LBH589、伏立诺他、丙戊酸、FR901228)、DHFR抑制剂(例如普拉曲沙)、维甲酸(例如蓓萨罗丁、维A酸)、抗体-药物缀合物(例如SGN-15)、二磷酸盐(例如唑来膦酸)、癌症疫苗(例如belagenpumatucel-L)、低分子量肝素(LMWH)(例如亭扎肝素、依诺肝素)、GSK1572932A、褪黑激素、重组人乳铁蛋白(talactoferrin)、地美司钠、拓扑异构酶抑制剂(例如氨柔比星、依托泊苷、karenitecin)、奈非那韦、西仑吉肽、ErbB3抑制剂(例如MM-121、U3-1287)、生存素抑制剂(例如YM155、LY2181308)、甲磺酸艾日布林、COX-2抑制剂(例如塞来昔布)、乙二醇化非格司亭、Polo-样激酶1抑制剂(例如BI 6727)、TRAIL受体2(TR-2)激动剂(例如CS-1008)、CNGRC肽(SEQ ID NO:225)-TNFα缀合物、二氯乙酸盐(DCA)、HGF抑制剂(例如SCH900105)、SAR240550、PPAR-γ激动剂(例如CS-7017)、γ分泌酶抑制剂(例如RO4929097)、表观遗传治疗剂(例如5-阿扎胞苷)、硝酸甘油、MEK抑制剂(例如AZD6244)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(例如UCN-01)、胆固醇-Fus1、抗微管蛋白剂(例如E7389)、法尼基-OH-转移酶抑制剂(例如洛那法尼)、免疫毒素(例如BB-10901、SS1(dsFv)PE38)、磺达肝癸钠、血管破裂剂(例如AVE8062)、PD-L1抑制剂(例如MDX-1105、MDX-1106)、β-葡聚糖、NGR-hTNF、EMD 521873、MEK抑制剂(例如GSK1120212)、埃博霉素类似物(例如伊沙匹隆)、纺锤体驱动蛋白抑制剂(例如4SC-205)、端粒靶向试剂(例如KML-001)、P70途径抑制剂(例如LY2584702)、AKT抑制剂(例如MK-2206)、血管生成抑制剂(例如来那度胺)、Notch信号转导抑制剂(例如OMP-21M18)、EGFR/c-Met双特异性抗体EM-1(如US2014/0141000A1所述)、放射疗法、外科手术、以及它们的组合。
可与本发明的抗体联合使用来治疗卵巢癌的示例性治疗剂包括被批准用于治疗卵巢癌的药物，例如美法仑
Figure BDA0001717945540001671
贝伐单抗
Figure BDA0001717945540001672
卡铂、环磷酰胺
Figure BDA0001717945540001673
顺铂(clisplatin)、盐酸阿霉素、盐酸吉西他滨
Figure BDA0001717945540001674
盐酸拓扑替康
Figure BDA0001717945540001675
奥拉帕尼
Figure BDA0001717945540001676
卡铂、顺铂、紫杉醇
Figure BDA0001717945540001677
噻替哌和盐酸拓扑替康。可使用的其它治疗剂是异环磷酰胺、奥拉帕尼、奥沙利铂、培美曲塞二钠、SJG-136、依托泊苷、地西他滨；免疫治疗剂(例如APC8024、奥戈伏单抗、OPT-821)、酪氨酸激酶抑制剂(例如EGFR抑制剂(例如埃罗替尼)、双重抑制剂(例如E7080)、多重激酶抑制剂(例如AZD0530、JI-101、索拉非尼、舒尼替尼、帕唑帕尼)、VEGF抑制剂(例如贝伐单抗、BIBF 1120、西地尼布、AZD2171)、PDGFR抑制剂(例如IMC-3G3)、紫杉醇、拓扑异构酶抑制剂(例如karenitecin、伊立替康)、HDAC抑制剂(例如丙戊酸钠、伏立诺他)、叶酸受体抑制剂(例如抗叶酸受体α单克隆抗体(farletuzumab))、血管生成素抑制剂(例如AMG 386)、埃博霉素类似物(例如伊沙匹隆)、蛋白酶体抑制剂(例如卡非佐米)、IGF-1受体抑制剂(例如OSI 906/AMG 479)、PARP抑制剂(例如维利帕尼，AG014699,iniparib，MK-4827)、极光激酶抑制剂(例如MLN8237,ENMD-2076)、血管生成抑制剂(例如来那度胺)、DHFR抑制剂(例如普拉曲沙)、放射免疫治疗剂(例如Hu3S193)、他汀类(例如洛伐他汀)、拓扑异构酶1抑制剂(例如NKTR-102)、癌症疫苗(例如p53合成长肽疫苗、自体OC-DC疫苗)、mTOR抑制剂(例如西罗莫司脂化物、依维莫司)、BCR/ABL抑制剂(例如伊马替尼)、ET-A受体拮抗剂(例如ZD4054)、TRAIL受体2(TR-2)激动剂(例如CS-1008)、HGF/SF抑制剂(例如AMG 102)、EGEN-001、Polo-样激酶1抑制剂(例如BI 6727)、γ分泌酶抑制剂(例如RO4929097)、Wee-1抑制剂(例如MK-1775)、抗微管蛋白剂(例如长春瑞滨，E7389)、免疫毒素(例如地尼白介素)、SB-485232、血管破裂剂(例如AVE8062)、整联蛋白抑制剂(例如EMD 525797)、纺锤体驱动蛋白抑制剂(例如4SC-205)、来那度胺、HER2抑制剂(例如MGAH22)、ErrB3抑制剂(例如MM-121)、放射疗法、以及它们的组合。
可与本发明的抗体联合使用来治疗骨髓瘤的示例性治疗剂包括一种或多种化学疗法或其它抗癌剂(例如沙利度胺类似物，例如来那度胺)、HSCT(Cook,(2008)J ManagCare Pharm.14(7Suppl):19-25)、抗-TIM-3抗体(Hallett等人(2011)J of AmericanSociety for Blood and Marrow Transplantation 17(8):1133-145)、肿瘤抗原脉冲的树突状细胞、肿瘤细胞和树突状细胞的融合体(例如电融合体)、或用恶性浆细胞产生的免疫球蛋白特异型接种(综述于Yi(2009)Cancer J 15(6):502-10)。
可与本发明的抗体联合使用来治疗肾癌例如肾细胞癌(RCC)或转移性RCC的示例性治疗剂包括被批准用于治疗RCC的药物，包括依维莫司
Figure BDA0001717945540001681
阿地白介素、贝伐单抗
Figure BDA0001717945540001682
阿西替尼
Figure BDA0001717945540001683
苹果酸卡博替尼
Figure BDA0001717945540001684
阿地白介素
Figure BDA0001717945540001685
甲磺酸乐伐替尼
Figure BDA0001717945540001686
甲苯磺酸索拉非尼
Figure BDA0001717945540001687
纳武单抗
Figure BDA0001717945540001688
盐酸帕唑帕尼、甲苯磺酸索拉非尼、舒尼替尼
Figure BDA0001717945540001689
西罗莫司脂化物
Figure BDA00017179455400016810
和盐酸帕唑帕尼
Figure BDA00017179455400016811
可使用的其它治疗剂是靶向试剂(例如VEGF抑制剂，如抗VEGF的单克隆抗体，例如贝伐单抗、VEGF酪氨酸激酶抑制剂，如索拉非尼、阿西替尼和帕唑帕尼)。
可与本发明的抗体联合使用来治疗慢性髓细胞性白血病(AML)的示例性治疗剂包括化疗剂(例如阿糖孢苷、羟基脲、氯法拉滨、美法仑、噻替派、氟达拉滨、白消安、依托泊苷、虫草素、喷司他丁、卡培他滨、阿扎胞苷、环磷酰胺、克拉屈滨、拓扑替康)、酪氨酸激酶抑制剂(例如BCR/ABL抑制剂(例如伊马替尼、尼罗替尼)、双重抑制剂(例如达沙替尼、博舒替尼)、多重激酶抑制剂(例如DCC-2036、帕纳替尼、索拉非尼、舒尼替尼、RGB-286638)、干扰素α、类固醇、凋亡剂(例如高三尖杉酯碱(omacetaxine mepesuccinat))、免疫治疗剂(例如异源CD4+记忆Th1-样T细胞/微粒结合抗-CD3/抗-CD28、自体细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)、AHN-12)、CD52靶向试剂(例如阿仑单抗)、HSP90抑制剂(例如坦螺旋霉素，STA-9090，AUY922，XL888)、mTOR抑制剂(例如依维莫司)、SMO拮抗剂(例如BMS 833923)、核糖核苷酸还原酶抑制剂(例如3-AP)、JAK-2抑制剂(例如INCB018424)、羟化氯喹、维甲酸(例如芬维A胺)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(例如UCN-01)、HDAC抑制剂(例如贝利司他、伏立诺他，JNJ-26481585)、PARP抑制剂(例如veliparib)、MDM2拮抗剂(例如RO5045337)、极光体B激酶抑制剂(例如TAK-901)、放射免疫疗法(例如锕-225-标记的抗-CD33抗体HuM 195)、Hedgehog抑制剂(例如PF-04449913)、STAT3抑制剂(例如OPB-31121)、KB004、癌症疫苗(例如AG858)、骨髓移植、干细胞移植、放射疗法、以及它们的组合。
可与本发明的抗体联合使用来治疗慢性淋巴细胞白血病(CLL)的示例性治疗剂包括化疗药(例如氟达拉滨、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、瘤可宁、苯达莫司汀、瘤可宁、白消安、吉西他滨、美法仑、喷司他丁、米托蒽醌、5-氮胞苷、培美曲塞二钠)、酪氨酸激酶抑制剂(例如EGFR抑制剂(例如埃罗替尼)、BTK抑制剂(例如PCI-32765(依鲁替尼)、多重激酶抑制剂(例如MGCD265、RGB-286638)、CD-20靶向试剂(例如利妥昔单抗、奥法木单抗、RO5072759、LFB-R603)、CD52靶向试剂(例如阿仑单抗)、泼尼松龙、达依泊汀α、来那度胺、Bcl-2抑制剂(例如ABT-263)、免疫疗法(例如异源CD4+记忆Th1-样T细胞/微粒结合抗-CD3/抗-CD28、自体细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)、HDAC抑制剂(例如伏立诺他、丙戊酸、LBH589、JNJ-26481585、AR-42)、XIAP抑制剂(例如AEG35156)、CD-74靶向试剂(例如马妥珠单抗(milatuzumab))、mTOR抑制剂(例如依维莫司)、AT-101、免疫毒素(例如CAT-8015，抗-Tac(Fv)-PE38(LMB-2))、CD37靶向试剂(例如TRU-016)、放射免疫治疗剂(例如131-托西莫单抗)、羟化氯喹、哌立福辛、SRC抑制剂(例如达沙替尼)、萨力多胺、PI3Kδ抑制剂(例如CAL-101)、维甲酸(例如芬维A胺)、MDM2拮抗剂(例如RO5045337)、普乐沙福、极光激酶抑制剂(例如MLN8237、TAK-901)、蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)、CD-19靶向试剂(例如MEDI-551、MOR208)、MEK抑制剂(例如ABT-348)、JAK-2抑制剂(例如INCB018424)、低氧活化的前药(例如TH-302)、紫杉醇或紫杉醇试剂、HSP90抑制剂、AKT抑制剂(例如MK2206)、HMG-CoA抑制剂(例如辛伐他汀)、GNKG186、放射疗法、骨髓移植、干细胞移植、以及它们的组合。
可与本发明的抗体联合使用来治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)的示例性治疗剂包括化疗药(例如泼尼松龙、地塞米松、长春新碱、天冬酰胺酶、柔红霉素、环磷酰胺、阿糖孢苷、依托泊苷、硫鸟嘌呤、巯嘌呤、氯法拉滨、annamycin脂质体、白消安、依托泊苷、卡培他滨、地西他滨、阿扎胞苷、拓扑替康、替莫唑胺)、酪氨酸激酶抑制剂(例如BCR/ABL抑制剂(例如伊马替尼、尼罗替尼)、ON 01910.Na、多重激酶抑制剂(例如索拉非尼)、CD-20靶向试剂(例如利妥昔单抗)、CD52靶向试剂(例如阿仑单抗)、HSP90抑制剂(例如STA-9090)、mTOR抑制剂(例如依维莫司、雷帕霉素)、JAK-2抑制剂(例如INCB018424)、HER2/neu受体抑制剂(例如曲妥单抗)、蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)、甲氨蝶呤、天冬酰胺酶、CD-22靶向试剂(例如依帕珠单抗(epratuzumab)/奥英妥珠单抗(inotuzumab))、免疫疗法(例如自体细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)、AHN-12)、博纳吐单抗、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(例如UCN-01)、CD45靶向试剂(例如BC8)、MDM2拮抗剂(例如RO5045337)、免疫毒素(例如CAT-8015、DT2219ARL)、HDAC抑制剂(例如JNJ-26481585)、JVRS-100、紫杉醇或紫杉醇试剂、STAT3抑制剂(例如OPB-31121)、PARP抑制剂(例如veliparib)、EZN-2285、放射疗法、类固醇、骨髓移植、干细胞移植、或它们的组合。
可与本发明的抗体联合使用来治疗急性髓性白血病(AML)的示例性治疗剂包括化疗药(例如阿糖孢苷、道诺霉素、伊达比星、氯法拉滨、地西他滨、癌喹诺酮衍生物(vosaroxin)、阿扎胞苷、氯法拉滨、利巴韦林、CPX-351、苏消安、艾西拉滨、阿扎胞苷)、酪氨酸激酶抑制剂(例如BCR/ABL抑制剂(例如伊马替尼、尼罗替尼)、ON 01910.Na、多重激酶抑制剂(例如米哚妥林、SU 11248、奎扎替尼(quizartinib)、索拉非尼)、免疫毒素(例如吉妥单抗)、DT388IL3融合蛋白、HDAC抑制剂(例如伏立诺他、LBH589)、普乐沙福、mTOR抑制剂(例如依维莫司)、SRC抑制剂(例如达沙替尼)、HSP90抑制剂(例如STA-9090)、维甲酸(例如蓓萨罗丁)、极光激酶抑制剂(例如BI 811283)、JAK-2抑制剂(例如INCB018424)、Polo-样激酶抑制剂(例如BI 6727)、cenersen、CD45靶向试剂(例如BC8)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(例如UCN-01)、MDM2拮抗剂(例如RO5045337)、mTOR抑制剂(例如依维莫司)、LY573636-钠、ZRx-101、MLN4924、来那度胺、免疫疗法(例如AHN-12)、组胺二盐酸盐、放射疗法、骨髓移植、干细胞移植、以及它们的组合。
可与本发明的抗体联合使用来治疗多发性骨髓瘤(MM)的示例性治疗剂包括化疗药(例如美法仑、氨磷汀、环磷酰胺、多柔比星、氯法拉滨、苯达莫司汀、氟达拉滨、阿霉素、SyB L-0501)、萨力多胺、来那度胺、地塞米松、泼尼松、泊马度胺、蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米、卡非佐米、MLN9708)、癌症疫苗(例如GVAX)、CD-40靶向试剂(例如SGN-40、CHIR-12.12)、哌立福辛、唑来膦酸、免疫治疗剂(例如MAGE-A3、NY-ESO-1、HuMax-CD38)、HDAC抑制剂(例如伏立诺他、LBH589、AR-42)、aplidin、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(例如PD-0332991、dinaciclib)、三氧化二砷、CB3304、HSP90抑制剂(例如KW-2478)、酪氨酸激酶抑制剂(例如EGFR抑制剂(例如西妥昔单抗)、多重激酶抑制剂(例如AT9283)、VEGF抑制剂(例如贝伐单抗)、普乐沙福、MEK抑制剂(例如AZD6244)、IPH2101、阿托伐他汀、免疫毒素(例如BB-10901)、NPI-0052、放射免疫治疗剂(例如钇Y 90替伊莫单抗)、STAT3抑制剂(例如OPB-31121)、MLN4924、极光激酶抑制剂(例如ENMD-2076)、IMGN901、ACE-041、CK-2抑制剂(例如CX-4945)、抗-CD38抗体(例如
Figure BDA0001717945540001711
(达雷木单抗))、放射疗法、骨髓移植、干细胞移植、以及它们的组合。
可与本发明的抗体联合使用来治疗前列腺癌的示例性治疗剂是被批准用于治疗前列腺癌的药物，例如乙酸阿比特龙
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比卡鲁胺
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卡巴他赛
Figure BDA0001717945540001714
结合雌激素
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雌二醇(stradiol)
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戊酸雌二醇
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酯化雌激素
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地加瑞克
Figure BDA0001717945540001719
多西他赛
Figure BDA00017179455400017110
恩杂鲁胺
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氟他胺、醋酸戈舍瑞林
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卡巴他赛
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醋酸亮丙瑞林
Figure BDA00017179455400017114
盐酸米托蒽醌、尼鲁米特
Figure BDA0001717945540001721
Sipuleucel-T
Figure BDA0001717945540001722
和二氯化镭223
Figure BDA0001717945540001723
可使用的其它药物包括化疗药(例如卡铂、氟达拉滨)、激素治疗剂(例如环丙氯地孕、酮康唑、氨鲁米特、阿巴瑞克、地加瑞克、醋酸亮丙瑞林、曲普瑞林、布舍瑞林)、酪氨酸激酶抑制剂(例如双重激酶抑制剂(例如拉帕替尼)、多重激酶抑制剂(例如索拉非尼、舒尼替尼)、VEGF抑制剂(例如贝伐单抗)、TAK-700、癌症疫苗(例如BPX-101、PEP223)、来那度胺、TOK-001、IGF-1受体抑制剂(例如西妥木单抗)、TRC105、极光A激酶抑制剂(例如MLN8237)、蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)、OGX-011、放射免疫治疗剂(例如HuJ591-GS)、HDAC抑制剂(例如丙戊酸、SB939、LBH589)、羟化氯喹、mTOR抑制剂(例如依维莫司)、多韦替尼乳酸盐、二吲哚甲烷、依法韦仑、OGX-427、染料木黄酮、IMC-3G3、巴氟替尼、CP-675,206、放射疗法、外科手术、或它们的组合。
可与本发明的抗体联合使用来治疗头颈部鳞状上皮细胞癌(HNSCC)的示例性治疗剂包括甲氨蝶呤
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博来霉素
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多西他赛
