EA045238B1

EA045238B1 - Антитела, специфически связывающие pd-1, и их применение

Info

Publication number: EA045238B1
Application number: EA201891093
Authority: EA
Inventors: Ралука Верона; Гордон Пауэрс; Нина Чи Сейбинз; Никки А. Диэнджелис; Сандра Сантулли-Маротто; Карла Р. Вихэджен; Шэн-Дзюн Ву; Кэтрин Ферранте; Энрике Зудаире Убани
Original assignee: Янссен Байотек, Инк.
Priority date: 2015-11-03
Filing date: 2016-11-01
Publication date: 2023-11-07

Description

Область применения изобретения

Настоящее изобретение относится к антителам, специфически связывающим PD-1, полинуклеотидам, кодирующим антитела или фрагменты, а также способам получения и применения вышеуказанного.

Предпосылки создания изобретения

Иммунная система жестко контролируется сетью костимуляторных и коингибиторных лигандов и рецепторов. Эти молекулы обеспечивают вторичные сигналы для активации T-клеток и обеспечивают сбалансированную сеть положительных и отрицательных сигналов для максимизации иммунных ответов против инфекции и опухолей, в то же время ограничивая иммунность против самих себя (Wang et al., (Epub Mar. 7, 2011) J Exp Med 208(3):577-92; Lepenies et al., (2008) Endocr Metab Immune Disord Drug Targets 8:279-288.

Терапия иммунных контрольных точек, нацеленная на коингибиторные пути в Т-клетках для стимулирования противоопухолевых иммунных ответов, привела к прогрессу в клиническом лечении пациентов с раком.

PD-1 представляет собой молекулу негативной иммунной контрольной точки, которая подавляет функции T-клеток CD4+ и CD8+ в микросреде опухоли (TME). Связывание PD-1 со своими лигандами (PD-L1 и PD-L2) вызывает инактивацию и истощение T-клеток в опухолях посредством ингибирования множества путей сигнализации от рецепторов T-клеток, что приводит к снижению выживаемости, роста и пролиферации T-клеток, нарушению эффекторной функции и изменению метаболизма. Доклинические исследования продемонстрировали, что блокада пути PD-1 может обращать истощение T-клеток и стимулировать противоопухолевый иммунитет.

Следовательно, путь PD-1 участвует в понижающей регуляции функций T-клеток в TME и уклонению опухолей от иммунного разрушения. Истощенные T-клетки в TME, в дополнение к экспрессии высоких уровней PD-1, экспрессируют и другие ингибиторные рецепторы, включая CTLA-4, TIM-3, LAG-3, CD244, TIGIT и CD160 (см., например, Pauken & Wherry; 2015, Trends in Immunology 36(4):265-276).

TIM-3 представляет собой трансмембранный рецептор, который экспрессируется на Th1-клетках (T-хелпер 1) CD4+ и цитотоксических T-клетках CD8+, которые секретируют ИФН-γ. TIM-3 по существу не экспрессируется на наивных T-клетках, но вместо этого усиливается на активированных эффекторных T-клетках. TIM-3 играет роль в регуляции иммунитета и толерантности in vivo (см. Hastings et al., (2009) Eur J Immunol 39(9):2492-501).

Антитела к PD-1 были описаны, например, в: патентах США № 5,897,862 и 7,488,802 и в международных патентных публикациях № WO2004/004771, WO2004/056875, WO2006/121168, WO2008/156712, WO2010/029435, WO2010/036959, WO2011/110604, WO2012/145493, WO2014/194302, WO2014/206107, WO2015/036394, WO2015/035606, WO2015/085847, WO2015/112900 и WO2015/112805.

Антитела к TIM-3 были описаны, например, в: Monney et al., Nature (2002) 415 (6871): 536-41 и в международных патентных публикациях № WO2011/155607, WO2013/006490 и WO2015/117002.

Комбинации с антителом к TIM-3 и антителом к PD-L1 оценивали, например, в международной патентной публикации № WO2011/159877.

Хотя антитела к PD-1/PD-L1 демонстрируют обнадеживающие значения клинического ответа у пациентов с множественными солидными опухолями, показатели ответа все еще достаточно низкие и составляют около 15-20% у ранее получавших лечение пациентов (Swaika et al., (2015) Mol Immunol doi: 10.1016/j.molimm.2015.02.009).

Таким образом, существует потребность в новых терапевтических средствах, которые ингибируют иммуносупрессивную активность ингибиторов контрольной точки, таких как PD-1 и TIM-3, для применения в иммунотерапии рака и лечении других заболеваний, которое могло бы быть основано на усилении иммунного ответа, таких как хронические инфекции.

Краткое изложение сущности изобретения

В изобретении предложено выделенное антитело-антагонист, специфически связывающееся с PD-1, содержащее определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1), HCDR2 и HCDR3 с SEQ ID NO: 82, 83 и 84 соответственно или с SEQ ID NO: 82, 83 и 85 соответственно.

В изобретении также предложено выделенное антитело-антагонист, специфически связывающееся с PD-1, содержащее определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1), HCDR2 и HCDR3 с SEQ ID NO: 82, 83 и 84 соответственно и определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1), LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 86, 87 и 88 соответственно.

В изобретении также предложено выделенное антитело-антагонист, специфически связывающееся с PD-1, содержащее определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1), HCDR2 и HCDR3 с SEQ ID NO: 82, 83 и 85 соответственно и определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1), LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 86, 87 и 88 соответственно.

В изобретении также предложено выделенное антитело-антагонист, специфически связывающееся

- 1 045238 с PD-1, содержащее определенные аминокислотные последовательности HCDR1, HCDR2, HCDR3,

LCDR1, LCDR2 и LCDR3, описанные в настоящем документе.

В изобретении также предложено выделенное антитело-антагонист, специфически связывающееся с PD-1, содержащее определенные аминокислотные последовательности VH и VL, описанные в настоящем документе.

В изобретении также предложен иммуноконъюгат, содержащий антитело или его антигенсвязывающий участок по изобретению, связанный с терапевтическим агентом или визуализирующим агентом.

В изобретении также предложена фармацевтическая композиция, содержащая антитело изобретения и фармацевтически приемлемый носитель.

В изобретении также предложен полинуклеотид, кодирующий VH антитела, VL антитела или VH и VL антитела по изобретению.

В изобретении также предложен вектор, содержащий полинуклеотид, который кодирует VH антитела, VL антитела или VH и VL антитела по изобретению.

В изобретении также предложена клетка-хозяин, содержащая вектор по изобретению.

В изобретении также предложен способ получения антитела по изобретению, включающий культивирование клетки-хозяина по изобретению в условиях экспрессии антитела и выделение антитела, продуцируемого клеткой-хозяином.

В изобретении также предложен способ лечения рака у субъекта, включающий введение требующему этого субъекту терапевтически эффективного количества выделенного антитела по изобретению в течение времени, достаточного для лечения рака.

В изобретении также предложен способ усиления иммунного ответа у субъекта, включающий введение требующему этого субъекту терапевтически эффективного количества выделенного антитела по изобретению в течение времени, достаточного для усиления иммунного ответа.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, связывающееся с антителом по изобретению.

В изобретении также предложен набор, содержащий антитело по изобретению.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1A показано, что поверхностная экспрессия TIM-3 в опухолях повышается после обработки антителами к PD-1. Мышей Balb/c с подтвержденными опухолями карциномы толстой кишки CT26 два раза в неделю обрабатывали антителом к PD-1 или носителем. Опухоли собирали в день 22 и оценивали экспрессию TIM-3 на инфильтрированных T-клетках опухоли с помощью проточной цитометрии. СИФ средняя интенсивность флуоресценции. PBS контроль.

На фиг. 1B показано, что на инфильтрированных лимфоцитах опухоли (TIL) после обработки антителами к PD-1 повышается поверхностная экспрессия TIM-3. Мышей Balb/c с подтвержденными опухолями карциномы толстой кишки MC38 два раза в неделю обрабатывали антителом к PD-1 или носителем. Средняя геометрическая интенсивность флуоресценции (гСИФ) экспрессии TIM-3 в общей популяции TIL CD8 показана у животных, получавших обработку носителем (PBS), или получавших обработку антителом к PD-1 (PD-1). p=0,003 в сравнении групп, получавших обработку носителем и антителом к PD-1.

На фиг. 1C показана относительная частота клеток TIM-3+ CD8 из всех TIL CD8+ в опухолях MC38, собранных у мышей, получавших обработку носителем (PBS), или получавших обработку антителом к PD-1 (PD-1). p=0,045 в сравнении групп, получавших обработку носителем и антителом к PD-1.

На фиг. 2A показано, что поверхностная экспрессия CD137 (гСИФ) повышена на TIL в опухолях карциномы толстой кишки MC38 у животных, получавших обработку антителами к PD-1 (группа PD-1), по сравнению с группой, получавшей обработку носителем (PBS). p=0,005 в сравнении групп, получавших обработку носителем и антителом к PD-1. Каждая точка представляет одну мышь. Данные представляют по меньшей мере 2 независимых эксперимента.

На фиг. 2B показано, что относительная частота клеток CD137 CD8+ из всех TIL CD8+ повышается в опухолях карциномы толстой кишки MC38 у животных, получавших обработку антителами к PD-1 (группа PD-1), по сравнению с группой, получавшей обработку носителем (PBS). p=0,0475 в сравнении групп, получавших обработку носителем и антителом к PD-1. Каждая точка представляет одну мышь. Данные представляют по меньшей мере 2 независимых эксперимента.

На фиг. 3A показано, что поверхностная экспрессия OX40 (гСИФ) повышена на TIL в опухолях карциномы толстой кишки MC38 у животных, получавших обработку антителами к PD-1 (группа PD-1), по сравнению с группой, получавшей обработку носителем (PBS). p=0,0013 в сравнении групп, получавших обработку носителем и антителом к PD-1. Каждая точка представляет одну мышь. Данные представляют по меньшей мере 2 независимых эксперимента.

На фиг. 3B показано, что относительная частота клеток OX40 CD8+ из всех TIL CD8+ повышается в опухолях карциномы толстой кишки MC38 у животных, получавших обработку антителами к PD-1 (группа PD-1), по сравнению с группой, получавшей обработку носителем (PBS). p=0,03 в сравнении групп, получавших обработку носителем и антителом к PD-1. Каждая точка представляет одну мышь. Данные представляют по меньшей мере 2 независимых эксперимента.

- 2 045238

На фиг. 4A показано, что поверхностная экспрессия GITR (гСИФ) повышена на TIL в опухолях карциномы толстой кишки MC38 у животных, получавших обработку антителами к PD-1 (группа PD-1), по сравнению с группой, получавшей обработку носителем (PBS). p=0,0004 в сравнении групп, получавших обработку носителем и антителом к PD-1. Каждая точка представляет одну мышь. Данные представляют по меньшей мере 2 независимых эксперимента.

На фиг. 4B показано, что относительная частота клеток GITR CD8+ из всех TIL CD8+ повышается в опухолях карциномы толстой кишки MC38 у животных, получавших обработку антителами к PD-1 (группа PD-1), по сравнению с группой, получавшей обработку носителем (PBS). p=0,0015 в сравнении групп, получавших обработку носителем и антителом к PD-1. Каждая точка представляет одну мышь. Данные представляют по меньшей мере 2 независимых эксперимента.

На фиг. 5 показано, что обработка антителами к TIM-3 после введения антител к PD-1 дополнительно индуцирует антиген-специфический иммунный ответ. Антитела испытывали в анализе ЦМВ с применением PBMC от ЦМВ-положительных доноров, у которых были индуцированы антигенспецифические иммунные ответы на пулы пептидов pp65. Клетки обрабатывали в течение 5 дней антителом PD1B244 к PD-1, повторно стимулировали и обрабатывали в течение 24 часов антителом TM3B105 к TIM-3. Иммунный ответ определяли посредством измерения повышений секреции ИФН-γ. Изо-IgG2: IgG2сигма - изотипический контроль. ЦМВ - проба, обработанная пептидами цитомегаловируса p65 в отсутствие антител.

На фиг. 6 показаны последовательности HCDR1 выбранных антител к PD-1 и родовую последовательность HCDR1.

На фиг. 7 показаны последовательности HCDR2 выбранных антител к PD-1 и родовую последовательность HCDR2.

На фиг. 8 показаны последовательности HCDR3 выбранных антител к PD-1 и первая родовая последовательность HCDR3.

На фиг. 9 показаны последовательности HCDR3 выбранных антител к PD-1 и вторая родовая последовательность HCDR3.

На фиг. 10 показаны последовательности LCDR1 выбранных антител к PD-1 и родовая последовательность LCDR1.

На фиг. 11 показаны последовательности LCDR2 выбранных антител к PD-1 и родовая последовательность LCDR2.

На фиг. 12 показаны последовательности LCDR3 выбранных антител к PD-1 и родовая последовательность LCDR3.

На фиг. 13 показаны последовательности HCDR1 выбранных антител к TIM-3 и родовая последовательность HCDR1. Родовую последовательность определяли путем построения молекулярных моделей для всех Fv (пары VH/VL) в MOE (CCG, г. Монреаль, Канада) с помощью протокола по умолчанию для моделирования антител. Для CDR, имеющих разные длины, эти структурные модели были выровнены на основе структурно консервативных областей, и были идентифицированы структурно эквивалентные положения CDR.

На фиг. 14 показаны последовательности HCDR2 выбранных антител к TIM-3 и родовая последовательность HCDR2. Родовую последовательность HCDR2 получали так, как описано для фиг. 10.

На фиг. 15 показаны последовательности HCDR3 выбранных антител к TIM-3 и первая родовая последовательность HCDR3. Родовую последовательность HCDR3 получали так, как описано для фиг. 10.

На фиг. 16 показаны последовательности LCDR1 выбранных антител к TIM-3 и родовая последовательность LCDR1. Родовую последовательность LCDR1 получали так, как описано для фиг. 10.

На фиг. 17 показаны последовательности LCDR2 выбранных антител к TIM-3 и родовая последовательность LCDR2. Родовую последовательность LCDR2 получали так, как описано для фиг. 10.

На фиг. 18 показаны последовательности LCDR3 выбранных антител к TIM-3 и родовую последовательность LCDR3. Родовую последовательность LCDR3 получали так, как описано для фиг. 10.

На фиг. 19A показано, что поверхностная экспрессия TIGIT (гСИФ) повышена на TIL в опухолях карциномы толстой кишки MC38 у животных, получавших обработку антителами к TIM-3 (группа TIM3), по сравнению с группе, получавшей обработку носителем (PBS). p=0,0181 в сравнении групп, получавших обработку носителем и антителом к TIM-3. Каждая точка представляет одну мышь. Данные представляют по меньшей мере 2 независимых эксперимента.

На фиг. 19B показано, что относительная частота клеток TIGIT+ CD8 из всех TIL CD8+ повышается в опухолях карциномы толстой кишки MC38 у животных, получавших обработку антителами к TIM-3 (группа TIM-3), по сравнению с группой, получавшей обработку носителем (PBS). p=0,0475 в сравнении групп, получавших обработку носителем и антителом к TIM-3. Каждая точка представляет одну мышь. Данные представляют по меньшей мере 2 независимых эксперимента.

На фиг. 20A показано, что поверхностная экспрессия TIGIT (гСИФ) повышена на TIL в опухолях карциномы толстой кишки CT26 у животных, получавших обработку антителами к TIM-3 (группа TIM3), по сравнению с группой, получавшей обработку носителем (PBS). p<0,001 в сравнении групп, получавших обработку носителем и антителом к TIM-3. Каждая точка представляет одну мышь. Данные

- 3 045238 представляют по меньшей мере 2 независимых эксперимента.

На фиг. 20B показано, что относительная частота клеток TIGIT+ CD8 из всех TIL CD8+ повышается в опухолях карциномы толстой кишки CT26 у животных, получавших обработку антителами к TIM-3 (группа TIM-3), по сравнению с группой, получавшей обработку носителем (PBS). p=0,0105 в сравнении групп, получавших обработку носителем и антителом к TIM-3. Каждая точка представляет одну мышь. Данные представляют по меньшей мере 2 независимых эксперимента.

На фиг. 21 показано усиление экспрессии TIM-3 на периферийных T-клетках в PBMC пациентов с меланомой после стимуляции ранее не получавших лечения пациентов с меланомой пулами пептидов антигенов меланомы (NY ESO, gp100, MART-1) в присутствии или в отсутствие антител PD-1 или к TIM3, блокирующих функцию. Экспрессию TIM-3 определяли с помощью проточной цитометрии на повторно стимулированных клетках в день 6.

На фиг. 22A показано, что обработка TM3B403 повышает частоту активированных NK-клеток в PBMC человека, стимулированных IL-2. IgG2s - изотипический контроль. Активацию NK-клеток оценивали как процентную долю (%) клеток, экспрессирующих CD69 в стимулированных PBMC.

На фиг. 22B показано, что обработка TM3B403 повышает частоту активированных NK-клеток в PBMC человека, стимулированных IL-2. IgG2s - изотипический контроль. Активацию NK-клеток оценивали как процентную долю (%) клеток, экспрессирующих CD25 в стимулированных PBMC.

Подробное описание изобретения

Все публикации, включая, без ограничений, патенты и заявки на патенты, цитируемые в настоящем описании, включены в настоящий документ путем ссылки так, как если бы они были полностью изложены в настоящем документе.

Следует понимать, что применяемые в настоящем документе термины предназначены только для цели описания конкретных вариантов осуществления и не имеют ограничительного характера. Все применяемые в настоящем документе технические и научные термины, если не указано иное, имеют общепринятое значение, понятное обычному специалисту в области, к которой относится изобретение.

В настоящем документе описаны примеры материалов и способов, хотя при практическом осуществлении для проверки настоящего изобретения могут применяться любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе. При описании и изложении формулы настоящего изобретения будут применяться следующие термины.

В настоящем описании и приложенной формуле изобретения формы единственного числа включают обозначения множественного числа, если из содержания текста четко не следует иное. Так, например, ссылка на клетку включает в себя комбинацию двух или более клеток и т. п.

Термины специфическое связывание, или специфически связывает, или связывает относятся к связыванию антитела с антигеном или эпитопом в пределах антигена с большей аффинностью, чем с другими антигенами. Как правило, антитело связывается с антигеном или эпитопом в пределах антигена с равновесной константой диссоциации (KD) около 1x10-8 М или менее, например, около 1x10-9 М или менее, около 1x10-10 М или менее, около 1x10-11 М или менее или около 1x10-12 М или менее, как правило, с KD, которая по меньшей мере в сто раз ниже его KD связывания с неспецифическим антигеном (например, БСА, казеином). Константу диссоциации можно измерять с помощью стандартных процедур. Однако антитела, которые специфически связываются с антигеном или эпитопом в пределах антигена, могут иметь перекрестную реактивность с другими родственными антигенами, например, с таким же антигеном других биологических видов (гомологов), таких как человек или обезьяна, например, Macaca fascicularis (яванский макак, макак), Pan troglodytes (шимпанзе) или Callithrix jacchus (обыкновенная игрунка, игрунка). Моноспецифическое антитело специфически связывает один антиген или один эпитоп, а биспецифическое антитело специфически связывает два разных антигена или два разных эпитопа.

Термин антитела подразумевается в широком значении и включает в себя молекулы иммуноглобулинов, включая моноклональные антитела, в том числе мышиные, человеческие, гуманизированные и химерные моноклональные антитела, антигенсвязывающие фрагменты, биспецифические или мультиспецифические антитела, димерные, тетрамерные или мультимерные антитела, одноцепочечные антитела, доменные антитела и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая содержит антигенсвязывающий сайт требуемой специфичности. Полноразмерные антитела состоят из двух тяжелых (H) цепей и двух легких (L) цепей, взаимно соединенных дисульфидными связями, а также из их мультимеров (например, IgM). Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области тяжелой цепи (состоящей из доменов CH1, шарнирной области CH2 и CH3). Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области легкой цепи (CL). Области VH и VL можно дополнительно подразделить на области гипервариабельности, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR), между которыми расположены каркасные области (FR). Каждая область VH и VL состоит из трех CDR и четырех сегментов FR, размещенных в направлении от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4.

Области, определяющие комплементарность (CDR) представляют собой антигенсвязывающие

- 4 045238 сайты в антителе. CDR можно определять с помощью различных терминов: (i) Области, определяющие комплементарность (CDR), три в VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3) и три в VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3), основаны на вариабельности последовательности (Wu and Kabat (1970) J Exp Med 132:211-50; Kabat et al Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). (ii) Термин гипервариабельные области, HVR или HV, три в VH (H1, H2, H3) и три в VL (L1, L2, L3), относится к областям вариабельных доменов антитела, которые являются гипервариабельными по структуре согласно определению Chothia and Lesk (Chothia and Lesk (1987) Mol Biol 196:901-17). В международной базе данных ImMunoGeneTics (IMGT) (http://www_imgt_org) представлены стандартизированная нумерация и определение антигенсвязывающих сайтов. Соответствие между определениями CDR, HV и IMGT описано в публикации Lefranc et al., (2003) Dev Comparat Immunol 27:55-77. Термины CDR, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 в настоящем документе включают в себя CDR, определенные любым из способов, описанных выше, по Kabat, Chothia или IMGT, если в описании явным образом не указано иное.

В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена тяжелой цепи иммуноглобулины могут относиться к пяти основным классам - IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. IgA и IgG дополнительно подразделяются на изотипы IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Легкие цепи антител любых видов позвоночных на основании аминокислотных последовательностей их константных доменов можно отнести к одному из двух четко отличающихся типов, а именно каппа (к) и лямбда (λ).

Термины фрагменты антигена или антигенсвязывающий участок относятся к части молекулы иммуноглобулина, которая сохраняет антигенсвязывающие свойства исходного полноразмерного антитела. Примерами антигенсвязывающих участков являются определяющие комплементарность области тяжелой цепи (HCDR) 1, 2 и 3, определяющие комплементарность области легкой цепи (LCDR) 1, 2 и 3, вариабельная область тяжелой цепи (VH), вариабельная область легкой цепи (VL), фрагменты Fab, F(ab')2, Fd и Fv, a также доменные антитела (dAb), состоящие из одного домена либо VH, либо VL. Домены VH и VL могут быть связаны вместе посредством синтетического линкера с образованием различных типов конфигураций одноцепочечных антител, в которых домены VH/VL могут объединяться в пару внутримолекулярно или межмолекулярно в тех случаях, когда домены VH и VL экспрессируются отдельными одноцепочечными конструктами антител с образованием моновалентного антигенсвязывающего сайта, такими как одноцепочечный Fv (scFv) или диатело; они описаны, например, в международных патентных публикациях № WO1998/44001, WO1988/01649, WO1994/13804 и WO1992/01047.

Термин моноклональное антитело относится к популяции антител с одинаковым аминокислотным составом в каждой тяжелой и каждой легкой цепи за исключением возможных известных изменений, таких как удаление C-концевого лизина из тяжелой цепи антитела. Моноклональные антитела, как правило, связываются с одним антигенным эпитопом за исключением мультиспецифических моноклональных антител, которые связываются с двумя или более разными антигенами или эпитопами. Биспецифические моноклональные антитела связываются с двумя разными антигенными эпитопами. В пределах популяции антител моноклональные антитела могут иметь гетерогенное гликозилирование. Моноклональные антитела могут быть моноспецифическими или мультиспецифическими, а также моновалентными, двухвалентными или мультивалентными. Термин моноклональное антитело, такое как биспецифическое антитело или триспецифическое антитело, включен в понятие мультиспецифического антитела.

Термин выделенное антитело относится к антителу или фрагменту антитела, которое по существу не содержит других антител, имеющих другие значения антигенной специфичности (например, выделенное антитело, специфически связывающее PD-1, по существу не содержит антител, специфически связывающих антигены, отличные от PD-1). Выделенное антитело, специфически связывающее TIM-3, по существу не содержит антител, специфически связывающих антигены, отличные от TIM-3. В случае биспецифических антител PD-1/TIM-3 биспецифическое антитело специфически связывает как PD-1, так и TIM-3 и по существу не содержит антител, специфически связывающих антигены, отличные от PD-1 и TIM-3. Термин выделенное антитело охватывает антитела, выделенные так, что они имеют более высокую степень чистоты, такие как антитела, являющиеся чистыми на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%.

Термин гуманизированные антитела относится к антителам, в которых по меньшей мере один CDR получен из биологического вида, отличного от человека, а каркасы вариабельной области получены из последовательностей человеческого иммуноглобулина. Гуманизированные антитела могут включать в себя намеренно встроенные мутации в каркасных областях, так что каркас может не быть точной копией экспрессированного человеческого иммуноглобулина или последовательностей генов зародышевой линии.

Термин человеческое антитело относится к антителу, имеющему вариабельные области тяжелой и легкой цепей, в которых как каркасные области, так и все 6 CDR получены из последовательностей человеческого происхождения. Если антитело содержит константную область или часть константной области, то константная область также получена из последовательностей человеческого происхождения.

Человеческое антитело содержит вариабельные области тяжелой или легкой цепи, которые полу

- 5 045238 чены из последовательностей человеческого происхождения, если вариабельные области антитела получены из системы, в которой применяется человеческий иммуноглобулин зародышевого типа или перестроенные гены иммуноглобулина. Такими примерами систем являются библиотеки генов человеческих иммуноглобулинов, отображаемые на фаге, и трансгенные животные, отличные от человека, такие как мыши или крысы, несущие локусы человеческих иммуноглобулинов, как описано в настоящем документе. Человеческое антитело может содержать аминокислотные отличия по сравнению с иммуноглобулином зародышевой линии человека или перестроенными генами иммуноглобулинов, обусловленные, например, встречающимися в естественных условиях соматическими мутациями или намеренным встраиванием замен в каркас или антигенсвязывающий сайт, или оба варианта. Как правило, человеческое антитело по аминокислотной последовательности по меньшей мере на около 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентично аминокислотной последовательности, кодируемой генами иммуноглобулина человеческой зародышевой линии или перестроенными генами иммуноглобулина. В некоторых случаях человеческое антитело может содержать консенсусные каркасные последовательности, полученные в результате анализов каркасных последовательностей человека, например, как описано в Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296:5786, или синтетическую HCDR3, включенную в библиотеки генов иммуноглобулинов человека, отображаемых на фаге, например, как описано в публикации Shi et al., (2010) J Mol Biol 397:385-96 и международной патентной публикации № WO2009/085462.

Человеческие антитела, полученные из последовательностей иммуноглобулинов человека, могут быть получены с помощью таких систем, как фаговый дисплей, включая синтетические CDR и/или синтетические каркасы, или могут быть подвергнуты мутагенезу in vitro для улучшения свойств антитела, что позволяет получать антитела, не экспрессирующиеся зародышевой линией человека in vivo .

Термин рекомбинантный относится к антителам и другим белкам, которые приготовлены, экспрессированы, созданы или выделены рекомбинантными средствами.

Термин эпитоп относится к части антигена, с которым специфически связывается антитело. Как правило, эпитопы состоят из химически активных (таких как полярные, неполярные или гидрофобные) поверхностных группировок фрагментов, таких как боковые цепи аминокислот или полисахаридов, и могут иметь конкретные характеристики трехмерной структуры, а также конкретные характеристики заряда. Эпитоп может состоять из непрерывных и/или прерывистых аминокислот, образующих конформационное пространственное звено. В случае прерывистого эпитопа аминокислоты из разных участков линейной последовательности антигена подходят близко друг к другу в трехмерном пространстве за счет сворачивания молекулы белка. Эпитоп антитела зависит от методологии, применяемой для выявления эпитопа.

Термин мультиспецифический относится к антителу, которое специфически связывает по меньшей мере два разных антигена или два разных эпитопа в пределах антигенов, например, три, четыре или пять разных антигенов или эпитопов.

Термин биспецифический относится к антителу, которое специфически связывает два разных антигена или два разных эпитопа в пределах одного антигена. Биспецифическое антитело может иметь перекрестную реактивность с другими родственными антигенами, например, таким же антигеном от других видов (гомологов), таких как человек или обезьяна, например, Macaca fascicularis (яванский макак, крабоед), Pan troglodytes (шимпанзе), Callithrix jacchus (игрунка обыкновенная, мармозет), или может связывать эпитоп, который имеется в двух или более разных антигенах.

Термин вариант относится к полипептиду или полинуклеотиду, который отличается от эталонного полипептида или эталонного полинуклеотида одной или более модификациями, например, заменами, вставками или делециями.

Термин вектор относится к полинуклеотиду, который способен к удвоению внутри биологической системы или который может быть перемещен между такими системами. Полинуклеотиды-векторы, как правило, содержат элементы, такие как точки начала репликации, сигнал полиаденилирования или селективные маркеры, функция которых заключается в том, чтобы способствовать удвоению или сохранению этих полинуклеотидов в биологической системе. Примеры таких биологических систем могут включать в себя клетку, вирус, животное, растение и реконструированные биологические системы, в которых используются биологические компоненты, способные к удвоению вектора. Содержащий вектор полинуклеотид может представлять собой молекулы ДНК или РНК или их гибрид.

Термин экспрессионный вектор относится к вектору, который можно использовать в биологической системе или в реконструированной биологической системе для направления трансляции полипептида, кодируемого полинуклеотидной последовательностью, присутствующей в экспрессионном векторе.

Термин полинуклеотид относится к синтетической молекуле, содержащей цепь нуклеотидов, ковалентно связанных через сахарофосфатную основную цепь или другую эквивалентную ковалентную химическую структуру. кДНК является типичным примером полинуклеотида.

Термины полипептид или белок относятся к молекуле, которая содержит по меньшей мере два аминокислотных остатка, связанных пептидной связью с образованием полипептида. Малые полипептиды, содержащие менее 50 аминокислот, могут называться пептидами.

- 6 045238

PD-1 относится к человеческому белку 1 запрограммированной гибели клеток (PD-1). PD-1 также известен как CD279 или PDCD1. Аминокислотная последовательность зрелого человеческого PD-1 (без сигнальной последовательности) показана в последовательности SEQ ID NO: 1. Внеклеточный домен охватывает остатки 1-150, трансмембранный домен охватывает остатки 151-171, а цитоплазматический домен охватывает остатки 172-268 в последовательности SEQ ID NO: 1. В тексте описания внеклеточный домен человеческого PD-1 huPD1-ECD относится к белку, имеющему аминокислотную последовательность из остатков 1-149 в последовательности SEQ ID NO: 1 и показанному в последовательности SEQ ID NO: 2. PD-1 в описании относится к зрелому человеческому PD-1, если явно не указано иное.

TIM-3 относится к клеточному рецептору 2 вируса гепатита A человека, также называемому HAVCR2. Аминокислотная последовательность зрелого человеческого TIM-3 (без сигнальной последовательности) показана в последовательности SEQ ID NO: 138. Внеклеточный домен охватывает остатки 1-181, трансмембранный домен охватывает остатки 182-202, а цитоплазматический домен охватывает остатки 203-280 в последовательности SEQ ID NO: 138. В тексте описания внеклеточный домен человеческого TIM-3 huTIM-3-ECD относится к белку, имеющему аминокислотную последовательность из остатков 1-179 в последовательности SEQ ID NO: 138 и показанному в последовательности SEQ ID NO: 89. TIM-3 в описании относится к зрелому человеческому TIM-3, если явно не указано иное.

Термин в комбинации с означает, что два или более терапевтических средства вместе вводят субъекту в смеси, одновременно в виде отдельных агентов или последовательно в виде отдельных агентов в любом порядке.

Термины сверхэкспрессировать, сверхэкспрессированный и сверхэкспрессия применяются взаимозаменяемо и относятся к пробе, такой как раковая клетка, злокачественная клетка или раковая ткань, которая имеет измеримо более высокие уровни PD-1, TIM-3, PD-L1, PD-L2 или лиганда TIM-3 по сравнению с эталонной пробой. Сверхэкспрессия может быть вызвана амплификацией генов или повышенной транскрипцией или трансляцией. Экспрессию и сверхэкспрессию белка в пробе можно измерять с помощью известных анализов, например, твердофазного ИФА, иммунофлуоресценции, проточной цитометрии или радиоиммунного анализа на живых или лизированных клетках. Экспрессию и сверхэкспрессию полинуклеотида в пробе можно измерять, например, с помощью флуоресцентной гибридизации in situ, саузерн-блоттинга или методик ПЦР. Белок или полинуклеотид сверхэкспрессирован, когда уровень белка или полинуклеотида в пробе по меньшей мере в 1,5 раза выше или статистически значим по сравнению с эталонной пробой. Методика выбора эталонной пробы известна.

Термин проба относится к сбору аналогичных текучих сред, клеток или тканей, выделенных из организма субъекта, а также к текучим средам, клеткам или тканям, находящимся внутри субъекта. Примерами проб являются биологические текучие среды, такие как кровь, сыворотка и серозные текучие среды, плазма, лимфа, моча, слюна, кистозная текучая среда, слезы, кал, мокрота, слизистые выделения секреторных тканей и органов, влагалищные выделения, асцитные жидкости, такие как связанные с несолидными опухолями, текучие среды в плевре, перикарде, брюшине, брюшной и других полостях тела, текучие среды, собранные посредством смыва из бронхов, жидкие растворы, контактировавшие с субъектом или биологическим источником, например, среда для культуры клеток и органов, включая кондиционированную среду клеток и органов, промывные жидкости и т. п., биоптаты тканей, аспираты, взятый тонкой иглой, или ткань опухоли после хирургической резекции.

Термин раковая клетка или опухолевая клетка относится к раковой, предраковой или трансформированной клетке, in vivo, ex vivo или в культуре тканей, которая имеет спонтанные или индуцированные фенотипические изменения. Эти изменения не обязательно затрагивают поступление нового генетического материала. Хотя трансформация может быть вызвана инфекцией трансформирующим вирусом и встраиванием новой геномной нуклеиновой кислоты, поглощением экзогенной нуклеиновой кислоты или она также может возникать спонтанно или после воздействия канцерогена, в результате чего происходит мутация эндогенного гена. Трансформация/рак проявляются в морфологических изменениях, иммортализации клеток, нарушении контроля роста, образовании очагов, пролиферации, злокачественности, модулировании уровней маркера, специфичных для опухоли, инвазивности, росте опухоли у приемлемых животных-хозяев, таких как бестимусные мыши и т. п., in vitro, in vivo и ex vivo (Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994)).

Термин около означает в пределах приемлемого диапазона ошибки для конкретного значения, определенного обычным специалистом в данной области, причем ошибка отчасти зависит от того, каким образом было измерено или определено значение, т.е. от ограничений системы измерения. Если в примерах или в других разделах описания в контексте конкретного анализа, результата или варианта осуществления явным образом не указано иное, термин около означает в пределах одного стандартного отклонения в соответствии с практикой, принятой в данной области, или в диапазоне до 5%, в зависимости от того, что больше.

Термины биспецифическое антитело PD-1/TIM-3, антитело PD-1/TIM-3, биспецифическое антитело к PD-1/TIM-3 или антитело к PD-1/TIM-3 относятся к молекуле, содержащей по меньшей мере один связывающий домен, специфически связывающий PD-1, и по меньшей мере один связывающий домен, специфически связывающий TIM-3. Домены, специфически связывающие PD-1 и TIM-3, обычно

- 7 045238 представляют собой пары VH/VL. Биспецифическое антитело к PD-1 или TIM-3 может быть моновалентным с точки зрения его связывания с PD-1 или TIM-3.

Термин валентный относится к наличию в молекуле установленного числа сайтов связывания, специфичных для антигена. Таким образом, термины моновалентный, двухвалентный, четырехвалентный и шестивалентный относятся к наличию в молекуле одного, двух, четырех и шести сайтов связывания соответственно, специфичных для антигена.

Термин специфическая к антигену T-клетка CD4+ или CD8+ относится к T-клетке CD4+ или CD8+, активированной специфическим антигеном или его иммуностимуляторным эпитопом.

Термин CD137 (также называемый членом 9 надсемейства рецепторов фактора некроза опухоли TNFRSF9, 4-1BBL) относится к молекуле CD137 человека, имеющей аминокислотную последовательность, показанную в последовательности SEQ ID NO: 281.

SEQ ID NO: 281

MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQ

RTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFG TFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDWCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQI ISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSWKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEG GCEL

Термин TIGIT (также называемый иммунорецептором T-клеток с доменами Ig и ITIM) относится к молекуле TIGIT человека, имеющей аминокислотную последовательность, показанную в последовательности SEQ ID NO: 301.

SEQ ID NO: 301

MMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPS FKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPLLG AMAATLWICTAVIVWALTRKKKALRIHSVEGDLRRKSAGQEEWSPSAPSPPGSCVQAEAAPA GLCGEQRGEDCAELHDYFNVLSYRSLGNCSFFTETG

Термин агонист относится к молекуле, которая при связывании с клеточным белком индуцирует по меньшей мере одну реакцию или тип активности, индуцируемые естественным лигандом белка. Молекула является агонистом, если происходит индукция в по меньшей мере одной реакции или типе активности на по меньшей мере около 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% больше, чем в по меньшей мере одной реакции или типе активности в отсутствие агониста (например, отрицательный контроль), или когда индукция статистически значима по сравнению с индукцией в отсутствие агониста. Агонист может представлять собой антитело, растворимый лиганд или малую молекулу. Примером агониста является антитело-агонист, которое специфически связывает активирующую T-клетки молекулу.

Термин антагонист относится к молекуле, которая при связывании с клеточным белком подавляет по меньшей мере одну реакцию или тип активности, индуцируемые естественным лигандом белка. Молекула является антагонистом, если происходит подавление по меньшей мере одной реакции или типа активности на по меньшей мере около 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% по сравнению с подавлением по меньшей мере одной реакции или типа активности в отсутствие антагониста (например, отрицательный контроль) или когда подавление является статистически значимым по сравнению с подавлением в отсутствие антагониста. Антагонистом может быть антитело, растворимый лиганд, малая молекула, ДНК или РНК, такая как миРНК. Примерами антагонистов являются антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, биспецифическое антитело-антагонист PD-1/TIM-3 или антитело-антагонист, специфически связывающее ингибирующую T-клетки молекулу. Типичную реакцию или тип активности, который индуцируется связыванием PD-1 со своим рецептором PD-L1 или PD-L2, может представлять собой снижение пролиферации антигенспецифических клеток CD4+ или CD8+ или снижение продукции интерферона-γ (ИФН-γ) T-клетками, что приводит к подавлению иммунных ответов против, например, опухоли. Типичная реакция или тип активности, которые индуцируются, например, связыванием TIM-3 со своим рецептором, таким как галектин-9, может представлять собой снижение пролиферации антигенспецифических клеток CD4+ или CD8+, снижение продукции ИФН-γ T-клетками или снижение поверхностной экспрессии CD137 на клетках CD4+ или CD8+, что приводит к подавлению иммунных ответов против, например, опухоли. Аналогичным образом типичная реакция или тип активности, которые индуцированы молекулой, ингибирующей T-клетки, представляет собой иммуносупрессию. Таким образом, антитело-антагонист PD-1, специфически связывающее PD-1, антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, биспецифическое антитело-антагонист PD-1/TIM-3 или антитело-антагонист, специфически связывающее ингибирующую T-клетки молекулу, индуцирует иммунные ответы посредством ингибирования ингибиторных путей.

Термин субъект включает в себя любого человека или не относящегося к человеку животного.

- 8 045238

Термин не относящееся к человеку животное включает в себя всех позвоночных, например, млекопитающих и не млекопитающих, таких как приматы, овцы, собаки, кошки, лошади, коровы, цыплята, амфибии, рептилии и т. д. Если не указано иное, термины пациент или субъект применяются взаимозаменяемо.

Нумерация аминокислотных остатков в константной области антитела в тексте описания приведена в соответствии с каталогом ЕС, как описано в публикации Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), если явно не указано иное.

В настоящем документе применяются традиционные одно- и трехбуквенные коды обозначения аминокислот, как показано в табл. 1.

Таблица 1

Аминокислота	Трехбуквенный код	Однобуквенный код
Аланин	Ala	A
Аргинин	Arg	R
Аспарагин	As η	N
Аспартат	Asp	D
Цистеин	Cys	C
Глутамат	Gln	E
Глутамин	Glu	Q
Глицин	Gly	G
Гистидин	His	H
Изолейцин	lie	I
Лизин	Lys	к
Метионин	Met	M
Фенилаланин	Phe	F
Пролин	Pro	P
Серин	Ser	S
Треонин	Thr	T
Триптофан	Trp	W
Тирозин	Tyr	Y
Валин	Vai	V

Композиции настоящего изобретения.

В настоящем изобретении предложены антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, и биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3. В настоящем изобретении предложены полипептиды и полинуклеотиды, кодирующие антитела по изобретению, или комплементарные к ним нуклеиновые кислоты, векторы, клетки-хозяева и способы их получения и применения.

Антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1.