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爱必妥
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羟基脲
Figure BDA0001717945540001728
或派姆单抗
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在一些实施方案中，将本发明的抗体与TLR激动剂联合施用。
在一些实施方案中，TLR3激动剂是TLR4激动剂。
在一些实施方案中，TLR3激动剂是TLR7/8激动剂。
示例性TLR激动剂是Pam3Cys，TLR-1/2激动剂；CFA，TLR-2激动剂；MALP2，TLR-2激动剂；Pam2Cys，TLR-2激动剂；FSL-1，TLR-2激动剂；Hib-OMPC，TLR-2激动剂；多核糖肌苷酸:多核糖胞啶酸(Poly I:C)，TLR-3激动剂；聚腺苷酸-聚尿苷酸(poly AU)，TLR-3激动剂；用聚-L-赖氨酸和羧甲基纤维素稳定化的聚肌胞苷酸
Figure BDA00017179455400017210
TLR-3激动剂；单磷酰基脂质A(MPL)，TLR-4激动剂；LPS，TLR-4激动剂；细菌鞭毛蛋白，TLR-5激动剂；唾液酸-Tn(STn)，与多个人癌细胞上的MUCI粘蛋白相关联的碳水化合物并且为TLR-4激动剂；咪喹莫特，TLR-7激动剂；瑞喹莫德，TLR-7/8激动剂；洛索立宾，TLR-7/8激动剂；以及未甲基化的CpG二核苷酸(CpG-ODN)，TLR-9激动剂。
示例性TLR4激动剂是特异性结合TLR4的激动性抗体。
在本文所述的一些实施方案中，将本发明的抗体与结合CSF-1R的抗体联合施用。
结合CSF-1R的示例性抗体是国际专利公布WO2013132044中所述的那些。
在本文所述的一些实施方案中，将本发明的抗体与LXRβ激动剂联合施用。
在本文所述的一些实施方案中，将本发明的抗体与DR4激动剂联合施用。
在本文所述的一些实施方案中，将本发明的抗体与DR5激动剂联合施用。
合适的DR4和DR5激动剂描述于例如国际专利公布WO2014159562中。
在本文所述的一些实施方案中，将本发明的抗体与抗-半乳糖凝集素1抗体联合施用。
可与本发明抗体联合使用的示例性抗-半乳糖凝集素1抗体是国际专利公布WO2015013389中所述的那些。
在本文所述的一些实施方案中，将本发明的抗体与BTK抑制剂联合施用。
在一些实施方案中，BTK抑制剂是
Figure BDA0001717945540001731
(依鲁替尼)。
在本文所述的一些实施方案中，将本发明的抗体与抗-HER2抗体联合施用。
在本文所述的一些实施方案中，将本发明的抗体与抗-CD20抗体联合施用。
在一些实施方案中，可采用化疗药如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺、和/或抗体如OKT3或CAMPATH，将本发明的抗体与骨髓移植、T细胞消融治疗剂(例如其之前、同时或之后)结合施用。在一些实施方案中，可在B细胞消融治疗剂(例如与CD20反应的试剂，如美罗华)之后施用本发明的抗体。例如，在一个实施方案中，可在外周血干细胞移植之后，使受试者经受高剂量化学疗法的标准治疗。在某些实施方案中，在移植后，受试者接受本发明的抗体。
在本文所述的一些实施方案中，将本发明的抗体在外科手术之前或之后施用。
在本文所述的一些实施方案中，将本发明的抗体与放射治疗联合施用。
可使用各种方法施用放射治疗，包括外部波束疗法、体内放射疗法、植入放射、立体定向放射手术、全身放射治疗、放射疗法和永久性或暂时性插植式近距放射治疗。外部波束疗法包括三维适形放射疗法，其中辐射场是设计的局部放射(例如针对预定靶标或器官的放射)、或聚焦放射。聚焦放射可选自立体定向放射外科手术、分次立体定向放射外科手术、或调强放射疗法。聚焦放射可具有粒子束(质子)、钴-60(质子)线性加速器(X射线)作为放射源(参见例如WO 2012/177624)。“近距放射治疗”是指通过在肿瘤或其它增生性组织患病部位处或其附近插入体内的空间上受限制的放射性材料而递送的放射疗法，并且包括暴露于放射性同位素(例如At-211、I-131、I-125、Y-90、Re-186、Re-188、Sm-153、Bi-212、P-32，以及Lu的放射性同位素)。用作细胞调节剂的合适辐射源包括固体和液体两者。放射源可为放射性核素，诸如I-125、I-131、Yb-169、Ir-192(作为固体源)、I-125(作为固体源)，或其它发射光子、β粒子、γ辐射或其它治疗性射线的放射性核素。放射性材料也可为由任何放射性核素溶液，例如I-125或I-131溶液制成的流体，或者放射性流体可使用含有固体放射性核素，例如Au-198、Y-90的微粒的适当流体的浆料产生。放射性核素可嵌入凝胶或放射性微球中。
在一些实施方案中，将本发明的抗体与达卡巴嗪联合施用来治疗黑色素瘤。不受任何特定理论的约束，据信PD-1和/或TIM-3阻断和化学疗法的联合使用由细胞死亡来促进，该细胞死亡是多数化疗化合物的细胞毒性作用的结果，可导致抗原呈递途径中肿瘤抗原的水平增加。可通过细胞死亡而产生与PD-1和/或TIM-3阻断协同作用的其它联合疗法是放疗、外科手术和激素。各个这些方案均在宿主中产生肿瘤抗原源。也可将血管生成抑制剂与PD-1和/或TIM-3阻断结合。抑制血管生成导致肿瘤细胞死亡，这可将肿瘤抗原送入宿主抗原呈递通路中。
也可将本发明的单特异性PD-1和/或TIM-3抗体与双特异性抗体联合施用。双特异性抗体可用于靶定两种独立的抗原。例如，抗-Fc受体/抗-肿瘤抗原(例如Her-2/neu)双特异性抗体用于使巨噬细胞靶定肿瘤部位。双特异性定向可更有效地激活肿瘤特异性应答。这些应答的T细胞臂将利用PD-1和/或TIM-3阻断来扩增。另选地，可利用结合肿瘤抗原和树突状细胞特异性细胞表面标记的双特异性抗体，将抗原直接递送至DC。
本发明抗体能够以未缀合形式使用或缀合于第二试剂，例如细胞毒性药物、放射性同位素、或蛋白质(例如蛋白毒素或病毒蛋白)。抗体分子可用于递送多种治疗剂，例如细胞毒性部分，如治疗药物、放射性同位素、植物、真菌、或细菌源的分子、或生物蛋白(例如蛋白毒素)或颗粒(例如重组病毒颗粒，例如经由病毒外壳蛋白)、或它们的混合物。
感染性疾病
本发明还提供一种用本发明的抗体治疗已暴露于特定毒素或病原体的受试者足以治疗受试者的时间的方法。
本发明还提供一种治疗患有感染性疾病的受试者的方法，该方法包括以足以治疗感染性疾病的时间向对其有需要的受试者施用治疗有效量的本发明抗体。
本发明还提供一种治疗具有病毒感染的受试者的方法，该方法包括以足以治疗病毒感染的时间向对其有需要的受试者施用治疗有效量的本发明抗体。
本发明还提供一种治疗具有细菌感染的受试者的方法，该方法包括以足以治疗细菌感染的时间向对其有需要的受试者施用治疗有效量的本发明抗体。
本发明还提供一种治疗具有真菌感染的受试者的方法，该方法包括以足以治疗真菌感染的时间向对其有需要的受试者施用治疗有效量的本发明抗体。
在感染(例如急性和/或慢性)的治疗中，本发明的抗体可与除了或代替刺激对感染的天然宿主免疫防御的常规治疗联合施用。对感染的天然宿主免疫防御包括炎症、发烧、抗体-介导的宿主防御、T-淋巴细胞-介导的宿主防御，包括淋巴因子分泌和细胞毒性T-细胞(尤其是病毒感染期间)，补体介导的裂解和调理(促进吞噬作用)、以及吞噬作用。能够再激活功能障碍T-细胞的本发明抗体将可用于治疗慢性感染，特别是细胞介导的免疫对完全恢复重要的那些。
与类似于如上讨论的其在肿瘤中的应用，本发明抗体可单独使用，或者作为佐剂与疫苗将联合使用，以刺激对病原体、毒素和自身抗原的免疫应答。该治疗方法对其有用的病原体的示例包括目前还没有针对其的特效疫苗的病原体，或常规疫苗对其不能完全有效的病原体。这些包括HIV、肝炎(甲型、乙型&丙型)、流行性感冒、疱疹、贾第鞭毛虫病、疟疾、利什曼原虫(Leishmania)、金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)。PD-1和/或TIM-3阻断可用于针对诸如HIV的因素导致的已建立感染，这些因素在感染过程中呈现变化的抗原。在施用本发明抗体时，这些新的表位被识别为外源的，从而激发较强的T细胞应答，该应答不通过PD-1或TIM-3的负信号受抑制。
病毒
对于病毒原因引起的感染，可将本发明的抗体与标准疗法联合来治疗病毒感染。此类标准疗法根据病毒类型而变化，但在几乎所有情况下，施用包含对病毒特异的抗体(例如IgA，IgG)的人血清可以是有效的。
引起可用本发明抗体治疗的感染的示例性病原性病毒包括HIV、肝炎(甲型、乙型或丙型)、疱疹病毒(例如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II和CMV、埃-巴二氏病毒)、腺病毒、流感病毒、黄病毒、艾柯病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、豇豆花叶病毒(cornovirus)、呼吸道合胞体病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒和虫媒病毒性脑炎病毒。
在一些实施方案中，病毒感染是流感病毒感染。流感感染可导致常出现于季节性流行病中的发烧、咳嗽、肌痛、头痛和不适。流行性感冒也与多种感染后疾病，诸如脑炎、心肌心包炎、古德帕斯丘综合征和雷氏症候群相关联。流感感染还抑制正常肺抗菌防御，使得从流行性感冒恢复的患者发展细菌性肺炎风险的增大。流感病毒表面蛋白示出由突变和重组引起的明显抗原变异。因此，溶细胞性T淋巴细胞是用于感染后消除病毒的宿主的主要载体。流行性感冒分为主要三类：甲型流感、乙型流感和丙型流感。甲型流感独特之处在于其感染人和多种其它动物(例如猪、马、鸟和海豹)并为大流行性流感的主要病因。细胞可被两种不同的甲型流感毒株感染，两种亲本病毒类型的节段化RNA基因组在复制期间混合以形成混合的复制体，产生新的流行株。乙型流感不在动物中复制并因此具有较小的遗传变异，并且丙型流感病毒仅具有单一血清型。
大部分常规疗法缓和由感染引起的症状，而宿主的免疫应答却实际上清除了疾病。然而，某些毒株(例如甲型流感)可导致更严重的疾病和死亡。可通过施用抑制病毒复制的环胺抑制剂金刚烷胺和金刚烷乙胺来同时临床性和预防性地治疗甲型流感。然而，这些药物的临床实用性因不良反应的相对较较高发病率、其较窄的抗病毒谱(仅甲型流感)、以及病毒抗性的倾向而受到限制。将血清IgG抗体施用于主要流感病毒表面蛋白(血细胞凝集素和神经氨酸苷酶)可防止肺部感染，然而需要粘膜IgA来防止上呼吸道和气管感染。治疗流行性感冒的最有效的当前治疗是施用经福尔马林或β-丙内酯失活的病毒进行接种。
在一些实施方案中，感染是肝炎感染，例如乙型肝炎感染或丙型肝炎感染。
乙型肝炎病毒(HB-V)是最具传染性的已知血液传播病原。其是急性和慢性肝炎和肝癌以及终身慢性感染的主要病因。在感染后，病毒在肝细胞中复制，接着其另外放出表面抗原HBsAg。检测血清中HBsAg的过度水平被用作诊断乙型肝炎感染的标准方法。急性感染可能消散或者其可能发展成慢性持久性感染。目前用于慢性HBV的治疗包括α-干扰素，其提高肝细胞表面上I型人白血细胞抗原(HLA)的表达，从而促进它们被细胞毒性T淋巴细胞识别。另外，核苷类似物更昔洛韦、泛昔洛韦和拉米夫定也在临床试验中示出治疗HBV感染的一些功效。用于HBV的另外治疗包括聚乙二醇化α-干扰素、adenfovir、恩替卡韦和替比夫定。虽然通过肠胃外施用抗-HBsAg血清抗体赋予被动免疫，但用失活或重组HBsAg疫苗接种也赋予感染抗性。为了治疗优势，可将本发明的抗体与常规治疗联合以用于乙型肝炎感染。
丙型肝炎病毒(HC-V)可致使慢性形式的肝炎，从而导致肝硬化。虽然症状类似于乙型肝炎引起的感染，但与HB-V截然相反，感染的宿主可在10-20年内无症状。本发明的抗体可作为单一治疗剂施用，或者与丙型肝炎感染的标准护理联合施用。例如，可将本发明的抗体与Sovaldi(索非布韦)、Olysio(西咪匹韦)加上利巴韦林或聚乙二醇化干扰素中的一种或多种一起施用。虽然包括特拉普韦(特拉匹韦)或波普瑞韦(博赛泼维)加利巴韦林和聚乙二醇化干扰素的方案也被批准，它们与增大的副作用和较长治疗持续时间相关联。
HC-V感染的常规治疗包括施用α-干扰素与利巴韦林的组合。用于HC-V感染的有前景的潜在疗法是蛋白酶抑制剂特拉匹韦(VX-960)。附加治疗包括巴维昔单抗(以B2-糖蛋白I依赖性方式结合阴离子磷脂磷脂酰丝氨酸的抗体，Peregrine Pharmaceuticals)、抗-HPV病毒外壳蛋白E2抗体(例如ATL 6865-Ab68+Ab65，XTL Pharmaceuticals)和
Figure BDA0001717945540001781
(多克隆抗-HCV人免疫球蛋白)。为了治疗优势，可将本发明的抗体与一种或多种这些治疗联合用于丙型肝炎感染。可与本发明的抗体联合使用来特定治疗丙型肝炎感染的蛋白酶、聚合酶和NS5A抑制剂包括在US 2013/0045202中描述的那些。
在另一个实施方案中，感染是麻疹病毒。在潜伏9-11天之后，被麻疹病毒感染的宿主发展出发烧、咳嗽、鼻炎和结膜炎。在1-2天之内，发展出红斑性斑状丘疹，其迅速遍及全身。因为感染也抑制细胞免疫，宿主处于发展细菌重复感染的较大风险中，包括中耳炎、肺炎和感染后脑脊髓炎。急性感染特别与营养不良青少年中的显著发病率和死亡率相关联。
用于麻疹的治疗包括被动施用合并的人IgG，即使在暴露后给予长达一周，其也可防止无免疫性受试者感染。然而，在用活的减毒病毒预先免疫是最有效的治疗，并且预防超过95％被免疫那些中的疾病。因为存在该病毒的一种血清型，单一免疫或感染通常使得生命免受后续感染。
在较小比例的被感染宿主中，麻疹可发展成SSPE，其为中枢神经系统持续感染引起的慢性进行性神经学障碍。S SPE由具有干扰病毒粒体装配和出芽缺陷的麻疹病毒的克隆变体引起。对于这些患者，用本发明的抗体再活化T-细胞以利于病毒清除将是期望的。
在另一个实施方案中，感染是HIV。HIV攻击CD4+细胞，包括T-淋巴细胞、单核细胞-巨噬细胞、滤泡树突状细胞和朗格汉斯细胞细胞，并且CD4+辅助/诱导细胞衰竭。因此，宿主得到细胞介导的免疫的严重缺陷。被HIV感染使至少50％个体产生AIDS，并且经由性接触、施用感染的血液或血液制品，用感染的精液人工受精、暴露于含血液的针或注射器传播，以及分娩期间母婴传播。
被HIV感染的宿主可能无症状，或者可能发展成急性病，类似于单核细胞增多症——发烧、头痛、喉咙痛、不适和皮疹。症状可发展成进行性免疫功能失调，包括持续性发热、盗汗、重量损失、原因不明痢疾、湿疹、牛皮癣、皮脂溢性皮炎、带状疱疹、口腔念珠菌病和口腔毛状白斑。寄生生物宿主的机会性感染常见于感染发展为AIDS的患者中。
用于HIV的治疗包括抗病毒疗法，包括单独或与地达诺新或扎西他滨、双脱氧肌苷、双脱氧胞苷、拉米夫定(lamidvudine)、司他夫定组合的核苷类似物、齐多夫定(AST)；逆转录抑制剂，诸如地拉夫定、奈韦拉平、洛韦胺，以及蛋白酶抑制剂，如沙奎那韦、托那韦、茚地那韦和奈非那韦。用于HIV的治疗包括
Figure BDA0001717945540001791
(利匹韦林)。为了治疗优势，可将本发明的抗体与常规治疗联合用于HIV感染。
在另一个实施方案中，感染是细胞巨化病毒(CMV)感染。CMV通常与持续性、潜伏性和反复性感染相关联。CMV感染并保持潜伏于单核细胞和粒细胞-单核祖细胞。CMV的临床症状包括类似于单核细胞增多症的症状(即发烧、腺体肿胀、不适)，以及发展为抗生素的过敏性皮疹的趋势。病毒通过直接接触传播。病毒在尿液、唾液、精液中散布，并且较小程度上在其它体液中散布。传播的发生可从感染的母亲到其胎儿或新生儿，并且通过输血和器官移植发生。CMV感染导致细胞免疫总体受损，特征为对非特异性促分裂原和特异性CMV抗原的母细胞化反应受损并且胞毒能力减弱。
CMV感染的治疗包括抗-病毒更昔洛韦、膦甲酸和西多福韦，但这些药物通常仅指定给免疫失能的患者。为了治疗优势，可将本文所述的本发明抗体与常规治疗联合用于细胞巨化病毒感染。
在另一个实施方案中，感染是埃-巴二氏病毒(EBV)感染。EBV可形成持续性和潜伏性感染并且主要攻击B细胞。被EBV感染引起传染性单核细胞增多症的临床症状，包括发烧、喉咙痛，通常具有流出物，全身性淋巴结肿大和脾肿大。也存在肝炎，其可发展成黄疸。
虽然EBV感染的典型治疗缓和症状，但EBV与某些癌症诸如伯基特淋巴瘤和鼻咽癌的发展相关联。因此，在并发症发展之前清除病毒感染将有很大益处。为了治疗优势，可将本发明的抗体与常规治疗联合用于埃-巴二氏病毒感染。
在另一个实施方案中，感染是单纯疱疹病毒(HSV)感染。HSV通过与感染宿主直接接触而传播。直接感染可能无症状，但通常导致包含感染颗粒的水疱。在疾病活动期周期时疾病显化，其中随着病毒潜在地感染神经节以后续爆发，损伤显现和消失。损伤可处于面部、生殖器、眼和/或手上。在一些情况下，感染也可导致脑炎。
用于疱疹感染的治疗主要涉及使症状爆发消退，并且包括全身性抗病毒药物，诸如：阿昔洛韦(例如
Figure BDA0001717945540001801
)、伐昔洛韦、泛昔洛韦、喷昔洛韦，以及局部药物，诸如二十二醇
Figure BDA0001717945540001802
曲金刚胺和zilactin。疱疹潜在感染的清除将有很大临床益处。为了治疗优势，可将本发明的抗体与常规治疗联合用于疱疹病毒感染。
在另一个实施方案中，感染是人T-淋巴细胞病毒(HTLV-1，HTLV-2)。HTLV经由性接触、母乳喂养或暴露于被污染血液来传播。病毒活化Th1细胞，导致其过度增殖且过度产生Th1相关的细胞因子(例如IFN-γ和TNF-α)。这继而导致Th2淋巴细胞受抑制且Th2细胞因子产生(例如IL-4、IL-5、IL-10和IL-13)减少，使得感染宿主对入侵生物启动足够免疫应答的能力下降，该免疫应答需要Th2-依赖性应答以进行清除(例如寄生虫感染，产生粘膜和体液抗体)。
HTLV感染导致机会性感染，导致支气管扩张、皮炎和被葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)和类圆线虫属(Strongyloides spp.)双重感染，从而由脓毒症引起死亡。HTLV感染也可直接导致成人T-细胞白血病/淋巴瘤和进行性脱髓鞘上运动神经元病，称为HAM/TSP。HTLV潜在感染的清除将有很大临床益处。为了治疗优势，可将本发明的抗体与常规治疗联合用于HTLV感染。
在另一个实施方案中，感染是人乳头状瘤病毒(HPV)。HPV主要侵袭角质细胞并以两种形式发生：皮肤和生殖器。据信传播通过直接接触和/或性行为发生。皮肤和生殖器HPV感染均可导致疣和潜在感染，有时导致复发感染，这由控制症状且阻碍疣出现的宿主免疫控制，但使宿主能够将感染传播给其他人。
被HPV感染也可导致特定癌症，诸如子宫颈、肛门的、外阴、阴茎和口咽(oropharynial)癌。不存在已知用于HPV感染的治疗法，但当前治疗是局部施用咪喹莫特，其刺激免疫系统以攻击受侵袭的区域。HPV潜在感染的清除将有很大临床益处。为了治疗优势，可将本发明的抗体与常规治疗联合用于HPV感染。
细菌感染
导致可用本发明抗体治疗的感染的病原性细菌的一些示例包括梅毒(syphilis)、衣原体(chlamydia)、立克次氏体细菌、分枝杆菌(mycobacteria)、葡萄球菌(staphylococci)、链球菌(streptococci)、肺炎双球菌(pneumonococci)、脑膜炎球菌(meningococci)和conococci、克雷白氏杆菌(klebsiella)、变形杆菌属(proteus)、沙雷氏菌(serratia)、假单胞菌属(pseudomonas)、军团杆菌(legionella)、白喉(diphtheria)、沙门氏菌属(salmonella)、杆菌(bacilli)、霍乱、破伤风、波特淋菌中毒、炭疽热、温疫、细螺旋体病和莱姆病细菌。可将本发明抗体与现有治疗方式联合用于前述感染。例如，用于梅毒的治疗包括青霉素(例如青霉素G)、四环素、强力霉素、头孢曲松和阿奇霉素。
博氏疏螺旋体所致的莱姆病通过蜱叮咬传播到人体。疾病初始表现为局部皮疹，继之以流感类症状，包括不适、发烧、头痛、脖子发僵和关节痛。稍后的临床表现可包括移动性关节炎和多发性关节炎，具有颅神经麻痹和神经根病变、心肌炎和心律失常的神经和心脏损害。莱姆病的一些病症较持久，导致类似于三期梅毒的不可逆损伤。莱姆病的现有疗法包括主要施用抗体。耐抗生素菌株可用羟化氯喹或甲氨蝶呤进行处理。具有神经性疼痛的抗生素难治愈患者可用加巴喷丁来治疗。米诺环素可有助于具有神经或其它炎性表现的晚期/慢性莱姆病。
除非血液滴度达到致使肝内栓塞的浓度，否则其它形式的borreliois，例如由B.recurentis、赫姆斯螺旋体(B.hermsii)、墨西哥疏螺旋体(B.turicatae)、B.parikeri、西班牙疏螺旋体(B.hispanica)、杜通螺旋体(B.duttonii)和波斯螺旋体(B.persica)以及细螺旋体病(例如问号钩端螺旋体(L.Interrogans))引起的那些通常自然消散。
真菌和寄生生物
导致可用本发明的抗体治疗的感染的病原性真菌的一些示例包括假丝酵母菌(Candida)(白假丝酵母(albicans)、克鲁斯假丝酵母(krusei)、光滑假丝酵母(glabrata)、热带假丝酵母(tropicalis)等)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、曲霉属(Aspergillus)(烟曲霉(fumigatus)、黑曲霉(niger)等)、毛霉菌目(Genus Mucorales)(毛霉菌属(mucor)、犁头霉属(absidia)、如根霉(rhizophus))、申克氏胞丝菌(Sporothrixschenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)和荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。
导致可用本文所述的本发明抗体治疗的感染的致病性寄生虫的一些示例包括溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、结肠小袋纤毛虫(Balantidium coli)、福氏耐格里变形虫(Naegleriafowleri)、棘阿米巴属(Acanthamoeba sp.)、氏贾第鞭毛虫(Giardialambia)、隐孢子虫属(Cryptosporidium sp.)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、微小巴贝虫(Babesia microti)、布氏锥虫(Trypanosomabrucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼虫(Leishmania donovani)、弓形虫(Toxoplasma gondi)和巴西日圆线虫(Nippostrongylus brasiliensis)。
诊断用途和试剂盒
试剂盒
本发明还提供包含本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体的试剂盒。
本发明还提供包含本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体的试剂盒。
本发明还提供包含本发明的含有特异性结合PD-1的第一域和特异性结合TIM-3的第二域的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体的试剂盒。
试剂盒可用于治疗用途并用作诊断试剂盒。
试剂盒可用于检测生物样本中PD-1、TIM-3、或PD-1和TIM-3的存在。
在一些实施方案中，试剂盒包含本文所述的本发明抗体和用于检测抗体的试剂。试剂盒可包括一个或多个其它元件，包括：使用说明；其它试剂，例如标记、治疗剂、或者可用于使抗体与标记或治疗剂螯合或以其它方式偶联的试剂、或辐射防护组合物；用于准备施用抗体的装置或其它材料；药学上可接受的载体；以及向受试者施用的装置或其它材料。
在一些实施方案中，试剂盒包括在容器中的本发明抗体和试剂盒的使用说明。
在一些实施方案中，试剂盒中的抗体被标记。
在一些实施方案中，试剂盒包含含有以下项的特异性结合PD-1的拮抗性抗体：
SEQ ID NO:41的VH和SEQ ID NO:49的VL；
SEQ ID NO:41的VH和SEQ ID NO:50的VL；
SEQ ID NO:42的VH和SEQ ID NO:51的VL；
SEQ ID NO:42的VH和SEQ ID NO:52的VL；
SEQ ID NO:42的VH和SEQ ID NO:53的VL；
SEQ ID NO:43的VH和SEQ ID NO:49的VL；
SEQ ID NO:43的VH和SEQ ID NO:54的VL；
SEQ ID NO:43的VH和SEQ ID NO:50的VL；
SEQ ID NO:43的VH和SEQ ID NO:55的VL；
SEQ ID NO:43的VH和SEQ ID NO:56的VL；
SEQ ID NO:43的VH和SEQ ID NO:57的VL；
SEQ ID NO:44的VH和SEQ ID NO:49的VL；
SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:49的VL；
SEQ ID NO:46的VH和SEQ ID NO:49的VL；
SEQ ID NO:47的VH和SEQ ID NO:49的VL；
SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:53的VL；
SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:52的VL；
SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:56的VL；
SEQ ID NO:47的VH和SEQ ID NO:58的VL；
SEQ ID NO:47的VH和SEQ ID NO:59的VL；
SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:60的VL；
SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:61的VL；
SEQ ID NO:45的VH和SEQ ID NO:62的VL；
SEQ ID NO:63的VH和SEQ ID NO:65的VL；或者
SEQ ID NO:64的VH和SEQ ID NO:65的VL。
在一些实施方案中，试剂盒包含含有SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:56的VL的特异性结合PD-1的拮抗性抗体。
在一些实施方案中，试剂盒包含含有SEQ ID NO:64的VH和SEQ ID NO:65的VL的特异性结合PD-1的拮抗性抗体。
在一些实施方案中，试剂盒包含含有以下项的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体：
SEQ ID NO:145的VH和SEQ ID NO:155的VL；
SEQ ID NO:146的VH和SEQ ID NO:156的VL；
SEQ ID NO:148的VH和SEQ ID NO:157的VL；
SEQ ID NO:147的VH和SEQ ID NO:155的VL；
SEQ ID NO:149的VH和SEQ ID NO:158的VL；
SEQ ID NO:150的VH和SEQ ID NO:159的VL；
SEQ ID NO:151的VH和SEQ ID NO:160的VL；
SEQ ID NO:152的VH和SEQ ID NO:161的VL；
SEQ ID NO:153的VH和SEQ ID NO:162的VL；
SEQ ID NO:154的VH和SEQ ID NO:163的VL；或者
SEQ ID NO:172的VH和SEQ ID NO:173的VL。
在一些实施方案中，试剂盒包含含有SEQ ID NO:146的VH和SEQ ID NO:156的VL的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体。
在一些实施方案中，试剂盒包含含有SEQ ID NO:172的VH和SEQ ID NO:173的VL的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体。
在一些实施方案中，试剂盒包含含有下列的HC1、LC1、HC2和LC2的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体：
分别为SEQ ID NO:186、188、190和193；
分别为SEQ ID NO:186、188、191和194；
分别为SEQ ID NO:187、189、190和193；
分别为SEQ ID NO:187、189、191、194；
分别为SEQ ID NO:186、188、192和195；
分别为SEQ ID NO:186、188、248和194；
分别为SEQ ID NO:241、188、244、195；
分别为SEQ ID NO:241、188、245、194；
分别为SEQ ID NO:242、189、246、194；
分别为SEQ ID NO:243、188、246、194；或者
分别为SEQ ID NO:243、188、247、195。
检测PD-1、TIM-3、或PD-1与TIM-3的方法
本发明还提供了一种检测样本中PD-1的方法，包括：获得样本，使样本与本发明的特异性结合PD-1的拮抗性抗体接触，并且检测与样本中的PD-1结合的抗体。
本发明还提供了一种检测样本中TIM-3的方法，包括：获得样本，使样本与本发明的特异性结合TIM-3的拮抗性抗体接触，并且检测与样本中的TIM-3结合的抗体。
本发明还提供了一种检测样本中PD-1和TIM-3的方法，包括：获得样本，使样本与本发明的包含特异性结合PD-1的第一域和特异性结合TIM-3的第二域的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体接触，并且检测与样本中的PD-1和TIM-3结合的抗体。
在一些实施方案中，样本可来源于尿液、血液、血清、血浆、唾液、腹水、循环细胞、循环肿瘤细胞、非组织缔合的细胞(即游离细胞)、组织(例如手术切除的肿瘤组织、活体组织切片，包括细针抽吸组织)、组织学制备物等。
可使用已知的方法检测结合PD-1、TIM-3、或PD-1与TIM-3的本发明抗体。示例性方法包括使用荧光或化学发光标记、或放射标记物直接标记抗体，或者使易于检测的部分(诸如生物素、酶或表位标签)连接到本发明的抗体上。示例性的标记和部分为钌、111In-DOTA、111In-二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶、聚组氨酸(HIS标签)、吖啶染料、花青染料、荧光酮染料、噁嗪染料、菲啶染料、罗丹明染料和
Figure BDA0001717945540001851
染料。
本发明的抗体可用于多种测定以检测样本中的PD-1、TIM-3、或PD-1与TIM-3。示例性的测定为蛋白质印迹分析、放射性免疫测定、表面等离振子共振、免疫沉淀、平衡透析、免疫扩散、电化学发光(ECL)免疫测定、免疫组织化学、荧光激活细胞分选(FACS)或ELISA测定。
本发明的其它实施方案：双特异性PD-1/TIM-3抗体
下文根据本文别处的公开内容陈述了本发明的某些其它实施方案。上文陈述为与本文所公开的发明相关的本发明的实施方案的特征还涉及所有这些其它带编号的实施方案中的每一者。
本发明的其它实施方案：双特异性PD-1/TIM-3抗体
下文根据本文别处的公开内容陈述了本发明的某些其它实施方案。上文陈述为与本文所公开的发明相关的本发明的实施方案的特征还涉及所有这些其它带编号的实施方案中的每一者。
1)一种分离的双特异性PD1/TIM-3抗体，包含特异性结合PD-1的第一域和特异性结合TIM-3的第二域。
2)根据实施方案1所述的双特异性PD1/TIM-3抗体，其中所述抗体增强抗原特异性CD4+或CD8+T细胞的活化。
3)根据实施方案1或2所述的双特异性PD1/TIM-3抗体，其中所述抗体
a)以小于约100nM的离解平衡常数(KD)结合人PD-1；
b)以小于约1nM的KD结合人PD-1；
c)以小于约100nM的KD结合猕猴PD-1；或者
d)以小于约1nM的KD结合猕猴PD-1；
当所述KD使用ProteOn XPR36系统在+25℃下进行测量时。
4)根据实施方案1-3中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体，其中所述抗体抑制TIM-3与半乳糖凝集素-9结合。
5)根据实施方案1-4中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体，其中所述第一域包含
a)分别为SEQ ID NO:82、83和84的重链互补决定区(HCDR)1(HCDR1)、2(HCDR2)和3(HCDR3)；
b)分别为SEQ ID NO:SEQ ID NO:82、83和85的HCDR1、HCDR2和HCDR3；
c)分别为SEQ ID NO:86、87和88的轻链互补决定区(LCDR)1(LCDR1)、2(LCDR2)和3(LCDR3)；
d)分别为SEQ ID NO:82、83和84的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列，以及分别为SEQ ID NO:86、87和88的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列；或者
e)分别为SEQ ID NO:82、83和85的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列，以及分别为SEQ ID NO:86、87和88的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
6)根据实施方案1-5中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体，其中所述第二域包含
a)分别为SEQ ID NO:SEQ ID NO:164、165和166的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列；
b)分别为SEQ ID NO:167、168和169的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列；或者
c)分别为SEQ ID NO:164、165和166的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列，以及分别为SEQ ID NO:167、168和169的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
7)根据实施方案1-6中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体，包
含下列的HCDR1、HCDR2和HCDR3：
a)分别为SEQ ID NO:10、13和16；
b)分别为SEQ ID NO:10、14和16；
c)分别为SEQ ID NO:10、13和17；
d)分别为SEQ ID NO:10、13和18；
e)分别为SEQ ID NO:10、14和17；
f)分别为SEQ ID NO:11、15和18；
g)分别为SEQ ID NO:10、13和19；
h)分别为SEQ ID NO:12、13和19；或者
i)分别为SEQ ID NO:66、67和68。
8)根据实施方案1-7中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体，其
中所述第一域包含下列的LCDR1、LCDR2和LCDR3：
a)分别为SEQ ID NO:20、26和31；
b)分别为SEQ ID NO:21、26和32；
c)分别为SEQ ID NO:22、27和33；
d)分别为SEQ ID NO:22、26和34；
e)分别为SEQ ID NO:23、28和35；
f)分别为SEQ ID NO:20、26和36；
g)分别为SEQ ID NO:21、27和37；
h)分别为SEQ ID NO:23、26和32；
i)分别为SEQ ID NO:22、26和32；
j)分别为SEQ ID NO:24、26和38；
k)分别为SEQ ID NO:20、29和39；
l)分别为SEQ ID NO:20、30和32；
m)分别为SEQ ID NO:25、26和40；
n)分别为SEQ ID NO:24、26和32；或者
o)分别为SEQ ID NO:69、70和71。
9)根据实施方案1-8中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体，其
中所述第二域包含下列的HCDR1、HCDR2和HCDR3：
a)分别为SEQ ID NO:90、99和107；
b)分别为SEQ ID NO:91、99和108；
c)分别为SEQ ID NO:91、99和109；
d)分别为SEQ ID NO:92、100和110；
e)分别为SEQ ID NO:93、101和111；
f)分别为SEQ ID NO:94、102和112；
g)分别为SEQ ID NO:95、103和113；
h)分别为SEQ ID NO:96、104和114；
i)分别为SEQ ID NO:97、105和115；或者
j)分别为SEQ ID NO:98、106和116；
10)根据实施方案1-9中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体，其
中所述第二域包含下列的LCDR1、LCDR2和LCDR3：
a)分别为SEQ ID NO:117、126和135；
b)分别为SEQ ID NO:118、127和136；
c)分别为SEQ ID NO:119、128和137；
d)分别为SEQ ID NO:120、129和139；
e)分别为SEQ ID NO:121、130和140；
f)分别为SEQ ID NO:122、131和141；
g)分别为SEQ ID NO:123、132和142；
h)分别为SEQ ID NO:124、133和143；或者
i)分别为SEQ ID NO:125、134和144。
11)根据实施方案1-10中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体，其中所述第一域包含下列的HCDR1、HCDR2、HCDR、LCDR1、LCDR2和LCDR3：
a)分别为SEQ ID NO:10、13、16、20、26和31；
b)分别为SEQ ID NO:10、13、16、21、26和32；
c)分别为SEQ ID NO:10、14、16、22、27和33；