PD-1 после взаимодействия с лигандом подавляет функции Т-клеток за счет множества механизмов (Pauken & Wherry (2015) Trends in Immunology 36(4):265-276). Взаимодействие c PD-1 непосредственно ингибирует сигнализацию рецептора Т-клеток (TCR) посредством совмещения с TCR и последующей индукции дефосфорилирования проксимальных сигнальных молекул TCR, ингибирования пути Ras/MEK/ERK, ведущего к ингибированию продвижения клеточного цикла и пролиферации Т-клеток, ингибированию роста и выживания клеток и перепрограммированию метаболизма Т-клеток за счет подавления пути PI3K/AKT, ведущего к усилению фактора транскрипции BATF и модуляции развития, поддержания и функции регуляторных Т-клеток. Также было выдвинуто предположение, что PD-1 повышает подвижность Т-клеток и ограничивает длительность взаимодействия между Т-клетками и клетками-мишенями, снижая таким образом степень активации Т-клеток (Honda et al., (2014) Immunity 40(2):235-47).

Опухоли встраивались в сигнальный путь PD-1 для понижающей регуляции функции Т-клеток в микросреде опухоли (ΤΜΈ) и во избежание иммунного разрушения. В условиях устойчивого антигена и воспаления в ТМЕ Т-клетки становятся истощенными или нефункциональными и постепенно теряют свою эффекторную функцию и способность к пролиферации. Истощенные Т-клетки экспрессируют высокие уровни PD-1, зачастую вместе с другими ингибиторными рецепторами, такими как TIM-3 или LAG-3 (Pauken & Wherry (2015) Trends in Immunology 36(4):265-276). Один из лигандов PD-1 -PD-L1 - в

-9045238 различных опухолях также усиливается. Экспрессия PD-L1 происходит на самих раковых клетках и/или инфильтрированных иммунных клетках, включая связанные с опухолью макрофаги, дендритные клетки, фибробласты и активированные T-клетки (Chen et al., 2012 Clin Cancer Res 18(24):6580-7). В таких условиях предполагается, что взаимодействие с PD-1 ограничивает противоопухолевые ответы T-клеток и ведет к уклонению от иммунитета. Недавние исследования показали, что более высокая частота и уровень экспрессии PD-1 наблюдаются на инфильтрированных лимфоцитах опухоли (TIL) во множественных солидных опухолей. Важно, что эти TIL PD-1+ функционально повреждены, о чем свидетельствует снижение пролиферативных и эффекторных функций (Pauken & Wherry; 2015, Trends in Immunology 36(4):265-276). Эти данные подтверждают гипотезу о том, что PD-1 опосредует иммуносупрессию в TME.

Истощение T-клеток в опухолях по меньшей мере частично обращается посредством блокады пути PD-1. Как было показано в ряде доклинических моделей опухолей, антитела к PD-1/PD-L1 усиливают функцию T-клеток и приводят к улучшению противоопухолевого иммунитета. Антитела PD-1/PD-L1 также продемонстрировали обнадеживающие клинические ответы при множестве солидных опухолей, при этом общая частота ответа (ORR) составила 20-40% при меланоме, 10-24% при немелкоклеточном раке легких (NSCLC), 12-31% при почечно-клеточной карциноме (RCC), 24-52% при раке мочевого пузыря и 20% при раке головы и шеи (Swaika et al., (2015) Mol Immunol 67 (2 Pt A):4-17).

В изобретении предложено выделенное антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащие определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1), HCDR2 и HCDR3 с SEQ ID NO: 82, 83 и 84 соответственно или с SEQ ID NO: 82, 83 и 85 соответственно.

В изобретении также предложено выделенное антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1), LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 86, 87 и 88 соответственно.

В изобретении также предложено выделенное антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с SEQ ID NO: 82, 83 и 84 соответственно и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 86, 87 и 88 соответственно.

В изобретении также предложено выделенное антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с SEQ ID NO: 82, 83 и 85 соответственно и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 86, 87 и 88 соответственно.

SEQ ID NO: 82, 83, 84, 85, 86, 87 и 88 представляют последовательности рода HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 аффинно-зрелых вариантов антител-антагонистов, специфически связывающих PD-1, имеющих аналогичные последовательности HCDR1, HCDR2, LCDR1, LCDR2 и LCDR3, и две аналогичные группы последовательностей HCDR3. Антитела в пределах рода связывают PD-1 с KD менее около 1x10-7 М, например, менее около 1x10-8 М, например, менее около 1x10-9 М или, например, менее около 1x10-10 М. Примерами таких антител являются антитела, имеющие последовательности аминокислот HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 антител PD1B114, PD1B149, PD1B160, PD1B162, PD1B164, PD1B11, PD1B183, PD1B184, PD1B185, PD1B187, PD1B71, PD1B177, PD1B70, PD1B175, PD1B194, PD1B195, PD1B196, PD1B197, PD1B198, PD1B199, PD1B200, PD1B201 и PD1B244, как описано в настоящем документе.

SEQ ID NO: 82

X1YX2IX3, где X1 представляет собой S или D;

X2 представляет собой V или A; и

X3 представляет собой H или S.

SEQ ID NO: 83

GIIPIX4X5TANYAQKFQG, где X4 представляет собой Y или F; и

X5 представляет собой G или D.

SEQ ID NO: 84

PGLAAAYDTGX6LDY, где X6 представляет собой N или S.

SEQ ID NO: 85

GX7X8X9X10TGX11LDY, где X7 представляет собой T или Y;

X8 представляет собой L или V;

X9 представляет собой D или R;

X10 представляет собой R или A; и

X11 представляет собой H или M.

SEQ ID NO: 86

RASQSVX12X13YLA,

- 10 045238 где X12 представляет собой S, R или D; и

X13 представляет собой S или N.

SEQ ID NO: 87

DASX14RAT, где X14 представляет собой N, D, Y, S или T.

SEQ ID NO: 88

QQRX15X16WPLT, где X15 представляет собой S, N, G, E, D, W или A; и

X16 представляет собой N, Y, E или A.

В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок имеют одно, два, три, четыре или пять из следующих свойств:

a) усиливает активацию специфичных к антигену T-клеток CD4 + или CD8+ дозозависимым образом, причем активацию измеряют с помощью анализа с антигеном цитомегаловируса (анализ ЦМВ), как описано в примере 1;

b) связывает PD-1 человека с равновесной константой диссоциации (KD) менее около 100 нМ, причем KD измеряют с помощью системы ProteOn XPR36 при +25°C;

c) связывает PD-1 человека с KD менее около 1 нМ, причем KD измеряют с помощью системы ProteOn XPR36 при +25°C;

d) связывает PD-1 яванского макака с KD менее около 100 нМ, причем KD измеряют с помощью системы ProteOn XPR36 при +25°C; или

e) связывает PD-1 яванского макака с KD менее около 1 нМ, причем KD измеряют с помощью системы ProteOn XPR36 при +25°C.

Примерами таких антител являются антитела PD-1 PD1B114, PD1B149, PD1B160, PD1B162, PD1B164, PD1B11, PD1B183, PD1B184, PD1B185, PD1B187, PD1B71, PD1B177, PD1B70, PD1B175, PD1B194, PD1B195, PD1B196, PD1B197, PD1B198, PD1B199, PD1B200, PD1B201 и PD1B244, как описано в настоящем документе.

В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок усиливает активацию специфичных к антигену T-клеток CD4+ или CD8+ дозозависимым образом, причем активацию измеряют с помощью анализа с антигеном цитомегаловируса (анализ ЦМВ), как описано в примере 1, а также связывает PD-1 человека с равновесной константой диссоциации (KD) менее около 100 нМ, причем KD измеряют с помощью системы ProteOn XPR36 при +25°C.

В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок усиливает активацию специфичных к антигену T-клеток CD4+ или CD8+ дозозависимым образом, причем активацию измеряют с помощью анализа с антигеном цитомегаловируса (анализ ЦМВ), как описано в примере 1, а также связывает PD-1 человека с равновесной константой диссоциации (KD) менее около 10 нМ, причем KD измеряют с помощью системы ProteOn XPR36 при +25°C.

В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок усиливает активацию специфичных к антигену T-клеток CD4+ или CD8+ дозозависимым образом, причем активацию измеряют с помощью анализа с антигеном цитомегаловируса (анализ ЦМВ), как описано в примере 1, а также связывает PD-1 яванского макака с равновесной константой диссоциации (KD) менее около 100 нМ, причем KD измеряют с помощью системы ProteOn XPR36 при +25°C.

В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок усиливает активацию специфичных к антигену T-клеток CD4+ или CD8+ дозозависимым образом, причем активацию измеряют с помощью анализа с антигеном цитомегаловируса (анализ ЦМВ), как описано в примере 1, а также связывает PD-1 яванского макака с равновесной константой диссоциации (KD) менее около 10 нМ, причем KD измеряют с помощью системы ProteOn XPR36 при +25°C.

Активацию специфичных к антигену T-клеток CD4+ или CD8+ можно оценивать посредством измерения усиления пролиферации T-клеток в анализе реакции смешанной культуры лимфоцитов (MLR), повышения секреции интерферона-γ (ИФН-γ) в анализе MLR, повышения секреции ФНО-α в анализе MLR, повышения секреции ИФН-γ в анализе с антигеном цитомегаловируса (анализ ЦМВ) или повышения секреции ФНО-α в анализе ЦМВ с помощью известных протоколов и так, как описано в примере 1. Антитела по изобретению усиливают активацию специфичных к антигену T-клеток CD4+ или CD8+, когда измеренная функциональность T-клеток повышается с помощью антител по изобретению дозозависимым образом.

Аффинность антитела к PD-1 человека или яванского макака можно определить экспериментально с помощью любого приемлемого способа. В таких способах могут использоваться приборы ProteOn

- 11 045238

XPR36, Biacore 3000 или KinExA, твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) или анализы конкурентного связывания, известные специалистам в данной области. Измеренное значение аффинности взаимодействия конкретного антитела/PD-1 может изменяться при измерении в разных условиях (например, осмолярность, pH). Таким образом, измерения аффинности и других параметров связывания (например, KD, Kon, Koff), как правило, проводятся в стандартизированных условиях и с использованием стандартизированного буферного раствора, такого как буферный раствор, описанный в настоящем документе. Специалистам в данной области будет понятно, что внутренняя ошибка измерений аффинности, например, с помощью Biacore 3000 или ProteOn (измеряемая как стандартное отклонение (СО)), как правило, может составлять 5-33% для измерений, проводимых в границах типичных пределов обнаружения. Следовательно, термин около в контексте KD отражает типичное стандартное отклонение в анализе. Например, типичное СО для KD, равной 1x10-9 М, составляет до ±0,33x10-9 М.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, содержащиеся в пределах вариабельной области тяжелой цепи (VH) последовательностей SEQ ID NO: 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 или 48, причем HCDR1, HCDR2 и HCDR3 определяются по Chothia, Kabat или IMGT.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок по изобретению содержат LCDR1, LCDR2 и LCDR3, содержащиеся в пределах вариабельной области легкой цепи (VL) последовательностей SEQ ID NO: 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 или 62, причем LCDR1, LCDR2 и LCDR определяются по Chothia, Kabat или IMGT.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок по изобретению содержат

HCDR1 с SEQ ID NO: 10, 11 или 12;

HCDR2 с SEQ ID NO: 13, 14 или 15; и

HCDR3 с SEQ ID NO: 16, 17, 18 или 19.

LCDR1 с SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23, 24 или 25;

LCDR2 с SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29 или 30; и

LCDR3 с SEQ ID NO: 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40.

HCDR1 с SEQ ID NO: 10, 11 или 12;

HCDR2 с SEQ ID NO: 13, 14 или 15;

HCDR3 с SEQ ID NO: 16, 17, 18 или 19;

LCDR1 с SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23, 24 или 25;

LCDR2 с SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29 или 30; и

LCDR3 с SEQ ID NO: 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок по изобретению содержат HCDR1, HCDR2 и HCDR3 последовательностей

SEQ ID NO

10, 13 и 16 соответственно;

10, 14 и 16 соответственно;

10, 13 и 17 соответственно;

10, 13 и 18 соответственно;

11, 15 и 18 соответственно;

10, 13 и 19 соответственно;

10, 14 и 17 соответственно; или

12, 13 и 19 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок по изобретению содержат LCDR1, LCDR2 и LCDR3 последовательностей

SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO

20, 26 и 31 соответственно;

21, 26 и 32 соответственно;

22, 27 и 33 соответственно;

22, 26 и 34 соответственно;

23, 28 и 35 соответственно;

20, 26 и 36 соответственно;

21, 27 и 37 соответственно;

23, 26 и 32 соответственно;

22, 26 и 32 соответственно;

24, 26 и 38 соответственно;

- 12 045238

SEQ ID NO: 20, 29 и 39 соответственно;

SEQ ID NO: 20, 30 и 32 соответственно;

SEQ ID NO: 25, 26 и 40 соответственно; или

SEQ ID NO: 24, 26 и 32 соответственно.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 14, 17, 23, 26 и 32 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок связывает PD-1 человека с равновесной константой диссоциации (KD) менее около 100 нМ, необязательно менее около 10 нМ, например менее около 1 нМ, например менее около 500 пМ, причем KD измеряют с помощью системы ProteOn XPR36 при +25°C.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок связывает PD-1 яванского макака с равновесной константой диссоциации (KD) менее около 100 нМ, необязательно менее около 10 нМ, например менее около 1 нМ, например менее около 500 пМ, причем KD измеряют с помощью системы ProteOn XPR36 при +25°C.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID NO: 56.

В некоторых вариантах осуществления VH и VL кодируются полинуклеотидными последовательностями с SEQ ID NO: 196 и 197 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело относится к изотипу IgG4, необязательно содержащему замену S228P по сравнению с IgG4 дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления антитело относится к изотипу IgG4/K, необязательно содержащему замену S228P по сравнению с IgG4 дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID NO: 56 и относится к изотипу IgG4, необязательно содержащему замену S228P по сравнению с IgG4 дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID NO: 56 и относится к изотипу IgG4/K, который содержит замену S228P по сравнению с IgG4 дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит тяжелую цепь (HC) с SEQ ID NO: 72 и легкую цепь (LC) с SEQ ID NO: 73.

В некоторых вариантах осуществления антитело относится к изотипу IgG2, необязательно содержащему замены V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S и P331S по сравнению с IgG2 дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления антитело относится к изотипу IgG2/K, необязательно содержащему замены V234a, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S и P331S по сравнению с IgG2 дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID NO: 56 и относится к изотипу IgG2/K, необязательно содержащему замены V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S и P331S по сравнению с IgG2 дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID NO: 56 и относится к изотипу IgG2/K, который содержит замены V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S и P331S по сравнению с IgG2 дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления антитело относится к изотипу IgG1.

В некоторых вариантах осуществления антитело относится к изотипу IgG3.

В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой биспецифическое антитело, такое как биспецифическое антитело PD-1/TIM-3.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении рака.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении солидной опухоли.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении меланомы.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении рака легкого.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении немелкоклеточного рака легкого (NSCLC).

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении плоскоклеточного NSCLC.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении неплоскоклеточного немелкоклеточного рака легкого (NSCLC).

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении аденокарциномы легкого.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении почечно-клеточной карциномы (RCC).

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении мезотелиомы.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении карциномы носоглотки (NPC).

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении колоректального рака.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении рака предстательной железы.

- 13 045238

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении устойчивого к кастрации рака предстательной железы.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении рака желудка.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении рака яичника.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении рака печени.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении рака поджелудочной железы.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении рака щитовидной железы.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении плоскоклеточного рака голо вы и шеи.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении карцином пищевода или желудочно-кишечного тракта.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении рака молочной железы.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении рака фаллопиевой трубы.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении рака головного мозга.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении рака уретры.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении эндометриоза.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении рака шейки матки.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении метастатического ракового поражения.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении гематологической злокачественной опухоли.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении неходжкинской лимфомы.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении хронического лимфоцитарного лейкоза.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении рака, в комбинации с антителом-антагонистом, специфически связывающим TIM-3.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении рака, в комбинации с антителом-антагонистом, специфически связывающим TIM-3 и содержащим VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении рака, в комбинации с антителом-антагонистом, специфически связывающим TIM-3 и содержащим VH с SEQ ID NO: 145 и VL с SEQ ID NO: 155.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении рака, в комбинации с антителом-антагонистом, специфически связывающим TIM-3 и содержащим VH с SEQ ID NO: 172 и VL с SEQ ID NO: 173.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении рака, такого как солидная опухоль, в комбинации с ингибитором FGFR.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении рака, такого как солидная опухоль, в комбинации с вакциной.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении рака, такого как солидная опухоль, в комбинации с антителом-агонистом, специфически связывающим GITR (SEQ ID NO: 271).

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении рака, такого как солидная опухоль, в комбинации с антителом-агонистом, специфически связывающим CD137 (SEQ ID NO: 281).

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении рака, такого как солидная опухоль, в комбинации с антителом-агонистом, специфически связывающим OX-40 (SEQ ID NO: 279).

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 66, 67, 68, 69, 70 и 71 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит VH с SEQ ID NO: 64 и VL с SEQ ID NO: 65.

В некоторых вариантах осуществления VH и VL кодируются полинуклеотидными последовательностями с SEQ ID NO: 198 и 199 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит VH с SEQ ID NO: 63 и VL с SEQ ID NO: 65.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок связывает PD-1 человека с равновесной константой диссоциации (KD) менее около 100 нМ, необязательно менее около 10 нМ, например менее около 1 нМ, например менее около 100 пМ, причем KD измеряют с помощью системы ProteOn XPR36 при +25°C.

В некоторых вариантах осуществления антитело относится к изотипу IgG4/K, необязательно содер- 14 045238 жащему замену S228P по сравнению с IgG4 дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит VH с SEQ ID NO: 64 и VL с SEQ ID NO:

и относится к изотипу IgG4, необязательно содержащему замену S228P по сравнению с IgG4 дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит VH с SEQ ID NO: 64 и VL с SEQ ID NO: 65 и относится к изотипу IgG4/K, который содержит замену S228P по сравнению с IgG4 дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит HC с SEQ ID NO: 74 и LC с SEQ ID NO: 75.

В некоторых вариантах осуществления антитело относится к изотипу IgG2/K, необязательно содержащему замену V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S и P331S по сравнению с IgG2 дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит VH с SEQ ID NO: 64 и VL с SEQ ID NO: 65 и относится к изотипу IgG2/K необязательно содержащему замены V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S и P331S по сравнению с IgG2 дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит VH с SEQ ID NO: 64 и VL с SEQ ID NO: 65 и относится к изотипу IgG2/K, который содержит замены V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S и P331S по сравнению с IgG2 дикого типа.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении плоскоклеточного рака головы и шеи.

- 15 045238

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 12, 13, 19, 24, 26 и 38 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит VH с SEQ ID NO: 47 и VL с SEQ ID NO: 58.

В некоторых вариантах осуществления антитело относится к изотипу IgG2.

В некоторых вариантах осуществления антитело относится к изотипу IgG2, который содержит замены V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S и P331S по сравнению с IgG2 дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления антитело относится к изотипу IgG4.

В некоторых вариантах осуществления антитело относится к изотипу IgG4, который содержит замену S228P по сравнению с IgG4 дикого типа.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 11, 15, 18, 20, 30 и 32 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит VH с SEQ ID NO: 45 и VL с SEQ ID NO: 60.

В некоторых вариантах осуществления VH и VL кодируются полинуклеотидными последовательностями с SEQ ID NO: 202 и 203 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит HC с SEQ ID NO: 76 и LC с SEQ ID NO: 77.

- 16 045238

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ

ID NO: 10, 13, 16, 20, 26 и 31 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит

VH с SEQ ID NO: 41 и VL с SEQ ID NO: 49.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит HC с SEQ ID NO: 212 и LC с SEQ ID NO: 213.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 13, 16, 21, 26 и 32 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит VH с SEQ ID NO: 41 и VL с SEQ ID NO: 50.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит HC с SEQ ID NO: 214 и LC с SEQ ID NO: 215.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 14, 16, 22, 27 и 33 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит VH с SEQ ID NO: 42 и VL с SEQ ID NO: 51.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит HC с SEQ ID NO: 216 и LC с SEQ ID NO: 217.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 14, 16, 22, 26 и 34 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит VH с SEQ ID NO: 42 и VL с SEQ ID NO: 52.

- 17 045238

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит HC с SEQ ID NO: 218 и LC с SEQ ID NO: 219.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 14, 16, 23, 28 и 35 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит VH с SEQ ID NO: 42 и VL с SEQ ID NO: 53.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит HC с SEQ ID NO: 220 и LC с SEQ ID NO: 221.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 13, 17, 20, 26 и 31 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит VH с SEQ ID NO: 43 и VL с SEQ ID NO: 49.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 13, 17, 20, 26 и 36 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит VH с SEQ ID NO: 43 и VL с SEQ ID NO: 54.

В некоторых вариантах осуществления антитело относится к изотипу IgG4, который содержит за- 18 045238 мену S228P по сравнению с IgG4 дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит HC с SEQ ID NO: 222 и LC с SEQ ID

NO: 223.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 13, 17, 21, 26 и 32 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит VH с SEQ ID NO: 43 и VL с SEQ ID NO: 50.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит HC с SEQ ID NO: 224 и LC с SEQ ID NO: 225.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий HCDR1, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 13, 17, 21, 27 и 37 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит VH с SEQ ID NO: 43 и VL с SEQ ID NO: 55.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит HC с SEQ ID NO: 226 и LC с SEQ ID NO: 227.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 13, 17, 23, 26 и 32 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит VH с SEQ ID NO: 43 и VL с SEQ ID NO: 56.

- 19 045238

ID NO: 10, 13, 17, 22, 26 и 32 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит VH с SEQ ID NO: 43 и VL с SEQ ID NO:

57.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит HC с SEQ ID NO: 228 и LC с SEQ ID NO: 229.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 13, 18, 20, 26 и 31 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит VH с SEQ ID NO: 44 и VL с SEQ ID NO: 49.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 11, 15, 18, 20, 26 и 31 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит VH с SEQ ID NO: 45 и VL с SEQ ID NO: 49.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 13, 19, 20, 26 и 31 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит VH с SEQ ID NO: 46 и VL с SEQ ID NO: 49.

- 20 045238

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 12, 13, 19, 20, 26 и 31 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит VH с SEQ ID NO: 47 и VL с SEQ ID NO: 49.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 14, 17, 23, 28 и 35 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID NO: 53.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 14, 17, 22, 26 и 34 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID NO: 52.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 12, 13, 19, 20, 29 и 39 соответственно.

- 21 045238

VH с SEQ ID NO: 47 и VL с SEQ ID NO: 59.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 11, 15, 18, 25, 26 и 40 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит VH с SEQ ID NO: 45 и VL с SEQ ID NO: 61.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 11, 15, 18, 24, 26 и 32 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит VH с SEQ ID NO: 45 и VL с SEQ ID NO: 62.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий VH с SEQ ID NO: 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 63 или 64.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий VL с SEQ ID NO: 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 или 65.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий VH с SEQ ID NO: 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 63 или 64 и VL с SEQ ID NO: 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 или 65.

Последовательности VH, VL, HCDR и LCDR примеров антител-антагонистов, специфически связывающих PD-1, по изобретению показаны в табл. 2.

Хотя варианты осуществления, проиллюстрированные в примерах, содержат пары вариабельных областей (одну из тяжелой цепи и одну из легкой цепи), специалисту в данной области будет понятно, что альтернативные варианты осуществления могут содержать одиночные вариабельные области тяжелой или легкой цепи. Одиночную вариабельную область можно применять для скрининга вариабельных

- 22 045238 доменов, способных к формированию двухдоменного специфического антигенсвязывающего фрагмента, способного, например, связываться с человеческим PD-1. Скрининг можно проводить посредством скрининга фагового дисплея, например, с применением иерархического двойного комбинаторного подхода, раскрытого в международной патентной публикации № WO1992/01047. Согласно этому подходу отдельную колонию, содержащую клон либо с VH-, либо с VL-цепью, применяют для инфицирования полной библиотеки клонов, кодирующих другую цепь (VL или VH), и полученный двухцепочечный специфичный антигенсвязывающий домен отбирают в соответствии с методиками фагового дисплея, применяя известные способы и способы, описанные в настоящем документе. Таким образом, отдельные полипептидные цепи VH и VL можно использовать при определении дополнительных антител, специфически связывающихся с человеческим PD-1, с помощью способов, раскрытых в международной патентной публикации № WO1992/01047.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, представляет собой мультиспецифическое антитело.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, представляет собой биспецифическое антитело.

В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, связывает PD-L1 (SEQ ID NO: 5), PD-L2 (SEQ ID NO: 8), LAG-3 (SEQ ID NO: 293), TIM3 (SEQ ID NO: 138), CEACAM-1 (SEQ ID NO: 296), CEACAM-5 (SEQ ID NO: 307), OX-40 (SEQ ID NO: 279), GITR (SEQ ID NO: 271), CD27 (SEQ ID NO: 280), VISTA (SEQ ID NO: 286), CD137 (SEQ ID NO: 281), TIGIT (SEQ ID NO: 301) или CTLA-4 (SEQ ID NO: 292). Биспецифические и мультиспецифические антитела можно создавать с помощью описанных в настоящем документе способов.

Таблица 2

Антитело PD1B114 PD1B149 PD1B160 PD1B162 PD1B164 PD1B11 PD1B183 PD1B184 PD1B185 PD1B187 PD1B192 PD1B71 PD1B177 PD1B70 PD1B175 PD1B194 PD1B195 PD1B196 PD1B197 PD1B198	HCDR1 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 11 10 12 10 10 10 12 12	HCDR2 13 13 14 14 14 13 13 13 13 13 13 13 15 13 13 14 14 14 13 13	SE HCDR3 16 16 16 16 16 17 17 17 17 17 17 18 18 19 19 17 17 17 19 19	;q ID NO LCDR1 20 21 22 22 23 20 20 21 21 23 22 20 20 20 20 23 22 23 24 20	LCDR2 26 26 27 26 28 26 26 26 27 26 26 26 26 26 26 28 26 26 26 29	LCDR3 31 32 33 34 35 31 36 32 37 32 32 31 31 31 31 35 34 32 38 39	VH 41 41 42 42 42 43 43 43 43 43 43 44 45 46 47 48 48 48 47 47	VL 49 50 51 52 53 49 54 50 55 56 57 49 49 49 49 53 52 56 58 59
PD1B199	11	15	18	20	30	32	45	60
PD1B200	11	15	18	25	26	40	45	61
PD1B201	11	15	18	24	26	32	45	62
PD1B131	66	67	68	69	70	71	63	65
PD1B132	66	67	68	69	70	71	64	65

Г омологичные антитела.

Варианты антител-антагонистов, специфически связывающих PD-1, или их антигенсвязывающего участка по изобретению, которые содержат аминокислотные последовательности VH, VL или VH и VL, показанные в табл. 2, табл. 21 и табл. 22, входят в рамки объема изобретения. Например, варианты могут содержать одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен в VH и/или VL постольку, поскольку гомологичные антитела сохранили или имеют улучшенные функциональные свойства по сравнению с исходными антителами. В некоторых вариантах осуществления идентичность последовательностей мо- 23 045238 жет составлять около 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с аминокислотной последовательностью VH или VL по изобретению. Необязательно любое изменение варианта по сравнению с исходным антителом не выполняется в рамках CDR варианта.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий VH с SEQ ID NO: 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 63 или 64, причем VH необязательно имеет одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен. Необязательно любые замены не выполняются в рамках CDR.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий VL с SEQ ID NO: 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 или 65, причем VL необязательно имеет одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен. Необязательно любые замены не выполняются в рамках CDR.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID NO: 56, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен. Необязательно любые замены не выполняются в рамках CDR.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий VH с SEQ ID NO: 64 и VL с SEQ ID NO: 65, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен. Необязательно любые замены не выполняются в рамках CDR.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий

VH с SEQ ID NO	41 и VL с SEQ ID NO	49;
VH с SEQ ID NO	: 41 и VL с SEQ ID NO	50;
VH с SEQ ID NO	: 42 и VL с SEQ ID NO	51;
VH с SEQ ID NO	: 42 и VL с SEQ ID NO	52;
VH с SEQ ID NO	: 42 и VL с SEQ ID NO	: 53;
VH с SEQ ID NO	: 43 и VL с SEQ ID NO	: 49;
VH с SEQ ID NO	: 43 и VL с SEQ ID NO	: 54;
VH с SEQ ID NO	: 43 и VL с SEQ ID NO	: 50;
VH с SEQ ID NO	: 43 и VL с SEQ ID NO	: 55;
VH с SEQ ID NO	: 43 и VL с SEQ ID NO	: 56;
VH с SEQ ID NO	: 43 и VL с SEQ ID NO	: 57;
VH с SEQ ID NO	: 44 и VL с SEQ ID NO	: 49;
VH с SEQ ID NO	: 45 и VL с SEQ ID NO	: 49;
VH с SEQ ID NO	: 46 и VL с SEQ ID NO	: 49;
VH с SEQ ID NO	: 47 и VL с SEQ ID NO	: 49;
VH с SEQ ID NO	: 48 и VL с SEQ ID NO	: 53;
VH с SEQ ID NO	: 48 и VL с SEQ ID NO	: 52;
VH с SEQ ID NO	: 47 и VL с SEQ ID NO	: 58;
VH с SEQ ID NO	: 47 и VL с SEQ ID NO	: 59;
VH с SEQ ID NO	: 45 и VL с SEQ ID NO	: 60;
VH с SEQ ID NO	: 45 и VL с SEQ ID NO	61;
VH с SEQ ID NO	: 45 и VL с SEQ ID NO	: 62; или
VH с SEQ ID NO: 63 и VL с SEQ ID NO: 65, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно

содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен. Необязательно любые замены не выполняются в рамках CDR.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий VH, имеющую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична VH с SEQ ID NO: 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 64 или 65. Необязательно любое изменение последовательностей с SEQ ID NO не выполняется в рамках CDR.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий VL, имеющую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична VL с SEQ ID NO: 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 или 65. Необязательно любое изменение последовательностей с SEQ ID NO не выполняется в рамках CDR.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его

- 24 045238 антигенсвязывающий участок, содержащий VH, имеющую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична VH с SEQ ID NO: 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 63 или 64, и VL, имеющую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична VL с SEQ ID NO: 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 или 65. Необязательно любое изменение последовательностей с SEQ ID NO не выполняется в рамках CDR.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий VH и VL, имеющие аминокислотные последовательности, которые на по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID NO: 56. Необязательно любое изменение последовательностей с SEQ ID NO не выполняется в рамках CDR.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий VH и VL, имеющие аминокислотные последовательности, которые на по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны VH с SEQ ID NO: 64 и VL с SEQ ID NO: 65. Необязательно любое изменение последовательностей с SEQ ID NO не выполняется в рамках CDR.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий VH и VL, имеющие последовательности аминокислот, которые на по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны VH и VL с SEQ ID NO:

и 49 соответственно;

и 50 соответственно;

и 51 соответственно;

и 52 соответственно;

и 53 соответственно;

и 49 соответственно;

и 54 соответственно;

и 50 соответственно;

и 55 соответственно;

и 56 соответственно;

и 57 соответственно;

и 49 соответственно;

и 53 соответственно;

и 52 соответственно;

и 58 соответственно;

и 59 соответственно;

и 60 соответственно;

и 61 соответственно;

и 62 соответственно; или и 65 соответственно. Необязательно любое изменение последовательностей с SEQ ID NO не выполняется в рамках CDR.

Гомологичные антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, или их антигенсвязывающие участки по изобретению имеют одно, два, три, четыре или пять из представленных ниже свойств:

a) усиливают активацию специфичных к антигену T-клеток CD4 + или CD8+ дозозависимым образом, причем активацию измеряют с помощью анализа с антигеном цитомегаловируса (анализ ЦМВ), как описано в примере 1;

b) связывают человеческий PD-1 с равновесной константой диссоциации (KD) менее около 100 нМ, причем KD измеряют с помощью системы ProteOn XPR36 при +25°C;

c) связывают человеческий PD-1 с KD менее около 1 нМ, причем KD измеряют с помощью системы ProteOn XPR36 при +25°C;

d) связывают PD-1 яванского макака с SEQ ID NO: 3 с KD менее около 100 нМ, причем KD измеряют с помощью системы ProteOn XPR36 при +25°C; или

e) связывают PD-1 яванского макака с SEQ ID NO: 3 с KD менее около 1 нМ, причем KD измеряют с помощью системы ProteOn XPR36 при +25°C.

В некоторых вариантах осуществления антитело усиливает активацию специфичных к антигену Tклеток CD4+ или CD8+ дозозависимым образом, причем активацию измеряют с помощью анализа с антигеном цитомегаловируса (анализ ЦМВ), как описано в примере 1, а также связывает человеческий PD1 с равновесной константой диссоциации (KD) менее около 100 нМ, причем KD измеряют с помощью системы ProteOn XPR36 при +25°C.

- 25 045238

В некоторых вариантах осуществления антитело усиливает активацию специфичных к антигену Tклеток CD4+ или CD8+ дозозависимым образом, причем активацию измеряют с помощью анализа с антигеном цитомегаловируса (анализ ЦМВ), как описано в примере 1, а также связывает PD-1 человека с равновесной константой диссоциации (KD) менее около 10 нМ, причем KD измеряют с помощью системы ProteOn XPR36 при +25°C.

Процент идентичности между двумя последовательностями зависит от числа идентичных положений, общих для последовательностей (т.е. % идентичности=число идентичных положений/общее число положений х 100), с учетом числа гэпов и длины каждого гэпа, который необходимо встроить для оптимального выравнивания двух последовательностей.

Процент идентичности между двумя аминокислотным последовательностями можно определить с помощью алгоритма E. Meyers and W. Miller (Comput Appl Biosci 4:11-17 (1988)), который встроен в программу ALIGN (версия 2.0), и с помощью таблицы массы остатков PAM120, штрафа на длину гэпа 12 и штрафа гэпа 4. Кроме того, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями можно определить с помощью алгоритма Needleman and Wunsch (J Mol Biol 48:444-453 (1970)), который встроен в программу GAP в пакете программ GCG (доступен на сайте http://_www_gcg_com), и с помощью либо матрицы Blossum 62, либо матрицы PAM250, а также веса гэпов 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и веса длины гэпов 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

Антитела с консервативными модификациями.

В изобретении также предложены антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, или их антигенсвязывающие участки, которые содержат VH, содержащие последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и VL, которые содержат последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3, причем одна или более из последовательностей CDR содержит установленные аминокислотные последовательности на основании описанных в настоящем документе антител (например, антител, показанных в табл. 2, табл. 21 и табл. 22) или их консервативных модификаций, и при этом антитела сохраняют желательные функциональные свойства исходных антител-антагонистов, специфически связывающих PD-1, по изобретению.

Антитела с консервативными модификациями имеют одно, два, три, четыре или пять из следующих свойств:

a) усиливают активацию специфичных к антигену T-клеток CD4+ или CD8+ дозозависимым образом, причем активацию измеряют с помощью анализа с антигеном цитомегаловируса (анализ ЦМВ), как описано в примере 1;

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 14, 17, 23, 26 и 32 соответственно и их консервативные модификации.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 66, 67, 68, 69, 70 и 71 соответственно и их консервативные модификации.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащий HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с

SEQ ID NO: 10, 13, 16, 20, 26 и 31 соответственно;

SEQ ID NO: 10, 13, 16, 21, 26 и 32 соответственно;

SEQ ID NO: 10, 14, 16, 22, 27 и 33 соответственно;

SEQ ID NO: 10, 14, 16, 22, 26 и 34 соответственно;

SEQ ID NO: 10, 14, 16, 23, 28 и 35 соответственно;

SEQ ID NO: 10, 13, 17, 20, 26 и 31 соответственно;

- 26 045238

SEQ ID NO: 10, 13, 17, 20, 26 и 36 соответственно;

SEQ ID NO: 10, 13, 17, 21, 26 и 32 соответственно;

SEQ ID NO: 10, 13, 17, 21, 27 и 37 соответственно;

SEQ ID NO: 10, 13, 17, 23, 26 и 32 соответственно;

SEQ ID NO: 10, 13, 17, 22, 26 и 32 соответственно;

SEQ ID NO: 10, 13, 18, 20, 26 и 31 соответственно;

SEQ ID NO: 11, 15, 18, 20, 26 и 31 соответственно;

SEQ ID NO: 10, 13, 19, 20, 26 и 31 соответственно;

SEQ ID NO: 12, 13, 19, 20, 26 и 31 соответственно;

SEQ ID NO: 10, 14, 17, 23, 28 и 35 соответственно;

SEQ ID NO: 10, 14, 17, 22, 26 и 34 соответственно;

SEQ ID NO: 12, 13, 19, 24, 26 и 38 соответственно;

SEQ ID NO: 12, 13, 19, 20, 29 и 39 соответственно;

SEQ ID NO: 11, 15, 18, 20, 30 и 32 соответственно;

SEQ ID NO: 11, 15, 18, 25, 26 и 40 соответственно;

SEQ ID NO: 11, 15, 18, 24, 26 и 32 соответственно и их консервативные модификации.

Термин консервативная модификация относится к модификациям аминокислот, которые не оказывают значимого влияния или не изменяют характеристики связывания антитела, содержащего аминокислотные последовательности. Консервативные модификации включают в себя замены, добавления и делеции аминокислот. Консервативные замены представляют собой замены, в которых аминокислоту заменяют аминокислотным остатком, имеющим аналогичную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих аналогичные боковые цепи, четко определены и включают в себя аминокислоты с кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту), щелочными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серии, треонин, тирозин, триптофан), ароматическими боковыми цепями (например, фенилаланин, триптофан, гистидин, тирозин), алифатическими боковыми цепями (например, глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, серин, треонин), амидами (например, аспарагин, глутамин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и серосодержащими боковыми цепями (цистеин, метионин). Более того, любой нативный остаток в полипептиде может быть также замещен аланином, как было описано ранее для мутагенеза с аланиновым сканированием (MacLennan et al., Acta Physiol. Scand. Suppl. 643:55-67, 1998; Sasaki et al., Adv. Biophys. 35:1-24, 1998). Аминокислотные замены в антителах по изобретению могут быть выполнены известными способами, например, путем ПЦР-опосредованного мутагенеза (патент США № 4,683,195). Альтернативно могут быть созданы библиотеки вариантов с помощью известных способов, например, с помощью случайных (NNK) или неслучайных кодонов, например, кодонов DVK, кодирующих 11 аминокислот (Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Lys, Asn, Arg, Ser, Tyr, Trp). Характеристики полученных в результате вариантов антител могут быть исследованы с помощью анализов, описанных в настоящем документе.

Антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3.

Домен иммуноглобулина T-клеток и домен муцина 3 (TIM-3, также известный как клеточный рецептор 2 вируса гепатита А (HAVCR2)) является коингибиторным рецептором иммунной контрольной точки, который был предложен для отрицательной регуляции как адаптивных, так и врожденных иммунных ответов. TIM-3 экспрессируется на конкретных подмножествах T-клеток CD4+ и CD8+ и функционирует с целью ограничения длительности и величины ответов T-клеток.

Ингибиторная роль TIM-3 в регуляции ответов T-клеток подтверждается фактами по нескольким направлениям. Мыши, дефицитные по TIM-3, имеют дефекты при индукции как антиген-специфичной, так и трансплантационной толерантности, что согласуется с тем, что TIM-3 ингибирует эффекторные Tклетки при нормальных иммунных ответах (Sabatos et al., (2003) Nat Immunol 4 (11): 1102-1110; SanchezFueyo et al., (2003) Nat Immunol 4 (11): 1093-1101). Антитела к TIM-3 обостряют экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE) в животных моделях (Monney et al., (2002) Nature 415 (6871): 536541). Было показано, что TIM-3 является критическим фактором дисфункционального или истощенного состояния T-клеток, которое наблюдается при хронической инфекции и раке (Sakuishi, K. and A. C. Anderson (2014). TIM-3 Regulation of Cancer Immunity. Tumor-Induced Immune Suppression. D. I. Gabrilovich and A. A. Hurwitz, Springer New York: 239-261).