d)分别为SEQ ID NO:10、14、16、22、26和34；
e)分别为SEQ ID NO:10、14、16、23、28和35；
f)分别为SEQ ID NO:10、13、17、20、26和31；
g)分别为SEQ ID NO:10、13、17、20、26和36；
h)分别为SEQ ID NO:10、13、17、21、26和32；
i)分别为SEQ ID NO:10、13、17、21、27和37；
j)分别为SEQ ID NO:10、13、17、23、26和32；
k)分别为SEQ ID NO:10、13、17、22、26和32；
l)分别为SEQ ID NO:10、13、18、20、26和31；
m)分别为SEQ ID NO:11、15、18、20、26和31；
n)分别为SEQ ID NO:10、13、19、20、26和31；
o)分别为SEQ ID NO:12、13、19、20、26和31；
p)分别为SEQ ID NO:10、14、17、23、28和35；
q)分别为SEQ ID NO:10、14、17、22、26和34；
r)分别为SEQ ID NO:10、14、17、23、26和32；
s)分别为SEQ ID NO:12、13、19、24、26和38；
t)分别为SEQ ID NO:12、13、19、20、29和39；
u)分别为SEQ ID NO:11、15、18、20、30和32；
v)分别为SEQ ID NO:11、15、18、25、26和40；
w)分别为SEQ ID NO:11、15、18、24、26和32；或者
x)分别为SEQ ID NO:66、67、68、69、70和71。
12)根据实施方案1-12中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体，其中所述第二域包含下列的HCDR1、HCDR2、HCDR、LCDR1、LCDR2和LCDR3：
a)分别为SEQ ID NO:90、99、107、117、126和135；
b)分别为SEQ ID NO:91、99、108、118、127和136；
c)分别为SEQ ID NO:91、99、109、119、128和137；
d)分别为SEQ ID NO:92、100、110、117、126和135；
e)分别为SEQ ID NO:93、101、111、120、129和139。
f)分别为SEQ ID NO:94、102、112、121、130和140；
g)分别为SEQ ID NO:95、103、113、122、131和141；
h)分别为SEQ ID NO:96、104、114、123、132和142；
i)分别为SEQ ID NO:97、105、115、124、133和143；或者
j)分别为SEQ ID NO:98、106、116、125、134和144；
13)根据实施方案1-12中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体，其中所述第一域包含分别为SEQ ID NO:10、14、17、23、26和32的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且第二域包含分别为SEQ ID NO:97、105、115、124、133和143的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
14)根据实施方案1-12中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体，其中所述第一域包含分别为SEQ ID NO:10、14、17、23、26和32的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且第二域包含分别为SEQ ID NO:91、99、108、118、127和136的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
15)根据实施方案1-12中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体，其中所述第一域包含分别为SEQ ID NO:66、67、68、69、70和71的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且第二域包含分别为SEQ ID NO:97、105、115、124、133和143的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
16)根据实施方案1-12中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体，其中所述第一域包含分别为SEQ ID NO:66、67、68、69、70和71的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且第二域包含分别为SEQ ID NO:91、99、108、118、127和136的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；或者
17)根据实施方案1-12中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体，其中所述第一域包含分别为SEQ ID NO:10、14、17、23、26和32的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且第二域包含分别为SEQ ID NO:97、105、115、124、133和143的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
18)根据实施方案1-17中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体，其中所述第一域包含SEQ ID NO:48的重链可变区(VH)和SEQ ID NO:56的轻链可变区(VL)，并且第二域包含SEQ ID NO:153的VH和SEQ ID NO:162的VL。
19)根据实施方案1-17中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体，其中所述第一域包含SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:56的VL，并且第二域包含SEQ ID NO:146的VH和SEQID NO:156的VL。
20)根据实施方案1-17中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体，其中所述第一域包含SEQ ID NO:64的VH和SEQ ID NO:65的VL，并且第二域包含SEQ ID NO:153的VH和SEQID NO:162的VL。
21)根据实施方案1-17中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体，其中所述第一域包含SEQ ID NO:64的VH和SEQ ID NO:65的VL，并且第二域包含SEQ ID NO:146的VH和SEQID NO:156的VL；或者
22)根据实施方案1-17中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体，其中所述第一域包含SEQ ID NO:48的VH和SEQ ID NO:56的VL，并且第二域包含SEQ ID NO:172的VH和SEQID NO:173的VL。
23)根据实施方案1-22中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体，包含第一重链(HC1)、第一轻链(LC1)、第二重链(HC2)和第二轻链(LC2)，其中所述HC1和LC1包含下列的氨基酸序列：
a)分别为SEQ ID NO:186和188；
b)分别为SEQ ID NO:187和189；
c)分别为SEQ ID NO:241和188；
d)分别为SEQ ID NO:242和189；或者
e)分别为SEQ ID NO:243和188。
24)根据实施方案1-23中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体，其中所述HC2和LC2包含下列的氨基酸序列：
a)分别为SEQ ID NO:190和193；
b)分别为SEQ ID NO:191和194；
c)分别为SEQ ID NO:192和195；
d)分别为SEQ ID NO:248和194；
e)分别为SEQ ID NO:244和195。
f)分别为SEQ ID NO:245和194；
g)分别为SEQ ID NO:246和194；或者
h)分别为SEQ ID NO:247和195。
25)根据实施方案1-24中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体，包含下列的HC1、LC1、HC2和LC2：
a)分别为SEQ ID NO:186、188、190和193；
b)分别为SEQ ID NO:186、188、191和194；
c)分别为SEQ ID NO:187、189、190和193；
d)分别为SEQ ID NO:187、189、191、194；
e)分别为SEQ ID NO:186、188、192和195；
f)分别为SEQ ID NO:186、188、248和194；
g)分别为SEQ ID NO:241、188、244、195；
h)分别为SEQ ID NO:241、188、245、194；
i)分别为SEQ ID NO:242、189、246、194；
j)分别为SEQ ID NO:243、188、246、194；或者
k)分别为SEQ ID NO:243、188、247、195。
26)根据实施方案1-25中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体，其中所述抗体为人或人源化的。
27)根据实施方案1-26中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体，其中所述抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
28)根据实施方案1-27中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体，其中所述抗体为IgG2同种型。
29)根据实施方案1-28中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体，包含抗体Fc中的一、二、三、四、五、六、七、八、九或十个置换。
30)根据实施方案1-29中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体，包含：
a)L234A、L235A、G237A、P238S、H268A、A330S和P331S置换；
b)V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换；
c)F234A、L235A、G237A、P238S和Q268A置换；
d)L234A、L235A或L234A和L235A置换；
e)F234A、L235A或F234A和L235A置换；
f)V234A置换；或者
g)S228P、F234A和L235A置换，其中残基根据EU索引进行编号。
31)根据实施方案1-30中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体，包含在抗体CH3恒定域中的至少一个置换。
32)根据实施方案1-31中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体，其中所述抗体CH3恒定域中的置换为K409R、F405L或F405L/R409K置换，其中残基根据EU索引进行编号。
33)根据实施方案1-32中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体，其中所述抗体包含
a)HC1中的F405L置换和HC2中的K409R置换，其中所述抗体为IgG1同种型；
b)HC1中的V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S、P331S和F405L置换，和HC2中的V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S、P331S和K409R置换，其中所述抗体为IgG2同种型；或者
c)HC1中的S228PL置换和HC2中的S228P、F405L和R409K置换，其中所述抗体为IgG4同种型。
34)一种药物组合物，包含根据实施方案1-33中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体以及药学上可接受的载体。
35)一种多核苷酸，其编码根据实施方案23-25中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体HC1、LC1、HC2或LC2。
36)一种载体，包含根据实施方案35所述的编码HC1、LC1、HC2或LC2、HC1和LC1或HC2和LC2的多核苷酸。
37)一种分离的宿主细胞，包含根据实施方案36所述的载体。
38)一种制备实施方案25、26或27所述的双特异性PD-1/TIM-3抗体的方法，包括在表达抗体的条件下培养根据实施方案37所述的宿主细胞，并且回收并纯化所述宿主细胞产生的双特异性PD1/TIM-3抗体。
39)根据实施方案25所述的产生双特异性PD-1/TIM-3抗体的方法，包括：
a)以约1:1摩尔比的混合物形式，将具有两个相同HC1和两个相同LC1的单特异性二价PD-1抗体和具有两个相同HC2和两个相同LC2的单特异性二价TIM-3抗体组合；
b)在混合物中引入还原剂；
c)将混合物温育约九分钟至约6小时；
d)移除所述还原剂；以及
e)纯化包含HC1、LC1、HC2和LC2的双特异性PD1/TIM-3抗体。
40)根据实施方案39所述的方法，其中所述还原剂为2-巯基乙醇胺(2-MEA)。
41)根据实施方案40所述的方法，其中：
a)2-MEA的以约25mM至约75mM的浓度存在；并且
b)所述温育步骤在约25℃至约37℃的温度下进行。
42)根据实施方案1-33中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体或根据实施方案34所述的药物组合物，其在治疗癌症中使用。
43)根据实施方案42使用的根据实施方案1-33中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体或根据实施方案34所述的药物组合物，其中所述癌症为实体瘤或血液恶性肿瘤。
44)根据实施方案42或43使用的根据实施方案1-33中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体或根据实施方案34所述的药物组合物，其中所述实体瘤是黑色素瘤、肺癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非鳞状NSCLC、结直肠癌、前列腺癌、阉割抵抗性前列腺癌、胃部癌症、卵巢癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、甲状腺癌、头颈部的鳞状细胞癌、食道癌或胃肠道癌、乳腺癌、输卵管癌、脑癌、尿道癌、泌尿生殖系统癌、子宫内膜异位症、宫颈癌或癌症的转移性病变。
45)根据实施方案42或43使用的根据实施方案1-33中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体或根据实施方案34所述的药物组合物，其中所述血液恶性肿瘤为淋巴瘤、骨髓瘤或白血病。
46)根据实施方案1-33中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体或根据实施方案34所述的药物组合物，其用于增强受试者的免疫应答。
47)根据实施方案46使用的根据实施方案1-33中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体或根据实施方案34所述的药物组合物，其中所述受试者具有癌症或病毒感染。
48)根据实施方案42-47中任一项使用的根据实施方案1-33中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体或根据实施方案34所述的药物组合物，其与第二治疗剂联合。
49)根据实施方案42-48中任一项使用的根据实施方案1-33中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体或根据实施方案34所述的药物组合物，其中所述第二治疗剂为用于治疗实体瘤或血液恶性肿瘤的标准护理药物。
50)根据实施方案42-49中任一项使用的根据实施方案1-33中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体或根据实施方案34所述的药物组合物，其中所述第二治疗剂为T细胞活化分子的激动剂。
51)根据实施方案42-50中任一项使用的根据实施方案1-33中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体或根据实施方案34所述的药物组合物，其中所述T细胞活化分子为CD86、CD80、CD28、ICOS、ICOS配体、TMIGD2、CD40、TL1A、GITR配体、4-1BB配体、OX40配体、CD70、CD40L、TNFRSF25、LIGHT、GITR、OX-40、CD27、CD137、NKG2D、CD48、CD226或MICA。
52)根据实施方案42-51中任一项使用的根据实施方案1-33中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体或根据实施方案34所述的药物组合物，其中所述激动剂为特异性结合T细胞活化分子的抗体。
53)根据实施方案42-52中任一项使用的根据实施方案1-33中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体或根据实施方案34所述的药物组合物，其中所述第二治疗剂为T细胞抑制分子的抑制剂。
54)根据实施方案42-53中任一项使用的根据实施方案1-33中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体或根据实施方案34所述的药物组合物，其中所述T细胞抑制分子为PD-1、PD-L1、PD-L2、VISTA、BTNL2、B7-H3、B7-H4、HVEM、HHLA2、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、BTLA、CD160、CEACAM-1、LAIR1、TGFβ、IL-10、Siglec家族、KIR、CD96、TIGIT、NKG2A、CD112、CD47、SIRPA或CD244。
55)根据实施方案42-54中任一项使用的根据实施方案1-33中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体或根据实施方案34所述的药物组合物，其中所述抑制剂或T细胞抑制分子为特异性结合T细胞抑制分子的抗体。
56)根据实施方案42-55中任一项使用的根据实施方案1-33中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体或根据实施方案34所述的药物组合物，其中所述第二治疗剂为疫苗。
57)根据实施方案42-56中任一项使用的根据实施方案1-33中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体或根据实施方案34所述的药物组合物，其中所述疫苗为多肽或其片段、或编码在肿瘤细胞上表达的多肽或其片段的DNA或RNA。
58)根据实施方案42-57中任一项使用的根据实施方案1-33中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体或根据实施方案34所述的药物组合物，其中所述多肽为PSMA、间皮素、EGFR或EGFRvIII。
59)根据实施方案42-58中任一项使用的根据实施方案1-33中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体或根据实施方案34所述的药物组合物，其中同时、顺序或分开施用所述第二治疗剂。
60)根据实施方案42-59中任一项使用的根据实施方案1-33中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体或根据实施方案34所述的药物组合物，其中所述受试者已经用放射治疗进行治疗或正在用放射治疗进行治疗。
61)根据实施方案42-60中任一项使用的根据实施方案1-33中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体或根据实施方案34所述的药物组合物，其中所述患者已经或将进行手术。
62)根据实施方案42-61中任一项使用的根据实施方案1-33中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体或根据实施方案34所述的药物组合物，其中所述受试者正在或已经利用PD-1抗体治疗。
63)根据实施方案42-62中任一项使用的根据实施方案1-33中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体或根据实施方案34所述的药物组合物，其中所述受试者难以利用PD-1抗体治疗。
64)根据实施方案42-63中任一项使用的根据实施方案1-33中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体或根据实施方案34所述的药物组合物，其中所述受试者抵抗利用PD-1抗体治疗。
65)根据实施方案42-64中任一项使用的根据实施方案1-33中任一项所述的双特异性PD1/TIM-3抗体或根据实施方案34所述的药物组合物，其中所述第一域包含SEQ IDNO:48的VL和SEQ ID NO:56的VL，并且第二域包含SEQ ID NO:146的VH和SEQ ID NO:156的VL。
66)根据实施方案1-33中任一项所述的抗体，其在治疗中使用。
67)一种抗独特型抗体，其结合根据实施方案1-33中任一项所述的抗体。
68)一种试剂盒，包含根据实施方案1-33中任一项所述的抗体。
69)根据实施方案68所述试剂盒，还包含用于检测抗体的试剂和使用说明。
本发明现结合以下具体的、非限制性实施例进行描述。
实施例1：一般方法
纯化的人混合淋巴细胞反应(MLR)
纯化的人混合淋巴细胞反应(MLR测定)用于测量向CD4+T细胞和树突状细胞共培养物添加测试抗体而诱导的细胞因子产量变化。
用Ficoll梯度从leukopak(Biological Specialty Corporation)分离外周血单核细胞(PBMC)。然后，CD4+T细胞根据制造商的说明书使用Miltenyi AutoMACS和CD4+T细胞分离珠从PBMC负选择进行新鲜分离，或者商购为冷冻CD4+T细胞(Hemacare Corporation)。使用一种树突状细胞供体(Hemacare Corporation)。在分离或解冻后，将CD4+T细胞和树突状细胞洗涤并重悬于测定培养基(RMPI1640培养基，补充有10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素、1X非必需氨基酸和1X丙酮酸钠-Invitrogen)中。将纯化的人CD4+T细胞稀释至1×106细胞/mL并以100,000个细胞/100μL/孔接种。将树突状细胞稀释至0.1×106细胞/mL并以5,000个细胞/50μL/孔接种到U形底部板中。将测试抗体或对照抗体在测定培养基中以4X浓度制备，当将50μL的抗体添加到150μL的细胞中时，得到1X。
将测试或对照抗体的10点系列稀释液以下列最终浓度添加到孔中：30nM、10nM、3.33nM、1.11nM、0.37nM、0.12nM、0.04nM、0.01nM、0.0046nM和00015nM。CD4+T细胞加树突状细胞以及单独的树突状细胞作为对照包括在内，以测定基线细胞因子分泌。将细胞在37℃，5％CO2下维持5天。在第5天，从培养板移取100μL组织培养上清液并转移至V形底部板。根据制造商规程，使用Meso Scale Discovery(MSD)Th1/Th2人细胞因子10-plex板，在组织培养上清液中测量累积细胞因子产量。简而言之，将MSD板用1％封闭剂B于4℃封闭过夜。次日，移除封闭剂，并用Biotek 406板清洗器洗涤板。制成8点标准曲线并以一式两份加入到板中。以25μL/孔添加解冻的组织培养上清液，将板密封并剧烈摇动1.5小时。在不移除标准物或上清液情况下，将25μL检测抗体添加到各个孔中。将板密封，并剧烈摇动1.5小时。洗涤板，添加读取缓冲液，并使用Meso Scale Discovery读板机读取板。
利用MSD软件计算细胞因子浓度。未知样本中细胞因子的浓度通过将未知输出信号与标准曲线中的输出信号和已知细胞因子浓度进行比较来计算。将计算的浓度上载到Spotfire TIBCO软件中以供可视化。在目视检查数据之后，阈值为3.5的MAD-中值异常值程序用于识别和排除log转换数据异常值。就各抗体而言，对各个细胞因子进行半最大有效浓度(Robust EC50)的Robust分析。
CMV测定
使用细胞巨化病毒抗原回忆测定(CMV测定)来测量向外周血单核细胞(PBMC)培养物中添加测试抗体以及CMV全抗原(对于PD-1抗体)或叠加通过65kd磷蛋白(pp65)的13815-mer肽库(对于TIM-3mAb和PD1/TIM-3双特异性mAb)而诱导的细胞因子产量变化。
在解冻后，将PBMC(Astarte Biologics and Hemcare Corporation)洗涤并重悬于测定培养基(RMPI1640培养基，补充有10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素、1X非必需氨基酸和1X丙酮酸钠-Invitrogen)中。将PBMC稀释至1.5×106细胞/mL并以150,000个细胞/100μL/孔接种。CMV抗原(Astarte Biologics)在测定培养基中以0.4μg/mL的4X浓度制备，当将50μL的抗原添加至100μL细胞和50μL抗体中时，得到0.1μg/mL。将抗体在测定培养基中以4X浓度制备，当将50μL的抗体添加到细胞和肽中时，得到1X。
将测试抗体的系列稀释液以介于150-0.001nM之间的最终浓度添加到孔中。以50nM或30nM的最终浓度制备的细胞加CMV抗原或pp65库、单独的细胞、以及同种型对照作为对照包括在内，以测定基线细胞因子分泌。使细胞在37℃，5％CO2下维持6天。对于MSD分析，在第6天，从培养板移取100μL组织培养上清液并转移至V形底部板。将上清液在-80℃下冷冻至少过夜。根据制造商规程，使用Meso Scale Discovery(MSD)Th1/Th2人细胞因子10-plex板，在组织培养上清液中测量累积细胞因子产量。简而言之，将MSD板用1％封闭剂B于4℃封闭过夜。次日，移除封闭剂，并用Biotek 406板清洗器洗涤板。制成8点标准曲线并以一式两份加入到板中。以25μL/孔添加解冻的组织培养上清液，将板密封并剧烈摇动1.5小时。在不移除标准物或上清液情况下，将25μL检测抗体添加到各个孔中。将板密封，并剧烈摇动1.5小时。洗涤板，添加读取缓冲液，并使用Meso Scale Discovery读板机读取板。
利用MSD软件计算细胞因子浓度。未知样本中细胞因子的浓度通过将未知输出信号与标准曲线中的输出信号和已知细胞因子浓度进行比较来计算。将计算的浓度上载到Spotfire TIBCO软件中以供可视化。在目视检查数据之后，阈值为3.5的MAD-中值异常值程序用于识别和排除log转换数据异常值。就各抗体而言，对各个细胞因子进行半最大有效浓度(Robust EC50)的Robust分析。
对于TIM-3抗体和PD1/TIM-3双特异性抗体，在第6天，在收集上清液进行MSD分析后，将细胞用PBS洗涤一次，并随后针对Live/Dead辨别和下列细胞表面标记物染色：CD3、CD4、CD8、CD137、PD-1和TIM-3。流式细胞术在LSR Fortessa(BD)上进行。使用Flow Jo软件分析数据。基于Fluorescence Minus One(FMO)方法，在活CMV-处理的CD8+和CD4+细胞上鉴别CD137+细胞。
对于顺序治疗实验，如上用pp65肽库刺激六天进行CMV回忆测定。在第六天，移除上清液，并在不存在抗-TIM-3抗体时用pp65库重刺激细胞。二十四小时后，移除上清液，并且如上所述利用MSD测量IFN-γ水平。
PD-1配体抑制测定
配体抑制测定设计基于MSD(Mescoscale Discovery)。MSD板直接涂有配体(cynoPDL1-ECD,huPDL1-ECD或huPDL2-ECD)并在4℃下温育过夜。次日，移除涂覆溶液并将板封闭。将固定浓度的生物素酰化PD-1(huPD1-ECD)与抗体或同种型对照抗体(作为阴性对照)一起预温育。根据一组待测试的抗体，将抗体以滴定法或在固定浓度下测试。将MSD板洗涤并将生物素酰化PD-1/抗体混合物添加到配体涂覆的MSD板中。将板洗涤，并用钌化链霉抗生物素蛋白检测结合于配体的生物素酰化PD-1。抗体对PD-1结合的抑制导致MSD测定中的信号减小。测定不存在抑制剂时的最大生物素酰化PD-1结合，并且有时用于使数据归一化为最大生物素酰化PD-1信号百分比。另外以抑制各种PD-1配体的剂量响应，测试对一种浓度下配体结合抑制呈阳性的mAb。
Jurkat细胞结合
将JurkaT细胞用20ng/ml的PHA刺激过夜，收获，洗涤，并检查活力。然后，将细胞在6-10℃下与各种浓度的测试抗体一起温育45-60分钟，洗涤并在6-10℃下与FITC-标记的山羊抗-人IgG一起温育45-60分钟。将细胞洗涤并用BD Cytofix固定，冷藏过夜，并在MACSQuant流式细胞仪上进行分析。将各抗体浓度下的PD-1阳性细胞百分比与抗体浓度对数绘制成图，并且EC50值生成于Prism中。
亲和力测量
PD-1 mAb
测试抗-PD-1mAb对huPD1-ECD和cynoPD-1-ECD的结合亲和力。使用ProteOnXPR36system，利用表面等离子体共振(SPR)进行亲和力测量。按照用于胺偶联化学的制造商说明书，通过偶联GLC芯片的抗-IgG Fc改性藻酸盐聚合物层表面的混合物来制备生物传感器表面。捕集测试mAb，并且在基于PBS的缓冲液中于25℃监测其与分析物(huPD1-ECD或cynoPD1-ECD)的相互作用。处理采集的数据，并且拟合至朗缪尔1:1结合模型。每个mAb的结果以kon(结合率)、koff(解离率)和KD(平衡解离常数)的格式记录。
TIM-3配体抑制测定
通过在96-孔White Maxisorp板(Nunc)的各孔的PBS中结合1μg/ml重组人Fc-TIM-3嵌合体(R&D系统-cat#:2365-TM-05)，实施TIM-3/半乳糖凝集素-9竞争ELISA。将板洗涤，并且用StartingBlock T20(Pierce)封闭并将抑制剂以10μg/ml浓度添加到孔中。在不洗涤情况下，将7.5μg/ml半乳糖凝集素-9添加到孔中并温育30min。然后将抗-半乳糖凝集素-9-生物素抗体多克隆抗体(R&D系统)以0.5μg/mL添加并温育30分钟。将板洗涤，添加HRP缀合的中和亲和素(Pierce)并将板再温育45分钟。在临读取板之前，洗涤板并添加POD化学发光底物(Roche)，并且在光度计上读取发光。
用于研究的抗原的产生
使用标准方法进行抗原的克隆、表达和纯化。各种蛋白质片段表达为六组氨酸标签或Fc融合蛋白。所使用蛋白质(不含标签序列)的氨基酸序列示于SEQ ID NO:1-9、138和89中。
全长人PD1(huPD1)；SEQ ID NO:1
PGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPE DGHCSWPL
人PD1的胞外域(huPD1-ECD)SEQ ID NO:2
PGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTL食蟹猕猴(cynomolgous，本文称为cyno)PD1(cPD1)；SEQ ID NO:3)PGWFLESPDRPWNAPTFSPALLLVTEGDNATFTCSFSNASESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTRLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQALVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAAQGTIEARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPAPCVPEQTEYATIVFPSGLGTSSPARRGSADGPRSPRPLRPEDGHCSWPL
cyno PD1的胞外域(cPD1-ECD)SEQ ID NO:4
PGWFLESPDRPWNAPTFSPALLLVTEGDNATFTCSFSNASESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTRLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQAL全长人PD-L1(huPD-L1)；SEQ ID NO:5
FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNER
人PD-L1的胞外域(huPDL1-ECD)SEQ ID NO:6
FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERT
猕猴PD-L1的胞外域(cynoPDL1-ECD)SEQ ID NO:7
AFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLTSLIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSNYRQRAQLLKDQLSLGNAALRITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLLNVTSTLRINTTANEIFYCIFRRLDPEENHTAELVIPELPLALPPNERT
人PD-L2的胞外域(huPDL2-ECD)SEQ ID NO:8
LFTVTVPKELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASLQKVENDTSPHRERATLLEEQLPLGKASFHIPQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDYKYLTLKVKASYRKINTHILKVPETDEVELTCQATGYPLAEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGLYQVTSVLRLKPPPGRNFSCVFWNTHVRELTLASIDLQSQMEPRTHPT小鼠PD1的胞外域(musPD1-ECD)SEQ ID NO:9
LEVPNGPWRSLTFYPAWLTVSEGANATFTCSLSNWSEDLMLNWNRLSPSNQTEKQAAFCNGLSQPVQDARFQIIQLPNRHDFHMNILDTRRNDSGIYLCGAISLHPKAKIEESPGAELVVTERILETSTRYPSPSPKPEGRFQ
全长人TIM-3，SEQ ID NO:138
SEVEYRAEVGQNAYLPCFYTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFECGNVVLRTDERDVNYWTSRYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMNDEKFNLKLVIKPAKVTPAPTRQRDFTAAFPRMLTTRGHGPAETQTLGSLPDINLTQISTLANELRDSRLANDLRDSGATIRIGIYIGAGICAGLALALIFGALIFKWYSHSKEKIQNLSLISLANLPPSGLANAVAEGIRSEENIYTIEENVYEVEEPNEYYCYVSSRQQPSQPLGCRFAMP
人TIM-3的胞外域(huTIM-3-ECD)SEQ ID NO:89
SEVEYRAEVGQNAYLPCFYTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFECGNVVLRTDERDVNYWTSRYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMNDEKFNLKLVIKPAKVTPAPTRQRDFTAAFPRMLTTRGHGPAETQTLGSLPDINLTQISTLANELRDSRLANDLRDSGATIR
实施例2：噬菌体展示文库中人抗-PD-1抗体的选择
PD-1-结合Fab选自从头合成pIX噬菌体展示文库，如Shi等人，J Mol Biol 397:385-96,2010，国际专利公布WO2009/085462和美国专利公布US2010/0021477中所述。简而言之，通过多样化人支架生成文库，其中种系VH基因IGHV1-69*01、IGHV3-23*01和IGHV5-51*01与人IGHJ-4微小基因经由H3环重组，并且人种系VLκ基因O12(IGKV1-39*01)、L6(IGKV3-11*01)、A27(IGKV3-20*01)和B3(IGKV4-1*01)与IGKJ-1微小基因重组以组装完整VH域和VL域。选择在围绕H1、H2、L1、L2和L3环的重链和轻链可变区中的位置用于多样化，所述位置与被鉴别为经常与蛋白和肽抗原接触的位置相对应。在选定位置处的序列多样性限于在各个IGHV或IGLV基因的IGHV或IGLV种系基因家族中的每个位置处出现的残基。通过使用长度为7-14个氨基酸的短至中等大小的合成环来产生在H3环处的多样性。设计在H3处的氨基酸分布，以模仿在人抗体中观察到的氨基酸变异。文库设计详述于Shi等人，(2010)JMol Biol 397:385-96。根据它们的人VH和VL种系基因起源，命名用于生成文库的支架。将三个重链文库与四个种系轻链相组合或与多样化轻链文库相组合，以产生12个独特的VH:VL组合。将这些文库稍后基于文库版本进一步组合产生附加文库，以针对PD-1进行淘选实验。