Было показано, что блокада TIM-3 восстанавливает активность эффекторных клеток, такую как секреция цитокинов и пролиферация. В истощенных вирусами популяциях клеток, например, в клетках, инфицированных ВГС, экспрессирующие TIM-3-клетки (клетки TIM-3+), экспрессируют меньше цитокинов ФНО-α и ИФН-γ, чем TIM-3-отрицательные клетки в обеих популяциях эффекторных клеток, Tклетках CD4+ и CD8+ (Golden-Mason et al., (2009) J Virol 83:9122). Блокада TIM-3 восстанавливала пролиферацию в T-клетках CD8+ от пациента с ВИЧ или в клетках, которые воспроизводили вирусное ис- 27 045238 тощение (Jones et al., (2008) J Exp Med 205:2763), a также пролиферацию и секрецию ИФН-γ и/или ФНОα в специфичных к NY-ESO-1 T-клетках из PBMC от пациентов с метастазами (Fourcade et al., (2010) J

Exp Med 207:2175). Было обнаружено, что T-клетки TIM-3+ концентрируются в опухолях и участвуют в иммуносупрессивной среде опухоли (Sakuishi et al., (2013) Oncoimmunology, 2: e23849).

Блокада TIM-3 (сама по себе частично или в комбинации с блокадой пути PD-1 - аддитивно или синергетически) показала противоопухолевую эффективность в нескольких доклинических моделях рака, включая карциному толстой кишки CT26 (Sakuishi et al., (2010) J Exp Med 207 (10): 2187-94), саркому WT3 и карциному предстательной железы TRAMP-C1 (Ngiow et al., (2011) Cancer Res 71(10):3540-3551).

Механизмы, посредством которых TIM-3 ингибирует реакции T-клеток, изучены не полностью. Цитоплазматический хвост TIM 3 содержит множество тирозиновых остатков (Ferris et al., (2014) J Immunol 193(4):1525-1530), но не имеет ингибиторных сигнальных повторов, таких как ITIM или ITSM, которые обнаружены во внутриклеточном хвосте PD-1. Показано, что тирозинкиназы Fyn и Lck семейства Src связывают TIM-3, хотя точные последствия этих взаимодействий еще необходимо подтвердить in vivo. Предложены две противоположные модели того, как TIM-3 регулирует сигнализацию T-клеток. С одной стороны, была предложена теория, что TIM-3 отрицательно регулирует сигнализацию TCR посредством привлечения фосфатазы в иммунологический синапс и дефосфорилирования Lck (Clayton et al., (2014) J Immunol 192 (2):782-791). Напротив, также было предположено, что TIM-3 усиливает сигнализацию TCR и, что парадоксально, приводит T-клетки в более истощенное состояние посредством усиления активации активности NFAT и сигнализации NFkB.

В дополнение к экспрессии на эффекторных T-клетках TIM-3 также экспрессируется на регуляторных T-клетках (T-reg), и было показано, что он отмечает супрессивное подмножество T-reg в опухолях. Анализы как на первичных человеческих клетках, так и на доклинических мышиных моделях показали, что T-reg TIM-3+ более эффективны в ингибировании T-хелперов 1 (Th1) и T-хелперов 17 (Th17), чем Treg TIM-3- (Gautron et al., (2014) Eur J Immunol 44(9):2703-2711; Sakuishi et al., (2013) Oncoimmunology, 2: e23849). Поскольку TIM-3 экспрессируется на высокосупрессивных T-reg, он может непосредственно ингибировать ответы T-клеток CD4+ и CD8+. Кроме того, T-reg TIM 3+ экспрессируют высокие уровни IL-10, который предположительно является фактором истощения эффекторных T-клеток в TME, в качестве дополнительного косвенного механизма супрессии противоопухолевых иммунных ответов (Sakuishi et al., (2013) Oncoimmunology, 2: e23849).

TIM-3 экспрессируется на нескольких типах врожденных иммунных клеток, включая моноциты/макрофаги, дендритные клетки и NK-клетки. Существующие данные подтверждают супрессивную роль TIM-3 в этих разных типах клеток.

TIM-3 конститутивно экспрессируется циркулирующими моноцитами CD14+ у здоровых доноров, и его экспрессия на периферических моноцитах значительно повышена у пациентов с хроническим воспалением и раком (Rong et al., (2014) Tissue Antigens 83(2):76-81). Уровни TIM-3 также возрастают на макрофагах, которые инфильтрируются в опухоли гепатоцеллюлярной карциномы (HCC), по сравнению с макрофагами из смежных тканей и предположительно играют роль при направлении поляризации макрофагов к фенотипу M2 развития опухоли.

Как сообщалось недавно, TIM-3 экспрессируется на дендритных клетках, которые инфильтрируются в опухолях у мышей. В данных условиях взаимодействие TIM-3 с HMBG1 предположительно подавляет врожденный иммунитет посредством блокирования распознавания и ответа на иммуностимулирующую нуклеиновую кислоту (Chiba et al., (2012) Immunol 13(9):832-842). TIM-3 также конститутивно экспрессируется на NK-клетках в периферической крови. Одно недавнее исследование показало, что NKклетки у пациентов с прогрессирующей меланомой экспрессируют высокие уровни TIM-3 на периферийных NK-клетках. Важно отметить, что NK-клетки TIM-3+ были функционально истощены и блокада анти-TIM-3 смогла обратить истощение и усилить функциональность NK-клеток (da Silva et al., (2014) Cancer Immunol Res 2(5):410-422).

TIM-3 связывает лиганды галектин-9 (Gal-9), фосфатидилсерин (PtdSer), HMGB1 и CEACAM-1. Лектин S-типа галектин-9 может ингибировать связанную с TIM-3 функцию эффектора Th1 и индуцировать апоптоз в T-клетках, экспрессирующих TIM-3 в мышиных моделях. PtdSer, как правило, находится на внутриклеточной стороне плазматической мембраны, но переворачивается на внеклеточную сторону во время апоптоза. PtdSer связывает сохраненное расщепление во всех трех членах семейства TIM человека (TIM-1, -3, -4). Ингибирование PtdSer, связывающего TIM-3, может активировать ответ T-клеток. Галектин-9 секретируется опухолевыми клетками и может способствовать уклонению от противоопухолевого иммунитета. Алармин ДНК, HMGB1, для которого TIM-3 может служить в качестве стока, может предотвращать взаимодействия HMGB1/RAGE, которые стимулируют врожденный иммунитет. CEACAM-1 может взаимодействовать с TIM-3 как в цис-форме в виде гетеродимера на T-клетках, так и в трансформе в виде лиганда. Взаимодействие между CEACAM-1 и TIM-3 может помогать опосредовать блокирование сигнализации иммунных ответов. Сочетанная блокада TIM-3 и CEACAM-1 при карциноме толстой кишки CT26 показала эффективность, аналогичную той, которую наблюдали при сочетанной блокаде PD-L1 и TIM-3.

- 28 045238

Таким образом, блокада TIM-3 с помощью антител по изобретению, описанных в настоящем документе, которая ингибирует функцию TIM-3, может улучшать иммунный ответ против инфекции и противоопухолевый иммунитет.

В изобретении также предложено выделенное антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, причем антитело ингибирует связывание TIM-3 с галектином-9.

Ингибирование связывания TIM-3 с галектином-9 антителами по изобретению можно оценивать с помощью конкурентного твердофазного ИФА. В примере анализа 1 мкг/мл рекомбинантного человеческого Fc-TIM-3 связывают на лунках планшет для микротитрования, лунки промывают и блокируют и затем добавляют 10 мкг/мл исследуемого антитела. Без промывки в лунки добавляют 7,5 мкг/мл галектина-9 и инкубируют в течение 30 мин, после чего добавляют 0,5 мкг/мл антитела к галектин-9-биотину и инкубируют в течение 30 мин. Планшеты промывают и добавляют 0,5 мкг/мл конъюгата поликлонального антитела к нейтравидину-HRP, инкубируют в течение 30 минут. Планшеты промывают и добавляют субстрат хемилюминесценции POD непосредственно перед считыванием сигнала люминесценции. Антитела по изобретению ингибируют связывание TIM-3 с галектином-9, причем связывание галектина-9 уменьшается на по меньшей мере около 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% по анализу, описанному в настоящем документе и в примере 1. Примерами антител, которые ингибируют связывание TIM-3 с галектином-9, являются антитела TM3B103, TM3B105, TM3B107, TM3B108, TM3B109, TM3B113, TM3B189, TM3B190 и TM3B196.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок усиливает активацию специфичных к антигену T-клеток CD4+ или CD8+.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок усиливает активацию специфичных к антигену T-клеток CD4+ или CD8+, причем активацию специфичных к антигену T-клеток CD4+ или CD8+ оценивают посредством измерения статистически значимого усиления поверхностной экспрессии CD137 не специфичных к антигену T-клетках CD4+ или CD8+ по способам, описанным в примере 14.

Применение CD137 в качестве маркера специфичных к антигену T-клеток CD4+ или CD8+, которые распространяются в ответ на стимуляцию антигеном ЦМВ, позволило обнаруживать функциональные эффекты антител-антагонистов изобретения к TIM-3 по изобретению.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок связывает TIM-3 в пределах остатков 32-47 TIM-3 (WGKGACPVFECGNVVL) (SEQ ID NO: 261).

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок связывает TIM-3 в пределах остатков 32-47 TIM-3 (WGKGACPVFECGNVVL) (SEQ ID NO: 261) и остатков 50-56 (DERDVNY) (SEQ ID NO: 262).

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок связывает TIM-3 в пределах остатков 90-102 TIM-3 (RIQIPGIMNDEKF) (SEQ ID NO: 263).

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок связывает TIM-3 в пределах остатков 90-102 TIM-3 (RIQIPGIMNDEKF) (SEQ ID NO: 263) и остатков 50-56 (DERDVNY) в SEQ ID NO: 262.

Термин в пределах означает, что 80% или более остатков эпитопа, с которым связывается антитело, расположены в пределах указанных участков аминокислотных последовательностей и что до 20% остатков эпитопа, с которым связывается антитело, расположены за пределами указанных участков аминокислотных последовательностей.

Эпитоп Tim-3, с которым связывается антитело, может быть определен, например, с помощью обмена водород/дейтерий (обмен H/D) или с помощью анализа кристаллической структуры антитела в комплексе с TIM-3. Остатки эпитопа представляют собой остатки, защищенные антителом по меньшей мере на 5% разности уровней дейтерирования посредством обмена H/D или экспонируемые на поверхности аминокислотные остатки, определенные как связывающие антитело в кристаллической структуре комплекса антитела и TIM-3. В кристаллической структуре комплекса антитела и TIM-3 остатками эпитопа являются те остатки TIM-3, которые находятся на расстоянии в пределах 4 А или менее от любого из остатков CDR антитела.

При анализе обмена H/D белок TIM-3 инкубируют в присутствии или в отсутствие антитела в дейтерированной воде в течение заданных периодов времени, что приводит к включению дейтерия в обмениваемые атомы водорода, не защищенные антителом, с последующим расщеплением белка протеазой и анализами пептидных фрагментов с помощью жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (ЖХМС). В примере анализа 5 мкл исследуемого антитела (10 мкг) или 5 мкл комплекса TIM-3 и исследуемого антитела (10 и 7,35 мкг соответственно) инкубируют с 120 мкл буферного раствора для мечения оксидом дейтерия (50 мМ фосфат, 100 мМ хлорид натрия при pH 7,4) в течение 0 с, 60 с, 300 с, 1800 с, 7200 с и 14400 с. Реакцию обмена дейтерия гасят путем добавлением 63 мкл 5 М гидрохлорида гуаниди- 29 045238 на, и конечный уровень pH составляет 2,5. Погашенную пробу подвергают расщеплению на колонке пепсином/протеазой типа XIII и анализу ЖХ-МС. Для расщепления пепсином/протеазой типа XIII 5 мкг проб денатурируют в 125 мкл контрольного буферного раствора (50 мМ фосфата, 100 мМ хлорида натрия при pH 7,4) путем добавления 63 мкл 5 М гидрохлорида гуанидина (конечный уровень pH составляет 2,5) и инкубации смеси в течение 3 мин. Затем смесь подвергают расщеплению пепсином/протеазой типа XIII и полученные пептиды анализируют с помощью системы сверхэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (СВЭЖХ-МС), состоящей из хроматографа Waters Acquity UPLC, соединенного с квадрупольным масс-спектрометром на платформе Q ExactiveTM Hybrid QuadrupoleOrbitrap (Thermo). Исходные данные MC обрабатывают с помощью программного обеспечения HDX WorkBench, предназначенного для анализа данных MC обмена H/D. Уровни дейтерия вычисляют с помощью средней разности масс между дейтерированным пептидом и его нативной формой (t0). Выявление пептида осуществляют путем поиска данных MC/MC в сравнении с последовательностью TIM-3 с помощью Mascot. Допуск по массе для ионов предшественника и продукта составляет 20 ч./млн и 0,05 Да соответственно.

Для рентгеновской кристаллографии TIM-3 и исследуемое антитело экспрессируют и очищают с помощью стандартных протоколов. Комплекс TIM-3/исследуемое антитело инкубируют в течение ночи при 4°C, концентрируют и отделяют от не образовавших комплекс соединений с помощью эксклюзионной хроматографии. Комплекс кристаллизуют способом паровой диффузии из различных известных исследуемых растворов, например, растворов, содержащих ПЭГ3350, цитрат аммония и 2-(Nморфолино)этансульфоновую кислоту (MES).

Антитела, связывающие в пределах остатков 32-47 TIM-3 (WGKGACPVFECGNVVL) (SEQ ID NO: 261), 90-102 (RIQIPGIMNDEKF) (SEQ ID NO: 263) и/или 50-56 (DERDVNY) (SEQ ID NO: 262), могут быть получены посредством выделения антител, связывающих TIM-3, с помощью библиотек фагового дисплея, отбора тех антител, которые конкурируют с эталонным антителом TM3B105 (VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156) или TM3B291 (VH с SEQ ID NO: 172 и VL с SEQ ID NO: 173) за связывание с TIM-3 на 100%, и подтверждения эпитопа полученных антител посредством решения кристаллической структуры комплекса антитело/TIM-3. Альтернативно мышей, крыс или кроликов можно иммунизировать с помощью пептидов, охватывающих остатки 32-47, 90-102 и/или 50-56 в TIM-3, и полученные антитела можно оценивать на их связывание в пределах указанной области.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, содержащие определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1), HCDR2 и HCDR3 с SEQ ID NO: 164, 165 и 166 соответственно.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1), LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 167, 168 и 169 соответственно.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с SEQ ID NO: 164, 165 и 166 соответственно и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 167, 168 и 169 соответственно.

SEQ ID NO: 164, 165, 166, 167, 168 и 169 представляют родовые последовательности HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 антагонистов к TIM-3, полученные из библиотек фагового дисплея. Родовые последовательности были получены на основании структурных моделей, которые приводили к выравниваниям последовательностей, представленным на фиг. 13, фиг. 14, фиг. 15, фиг. 16, фиг. 17 и фиг. 18 и обобщенным в настоящем документе.

SEQ ID NO: 164

X17YX18MX19, где X17 представляет собой N, S, G или D;

X18 представляет собой W или A; и

X19 представляет собой S или H.

SEQ ID NO: 165

X20IX21X22SGGSX23YYADSVKG, где X20 представляет собой A или V;

X21 представляет собой S или K;

X22 представляет собой G или Y; и

X23 представляет собой T или K.

SEQ ID NO: 166

X24X25X26X27X28X29X30X31DY, где X24 представляет собой D, S, N, G или E;

X25 представляет собой H, P, E, T или L;

X26 представляет собой W, E, N или удален;

X27 представляет собой D, P или удален;

X28 представляет собой P, Y, D или удален;

X29 представляет собой N, A, D, G или удален;

- 30 045238

X30 представляет собой F, P, R, W или V; и

X31 представляет собой L или F.

SEQ ID NO: 167

X3 2X33SQ SVX3 4X3 5X3 6X3 7X3 8X3 9X40X41X42LA, где X32 представляет собой R или K;

X33 представляет собой A или S;

X34 представляет собой S, N или L;

X35 представляет собой S, A, N или удален;

X36 представляет собой S или удален;

X37 представляет собой S или удален;

X38 представляет собой N или удален;

X39 представляет собой N или удален;

X40 представляет собой K или удален;

X41 представляет собой S, D или N; и

X42 представляет собой Y или T.

SEQ ID NO: 168

X43ASX44RX45X46, где X43 представляет собой G, D, W или T;

X44 представляет собой S, N или T;

X45 представляет собой A или E; и

X46 представляет собой T или S.

SEQ ID NO: 169

QQX47X48X49X50PX51T (SEQ ID NO: 169), где X47 представляет собой Y, G или S;

X48 представляет собой G или Y;

X49 представляет собой S, H или T;

Х50 представляет собой S, A или T; и

Х51 представляет собой L, I или W.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, содержащиеся в пределах вариабельной области тяжелой цепи (VH) с SEQ ID NO: 145, 146, 147, 148 или 149, причем HCDR1, HCDR2 и HCDR3 определены по Chothia, Kabat или IMGT.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, содержащиеся в пределах вариабельной области легкой цепи (VL) с SEQ ID NO: 155, 156, 157 или 158, причем LCDR1, LCDR2 и LCDR3 определены по Chothia, Kabat или IMGT.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок содержит

HCDR1 с SEQ ID NO: 90, 91, 92 или 93;

HCDR2 с SEQ ID NO: 99, 100 или 101; и

HCDR3 с SEQ ID NO: 107, 108, 109, 110 или 111.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок по изобретению содержат

LCDR1 с SEQ ID NO: 117, 118, 119 или 120;

LCDR2 с SEQ ID NO: 126, 127, 128 или 129; и

LCDR3 с SEQ ID NO: 135, 136, 137 или 139.

HCDR1 с SEQ ID NO: 90, 91, 92 или 93;

HCDR2 с SEQ ID NO: 99, 100 или 101;

HCDR3 с SEQ ID NO: 107, 108, 109, 110 или 111;

LCDR1 с SEQ ID NO: 117, 118, 119 или 120;

LCDR2 с SEQ ID NO: 126, 127, 128 или 129; или

LCDR3 с SEQ ID NO: 135, 136, 137 или 139.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с

SEQ ID NO: 90, 99 и 107 соответственно;

SEQ ID NO: 91, 99 и 108 соответственно;

SEQ ID NO: 91, 99 и 109 соответственно;

SEQ ID NO: 92, 100 и 110 соответственно; или

SEQ ID NO: 93, 101 и 111 соответственно;

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3,

- 31 045238 или его антигенсвязывающий участок содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с

SEQ ID NO: 117, 126 и 135 соответственно;

SEQ ID NO: 118, 127 и 136 соответственно;

SEQ ID NO: 119, 128 и 137 соответственно; или

SEQ ID NO: 120, 129 и 139 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с

SEQ ID NO: 90, 99, 107, 117, 126 и 135 соответственно;

SEQ ID NO: 91, 99, 108, 118, 127 и 136 соответственно;

SEQ ID NO: 91, 99, 109, 119, 128 и 137 соответственно;

SEQ ID NO: 92, 100, 110, 117, 126 и 135 соответственно; или

SEQ ID NO: 93, 101, 111, 120, 129 и 139 соответственно.

В изобретении также предложено выделенное антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с SEQ ID NO: 164, 165 и 108 соответственно и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 118, 168 и 169 соответст венно.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 91, 99, 108, 118, 127 и 136 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок связывает TIM-3 в пределах остатков 32-47 TIM-3 (WGKGACPVFECGNVVL) (SEQ ID NO: 261).

В некоторых вариантах осуществления антитело, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок связывает TIM-3 в пределах остатков 32-47 TIM-3 (WGKGACPVFECGNVVL) (SEQ ID NO: 261) и остатков 50-56 (DERDVNY) SEQ ID NO: 262.

В некоторых вариантах осуществления антитело, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок ингибирует связывание TIM-3 с галектином-9.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит каркас тяжелой цепи, полученный из IGHV3-23 (SEQ ID NO: 174), и каркас легкой цепи, полученный из IGKV3-11 (SEQ ID NO: 171).

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156.

В некоторых вариантах осуществления VH и VL кодируются полинуклеотидными последовательностями с SEQ ID NO: 204 и 205 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок усиливает активацию специфичных к антигену T-клеток CD4+ или CD8+, причем активацию специфичных к антигену T-клеток CD4+ или CD8+ оценивают посредством измерения статистически значимого усиления поверхностной экспрессии CD137 на специфичных к антигену T-клетках CD4+ или CD8+ по способам, описанным в примере 14.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156 и относится к изотипу IgG4, необязательно содержащему замену S228P по сравнению с IgG4 дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156 и относится к изотипу IgG4K, который содержит замену S228P по сравнению с IgG4 дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156 и относится к изотипу IgG2/K, необязательно содержащему замены V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S и P331S по сравнению с IgG2 дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156 и относится к изотипу IgG2/K, содержащему замены V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S и P331S по сравнению с IgG2 дикого типа.

- 32 045238

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит HC с SEQ ID NO: 78 и LC с SEQ ID NO:

79.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит HC с SEQ ID NO: 240 и LC с SEQ ID NO: 79.

SEQ ID NO: 78

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTY YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPYAPLDYWGQGTLVTVSSASTKGP SVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWT VPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVWDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 79

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVNDYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIP ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQGGHAPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 240

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTY YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPYAPLDYWGQGTLVTVSSASTKGP SVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWT VTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVWDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

- 33 045238

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении рака, в комбинации с антителом-антагонистом, которое специфически связывает PD-1.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении рака, в комбинации с антителом-антагонистом, которое специфически связывает PD-1, содержащим VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID NO: 56.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении рака, в комбинации с антителом-антагонистом, которое специфически связывает PD-1, содержащим VH с SEQ ID NO: 47 и VL с SEQ ID NO: 58.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении рака, в комбинации с антителом-антагонистом, которое специфически связывает PD-1, содержащим VH с SEQ ID NO: 45 и VL с SEQ ID NO: 60.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении рака, в комбинации с антителом-антагонистом, которое специфически связывает PD-1, содержащим VH с SEQ ID NO: 64 и VL с SEQ ID NO: 65.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении рака, такого как солидная опухоль, в комбинации с антителом-антагонистом, специфически связывающим TIGIT (SEQ ID NO: 301).

Антитело приемлемо для применения в терапии субъекта, который получает или получал лечение антителом-антагонистом, которое специфически связывает PD-1, содержащим VH с SEQ ID NO: 230 и VL с SEQ ID NO: 231 (например, KEYTRUDA® (пембролизумаб)).

Антитело приемлемо для применения в терапии субъекта, который получает или получал лечение антителом-антагонистом, которое специфически связывает PD-1, содержащим VH с SEQ ID NO: 232 и VL с SEQ ID NO: 233 (например, OPDIVO® (ниволумаб)).

Антитело приемлемо для применения в терапии субъекта, который не поддается лечению антителом-антагонистом, которое специфически связывает PD-1, содержащим VH с SEQ ID NO: 230 и VL с SEQ ID NO: 231 (например, KEYTRUDA® (пембролизумаб)).

Антитело приемлемо для применения в терапии субъекта, который не поддается лечению антителом-антагонистом, которое специфически связывает PD-1, содержащим VH с SEQ ID NO: 232 и VL с SEQ ID NO: 233 (например, OPDIVO® (ниволумаб)).

Антитело приемлемо для применения в терапии субъекта, который имеет рецидивирующую опухоль после лечения антителом-антагонистом, которое специфически связывает PD-1, содержащим VH с SEQ ID NO: 230 и VL с SEQ ID NO: 231 (например, KEYTRUDA® (пембролизумаб)).

Антитело приемлемо для применения в терапии субъекта, который имеет рецидивирующую опухоль после лечения антителом-антагонистом, которое специфически связывает PD-1, содержащим VH с SEQ ID NO: 232 и VL с SEQ ID NO: 233 (например, OPDIVO® (ниволумаб)).

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 97, 105, 115, 124, 133 и 143 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит каркас тяжелой цепи, полученный из IGHV5-51 (SEQ ID NO: 179), и каркас легкой цепи, полученный из IGKV1-39 (SEQ ID NO: 182).

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит VH с SEQ ID NO: 172 и VL с SEQ ID NO: 173.

- 34 045238

В некоторых вариантах осуществления VH и VL кодируются полинуклеотидными последовательностями с SEQ ID NO: 206 и 207 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок связывает TIM-3 в пределах остатков 90-102 TIM-3 (WGKGACPVFECGNVVL) (SEQ ID NO: 263).

В некоторых вариантах осуществления антитело, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок связывает TIM-3 в пределах остатков 90-102 TIM-3 (WGKGACPVFECGNVVL) (SEQ ID NO: 263) и остатков 50-56 (DERDVNY) в SEQ ID NO: 262.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит VH с SEQ ID NO: 172 и VL с SEQ ID NO: 173 и относится к изотипу IgG4, необязательно содержащему замену S228P по сравнению с IgG4 дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит VH с SEQ ID NO: 172 и VL с SEQ ID NO: 173 и относится к изотипу IgG4K, который содержит замену S228P по сравнению с IgG4 дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит VH с SEQ ID NO: 172 и VL с SEQ ID NO: 173 и относится к изотипу IgG2/K, необязательно содержащему замены V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S и P331S по сравнению с IgG2 дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит VH с SEQ ID NO: 172 и VL с SEQ ID NO: 173 и относится к изотипу IgG2/K, содержащему замены V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S и P331S по сравнению с IgG2 дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит HC с SEQ ID NO: 80 и LC с SEQ ID NO: 81.

SEQ ID NO: 80

EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWMQWVRQMPGKGLEWMGAIYPGDGDIR

YTQNFKGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARWEKSTTVVQRNYFDYWGQGTTVTVS

SASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPK

DTLMISRTPEVTCVWDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTVLHQD

WLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD

IAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS

LSLSPGK

SEQ ID NO: 81

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASENVGTFVSWYQQKPGKAPKLLIYGASNRYTGVP

SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGQSYSYPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQ

LKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK

HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

- 35 045238

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ).

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении рака, в комбинации с антителом-антагонистом, которое специфически связывает PD-1, содержащим VH с SEQ ID NO: 65 и VL с SEQ ID NO: 65.

Антитело приемлемо для применения в терапии, например, в лечении рака, такого как солидная

- 36 045238 опухоль, в комбинации с антителом-агонистом, специфически связывающим CD137 (SEQ ID NO: 281).

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 90, 99, 107, 117, 126 и 135 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит каркас тяжелой цепи, полученный из IGHV3-23 (SEQ ID NO: 174), и каркас легкой цепи, полученный из IGKV3-20 (SEQ ID NO: 180).

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит VH с SEQ ID NO: 145 и VL с SEQ ID NO: 155.

В некоторых вариантах осуществления VH и VL кодируются полинуклеотидными последовательностями с SEQ ID NO: 208 и 209 соответственно.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 91, 99, 109, 119, 128 и 137.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит каркас тяжелой цепи, полученный из IGHV3-23 (SEQ ID NO: 174), и каркас легкой цепи, полученный из IGKV4-1 (SEQ ID NO: 181).

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит VH с SEQ ID NO: 148 и VL с SEQ ID NO: 157.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 92, 100, 110, 117, 126 и 135 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит VH с SEQ ID NO: 147 и VL с SEQ ID NO: 155.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 93, 101, 111, 120, 129 и 139 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит VH с SEQ ID NO: 149 и VL с SEQ ID NO: 158.

В некоторых вариантах осуществления VH и VL кодируются полинуклеотидными последовательностями с SEQ ID NO: 201 и 211 соответственно.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 94, 102, 112, 121, 130 и 140 соответственно.

- 37 045238 каркас тяжелой цепи, полученный из IGHV1-02 (SEQ ID NO: 175), и каркас легкой цепи, полученный из

IGKV4-1 (SEQ ID NO: 181).

VH с SEQ ID NO: 150 и VL с SEQ ID NO: 159.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 95, 103, 113, 122, 131 и 141 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит каркас тяжелой цепи, полученный из IGHV4-30-4 (SEQ ID NO: 176), и каркас легкой цепи, полученный из IGKV1-39 (SEQ ID NO: 182).

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит VH с SEQ ID NO: 151 и VL с SEQ ID NO: 160.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 96, 104, 114, 123, 132 и 142 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит каркас тяжелой цепи, полученный из IGHV1-03 (SEQ ID NO: 177), и каркас легкой цепи, полученный из IGKV1-33 (SEQ ID NO: 183).

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит VH с SEQ ID NO: 152 и VL с SEQ ID NO: 161.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит каркас тяжелой цепи, полученный из IGHV1-03 (SEQ ID NO: 177), и каркас легкой цепи, полученный из IGKV1-39 (SEQ ID NO: 182).

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит VH с SEQ ID NO: 153 и VL с SEQ ID NO: 162.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 98, 106, 116, 125, 134 и 144 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит каркас тяжелой цепи, полученный из IGHV2-26 (SEQ ID NO: 178), и каркас легкой цепи, полученный из IGKV4-1 (SEQ ID NO: 181).

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий участок содержит VH с SEQ ID NO: 154 и VL с SEQ ID NO: 163.

Последовательности VH, VL, HCDR и LCDR примеров антител-антагонистов, специфически связывающих TIM-3, по изобретению показаны в табл. 3.

Хотя варианты осуществления, проиллюстрированные в примерах, содержат пары вариабельных областей (одну из тяжелой цепи и одну из легкой цепи), специалисту в данной области будет понятно, что альтернативные варианты осуществления могут содержать одиночные вариабельные области тяжелой или легкой цепи. Одиночную вариабельную область можно применять для скрининга вариабельных доменов, способных к формированию двухдоменного специфического антигенсвязывающего фрагмента, способного, например, связываться с человеческим TIM-3. Скрининг можно проводить способами скрининга фагового дисплея аналогично тому, как описано в настоящем документе.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, представляет собой мультиспецифическое антитело.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, представляет собой биспецифическое антитело.

В некоторых вариантах осуществления биспецифическое или мультиспецифическое антитело связывает PD-1 (SEQ ID NO: 1), PD-L1 (SEQ ID NO: 5), PD-L2 (SEQ ID NO: 8), LAG-3 (SEQ ID NO: 293),

- 38 045238

CEACAM-1 (SEQ ID NO: 296), CEACAM-5 (SEQ ID NO: 307), NKG2D (SEQ ID NO: 282) или TIGITI (SEQ ID NO: 301). Биспецифические и мультиспецифические антитела можно создавать с помощью описанных в настоящем документе способов.

Таблица 3

Название mAb	SEQ ID NO:
HCDR1	HCDR2	HCDR3	LCDR1	LCDR2	LCDR3	VH	VL
TM3B103	90	99	107	117	126	135	145	155
ТМЗВ105	91	99	108	118	127	136	146	156
ТМЗВ109	91	99	109	119	128	137	148	157
ТМЗВ108	92	100	110	117	126	135	147	155
TM3B113	93	101	111	120	129	139	149	158
ТМЗВ189	94	102	112	121	130	140	150	159
ТМЗВ190	95	103	113	122	131	141	151	160
TM3B193	96	104	114	123	132	142	152	161
ТМЗВ195	97	105	115	124	133	143	153	162
ТМЗВ196	98	106	116	125	134	144	154	163
ТМЗВ291	97	105	115	124	133	143	172	173

Г омологичные антитела.

Варианты антител-антагонистов, которые специфически связывают TIM-3, по изобретению, содержащих аминокислотные последовательности VH или VL, показанные в табл. 3, табл. 36 и табл. 37, находятся в рамках объема изобретения. Например, варианты могут содержать одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен в VH и/или VL постольку, поскольку гомологичные антитела сохранили или имеют улучшенные функциональные свойства по сравнению с исходными антителами. В некоторых вариантах осуществления идентичность последовательностей может составлять около 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с аминокислотной последовательностью VH или VL по изобретению.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, содержащий VH с SEQ ID NO: 145 и VL с SEQ ID NO: 155, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен. Необязательно любые замены не выполняются в рамках CDR.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, содержащий VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен. Необязательно любые замены не выполняются в рамках CDR.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, содержащий VH с SEQ ID NO: 148 и VL с SEQ ID NO: 157, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен. Необязательно любые замены не выполняются в рамках CDR.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, содержащий VH с SEQ ID NO: 147 и VL с SEQ ID NO: 155, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен. Необязательно любые замены не выполняются в рамках CDR.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, содержащий VH с SEQ ID NO: 149 и VL с SEQ ID NO: 158, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен. Необязательно любые замены не выполняются в рамках CDR.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, содержащий VH с SEQ ID NO: 150 и VL с SEQ ID NO: 159, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен. Необязательно любые замены не выполняются в рамках CDR.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его

- 39 045238 антигенсвязывающий участок, содержащий VH с SEQ ID NO: 151 и VL с SEQ ID NO: 160, причем VH,

VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен. Необязательно любые замены не выполняются в рамках CDR.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, содержащий VH с SEQ ID NO: 152 и VL с SEQ ID NO: 161, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен. Необязательно любые замены не выполняются в рамках CDR.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, содержащий VH с SEQ ID NO: 153 и VL с SEQ ID NO: 162, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен. Необязательно любые замены не выполняются в рамках CDR.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит VH с SEQ ID NO: 154 и VL с SEQ ID NO: 163, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен. Необязательно любые замены не выполняются в рамках CDR.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, содержащий VH с SEQ ID NO: 172 и VL с SEQ ID NO: 173, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен. Необязательно любые замены не выполняются в рамках CDR.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, содержащий VH, имеющую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична VH с SEQ ID NO: 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154 или 172. Необязательно любое изменение последовательностей с SEQ ID NO не выполняется в рамках CDR.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, содержащий VL, имеющую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична VL с SEQ ID NO: 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163 или 173. Необязательно любое изменение последовательностей с SEQ ID NO не выполняется в рамках CDR.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, содержащий VH, имеющую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична VH с SEQ ID NO: 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, или 172, и VL, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную VL с SEQ ID NO: 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163 или 173. Необязательно любое изменение последовательностей с SEQ ID NO не выполняется в рамках CDR.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, содержащий VH и VL, имеющие аминокислотные последовательности, которые на по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны VH с SEQ ID NO: 145 и VL с SEQ ID NO: 155. Необязательно любое изменение последовательностей с SEQ ID NO не выполняется в рамках CDR.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, содержащий VH и VL, имеющие аминокислотные последовательности, которые на по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156. Необязательно любое изменение последовательностей с SEQ ID NO не выполняется в рамках CDR.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, содержащий VH и VL, имеющие аминокислотные последовательности, которые на по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны VH с SEQ ID NO: 148 и VL с SEQ ID NO: 157. Необязательно любое изменение последовательностей с SEQ ID NO не выполняется в рамках CDR.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, содержащий VH и VL, имеющие аминокислотные последовательности, которые на по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны VH с SEQ ID NO: 147 и VL с SEQ ID NO: 155. Необязательно любое изменение последовательностей с SEQ ID NO не выполняется в рамках CDR.

- 40 045238 антигенсвязывающий участок, содержащий VH и VL, имеющие аминокислотные последовательности, которые на по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны VH с

SEQ ID NO: 149 и VL с SEQ ID NO: 158. Необязательно любое изменение последовательностей с SEQ ID

NO не выполняется в рамках CDR.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, содержащий VH и VL, имеющие аминокислотные последовательности, которые на по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны VH с SEQ ID NO: 150 и VL с SEQ ID NO: 159. Необязательно любое изменение последовательностей с SEQ ID NO не выполняется в рамках CDR.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, содержащий VH и VL, имеющие аминокислотные последовательности, которые на по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны VH с SEQ ID NO: 151 и VL с SEQ ID NO: 160. Необязательно любое изменение последовательностей с SEQ ID NO не выполняется в рамках CDR.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, содержащий VH и VL, имеющие аминокислотные последовательности, которые на по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны VH с SEQ ID NO: 152 и VL с SEQ ID NO: 161. Необязательно любое изменение последовательностей с SEQ ID NO не выполняется в рамках CDR.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, содержащий VH и VL, имеющие аминокислотные последовательности, которые на по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны VH с SEQ ID NO: 153 и VL с SEQ ID NO: 162. Необязательно любое изменение последовательностей с SEQ ID NO не выполняется в рамках CDR.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, содержащий VH и VL, имеющие аминокислотные последовательности, которые на по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны VH с SEQ ID NO: 154 и VL с SEQ ID NO: 163. Необязательно любое изменение последовательностей с SEQ ID NO не выполняется в рамках CDR.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, содержащий VH и VL, имеющие аминокислотные последовательности, которые на по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны VH с SEQ ID NO: 172 и VL с SEQ ID NO: 173. Необязательно любое изменение последовательностей с SEQ ID NO не выполняется в рамках CDR.

Гомологичные антитела по изобретению, описанные в настоящем документе, имеют по существу аналогичные функциональные свойства по сравнению с исходными антителами TIM-3.

Антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению с консервативными модификациями.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит VH, содержащую последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и VL, содержащую последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3, причем одна или более из последовательностей CDR содержит установленные аминокислотные последовательности на основе описанных в настоящем документе антител (например, антител, показанных в табл. 3, табл. 36 или табл. 37) или их консервативных модификаций, и при этом антитела сохраняют желательные функциональные свойства исходных антител-антагонистов, специфически связывающих TIM-3, по изобретению.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 90, 99, 107, 117, 126 и 135 соответственно и их консервативные модификации.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 91, 99, 108, 118, 127 и 136 соответственно и их консервативные модификации.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 91, 99, 109, 119, 128 и 137 соответственно и их консервативные модификации.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 92, 100, 110, 117, 126 и 135 соответственно и их консервативные модификации.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 93, 101, 111, 120, 129 и 139 соответственно и их консервативные модификации.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с

- 41 045238

SEQ ID NO: 94, 102, 112, 121, 130 и 140 соответственно и их консервативные модификации.

SEQ ID NO: 95, 103, 113, 122, 131 и 141 соответственно и их консервативные модификации.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 96, 104, 114, 123, 132 и 142 соответственно и их консервативные модификации.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 97, 105, 115, 124, 133 и 143 соответственно и их консервативные модификации.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 98, 106, 116, 125, 134 и 144 соответственно и их консервативные модификации.

Термин консервативная модификация относится к модификациям, описанным в настоящем документе.

Антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению с конкретными каркасными последовательностями.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит VH и VL, полученные из конкретных последовательностей иммуноглобулина зародышевых линий человека.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит каркас VH, полученный из IGHV3-23 (SEQ ID NO: 174), IGHV1-02 (SEQ ID NO: 175), IGHV4-30-4 (SEQ ID NO: 176), IGHV1-03 (SEQ ID NO: 177), IGHV226 (SEQ ID NO: 178) или IGHV5-51 (SEQ ID NO: 179).

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит каркас VL, полученный из IGKV3-20 (A27) (SEQ ID NO: 180), IGKV3-11 (L6) (SEQ ID NO: 171), IGKV4-1 (B3) (SEQ ID NO: 181), IGKV1-39 (O12) (SEQ ID NO: 182) или IGKV1-33 (O18) (SEQ ID NO: 183).

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит каркас VH, полученный из IGHV3-23 (SEQ ID NO: 174), и каркас VL, полученный из IGKV3-20 (SeQ ID NO: 180).

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит каркас VH, полученный из IGHV3-23 (SEQ ID NO: 174), и каркас VL, полученный из IGKV3-11 (SeQ ID NO: 171).

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит каркас VH, полученный из IGHV3-23 (SEQ ID NO: 174), и каркас VL, полученный из IGKV4-1 (SEQ ID NO: 181).

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит каркас VH, полученный из IGHV1-02 (SEQ ID NO: 175), и каркас VL, полученный из IGKV4-1 (SEQ ID NO: 181).

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит каркас VH, полученный из IGHV4-30-4 (SEQ ID NO: 176), и каркас VL, полученный из IGKV1-39 (SEQ ID NO: 182).

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит каркас VH, полученный из IGHV1-03 (SEQ ID NO: 177), и каркас VL, полученный из IGKV1-33 (SeQ ID NO: 183).

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит каркас VH, полученный из IGHV1-03 (SEQ ID NO: 177), и каркас VL, полученный из IGKV1-39 (SeQ ID NO: 182).

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит каркас VH, полученный из IGHV2-26 (SEQ ID NO: 178), и каркас VL, полученный из IGKV4-1 (SEQ ID NO: 181).

В изобретении также предложено антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, или его антигенсвязывающий участок, который содержит каркас VH, полученный из IGHV5-51 (SEQ ID NO: 179), и каркас VL, полученный из IGKV1-39 (SeQ ID NO: 182).

К антителам по изобретению, содержащим вариабельные области тяжелой или легкой цепи и полученным из конкретного каркаса или последовательности зародышевой линии, относятся антитела, полученные из системы, в которой применяются гены иммуноглобулина зародышевой линии человека, например, из трансгенных мышей или из библиотек фаговых дисплеев, как описано в настоящем документе. Антитело, полученное из конкретного каркаса или последовательности зародышевой линии, может содержать аминокислотные отличия по сравнению с последовательностью, из которой оно получено, например, вследствие возникающих в естественных условиях соматических мутаций или намерен- 42 045238 ных замен.