针对huPD1-ECD、cynoPD1-ECD、musPD1-ECD、huPD1-Fc和/或musPD1-Fc，对这些文库进行淘选。重组蛋白质是生物素酰化的(bt)并且被捕集在链霉抗生物素蛋白磁珠(Dynal)上，然后以100nM或10nM的最终浓度暴露于从头合成pIX Fab文库。在PBS-Tween中洗掉非特异性噬菌体，并且通过MC1061F的大肠杆菌细胞感染来回收结合的噬菌体。从这些细胞扩增噬菌体过夜，并且重复淘选共三或四轮。在最终一轮生物淘选后，以两种ELISA形式筛选出结合huPD1-ECD、huPD1-Fc、musPD1-Fc和/或cynoPD1-Fc的单克隆Fab。在形式1中，Fab通过抗-Fd抗体捕集于ELISA板上，并将各种形式的btPD1添加至捕集的Fab，然后用链霉抗生物素蛋白:HRP检测bt-PD1。在形式2中，各种形式的btPD1通过链霉抗生物素蛋白捕集于ELISA上，并且将分泌的Fab添加至捕集的抗原，然后用GoatAntiFab’2HRP检测Fab。在重链和轻链可变区中对已证实结合蛋白质的克隆进行测序。
然后，测试人PD-1或小鼠PD-1选择的Fab与哺乳动物细胞上清液中分泌的cynoPD1-Fc的交叉反应性。Fab通过抗-Fd抗体捕集于ELISA上，并将cynoPD1-Fc上清液添加至捕集的Fab，然后用GoatAntiHumanFc:HRP检测cynoPD1-Fc。基于对cynoPD1-Fc的结合特征，选择选定的抗体以进一步表征。
选定的Fab被选择用于进一步表征并且克隆为IgG2σ/κ。IgG2σ的效应子功能消失并且在相比于野生型IgG2时具有V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换。IgG2σ在美国专利8,961,967中有所描述。评价抗体阻断人PD-1与猕猴PD-L1结合的能力，对人和猕猴PD-1蛋白质的亲和力，以及其结合内源性表达人PD-1的细胞(JurkaT细胞)的能力。随后评价抗体阻断人PD-L1和人PD-L2结合huPD1的能力。
基于结果，针对亲和力成熟选择几种抗体。因亲和力成熟而被选择的选定抗体的表征示于表7。
表7：
Figure BDA0001717945540002051
实施例3：人抗-PD-1抗体的亲和力成熟
使用在所选VL位置处和HCDR1和HCDR2处具有多样性的噬菌体展示文库，使抗体PD1B70、PD1B71和PD1B114(PD1B11的相近同源物)以Fab形式亲和力成熟化。各Fab的亲和力成熟文库的设计示于表8。残基根据表8中PD1B114VH SEQ ID NO:41编号。
表8：
Figure BDA0001717945540002061
构建文库并产生噬菌体。然后，使用VH和VL噬菌体文库针对huPD1-ECD和cynoPD1-ECD生物素酰化重组蛋白质进行噬菌体淘选。在噬菌体淘选后，对结合人和cyno PD-1两者的可溶性Fab进行筛选。所选Fab克隆为IgG2σ同种型，并且在1μg/ml和10μg/ml浓度下表征其Jurkat细胞结合和猕猴PD-L1配体抑制。
表9示出亲本和亲和力成熟抗体的表征结果。
表9：
Figure BDA0001717945540002071
使用ProteOn SPR分析，在如上所述亲和力实验中评估亲和力成熟的抗体与huPD1-ECD和cynoPD1-ECD的结合。mAb与cyno PD-1的结合特征示于表10中且与人PD-1的结合特征示于表11中。计算由人和cyno蛋白质生成的3个或更多个平行测定值的标准偏差(STDEV)。如果对小于3个平行测定值进行计算，则指出范围(RANGE)。范围被定义为所测平行测定值的最低和最高值。对于没有范围或标准偏差中所指示值的表10或表11中的样本，仅进行一次实验。最佳亲和力成熟的变体具有单数位nM范围内的对人和cyno PD-1的亲和力(依据相比于其亲本mAb亲和力增加约4-20倍)。
表10：
Figure BDA0001717945540002081
表11：
Figure BDA0001717945540002082
Figure BDA0001717945540002091
实施例4：组合变体PD-1mAb产生
在分析亲和力结果之后，考虑组合序列。
PD1B11和PD1B114具有极类似的序列。因为相比于PD1B114，PD1B11对人PD-1的亲和力更紧密约3倍且对cyno PD-1的亲和力更紧密约2倍，制备具有其各种CDR的组合的抗体。利用定点诱变将PD1B11的HCDR3置入PD1B164和PD1B162(PD1B114的亲和力成熟变体)，而将PD1B164(PD1B114的亲和力成熟变体)的HCDR2置入PD1B187(PD1B11的亲和力成熟变体)中。将所得的重链与亲本轻链配对，分别产生新的抗体PD1B194、PD1B195和PD1B196。
即使在亲和力成熟期间用多样化VL文库产生抗体，PD1B175和PD1B177均包含亲本轻链。在试图增大抗体亲和力中，将PD1B175重链与PD1L185或PD1L187亲和力成熟的轻链配对，并将PD1B177重链与PD1L86、PD1L168或PD1L190亲和力成熟的轻链配对，产生抗体PD1B197、PD1B198、PD1B199、PD1B200和PD1B201。实施例5中的表20示出了抗体的VH和VI配对。
这些抗体的HCDR、LCDR、VH和VL序列示于实施例5中的表14、15、16、17、18、19、21和22中。抗体克隆为IgG2σ/κmAbs，并且瞬时表达于HEK293expi细胞中以用于亲和力测量。
如上所述测定所得的抗体的亲和力。表12示出测量的组合mAb变体与cyno Pd-1的亲和力并且表13示出其与人PD-1的亲和力。计算由人和cyno蛋白质生成的3个或更多个平行测定值的标准偏差。如果对小于3个平行测定值进行计算，则指出范围。范围被定义为所测平行测定值的最低和最高值。对于没有范围或标准偏差的样本，仅进行一次实验。
表12：
Figure BDA0001717945540002101
表13：
Figure BDA0001717945540002111
实施例5：来源于噬菌体展示文库的抗-PD1抗体的结构表征
在用各种计划产生抗体过程中，使用标准技术获得抗体的cDNA序列和氨基酸翻译。在多肽序列测定中，一些编码可变区或全长抗体的抗体cDNA用标准方法进行密码子优化以大规模表达。
表14示出所选PD-1抗体的HCDR1序列。
表15示出所选PD-1抗体的HCDR2序列。
表16示出所选PD-1抗体的HCDR3序列。
表17示出所选PD-1抗体的LCDR1序列。
表18示出所选PD-1抗体的LCDR2序列。
表19示出所选PD-1抗体的LCDR3序列。
表20示出所选PD-1抗体的VH和VL配对。
表21示出所选PD-1抗体的VH序列。
表22示出所选PD-1抗体的VL序列。
表14：
Figure BDA0001717945540002121
表15：
Figure BDA0001717945540002122
Figure BDA0001717945540002131
表16：
Figure BDA0001717945540002132
Figure BDA0001717945540002141
表17：
Figure BDA0001717945540002142
表18：
Figure BDA0001717945540002143
Figure BDA0001717945540002151
表19：
Figure BDA0001717945540002152
Figure BDA0001717945540002161
表20：
Figure BDA0001717945540002162
表21：
Figure BDA0001717945540002171
表22：
Figure BDA0001717945540002172
Figure BDA0001717945540002181
所有抗-PD-1抗体被鉴定为具有VH1-69(SEQ ID NO:170)和IGKV3-11(L6)(SEQ IDNO:171)框架。
SEQ ID NO:170
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFS SYAIS WVRQAPGQGLEWMG GIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR
SEQ ID NO:171
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWP
实施例6：小鼠中PD-1抗体的产生和表征
BALB/c经腹膜内注射huPD1-ECD进行免疫并且评估特异性IgG效价。一旦获得足够的效价，分离脾细胞并与FO细胞融合。将所得的杂交瘤接种于96孔板中并培养10天。通过标准捕获ELISA来鉴定结合huPD1-ECD的抗原特异性克隆。进一步测试人PD-1-特异性杂交瘤与人和cynoPD-1的亲和力，与JurkaT细胞的结合以及cyno PD-L1抑制。基于结果，利用框架适应选择人源化克隆PD1B28。
框架适应过程按照基本上在美国专利公布2009/0118127和Fransson等人，(2010)J Mol Biol 398:214-231中所述的方式完成。简而言之，将重链和轻链序列与人种系序列(自2007年10月1起仅“01”等位基因)进行比较，该比较使用对IMGT数据库(Kaas等人，(2004)Nucl Acids Res 32,D208-D210；Lefranc等人，(2005)Nucl Acid Res 33,D593-D597)进行的BLAST检索。从该组人种系基因中去除冗余基因(在氨基酸水平100％相同)以及那些具有未配对半胱氨酸残基的基因。在框架和CDR区两者中选择其余最接近匹配人种系基因作为受体人框架。根据整体序列同源性与CDR长度以及CDR相似性选择几种VL和VH种系人框架。基于IGHJ/IGJK种系基因的序列相似性来选择FR-4。然后，将PD1B28的CDR转移至所选择的受体人框架中以生成HFA变体，除了在对应于VH的HCDR1的区域中之外。对于该区域，CDR和HV的组合、或较短的HCDR2(称为Kabat-7，参见美国专利公布2009/0118127)从非人抗体转移至人FR，因为尚未发现残留的HCDR2残基与已知结构的抗原-抗体复合物接触(Almagro,(2004)J Mol Recognit.17:132)。将回复突变引入人源化抗体的特定残基位置。PD1B131回复突变：VH：V37I_Q39L_W47S_R98S，VL：Y49K。PD1B132：VH W47S_R98S，VL：Y49K(残基根据Chothia编码)。所选抗体表达为IgG2σ/κ。表征所得的抗体与重组PD-1和表达于细胞(Jurkat细胞)PD-1的结合，以及其配体抑制(cyno PD-L1和人PD-L1)。所选人源化抗体的表征示于表23。所产生抗体的VH和VL序列分别示于表24和表25中。
表23：
Figure BDA0001717945540002201
表24：
Figure BDA0001717945540002202
表25：
Figure BDA0001717945540002203
PD1B131和PD1B132的CDR序列在下文示出：
HCDR1(SEQ ID NO:66)
RYDMS
HCDR2(SEQ ID NO:67)
YISGGGANTYYLDNVKG
HCDR3(SEQ ID NO:68)
PYLSYFDV
LCDR1(SEQ ID NO:69)
RASQSLSDYLH
LCDR2(SEQ ID NO:70)
SASQSIS
LCDR3(SEQ ID NO:71)
QNGHSFPYT
实施例7：同种型转换对抗-PD-1抗体特性的影响
将(IgG2σ/κ同种型的)抗体PD1B196和PD1B199的可变区克隆为IgG4S228P同种型，并将(IgG2的)抗体PD1B132的可变区克隆为IgG2σ同种型，以评估功能性和可发展性的可能差异。
抗体命名为PD1B244(PD1B196VH/VL，IgG4S228P上)PD1B245(PD1B199VH/VL，IgG4S228P上)和PD1B243(PD1B132VH/VL，IgG2σ上)。
同种型转换对抗体特性没有一致影响，然而，对于一些抗体，在CMV测定中看到EC50值的一些变化。
以下举例说明了各种抗体的重链和轻链氨基酸序列。表26示出所选抗体的VH VL、重链和轻链序列标识号(SEQ ID NO:)的汇总。
表26：
Figure BDA0001717945540002211
Figure BDA0001717945540002221
SEQ ID NO:72 PD1B244的HC
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFDTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPGLAAAYDTGSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:73 PD1B244的LC
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRNYWPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:74 PD1B243的HC
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSRYDMSWVRQAPGKGLESVAYISGGGANTYYLDNVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASPYLSYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:75 PD1B243的LC
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSLSDYLHWYQQKPGQAPRLLIKSASQSISGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQNGHSFPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:76 PD1B245的HC
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDYVISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIYGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGTLDRTGHLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:77 PD1B245的LC
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIHDASTRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRNYWPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:212 PD1B114的HC
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPGLAAAYDTGNLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:213 PD1B114的LC
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO 214 PD1B149的HC
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPGLAAAYDTGNLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:215 PD1B149的LC
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRNYLAWYQQKPGQAPRLLIHDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRNYWPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:216 PD1B160的HC
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFDTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPGLAAAYDTGNLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:217 PD1B160的LC
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SEQ ID NO:218 PD1B162的HC
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFDTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPGLAAAYDTGNLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:219 PD1B162的LC
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SEQ ID NO:220 PD1B164的HC
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SEQ ID NO:221 PD1B164的LC
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SEQ ID NO:222 PD1B183的HC
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPGLAAAYDTGSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:223 PD1B183的LC
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIKDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRGYWPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:224 PD1B184的HC
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPGLAAAYDTGSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:225 PD1B184的LC
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRNYLAWYQQKPGQAPRLLIHDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRNYWPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:226 PD1B185的HC