Примеры антител-антагонистов, специфически связывающих TIM-3 и имеющих определенные каркасные последовательности VH и VL, показаны в табл. 38.

Биспецифические антитела к PD-1/TIM-3.

В изобретении также предложены биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3.

В изобретении также предложено выделенное биспецифическое антитело-антагонист PD-1/TIM-3, которое содержит первый домен, специфически связывающий PD-1, и второй домен, специфически связывающий TIM-3.

В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело-антагонист PD-1/TIM-3 по изобретению усиливает активацию специфичных к антигену T-клеток CD4+ или CD8+.

В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело-антагонист PD-1/TIM-3 по изобретению усиливает активацию специфичных к антигену T-клеток CD4+ или CD8+, причем усиленную активацию специфичных к антигену T-клеток CD4+ или CD8+ оценивают посредством измерения статистически значимого повышения поверхностной экспрессии CD137 на специфичных к антигену T-клетках CD4+ или CD8+.

В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело-антагонист PD-1/TIM-3 по изобретению ингибирует связывание TIM-3 с галектином-9.

В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело-антагонист PD-1/TIM-3 по изобретению связывает человеческий PD-1 с равновесной константой диссоциации (KD) менее около 100 нМ, причем KD измеряют с помощью системы ProteOn XPR36 при +25°C;

связывает PD-1 человека с KD менее около 1 нМ, причем KD измеряют с помощью системы ProteOn XPR36 при +25°C;

связывает PD-1 яванского макака с KD менее около 100 нМ, причем KD измеряют с помощью системы ProteOn XPR36 при +25°C; или связывает PD-1 яванского макака с KD менее около 1 нМ;

причем KD измеряют с помощью системы ProteOn XPR36 при +25°C.

В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело-антагонист PD-1/TIM-3 по изобретению усиливает активацию специфичных к антигену T-клеток CD4+ или CD8+, причем активацию специфичных к антигену T-клеток CD4+ или CD8+ оценивают посредством измерения статистически значимого повышения поверхностной экспрессии CD137 на специфичных к антигену T-клетках CD4+ или CD8+, а также связывает человеческий PD-1 с равновесной константой диссоциации (KD) менее около 100 нМ, причем KD измеряют с помощью системы ProteOn XPR36 при +25°C.

В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело-антагонист PD-1/TIM-3 по изобретению усиливает активацию специфичных к антигену T-клеток CD4+ или CD8+, причем активацию специфичных к антигену T-клеток CD4+ или CD8+ оценивают посредством измерения статистически значимого повышения поверхностной экспрессии CD137 на специфичных к антигену T-клетках CD4+ или CD8+, а также связывает человеческий PD-1 с равновесной константой диссоциации (KD) менее около 1 нМ, причем KD измеряют с помощью системы ProteOn XPR36 при +25°C.

В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело-антагонист PD-1/TIM-3 по изобретению усиливает активацию специфичных к антигену T-клеток CD4+ или CD8+, причем активацию специфичных к антигену T-клеток CD4+ или CD8+ оценивают посредством измерения статистически значимого повышения поверхностной экспрессии CD137 на специфичных к антигену T-клетках CD4+ или CD8+, а также связывает PD-1 яванского макака с равновесной константой диссоциации (KD) менее около 100 нМ, причем KD измеряют с помощью системы ProteOn XPR36 при +25°C.

В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело-антагонист PD-1/TIM-3 по изобретению усиливает активацию специфичных к антигену T-клеток CD4+ или CD8+, причем активацию специфичных к антигену T-клеток CD4+ или CD8+ оценивают посредством измерения статистически значимого повышения поверхностной экспрессии CD137 на специфичных к антигену T-клетках CD4+ или CD8+, а также связывает PD-1 яванского макака с равновесной константой диссоциации (KD) менее около 1 нМ, причем KD измеряют с помощью системы ProteOn XPR36 при +25°C.

Описанные в настоящем документе биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению можно оценивать по их способности усиливать активацию специфичных к антигену T-клеток CD4+ или CD8+, ингибировать связывание TIM-3 с галектином-9, а кинетику связывания с PD-1 или TIM-3 человека или яванского макака можно оценивать с помощью способов, описанных в настоящем документе.

Например, в качестве маркера активации специфичных к антигену T-клеток CD4+ или CD8+ можно применять CD137. Поверхностную экспрессию CD137 можно измерять на T-клетках, культивированных в присутствии или в отсутствие исследуемого антитела, такого как биспецифическое антитело PD-1/TIM3, с помощью антитела к CD137 и вторичного антитела, конъюгированного, например, с флуоресцентным красителем. Оценивают статистически значимое различие полученного сигнала на T-клетках, культивированных в присутствии или в отсутствие исследуемого антитела.

- 43 045238

В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело-антагонист PD-1/TIM-3 по изобретению связывает TIM-3 в пределах остатков 32-47 TIM-3 (WGKGACPVFECGNVVL) (SEQ ID NO:

261).

В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело-антагонист PD-1/TIM-3 по изобретению связывает TIM-3 в пределах остатков 32-47 TIM-3 (WGKGACPVFECGNVVL) (SEQ ID NO: 261) и остатков 50-56 (DERDVNY) SEQ ID NO: 262.

В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело-антагонист PD-1/TIM-3 по изобретению связывает TIM-3 в пределах остатков 90-102 TIM-3 (WGKGACPVFECGNVVL) (SEQ ID NO: 263).

В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело-антагонист PD-1/TIM-3 по изобретению связывает TIM-3 в пределах остатков 90-102 TIM-3 (WGKGACPVFECGNVVL) (SEQ ID NO: 263) и остатков 50-56 (DERDVNY) в SEQ ID NO: 262.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит определяющие комплементарность области тяжелой цепи (HCDR) 1, HCDR2 и HCDR3 с SEQ ID NO: 82, 83 и 84 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с SEQ ID NO: 82, 83 и 85 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит определяющие комплементарность области легкой цепи (LCDR) 1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 86, 87 и 88 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с SEQ ID NO: 82, 83 и 84 соответственно и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 86, 87 и 88 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с SEQ ID NO: 82, 83 и 85 соответственно и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 86, 87 и 88 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления второй домен содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 164, 165 и 166 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления второй домен содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 167, 168 и 169 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления второй домен содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 164, 165 и 166 соответственно и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с последовательностями аминокислот SEQ ID NO: 167, 168 и 169 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с

SEQ ID NO: 10, 13, 16, 20, 26 и 31 соответственно;

SEQ ID NO: 10, 13, 16, 21, 26 и 32 соответственно;

SEQ ID NO: 10, 14, 16, 22, 27 и 33 соответственно;

SEQ ID NO: 10, 14, 16, 22, 26 и 34 соответственно;

SEQ ID NO: 10, 14, 16, 23, 28 и 35 соответственно;

SEQ ID NO: 10, 13, 17, 20, 26 и 31 соответственно;

SEQ ID NO: 10, 13, 17, 20, 26 и 36 соответственно;

SEQ ID NO: 10, 13, 17, 21, 26 и 32 соответственно;

SEQ ID NO: 10, 13, 17, 21, 27 и 37 соответственно;

SEQ ID NO: 10, 13, 17, 23, 26 и 32 соответственно;

SEQ ID NO: 10, 13, 17, 22, 26 и 32 соответственно;

SEQ ID NO: 10, 13, 18, 20, 26 и 31 соответственно;

SEQ ID NO: 11, 15, 18, 20, 26 и 31 соответственно;

SEQ ID NO: 10, 13, 19, 20, 26 и 31 соответственно;

SEQ ID NO: 12, 13, 19, 20, 26 и 31 соответственно;

SEQ ID NO: 10, 14, 17, 23, 28 и 35 соответственно;

SEQ ID NO: 10, 14, 17, 22, 26 и 34 соответственно;

SEQ ID NO: 10, 14, 17, 23, 26 и 32 соответственно;

SEQ ID NO: 12, 13, 19, 24, 26 и 38 соответственно;

SEQ ID NO: 12, 13, 19, 20, 29 и 39 соответственно;

SEQ ID NO: 11, 15, 18, 20, 30 и 32 соответственно;

SEQ ID NO: 11, 15, 18, 25, 26 и 40 соответственно;

SEQ ID NO: 11, 15, 18, 24, 26 и 32 соответственно; или

SEQ ID NO: 66, 67, 68, 69, 70 и 71 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления второй домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с

SEQ ID NO: 90, 99, 107, 117, 126 и 135 соответственно;

SEQ ID NO: 91, 99, 108, 118, 127 и 136 соответственно;

SEQ ID NO: 91, 99, 109, 119, 128 и 137 соответственно;

SEQ ID NO: 92, 100, 110, 117, 126 и 135 соответственно;

SEQ ID NO: 93, 101, 111, 120, 129 и 139 соответственно;

- 44 045238

SEQ ID NO: 94, 102, 112, 121, 130 и 140 соответственно;

SEQ ID NO: 95, 103, 113, 122, 131 и 141 соответственно;

SEQ ID NO: 96, 104, 114, 123, 132 и 142 соответственно;

SEQ ID NO: 97, 105, 115, 124, 133 и 143 соответственно; или

SEQ ID NO: 98, 106, 116, 125, 134 и 144 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 63 или 64, причем VH необязательно имеет одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать консервативных аминокислотных замен. Необязательно любые замены не выполняются в рамках CDR.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VL с SEQ ID NO: 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 или 65, причем VL необязательно имеет одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать консервативных аминокислотных замен. Необязательно любые замены не выполняются в рамках CDR.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 63 или 64 и VL с SEQ ID NO: 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 и 65, причем VH, VL или VH и VL необязательно имеют одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать консервативных аминокислотных замен. Необязательно любые замены не выполняются в рамках CDR.

В некоторых вариантах осуществления второй домен содержит VH с SEQ ID NO: 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154 или 172, причем VH необязательно имеет одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать консервативных аминокислотных замен. Необязательно любые замены не выполняются в рамках CDR.

В некоторых вариантах осуществления второй домен содержит VL с SEQ ID NO: 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163 или 173, причем VL необязательно имеет одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать консервативных аминокислотных замен. Необязательно любые замены не выполняются в рамках CDR.

В некоторых вариантах осуществления второй домен содержит VH с SEQ ID NO: 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154 или 172 и VL с SEQ ID NO: 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163 или 173, причем VH и VL необязательно имеют одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать консервативных аминокислотных замен. Необязательно любые замены не выполняются в рамках CDR.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 41 и VL с SEQ ID NO: 49.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 41 и VL с SEQ ID NO: 50.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 42 и VL с SEQ ID NO: 51.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 42 и VL с SEQ ID NO: 52.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 42 и VL с SEQ ID NO: 53.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 43 и VL с SEQ ID NO: 49.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 43 и VL с SEQ ID NO: 54.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 43 и VL с SEQ ID NO: 50.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 43 и VL с SEQ ID NO: 55.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 43 и VL с SEQ ID NO: 56.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 43 и VL с SEQ ID NO: 57.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 44 и VL с SEQ ID NO: 49.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 45 и VL с SEQ ID NO: 49.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 46 и VL с SEQ ID NO: 49.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 47 и VL с SEQ ID NO: 49.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID

- 45 045238

NO: 53.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID NO: 52.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID NO: 56.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 47 и VL с SEQ ID NO: 58.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 47 и VL с SEQ ID NO: 59.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 45 и VL с SEQ ID NO: 60.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 45 и VL с SEQ ID NO: 61.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 45 и VL с SEQ ID NO: 62.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 63 и VL с SEQ ID NO: 65.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 64 и VL с SEQ ID NO: 65.

В некоторых вариантах осуществления второй домен содержит VH с SEQ ID NO: 145 и VL с SEQ ID NO: 155.

В некоторых вариантах осуществления второй домен содержит VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156.

В некоторых вариантах осуществления второй домен содержит VH с SEQ ID NO: 148 и VL с SEQ ID NO: 157.

В некоторых вариантах осуществления второй домен содержит VH с SEQ ID NO: 147 и VL с SEQ ID NO: 155.

В некоторых вариантах осуществления второй домен содержит VH с SEQ ID NO: 149 и VL с SEQ ID NO: 158.

В некоторых вариантах осуществления второй домен содержит VH с SEQ ID NO: 150 и VL с SEQ ID NO: 159.

В некоторых вариантах осуществления второй домен содержит VH с SEQ ID NO: 151 и VL с SEQ ID NO: 160.

В некоторых вариантах осуществления второй домен содержит VH с SEQ ID NO: 152 и VL с SEQ ID NO: 161.

В некоторых вариантах осуществления второй домен содержит VH с SEQ ID NO: 153 и VL с SEQ ID NO: 162.

В некоторых вариантах осуществления второй домен содержит VH с SEQ ID NO: 154 и VL с SEQ ID NO: 163.

В некоторых вариантах осуществления второй домен содержит VH с SEQ ID NO: 172 и VL с SEQ ID NO: 173.

В изобретении также предложено выделенное биспецифическое антитело-антагонист PD-1/TIM-3, которое содержит первый домен, специфически связывающий PD-1, и второй домен, специфически связывающий TIM-3, причем первый домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 14, 17, 23, 26 и 32 соответственно, а второй домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 91, 99, 108, 118, 127 и 136 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело-антагонист PD-1/TIM-3 связывает TIM-3 в пределах остатков 32-47 TIM-3 (WGKGACPVFECGNVVL) (SEQ ID NO: 261).

В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело-антагонист PD-1/TIM-3 связывает TIM-3 в пределах остатков 32-47 TIM-3 (WGKGACPVFECGNVVL) (SEQ ID NO: 261) и остатков 50-56 (DERDVNY) SEQ ID NO: 262.

В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело-антагонист PD-1/TIM-3 ингибирует связывание TIM-3 с галектином-9.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID NO: 56, а второй домен содержит VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156.

В некоторых вариантах осуществления антитело относится к изотипу IgG2, который содержит замены F405L и/или K409R.

- 46 045238

В некоторых вариантах осуществления антитело относится к изотипу IgG4, который содержит замены F405L и K409R.

В некоторых вариантах осуществления антитело относится к изотипу IgG4, который содержит замену S228P в тяжелой цепи по сравнению с IgG4 дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления выделенное биспецифическое антитело-антагонист PD1/TIM-3 содержит первую тяжелую цепь (HC1), первую легкую цепь (LC1), вторую тяжелую цепь (HC2) и вторую легкую цепь (LC2) с SEQ ID NO: 241, 188, 245 или 194 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления выделенное биспецифическое антитело-антагонист PD1/TIM-3 содержит HC1, LC1, HC2 и LC2 с SEQ ID NO: 186, 188, 191 или 194 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления выделенное биспецифическое антитело-антагонист PD1/TIM-3 содержит HC1, LC1, HC2 и LC2 с SEQ ID NO: 186, 188, 248 или 194 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления выделенное биспецифическое антитело-антагонист PD1/TIM-3 содержит HC1, LC1, HC2 и LC2 с SEQ ID NO: 243, 188, 246 или 194 соответственно.

Антитело приемлемо для применения в терапии субъекта, который получает или получал лечение антителом к PD-1, содержащим VH с SEQ ID NO: 230 и VL с SEQ ID NO: 231 (например, KEYTRUDA® (пембролизумаб)).

Антитело приемлемо для применения в терапии субъекта, который получает или получал лечение антителом к PD-1, содержащим VH с SEQ ID NO: 232 и VL с SEQ ID NO: 233 (например, OPDIVO® (ниволумаб)).

Антитело приемлемо для применения в терапии субъекта, который не поддается лечению антителом к PD-1, содержащим VH с SEQ ID NO: 230 и VL с SEQ ID NO: 231 (например, KEYTRUDA® (пембролизумаб)).

- 47 045238

Антитело приемлемо для применения в терапии субъекта, который не поддается лечению антителом к PD-1, содержащим VH с SEQ ID NO: 232 и VL с SEQ ID NO: 233 (например, OPDIVO® (ниволумаб)).

Антитело приемлемо для применения в терапии субъекта, который имеет рецидивирующую опухоль после лечения антителом к PD-1, содержащим VH с SEQ ID NO: 230 и VL с SEQ ID NO: 231 (например, KEYTRUDA® (пембролизумаб)).

Антитело приемлемо для применения в терапии субъекта, который имеет рецидивирующую опухоль после лечения антителом к PD-1, содержащим VH с SEQ ID NO: 232 и VL с SEQ ID NO: 233 (например, OPDIVO® (ниволумаб)).

В изобретении также предложено выделенное биспецифическое антитело-антагонист PD-1/TIM-3, которое содержит первый домен, специфически связывающий PD-1, и второй домен, специфически связывающий TIM-3, причем первый домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 66, 67, 68, 69, 70 и 71 соответственно, а второй домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 97, 105, 115, 124, 133 и 143 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело-антагонист PD-1/TIM-3 связывает TIM-3 в пределах остатков 90-102 TIM-3 (WGKGACPVFECGNVVL) (SEQ ID NO: 263).

В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело PD-1/TIM-3 связывает TIM-3 в пределах остатков 90-102 TIM-3 (RIQIPGIMNDEKF) (SEQ ID NO: 263) и остатков 50-56 (DERDVNY) в SEQ ID NO: 262.

В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело PD-1/TIM-3 ингибирует связывание TIM-3 с галектином-9.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 64 и VL с SEQ ID NO: 65, а второй домен содержит VH с SEQ ID NO: 153 и VL с SEQ ID NO: 162.

В некоторых вариантах осуществления выделенное биспецифическое антитело PD-1/TIM-3 содержит HC1, LC1, HC2 и LC2 с SEQ ID NO: 187, 189, 190 и 193 соответственно.

В изобретении также предложено выделенное биспецифическое антитело-антагонист PD-1/TIM-3, которое содержит первый домен, специфически связывающий PD-1, и второй домен, специфически связывающий TIM-3, причем первый домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 66, 67, 68, 69, 70 и 71 соответственно, а второй домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 91, 99, 108, 118, 127 и 136 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 64 и VL с SEQ ID NO: 65, а второй домен содержит VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156.

В некоторых вариантах осуществления выделенное биспецифическое антитело-антагонист PD1/TIM-3 содержит HC1, LC1, HC2 и LC2 с SEQ ID NO: 187, 189, 191 и 194 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления выделенное биспецифическое антитело PD-1/TIM-3 содер

- 48 045238 жит HC1, LC1, HC2 и LC2 с SEQ ID NO: 242, 189, 246 и 194 соответственно. В изобретении также предложено выделенное биспецифическое антитело-антагонист PD-1/TIM-3, которое содержит первый домен, специфически связывающий PD-1, и второй домен, специфически связывающий TIM-3, причем первый домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 14, 17, 23, 26 и 32 соответственно, а второй домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 97, 105, 115, 124, 133 и 143 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID NO: 56, а второй домен содержит VH с SEQ ID NO: 172 и VL с SEQ ID NO: 173.

В некоторых вариантах осуществления выделенное биспецифическое антитело-антагонист PD1/TIM-3 содержит HC1, LC1, HC2 и LC2 с SEQ ID NO: 186, 188, 192 и 195 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления выделенное биспецифическое антитело-антагонист PD1/TIM-3 содержит HC1, LC1, HC2 и LC2 с SEQ ID NO: 241, 188, 244 и 195 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления выделенное биспецифическое антитело-антагонист PD1/TIM-3 содержит HC1, LC1, HC2 и LC2 с SEQ ID NO: 243, 188, 247 и 195 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления антитело усиливает активацию специфичных к антигену Tклеток CD4+ или CD8+, причем активацию специфичных к антигену T-клеток CD4+ или CD8+ оценивают посредством измерения статистически значимого усиления поверхностной экспрессии CD137 на специфичных к антигену T-клетках CD4+ или CD8+ по способам, описанным в примере 14.

В изобретении также предложено выделенное биспецифическое антитело-антагонист PD-1/TIM-3, которое содержит первый домен, специфически связывающий PD-1, и второй домен, специфически связывающий TIM-3, причем первый домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 14, 17, 23, 26 и 32 соответственно, а второй домен содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 97, 105, 115, 124, 133 и 143 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления первый домен содержит VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID NO: 56, а второй домен содержит VH с SEQ ID NO: 153 и VL с SEQ ID NO: 156.

В некоторых вариантах осуществления выделенное биспецифическое антитело PD-1/TIM-3 содержит HC1, LC1, HC2 и LC2 с SEQ ID NO: 186, 188, 190 и 193 соответственно.

Примеры биспецифических антител-антагонистов PD-1/TIM-3 по изобретению, имеющих определенные последовательности VH, VL, HCDR и LCDR, показаны в табл. 4 и табл. 5.

- 49 045238

Таблица 4

шАЬ	Последовательности SEQ ID NO плеча, связывающего PD-
VH	VL	HCDR	1:	LCDR
			1	2	3	1	2	3
РТВВ14	48	56	10	14	17	23	26	32
РТВВ15	48	56	10	14	17	23	26	32
РТВВ16	64	65	66	67	68	69	70	71
РТВВ17	64	65	66	67	68	69	70	71
РТВВ24	48	56	10	14	17	23	26	32
РТВВЗО	48	56	10	14	17	23	26	32
РТВВ27	48	56	10	14	17	23	26	32
РТВВ28	48	56	10	14	17	23	26	32
РТВВ18	64	65	66	67	68	69	70	71
РТВВ20	48	56	10	14	17	23	26	32
РТВВ21	48	56	10	14	17	23	26	32

Таблица 5

mAb	Последовательности SEQ ID NO плеча, связывающего TIM3:
VH	VL	HCDR	LCDR2
1	2	3	1	2	3
РТВВ14	153	162	97	105	115	124	133	143
РТВВ15	146	156	91	99	108	118	127	136
РТВВ16	153	162	97	105	115	124	133	143
РТВВ17	146	156	91	99	108	118	127	136
РТВВ24	172	173	97	105	115	124	133	143
РТВВЗО	146	156	91	99	108	118	127	136
РТВВ27	172	173	97	105	115	124	133	143
РТВВ28	146	156	91	99	108	118	127	136
РТВВ18	146	156	91	99	108	118	127	136
РТВВ20	146	156	91	99	108	118	127	136
РТВВ21	172	173	97	105	115	124	133	143

Сконструированные и модифицированные антитела.

Антитела по изобретению могут быть дополнительно сконструированы с получением модифицированных антител с аналогичными или измененными свойствами по сравнению с исходными антителами. В антителах по изобретению могут быть сконструированы области VH, VL, VH и VL, константные области, каркас VH, каркас VL или любой или все из шести CDR.

Термин антитела по изобретению, применяемый в настоящем документе, относится к антителамантагонистам, специфически связывающим PD-1, к антителам-антагонистам, специфически связывающим TIM-3, и к биспецифическим антителам-антагонистам PD-1/TIM-3, которые содержат первый домен, специфически связывающий PD-1, и второй домен, специфически связывающий TIM-3 (например, биспецифические антитела PD-1/TIM-3), как описано в настоящем документе.

Антитела по изобретению могут быть сконструированы посредством прививания CDR. Одна или более последовательностей CDR антител по изобретению, описанных в настоящем документе, могут быть привиты на другую каркасную последовательность. Прививание CDR можно выполнить с помощью известных способов и способов, описанных в настоящем документе.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, или биспецифические антитела PD-1/TIM-3 по изобретению содержат VH, которая содержит HDCR1 с

- 50 045238

SEQ ID NO: 10, 11 или 12, HCDR2 с SEQ ID NO: 13, 14 или 15, HCDR3 с SEQ ID NO: 16, 17, 18 или 19, и

VL, которая содержит LCDR1 с SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23, 24 или 25, LCDR2 с SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29 или 30 и/или LcDr3 с SEQ ID NO: 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40, причем каркас VH получен из каркаса VH, отличного от VH1-69 (SEQ ID NO: 170), а каркас VL получен из каркаса VL, отличного от

IGKV3-11 (SEQ ID NO: 171).

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, или биспецифические антитела PD-1/TIM-3 по изобретению содержат HDCR1 с SEQ ID NO: 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 или 98, HCDR2 с SEQ ID NO: 99, 100, 101, 102, 10, 104, 105 или 106, HCDR3 с SEQ ID NO: 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115 или 116 и VL, содержащую LCDR1 с SEQ ID NO: 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124 или 125, LCDR2 с SEQ ID NO: 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 или 134 и/или LCDR3 с SEQ ID NO: 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143 или 144, причем каркас VH получен из каркаса VH генных последовательностей зародышевой линии человека, отличных от таковых в IGHV323 (SEQ ID NO: 174), IGHV1-02 (SEQ ID NO: 175), IGHV4-30-4 (SEQ ID NO: 176), IGHV1-03 (SEQ ID NO: 177), IGHV2-26 (SEQ ID NO: 178) или IGHV5-51 (SEQ ID NO: 179), а каркас VL получен из каркаса VL генных последовательностей зародышевой линии человека, отличных от таковых в IGKV3-20 (A27) (SEQ ID NO: 180), IGKV3-11 (L6) (SEQ ID NO: 171), IGKV4-1 (B3) (SEQ ID NO: 181), IGKV1-39 (012) (SEQ ID NO: 182) или IGKV1-33 (018) (SEQ ID NO: 183).

Применяемые каркасные последовательности могут быть получены из общедоступных баз данных ДНК или опубликованных источников, включающих в себя генные последовательности антител зародышевой линии. Например, последовательности ДНК и кодируемые белковые последовательности человеческих генов вариабельных областей легкой и тяжелой цепей зародышевой линии можно найти в международной информационной системе IMGT®, international ImMunoGeneTics information system® (http://_www-imgt_org). Каркасные последовательности, которые можно применять для замены существующих каркасных последовательностей в антителах по изобретению, могут быть такими, которые показывают наибольшую процентную идентичность с исходными каркасами по всей длине VH или VL или по длине FR1, FR2, FR3 и FR4. Кроме того, приемлемые каркасы можно дополнительно выбирать на основании VH и VL в отрезках CDR1 и CDR2 или идентичных LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1 и HCDR2 канонической структуры. Приемлемые каркасы можно выбирать с помощью известных способов, таких как адаптация для человеческого каркаса, описанная в патенте США № 8,748,356, или супергуманизация, описанная в патенте США № 7,709,226.

Каркасные последовательности исходных и сконструированных антител можно подвергать дополнительной модификации, например, посредством обратных мутаций, для восстановления и/или улучшения связывания полученного антитела с антигеном, как описано, например, в патенте США № 6,180,370. Каркасные последовательности исходных или сконструированных антител можно дополнительно подвергать модификациям посредством введения мутаций в одном или более остатках в пределах каркасной области или в пределах одной или более областей CDR для удаления T-клеточных эпитопов и, следовательно, снижения потенциальной иммуногенности антитела. Такой подход также называют деиммунизацией и он более подробно описан в патентной публикации США № US20070014796.

Остатки CDR антител по изобретению могут быть мутированы для повышения аффинности антител к PD-1, TIM-3 или PD-1 и TIM-3.

Остатки CDR антител по изобретению могут быть мутированы, например, для сведения к минимуму риска посттрансляционной модификации. Аминокислотные остатки предполагаемых мотивов для дезаминирования (NS), катализированного кислотой гидролиза (DP), изомеризации (DS) или окисления (W) можно замещать любой из природных аминокислот с целью мутагенеза мотивов, и полученные антитела можно проверять на их функциональность и стабильность с применением способов, описанных в настоящем документе.

В антителах по изобретению можно выполнять замены в Fc, чтобы модулировать эффекторные функции и фармакокинетические свойства антитела. В традиционной иммунной функции взаимодействие комплексов антитело-антиген с клетками иммунной системы приводит к широкому ряду ответов в диапазоне от эффекторных функций, таких как антителозависимая цитотоксичность, дегрануляция тучных клеток и фагоцитоз, до иммуномодулирующих сигналов, таких как регулирование пролиферации лимфоцитов и секреция антител. Все из этих взаимодействий инициируются посредством связывания домена Fc антител или иммунных комплексов со специализированными рецепторами клеточной поверхности на гемопоэтических клетках. Разнообразие клеточных ответов, запускаемых антителами и иммунными комплексами, происходит от структурной гетерогенности трех рецепторов Fc: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) и FcyRIII (CD16). FcyRI (CD64), FcyRIIA (CD32A) и FcyRIII (CD16) представляют собой активирующие рецепторы Fcy (т.е. усиливающие иммунную систему); FcyRIIB (CD32B) представляет собой ингибирующий рецептор Fcy (т.е. тормозящий иммунную систему). Связывание с рецептором FcRn модулирует период полужизни антитела.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты по изобретению содержат по меньшей мере одну замену в области Fc.

- 51 045238

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты по изобретению содержат один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или больше аминокислотных замен.

Положения в Fc, которые могут быть замещены для модуляции периода полужизни антитела, являются такими, которые, например, описаны в Dall'Acqua et al., (2006) J Biol Chem 281:23514-240; Zalevsky et al., (2010) Nat Biotechnol 28:157-159; Hinton et al., (2004) J Biol Chem 279 (8):6213-6216; Hinton et al., (2006) J Immunol 176:346-356; Shields et al. (2001) J Biol Chem 276:6591-6607; Petkova et al., (2006) Int Immunol 18:1759-1769; Datta-Mannan et al., (2007) Drug Metab Dispos 35:86-94, 2007; Vaccaro et al., (2005) Nat Biotechnol 23:1283-1288; Yeung et al., (2010) Cancer Res 70:3269-3277; Kim et al., (1999) Eur J Immunol 29: 2819, и включают в себя положения 250, 252, 253, 254, 256, 257, 307, 376, 380, 428, 434 и 435. Примерами замен, которые можно выполнять по отдельности или в комбинации, являются замены T250Q, M252Y, I253A, S254T, T256E, P257I, T307A, D376V, E380A, M428L, H433K, N434S, N434A, N434H, N434F, H435A и H435R. Примерами замен, которые можно выполнять по отдельности или в комбинации для увеличения периода полужизни антитела, являются замены M428L/N434S, M252Y/S254T/T256E, T250Q/M428L, N434A и T307A/E380A/N434A. Примерами замен, которые можно выполнять по отдельности или в комбинации для уменьшения периода полужизни антитела, являются замены H435A, P257I/N434H, D376V/N434H, M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, T308P/N434A и H435R.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению содержат в Fc антитела по меньшей мере одну замену в положениях аминокислот 250, 252, 253, 254, 256, 257, 307, 376, 380, 428, 434 или 435.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению содержат в Fc антитела по меньшей мере одну замену, которую выбирают из группы, состоящей из T250Q, M252Y, I253A, S254T, T256E, P257I, T307A, D376V, E380A, M428L, H433K, N434S, N434A, N434H, N434F, H435A и H435R.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению содержат в Fc антитела по меньшей мере одну замену, которую выбирают из группы, состоящей из M428L/N434S, M252Y/S254T/T256E, T250Q/M428L, N434A, T307A/E380A/N434A, H435A, P257I/N434H, D376V/N434H,

M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, T308P/N434A и H435R.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению содержат в Fc антитела по меньшей мере одну замену, которая уменьшает связывание антитела с активирующим рецептором Fcy (FcyR) и/или уменьшает эффекторные функции Fc, такие как связывание C1q, комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC), антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) или фагоцитоз (ADCP).

Положения в Fc, которые могут быть замещены для уменьшения связывания антитела с активирующим FcyR и, следовательно, для уменьшения эффекторной функции, являются такими, как, например, описанные в Shields et al., (2001) J Biol Chem 276:6591-6604; международной патентной публикации № WO2011/066501, патентах США № 6,737,056 и 5,624,821; Xu et al., (2000) Cell Immunol 200:16-26; Alegre et al., (1994) Transplantation 57:1537-1543; Bolt et al., (1993) Eur J Immunol 23:403-411; Cole et al., (1999) Transplantation 68:563-571; Rother et al., (2007) Nat Biotechnol 25:1256-1264; Ghevaert et al., (2008) J Clin Invest 118:2929-2938; An et al., (2009) mAbs, 1:572-579); и включают в себя положения 214, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 265, 267, 268, 270, 295, 297, 309, 327, 328, 329, 330, 331 и 365. Примерами замен, которые можно выполнять по отдельности или в комбинации, являются замены K214T, E233P, L234V, L234A, делеция G236, V234A, F234A, L235A, G237A, P238A, P238S, D265A, S267E, H268A, H268Q, Q268A, N297A, A327Q, P329A, D270A, Q295A, V309L, A327S, L328F, A330S и P331S в IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Примерами замен в комбинациях, которые позволяют получать антитела со снижением ADCC, являются замены L234A/L235A в IgG1, V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S в IgG2, F234A/L235A в IgG4, S228P/F234A/L235A в IgG4, N297A во всех изотипах Ig, V234A/G237A в IgG2, K214T/E233P/L234V/L235A/G236-делеция/A327G/P331А/D365E/L358M в IgG1,

H268Q/V309L/A330S/P331S в IgG2, S267E/L328F в IgG1, L234F/L235E/D265A в IgG1, L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S в IgG1, S228P/F234A/L235A/G237A/P238S в IgG4 и S228P/F234A/L235A/G236-делеция/G237A/P238S в IgG4. Можно также применять гибридные домены Fc IgG2/4, такие как Fc с остатками 117-260 из IgG2 и остатками 261-447 из IgG4.

Для усиления стабильности IgG4 в антителах IgG4 можно выполнять известную замену S228P.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению содержат замену в по меньшей мере одном положении остатка 214, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 265, 267, 268, 270, 295, 297, 309, 327, 328, 329, 330, 331 или 365, причем нумерация остатков соответствует каталогу EU.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению содержат по меньшей мере одну замену, которую выбирают из группы, состоящей из K214T, E233P, L234V, L234A, делеции G236, V234A, F234A, L235A, G237A, P238A, P238S, D265A, S267E, H268A, H268Q, Q268A, N297A, A327Q, P329A, D270A, Q295A, V309L, A327S, L328F, A330S и P331S, причем нумерация остатков соответствует каталогу EU.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению содержат замену в по меньшей

- 52 045238 мере одном положении остатка 228, 234, 235, 237, 238, 268, 330 или 331, причем нумерация остатков соответствует каталогу EU.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению содержат замену S228P, причем нумерация остатков соответствует каталогу EU.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению содержат замену V234A, причем нумерация остатков соответствует каталогу EU.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению содержат замену F234A, причем нумерация остатков соответствует каталогу EU.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению содержат замену G237A, причем нумерация остатков соответствует каталогу EU.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению содержат замену P238S, причем нумерация остатков соответствует каталогу EU.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению содержат замену H268A, причем нумерация остатков соответствует каталогу EU.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению содержат замену Q268A, причем нумерация остатков соответствует каталогу EU.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению содержат замену A330S, причем нумерация остатков соответствует каталогу EU.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению содержат замену P331S, причем нумерация остатков соответствует каталогу EU.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению содержат замены L234A, L235A, G237A, P238S, H268A, A330S и P331S, причем нумерация остатков соответствует каталогу EU.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению содержат замены V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S и P331S, причем нумерация остатков соответствует каталогу EU.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению содержат замены F234A, L235A, G237A, P238S и Q268A, причем нумерация остатков соответствует каталогу EU.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению содержат замены L234A, L235A или L234A и L235A, причем нумерация остатков соответствует каталогу EU.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению содержат замены F234A, L235A или F234A и L235A, причем нумерация остатков соответствует каталогу EU.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению содержат замены S228P, F234A и L235A, причем нумерация остатков соответствует каталогу EU.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению содержат в Fc антитела по меньшей мере одну замену, которая усиливает связывание антитела с рецептором Fcy (FcyR) и/или усиливает эффекторные функции Fc, такие как связывание C1q, комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC), антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) или фагоцитоз (ADCP).

В дополнение к своей иммуномодулирующей активности антитела PD-1 или TIM-3 по изобретению могут уничтожать опухолевые клетки, экспрессирующие PD-1 и/или TIM-3, непосредственно посредством антителоопосредованных эффекторных функций, например, ADCC, ADCP или CDC.

Положения в Fc, которые могут быть замещены для увеличения связывания антитела с активирующим Fcy и/или для усиления эффекторных функций антитела, являются такими, как, например, описанные в патенте США № 6,737,056; патентной публикации США № 2015/0259434; Shields et al., (2001) J Biol Chem 276:6591-6604; Lazar et al., (2006) Proc Natal Acad Sci 103:4005-4010; Stavenhagen et al., (2007) Cancer Res 67:8882-8890; Richards et al., (2008) Mol Cancer Ther 7:2517-2527; Diebolder et al., Science; опубликованных в сети Интернет 13 марта 2014 г.; doi:10.1126/science.1248943, и включают в себя положения 236, 239, 243, 256, 290, 292, 298, 300, 305, 312, 326, 330, 332, 333, 334, 345, 360, 339, 378, 396 или 430 (нумерация остатков соответствует каталогу EU). Примерами замен, которые можно выполнять по отдельности или в комбинации, являются G236A, S239D, F243L, T256A, K290A, R292P, S298A, Y300L, V305L, K326A, A330K, I332E, E333A, K334A, A339T и P396L. Примеры комбинаций замен, которые позволяют получать антитела с повышенными ADCC или ADCP, представляют собой замены S239D/I332E, S298A/E333A/K334A, F243L/R292P/Y300L, F243L/R292P/Y300L/P396L,

F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L и G236A/S239D/I332E в IgG1.

Положения в Fc, которые могут быть замещены для усиления CDC антитела, представляют собой описанные, например, в международной заявке на патент WO2014/108198, Idusogie et al., (2001) J Immunol 166:2571-2575 и Moore et al., (2010) Mabs, 2:181-189, и включают в себя положения 267, 268, 324, 326, 333, 345 и 430. Примерами замен, которые можно выполнять по отдельности или в комбинации, являются замены S267E, H268F, S324T, K326A, K326W, E333A, E345K, E345Q, E345R, E345Y, E430S, E430F и E430T. Примерами комбинаций замен, которые позволяют получать антитела с уменьшением CDC, являются замены K326A/E333A, K326W/E333A, H268F/S324T, S267E/H268F, S267E/S324T и S267E/H268F/S324T в IgG1.

Термины антителозависимая клеточная цитотоксичность, антителозависимая клеточно- 53 045238 опосредованная цитотоксичность или ADCC представляют собой механизм индукции гибели клеток, который зависит от взаимодействия покрытых антителами клеток-мишеней с эффекторными клетками, обладающими литической активностью, например, клетками-естественными киллерами, моноцитами, макрофагами и нейтрофилами, посредством гамма-рецепторов Fc (FcyR), экспрессирующихся на эффекторных клетках. Например, NK-клетки экспрессируют FcyRIIIa, тогда как моноциты экспрессируют FcyRI, FcyRII и FcyRIIIa. Гибель покрытых антителами клеток-мишеней, таких как PD-1- или TIM-3экспрессирующие клетки, происходит в результате активности эффекторных клеток посредством секреции мембранных порообразующих белков и протеаз. Для оценки активности ADCC антитела по описанному в настоящем документе изобретению антитело можно добавлять к клеткам, экспрессирующим TIM-3 или PD-1, в комбинации с иммунными эффекторными клетками, которые могут активироваться комплексами антиген-антитело, что приводит к цитолизу клетки-мишени. Цитолиз можно обнаруживать по высвобождению метки (например, радиоактивных субстратов, флуоресцентных красителей или природных внутриклеточных белков) из лизированных клеток. Примеры эффекторных клеток для таких анализов включают в себя мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) и NK-клетки. Примеры клеток-мишеней включают в себя клетки, экспрессирующие TIM-3 или PD-1 либо эндогенно, либо рекомбинантно. В примере анализа клетки-мишени применяли в соотношении 1 клетка-мишень на 50 эффекторных клеток. Клетки-мишени предварительно метили BATDA (Perkin-Elmer) в течение 20 минут при 37°C, дважды промывали и ресуспендировали в среде DMEM с 10% термоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина (все получены от компании Invitrogen). Клетки-мишени (1x104 клеток) и эффекторные клетки (0,5x106 клеток) объединяли и добавляли по 100 мкл клеток в лунки 96-луночной планшеты с U-образным дном. Дополнительно добавляли 100 мкл с исследуемыми антителами или без них. Планшеты центрифугировали при 200 g в течение 3 минут, инкубировали при 37°C в течение 2 часов, а затем повторно центрифугировали при 200 g в течение 3 минут. Отбирали в совокупности 20 мкл супернатанта на лунку и лизис клеток измеряли посредством добавления 200 мкл реагента DELPHIA на основе европия (PerkinElmer). Данные нормализовали по максимальной цитотоксичности с 0,67% Triton X-100 (Sigma Aldrich) и минимальному контролю, который определяли по высвобождению BATDA из клеток-мишеней в отсутствие любого антитела. Антитело по изобретению может индуцировать ADCC на уровне около 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100%.

Антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP) относится к механизму уничтожения покрытых антителами клеток-мишеней посредством интернализации фагоцитарными клетками, такими как макрофаги или дендритные клетки. ADCP можно оценивать с помощью моноцитарных макрофагов в качестве эффекторных клеток и клеток Дауди (ATCC® CCL-213™) или клеток B-клеточного лейкоза, или лимфомы, или опухолевых клеток, экспрессирующих TIM-3 или PD-1, в качестве клеток-мишеней, сконструированных с целью экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP) или другой меченой молекулы. Соотношение эффекторных клеток и клеток-мишеней может составлять, например, 4: 1. Эффекторные клетки можно инкубировать с клетками-мишенями в течение 4 часов с антителом по изобретению или без него. После инкубации клетки можно отделять с помощью аккутазы. Идентификацию макрофагов можно проводить с помощью антител к CD11b и к CD14, связанных с флуоресцентной меткой, а процентное значение фагоцитоза можно определять на основании % флуоресцентного GFP в макрофагах CD11+CD14+ с помощью стандартных способов. Антитело по изобретению может индуцировать ADCP на уровне около 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100%.

Комплемент-зависимая цитотоксичность, или CDC, относится к механизму индукции гибели клеток, в рамках которого эффекторный домен Fc связанного с мишенью антитела связывает и активирует компонент комплемента C1q, который, в свою очередь, активирует каскад комплемента, приводящий к гибели клетки-мишени. Активация комплемента может также приводить к осаждению компонентов комплемента на поверхности клетки-мишени, что упрощает ADCC посредством связывания на лейкоцитах рецепторов комплемента (например, CR3). CDC для клеток, экспрессирующих TIM-3 или PD-1, может измеряться, например, посредством высевания клеток Дауди при 1x105 клеток/лунка (50 мкл/лунка) в RPMI-B (RPMI с добавлением 1% BSA), добавления 50 мкл исследуемых антител в лунки до конечной концентрации в диапазоне 0-100 мкг/мл, инкубирования реакционной смеси в течение 15 мин при комнатной температуре, добавления 11 мкл пулированной человеческой сыворотки в лунки и инкубирования реакционной смеси в течение 45 мин при 37°C. Процентное значение (%) лизированных клеток может определяться как % окрашенных пропидий йодидом клеток в анализе FACS с помощью стандартных способов. Антитела по изобретению могут индуцировать CDC на уровне около 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100%.

Способность антител по описанному в настоящем документе изобретению индуцировать ADCC можно усиливать посредством конструирования их олигосахаридного компонента. IgG1 или IgG3 человека подвергаются N-гликозилированию по Asn297 большинством гликанов в известных 2-антенарных формах G0, G0F, G1, G1F, G2 или G2F. Антитела, продуцируемые несконструированными клетками

- 54 045238

CHO, как правило, имеют содержание фукозы в гликанах около по меньшей мере 85%. Удаление центральной фукозы из олигосахаридов типа 2-антенарного комплекса, присоединенных к областям Fc, усиливает ADCC антител посредством улучшенного связывания FcyRIIIa без изменения связывания с антигеном или активности CDC. Такие mAb можно получать с помощью разных способов, которые, по имеющимся данным, приводят к успешной экспрессии антител с относительно высокой степенью дефукозилирования, несущих Fc-олигосахариды типа 2-антенарного комплекса, таких как контроль осмоляльности культуры (Konno et al., (2012) Cytotechnology 64:249-65), применение в качестве линии клеток-хозяев вариантной линии CHO Lec13 (Shields et al., (2002) J Biol Chem 277:26733-26740), применение в качестве линии клеток-хозяев вариантной линии клеток CHO EB66 (Olivier et al., MAbs;2(4), 2010; электронное издание до печатного издания; PMID: 20562582), применение гибридомной клеточной линии крысы YB2/0 в качестве линии клеток-хозяев (Shinkawa et al., (2003) J Biol Chem 278:3466-3473), встраивание малой интерферирующей РНК, специфичной к гену а-1,6-фукозилтрансферазы (FUT8) (Mori et al., (2004) Biotechnol Bioeng 88:901-908), или коэкспрессия в-1,4-М-ацетилглюкозаминилтрансферазы III и αманнозидазы II комплекса Гольджи, или применение мощного ингибитора альфа-маннозидазы I, кифунензина (Ferrara et al., (2006) J Biol Chem 281:5032-5036; Ferrara et al., (2θΟ6) Biotechnol Bioeng 93:851861; Xhou et al., (2008) Biotechnol Bioeng 99:652-65).

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению содержат в Fc антитела по меньшей мере одну замену, которая усиливает эффекторную функцию антитела.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению содержат в Fc антитела по меньшей мере одну замену в положении аминокислот 236, 239, 243, 256, 267, 268, 290, 292, 298, 300, 305, 312, 324, 326, 330, 332, 333, 334, 345, 360, 339, 378, 396 или 430.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению содержат в Fc антитела по меньшей мере одну замену, которую выбирают из группы, состоящей из G236A, S239D, F243L, T256A, K290A, R292P, S298A, Y300L, V305L, K326A, A330K, I332E, E333A, K334A, A339T, P396L, S267E, H268F, S324T, K326A, K326W, E333A, E345K, E345Q, E345R, E345Y, E430S, E430F и Е43ОТ.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению содержат в Fc антитела по меньшей мере одну замену, которую выбирают из группы, состоящей из S239D/I332E, S298A/E333A/K334A, F243L/R292P/Y300L, F243L/R292P/Y300L/P396L, F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L,

G236A/S239D/I332E, K326A/E333A, K326W/E333A, H268F/S324T, S267E/H268F, S267E/S324T и S267E/H268F/S324T.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению имеют 2-антенарную структуру гликана с содержанием фукозы от около 0% до около 15%, например, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или 0%.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению имеют 2-антенарную структуру гликана с содержанием фукозы около 50%, 40%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или 0%.

Замены в Fc и сниженное содержание фукозы могут усиливать активность ADCC антителантагонистов, специфически связывающих TIM-3 или PD-1, по изобретению. Антитела TIM-3 или PD-1 с усиленной активностью ADCC, ADCP и/или CDC можно использовать в лечении пациентов с опухолями, экспрессирующими TIM-3 и/или PD-1, включая злокачественные заболевания крови.

Термин содержание фукозы означает количество моносахарида фукозы в пределах сахаридной цепи в положении Asn297. Относительное количество фукозы представляет собой процентное содержание фукозосодержащих структур, относящихся ко всем гликоструктурам. Они могут быть охарактеризованы и количественно определены множеством способов, например: 1) с применением метода частоты оборота матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (MALDI-TOF) в пробе, обработанной N-гликозидазой F (например, в комплексных, гибридных, олиго- и высокоманнозных структурах), как описано в международной патентной публикации № WO2008/077546; 2) посредством ферментативного высвобождения гликанов Asn297 с последующей дериватизацией и обнаружением/количественным определением с помощью ВЭЖХ (СВЭЖХ) с флуоресцентным обнаружением и/или ВЭЖХ-МС (СВЭЖХМС); 3) анализа интактного белка нативного или восстановленного mAb с обработкой или без обработки гликанов Asn297 ферментом Endo S или другим ферментом, который расщепляет связь между первым и вторым моносахаридами GlcNAc, сохраняя фукозу присоединенной к первому GlcNAc; 4) расщепления mAb на составляющие пептиды посредством ферментативного расщепления (например, трипсином или эндопептидазой Lys-C) и последующим разделением, обнаружением и количественным определением посредством ВЭЖХ-МС (СВЭЖХ-МС); или 5) отделения олигосахаридов mAb от белка mAb на Asn 297 посредством специфического ферментативного дегликозилирования с помощью PNGase F. Высвобожденные олигосахариды можно метить флуорофором, разделять и идентифицировать различными вспомогательными методиками, которые позволяют точно охарактеризовать структуры гликанов посредством масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI) посредством сравнения экспериментальных масс с теоретическими массами, определить степень сиалилирования с помощью ионообменной ВЭЖХ (GlycoSep C), разделить и количественно оценить формы олигосаха- 55 045238 ридов по критерию гидрофильности с помощью ВЭЖХ с обычной фазой (GlycoSep N), а также разделить и количественно оценить формы олигосахаридов с помощью высокоэффективного капиллярного электрофореза с лазер-индуцированной флуоресценцией (HPCE-LIF).

Термины низкофукозный или с низким содержанием фукозы относятся к антителам с содержанием фукозы около 0-15%.

Выражения нормофукозный или с нормальным содержанием фукозы относятся к антителам с содержанием фукозы более около 50%, как правило, более около 60%, 70%, 80% или более 85%.

Антитела по изобретению могут быть модифицированы посттрансляционно в рамках процессов, таких как гликозилирование, изомеризация, дегликозилирование или ковалентная модификация неприродного происхождения, такая как присоединение фрагментов полиэтиленгликоля (пегилирование) или липидизация. Такие модификации могут выполняться in vivo или in vitro. Например, антитела по изобретению, описанные в настоящем документе, можно конъюгировать с полиэтиленгликолем (пегилировать) для усовершенствования их фармакокинетических профилей. Конъюгация может быть выполнена методиками, известными специалистам в данной области. Показано, что конъюгация терапевтических антител с ПЭГ улучшает фармакодинамику, в то же время не влияя на функции (Knigh et al., (2004) Platelets 15:409-18; Leong et al., (2001) Cytokine 16:106-19; Yang et al., (2003) Protein Eng 16:761-70).

Антитела по изобретению могут быть модифицированы с целью улучшения стабильности, селективности, перекрестной реактивности, аффинности, иммуногенности или достижения других желательных биологических или биофизических свойств, что также находится в рамках объема изобретения. На стабильность антитела влияет ряд факторов, включая (1) внутреннюю укладку отдельных доменов, влияющую на их собственную стабильность; (2) поверхностные взаимодействия белок/белок, влияющие на объединение в пары HC и LC; (3) глубину расположения полярных и заряженных остатков; (4) сеть Hмостиков между полярными и заряженными остатками; и (5) поверхностный заряд и распределение полярных остатков наряду с другими внутри- и межмолекулярными взаимодействиями (Worn et al., (2001) J Mol Biol 305:989-1010). Остатки, способные дестабилизировать структуру, можно выявить на основании кристаллической структуры антитела или в определенных случаях путем молекулярного моделирования, а влияние остатков на стабильность антитела можно исследовать путем создания и оценки вариантов, содержащих мутации в выявленных остатках. Один из способов повышения стабильности антитела заключается в увеличении средней температуры перехода (Tm), измеряемой с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC). Как правило, Tm белка имеет положительную корреляцию с его стабильностью и отрицательную корреляцию с его подверженностью нарушениям третичной структуры и денатурации в растворах, а также деградации, которая зависит от склонности белка к нарушению третичной структуры (Remmele et al (2000) Biopharm 13:36-46). В ряде исследований была установлена корреляция между степенью физической стабильности составов, измеренной как термостабильность с помощью DSC, и измерениями физической стабильности, проведенными другими способами (Gupta et al., (2003) AAPS PharmSci 5E8; Zhang et al., (2004) J Pharm Sci 93:3076-89; Maa et al., (1996) Int J Pharm 140:155-68; Bedu-Addo et al., (2004) Pharm Res 21:1353-61; Remmele et al., (1997) Pharm Res 15:200-8). Результаты исследований состава позволяют предположить, что Tm Fab влияет на долговременную физическую стабильность соответствующего моноклонального антитела (mAb).

Циркулирующие эндогенные карбоксипептидазы могут удалять C-концевой лизин (CTL) из введенных антител (Cai et al., (2011) Biotechnol Bioeng 108:404-412). Удаление CTL во время изготовления можно контролировать на уровне менее максимального посредством контроля концентрации внеклеточного Zn2+, ЭДТА или ЭДТА-Fe3+, как описано в патентной публикации США № US20140273092. Содержание CTL в антителах можно измерять с помощью известных способов.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению имеют содержание C-концевого лизина от около 10% до около 90%, от около 20% до около 80%, от около 40% до около 70%, от около 55% до около 70% или около 60%.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению имеют содержание C-концевого лизина около 0%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%.

Способы создания гомологичных антител, антител с консервативными модификациями, а также сконструированных и модифицированных антител.

Антитела по изобретению, которые имеют измененные аминокислотные последовательности по сравнению с исходными антителами, можно создать с помощью стандартных технологий клонирования и экспрессии. Например, можно выполнять направленный точечный мутагенез или ПЦРопосредованный мутагенез с целью встраивания мутации(й), а влияние на связывание антитела или на другое целевое функциональное свойство можно оценивать известными способами и способами, описанными в примерах в настоящем документе.

Аллотипы антител.

Антитело по изобретению может относиться к изотипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.

В некоторых вариантах осуществления антитело по изобретению относится к изотипу IgG1.

В некоторых вариантах осуществления антитело по изобретению относится к изотипу IgG2.

В некоторых вариантах осуществления антитело по изобретению относится к изотипу IgG3.

- 56 045238

В некоторых вариантах осуществления антитело по изобретению относится к изотипу IgG4.

Иммуногенность терапевтических антител связана с повышенным риском реакций на инфузию и сниженной длительностью терапевтического ответа (Baert et al., (2003) N Engl J Med 348:602-08). Степень, с которой терапевтические антитела индуцируют иммунный ответ в организме-хозяине, отчасти может определяться аллотипом антитела (Stickler et al., (2011) Genes and Immunity 12:213-21). Аллотип антитела связан с вариациями аминокислотной последовательности в конкретных положениях в последовательностях константных областей антитела.

В табл. 6 показаны выбранные аллотипы IgG1, IgG2 и IgG4.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению относятся к аллотипу G2m(n), G2m(n-), G2m(n)/(n-), nG4m(a), G1m(17) или G1m(17,1).

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению относятся к аллотипу G2m(n), G2m(n-), G2m(n)/(n-), nG4m(a), G1m(17) или G1m(17,1).

В некоторых вариантах осуществления биспецифические антитела PD-1/TIM-3 по изобретению относятся к аллотипу G2m(n), G2m(n-), G2m(n)/(n-), nG4m(a), G1m(17) или G1m(17,l).

Таблица 6

Аллотип Аминокислотный остаток в положении различия

	(нумерация остатков: по каталогу EU)
	IgG2	IgG4	IgGl
	189	282	309	422	214	356	358	431
G2m(n)	T	Μ
G2m(n-)	P	V
G2m(n)/ (n-)	T	V
nG4m(a)			L	R
Glm(17)					К	E	M	A
Glm(17,1)					К	D	L	A

Антиидиотипические антитела.

В настоящем изобретении предложено антиидиотипическое антитело, связывающееся с антителом по изобретению.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающееся с антителом к PD-1 по изобретению.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 41 и VL с SEQ ID NO: 49.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 41 и VL с SEQ ID NO: 50.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 42 и VL с SEQ ID NO: 51.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 42 и VL с SEQ ID NO: 52.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 42 и VL с SEQ ID NO: 53.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 43 и VL с SEQ ID NO: 49.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 43 и VL с SEQ ID NO: 54.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 43 и VL с SEQ ID NO: 50.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 43 и VL с SEQ ID NO: 55.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 43 и VL с SEQ ID NO: 56.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 43 и VL с SEQ ID NO: 57.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 44 и VL с SEQ ID NO: 49.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 45 и VL с SEQ ID NO: 49.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 46 и VL с SEQ ID NO: 49.

- 57 045238

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 47 и VL с SEQ ID NO: 49.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID NO: 53.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID NO: 52.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID NO: 56.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 47 и VL с SEQ ID NO: 58.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 47 и VL с SEQ ID NO: 59.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 45 и VL с SEQ ID NO: 60.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 45 и VL с SEQ ID NO: 61.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 45 и VL с SEQ ID NO: 62.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 63 и VL с SEQ ID NO: 65.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 64 и VL с SEQ ID NO: 65.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело-антагонист, которое специфически связывает TIM-3, по изобретению.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 145 и VL с SEQ ID NO: 155.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 148 и VL с SEQ ID NO: 157.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 147 и VL с SEQ ID NO: 155.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 149 и VL с SEQ ID NO: 158.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 150 и VL с SEQ ID NO: 159.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 151 и VL с SEQ ID NO: 160.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 152 и VL с SEQ ID NO: 161.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 153 и VL с SEQ ID NO: 162.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 154 и VL с SEQ ID NO: 163.

В некоторых вариантах осуществления набор содержит антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, которое содержит VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID NO: 56.

В некоторых вариантах осуществления набор содержит антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, которое содержит VH с SEQ ID NO: 64 и VL с SEQ ID NO: 65.

В изобретении также предложено антиидиотипическое антитело, специфически связывающее антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 172 и VL с SEQ ID NO: 173.

В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело применяется для обнаружения уровня терапевтических антител (например, антител к PD-1, к TIM-3 или биспецифических антител PD-1/TIM-3 по изобретению, описанных в настоящем документе) в пробе.

Антиидиотипическое (Id) антитело представляет собой антитело, распознающее антигенные детерминанты (например, паратоп или CDR) антитела. Id-антитело может быть блокирующим или неблокирующим антиген. С помощью блокирующего антиген Id можно обнаруживать свободное антитело в пробе (например, антитело к PD-1, к TIM-3 или биспецифическое антитело PD-1/TIM-3 по изобретению, описанное в настоящем документе). Неблокирующее Id-антитело можно применять для обнаружения всех антител (свободных, частично связанных с антигеном или полностью связанных с антигеном) в пробе. Id-антитело можно готовить посредством иммунизации животного антителом, для которого готовят анти-Id-антитело.

Анти-Id-антитело также можно применять в качестве иммуногена для индукции иммунного ответа

- 58 045238 у еще одного животного, получая так называемое анти-анти-И-антитело. Анти-анти-Id-антитело может быть эпитопно идентичным первоначальному mAb, которое индуцировало анти-Id. Таким образом, применяя антитела к идиотипическим детерминантам mAb, можно выявлять другие клоны, экспрессирующие антитела идентичной специфичности. Антитела анти-Id можно подвергать вариациям (таким образом получая варианты антитела анти-Id) и/или получению производных любой приемлемой методикой из тех, что описаны в других разделах настоящего документа в отношении антител, специфически связывающих PD-1 или TIM-3 или биспецифических антител PD-1/TIM-3.

Иммуноконъюгаты.

Термин иммуноконъюгат означает антитело по изобретению, конъюгированное с одной или более гетерологичными молекулами.

В некоторых вариантах осуществления антитело по изобретению конъюгировано с одним или более цитотоксическими агентами или визуализирующими агентами.

Примеры цитотоксических агентов включают в себя химиотерапевтические агенты или лекарственные средства, ингибирующие рост агенты, токсины (например, белковые токсины, ферментативноактивные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения или их фрагменты) и радионуклиды.

Цитотоксический агент может представлять собой одно или более лекарственных средств, таких как майтанзиноид (см., например, патенты США № 5,208,020, 5,416,06), ауристатин, например, монометилауристатиновые функциональные группы DE и DF (MMAE и MMAF) лекарственных средств (см., например, патенты США № 5,635,483, 5,780,588 и 7,498,298), доластатин, калихеамицин или их производные (см., например, патенты США № 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001 и 5,877,296; Hinman et al., (1993) Cancer Res 53:3336-3342 и Lode et al., (1998) Cancer Res 58:2925-2928); антрациклин, такой как дауномицин или доксорубицин (см., например, Kratz et al., (2006) Current Med. Chem 13:477-523; Jeffrey et al., (2006) Bioorganic & Med Chem Letters 16:358-362; Torgov et al., (2005) Bioconj Chem 16:717-721; Nagy et al., (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97:829-834; Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12: 1529-1532 (2002); King et al., (2002) J Med Chem 45:4336-4343 и патент США № 6,630,579), метотрексат, виндезин, таксан, такой как доцетаксел, паклитаксел, ларотаксел, тезетаксел и ортатаксел.

Цитотоксический агент может также представлять собой ферментативно-активный токсин или его фрагмент, такой как A-цепь дифтерии, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, Aцепь экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), A-цепь рицина, A-цепь модекцина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, диантины, белки Phytolacca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трихотецены.

Цитотоксический агент или визуализирующий агент может также представлять собой радионуклид. Примеры радионуклидов включают в себя Ac-225, At-211, I-131, 1-125, Y-90, Re-186, Re-188, Sm-153, Bi212, P-32, Pb-212 и радиоактивные изотопы Lu. При применении для обнаружения радиоконъюгата он может содержать радиоактивный атом для сцинтиграфических исследований, например, Tc-99m или I123, или спиновую метку для визуализации с использованием ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (также известна как магнитно-резонансная томография (МРТ)), например, I-123, I-131, In-111, F-19, C-13, N-15 или O-17.

Конъюгаты антител по изобретению и гетерологичных молекул могут быть получены с применением разнообразных бифункциональных агентов сочетания белков, таких как N-сукцинимидил-3-(2пиридилдитиол)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-мαлеимидометил)циклогексан-1 -карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные сложных имидоэфиров (таких как диметиладипимидат HQ), активных сложных эфиров (таких как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидных соединений (таких как бис-(п-азидобензоил)гександиамин), производных бис-диазония (таких как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианатов (таких как толуол-2,6диизоцианат) и бис-активных соединений фтора (таких как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин рицин можно готовить так, как описано в Vitetta et al., (1987) Science 238: 1098. Меченный углеродом-14 l-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA) является примером хелатирующего агента для конъюгации радионуклида с антителом. См., например, W094/11026. Линкер может представлять собой отщепляемый линкер, способствующий высвобождению цитотоксического лекарственного средства в клетке. Например, можно применять кислотонеустойчивый линкер, чувствительный к пептидазам линкер, фотолабильный линкер, диметиловый линкер или дисульфид-содержащий линкер (Chari et al., (1992) Cancer Res 52: 127-131; патент США № 5,208,020).

Конъюгаты антител по изобретению и гетерологичной молекулы можно готовить с помощью перекрестно-сшивающих реагентов, таких как BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфоSIAB, сульфо-SMCC, сульфо- SMPB и SVSB (сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоат), которые доступны в продаже (например, от компании Pierce Biotechnology, Inc., г. Рокфорд, штат Иллинойс, США).

- 59 045238

В изобретении также предложен иммуноконъюгат, который содержит антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, по изобретению, сцепленное с терапевтическим агентом или визуализирующим агентом.

В изобретении также предложен иммуноконъюгат, который содержит антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, по изобретению, сцепленное с терапевтическим агентом или визуализирующим агентом.

В изобретении также предложен иммуноконъюгат, который содержит биспецифическое антитело PD-1/TIM-3 по изобретению, связанное с терапевтическим агентом или визуализирующим агентом.

Создание моноспецифических антител по изобретению.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению являются человеческими.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению являются гуманизированными.

Моноспецифические антитела по изобретению, описанные в настоящем документе (например, антитела, специфически связывающие PD-1 или TIM-3), можно создавать с применением разнообразных технологий. Например, для создания моноклональных антител можно применять способ гибридом по Kohler and Milstein, Nature 256:495, 1975. В способе гибридом мышь или другое животное-хозяина, например, хомяка, крысу или обезьяну, иммунизируют PD-1 или TIM-3 человека или яванского макака либо фрагментами PD-1 или TIM-3, такими как внеклеточные домены PD-1 или TIM-3, с последующим слиянием спленоцитов от иммунизированных животных с клетками миеломы с применением стандартных способов с образованием клеток гибридомы (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Колонии, возникающие из одиночных клеток иммортализованной гибридомы, подвергают скринингу на основании продукции антител с желательными свойствами, такими как специфичность связывания, перекрестная реактивность или ее отсутствие и аффинность к антигену.

Для получения антител по изобретению можно применять разнообразных животных-хозяев. Например, для создания мышиных антител к человеческому PD-1 или TIM-3 можно применять мышей Balb/c. Антитела, полученные от мышей линии Balb/c и от других животных, отличных от человека, могут быть гуманизированы с применением разнообразных технологий для создания последовательностей, имеющих большее сходство с человеческими последовательностями.

Примеры методик гуманизации, включающих в себя отбор человеческих акцепторных каркасов, известны и включают в себя прививание CDR (патент США № 5,225,539), прививание SDR (патент США № 6,818,749), изменение поверхности (Padlan, (1991) Mol Immunol 28:489-499), изменение поверхности определяющих специфичность остатков (патентная публикация США № 2010/0261620), адаптацию человеческого каркаса (патент США № 8,748,356) или супергуманизацию (патент США № 7,709, 226). В этих способах CDR исходных антител переносят на человеческие каркасы, которые можно выбирать на основании их общей гомологии с исходными каркасами, на основании сходства длины CDR или идентичности канонической структуры либо их комбинации.

Гуманизированные антитела могут быть дополнительно оптимизированы с улучшением их селективности или аффинности к желательному антигену посредством включения измененных остатков, поддерживающих каркас, с сохранением аффинности связывания (обратных мутаций) такими методиками, которые описаны в международных патентных публикациях № WO1090/007861 и WO1992/22653, или посредством встраивания вариации в любую из CDR, например, для улучшения аффинности антитела.

Для получения человеческих антител против белка-мишени можно применять трансгенных животных, несущих в своем геноме локусы иммуноглобулинов (Ig) человека, таких как мыши или крысы, которые описаны, например, в патенте США № 6,150,584, международной патентной публикации № WO99/45962, международных патентных публикациях № WO2002/066630, WO2002/43478, WO2002/043478 и WO1990/04036; Lonberg et al (1994) Nature 368:856-9; Green et al. (1994) Nature Genet. 7:13-21; Green & Jakobovits (1998) Exp. Med. 188:483-95; Lonberg and Huszar (1995) Int Rev Immunol 13:65-93; Bruggemann et al., (1991) Eur J Immunol 21:1323-1326; Fishwild et al., (1996) Nat Biotechnol 14:845-851; Mendez et al., (1997) Nat Genet 15:146-156; Green (1999) J Immunol Methods 231:11-23; Yang et al., (1999) Cancer Res 59:1236-1243; Buggemann and Taussig (1997) Curr Opin Biotechnol 8:455-458. Эндогенные локусы иммуноглобулинов у таких животных можно разорвать или удалить, и в геном животного можно встроить по меньшей мере один полный или частичный локус иммуноглобулина человека посредством гомологичной или негомологичной рекомбинации, с применением трансхромосом или с применением минигенов. Для получения человеческих антител, направленных против выбранного антигена, с применением описанной выше технологии можно привлекать такие компании, как Regeneron (http://_www_regeneron_com), Harbour Antibodies (http://_www_harbourantibodies_com), Open Monoclonal Technology, Inc. (OMT) (http://_www_omtinc_net), KyMab (http://_www_kymab_com), Trianni (http://_www.trianni_com) и Ablexis (http://_www_ablexis_com).

Человеческие антитела можно выбирать из библиотеки фагового дисплея, причем фаг сконструирован с возможностью экспрессии человеческих иммуноглобулинов или их участков, таких как Fab, одноцепочечные антитела (scFv) или неспаренные либо спаренные вариабельные области антител (Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296:57-86; Krebs et al., (2001) J Immunol Meth 254:67-84; Vaughan et al., (1996) Nature Biotechnology 14:309-314; Sheets et al., (1998) PITAS (USA) 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter (1991) J

- 60 045238

Mol Biol 227:381; Marks et al., (1991) J Mol Biol 222:581). Антитела по изобретению могут быть выделены, например, из библиотеки фагового дисплея, экспрессирующей вариабельные области тяжелой и легкой цепей антитела в виде гибридных белков с белком оболочки бактериофага pIX, как описано в публикации Shi et al., (2010) J Mol Biol 397:385-96 и в международной патентной публикации № WO09/085462). В библиотеках можно проводить скрининг на связывание фагов с PD-1 или TIM-3 человека и/или яванского макака, и полученные положительные клоны могут быть дополнительно охарактеризованы; из лизатов клонов могут быть выделены Fab и экспрессированы в виде полноразмерных IgG. Такие способы использования фагового дисплея для выделения человеческих антител описаны, например, в патентах США № 5,223,409, 5,403,484, 5,571,698, 5,427,908, 5,580,717, 5,969,108, 6,172,197, 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 и 6,593,081.

Подготовка иммуногенных антигенов и продукция моноклональных антител могут быть выполнены с применением любой приемлемой методики, такой как продукция рекомбинантного белка. Иммуногенные антигены можно вводить животным в форме очищенного белка или белковых смесей, включающих в себя цельные клетки или клеточные либо тканевые экстракты, или антиген может быть образован de novo в организме животного из нуклеиновых кислот, кодирующих указанный антиген или его участок.

Создание биспецифических антител PD-1/TIM-3 по изобретению.

Биспецифические антитела PD-1/TIM-3 по изобретению (например, биспецифические антитела, которые содержат первый домен, специфически связывающий PD-1, и второй домен, специфически связывающий TIM-3) можно создавать посредством комбинирования связывающих PD-1 доменов VH/VL и связывающих TIM-3 доменов VH/VL, выделенных и охарактеризованных в настоящем документе. Альтернативно биспецифические антитела PD-1/TIM-3 можно конструировать с применением доменов VH/VL из доступных в открытых источниках моноспецифических антител к PD-1 и к TIM-3 и/или посредством соединения связывающих PD-1 или TIM-3 доменов VH/VL, указанных в настоящем документе, с доступными в открытых источниках связывающими PD-1 или TIM-3 доменами VH/VL.

Примерами антител к PD-1, которые можно применять для конструирования биспецифических молекул PD-1/TIM-3, являются, например, описанные в патентах США № 5,897,862 и 7,488,802, и международных патентных публикациях № WO2004/004771, WO2004/056875, WO2006/121168,

WO2008/156712, WO2010/029435, WO2010/036959, WO2011/110604, WO2012/145493, WO2014/194302, WO2014/206107, WO2015/036394, WO2015/035606, WO2015/085847, WO2015/112900 и WO2015/112805. Например, можно применять домены VH/VL из KEYTRUDA® (пембролизумаб) и OPDIVO® (ниволумаб). Эти домены VH/VL PD-1 можно встраивать в биспецифические антитела, которые содержат связывающие TIM-3 домены VH/VL, описанные в настоящем документе и в табл. 3. Например, домены VH/VL антител TIM-3 TM3B103, TM3B105, TM3B107, TM3B108, TM3B109, TM3B113, TM3B189, TM3B190 и TM3B196, описанных в настоящем документе, можно применять для создания биспецифических антител PD-1/TIM-3.

Аналогичным образом, примерами антител к TIM-3, которые можно применять для конструирования биспецифических молекул PD-1/TIM-3, являются, например, описанные в международных патентных публикациях № WO2011/155607, WO2013/006490 и WO2015/117002. Эти домены VH/VL TIM-3 можно встраивать в биспецифические антитела, которые содержат связывающие PD-1 домены VH/VL, описанные в настоящем документе и в табл. 2. Например, домены VH/VL антител PD-1 PD1B114, PD1B149, PD1B160, PD1B162, PD1B164, PD1B11, PD1B183, PD1B184, PD1B185, PD1B187, PD1B192, PD1B71, PD1B177, PD1B70, PD1B175, PD1B194, PD1B195, PD1B196, PD1B197, PD1B198, PD1B199, PD1B200, PD1B201, PD1B131 и PD1B132, описанных в настоящем документе, можно применять для создания биспецифических антител PD-1/TIM-3.

Созданные биспецифические антитела PD-1/TIM-3 можно исследовать на их связывание с PD-1 и TIM-3, а также на их желательные функциональные характеристики, такие как усиление активации специфичных к антигену T-клеток CD4+ и CD4+, с помощью способов, описанных в настоящем документе.

Биспецифические антитела по изобретению содержат антитела, имеющие полноразмерную структуру антитела.

Полноразмерные биспецифические антитела можно создавать, например, посредством обмена Fabплечами (например, посредством обмена полумолекулами, обмена пары тяжелая цепь - легкая цепь) между двумя моноспецифическими двухвалентными антителами, встраивая в CH3-интерфейс тяжелой цепи в каждой полумолекуле мутации, способствующие образованию гетеродимера из двух полумолекул антител, имеющих разную специфичность, либо in vitro в бесклеточной среде, либо с применением коэкспрессии. Реакция обмена Fab-плечами является результатом реакции изомеризации дисульфидной связи и диссоциации-ассоциации CH3-доменов. Восстанавливаются дисульфидные связи тяжелых цепей в шарнирных областях исходных моноспецифических антител. Полученные свободные цистеины одного из исходных моноспецифических антител образуют дисульфидную связь тяжелых цепей с цистеиновыми остатками второй молекулы исходного моноспецифического антитела и одновременно CH3-домены исходных антител высвобождаются и происходит переформирование путем диссоциации-ассоциации. CH3-домены Fab-плеч можно сконструировать так, чтобы они способствовали гетеродимеризации, а не

- 61 045238 гомодимеризации. Полученный продукт представляет собой биспецифическое антитело, имеющее два Fab-плеча или полумолекулы, каждое из которых связывается с отдельным эпитопом. В случае антител IgG1 можно применять мутации F405L в одной тяжелой цепи и K409R в другой тяжелой цепи. Для антител IgG2 можно применять IgG2 дикого типа и антитело IgG2 с заменами F405L и R409K. Для создания биспецифических антител конструируют первое моноспецифическое двухвалентное антитело и второе моноспецифическое двухвалентное антитело так, чтобы в области Fc они имели мутацию F405L или K409R; антитела инкубируют вместе в восстанавливающих условиях, достаточных для того, чтобы остатки цистеина в шарнирных областях могли подвергаться изомеризации дисульфидной связи; таким образом получают биспецифическое антитело в результате обмена Fab-плечами. Условия инкубации могут быть оптимально возвращены до невосстанавливающих. Примерами восстанавливающих агентов, которые могут применяться, являются 2-меркаптоэтиламин (2-MEA), дитиотреитол (DTT), дитиоэритритол (DTE), глутатион, трис(2-карбоксиэтил)фосфин (TCEP), L-цистеин и бета-меркаптоэтанол. Например, можно применять инкубацию в течение по меньшей мере 90 мин при температуре по меньшей мере 20°C в присутствии по меньшей мере 25 мМ 2-MEA или в присутствии по меньшей мере 0,5 мМ дитиотреитола при pH от 5 до 8, например, при pH 7,0 или при pH 7,4.

Биспецифические антитела можно также получать с таких применением конфигураций, как выступ во впадину (Genentech), CrossMAb (Roche) и электростатическое соответствие (Chugai, Amgen, NovoNordisk, Oncomed), LUZ-Y (Genentech), доменное антитело, сконструированное посредством обмена цепей (SEEDbody) (EMD Serono) и Biclonic (Merus).

Для получения полноразмерных биспецифических антител можно применять стратегию выступ во впадину (см., например, международную публикацию № WO 2006/028936). Вкратце, выбранные аминокислоты, образующие интерфейс между CH3-доменами в человеческом IgG, можно подвергать мутации в положениях, влияющих на взаимодействия CH3-доменов, стимулируя образование гетеродимера. Аминокислоту с короткой боковой цепью (впадина) встраивают в тяжелую цепь антитела, которое специфически связывается с первым антигеном, а аминокислоту с длинной боковой цепью (выступ) встраивают в тяжелую цепь антитела, которое специфически связывается со вторым антигеном. После коэкспрессии двух антител в результате предпочтительного взаимодействия тяжелой цепи с впадиной и тяжелой цепи с выступом образуется гетеродимер. Примерами пар замен в CH3, образующих выступ и впадину, являются следующие (указаны как модифицированное положение в первом CH3-домене первой тяжелой цепи/модифицированное положение во втором CH3-домене второй тяжелой цепи): T366Y/F405A, T366W/F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S и T36 6W/T36 6S_L368A_Y407V.

Для получения полноразмерных биспецифических антител по изобретению можно применять технологию CrossMAb. Антитела CrossMAb, дополнительно к использованию стратегии обмена Fabплечами в промоторе по типу выступ во впадину, имеют в одной из половин плеч обмен доменами CH1 и CL для обеспечения правильного объединения в пары легкой цепи полученного биспецифического антитела (см., например, патент США № 8,242,247).

Для получения полноразмерных биспецифических антител по изобретению могут применяться другие стратегии перенаправления посредством обмена вариабельного или константного или обоих доменов между тяжелой цепью и легкой цепью или внутри тяжелой цепи в биспецифических антителах (либо в одном, либо в обоих плечах). Такие обмены включают в себя, например, обмены VH-CH1 с VL-CL, VH с VL, CH3 с CL и CH3 с CH1, как описано в патентных публикациях № WO2009/080254, WO2009/080251, WO2009/018386 и WO2009/080252.

Можно применять другие стратегии, такие как стимулирование гетеродимеризации тяжелых цепей с применением электростатических взаимодействий посредством введения замен положительно заряженных остатков на одной поверхности CH3 и отрицательно заряженных остатков на другой поверхности CH3, как описано в патентной публикации США № US2010/0015133; патентной публикации США № US2009/0182127; патентной публикации США № US2010/028637 или патентной публикации США № US2011/0123532. В других стратегиях гетеродимеризацию можно стимулировать посредством следующих замен (указаны модифицированные положения в первом CH3-домене первой тяжелой цепи/модифицированное положение во втором CH3-домене второй тяжелой цепи): L351Y_F405A_Y407V/T394W, T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V,

T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T36 6A_K409F, L351Y_Y407A/T36 6V_K409F, Y407A/T366A_K409F или T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W, как описано в патентной публикации США № US2012/0149876 или патентной публикации США № US2013/0195849.

Для получения биспецифических антител по изобретению можно использовать технологию LUZ-Y. В этой технологии к C-концам CH3-доменов присоединяют последовательность типа лейциновой застежки для управления сборкой гетеродимера из исходных mAb, которую удаляют после очистки, как описано Wranik et al., (2012) J Biol Chem 287(52): 42221-9.

Для получения биспецифических антител по изобретению можно использовать технологию SEEDbody. Для стимуляции гетеродимеризации антитела SEEDbody в своих константных доменах имеют замену выбранных остатков IgG остатками IgA, как описано в патенте США № US20070287170.

- 62 045238

Как правило, мутации получают на уровне ДНК в молекуле, такой как константный домен антитела, с помощью стандартных способов.

Антитела по изобретению могут быть сконструированы в разнообразных известных форматах антител.

В некоторых вариантах осуществления биспецифические антитела включают в себя рекомбинантные IgG-подобные молекулы с двойным нацеливанием, причем каждая из двух сторон молекулы содержит Fab-фрагмент или участок Fab-фрагмента по меньшей мере двух разных антител; слитые молекулы IgG, в которых полноразмерные антитела IgG слиты с дополнительным Fab-фрагментом или участками Fab-фрагмента; слитые молекулы Fc, в которых одноцепочечные молекулы Fv или стабилизированные диатела слиты с константными доменами тяжелой цепи, областями Fc или их частями; слитые молекулы Fab, в которых разные Fab-фрагменты слиты друг с другом; антитела из тяжелых цепей на основе ScFv и диател (например, доменные антитела, нанотела), в которых разные одноцепочечные молекулы Fv, или разные диатела, или разные антитела из тяжелых цепей (например, доменные антитела, нанотела) слиты друг с другом, или с другим белком, или с молекулой-носителем.

Полинуклеотиды, векторы и клетки-хозяева.

В изобретении также предложено антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, TIM-3 или PD-1 и TIM-3, имеющее определенные последовательности VH и VL, причем VH антитела кодируется первым полинуклеотидом, a VL антитела кодируется вторым полинуклеотидом. Полинуклеотид может быть комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислотой (кДНК) и может иметь оптимизированные кодоны для экспрессии в приемлемом хозяине. Известной технологией является оптимизация по кодонам.

В изобретении также предложен выделенный полинуклеотид, кодирующий VH антитела по изобретению, VL антитела по изобретению, тяжелую цепь антитела по изобретению или легкую цепь антитела по изобретению.

В изобретении также предложен выделенный полинуклеотид, который кодирует VH, VL или VH и VL антитела-антагониста, специфически связывающего PD-1, по изобретению.

В изобретении также предложен выделенный полинуклеотид, кодирующий VH с SEQ ID NO: 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 63 или 64.

В изобретении также предложен выделенный полинуклеотид, кодирующий VL с SEQ ID NO: 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 или 65.

В изобретении также предложен выделенный полинуклеотид, содержащий полинуклеотидную последовательность с SEQ ID NO: 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202 или 203.

В изобретении также предложен выделенный полинуклеотид, который кодирует VH, VL или VH и VL антитела-антагониста, специфически связывающего TIM-3, по изобретению.

В изобретении также предложен выделенный полинуклеотид, кодирующий VH с SEQ ID NO: 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154 или 172.