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPGLAAAYDTGSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:227 PD1B185的LC
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRNYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASDRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRWNWPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:228 PD1B192的HC
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPGLAAAYDTGSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:229 PD1B192的LC
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDSYLAWYQQKPGQAPRLLIHDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRNYWPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
实施例8：PD-1抗体在基于细胞的测定中的表征
使用如实施例1所述的方案，在MLR和CMV测定中表征所选抗体。得自MLR和CMV测定的IFN-γ诱导的EC50值示于表27中。在大部分情况下，抗-PD-1抗体示出IFN-γ水平在MLR和CMV测定中均剂量依赖性增大。
表27：
Figure BDA0001717945540002291
除IFN-γ之外，另外细胞因子的分泌水平也在两种测定中被PD-1阻断影响。在CMV刺激时，抗-PD-1抗体导致剂量依赖性诱导TNF-α和IL-4，而在MLR测定中，其增大TNF-α和IL-2水平。
实施例9：用噬菌体展示文库产生人抗-TIM-3抗体
实施例2中所述的从头合成pIX Fab文库针对重组人TIM-3-Fc融合蛋白(R&D系统，#2365-TM；全长TIM-3的残基Ser22-Arg200)(huTIM-3-Fc)的胞外域进行淘选。
重组蛋白质是生物素酰化的(bt)并且被捕集在链霉抗生物素蛋白磁珠(Dynal)上，然后以100nM的最终浓度暴露于从头合成pIX Fab文库。在PBS-Tween中洗掉非特异性噬菌体，并且通过MC1061F的大肠杆菌细胞感染来回收结合的噬菌体。从这些细胞扩增噬菌体过夜，并且重复淘选共三轮。在最终一轮生物淘选后，筛选出结合由链霉抗生物素蛋白捕集于ELISA板上的生物素酰化人TIM-3-Fc的单克隆Fab，并且将分泌的Fab添加至捕集的抗原，然后用山羊抗人κ:HRP检测Fab。所选抗体表达并克隆于如下所示的各种IgG同种型上，并且进一步表征。
实施例10：小鼠中抗-TIM-3抗体产生
在18天过程中，用重组人TIM-3-Fc融合蛋白(R&D系统，目录号2365-TM)免疫Balb/c小鼠。收获脾，使富集的B细胞群与FO小鼠骨髓瘤细胞融合，产生mAb分泌性杂交瘤。通过ELISA筛选出结合TIM-3-Fc蛋白质和不相关人IgG1Fc的杂交瘤上清液。然后，测定TIM-3特异性上清液结合表达TIM-3的THP-1细胞的能力。
使用标准分子生物学技术(RT-PCR，然后使PCR片段连接到质粒表达载体中)，从TIM-3阳性杂交瘤克隆所选的mAb HC和LC v-基因。使mAb重组表达，并且重复ELISA以确认TIM-3特异性结合。采用MOE(CCG,Montreal)和目视检查构建人框架适应性小鼠抗体序列的分子模型。对可能影响抗原结合的潜在疑难位置、可能影响域稳定性的VL/VH堆积和/或核心残基进行鉴别。对于VL和VH两者，如果疑难位置被鉴别出，则多种人框架被提出对小鼠框架序列具有或不具有回复突变。将所设计的序列克隆到重链和轻链质粒中并且在Expi293F细胞中表达。对培养上清液中表达的抗体进行定量并评估与重组人TIM-3转染的HEK293细胞的结合。
实施例11：抗-TIM-3抗体的同种型
在抗体表征过程中，将分离的抗-TIM-3抗体的VH和VL克隆到任选地具有各种Fc置换的各种重链同种型以及具有κ轻链的同种异型上，以评价同种型转换(如果有的话)对抗体的功能性或可发展性的影响。所用各种同种型示于表28中。
表28：
Figure BDA0001717945540002301
Figure BDA0001717945540002311
产生的抗体中所用的各种同种异型示于表29中。一些抗体具有嵌合同种异型。抗体TM3B105和TM3B403的区别例如在于位置189处恒定区中的一个氨基酸置换。TM3B105重链和轻链分别为SEQ ID NO:240和79；TM3B403重链和轻链分别为SEQ ID NO:78和79。两种抗体预计具有相同的特征。
表29：
Figure BDA0001717945540002312
Figure BDA0001717945540002321
一般来讲，具有IgG2σFc的抗-TIM-3抗体在CMV测定中比具有huIgG4Fc的抗-TIM-3抗体的活性更大。此外，具有huIgG2Fc的抗体展示出介于IgG2σ和IgG4之间的功能性。同种异型对抗体活性没有影响。
实施例12：抗-TIM-3抗体的结构表征
在用各种计划产生抗体过程中，使用标准技术获得抗体的cDNA序列和氨基酸翻译。在多肽序列测定中，一些编码可变区或全长抗体的抗体cDNA用标准方法进行密码子优化以大规模表达。从噬菌体展示文库分离抗体TM3B103、TM3B105、M3B108、TM3B109和TM3B113。由免疫小鼠产生抗体TM3B189、TM3B190、TM3B193、TM3B195和TM3B196。
表30示出所选的抗-TIM-3抗体的HCDR1序列。
表31示出所选的抗-TIM-3抗体的HCDR2序列。
表32示出所选的抗-TIM-3抗体的HCDR3序列。
表33示出所选的抗-TIM-3抗体的LCDR1序列。
表34示出所选的抗-TIM-3抗体的LCDR2序列。
表35示出所选的抗-TIM-3抗体的LCDR3序列。
表36示出所选的抗-TIM-3抗体的VH序列。
表37示出所选的抗-TIM-3抗体的VL序列。
表38示出所选的抗-TIM-3抗体的框架。
表30：
Figure BDA0001717945540002322
Figure BDA0001717945540002331
表31：
Figure BDA0001717945540002332
表32：
Figure BDA0001717945540002333
表33：
Figure BDA0001717945540002334
Figure BDA0001717945540002341
表34：
Figure BDA0001717945540002342
表35：
Figure BDA0001717945540002343
表36：
Figure BDA0001717945540002351
Figure BDA0001717945540002361
表37：
Figure BDA0001717945540002362
Figure BDA0001717945540002371
表38：
Figure BDA0001717945540002372
IGHV3-23SEQ ID NO:174
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK
IGHV1-02SEQ ID NO:175
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT GYYMHWVRQAPGQGLEWMG RINPNSGGTNYAQKFQGRVTSTRDTSISTAYMELSRLRSDDTVVYYCAR
IGHV4-30 SEQ ID NO:176
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR
IGHV1-03 SEQ ID NO:177
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMHWVRQAPGQRLEWMG
WINAGNGNTKYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR
IGHV2-26 SEQ ID NO:178
QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSNARMGVSWIRQPPGKALEWLA HIFSNDEKSYSTSLKSRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARI
IGHV5-51 SEQ ID NO:179
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCAR
IGKV3-20 SEQ ID NO:180
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSP
IGKV3-11 SEQ ID NO:171
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWP
IGKV4-1SEQ ID NO:181
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSP
IGKV1-39 SEQ ID NO:182
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPI
GKV1-33 SEQ ID NO:183
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLP
实施例13：抗-TIM-3抗体的表征
表征所选抗体与人或cyno细胞的结合，以及其阻断配体半乳糖凝集素9结合的能力。表39示出这些测定中所选抗体的特征。细胞结合数据表示所计算的抗体结合经指定TIM-3重组蛋白质转染的细胞(以μg/ml单位表示)的EC50值。就所指定抗体所见，半乳糖凝集素-9抑制表示抑制半乳糖凝集素-9与人TIM-3结合的最大水平。受试抗体测试为IgG2σ同种型。
通过将重组huTIM-3-Fc蛋白质涂覆于MSD板上进行表位作图测定。将板封闭并洗涤，然后添加与增大浓度的未标记抗-TIM-3mAB的一起温育的MSD-标签-标记的抗-TIM-3mAb的混合物。在室温轻柔振荡下温育后，将板洗涤并用SECTOR Imager 6000分析。彼此竞争性结合人TIM-3的抗体被认为结合类似的表位。如果>75％的结合受到抑制，则记录为阳性抑制。部分抑制为40-75％抑制。<40％抑制表示为阴性。
表39：
Figure BDA0001717945540002391
实施例14：表征抗-TIM-3抗体的体外功能测定的展开
可使用经异源树突状细胞或特异性抗原(诸如破伤风类毒素或CMV)刺激的正常供体的T细胞进行抑制性受体如PD-1的功能评价。以此设定，在抗体处理情况下，T细胞功能变化可通过测量上清液细胞因子水平或T细胞活化的标记物进行检测。抗-TIM-3抗体的效应可在这些类型测定中高度可变，并且大多数T细胞(非抗原特异性)的活化状态或功能性的总体变化较小。另一方面，在这些测定中使用遵循单一T细胞亚群/克隆的四聚物方法因这些T细胞克隆的较低频率和异质功能特征而没有提供检测抗-TIM-3抗体功能效应所需的解决方案。此外，该方法需要预先鉴定各个供体中CMV-特异性T细胞所识别的表位。
CD137最近描述为活化抗原特异性T细胞的替代标记物(Wolf等人，(2007)Blood110(1):201-210；Klinger等人，(2013)PLoS One 8(9):e74231)。在我们的测定中，使用CD137能够鉴定响应于CMV抗原刺激而扩增的抗原特异性CD8+和CD4+T细胞，并允许检测抗-TIM-3抗体的功能效应。除CD137表达之外，另外在这些测定中通过MSD评价细胞因子分泌。
在CMV pp65-刺激的PBMC中测试所选抗-TIM-3抗体的活性。在这些测定中，抗-TIM-3抗体加强T细胞活化，如CD8+和CD4+T细胞两者上提高的CD137表达所证实的那样。此外，在该测定中，所选抗-TIM-3抗体还增强IFN-γ和TNF-α的分泌。
表40示出CMV测定的结果，其中对所选TIM-3抗体而言，在CD8+或CD4+细胞上评价增强的CD137表面表。该表显示用双尾t检验(不等方差)产生的p值。
表40：
Figure BDA0001717945540002401
实施例15：双特异性PD-1/TIM-3抗体的产生
所选单特异性PD-1和TIM-3抗体表达为IgG1/κ、IgG2/κ或IgG4/κ。置换在单特异性抗体的位置405和409(EU编号)处进行，以促进后续体外臂交换并形成双特异性抗体。IgG1和IgG2抗-PD-1以及抗-TIM-3抗体被工程化成分别具有F405L和K409R置换，以促进臂交换并产生双特异性抗体。在IgG4上，409WT位置为R，因此IgG4抗-PD-1抗体未被工程化，并且IgG4抗-TIM-3抗体被工程化成具有F405L和R409K置换。除位置405和409置换之外，IgG4mAb被工程化成具有S228P置换，并且IgG2抗体被任选地工程化成包括IgG2σ置换(V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S)。
将单特异性抗体表达并通过使用蛋白A柱(HiTrap MabSelect SuRe柱)的标准方法纯化。洗脱后，将收集物透析至D-PBS(pH 7.2)。
通过在体外Fab臂交换中组合单特异性PD-1mAb和单特异性TIM-3mAb来生成双特异性PD-1/TIM-3抗体，如国际专利公布WO2011/131746中所述。简而言之，将约1-20mg/ml的各抗体的PBS溶液(pH 7-7.4)和75mM 2-巯基乙醇胺(2-MEA)以摩尔比1:1混合在一起并在25-37℃下温育2-6h，然后采用标准方法通过透析、渗滤、切向流过滤和/或旋转细胞过滤除去2-MEA。
使用标准方法，利用疏水作用色谱在体外Fab臂交换后进一步纯化双特异性抗体，以使残余的亲本PD-1和TIM-3抗体最小化。
在体外Fab臂交换中，使所选单特异性抗-PD-1抗体和抗-TIM-3抗体在基质中混合，以产生双特异性抗体。表41、表42和表43示出所产生双特异性抗体及其同种型的VH、VL、HC和LC序列。G2抗体同种异型为G2m(n)/(n-)或G2m(n-)。
在一些实验中，使用对PD-1或TIM-3呈单价的对照抗体，并且第二臂对结合gp120呈惰性。gp120结合臂具有SEQ ID NO:184的VH和SEQ ID NO:185的VL。表44示出所产生的对照抗体。
SEQ ID NO:184gp120结合mAb的VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCQASGYRFSNFVIHWVRQAPGQRFEWMGWINPYNGNKEFSAKFQDRVTFTADTSANTAYMELRSLRSADTAVYYCARVGPYSWDDSPQDNYYMDVWGKGTTVIVSS
SEQ ID NO:185gp120结合mAb的VL
EIVLTQSPGTLSLSPGERATFSCRSSHSIRSRRVAWYQHKPGQAPRLVIHGVSNRASGISDRFSGSGSGTDFTLTITRVEPEDFALYYCQVYGASSYTFGQGTKLERK
表41：
Figure BDA0001717945540002421
表42：
Figure BDA0001717945540002422
Figure BDA0001717945540002431
表43：
Figure BDA0001717945540002432
SEQ ID NO:186
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFDTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPGLAAAYDTGSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:187
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSRYDMSWVRQAPGKGLESVAYISGGGANTYYLDNVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASPYLSYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:188
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRNYWPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:189
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSLSDYLHWYQQKPGQAPRLLIKSASQSISGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQNGHSFPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:190
EVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSYWMQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGDGDIRYTQNFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCARWEKSTTVVQRNYFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:191
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SEQ ID NO:192
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SEQ ID NO:193
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SEQ ID NO:194
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SEQ ID NO:195
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASENVGTFVSWYQQKPGKAPKLLIYGASNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGQSYSYPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:241