В изобретении также предложен выделенный полинуклеотид, кодирующий VL с SEQ ID NO: 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163 или 173.

В изобретении также предложен выделенный полинуклеотид, содержащий полинуклеотидную последовательность с SEQ ID NO: 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210 или 211.

В изобретении также предложен выделенный полинуклеотид, который кодирует HC1, LC1, HC2 или LC2 биспецифического антитела-антагониста PD-1/TIM-3 по изобретению.

В изобретении также предложен выделенный полинуклеотид, кодирующий HC1 с SEQ ID NO: 186, 187, 241, 242 или 243.

В изобретении также предложен выделенный полинуклеотид, кодирующий LC1 с SEQ ID NO: 188 или 189.

В изобретении также предложен выделенный полинуклеотид, кодирующий HC2 с SEQ ID NO: 190, 191, 192, 244, 245, 246, 247 или 248.

В изобретении также предложен выделенный полинуклеотид, кодирующий LC2 с SEQ ID NO: 193, 194 или 195.

В изобретении также предложен выделенный полинуклеотид, содержащий полинуклеотидную последовательность с SEQ ID NO: 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259 и 260.

SEQ ID NO: 196 (PD1H170)

CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCAGCAGCGTGAAAGT

GAGCTGCAAAGCGAGCGGCGGCACCTTTAGCAGCTATGCGATTAGCTGGGTGCGCCAGGCGCCG

GGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCGGCATTATTCCGATTTTTGACACCGCGAACTATGCGCAGA

AATTTCAGGGCCGCGTGACCATTACCGCGGATGAAAGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGAG CAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCCCTGGTCTCGCTGCGGCTTAT GATACTGGTTCCTTGGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC

SEQ ID NO: 197 (PD1L148)

- 63 045238

GAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGAGCCCGGGCGAACGCGCGAC CCTGAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCGTTCGCTCCTACCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGC CAGGCGCCGCGCCTGCTGATCTACGACGCGAGCAATCGTGCGACCGGCATTCCGGCGCGCTTTA GCGGCTCCGGTAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCGGAAGATTTTGC GGTGTATTATTGCCAGCAACGTAATTATTGGCCGCTGACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAA ATTAAA

SEQ ID NO: 198 (PD1H129)

GAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACT GAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCGCCTTCAGCAGATACGACATGAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCT GGCAAAGGACTGGAAAGCGTGGCCTACATCTCTGGCGGAGGCGCCAACACCTACTACCTGGACA ACGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAA CTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCTCCCCCTACCTGAGCTACTTCGAC GTGTGGGGCCAGGGCACACTCGTGACCGTGTCATCT

SEQ ID NO: 199 (PD1L62)

GAGATCGTGATGACCCAGAGCCCTGCCACCCTGTCCGTGTCTCCAGGCGAAAGAGCCAC CCTGAGCTGCAGAGCCAGCCAGAGCCTGAGCGACTACCTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGC CAGGCCCCCAGACTGCTGATCAAGTCTGCCAGCCAGTCCATCAGCGGCATCCCCGCCAGATTTT CTGGCAGCGGCTCCGGCACCGAGTTCACCCTGACAATCAGCAGCCTGCAGAGCGAGGACTTCGC CGTGTACTACTGCCAGAACGGCCACAGCTTCCCTTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAA ATCAAG

SEQ ID NO: 200 (PD1H163)

CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCAGCAGCGTGAAAGT GAGCTGCAAAGCGAGCGGCGGCACCTTCAAGTCCTATGTGATTCATTGGGTGCGCCAGGCGCCG GGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCGGTATTATCCCAATTTTTGGCACCGCCAATTATGCGCAGA AATTTCAGGGCCGCGTGACCATTACCGCTGATGAAAGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGAG CAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGGTTATGTGCGGGCTACGGGC ATGTTGGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC

SEQ ID NO: 201 (PD1L185)

GAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGAGCCCGGGCGAACGCGCGAC CCTGAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCGTTAGCAATTATCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGC CAGGCGCCGCGCCTGCTGATCTACGACGCCAGCAATCGCGCGACCGGCATTCCGGCGCGCTTTA GCGGCTCCGGTAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCGGAAGATTTTGC GGTGTATTATTGCCAGCAACGTGCATATTGGCCGCTGACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAA ATTAAA

SEQ ID NO: 202 (PD1H164)

CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCAGCAGCGTGAAAGT

- 64 045238

GAGCTGCAAAGCGAGCGGCGGCACCTTCAGCGATTATGTGATTTCCTGGGTGCGCCAGGCGCCG GGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCGGTATTATCCCGATTTACGGGACCGCTAACTATGCGCAGA AATTTCAGGGCCGCGTGACCATTACCGCTGATGAAAGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGAG CAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGGTACCCTCGACCGGACCGGG CATTTGGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC

SEQ ID NO: 203 (PD1L86)

GAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGAGCCCGGGCGAACGCGCGAC CCTGAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCGTCTCCTCCTACCTTGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGC CAGGCGCCGCGCCTGCTGATCCACGACGCCTCTACGCGTGCGACCGGCATTCCGGCGCGCTTTA GCGGCTCCGGTAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCGGAAGATTTTGC GGTGTATTATTGCCAGCAACGTAATTATTGGCCGCTCACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAA ATTAAA

SEQ ID NO: 204 (TM3H24)

GAAGTGCAGCTGCTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCGGGCGGCAGCCTGCGCCT GAGCTGCGCGGCAAGCGGCTTTACCTTTAGCAGCTATGCGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCGCCG GGCAAAGGCCTGGAATGGGTGAGCGCGATTAGCGGCAGCGGCGGCAGCACCTATTATGCGGATA GCGTGAAAGGCCGCTTTACCATTAGCCGCGATAACAGCAAAAACACCCTGTATCTGCAGATGAA CAGCCTGCGCGCGGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGAAATCCCCGTACGCGCCCTTGGAC TATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC

SEQ ID NO: 205 (TM3L33)

GAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGAGCCCGGGCGAACGCGCGAC CCTTAGCTGCCGTGCAAGTCAGAGTGTGAACGACTACCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGC CAGGCGCCGCGCCTGCTGATTTATGATGCGAGCAACCGCGCGACCGGCATTCCGGCGCGCTTTA GCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCGGAAGATTTTGC GGTGTATTATTGCCAGCAGGGTGGTCACGCGCCGATCACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAA ATTAAA

SEQ ID NO: 206 (TM3H162)

GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAGCCTGGCGAGAGCCTGAAGAT CAGCTGCAAGGGCAGCGGCTACAGCTTCACCAGCTACTGGATGCAGTGGGTGCGCCAGATGCCT GGCAAGGGCCTGGAATGGATGGGCGCCATCTATCCCGGCGACGGCGACATCAGATACACCCAGA ACTTCAAGGGCCAAGTGACCATCAGCGCCGACAAGAGCATCAGCACCGCCTACCTGCAGTGGTC CAGCCTGAAGGCCAGCGACACCGCCATGTACTACTGTGCCAGATGGGAGAAGTCCACCACCGTG GTGCAGCGGAACTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACCGTGTCTAGT

SEQ ID NO: 207 (TM3L85)

GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGAC CATCACATGCAAGGCCAGCGAGAACGTGGGCACCTTCGTGTCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGC

- 65 045238

AAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGGCGCCAGCAACAGATACACCGGCGTGCCCAGCAGATTCA GCGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCTAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGC CACCTACTACTGCGGCCAGAGCTACAGCTACCCCACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATC AAG

SEQ ID NO: 208 (TM3H21)

GAAGTGCAGCTGCTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCGGGCGGCAGCCTGCGCCT GAGCTGCGCGGCGAGCGGCTTTACCTTTAGCAACTATTGGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCGCCG GGCAAAGGCCTGGAATGGGTGAGCGCGATTAGCGGCAGCGGCGGCAGCACCTATTATGCGGATA GCGTGAAAGGCCGCTTTACCATTAGCCGCGATAACAGCAAAAACACCCTGTATCTGCAGATGAA CAGCCTGCGCGCGGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGAAAGATCATTGGGATCCCAATTTT TTGGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC

SEQ ID NO: 209 (PH9L1)

GAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGGCACCCTGAGCCTGAGCCCGGGCGAACGCGCGAC CCTGAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCGTGAGCAGCAGCTATCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCG GGCCAGGCGCCGCGCCTGCTGATTTATGGCGCGAGCAGCCGCGCGACCGGCATTCCGGATCGCT TTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCCGCCTGGAACCGGAAGATTT TGCGGTGTATTATTGCCAGCAGTATGGCAGCAGCCCGCTGACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTG GAAATTAAA

SEQ ID NO: 210 (TM3H65)

GAAGTGCAGCTGCTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCGGGCGGCAGCCTGCGCCT GAGCTGCGCGGCGAGCGGCTTTACCTTTAGCGACTATTGGATGAGCTGGGTGCGCCAGGCGCCG GGCAAAGGCCTGGAATGGGTGAGCGTGATCAAGTATAGCGGTGGCTCCAAATATTATGCGGATA GCGTGAAAGGCCGCTTTACCATTAGCCGCGATAACAGCAAAAACACCCTGTATCTGCAGATGAA CAGCCTGCGCGCGGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGAAAGAGCTGGAGGGGGTGTTCGAC TATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGC

SEQ ID NO: 211 (TM3L12)

GAAATTGTGCTGACCCAGAGCCCGGGCACCCTGAGCCTGAGCCCGGGCGAACGCGCGAC CCTGAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCGTTAGCAATAGCACTCTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCG GGCCAGGCGCCGCGCCTGCTGATTTATACTGCGAGCAGCCGCGCGACCGGCATTCCGGATCGCT TTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCCGCCTGGAACCGGAAGATTT TGCGGTGTATTATTGCCAGCAGTCTTACACATCTCCGTGGACTTTTGGCCAGGGCACCAAAGTG GAAATTAAA

Полинуклеотидные последовательности, кодирующие VH или VL, или их антигенсвязывающий фрагмент антител по изобретению, или тяжелую цепь и легкую цепь антител по изобретению, могут быть функционально связаны с одним или более регуляторными элементами, такими как промотор или энхансер, которые позволяют экспрессировать нуклеотидную последовательность в предполагаемой клетке-хозяине. Полинуклеотид может представлять собой кДНК.

В изобретении также предложен вектор, содержащий полинуклеотид по изобретению. Такие векторы могут представлять собой плазмидные векторы, вирусные векторы, векторы для экспрессии бакуловирусов, векторы на основе транспозонов или любой другой вектор, приемлемый для встраивания синтетического полинуклеотида по изобретению в данный организм или в данное генетическое окружение любым образом. Например, полинуклеотиды, кодирующие вариабельные области легкой и/или тяжелой цепей антител по изобретению, необязательно соединенные с константными областями, встроены в экспрессионные векторы. Легкую и/или тяжелую цепи можно клонировать в одном или в разных экспрессионных векторах. Сегменты ДНК, кодирующие иммуноглобулиновые цепи, могут быть функционально связаны в экспрессионном(ых) векторе(ах) с управляющими последовательностями, обеспечивающими экспрессию иммуноглобулиновых полипептидов. К таким управляющим последовательностям относятся сигнальные последовательности, промоторы (например, естественно ассоциированные или гетерологичные промоторы), энхансерные элементы и последовательности терминации транскрипции, и их выбирают так, чтобы они были совместимы с клеткой-хозяином, выбранной для экспрессии антитела. После встраивания вектора в соответствующего хозяина выполняют инкубацию хозяина в условиях, приемлемых для высокоуровневой экспрессии белков, кодируемых встроенными полинуклеотидами.

В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид с SEQ ID NO: 196 и 197.

- 66 045238

В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид с SEQ ID NO: 198 и 199.

В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид с SEQ ID NO: 200 и 201.

В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид с SEQ ID NO: 202 и 203.

В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид с SEQ ID NO: 204 и 205.

В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид с SEQ ID NO: 206 и 207.

В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид с SEQ ID NO: 208 и 209.

В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид с SEQ ID NO: 210 и 211.

В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид с SEQ ID NO: 253 и 254.

В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид с SEQ ID NO: 255 и 256.

В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид с SEQ ID NO: 257 и 258.

В некоторых вариантах осуществления вектор содержит полинуклеотид с SEQ ID NO: 259 и 260.

Как правило, приемлемые экспрессионные векторы могут реплицироваться в организмах-хозяевах либо в виде эписом, либо в виде неотъемлемой части хромосомной ДНК хозяина. Обычно экспрессионные векторы содержат маркеры селекции, такие как вызывающие резистентность к ампициллину, резистентность к гигромицину, резистентность к тетрациклину, резистентность к канамицину или резистентность к неомицину, чтобы обеспечивать обнаружение таких клеток, трансформированных желательными последовательностями ДНК.

Приемлемые промоторные и энхансерные элементы известны в данной области. Примеры промоторов для экспрессии в эукариотической клетке включают в себя промоторные и энхансерные элементы генов легкой и/или тяжелой иммуноглобулиновых цепей; немедленно-ранний промотор цитомегаловируса; промотор тимидинкиназы вируса простого герпеса; ранние и поздние промоторы SV40; промотор, присутствующий в длинных концевых повторах ретровируса; промотор мышиного металлотионеина-I и различные известные тканеспецифические промоторы. Выбор соответствующего вектора и промотора вполне соответствует уровню обычного специалиста в данной области.

Примерами векторов, которые могут применяться, являются бактериальные: pBs, phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene, Ла-Холья, г. Сан-Диего, штат Калифорния, США); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 и pRIT5 (Pharmacia, г. Уппсала, Швеция). Эукариотические: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG и pSVL (Pharmacia), pEE6.4 (Lonza) и pEE12.4 (Lonza).

В изобретении также предложена клетка-хозяин, содержащая один или более векторов по изобретению. Термин клетка-хозяин относится к клетке, в которую был встроен вектор. Следует понимать, что термин клетка-хозяин служит для обозначения не только конкретной заявленной клетки, но и потомства такой клетки, а также стабильной клеточной линии, полученной из конкретной заявленной клетки. Так как в последующих поколениях могут возникать определенные модификации вследствие либо мутации, либо воздействий среды, такое потомство может не быть идентичным исходной клетке, но оно также может охватываться термином клетка-хозяин, применяемым в настоящем документе. Такими клетками-хозяевами могут быть эукариотические, прокариотические, растительные клетки или клетки архей. Escherichia coli, бациллы, такие как Bacillus subtilis, и другие энтеробактерии, такие как Salmonella, Serratia, а также различные виды Pseudomonas являются примерами прокариотических клетокхозяев. Для экспрессии также могут использоваться другие микроорганизмы, такие как дрожжи. Сахаромицеты (например, S. cerevisiae) и Pichia являются примерами приемлемых дрожжевых клеток-хозяев. Примерами эукариотических клеток могут быть клетки млекопитающих, насекомых, птиц или другие клетки животного происхождения. Эукариотические клетки млекопитающих включают в себя иммортализованные клеточные линии, такие как гибридомы или клеточные линии миеломы, например, мышиные клеточные линии SP2/0 (Американская коллекция типовых культур (ATCC), г. Манассас, штат Вирджиния, США, CRL-1581), NS0 (Европейская коллекция клеточных культур (ECACC), г. Солсбери, Уилтшир, Великобритания, ECACC № 85110503), FO (ATCC CRL-1646) и Ag653 (ATCC CRL-1580). Примером клеточной линии миеломы человека является U266 (АТТС CRL-TIB-196). Другие используемые клеточные линии включают в себя линии, полученные из клеток яичника китайского хомячка (CHO), например, CHOK1SV (Lonza Biologies, г. Уолкерсвилл, штат Мэриленд, США), Potelligent® CHOK2SV (Lonza), CHO-K1 (ATCC CRL-61) или DG44.

В изобретении также предложен способ продукции антитела по изобретению, включающий в себя культивирование клетки-хозяина по изобретению в условиях экспрессии антитела и выделение антитела, продуцированного клеткой-хозяином. Способы получения антител и их очистки известны в данной области. После синтеза (химического или рекомбинантного) цельные антитела, их димеры, отдельные легкие и/или тяжелые цепи или другие фрагменты антитела, такие как VH и/или VL, можно очищать в соответствии со стандартными процедурами, включающими в себя осаждение сульфатом аммония, применение аффинных колонок, колоночную хроматографию, высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), электрофорез в геле и т. п. (см. по существу Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., 1982)). Заявленное антитело может быть по существу чистым, например, чистым на по меньшей мере от около 80% до 85%, чистым на по меньшей мере от около 85% до 90%, чистым на по меньшей мере от около 90% до 95%, чистым на по меньшей мере от около 98% до 99% или более, например, не содержа- 67 045238 щим загрязняющих веществ, таких как клеточный дебрис, макромолекулы и т. д., отличных от заявленного антитела.

Полинуклеотидные последовательности по изобретению могут быть включены в векторы с применением стандартных способов молекулярной биологии. Трансформацию клетки-хозяина, культивирование, экспрессию и очистку антитела выполняют с применением известных способов. Другой вариант осуществления изобретения представляет собой способ получения антитела-антагониста, специфически связывающего PD-1, по изобретению, который включает в себя:

встраивание в экспрессионный вектор первого полинуклеотида, кодирующего VH антитела, и второго полинуклеотида, кодирующего VL антитела;

трансформацию клетки-хозяина экспрессионным вектором;

культивирование клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, в которых экспрессируются VL и VH и образуется антитело; и выделение антитела из клетки-хозяина или культуральной среды.

Другой вариант осуществления изобретения, описанного в настоящем документе, представляет собой способ получения антитела-антагониста, специфически связывающего TIM-3, по изобретению, который включает в себя:

Полинуклеотиды, кодирующие определенные последовательности VH или VL по изобретению, описанные в настоящем документе и в некоторых вариантах осуществления, в любом и каждом из перечисленных ниже пронумерованных вариантов осуществления, можно встраивать в векторы с помощью стандартных способов молекулярной биологии. Трансформацию клетки-хозяина, культивирование, экспрессию и очистку антитела выполняют с применением известных способов.

Фармацевтические композиции/введение.

В изобретении предложены фармацевтические композиции, содержащие антитела по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Для терапевтического применения возможна подготовка антител по изобретению в виде фармацевтических композиций, содержащих эффективное количество антитела в качестве активного ингредиента в фармацевтически приемлемом носителе. Термин носитель относится к разбавителю, адъюванту, эксципиенту или несущей среде, с которыми вводят антитело по изобретению. Такие носители могут представлять собой жидкости, такие как вода и масла, включая масла, получаемые из нефти, масла животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т. п. Например, можно применять 0,4% солевой раствор и 0,3% раствор глицина. Эти растворы стерильны и по существу не содержат твердых частиц. Их можно стерилизовать с применением традиционных известных стандартных методик стерилизации (например, фильтрации). Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для приближения к физиологическим условиям, такие как регулирующие pH и буферные агенты, стабилизирующие, загущающие, увлажняющие и окрашивающие агенты и т. д. Концентрация антител по изобретению в таком фармацевтическом составе может варьировать от менее около 0,5%, обычно по меньшей мере около 1% и до 15 или 20% вес., и может выбираться преимущественно на основании необходимой дозы, объемов текучей среды, значений вязкости и т. д. в соответствии с конкретным выбранным способом введения. Приемлемые несущие среды и составы, включающие другие человеческие белки, например, сывороточный альбумин человека, описаны, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092, см. в особенности с. 958989.

Способом введения для терапевтического применения антител по изобретению может служить любой приемлемый путь доставки антитела в организм-хозяин, такой как парентеральное введение, например, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное или подкожное, легочное, чресслизистое (пероральное, интраназальное, интравагинальное, ректальное), в виде состава в таблетке, капсуле, растворе, порошке, геле, частице; и содержащиеся в шприце, имплантированном устройстве, осмотическом насосе, картридже, микронасосе; или же с помощью других средств, очевидных квалифицированному специалисту, которые известны в данной области. Локализованное введение можно обеспечить, например, посредством доставки в сустав, бронхи, брюшную полость, капсулу, хрящ, полость, мозжечок, желудочек мозга, толстую кишку, шейку матки, желудок, печень, миокард, кость, таз, перикард, полость живота, плевру, предстательную железу, легкие, прямую кишку, почку, сетчатку, позвоночник, суставную сумку, грудную клетку, матку, сосуд, внутрь мочевого пузыря, поврежденную ткань, вагинально, ректально, буккально, сублингвально, интраназально или трансдермально.

Антитела по изобретению можно вводить субъекту любым приемлемым способом, например, па- 68 045238 рентерально посредством внутривенной (в/в) инфузии или болюсной инъекции, внутримышечно, подкожно или внутрибрюшинно. В/в инфузию можно осуществлять, например, в течение 15, 30, 60, 90, 120,

180 или 240 минут либо от 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 часов.

Доза, вводимая субъекту, является достаточной для ослабления или по меньшей мере частичной задержки заболевания, лечение которого осуществляется (терапевтически эффективное количество), и может иногда составлять от 0,005 мг до около 100 мг/кг, например, от около 0,05 мг до около 30 мг/кг, или от около 5 мг до около 25 мг/кг, или около 4 мг/кг, около 8 мг/кг, около 16 мг/кг, или около 24 мг/кг, или, например, около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мг/кг, но может быть даже выше, например, около 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мг/кг.

Также можно вводить фиксированную стандартную дозу, например, 50, 100, 200, 500 или 1000 мг, или доза может быть основана на площади поверхности тела пациента, например, 500, 400, 300, 250, 200 или 100 мг/м2. Для лечения пациенту обычно можно вводить от 1 до 8 доз (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8), но можно вводить и 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более доз.

Введение антител по изобретению можно повторять через одни сутки, двое суток, трое суток, четверо суток, пять суток, шесть суток, одну неделю, две недели, три недели, один месяц, пять недель, шесть недель, семь недель, два месяца, три месяца, четыре месяца, пять месяцев, шесть месяцев или более. Также возможны повторные курсы лечения в виде длительного введения. Повторное введение можно проводить в той же дозе или в другой дозе. Например, антитела по изобретению можно вводить в дозе 8 мг/кг или 16 мг/кг с недельным интервалом в течение 8 недель с последующим введением в дозе 8 мг/кг или 16 мг/кг каждые две недели в течение дополнительных 16 недель, с последующим введением в дозе 8 мг/кг или 16 мг/кг каждые четыре недели посредством внутривенной инфузии.

Например, антитела по изобретению можно вводить в виде суточной дозы в количестве около 0,1100 мг/кг, например, 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мг/кг в сутки, по меньшей мере в одни из суток 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40, или альтернативно по меньшей мере в одну из недель 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 после начала лечения, или в любой их комбинации с применением одной или разделенных доз каждые 24, 12, 8, 6, 4 или 2 часа, или в любой их комбинации.

Антитела по изобретению можно также вводить профилактически, чтобы снизить риск развития рака, замедлить начало развития события при прогрессировании рака и/или снизить риск рецидива в случае ремиссии рака.

Антитела по изобретению могут быть лиофилизированы для хранения и восстановлены в приемлемом носителе перед применением. Было показано, что эта методика эффективна для стандартных белковых препаратов; можно использовать известные методики лиофилизации и восстановления.

Способы и варианты применения.

Антитела по изобретению применяют в диагностике in vitro и in vivo, а также в качестве средств лечения и профилактики. Например, антитела по изобретению можно вводить в клетки в культуре in vitro или ex vivo или субъекту для лечения, профилактики и/или диагностики разнообразных расстройств, таких как онкологические и инфекционные заболевания.

В изобретении предложен способ модификации иммунного ответа у субъекта, включающий в себя введение субъекту антитела по изобретению в течение времени, достаточного для модификации иммунного ответа.

В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ усиливается, стимулируется или повышается.

В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, субъект представляет собой человека-пациента.

В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, субъект представляет собой человека-пациента, который нуждается в усилении иммунного ответа.

В некоторых вариантах осуществления субъект имеет иммунодефицит.

В некоторых вариантах осуществления субъект имеет риск развития иммунодефицита. Субъект с иммунодефицитом может проходить или прошел химиотерапию или радиационную терапию.

В некоторых вариантах осуществления субъект имеет иммунодефицит или риск его развития в результате инфекции.

Антитела по изобретению приемлемы для лечения субъекта, имеющего заболевание, которое можно лечить посредством усиления иммунных ответов, опосредованных T-клетками.

В некоторых вариантах осуществления антителом-антагонистом, специфически связывающим PD-1 и применяемым в способах по изобретению, описанных в настоящем документе, является PD1B114, PD1B149, PD1B160, PD1B162, PD1B164, PD1B11, PD1B183, PD1B184, PD1B185, PD1B187, PD1B71, PD1B177, PD1B70, PD1B175, PD1B194, PD1B195, PD1B196, PD1B197, PD1B198, PD1B199, PD1B200, PD1B201, PD1B243, PD1B244, PD1B131 или PD1B132. Аминокислотные последовательности VH и VL этих антител показаны в табл. 2.

В некоторых вариантах осуществления антителом-антагонистом, специфически связывающим TIM- 69 045238 и применяемым в способах по изобретению, описанных в настоящем документе, является TM3B103,

TM3B105, TM3B109, TM3B108, TM3B113, TM3B189, TM3B190, TM3B193, TM3B195, TM3B196 или

TM3B291. Аминокислотные последовательности VH и VL этих антител показаны в табл. 3.

В некоторых вариантах осуществления биспецифическим антителом PD-1/TIM-3, применяемым в способах по изобретению, является PTBB14, PTBB15, PTBB16, PTBB17, PTBB24, РТВВЗО, PTBB27, PTBB2 8, PTBB18, PTBB20 или PTBB21. Аминокислотные последовательности HC1, LC1, HC2 и LC2 этих антител показаны в табл. 41 и табл. 42.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1 и применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 41 и VL с SEQ ID NO: 49.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1 и применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 41 и VL с SEQ ID NO: 50.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1 и применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 42 и VL с SEQ ID NO: 51.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1 и применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 42 и VL с SEQ ID NO: 52.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1 и применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 42 и VL с SEQ ID NO: 53.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1 и применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 43 и VL с SEQ ID NO: 49.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1 и применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 43 и VL с SEQ ID NO: 54.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1 и применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 43 и VL с SEQ ID NO: 50.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1 и применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 43 и VL с SEQ ID NO: 55.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1 и применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 43 и VL с SEQ ID NO: 56.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1 и применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 43 и VL с SEQ ID NO: 57.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1 и применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 44 и VL с SEQ ID NO: 49.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1 и применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 45 и VL с SEQ ID NO: 49.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1 и применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 46 и VL с SEQ ID NO: 49.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1 и применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 47 и VL с SEQ ID NO: 49.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1 и применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID NO: 53.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1 и применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID NO: 52.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1 и применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID NO: 56.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1 и применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 47 и VL с SEQ ID NO: 58.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1 и применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 47 и VL с SEQ ID NO: 59.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1 и применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 45 и VL с SEQ ID NO: 60.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1 и применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 45 и VL с SEQ ID NO: 61.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1 и применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 45 и VL с SEQ ID NO: 62.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3 и применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 145 и VL с SEQ ID NO: 155.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3 и применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3 и применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 148 и VL с SEQ ID NO: 157.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3 и применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 147 и VL с SEQ ID NO: 155.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3 и

- 70 045238 применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 149 и VL с SEQ ID NO: 158.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3 и применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 150 и VL с SEQ ID NO: 159.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3 и применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 151 и VL с SEQ ID NO: 160.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3 и применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 152 и VL с SEQ ID NO: 161.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3 и применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 153 и VL с SEQ ID NO: 162.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3 и применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 154 и VL с SEQ ID NO: 163.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3 и применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 172 и VL с SEQ ID NO: 173.

В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело-антагонист PD-1/TIM-3, которое содержит первый домен, специфически связывающий PD-1, и второй домен, специфически связывающий TIM-3, применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID NO: 56 в первом домене, а также VH с SEQ ID NO: 153 и VL с SEQ ID NO: 162 во втором домене.

В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело-антагонист PD-1/TIM-3, которое содержит первый домен, специфически связывающий PD-1, и второй домен, специфически связывающий TIM-3, применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID NO: 56 в первом домене, а также VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156 во втором домене.

В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело-антагонист PD-1/TIM-3, которое содержит первый домен, специфически связывающий PD-1, и второй домен, специфически связывающий TIM-3, применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 64 и VL с SEQ ID NO: 65 в первом домене, а также VH с SEQ ID NO: 153 и VL с SEQ ID NO: 162 во втором домене.

В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело-антагонист PD-1/TIM-3, которое содержит первый домен, специфически связывающий PD-1, и второй домен, специфически связывающий TIM-3, применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 64 и VL с SEQ ID NO: 65 в первом домене, а также VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156 во втором домене.

В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело-антагонист PD-1/TIM-3, которое содержит первый домен, специфически связывающий PD-1, и второй домен, специфически связывающий TIM-3, применяемое в способах по изобретению, содержит VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID NO: 56 в первом домене, а также VH с SEQ ID NO: 172 и VL с SEQ ID NO: 173 во втором домене.

Рак.

Блокада PD-1 может усиливать иммунный ответ на раковые клетки у субъекта. Лиганд к PD-1 - PDL1 - обильно экспрессируется при разнообразных видах рака у человека (Dong et al., (2002) Nat Med 8:787-9). Взаимодействие между PD-1 и PD-L1 может приводить к снижению инфильтрации лимфоцитов в опухоли, снижению опосредованной T-клеточным рецептором пролиферации и/или уклонению клеток рака от иммунитета (Dong et al., (2003) J Mol Med 81:281-7; Blank et al., (2005) Cancer Immunol Immunother 54:307-314; Konishi et al., (2004) Clin Cancer Res 10:5094-100). Иммунную супрессию можно обратить посредством ингибирования локального взаимодействия PD-1 с PD-L1; данный эффект аддитивен, если взаимодействие PD-1 с PD-L2, вторым лигандом PD-1, также заблокировано (Iwai et al., (2002) Proc Natl Acad Sci 99:12293-7; Brown et al., (2003) J Immunol 170:1257-66). Таким образом, ингибирование PD-1 может приводить к усилению иммунного ответа.

TIM-3 представляет собой коингибиторный белок, экспрессируемый на активированных Tхелперных клетках 1 (Th1) CD4+ и цитотоксических T-клетках CD8+, которые секретируют ИФН-γ. TIM-3 коэкспрессируется на истощенных T-клетках PD-1+, как показано в доклинических моделях рака и вирусного истощения. Одновременная блокада этих путей может восстанавливать эффекторную функцию T-клеток (например, секрецию ИФН-γ, пролиферацию) в некоторых моделях, а также в PBMC человека, полученных от пациентов с метастатическими меланомами и пациентами с ВИЧ или ВГС. TIM-3 также обогащается на регуляторных T-клетках Foxp3+, и было показано, что Treg, коэкспрессирующие TIM-3, LAG3 и CTLA4, являются высокоэффективными супрессорами эффекторных T-клеток (Teff) (Galuton et al., (2014) Eur J Immunol 44 (9): 2703-11). Экспрессия TIM-3 коррелировала с ухудшением прогноза при NSCLC (Zhuang et al., (2012) Am J Clin Pathol 137 (6): 978-85). Лимфоциты из опухолей тканей от пациентов с карциномой яичников, ободочной и прямой кишки, шейки матки и гепатоцитов показывают большую долю TIM-3+ T-клеток CD4, и такие клетки имеют сниженную способность к продукции ILF-γ (Yan et al., (2013) PLoS One 8 (3): e58006).

В изобретении также предложен способ ингибирования роста опухолевых клеток у субъекта, который включает в себя введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела-антагониста, специфически связывающего PD-1, по изобретению в течение времени, достаточного для ингибирования роста опухолевых клеток.

- 71 045238

В изобретении также предложен способ ингибирования роста опухолевых клеток у субъекта, который включает в себя введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела-антагониста, специфически связывающего TIM-3, по изобретению в течение времени, достаточного для ингибирования роста опухолевых клеток.

В изобретении также предложен способ ингибирования роста опухолевых клеток у субъекта, который включает в себя введение субъекту терапевтически эффективного количества биспецифического антитела-антагониста PD-1/TIM-3 по изобретению в течение времени, достаточного для ингибирования роста опухолевых клеток.

В изобретении также предложен способ лечения рака посредством введения требующему этого субъекту терапевтически эффективного количества антитела-антагониста, специфически связывающего PD-1, по изобретению в течение времени, достаточного для лечения рака.

В изобретении также предложен способ лечения рака посредством введения требующему этого субъекту терапевтически эффективного количества антитела-антагониста, специфически связывающего TIM-3, по изобретению в течение времени, достаточного для лечения рака.

В изобретении также предложен способ лечения рака посредством введения требующему этого субъекту терапевтически эффективного количества биспецифического антитела PD-1/TIM-3 по изобретению в течение времени, достаточного для лечения рака.

Примерами антител, которые можно применять, являются антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, и биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3: PD1B114, PD1B149, PD1B160, PD1B162, PD1B164, PD1B11, PD1B183, PD1B184, PD1B185, PD1B187, PD1B71, PD1B177, PD1B70, PD1B175, PD1B194, PD1B195, PD1B196, PD1B197, PD1B198, PD1B199, PD1B200, PD1B201, TM3B103, TM3B105, TM3B109, TM3B108, TM3B113, TM3B189, TM3B190, TM3B193, TM3B195, TM3B196, TM3B291, PTBB14, PTBB15, PTBB16, PTBB17, PTBB24, PTBB30, PTBB27, PTBB28, PTBB18, PTBB20 и PTBB21, имеющие аминокислотную последовательность VH и VL и характеристики, описанные в настоящем документе.

Рак может представлять собой гиперпролиферативное состояние или расстройство, солидную опухоль, гематологическую злокачественную опухоль, опухоль мягкой ткани или метастатическое поражение.

Предполагается, что термин рак включает в себя все типы раковых разрастаний или онкогенных процессов, метастазирования в тканях или злокачественной трансформации клеток, тканей или органов независимо от типа гистопатологии или стадии инвазивности. Примеры рака включают в себя солидные опухоли, гематологические злокачественные опухоли, опухоли мягких тканей и метастатические поражения. Примеры солидных опухолей включают в себя злокачественные образования, например, саркомы, и карциномы (включая аденокарциномы и плоскоклеточные карциномы) в различных системах органов, такие как поражения печени, легкого, молочной железы, лимфатической системы, желудочнокишечного (например, толстая кишка) и мочеполового трактов (например, почки, уротелиальные клетки), предстательной железы и глотки. Аденокарциномы включают в себя злокачественные образования, такие как многие виды рака толстой кишки, рак прямой кишки, почечно-клеточная карцинома, рак печени, немелкоклеточная карцинома легкого, рак тонкого кишечника и рак пищевода. Плоскоклеточные карциномы включают в себя злокачественные образования, например, в легком, пищеводе, коже, в области головы и шеи, ротовой полости, анусе и шейке матки.

В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой меланому.

Метастатические поражения упомянутых выше видов рака можно также лечить или предотвращать с помощью способов и антител по изобретению, описанных в настоящем документе.

Примеры видов рака, рост которых можно ингибировать или уменьшать с помощью антител по изобретению, включают в себя виды рака, которые отвечают на иммунотерапию. Примеры такого рака включают в себя меланому, рак почки, рак предстательной железы, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак желудочно-кишечного тракта, рак желудка, рак пищевода, рак легкого, метастазирующую злокачественную меланому, светлоклеточную карциному, устойчивую к гормонам аденокарциному предстательной железы, немелкоклеточный рак легкого или рак головы и шеи. Устойчивые или рецидивирующие злокачественные образования можно лечить с помощью антител по изобретению, описанных в настоящем документе.

Примерами других видов рака, которые можно лечить антителами по изобретению, являются рак ануса, базально-клеточная карцинома, рак желчевыводящих путей, рак мочевого пузыря, рак костей, рак мозга и ЦНС, карцинома фаллопиевых труб, карцинома влагалища, карцинома вульвы, злокачественная меланома кожи или глаза, астроклеточный рак пищевода, рак яичка, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак прямой кишки, рак матки, первичная лимфома ЦНС; опухоль центральной нервной системы (ЦНС), рак шейки матки, хориокарцинома, рак прямой кишки, рак соединительной ткани, рак пищеварительной системы, рак эндометрия, рак глаза; внутриэпителиальное новообразование, рак почки, рак гортани, рак печени; мелкоклеточный рак легкого, нейробластома, рак ротовой полости (например, губы, языка, рта и глотки), рак носоглотки, ретинобластома, рабдомиосаркома, рак дыхательной системы, саркома, рак щитовидной железы, рак мочевой системы, гепатокарцинома, рак анальной области, карцинома

- 72 045238 фаллопиевых труб, карцинома влагалища, карцинома вульвы, рак тонкого кишечника, рак эндокринной системы, рак паращитовидной железы, рак надпочечника, саркома мягкой ткани, рак уретры, рак пениса, солидные опухоли у детей, опухолевый ангиогенез, рак спинного мозга, глиома мозгового ствола, аденома гипофиза, саркома Капоши, рак меркелевых клеток, эпидермоидный рак, плоскоклеточный рак, вида рака, индуцированного окружающей средой, включая рак, индуцированный асбестом, и другие карциномы и саркомы, а также комбинации указанных видов рака.

Примеры гематологических злокачественных опухолей, которые можно лечить антителами по изобретению, включают в себя лейкозы, лимфомы и миелому, такие как лимфобластный лейкоз/лимфома предшественников B-клеток и неходжкинская лимфома B-клеток, острый промиелоцитный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ), хронический лимфоцитарный лейкоз В-клеток (ХЛЛ)/малая лимфоцитарная лимфома (МЛЛ), острый лимфоцитарный лейкоз B-клеток, пролимфоцитарный лейкоз Bклеток, лимфоплазмоцитарная лимфома, лимфома мантийных клеток (MCL), фолликулярная лимфома (FL), включая низкодифференцированную, среднедифференцированную и высокодифференцированную FL, кожную фолликулярную центральную лимфому, лимфому B-клеток краевой зоны (типов MALT, узелкового и селезеночного), лейкоз ворсистых клеток, диффузную лимфому крупных B-клеток (DLBCL), лимфому Беркитта (BL), плазмоцитому, множественную миелому (ММ), плазмоцитарный лейкоз, посттрансплантационное лимфопролиферативное расстройство, макроглобулинемию Вальденстрема, нарушения функции плазмоцитов, анапластическая крупноклеточная лимфома (ALCL), острый лимфоцитарный лейкоз T-клеток, первичный системный амилоидоз (например, амилоидоз легких цепей), пролимфоцитарный/миелоцитарный лейкоз, острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ), крупногранулярный лимфоцитарный лейкоз (LGL), лейкоз NK-клеток и ходжкинскую лимфому.

Термин нарушение функции плазмоцитов относится к расстройствам, которые характеризуются клональными плазмоцитами и включают в себя множественную миелому, амилоидоз легких цепей и макроглобулинемию Вальденстрема. Амилоидоз легких цепей и макроглобулинемия Вальденстрема могут возникать независимо от множественной миеломы. Они также могут проявляться одновременно со множественной миеломой и развиваться либо до, либо после развития множественной миеломы.

Примеры B-клеточных неходжкинских лимфом представляют собой лимфогранулематоз, первичную выпотную лимфому, внутрисосудистую B-крупноклеточную лимфому, средостенную Bкрупноклеточную лимфому, заболевания тяжелых цепей (включая γ-, μ- и α-цепи), лимфомы, индуцированные терапией иммуносупрессорными агентами, такие как лимфома, вызванная циклоспорином, и лимфома, вызванная метотрексатом.

Пациентов, имеющих рак, включая метастатический рак, который экспрессирует PD-L1, можно лечить антителами по изобретению. Рак может представлять собой меланому, почечно-клеточную карциному, плоскоклеточный немелкоклеточный рак легких (NSCLC), неплоскоклеточный NSCLC, колоректальный рак, устойчивый к кастрации рак предстательной железы, рак яичника, рак желудка, аденокарциному (ACA), плоскоклеточную карциному (SCC), гепатоцеллюлярную карциному (HCC), карциному поджелудочной железы, плоскоклеточную карциному головы и шеи, карциномы пищевода, желудочнокишечного тракта и молочной железы.

Пациентов, имеющих рак, который экспрессирует TIM-3, можно лечить антителами по изобретению. Виды рака, экспрессирующие TIM-3, включают в себя рак шейки матки, рак легкого, NSCLC, острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), диффузную B-крупноклеточную лимфому (DLBCL), меланому, рак почки, почечно-клеточную карциному (RCC), карциному светлых почечных клеток, карциному папиллярных почечных клеток, метастатическую почечно-клеточную карциному, плоскоклеточную карциному, плоскоклеточную карциному пищевода, карциному носоглотки, колоректальный рак, рак молочной железы (например, рак молочной железы, который не экспрессирует один, два или все из рецептора эстрогена, рецептора прогестерона и Her2/neu, например, трижды отрицательный рак молочной железы), мезотелиому, гепатоцеллюлярную карциному и рак яичника. Рак, экспрессирующий TIM-3, может представлять собой метастатический рак.

В некоторых вариантах осуществления субъект имеет солидную опухоль.

В некоторых вариантах осуществления субъект имеет гематологическую злокачественную опухоль.

В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой меланому.

В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой рак легкого.

В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой немелкоклеточный рак легкого (NSCLC).

В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой плоскоклеточный немелкоклеточный рак легких (NSCLC).

В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой неплоскоклеточный NSCLC.

В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой аденокарциному легкого.

В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой почечно-клеточную

- 73 045238 карциному (RCC).

В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой мезотелиому.

В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой карциному носоглотки (NPC).

В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой колоректальный рак.

В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой рак предстательной железы.

В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой устойчивый к кастрации рак предстательной железы.

В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой рак желудка.

В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой рак яичника.

В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой рак печени.

В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой рак поджелудочной железы.

В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой рак щитовидной же лезы.

В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой плоскоклеточную карциному головы и шеи.

В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой карциномы пищевода или желудочно-кишечного тракта.

В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой рак молочной железы.

В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой рак фаллопиевой трубы.

В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой рак головного мозга.

В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой рак уретры.

В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой урогенитальный рак.

В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой эндометриоз.

В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой рак шейки матки.

В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой метастатическое ра ковое поражение.

В некоторых вариантах осуществления гематологическая злокачественная собой лимфому, миелому или лейкоз.

В некоторых вариантах осуществления собой B-клеточную лимфому.

В некоторых вариантах осуществления собой лимфому Беркитта.

В некоторых вариантах осуществления собой ходжкинскую лимфому.

В некоторых вариантах осуществления собой неходжкинскую лимфому.

В некоторых вариантах осуществления собой миелодиспластический синдром.

В некоторых вариантах осуществления собой острый миелоидный лейкоз (ОМЛ).

В некоторых вариантах осуществления гематологическая гематологическая гематологическая гематологическая гематологическая гематологическая гематологическая собой хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ).

В некоторых вариантах осуществления гематологическая собой хронический миеломоноцитарный лейкоз (CMML).

В некоторых вариантах осуществления гематологическая собой множественную миелому (ММ).

В некоторых вариантах осуществления гематологическая опухоль представляет опухоль представляет опухоль представляет опухоль представляет опухоль представляет опухоль представляет опухоль представляет опухоль представляет опухоль представляет опухоль представляет опухоль представляет злокачественная злокачественная злокачественная злокачественная злокачественная злокачественная злокачественная злокачественная злокачественная злокачественная собой плазмоцитому.

В некоторых вариантах осуществления субъект имеет опухоль, которая экспрессирует PD-L1.

В некоторых вариантах осуществления субъект имеет инфильтрированные в опухоль T-лимфоциты (TIL) в опухолевой ткани.

В некоторых вариантах осуществления субъект имеет TIL PD-1+/TIM-3+ в опухолевой ткани.

В некоторых вариантах осуществления субъект имеет увеличение числа инфильтрированных в опухоль T-лимфоцитов (TIL) PD-1+/TIM-3+ в опухолевой ткани.

Термин увеличение числа относится к статистически значимому увеличению у субъекта по сравнению с контролем. Увеличение числа, например, относится к статистически значимому увеличению

- 74 045238 числа TIL у субъекта (например, пациента) до и после лечения антителом PD-1 или другим терапевтическим средством.

В некоторых вариантах осуществления субъект имеет повышенную экспрессию или активность интерферона-гамма (ИФН-γ).

В некоторых вариантах осуществления субъект получал лечение антителом к PD-1.

В некоторых вариантах осуществления субъект устойчив к лечению антителом к PD-1.

В некоторых вариантах осуществления субъект имеет рецидивирующую опухоль после лечения антителом к PD-1.

В некоторых вариантах осуществления субъект получал лечение антителом к PD-1, содержащим VH с SEQ ID NO: 230 и VL с SEQ ID NO: 231 (например, KEYTRUDA® (пембролизумаб)).

В некоторых вариантах осуществления субъект получал лечение антителом к PD-1, содержащим VH с SEQ ID NO: 232 и VL с SEQ ID NO: 233 (например, OPDIVO® (ниволумаб)).

В некоторых вариантах осуществления субъект устойчив к лечению антителом к PD-1, содержащим VH с SEQ ID NO: 230 и VL с SEQ ID NO: 231 (например, KEYTRUDA® (пембролизумаб)).

В некоторых вариантах осуществления субъект устойчив к лечению антителом к PD-1, содержащим VH с SEQ ID NO: 232 и VL с SEQ ID NO: 233 (например, OPDIVO® (ниволумаб)).

В некоторых вариантах осуществления субъект имеет рецидивирующую опухоль после лечения антителом к PD-1, содержащим VH с SEQ ID NO: 230 и VL с SEQ ID NO: 231 (например, KEYTRUDA® (пембролизумаб)).

В некоторых вариантах осуществления субъект имеет рецидивирующую опухоль после лечения антителом к PD-1, содержащим VH с SEQ ID NO: 232 и VL с SEQ ID NO: 233 (например, OPDIVO® (ниволумаб)).

SEQ ID NO: 230

QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGG

INPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDY

WGQGTTVTVSS

SEQ ID NO: 231

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLE

SGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO: 232

QVQLVESGGGWQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRY

YADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO: 233

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIP

ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK

В некоторых вариантах осуществления субъект получал или получает лечение антителом к PD-L1.

В некоторых вариантах осуществления субъект устойчив к лечению антителом PD-L1.

В некоторых вариантах осуществления субъект имеет рецидивирующую опухоль после лечения антителом PD-L1.

В некоторых вариантах осуществления субъект устойчив к лечению или у него произошел рецидив после лечения антителом PD-L1 - дурвалумабом (MEDI-4736). Дурвалумаб содержит VH с SEQ ID NO: 234 и VL с SEQ ID NO: 235.

SEQ ID NO: 234

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVAN

IKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREG

GWFGELAFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO: 235

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY

DASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPWTFG

QGTKVEIK

В некоторых вариантах осуществления субъект устойчив к лечению или у него произошел рецидив после лечения антителом PD-L1 - атезолизумабом.

Атезолизумаб содержит VH с SEQ ID NO: 236 и VL с SEQ ID NO: 237.

- 75 045238

SEQ ID NO: 236

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAW

ISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRH

WPGGFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO: 237

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITORASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYS

ASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQ

GTKVEIK

В некоторых вариантах осуществления субъект устойчив к лечению или у него произошел рецидив после лечения антителом PD-L1 - авелумабом.

Авелумаб содержит VH с SEQ ID NO: 238 и VL с SEQ ID NO: 239.

SEQ ID NO: 238

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSS

IYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIK

LGTVTTVDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO: 239

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMI

YDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRV

FGTGTKVTVL

В некоторых вариантах осуществления субъект устойчив к лечению или у него произошел рецидив после лечения антителом PD-L1 - MDX-1105.

В некоторых вариантах осуществления субъект получал или получает лечение антителом к PD-L2.

В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, субъект устойчив к лечению антителом PD-L2.

В некоторых вариантах осуществления субъект имеет рецидивирующую опухоль после лечения антителом PD-L2.

Различные качественные и/или количественные способы могут применяться для определения рецидивирующих или рефрактерных форм заболевания. Симптомами, которые могут быть связаны с рецидивом или устойчивостью заболевания, являются, например, ухудшение или отсутствие улучшения состояния пациента или возврат или ухудшение различных симптомов, связанных с солидными опухолями, и/или распространение раковых клеток в организме из одного места в другие органы, ткани или клетки.

В настоящем документе было обнаружено, что экспрессия TIM-3 повышена в T-клетках CD8+, выделенных из опухолей после лечения антителом к PD-1. Таким образом, терапевтическое введение антител-антагонистов, специфически связывающих TIM-3, или биспецифических антител-антагонистов PD1/TIM-3, описанных в настоящем документе, субъекту, который получал или получает терапию антителом к PD-1 и устойчив к лечению антителом к PD-1 либо у которого произошел рецидив после или во время лечения антителом к PD-1, может улучшать клинический результат для пациентов.

В изобретении также предложен способ лечения рака у субъекта, который включает в себя введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела-антагониста, специфически связывающего TIM-3, по изобретению, причем субъект проходит или проходил лечение антителом к PD-1.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, содержит VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156.

В изобретении также предложен способ лечения рака у субъекта, который включает в себя введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела-антагониста, которое специфически связывает TIM-3, содержащего VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156, причем субъект проходит или проходил антителом к PD-1 KEYTRUDA® (пембролизумаб), содержащим VH с SEQ ID NO: 230 и VL с SEQ ID NO: 231.

В изобретении также предложен способ лечения рака у субъекта, который включает в себя введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела-антагониста, которое специфически связывает TIM-3, содержащего VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156, причем субъект проходит или проходил лечение антителом к PD-1 OPDIVO® (ниволумаб), содержащим VH с SEQ ID NO: 232 и VL с SEQ ID NO: 233.

В изобретении также предложен способ лечения рака у субъекта, который включает в себя введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела-антагониста, специфически связывающего TIM-3, по изобретению, причем субъект проходит или проходил лечение антителом к PD-L1.

В изобретении также предложен способ лечения рака у субъекта, который включает в себя введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела-антагониста, специфически связывающего

- 76 045238

TIM-3, по изобретению, причем субъект проходит или проходил лечение антителом к PD-L2.

В изобретении также предложен способ лечения рака у субъекта, который включает в себя введение субъекту терапевтически эффективного количества биспецифического антитела-антагониста PD-1/TIM-3 по изобретению, причем субъект проходит или проходил лечение антителом к PD-1.

В изобретении также предложен способ лечения рака у субъекта, который включает в себя введение субъекту терапевтически эффективного количества биспецифического антитела-антагониста PD-1/TIM-3 по изобретению, причем субъект проходит или проходил лечение антителом к PD-L1.

В изобретении также предложен способ лечения рака у субъекта, который включает в себя введение субъекту терапевтически эффективного количества биспецифического антитела-антагониста PD-1/TIM-3 по изобретению, причем субъект проходит или проходил лечение антителом к PD-L2.

В изобретении также предложен способ лечения рака у субъекта, который включает в себя введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела-антагониста, которое специфически связывает PD-1, содержащего VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID NO: 56 в течение времени, достаточного для лечения рака.

В изобретении также предложен способ лечения рака у субъекта, который включает в себя введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела-антагониста, которое специфически связывает PD-1, содержащего VH с SEQ ID NO: 64 и VL с SEQ ID NO: 65 в течение времени, достаточного для лечения рака.

Любое из антител PD-1, TIM-3 или биспецифических антител PD-1/TIM-3 по изобретению, описанных в настоящем документе, может применяться в способах по изобретению.

Термины лечить или лечение относятся к терапевтическому лечению, при котором целью является замедление (уменьшение) нежелательного физиологического изменения или заболевания, такого как развитие или распространение опухоли или опухолевых клеток, либо обеспечение благоприятного или желательного клинического результата во время лечения. Преимущественные или желательные клинические результаты включают в себя ослабление симптомов, уменьшение степени заболевания, стабилизацию (т.е. отсутствие ухудшения) состояния заболевания, задержку или замедление прогрессирования заболевания, отсутствие метастазов, облегчение или временное улучшение болезненного состояния и ремиссию (частичную или полную), как обнаруживаемые, так и не обнаруживаемые. Термин лечение может также означать продление времени жизни по сравнению с ожидаемым в отсутствие лечения субъекта. К субъектам, требующим лечения, относятся те, у которых уже отмечаются нежелательное физиологическое изменение или заболевания, а также субъекты, склонные к физиологическому изменению или заболеванию.

Термин терапевтически эффективное количество относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желательного терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела по изобретению может изменяться в зависимости от факторов, таких как состояние заболевания, возраст, пол и вес индивида, а также способности антитела по изобретению вызывать желательный ответ у индивида. Примеры показателей эффективного терапевтического средства или комбинации терапевтических средств включают в себя, например, улучшение самочувствия пациента, снижение опухолевой нагрузки, прекращение или замедление роста опухоли и/или отсутствие метастазирования раковых клеток в другие места организма.

Комбинированные виды терапии для лечения рака.

Антитела по изобретению можно вводить в комбинации со вторым терапевтическим агентом.

Антитела по изобретению можно вводить в комбинации с одним, двумя, тремя, четырьмя, пятью или шестью дополнительными терапевтическими агентами.

Любое из антител-антагонистов, специфически связывающих PD-1, антител-антагонистов, специфически связывающих TIM-3, или биспецифических антител-антагонистов PD-1/TIM-3 по изобретению можно применять в комбинации со вторым терапевтическим агентом.

Любое из антител-антагонистов, специфически связывающих PD-1, антител-антагонистов, специфически связывающих TIM-3, или биспецифических антител-антагонистов PD-1/TIM-3 по изобретению можно применять в комбинации с одним, двумя, тремя, четырьмя, пятью или шестью дополнительными терапевтическими агентами.

Термин в комбинации с относится к введению антител по изобретению и по меньшей мере одного второго терапевтического агента одновременно как отдельных агентов или последовательно как отдельных агентов в любом порядке. Как правило, каждый агент будут вводить в дозе и/или согласно временной схеме, определенной для этого агента.

В некоторых вариантах осуществления второй терапевтический агент модулирует активность молекулы, участвующей в иммунном цикле против рака, например, молекулы, участвующей в стимуляторном или ингибиторном путях, которые функционируют при высвобождении антигенов раковых клеток, презентации раковых клеток, затравке и активации T-клеток, направлении T-клеток к опухолям, инфильтрации T-клеток в опухоли, распознавании раковых клеток T-клетками и уничтожении раковых клеток. Иммунный цикл против рака описан в Chen and Mellman (2013) Immunity 39:1-10. В некоторых вариантах осуществления второй терапевтический агент модулирует активность молекулы, участвующей в регуля- 77 045238 ции активности регуляторных T-клеток (Treg), костимуляторных или коингибиторных лигандов, экспрессированных на опухолях, активаторных или ингибиторных рецепторов на клетках-естественных киллерах (NK) или иммуносупрессивных факторов в микросреде опухоли. Комбинированные виды иммунотерапии рака описаны в Manoney et al., (2015) Nature Reviews 14:561-584.

Второй терапевтический агент, как правило, усиливает активность стимуляторных молекул и подавляет активность ингибиторных молекул, как известно. Таким образом, термин модулировать относится к усилению иммунного ответа вторым терапевтическим агентом независимо от того, является ли агент сам по себе агонистом или антагонистом конкретной молекулы.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению вводят в комбинации с ингибитором ингибиторной молекулы T-клетки.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению вводят в комбинации с ингибитором ингибиторной молекулы T-клетки PD-1, PD-L1, PD-L2, VISTA, BTNL2, B7-H3, B7-H4, HVEM, HHLA2, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, BTLA, CD160, CEACAM-1, LAIR1, TGFe, IL-10, белком семейства Siglec, KIR, CD96, TIGIT, NKG2A, CD112, CD47, SIRPA или CD244.

В некоторых вариантах осуществления KIR является KIR2DL1, KIR2DL2 или KIR2DL3.

Ингибирование ингибиторных молекул может осуществляться путем ингибирования на уровне ДНК, РНК или белка. В некоторых вариантах осуществления ингибиторную нуклеиновую кислоту (например, дцРНК, миРНК или шпилечная РНК) применяют для ингибирования экспрессии ингибиторной молекулы.

В некоторых вариантах осуществления ингибитор ингибиторной молекулы представляет собой растворимый лиганд ингибиторной молекулы.

В некоторых вариантах осуществления ингибитор ингибиторной молекулы представляет собой антитело-антагонист, специфически связывающее ингибиторную молекулу.

В некоторых вариантах осуществления ингибитор ингибиторной молекулы представляет собой гибридный белок CTLA-4-Fc или TIM-3-Fc.

В некоторых вариантах осуществления ингибитор ингибиторной молекулы представляет собой антитело или фрагмент антитела, который связывает PD-1, PD-L1, PD-L2, VISTA, BTNL2, B7-H3, B7-H4, HVEM, HHLA2, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, BTLA, CD160, CEACAM-1, LAIR1, TGFe, IL-10, белок семейства Siglec, KIR, CD96, TIGIT, NKG2A, CD112, CD47, SIRPA или CD244.

Примерами антител к PD-1, которые можно применять в способах по изобретению, являются те, которые описаны в настоящем документе и в патентах США № 5,897,862 и 7,488,802, а также в международных патентных публикациях № WO2004/004771, WO2004/056875, WO2006/121168, WO2008/156712, WO2010/029435, WO2010/036959, WO2011/110604, WO2012/145493, WO2014/194302, WO2014/206107, WO2015/036394, WO2015/035606, WO2015/085847, WO2015/112900 и WO2015/112805. Примеры антител к PD-1 включают в себя KEYTRUDA® (пембролизумаб) и OPDIVO® (ниволумаб).

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению вводят в комбинации с растворимым лигандом PD-1.

В некоторых вариантах осуществления растворимым лигандом PD-1 является растворимый PD-L1 или растворимый PD-L2, слитый с Fc.

В некоторых вариантах осуществления растворимым лигандом PD-1 является AMP-224.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению вводят в комбинации с антителом к PD-L1 или его антигенсвязывающими фрагментами.

Примерами антител PD-L1, которые можно применять в способах по изобретению, являются антитела MDPL3280A (компания Genentech/Roche) и другие моноклональные антитела человека, раскрытые в патенте США № 7,943,743 и патентной публикации США № 20120039906. Другие связывающие агенты к PD-L1 включают в себя YW243.55.S70 (вариабельные области тяжелой и легкой цепи показаны в последовательностях SEQ ID NO 20 и 21 в WO2010/077634) и MDX-1105 (также называемый BMS-936559 и, например, связывающие агенты к PD-L1, раскрытые в WO2007/005874). Последовательности VH и VL антител к PD-1 дурвалумаба, атезолимумаба и авелумаба, - которые можно применять, раскрыты в настоящем документе.

Примерами антител PD-L2, которые можно применять в способах по изобретению, являются те, которые описаны в патентах США № 8,080,636, 8,188,238, патентной публикации США № 20110271358 и международной патентной публикации № WO2012145493.

Примерами антител B7-H4, которые можно применять в способах по изобретению, являются те, которые описаны в патентах США № 7,888,477, 8,609,816, 7,931,896, европейском патенте № 1817055, патентных публикациях США № US20140037551 и US2014029486, а также международных патентных публикациях № WO2014/100483 и WO2014/159835.

Примерами антител к CTLA-4, которые можно применять в способах по изобретению, являются ипилимумаб (MDX-010, CAS № 477202-00-9) и тремелимумаб (моноклональное антитело IgG2, поставляемое компанией Pfizer, ранее известное как тицилимумаб, CP-675,206).

Примерами антител к LAG-3, которые можно применять в способах по изобретению, являются те,

- 78 045238 которые описаны, например, в международных патентных публикациях № WO2008/132601 и

WO2010/019570.

Примерами антител к CEACAM-1, которые можно применять в способах по изобретению, являются те, которые описаны в патенте США № 8,598,322 и в патентных публикациях США № US2004/0047858, US20140271618 и US20120100158. Без стремления к ограничению какой-либо конкретной теорией, CEACAM-1 был описан как лиганд и партнер TIM-3 (см., например, международную патентную публикацию № WO2014/022332). Синергетический эффект in vivo комбинации антител к TIM-3 и к CEACAM1 был обнаружен в моделях рака ксенотрансплантата (см., например, международную патентную публикацию № WO2014/022332). Опухоли могут применять CEACAM-1 для ингибирования иммунной системы. Таким образом, антитела к CEACAM-1 можно применять в комбинации с антителами по изобретению, описанными в настоящем документе.

Примерами антител к LAIR-1, которые можно применять в способах по изобретению, являются те, которые описаны в патенте США № 6,479,638 и международной патентной публикации № WO2010/078580.

Примеры антител к CD96, которые можно применять в способах изобретения, включают те, которые описаны в международной патентной публикации № WO2015/024060.

Примерами антител к TIM-3, которые можно применять в способах по изобретению, являются те, которые описаны в настоящем документе и в международных патентных публикациях № WO2011/155607, WO2013/006490 и WO2015/117002.

Примерами антител к TIGIT, которые можно применять в способах изобретения, являются те, которые описаны в международных патентных публикациях № US20140056890 и US20150216970. Примером антитела к TIGIT является RG-6058 (MTIG-7192A).

В настоящем документе было обнаружено, что экспрессия TIGIT повышена в T-клетках CD8+, выделенных из опухолей после лечения антителом к TIM-3 в животных моделях рака. Таким образом, терапевтическое введение антител-антагонистов, специфически связывающих TIGIT, субъекту, который уже получал или получает терапию антителом к TIM-3 и устойчив к лечению антителом к TIM-3 либо у которого произошел рецидив после или во время лечения антителом к TIM-3, может улучшить клинический результат для пациентов.

В изобретении также предложен способ лечения рака у субъекта, включающий в себя введение требующему этого субъекту терапевтически эффективного количества антитела-антагониста, которое специфически связывает TIM-3, и антитела-антагониста, которое специфически связывает TIGIT, в течение времени, достаточного для лечения рака.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, которое специфически связывает TIGIT, вводят после введения антитела-антагониста, которое специфически связывает TIM-3.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист, которое специфически связывает TIGIT, и антитело-антагонист, которое специфически связывает TIM-3, вводят одновременно как отдельные агенты или последовательно как отдельные агенты в любом порядке.

Примерами антител к BTLA, которые можно применять в способах изобретения, являются те, которые описаны в патентах США № 8,546,541, 7,479,544, 8,188,232, 8,247,537, 8,563,694 и в международной патентной публикации № WO2014184360.

Примерами антител к TIGIT, которые можно применять в способах изобретения, являются те, которые описаны в международной патентной публикации № US20110280866.

Примерами антител CD47, которые можно применять в способах по изобретению, являются те, которые описаны в патенте США № 8,101,719.

Примеры антител CD244, которые можно применять в способах по изобретению, включают те, которые описаны в патенте США № 5,688,690.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к TIM3 или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к PDL1 или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к PDL2 или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к VISTA или его антигенсвязывающим фрагментом.

- 79 045238

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к

BTNL2 или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к B7H3 или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к B7H4 или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к HVEM или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к HLA2 или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к CTLA-4 или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к LAG-3 или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к BTLA или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к CD160 или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к CEACAM-1 или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к LAIR1 или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к TGFe или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к IL-10 или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к TIGIT или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспе- 80 045238 цифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к KIR или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к NKG2A или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к CD112 или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к CD47 или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к SIRPA или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты к PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к CD244 или его антигенсвязывающим фрагментом.

Молекулы иммунных ингибиторов могут регулировать или синергетически регулировать функции T-клеток, способствуя уклонению опухоли от иммунитета. Таким образом, комбинированные виды терапии с двумя или более ингибиторами ингибиторных молекул могут обеспечивать улучшенную терапию для пациента по сравнению только с монотерапией.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению вводят в комбинации с активатором активирующей молекулы.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению вводят в комбинации с активатором активирующей молекулы CD86, CD80, CD28, ICOS, лиганда ICOS, TMIGD2, CD40, лиганда GITR, лиганда 4-1BB, лиганда OX40, CD70, CD40L, TNFRSF25, LIGHT, GITR, OX-40, CD27, CD137, NKG2D, CD48, CD226 или MICA.

Активацию активирующих молекул можно выполнять с применением, например, растворимых лигандов или производных лигандов активирующих молекул, пептидов или антител-агонистов.

В некоторых вариантах осуществления активатор активирующей молекулы представляет собой растворимый лиганд активирующей T-клетки молекулы.

В некоторых вариантах осуществления активатор активирующей молекулы представляет собой антитело-агонист, специфически связывающее активирующую молекулу.

Примеры антител к CD40, которые можно применять в способах по изобретению, включают в себя CP-870,893 и гуманизированные S2C6, описанные в патенте США № 7,288,251 (антитело 21.4.1) и патенте США № 8,303,955 соответственно, а также антитела к CD40, описанные в международных патентных публикациях № WO2001/056603, WO2001/083755, WO2013/034904 и WO2014/070934.

Примеры агонистов GITR включают в себя, например, гибридные белки GITR и антитела к GITR (например, двухвалентные антитела к GITR), такие как гибридный белок GITR, описанный в патенте США № 6,111,090, европейском патенте № 090505B1, патенте США № 8,586,023, международных патентных публикациях № WO2010/003118 и WO2011/090754, или антитело к GITR, описанное в патентах США № 7,025,962, 7,812,135, 8,388,967, 8,591,886 и 7,618,632, европейских патентах № 1947183 и 1866339 или международных патентных публикациях № WO2011/028683, WO2013/039954, WO2005/007190, WO2007/133822, WO2005/055808, WO1999/40196, WO2001/03720, WO1999/20758, WO2006/083289, WO2005/115451 и WO2011/051726.

В настоящем документе было обнаружено, что экспрессия GITR повышена в T-клетках CD8+, выделенных из опухолей после лечения антителом к PD-1 в животных моделях рака. Восстановление экспрессии GITR на TIL посредством лечения антителом к PD-1 подтверждает, что комбинированная терапия антителами к GITR и PD-1 может улучшать клинический результат для пациентов.

В изобретении также предложен способ лечения рака у субъекта, включающий в себя введение требующему этого субъекту терапевтически эффективного количества антитела-антагониста, которое специфически связывает PD-1, и антитела-агониста, которое специфически связывает GITR, в течение времени, достаточного для лечения рака.

В некоторых вариантах осуществления антитело-агонист, которое специфически связывает GITR, вводят после введения антитела-антагониста, которое специфически связывает PD-1.

В некоторых вариантах осуществления антитело-агонист, которое специфически связывает GITR, и антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, вводят одновременно как отдельные агенты

- 81 045238 или последовательно как отдельные агенты в любом порядке.

Примеры антител к OX40, которые можно применять в способах по изобретению, включают в себя те, которые описаны в патентах США № 8,133,983, 7,960,515, патентной публикации США №

20130280275 и международных патентных публикациях № WO2013028231 и WO2014148895.

Примером антитела к OX40, которое можно применять в способах по изобретению, является антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 309 и VL с SEQ ID NO: 310.

Другим примером антитела к OX40, которое можно применять в способах по изобретению, является антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 311 и VL с SEQ ID NO: 312.

В настоящем изобретении было обнаружено, что экспрессия OX40 повышена в T-клетках CD8+ , выделенных из опухолей после лечения антителом к PD-1 в животных моделях рака. Восстановление экспрессии OX40 на TIL посредством лечения антителом к PD-1 подтверждает, что комбинированная терапия антителами к OX40 и PD-1 может улучшать клинический результат для пациентов.

В изобретении также предложен способ лечения рака у субъекта, включающий в себя введение требующему этого субъекту терапевтически эффективного количества антитела-антагониста, которое специфически связывает PD-1, и антитела-агониста, которое специфически связывает OX40, в течение времени, достаточного для лечения рака.

В некоторых вариантах осуществления антитело-агонист, которое специфически связывает OX40, вводят после введения антитела-антагониста, которое специфически связывает PD-1.

В некоторых вариантах осуществления антитело-агонист, которое специфически связывает OX40, и антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, вводят одновременно как отдельные агенты или последовательно как отдельные агенты в любом порядке.

Примеры антител CD70, которые можно применять в способах по изобретению, включают в себя те, которые описаны в патентной публикации США № US20130336976.

Примеры антител TNFRSF25, которые можно применять в способах по изобретению, включают в себя те, которые описаны в патенте США № 7,708,996.

Примеры антител CD27, которые можно применять в способах по изобретению, включают в себя те, которые описаны в патентной публикации США № US20130336976.

Примеры антител к CD137, которые можно применять в способах по изобретению, включают в себя те, которые описаны в патентах США № 6,974,863, 6,303,121, 7,138,500, 7,288,638, 8,716,452, 8,821,867 и в патентной публикации США № US20130149301.

В настоящем изобретении было обнаружено, что экспрессия CD137 повышена в T-клетках CD8+, выделенных из опухолей после лечения антителом к PD-1 в животных моделях рака. Восстановление экспрессии CD137 на TIL посредством лечения антителом к PD-1 подтверждает, что комбинированная терапия антителами к CD137 и PD-1 может улучшать клинический результат для пациентов.

В изобретении также предложен способ лечения рака у субъекта, включающий в себя введение требующему этого субъекту терапевтически эффективного количества антитела-антагониста, которое специфически связывает PD-1, и антитела-агониста, которое специфически связывает CD137, в течение времени, достаточного для лечения рака.

В некоторых вариантах осуществления антитело-агонист, которое специфически связывает CD137, вводят после введения антитела-антагониста, которое специфически связывает PD-1.

В некоторых вариантах осуществления антитело-агонист, которое специфически связывает CD137, и антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, вводят одновременно как отдельные агенты или последовательно как отдельные агенты в любом порядке.

Примеры антител NKG2D, которые можно применять в способах по изобретению, включают в себя те, которые описаны в патентной публикации США № US20110150870.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к CD86 или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к CD80 или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к CD28 или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к ICOS или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1,

- 82 045238 по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты к PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к лиганду ICOS или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к TMIGD2 или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к CD40 или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты к PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к лиганду GITR или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты к PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к лиганду 4-1BB или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты к PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к лиганду OX40 или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к CD70 или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к CD40L или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к TNFRSF25 или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к LIGHT или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к GITR или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к OX40 или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к CD27 или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к CD137 или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к NKG2D или его антигенсвязывающим фрагментом.

- 83 045238

CD48 или его антигенсвязывающим фрагментом.

CD226 или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с антителом к MICA или его антигенсвязывающим фрагментом.

Комбинацию антител, приведенную в настоящем документе, можно вводить по отдельности, например, как отдельные антитела, или в соединении, например, как биспецифическую или триспецифическую молекулу антитела.

Эффективность комбинаций, описанных в настоящем документе, можно исследовать на животных моделях, известных в данной области.

Антитела по изобретению, описанные в настоящем документе, можно вводить в комбинации с вакциной.

Примерами вакцин являются иммуногенные агенты, такие как раковые клетки, очищенные опухолевые антигены (включая рекомбинантные белки, эпитопы антигена, пептиды и молекулы углеводов), опухолевые антигены, доставляемые пациенту посредством генной терапии, клеток и трансфицированные генами клетки, кодирующие стимулирующие иммунитет цитокины. Примеры вакцин, которые можно применять, включают в себя пептиды антигенов меланомы, такие как пептиды gp100, антигены MAGE, Trp-2, MART1 и/или тирозиназа, или опухолевые клетки, трансфицированные для экспрессии цитокина GM-CSF, вакцины на основе ДНК, вакцины на основе РНК и вакцины на основе вирусной трансдукции, пептиды, или антигены предстательной железы, или пептиды антигенов рака легкого. Вакцина против рака может быть профилактической или терапевтической.

Были разработаны многие экспериментальные стратегии вакцинации против опухолей (см. Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738; см. также Restifo, N. and Sznol, M., Cancer Vaccines, Ch. 61, pp. 3023-3043 in DeVita, V. et al. (eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology. Fifth Edition). В одной из этих стратегий вакцину готовят с применением аутологичных или аллогенных опухолевых клеток. Как показано, эти клеточные вакцины наиболее эффективны, когда опухолевые клетки трансдуцированы для экспрессии GM-CSF. Было показано, что GM-CSF является мощным активатором презентации антигена для вакцинации к опухоли (Dranoff et al., (1993) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 90: 3539-43).

Антитела по изобретению, описанные в настоящем документе, можно вводить в комбинации с одним или набором рекомбинантных белков и/или пептидов, экспрессированных в опухоли или на ней, чтобы вызвать иммунный ответ на эти белки. Иммунная система обычно принимает эти белки как аутоантигены и поэтому толерантна к ним. Опухолевый антиген может также включать в себя белок теломеразы, который требуется для синтеза теломер хромосом и который экспрессирован при более чем 85% видов рака у человека, но лишь в ограниченном числе соматических тканей (Kim et al., (1994) Science 266: 2011-2013). Опухолевые антигены могут также представлять собой неоантигены, экспрессированные в раковых клетках или на них в результате соматических мутаций, которые изменяют последовательность белка или создают гибридные белки из двух неродственных последовательностей (например, bcr-abl в хромосоме Philadelphia) или идиотипы из B-клеточных опухолей. Опухолевые антигены могут представлять собой антигенные эпитопы простат-специфического антигена (PSA), мезотелина, простат-специфического мембранного антигена (PSMA), синовиальной саркомы X2 (SSX2), NKX3.1, кислой фосфатазы простаты (PAP) или рецепторов фактора роста эпидермиса либо пептиды, специфические для вариантов EGFR, такие как известный EGFRvIII, сверхэкспрессированный на опухолевых клетках.

Другие вакцины против опухолей могут включать в себя белки из вирусов, участвующих в раковых заболеваниях у человека, такие как вирусы папилломы человека (ВПЧ), вирусы гепатита (ВГВ и ВГС), герпес-вирус саркомы Капоши (KHSV) и вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ). Другую форму специфических опухолевых антигенов, которые можно применять в комбинации с антителами по изобретению, описанными в настоящем документе, представляют собой очищенные белки теплового шока (HSP), выделенные из самой опухолевой ткани. HSP содержат фрагменты белков из опухолевых клеток и проявляют высокую эффективность при доставке в антигенпрезентирующие клетки для возбуждения иммунитета против опухоли (Suot and Srivastava (1995) Science 269:1585-1588; Tamura et al., (1997) Science 278:117-120).

Дендритные клетки (DC) являются мощными антигенпрезентирующими клетками, которые можно применять для затравки специфических ответов на антиген. DC можно получить ex vivo и нагрузить различными белковыми и пептидными антигенами, а также экстрактами опухолевых клеток (Nestle et al., (1998) Nature Medicine 4: 328-332). DC можно также трансформировать генетическими средствами для экспрессии этих опухолевых антигенов. DC также сливали непосредственно с опухолевыми клетками в

- 84 045238 целях иммунизации (Kugler et al., (2000) Nature Medicine 6:332-336). В качестве способа вакцинации иммунизацию DC можно эффективно комбинировать с антителами по изобретению, описанными в настоящем документе, для активации более мощных ответов против опухолей.

В некоторых вариантах осуществления вакцина представляет собой полипептид или его фрагмент либо ДНК или РНК, кодирующую полипептид или его фрагмент, экспрессированный на опухолевых клетках.

В некоторых вариантах осуществления полипептид или его фрагмент, экспрессированный на опухолевых клетках, представляет собой PSMA.

В некоторых вариантах осуществления полипептид или его фрагмент, экспрессированный на опухолевых клетках, представляет собой мезотелин.

В некоторых вариантах осуществления полипептид или его фрагмент, экспрессированный на опухолевых клетках, представляет собой вариант EGFR или EGFR, такой как EGFRvIII.

В некоторых вариантах осуществления полипептид или его фрагмент, экспрессированный на опухолевых клетках, представляет собой PAP.

В некоторых вариантах осуществления полипептид или его фрагмент, экспрессированный на опухолевых клетках, представляет собой синовиальную саркому X2 (SSX2).

В некоторых вариантах осуществления полипептид или его фрагмент, экспрессированный на опухолевых клетках, представляет собой NKX3.1.

В некоторых вариантах осуществления опухолевые клетки представляют собой клетки меланомы, рака легкого, плоскоклеточного немелкоклеточного рака легкого (NSCLC), неплоскоклеточного NSCLC, колоректального рака, рака предстательной железы, устойчивого к кастрации рака предстательной железы, рака яичника, рака желудка, рака печени, рака поджелудочной железы, рака щитовидной железы, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, карцином пищевода или желудочно-кишечного тракта или рака молочной железы.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению вводят в комбинации с вакциной против почечно-клеточной карциномы (RCC).

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению вводят в комбинации с вакциной против рака легкого.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению вводят в комбинации с вакциной против рака предстательной железы.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с вакциной против опухоли, которая содержит фрагмент пептида EGFR или EGFRvIII либо вектор, кодирующий фрагмент пептида EGFR или EGFRvIII.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с вакциной против опухоли, которая содержит фрагмент пептида мезотелина либо вектор, кодирующий фрагмент пептида мезотелина.

В некоторых вариантах осуществления антитела-антагонисты, специфически связывающие PD-1, по изобретению, антитела-антагонисты, специфически связывающие TIM-3, по изобретению или биспецифические антитела-антагонисты PD-1/TIM-3 по изобретению вводят в комбинации с вакциной против опухоли, которая содержит фрагмент пептида простат-специфического антигена либо вектор, кодирующий фрагмент пептида простат-специфического антигена.

Приемлемые векторы, которые можно применять в способах по изобретению, известны и включают в себя лентивирусные векторы, аденовирусные векторы, минимальный вектор нуклеиновых кислот (MNAV), вирус коровьей оспы, вирус ветряной оспы, VRP-производное альфа-вируса, Saccharomyces cerevisiae, MVA, Listeria monocytogenes, плазмиду на основе pVAX; например, см. Pol et al., (2014) Oncoimmunology 1 (3): e28185.

Антитела по изобретению можно вводить в комбинации со стандартным лечением рака.

Антитела по изобретению, описанные в настоящем документе, можно вводить в комбинации со стандартными курсами химиотерапевтического лечения рака. В этих случаях возможно уменьшение дозы вводимого химиотерапевтического агента (Mokyr et al., (1998) Cancer Research 58: 5301-5304).

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению можно вводить в комбинации с одной или более из других молекул антител, химиотерапии, другой противораковой терапии (например, таргетной противораковой терапии или онколитических лекарственных средств), цитотоксических агентов, цитокинов, хирургических и/или радиационных процедур.

Примеры цитотоксических агентов, которые можно вводить в комбинации с антителами по изобретению, включают в себя антимикротубулиновые агенты, ингибиторы топоизомеразы, антиметаболиты,

- 85 045238 ингибиторы митоза, алкилирующие агенты, антрациклины, алкалоиды барвинка, агенты интеркаляции, агенты, способные помешать на сигнальном пути трансдукции, агенты, способствующие апоптозу, ингибиторы протеосом и облучение (например, местное или общее облучение организма).

Стандартные терапевтические агенты включают в себя анастрозол (Arimidex®), бикалутамид (Casodex®), блеомицина сульфат (Blenoxane®), бусульфан (Myleran®), бусульфан для инъекций (Busulfex®), капецитабин (Xeloda®), N-4-пентоксикарбонил-5-дезокси-5-фторцитидин, карбоплатин (Paraplatin®), кармустин (BiCNU®), хлорамбуцил (Leukeran®), цисплатин (Platinol®), кладрибин (Leustatin®), циклофосфамид (Cytoxan® или Neosar®), цитарабин, цитозина арабинозид (Cytosar-U®), липосомы цитарабина для инъекций (DepoCyt®), дакарбазин (DTIC-Dome®), дактиномицин (Actinomycin D, Cosmegan), даунорубицина гидрохлорид (Cerubidine®), липосомы даунорубицина цитрата для инъекций (DaunoXome®), дексаметазон, доцетаксел (Taxotere®), доксорубицина гидрохлорид (Adriamycin®, Rubex®), этопозид (Vepesid®), флударабина фосфат (Fludara®), 5-фторурацил (Adrucil®, Efudex®), флутамид (Eulexin®), тезацитибин, гемцитабин (дифтордезоксицитидин), гидроксимочевина (Hydrea®), идарубицин (Idamycin®), ифосфамид (IFEX®), иринотекан (Camptosar®), L-аспарагиназа (ELSPAR®), лейковорин кальция, мелфалан (Alkeran®), 6-меркаптопурин (Purinethol®), метотрексат (Folex®), митоксантрон (Novantrone®), паклитаксел (Taxol®), феникс (иттрий-90/MX-DTPA), пентостатин, имплантат полифепросан-20 с кармустином (Gliadel®), тамоксифена цитрат (Nolvadex®), тенипозид (Vumon®), 6тиогуанин, тиотепа, тирапазамин (Tirazone®), топотекана гидрохлорид для инъекций (Hycamptin®), винбластин (Velban®), винкристин (Oncovin®), винорелбин (Navelbine®), ибрутиниб, идеалисиб и брентуксимаб ведотин.