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SEQ ID NO:242
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SEQ ID NO:243
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SEQ ID NO:244
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SEQ ID NO:248
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表44：
Figure BDA0001717945540002491
实施例16：双特异性PD-1/TIM-3抗体的表征
在CMV测定中，测试所产生的拮抗性双特异性抗体增强抗原特异性T细胞应答的能力。通过估计CD4+和CD+T细胞两者上的CD137表达并且通过培养上清液中的IFN-γ和TNF-α水平(如实施例14所述)来测量功能性。表45和表46汇总了该测定中双特异性PD-1/TIM-3抗体活性的不同读出值。如该表中所示，所选双特异性分子导致CD4+和CD8+T细胞上的CD137表达以及分泌的IFN-γ和TNF-α水平显著增大。总之，具有huIgG2σFc的PD-1/TIM-3双特异性抗体(bispecifics)具有最强的活性，继之以具有huIgG2的那些，接着为具有huIgG4的那些。
表45：
Figure BDA0001717945540002492
表46：
Figure BDA0001717945540002501
实施例17：抗-PD1抗体上调肿瘤上的TIM-3表达
在CT26或MC38结肠癌小鼠模型中评价抗-PD-1抗体治疗在肿瘤上的TIM-3表达中的效应。
Balb/c小鼠经皮下植入1×106个CT26结肠癌肿瘤。在肿瘤细胞移植后七天，测量肿瘤并且通过尺寸肿瘤将小鼠随机化。用PBS或10mg/kg抗-小鼠PD-1抗体(克隆RMP1-14，BioXCell)治疗开始于肿瘤细胞移植后第7天，并且剩余的研究每两周继续进行一次。为了分析TIM-3的T细胞表达，在第22天收获肿瘤，并且用GentleMACS(Miltenyi)分离。染色或流式细胞术采用Live/Dead和CD3、CD4、CD8和TIM-3的标记物进行。流式细胞术在LSRFortessa(BD)上进行。使用Flow Jo软件分析数据。
野生型C57Bl/6雌性小鼠经皮下植入经皮下植入5×105个悬浮于PBS的MC-38结肠癌细胞。测量肿瘤并且通过尺寸肿瘤将小鼠随机化(50-100mm3)。用PBS或10mg/kg抗-小鼠PD-1(克隆RMP1-14，BioXCell)治疗开始于随机化之后，并且剩余的研究每两周继续进行一次。为了肿瘤浸润T细胞特征，在移植后12、15、19或22天收获肿瘤并用GentleMACS(Miltenyi)分离。
流式细胞术的染色利用Live/Dead和CD45、Thy1、CD3、CD4、CD8、TIM-3、CD137、OX40、GITR、TIGIT的标记物进行。流式细胞术数据在LSR Fortessa(BD)上采集。用FlowJo软件(v9.9.4)分析数据并利用GraphPad Prism可视化。利用GraphPad Prism生成统计值。
在第22天从CT26肿瘤分离的CD8+T细胞上TIM-3的表达的分析显示出，相比于PBS对照，经PD-1处理的样本中TIM-3的表达有所提高。图1A示出在两个处理组中TIM-3表达的平均荧光强度。
当相比于PBS对照时，在抗-PD-1mAb处理的样本中，MC-38肿瘤中TIM-3的表达也有所提高。图1B示出CD8+TIL群体中TIM-3表达的几何平均荧光强度。图1C示出总CD8+TIL的TIM-3+CD8+细胞的相对频率百分比(％)。
这些数据示出TIM-3响应于抗-PD-1处理而上调，支持了在经PD-1治疗的受试者中靶定TIM-3的合理性。
还在从经抗-小鼠PD-1抗体治疗的小鼠分离的CD8+T细胞浸润MC38肿瘤上分析了CD137、OX40和GITR表达。这些结果示出TNF家族协同刺激受体CD137、OX40和GITR表达的频率和水平(gMFI)均在PD-1阻断后有所提高。图2A和图2B分别示出CD8TIL上CD137表达的gMFI和相对频率。图3A和图3B分别示出CD8TIL上OX40表达的gMFI和相对频率，并且图4A和图4B分别示出CD8TIL上GITR的gMFI和相对表达。
这些数据支持在经PD-1处理的受试者中靶定CD137、OX40和/或GITR的合理性。
实施例18：PD-1阻断后抗-TIM-3抗体的活性
还在CMV测定中测试了抗-PD-1抗体阻断后抗-TIM-3抗体的活性。在这些实验中，将得自正常供体(CMV-血清阳性)的PBMC与pp65肽库和抗-PD-1抗体一起温育5天。在第5天，收获上清液，并在不存在抗-TIM-3或抗-PD-1抗体时用pp65肽库重刺激细胞。24小时后测量上清液中的IFN-γ水平。在抗-PD-1阻断5天后用抗-TIM-3抗体处理导致IFN-γ水平显著增大。该效应相比于持续抗-PD-1处理是显著的(p＝0.0183)。在实验中，使用抗-TIM-3抗体TM3B403和抗-PD-1抗体PD1B244。图5示出CMV测定中增大的IFN-γ水平，其中PBMC在用抗-PD-1PD1B244处理5天后用抗-TIM-3抗体TM3B105处理。值表示用于各个条件的六次生物重复测定的平均值。
实施例19：抗-TIM-3抗体的表位作图
实施溶液氢/氘交换质谱(HDX-MS)以鉴定TMB403和TMB291的结合表位。对于该实验，将TM3B403和TM3B291的VH和VL克隆为在C-末端具有六组氨酸标签的IgG1Fab。在悬浮摇瓶中，由HEK293Expi细胞的瞬时转染产生Fab。TIM-3IgG1Fc嵌合体，Ser22-Arg200(登录号Q8TDQ0)在得自R&D系统(目录号2365-TM)的小鼠骨髓瘤细胞系(NS0来源)中产生。
对于H/D交换，用于分析Fab扰动的步骤与前述的那些类似(Hamuro等人，Biomolecular Techniques 14:171-182,2003；Horn等人，Biochemistry45:8488-8498,2006)，同时作了一些修改。简而言之，将去糖基化人TIM-3/Fc融合蛋白或去糖基化人TIM-3-Fc加Fab混合物与氧化氘标记缓冲液在0℃一起温育不同的时间，多至2小时。通过添加盐酸胍来猝灭氘交换，并且使淬灭的样本经受柱上胃蛋白酶消化和LC-MS分析。质谱仅以MS模式记录。对于氘引入的计算，将给定肽的质谱在提取的离子色谱峰上合并，并计算加权平均m/z。从天然肽(0min)质量到加权平均质量的质量增加对应于氘引入水平。约98.4％的蛋白质可映射于特定肽。
由LC-MS上的质量位移监测所识别肽处的氘水平。绘制出所选氘积聚曲线，其在肽的交换时间内示出氘水平和/或斜率的显著差异。去糖基化人Tim-3/Fc融合蛋白示出在序列32WGKGACPVFECGNVVL47(SEQ ID NO:261)处结合TM3B403时和在序列90RIQIPGIMNDEKF102(SEQ ID NO:262)处结合TM3B291时氘摄入的显著降低。这些在结合Fab时氘摄入显著降低的区域可因此被视为mAb的主要表位。
片段50DERDVNY56(SEQ ID NO:263)示出在结合TM3B403或TM3B291时氘交换适度下降。该区域也可被视为两种抗体的潜在表位。
TM3B403或TM3B291的主要结合表位是不同的。然而，基于HDX作图结果，它们可共享类似的适度保护区50DERDVNY56(SEQ ID NO:263)。为了有助于评估该区域是否对两种Fab分子的共同结合表位区作贡献，进行竞争ELISA。将重组人Tim-3/Fc蛋白质直接涂覆到板上并然后封闭和洗涤。钌(Ru)-标记的TM3B291Fab的混合物与不同浓度的未标记TM3B105或TM3B291一起预温育。将板温育，洗涤，并将MSD Read Buffer T分配到各个孔中，然后用SECTOR Imager 6000(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD)读取。
竞争分析表明，TM3B403与TM3B291竞争性结合TIM-3。该结果可表明适度保护的区域DERDVNY(SEQ ID NO:263)是两种抗体的表位的一部分，并且抗体可因其表位紧密靠近而在空间上彼此阻断结合。
实施例20：TIM-3阻断增大CD8+TIL上的TIGIT表达
在CT26和MC38结肠癌小鼠模型中评价抗-TIM-3抗体治疗对肿瘤中TIGIT表达的效应。该研究如实施例17所述的那些进行，不同的是使用10mg/ml抗-TIM-3RMT3-23(Bioxcell)抗体。
在TIM-3阻断后，在CT26(图19A，图19B)和MC38(图20A，图20B)肿瘤模型两者中评价CD8+TIL上的TIGIT表达(图19A，图20A)和TIGIT+TIL的相对频率(图19B，图20B)。
实施例21：在黑色素瘤患者PBMC中体外PD-1阻断后TIM-3表达增大
在存在抗-PD-1或抗-TIM-3功能阻断性抗体时，用黑色素瘤抗原肽库(NY-ESO，gp100，MART-1)刺激得自初次用药黑色素瘤患者的PBMC。在第6天，在肽重刺激的细胞上评价TIM-3的表达。结果示出相比于对照或TIM-3处理的PBMC，抗-PD-1处理的样本中TIM-3+CD8+T细胞的频率显著增大(图21)。
在第0天，将得自初次用药黑色素瘤患者的冷冻PBMC迅速在37℃水浴中解冻。使细胞解冻，洗涤并在完全RMPI培养基(RPMI+10％FBS+1％丙酮酸钠+1％NEAA+1％青霉素/链霉素)中进行计数。在存在或不存在抗-PD-1或抗-TIM-3功能阻断抗体(分别为PD1B244和TM3B403)和1μg/mL黑色素瘤抗原肽库(NY-ESO，gp100，MART-1)情况下，将细胞于37C以200,000个细胞/孔铺板到96孔U形底部板中6天。在第6天，将细胞用肽库重刺激，并用流式细胞术分析PD-1和TIM-3的表达以及T细胞活化和增殖标记物。
实施例22：抗-TIM-3抗体增大IL-2刺激的PBMC中活化NK细胞的频率
在用IL-2(20U)刺激人PBMC的测定中，测定抗-TIM-3抗体TM3B403对活化NK细胞的频率的影响。在mAb浓度范围内后处理48小时，通过流式细胞术评价CD69和CD25的频率、NK细胞活化的标记物。当利用CD69阳性细胞百分比(图22A)或CD25阳性细胞百分比(图22B)评估活化时，TM3B403增大活化NK细胞的频率。
Figure IDA0001717945590000011
Figure IDA0001717945590000021
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Figure IDA0001717945590000821
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Claims (23)

1.一种分离的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体，包含特异性结合PD-1的第一域和特异性结合TIM-3的第二域，其中：
a) 所述第一域包含分别为SEQ ID NO: 10、14、17、23、26和32，或者分别为SEQ ID NO:66、67、68、69、70和71的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；并且
b) 所述第二域包含分别为SEQ ID NO: 97、105、115、124、133和143，或者分别为SEQID NO: 91、99、108、118、127和136的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体具有以下特性中的一个或两个：
a) 增强抗原特异性CD4+或CD8+ T细胞的活化；或者
b) 抑制SEQ ID NO: 138的TIM-3与SEQ ID NO: 308的半乳糖凝集素-9结合。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的抗体，其中所述抗体在TIM-3残基32-47（WGKGACPVFECGNVVL）（SEQ ID NO: 261）内结合TIM-3，任选地还结合在TIM-3残基50-56（DERDVNY）（SEQ ID NO: 262）内。
4.根据权利要求3所述的抗体，其中
a) 所述第一域包含分别为SEQ ID NO: 10、14、17、23、26和32的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且所述第二域包含分别为SEQ ID NO: 91、99、108、118、127和136的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；
b) 所述第一域包含SEQ ID NO: 48的VH和SEQ ID NO: 56的VL，并且所述第二域包含SEQ ID NO: 146的VH和SEQ ID NO: 156的VL；
c) 第一重链（HC1）、第一轻链（LC1）、第二重链（HC2）和第二轻链（LC2）分别包含为SEQID NO: 186、188、191和194的序列；
d) 所述HC1、LC1、HC2和LC2分别包含为SEQ ID NO: 186、188、248和194的序列；
e) 所述HC1、LC1、HC2和LC2分别包含为SEQ ID NO: 241、188、245和194的序列；或者
f) 所述HC1、LC1、HC2和LC2分别包含为SEQ ID NO: 243、188、246和194的序列。
5.根据权利要求1-2中任一项所述的抗体，其中所述抗体在TIM-3残基90-102（RIQIPGIMNDEKF）（SEQ ID NO: 263）内结合TIM-3，任选地还结合在TIM-3残基50-56（DERDVNY）（SEQ ID NO: 262）内。
6.根据权利要求5所述的抗体，其中
a) 所述第一域包含分别为SEQ ID NO: 10、14、17、23、26和32的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且所述第二域包含分别为SEQ ID NO: 97、105、115、124、133和143的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；
b) 所述第一域包含SEQ ID NO: 48的VH和SEQ ID NO: 56的VL，并且所述第二域包含SEQ ID NO: 172的VH和SEQ ID NO: 173的VL；
c) 第一重链（HC1）、第一轻链（LC1）、第二重链（HC2）和第二轻链（LC2）分别包含为SEQID NO: 186、188、192和195的序列；
d) 所述HC1、LC1、HC2和LC2分别包含为SEQ ID NO: 241、188、244和195的序列；或者
e) 所述HC1、LC1、HC2和LC2分别包含为SEQ ID NO: 243、188、247和195的序列。
7.根据权利要求1-2中任一项所述的抗体，其中所述抗体为：
a) IgG1同种型，其在Fc区中任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九或十个置换；
b) IgG2同种型，其在Fc区中任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九或十个置换；
c) IgG3同种型，其在Fc区中任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九或十个置换；
d) IgG4同种型，其在Fc区中任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九或十个置换；
e) IgG1同种型，其包含L234A、L235A、G237A、P238S、H268A、A330S和P331S置换；
f) IgG2同种型，其包含V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S和P331S置换；
g) IgG4同种型，其包含F234A、L235A、G237A、P238S和Q268A置换；
h) IgG1同种型，其包含L234A、L235A或L234A和L235A置换；
i) IgG4同种型，其包含F234A、L235A或F234A和L235A置换；
j) IgG2同种型，其包含V234A置换；
k) IgG4同种型，其包含S228P置换；
l) IgG4同种型，其包含S228P、F234A和L235A置换；
m) IgG2同种型，其包含F405L和R409K置换；或者
n) IgG1同种型，其包含F405L和K409R置换，其中残基根据EU索引进行编号。
8.一种药物组合物，包含根据权利要求1-7中任一项所述的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体以及药学上可接受的载体。
9.一种多核苷酸，其编码权利要求1-7中任一项所述的拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体。
10.一种载体，包含根据权利要求9所述的多核苷酸。
11.一种分离的宿主细胞，包含根据权利要求10所述的载体。
12.一种制备拮抗性双特异性PD-1/TIM-3抗体的方法，包括在表达所述抗体的条件下培养根据权利要求11所述的宿主细胞，并且回收并纯化所述宿主细胞产生的拮抗性双特异性PD1/TIM-3抗体。
13.根据权利要求1-7中任一项所述的分离的抗体或者根据权利要求8所述的药物组合物在制备用于治疗受试者的癌症的药物中的用途。
14.根据权利要求13所述的用途，其中所述癌症是实体瘤或血液恶性肿瘤。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述实体瘤是黑色素瘤、肺癌、鳞状非小细胞肺癌、非鳞状非小细胞肺癌、结直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、甲状腺癌、头颈部的鳞状细胞癌、食道癌、乳腺癌、输卵管癌、脑癌、尿道癌、泌尿生殖系统癌或宫颈癌。
16.根据权利要求14所述的用途，其中所述实体瘤是阉割抗性前列腺癌。
17.根据权利要求14所述的用途，其中所述实体瘤是癌症的转移性病变。
18.根据权利要求1-7中任一项所述的分离的抗体或者根据权利要求8所述的药物组合物在制备用于增强受试者的免疫应答的药物中的用途。
19.根据权利要求18所述的用途，其中所述受试者具有癌症或病毒感染。
20.根据权利要求13-19中任一项所述的用途，其中将所述分离的抗体与第二治疗剂联合施用。
21.根据权利要求20所述的用途，其中所述第二治疗剂为：
a) 用于治疗所述实体瘤或所述血液恶性肿瘤的标准护理药物；或者
b) 疫苗。
22.根据权利要求13-19中任一项所述的用途，其中将所述分离的抗体与放射法或外科手术联合施用。
23.根据权利要求13-19中任一项所述的用途，其中
a) 所述受试者正在或已经用特异性结合PD-1的拮抗性抗体治疗；或者
b) 受试者难以或抵抗用特异性结合PD-1的拮抗性抗体治疗。
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