Примеры алкилирующих агентов включают в себя производные горчичного газа, производные этиленимина, алкилсульфонаты, нитрозомочевины и триазены: горчичный урацил (Aminouracil Mustard®, Chlorethaminacil®, Demethyldopan®, Desmethyldopan®, Haemanthamine®, Nordopan®, Uracil Nitrogen Mustard®, Uracillost®, Uracilmostaza®, Uramustin®, Uramustine®), хлорметин (Mustargen®), циклофосфамид (Cytoxan®, Neosar®, Clafen®, Endoxan®, Procytox®, Revimmune™), ифосфамид (Mitoxana®), мелфалан (Alkeran®), хлорамбуцил (Leukeran®), пипоброман (Amedel®, Vercyte®), триэтиленмеламин (Hemel®, Hexalen®, Hexastat®), триэтилентиофосфорамин, темозоломид (Temodar®), тиотепа (Thioplex®), бусульфан (Busilvex®, Myleran®), кармустин (BiCNU®), ломустин (CeeNU®) и стрептозоцин (Zanosar®). Дополнительные примеры алкилирующих агентов включают в себя оксалиплатин (Eloxatin®), темозоломид (Temodar® и Temodal®), дактиномицин (известный также как актиномицин-D, Cosmegen®), алтретамин (известный также как гексаметилмеламин (HMM), Hexalen®), бендамустин (Treanda®), карбоплатин (Paraplatin®), ломустин (известный также как CCNU, CeeNU®), цисплатин (известный также как CDDP, Platinol® и Platinol®-AQ), хлорамбуцил (Leukeran®), преднумустин, прокарбазин (Matulane®) и тиотепа (известный также как тиофосфоамид, TESPA и TSPA, Thioplex®).

Примеры антрациклинов включают в себя, например, доксорубицин (Adriamycin® и Rubex®); блеомицин (Lenoxane®), даунорубицин (даунорубицина гидрохлорид, дауномицина и рубидомицина гидрохлорид, Cerubidine®), липосомы даунорубицина (липосомы даунорубицина цитрата, DaunoXome®), митоксантрон (DHAD, Novantrone®), эпирубицин (Ellence™), идарубицин (Idamycin®, Idamycin PFS®), митомицин C (Mutamycin®), гелданамицин, гербимицин, равидомицин и дезацетилравидомицин.

Примеры алкалоидов барвинка, которые можно применять в комбинации с антителами по изобретению, включают в себя винорелбина тартрат (Navelbine®), винкристин (Oncovin®) и виндезин (Eldisine®), винбластин (известный также как винбластина сульфат, винкалейкобластин и VLB, AlkabanAQ® и Velban®) и винорелбин (Navelbine®).

Примерами ингибиторов протеосом, которые можно применять в комбинации с антителами по изобретению, являются бортезомиб (Velcade®); карфилзомиб (Kyprolis®), иксазомиб (Ninlaro®), маризомиб (NPI-0052) и деланзомиб (CEP-18770).

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению вводят в комбинации с ингибитором тирозинкиназы (например, ингибитором рецептора тирозинкиназы (RTK)). Примеры ингибиторов тирозинкиназы включают в себя ингибитор пути фактора роста эпидермиса (EGF) (например, ингибитор рецептора фактора роста эпидермиса (EGFR)), ингибитор пути фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) (например, ингибитор рецептора фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR) (например, ингибитор VEGFR-1, ингибитор VEGFR-2, ингибитор VEGFR-3)), ингибитор пути фактора роста из тромбоцитов (PDGF) (например, ингибитор рецептора фактора роста из тромбоцитов (PDGFR) (например, ингибитор PDGFR-β)), ингибитор RAF-1, ингибитор KIT и ингибитор RET. В некоторых вариантах осуществления вторым терапевтическим агентом является акситиниб (AG013736), бозутиниб (SKI-606), цедираниб (RECENTIN™, AZD2171), дасатиниб (SPRYCEL®, BMS-354825), эрлотиниб (TARCEVA®), гефитиниб (IRESSA®), иматиниб (Gleevec®, CGP57148B, STI-571), лапатиниб (TYKERB®, TYVERB®), лестауртиниб (CEP-701), нератиниб (HKI-272), нилотиниб (TASIGNA®), семаксаниб (семаксиниб, SU5416), сунитиниб (SUTENT®, SU11248), тоцераниб (PALLADIA®), вадетаниб (ZACTIMA®, ZD6474), ваталаниб (PTK787,

- 86 045238

PTK/ZK), трастузумаб (HERCEPTIN®), бевацизумаб (AVASTIN®), ритуксимаб (RITUXAN®), цетуксимаб (ERBITUX®), панитумумаб (VECTIBIX®), ранибизумаб (Lucentis®), нилотиниб (TASIGNA®), сорафениб (NEXAVAR®), алемтузумаб (CAMPATH®), гемтузумаб озогамицин (MYLOTARG®), ENMD2076, PCI-32765, AC220, довитиниба лактат (TKI258, CHIR-258), BIBW 2992 (TOVOK™), SGX523, PF04217903, PF-02341066, PF-299804, BMS-777607, ABT-869, MP470, BIBF 1120 (VARGATEF®), AP24534, JNJ-26483327, MGCD265, DCC-2036, BMS-690154, CEP-11981, тивозаниб (AV-951), OSI-930, MM-121, XL-184, XL-647, XL228, AEE788, AG-490, AST-6, BMS-599626, CUDC-101, PD153035, пелитиниб (EKB569), вадетаниб (зактима), WZ3146, WZ4002, WZ8040, ABT-869 (линифаниб), AEE788, AP24534 (понатиниб), AV-951 (тивозаниб), акситиниб, BAY 73-4506 (регорафениб), бриваниба аланинат (BMS-582664), бриваниб (BMS-540215), цедираниб (AZD2171), CHIR-258 (довитиниб), CP 673451, CYC116, E7080, Ki8751, мазитиниб (AB1010), MGCD-265, мотезаниба дифосфат (AMG-706), MP-470, OSI-930, пазопаниба гидрохлорид, PD173074, сорафениба тозилат (Bay 43-9006), SU 5402, TSU-68 (SU6668), ваниб, XL880 (GSK1363089, EXEL-2880). Выбранные ингибиторы тирозинкиназы выбирают из сунитиниба, эрлотиниба, гефитиниба или сорафениба. В некоторых вариантах осуществления ингибитором EGFR является биспецифическое антитело EGFRc-Met (EM-1 mAb), содержащее тяжелую и легкую цепи с SEQ ID NO: 249, 250, 251 и 252 (US2014/0141000).

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению вводят в комбинации с ингибиторами рецептора фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), которые включают в себя бевацизумаб (Avastin®), акситиниб (Inlyta®), бриваниба аланинат (BMS-582664, (S)-((R)-1-(4-(4-фтор-2-метил-1H-индол-5илокси)-5-метилпирроло[2,1-f][1,2,4]триазин-6-илокси)пропан-2-ил)2-аминопропаноат), сорафениб (Nexavar®); пазопаниб (Votrient®), сунитиниба малат (Sutent®), цедираниб (AZD2171, CAS 288383-201), варгатеф (BIBF1120, CAS 928326-83-4), форетиниб (GSK1363089), телатиниб (BAY57-9352, CAS 332012-40-5), апатиниб (YN968D1, CAS 811803-05-1), иматиниб (Gleevec®), понатиниб (AP24534, CAS 943319-70-8), тивозаниб (AV951, CAS 475108-18-0), регорафениб (BAY73-4506, CAS 755037-03-7), ваталаниба дигидрохлорид (PTK787, CAS 212141-51-0), бриваниб (BMS-540215, CAS 649735-46-6), вандетаниб (Caprelsa® или AZD6474), мотезаниба дифосфат (AMG706, CAS 857876-30-3, N-(2,3-дигидро-3,3диметил-1H-индол-6-ил)-2-[(4-пиридинилметил)амино]-3-пиридинкарбоксамид, описанный в публикации PCT № WO 02/066470), довитиниб-димолочная кислота (TKI258, CAS 852433-84-2), линфаниб (ABT869, CAS 796967-16-3); кабозантиниб (XL184, CAS 849217-68-1), лестауртиниб (CAS 111358-88-4); N-[5-κ5-(1,1-диметилэтил)-2-оксазолил]метил]тио]-2-тиазолил]-4-пиперидинкарбоксамид (BMS38703, CAS 345627-80-7); (3R,4R)-4-амино-1-((4-((3-метоксифенил)амино)пирроло[2,1-f][1,2,4]триазин-5ил)метил)пиперидин-3-ол (BMS690514); N-(3,4-дихлор-2-фторфенил)-6-метокси-7[[(3aα,5β,6aα)октагидро-2-метилциклопента[c]пиррол-5-ил]метокси]-4-хиназолинамин (XL647, CAS 781613-23-8); 4-метил-3-[[1-метил-6-(3-пиридинил)-1H-пиразоло[3,4-d]пиримидин-4-ил]амино]-N-[3(трифторметил)фенил]бензамид (BHG712, CAS 940310-85-0) и афлиберцепт (Eylea®).

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению вводят в комбинации с ингибитором PI3K. В одном варианте осуществления ингибитор PI3K представляет собой ингибитор дельта- и гамма-изоформ PI3K. Примеры ингибиторов PI3K, которые можно применять, описаны, например, в WO 2010/036380, WO 2010/006086, WO 09/114870, WO 05/113556, GSK 2126458, GDC-0980, GDC-0941, Sanofi XL147, XL756, XL147, PF-46915032, BKM 120, CAL-101, CAL 263, SF1126, PX-886, и ингибитор двойного PI3K (например, Novartis BEZ235).

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению вводят в комбинации с ингибитором mTOR, например, одним или более ингибиторами mTOR, которые выбирают из одного или более из рапамицина, темсиролимуса (TORISEL®), AZD8055, BEZ235, BGT226, XL765, PF-4691502, GDC0980, SF1126, OSI-027, GSK1059615, KU-0063794, WYE-354, Palomid 529 (P529), PF-04691502, или PKI-587, ридафоролимуса (ранее известного как деферолимус, (1R,2R,4S)-4-[(2R)2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-дигидрокси-19,30-диметокси15,17,21,23,29,35-гексаметил-2,3,10,14,20-пентаоксо-11,36-диокса-4азатрицикло[30.3.1.04,9]гексатриаконта-16,24,26,28-тетраен-12-ил]пропил]-2-метоксициклогексила диметилфосфинат, также известного как AP23573 и MK8669 и описанного в публикации PCT № WO 03/064383); эверолимуса (Afinitor® или RAD001); рапамицина (AY22989, Sirolimus®); симапимода (CAS 164301-51-3); эмсиролимуса, (5-{2,4-бис-[(3S)-3-метилморфолин-4-ил]пиридо[2,3-d]пиримидин-7-ил}-2метоксифенил)метанола (AZD8055); 2-амино-8-[транс-4-(2-гидроксиэтокси)циклогексил]-6-(6-метокси-3пиридинил)-4-метилпиридо[2,3-d]пиримидин-7(8H)-она (PF04691502, CAS 1013101-36-4) и N2-[1,4диоксо-4-[[4-(4-оксо-8-фенил-4H-1-бензопиран-2-ил)морфолиний-4-ил]метокси]бутил]-Lаргинилглицил-L-α-аспартил-L-серина (SEQ ID NO: 237), внутренней соли (SF1126, CAS 936487-67-1) и XL765.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению вводят в комбинации с ингибитором BRAF, например, GSK2118436, RG7204, PLX4032, GDC-0879, PLX4720 и сорафениба тозилат (Bay 43-9006).

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению вводят в комбинации с ингибито

- 87 045238 ром MEK.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению вводят в комбинации с ингибитором JAK2, например, CEP-701, INCB18424, CP-690550 (тасоцитиниб).

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению вводят в комбинации с паклитакселом или агентом паклитаксела, например, с TAXOL®, со связанным с белком паклитакселом (например, ABRAXANE®). Примеры агентов паклитаксела включают в себя наночастицы связанного с альбумином паклитаксела (ABRAXANE, продается компанией Abraxis Bioscience), связанный с докозагексаеновой кислотой паклитаксел (ДГК-паклитаксел, Taxoprexin, продается компанией Protarga), связанный с полиглутаматом паклитаксел (PG-паклитаксел, паклитаксел полиглумекс, CT-2103, XYOTAX, продается компанией Cell Therapeutic), активируемое опухолью пролекарство (TAP), ANG105 (Angiopep-2, связанный с тремя молекулами паклитаксела, продается компанией ImmunoGen), паклитаксел-EC-1 (паклитаксел, связанный с erbB2-распознающим пептидом EC-1; см. Li et al., Biopolymers (2007) 87:225-230) и конъюгированный с глюкозой паклитаксел (например, 2'-паклитаксел метил-2-глюкопиранозилсукцинат, см. Liu et al., (2007) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 17:617-620).

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению вводят в комбинации с клеточной иммунотерапией (например, Provenge (например, Sipuleucel)) и необязательно в комбинации с циклофосфамидом.

Примеры терапевтических агентов, которые можно применять в комбинации с антителами по изобретению для лечения рака поджелудочной железы, включают себя химиотерапевтический агент, например, паклитаксел или агент паклитаксела (например, композицию паклитаксела, такую как TAXOL, стабилизированную альбумином композицию наночастиц паклитаксела (например, ABRAXANE) или липосомную композицию паклитаксела); гемцитабин (например, гемцитабин отдельно или в комбинации с AXP107-11); другие химиотерапевтические агенты, такие как оксалиплатин, 5-фторурацил, капецитабин, рубитекан, эпирубицин-гидрохлорид, NC-6004, цисплатин, доцетаксел (например, TAXOTERE), митомицин C, ифосфамид; интерферон; ингибитор тирозинкиназы (например, ингибитор EGFR (например, эрлотиниб, панитумумаб, цетуксимаб, нимотузумаб)); ингибитор рецептора HER2/neu (например, трастузумаб); ингибитор двойной киназы (например, бозутиниб, саракатиниб, лапатиниб, вандетаниб); ингибитор множественной киназы (например, сорафениб, сунитиниб, XL184, пазопаниб); ингибитор VEGF (например, бевацизумаб, AV-951, бриваниб); радиоиммунотерапию (например, XR303); вакцину против рака (например, GVAX, пептид сурвивин); ингибитор COX-2 (например, целекоксиб); ингибитор рецептора IGF-1 (например, AMG 479, MK-0646); ингибитор mTOR (например, эверолимус, темсиролимус), ингибитор IL-6 (например, CNTO 328); ингибитор циклин-зависимой киназы (например, P276-00, UCN-01); соединение, направленное на изменение энергетического метаболизма (AEMD) (например, CPI-613); ингибитор HDAC (например, вориностат); агонист рецептора-2 к TRAIL (TR-2) (например, конатумумаб); ингибитор MEK (например, AS703026, селуметиниб, GSK1120212); ингибитор двойной киназы Raf/MEK (например, RO5126766), ингибитор сигнализации Notch (например, MK0752), гибридный белок моноклонального антитела с антителом (например, L19IL2), куркумин; ингибитор HSP90 (например, танеспимицин, STA-9090), rIL-2; денилейкин дифтитокс; ингибитор топоизомеразы 1 (например, иринотекан, PEP02); статин (например, симвастатин), ингибитор фактора VIIa (например, PCI-27483), ингибитор AKT (например, RX-0201), активируемое гипоксией пролекарство (например, TH302), метформина гидрохлорид, ингибитор гамма-секретазы (например, R04929097), ингибитор рибонуклеотид-редуктазы (например, 3-AP), иммунотоксин (например, HuC242-DM4), ингибитор PARP (например, KU-0059436, велипариб), ингибитор CTLA-4 (например, CP-675,206, ипилимумаб), терапию AdV-tk, ингибитор протеосом (например, бортезомиб (Velcade), NPI-0052), тиазолидиндион (например, пиоглитазон), NPC-1C; ингибитор киназы Aurora (например, R763/AS703569), ингибитор CTGF (например, FG-3019), siG12D LODER, и радиационную терапию (например, томотерапию, стереотаксическое облучение, протонную терапию), хирургию и их комбинацию. В определенных вариантах осуществления с антителами по изобретению можно применять комбинацию паклитаксела или агента паклитаксела с гемцитабином.

- 88 045238

Примеры терапевтических агентов, которые можно применять в комбинации с антителами по изобретению для лечения мелкоклеточного рака легкого (SCLC), включают в себя такие одобренные лекарственные средства для лечения SCLC, как метотрексат (Folex®, Mexate®), эверолимус (Afinitor®), доксорубицина гидрохлорид, этопозида фосфат (Etopophos®), топотекана гидрохлорид (Hycamtin®), мехлоретамина гидрохлорид (Mustargen®), топотекана гидрохлорид. Другими терапевтическими агентами, которые можно применять, являются карбоплатин, цисплатин, оксалиплатин, иринотекан, гемцитабин, липосомный SN-38, бендамустин, темозоломид, белотекан, NK012, FR901228, флавопиридол), ингибитор тирозинкиназы (например, ингибитор EGFR (например, эрлотиниб, гефитиниб, цетуксимаб, панитумумаб), ингибитор множественной киназы (например, сорафениб, сунитиниб), ингибитор VEGF (например, бевацизумаб, вандетаниб), вакцина против рака (например, GVAX); ингибитор Bcl-2 (например, облимерсен натрий, ABT-263), ингибитор протеосом (например, бортезомиб (Velcade), NPI-0052), паклитаксел или агент паклитаксела; доцетаксел, ингибитор рецептора IGF-1 (например, AMG 479), ингибитор HGF/SF (например, AMG 102, MK-0646), хлорохин, ингибитор киназы Aurora (например, MLN8237), радиоиммунотерапия (например, TF2), ингибитор HSP90 (например, танеспимицин, STA-9090), ингибитор mTOR (например, эверолимус), биспецифическое антитело к Ep-CAM/CD3 (например, MT110), ингибитор CK-2 (например, CX-4945), ингибитор HDAC (например, белиностат), антагонист SMO (например, BMS 833923), пептидная вакцина против рака и радиационная терапия (например, радиационная терапия с модуляцией интенсивности (IMRT), гипофракционированная радиационная терапия, радиационная терапия по местам гипоксии), хирургия и их комбинации.

Примеры терапевтических агентов, которые можно применять в комбинации с антителами по изобретению для лечения немелкоклеточного рака легкого, включают в себя одобренные лекарственные средства для лечения NSCLC, в том числе метотрексат (Folex®, Mexate®), паклитаксел (Abraxane®), афатиниб (Gilotrif®), эверолимус (Afinitor®), алектиниб (Alecensa®), пеметрексед динатрий (Alimta®), бевацизумаб (Avastin®), карбоплатин, церитиниб (Zykadia®), кризотиниб (Xalkori®), рамуцирумаб (Cyramza®), доцетаксел, эверолимус (Afinitor®), гефитиниб (Iressa®), афатиниба дималеат (Gilotrif®), гемцитабина гидрохлорид (Gmezar®), пембролизумаб (Keytruda®), мехлоретамина гидрохлорид (Mustargen®), винорелбина тартрат (Navelbine®), нецитумумаб (Portrazza®), ниволумаб (Opdivo®), осимертиниб, паклитаксел (Taxol®), карбоплатин, пеметрексед динатрий, рамуцирумаб (Cyramza®), осимертиниб (Tagrisso®). Другими терапевтическими агентами, которые можно применять, являются винорелбин, цисплатин, доцетаксел, пеметрексед динатрий, этопозид, гемцитабин, карбоплатин, липосомный SN-38, TLK286, темозоломид, топотекан, пеметрексед динатрий, азацитидин, иринотекан, тегафур-гимерацилотерацил-калий, сапацитабин, ингибитор тироизинкиназы (например, ингибитор EGFR (например, эрлотиниб, гефитиниб, цетуксимаб, панитумумаб, нецитумумаб, PF-00299804, нимотузумаб, RO5083945)), ингибитор MET (например, PF-02341066, ARQ 197), ингибитор киназы PI3K (например, XL147, GDC0941), ингибитор двойной киназы Raf/MEK (например, RO5126766), ингибитор двойной киназы PI3K/mTOR (например, XL765), ингибитор SRC (например, дасатиниб), двойной ингибитор (например, BIBW 2992, GSK1363089, ZD6474, AZD0530, AG-013736, лапатиниб, MEHD7945A, линифаниб), ингибитор множественной киназы (например, сорафениб, сунитиниб, пазопаниб, AMG 706, XL184, MGCD265, BMS-690514, R935788), ингибитор VEGF (например, эндостар, эндостатин, бевацизумаб, цедираниб, BIBF 1120, акситиниб, тивозаниб, AZD2171), вакцина против рака (например, вакцина липосом BLP25, GVAX, рекомбинантная ДНК и аденовирус, экспрессирующий белок L523S), ингибитор Bcl-2 (например, облимерсен натрий), ингибитор протеосом (например, бортезомиб, карфилзомиб, NPI-0052, MLN9708), паклитаксел или агент паклитаксела, доцетаксел, ингибитор рецептора IGF-1 (например, циксутумумаб, MK-0646, OSI 906, CP-751,871, BIIB022), гидроксихлорохин, ингибитор HSP90 (например, танеспимицин, STA-9090, AUY922, XL888), ингибитор mTOR (например, эверолимус, темсиролимус, ридафоролимус), биспецифическое антитело Ep-CAM/CD3 (например, MT110), ингибитор CK-2 (например, CX4945), ингибитор HDAC (например, MS 275, LBH589, вориностат, вальпроевая кислота, FR901228), ингибитор DHFR (например, пралатрексат), ретиноид (например, бексаротен, третиноин), конъюгат антитела с лекарственным средством (например, SGN-15), бисфосфонат (например, золедроновая кислота), вакцина против рака (например, белагенпуматуцел-L), низкомолекулярный гепарин (LMWH) (например, тинзапарин, эноксапарин), GSK1572932A, мелатонин, талактоферрин, димесна, ингибитор топоизомеразы (например, амрубицин, этопозид, каренитецин), нелфинавир, циленгитид, ингибитор ErbB3 (например, MM-121, U3-1287), ингибитор сурвивина (например, YM155, LY2181308), эрибулина мезилат, ингибитор COX-2 (например, целекоксиб), пегфилграстим, ингибитор Polo-образной киназы 1 (например, BI 6727), агонист рецептора 2 к TRAIL (TR-2) (например, CS-1008), конъюгат пептида CNGRC (SEQ ID NO: 225) и ФНО-альфа, дихлорацетат (DCA), ингибитор HGF (например, SCH 900105), SAR240550, агонист PPAR-гамма (например, CS-7017), ингибитор гамма-секретазы (например, RO4929097), эпигенетическая терапия (например, 5-азацитидин), нитроглицерин, ингибитор MEK (например, AZD6244), ингибитор зависимой от циклина киназы (например, UCN-01), холестерин-Fus1, агент антитубулина (например, E7389), ингибитор фарнезил-OH-трансферазы (например, лонафарниб), иммунотоксин (например, BB-10901, SS1 (dsFv) PE38), фондапаринукс, разрушающий сосуды агент (например, AVE8062), ингиби

- 89 045238 тор PD-L1 (например, MDX-1105, MDX-1106), бета-глюкан, NGR-hTNF, EMD 521873, ингибитор MEK (например, GSK1120212), аналог эпотилона (например, иксабепилон), ингибитор кинезина веретена (например, 4SC-205), нацеленный на теломеры агент (например, KML-001), ингибитор пути P70 (например, LY2584702), ингибитор AKT (например, MK-2206), ингибитор ангиогенеза (например, леналидомид), ингибитор сигнализации Notch (например, OMP-21M18), биспецифическое антитело EM-1 к EGFR/cMet, как описано в US2014/0141000A1, радиационная терапия, хирургия и их комбинации.

Примеры терапевтических агентов, которые можно применять в комбинации с антителами по изобретению для лечения рака яичника, включают в себя одобренные лекарственные средства для лечения рака яичника, такие как мелфалан (Alkeran®), бевацизумаб (Avastin®), карбоплатин, циклофосфамид (Clafen®, Cytoxan®), клисплатин, доксорубицина гидрохлорид, гемцитабина гидрохлорид (Gemzar®), топотекана гидрохлорид (Hycamtin®), Olaparib (Lynparza®), карбоплатин, цисплатин, паклитаксел (Taxol®), тиотепа и топотекана гидрохлорид. Другими терапевтическими агентами, которые можно применять, являются ифосфамид, олапариб, оксалиплатин, пеметрексед динатрий, SJG-136, этопозид, децитабин; иммунотерапия (например, APC8024, ореговомаб, OPT-821), ингибитор тирозинкиназы (например, ингибитор EGFR (например, эрлотиниб), ингибитор двойной киназы (например, E7080), ингибитор множественной киназы (например, AZD0530, JI-101, сорафениб, сунитиниб, пазопаниб), ингибитор VEGF (например, бевацизумаб, BIBF 1120, цедираниб, AZD2171), ингибитор PDGFR (например, IMC-3G3), паклитаксел, ингибитор топоизомеразы (например, каренитецин, иринотекан), ингибитор HDAC (например, вальпроат, вориностат), ингибитор рецептора фолата (например, фарлетузумаб), ингибитор ангиопоэтина (например, AMG 386), аналог эпотилона (например, иксабепилон), ингибитор протеосом (например, карфилзомиб), ингибитор рецептора IGF-1 (например, OSI 906, AMG 479), ингибитор PARP (например, велипариб, AG014699, инипариб, MK-4827), ингибитор киназы Aurora (например, MLN8237, ENMD-2076), ингибитор ангиогенеза (например, леналидомид), ингибитор DHFR (например, пралатрексат), радиоиммунотерапевтический агент (например, Hu3S193), статин (например, ловастатин), ингибитор топоизомеразы-1 (например, NKTR-102), вакцина против рака (например, вакцина p53 из синтетических длинных пептидов, вакцина из аутологичного OC-DC), ингибитор mTOR (например, темсиролимус, эверолимус), ингибитор BCR/ABL (например, иматиниб), антагонист рецептора ET-A (например, ZD4054), агонист рецептора-2 к TRAIL (TR-2) (например, CS-1008), ингибитор HGF/SF (например, AMG 102), EGEN-001, ингибитор Polo-образной киназы 1 (например, BI 6727), ингибитор гамма-секретазы (например, RO4929097), ингибитор Wee-1 (например, MK-1775), антитубулиновый агент (например, винорелбин, E7389), иммунотоксин (например, денилейкин дифтитокс), SB-485232, разрушающий сосуды агент (например, AVE8062), ингибитор интегрина (например, EMD 525797), ингибитор кинезина веретена (например, 4SC-205), ревлимид, ингибитор HER2 (например, MGAH22), ингибитор ErrB3 (например, MM-121), радиационная терапия и их комбинации.

Примеры терапевтических агентов, которые можно применять в комбинации с антителами по изобретению для лечения миеломы, включают в себя одно или более из химиотерапии или других агентов против рака (например, аналогов талидомида, например, леналидомид), HSCT (Cook, (2008) J Manag Care Pharm 14 (7 Suppl): 19-25) и антитело к TIM-3 (Hallett et al., (2011) J of American Society for Blood and Marrow Transplantation 17 (8): 1133-145), дендритные клетки после контакта с антигеном опухоли, слияния (например, электрослияния) опухолевых клеток и дендритных клеток или вакцинация идиотипом иммуноглобулина, продуцируемого злокачественными плазмоцитами (обзор в Yi (2009) Cancer J 15 (6): 502-10).

Примеры терапевтических агентов, которые можно применять в комбинации с антителами по изобретению для лечения рака почки, например, почечно-клеточной карциномы (RCC) или метастазов RCC, включают в себя лекарственные средства, одобренные для лечения RCC, в том числе эверолимус (Afinitor®), алдеслейкин, бевацизумаб (Avastin®), акситиниб (Inlyta®), кабозантиниб-S-малат (Cabometyx®), алдеслейкин (Proleukin®), ленватиниба мезилат (Lenvima®), сорафениба тозилат (Nexavar®), ниволумаб (Opdivo®), пазопаниба гидрохлорид, сорафениба тозилат, сунитиниб (Sutent®), темсиролимус (Torisel®) и пазопаниба гидрохлорид (Votrient®). Другими терапевтическими средствами, которые можно применять, являются нацеленный агент (например, ингибитор VEGF, такой как моноклональное антитело к VEGF (например, бевацизумаб)), ингибитор тирозинкиназы, такой как сорафениб, акситиниб и пазопаниб.

Примеры терапевтических агентов, которые можно применять в комбинации с антителами по изобретению для лечения хронического миелогенного лейкоза (ХМЛ), включают в себя химиотерапевтический агент (например, цитарабин, гидроксимочевину, клофарабин, мелфалан, тиотепу, флударабин, бусульфан, этопозид, кордицепин, пентостатин, капецитабин, азацитидин, циклофосфамид, кладрибин, топотекан), ингибитор тирозинкиназы (например, ингибитор BCR/ABL (например, иматиниб, нилотиниб)), ингибитор двойной киназы (например, дасатиниб, бозутиниб), ингибитор множественной киназы (например, DCC-2036, понатиниб, сорафениб, сунитиниб, RGB-286638), интерферон-альфа, стероиды, агент апоптоза (например, омацетаксина мепесукцинат), иммунотерапию (например, аллогенные Th1подобные T-клетки памяти CD4+/связанные на микрочастицах анти-CD3/анти-CD2 8, аутологичные ин

- 90 045238 дуцированные цитокином клетки-киллеры (CIK), AHN-12), нацеливающий агент CD52 (например, алемтузумаб), ингибитор HSP90 (например, танеспимицин, STA-9090, AUY922, XL888), ингибитор mTOR (например, эверолимус), антагонист SMO (например, BMS 833923), ингибитор рибонуклеотид-редуктазы (например, 3-AP), ингибитор JAK-2 (например, INCB018424), гидроксихлорохин, ретиноид (например, фенретинид), ингибитор зависимой от циклина киназы (например, UCN-01), ингибитор HDAC (например, белиностат, вориностат, JNJ-26481585), ингибитор PARP (например, велипариб), антагонист MDM2 (например, RO5045337), ингибитор киназы Aurora B (например, TAK-901), радиоиммунотерапию (например, меченное актинием-225 антитело HuM 195 к CD33), ингибитор Hedgehog (например, PF04449913), ингибитор STAT3 (например, OPB-31121), KB004, вакцину против рака (например, AG858), пересадку костного мозга, пересадку стволовых клеток, радиационную терапию и их комбинации.

Примеры терапевтических агентов, которые можно применять в комбинации с антителами по изобретению для лечения хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ), включают в себя химиотерапевтический агент (например, флударабин, циклофосфамид, доксорубицин, винкристин, хлорамбуцил, бендамустин, хлорамбуцил, бусульфан, гемцитабин, мелфалан, пентостатин, митоксантрон, 5-азацитидин, пеметрексед динатрий), ингибитор тирозинкиназы (например, ингибитор EGFR (например, эрлотиниб), ингибитор BTK (например, PCI-32765 (ибрутиниб), ингибитор множественной киназы (например, MGCD265, RGB-286638), нацеливающий агент CD-20 (например, ритуксимаб, офатумумаб, RO5072759, LFB-R603), нацеливающий агент CD52 (например, алемтузумаб), преднизолон, дарбепоэтин-альфа, леналидомид, ингибитор Bcl-2 (например, ABT-263), иммунотерапию (например, аллогенные Th1подобные T-клетки памяти CD4+/связанные на микрочастицах анти-CD3/анти-CD28, аутологичные индуцированные цитокином клетки-киллеры (CIK)), ингибитор HDAC (например, вориностат, вальпроевая кислота, LBH589, JNJ-26481585, AR-42), ингибитор XIAP (например, AEG35156), нацеливающий агент CD-74 (например, милатузумаб), ингибитор mTOR (например, эверолимус), AT-101, иммунотоксин (например, CAT-8015, анти-Tac(Fv)-PE38 (LMB-2)), нацеливающий агент CD37 (например, TRU-016), радиоиммунотерапию (например, 131-тоситумомаб), гидроксихлорохин, перифосин, ингибитор SRC (например, дасатиниб), талидомид, ингибитор PI3K-дельта (например, CAL-101), ретиноид (например, фенретинид), антагонист MDM2 (например, RO5045337), плериксафор, ингибитор киназы Aurora (например, MLN8237, TAK-901), ингибитор протеосом (например, бортезомиб), нацеливающий агент CD-19 (например, MEDI-551, MOR208), ингибитор MEK (например, ABT-348), ингибитор JAK-2 (например, INCB018424), активируемое гипоксией пролекарство (например, TH-302), паклитаксел или агент паклитаксела, ингибитор HSP90, ингибитор AKT (например, MK2206), ингибитор HMG-CoA (например, симвастатин), GNKG186, радиационную терапию, пересадку костного мозга, пересадку стволовых клеток и их комбинацию.

Примеры терапевтических агентов, которые можно применять в комбинации с антителами по изобретению для лечения острого лимфоцитарного лейкоза (ОЛЛ), включают в себя химиотерапевтический агент (например, преднизолон, дексаметазон, винкристин, аспарагиназу, даунорубицин, циклофосфамид, цитарабин, этопозид, тиогуанин, меркаптопурин, клофарабин, липосомный аннамицин, бусульфан, этопозид, капецитабин, децитабин, азацитидин, топотекан, темозоломид), ингибитор тирозинкиназы (например, ингибитор BCR/ABL (например, иматиниб, нилотиниб)), ON 01910.Na, ингибитор множественной киназы (например, сорафениб), нацеливающий агент CD-20 (например, ритуксимаб), нацеливающий агент CD52 (например, алемтузумаб), ингибитор HSP90 (например, STA-9090), ингибитор mTOR (например, эверолимус, рапамицин), ингибитор JAK-2 (например, INCB018424), ингибитор рецептора HER2/neu (например, трастузумаб), ингибитор протеосом (например, бортезомиб), метотрексат, аспарагиназу, нацеливающий агент CD-22 (например, эпратузумаб, инотузумаб), иммунотерапию (например, аутологичные индуцированные цитокином клетки-киллеры (CIK), AHN-12), блинатумомаб, ингибитор зависимой от циклина киназы (например, UCN-01), нацеливающий агент CD45 (например, BC8), антагонист MDM2 (например, RO5045337), иммунотоксин (например, CAT-8015, DT2219ARL), ингибитор HDAC (например, JNJ-26481585), JVRS-100, паклитаксел или агент паклитаксела, ингибитор STAT3 (например, OPB-31121), ингибитор PARP (например, велипариб), EZN-2285, радиационную терапию, стероиды, пересадку костного мозга, пересадку стволовых клеток или их комбинацию.

Примеры терапевтических агентов, которые можно применять в комбинации с антителами по изобретению для лечения острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), включают в себя химиотерапевтический агент (например, цитарабин, даунорубицин, идарубицин, клофарабин, децитабин, восароксин, азацитидин, клофарабин, рибавирин, CPX-351, треосульфан, элацитарабин, азацитидин), ингибитор тирозинкиназы (например, ингибитор BCR/ABL (например, иматиниб, нилотиниб)), ON 01910.Na, ингибитор множественной киназы (например, мидостаурин, SU 11248, квизартиниб, сорафиниб), иммунотоксин (например, гемтузумаб озогамицин), гибридный белок DT388IL3, ингибитор HDAC (например, вориностат, LBH589), плериксафор, ингибитор mTOR (например, эверолимус), ингибитор SRC (например, дасатиниб), ингибитор HSP90 (например, STA-9090), ретиноид (например, бексаротен), ингибитор киназы Aurora (например, BI 811283), ингибитор JAK-2 (например, INCB018424), ингибитор Polo-образной киназы (например, BI 6727), ценерсен, нацеливающий агент CD45 (например, BC8), ингибитор зависимой от циклина киназы (например, UCN-01), антагонист MDM2 (например, RO5045337), ингибитор mTOR

- 91 045238 (например, эверолимус), LY573636-натрий, ZRx-101, MLN4924, леналидомид, иммунотерапию (например, AHN-12), гистамина дигидрохлорид, радиационную терапию, пересадку костного мозга, пересадку стволовых клеток и их комбинацию.

Примеры терапевтических агентов, которые можно применять в комбинации с антителами по изобретению для лечения множественной миеломы (MM), включают в себя химиотерапевтический агент (например, мелфалан, амифостин, циклофосфамид, доксорубицин, клофарабин, бендамустин, флударабин, адриамицин, SyB L-0501), талидомид, леналидомид, дексаметазон, преднизон, помалидомид, ингибитор протеосом (например, бортезомиб, карфилзомиб, MLN9708), вакцину против рака (например, GVAX), нацеливающий агент CD-40 (например, SGN-40, CHIR-12.12), перифосин, золедроновую кислоту, иммунотерапию (например, MAGE-A3, NY-ESO-1, HuMax-CD38), ингибитор HDAC (например, вориностат, LBH589, AR-42), аплидин, ингибитор зависимой от циклина киназы (например, PD-0332991, динациклиб), триоксид мышьяка, СВ3304, ингибитор HSP90 (например, KW-2478), ингибитор тирозинкиназы (например, ингибитор EGFR (например, цетуксимаб)), ингибитор множественной киназы (например, AT9283), ингибитор VEGF (например, бевацизумаб), плериксафор, ингибитор MEK (например, AZD6244), IPH2101, аторвастатин, иммунотоксин (например, BB-10901), NPI-0052, радиоиммунотерапию (например, иттрий Y-90 ибритумомаб тиуксетан), ингибитор STAT3 (например, ОРВ-31121), MLN4924, ингибитор киназы Aurora (например, ENMD-2076), IMGN901, АСЕ-041, ингибитор CK-2 (например, CX-4945), антитело к CD38 (например, DARZALEX® (даратумумаб)), радиационную терапию, пересадку костного мозга, пересадку стволовых клеток и их комбинацию.

Примерами терапевтических агентов, которые можно применять в комбинации с антителами по изобретению для лечения рака предстательной железы, являются одобренные лекарственные средства для лечения рака предстательной железы, такие как абиратерона ацетат (Zytiga®), бикалутамид (Casodex®), кабазитаксел (Jevtana®), конъюгированные эстрогены (Premarin®), страдиол (Estrace®), эстрадиола валерат (Delestrogen®), этерифицированные эстрогены (Menest®), дегареликс (Firmagon®), доцетаксел (Taxotere®), энзалутамид (Xtandi®), флутамид, госерелина ацетат (Zoladex®), кабазитаксел (Jevtana®), лейпролида ацетат (Lupron®), митоксантрона гидрохлорид, нилутамид (Nilandron®) сипулейцелT (Provenge®) и радия-223 дихлорид (Xofigo®). Другие лекарственные средства, которые можно применять, включают в себя химиотерапевтический агент (например, карбоплатин, флударабин), гормональную терапию (например, ципротерона ацетат, кетоконазол, аминоглутетимид, абареликс, дегареликс, лейпролид, трипторелин, бусерелин), ингибитор тирозинкиназы (например, ингибитор двойной киназы (например, лапатаниб)), ингибитор множественной киназы (например, сорафениб, сунитиниб), ингибитор VEGF (например, бевацизумаб), TAK-700, вакцину против рака (например, BPX-101, PEP223), леналидомид, TOK-001, ингибитор рецептора IGF-1 (например, циксутумумаб), TRC105, ингибитор киназы Aurora A (например, MLN8237), ингибитор протеосом (например, бортезомиб), OGX-011, радиоиммунотерапию (например, HuJ591-GS), ингибитор HDAC (например, вальпроевая кислота, SB939, LBH589), гидроксихлорохин, ингибитор mTOR (например, эверолимус), довитиниба лактат, дииндолилметан, эфавиренз, OGX-427, генистеин, IMC-3G3, бафетиниб,CP-675,206, радиационную терапию, хирургию или их комбинацию.

Примеры терапевтических агентов, которые можно применять в комбинации с антителами по изобретению для лечения плоскоклеточной карциномы головы и шеи (HNSCC), включают в себя метотрексат (Folex®, Mexate®), блеомицин (Blenoxane®), доцетаксел (Taxotere®), эрбитукс (Cetuximab®), гидроксимочевину (Hydrea®) или пембролизумаб (Keytruda®).

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению вводят в комбинации с агонистом TLR.

В некоторых вариантах осуществления агонист TLR3 представляет собой агонист TLR4.

В некоторых вариантах осуществления агонист TLR3 представляет собой агонист TLR7/8.

Примерами агонистов TLR являются Pam3Cys, агонист TLR-1/2; CFA, агонист TLR-2; MALP2, агонист TLR-2; Pam2Cys, агонист TLR-2; FSL-1, агонист TLR-2; Hib-OMPC, агонист TLR-2; полирибоинозиновая-полирибоцитидиновая кислота (Poly I:C), агонист TLR-3; полиаденозин-полиуридиловая кислота (поли-AU), агонист TLR-3; полиинозиновая-полицитидиловая кислота, стабилизированная поли-Lлизином и карбоксиметилцеллюлозой (Hiltonol®), агонист TLR-3; монофосфорил-липид A (MPL), агонист TLR-4; LPS, агонист TLR-4; бактериальный флагеллин, агонист TLR-5; сиалил-Tn (STn), углевод, связанный с муцином MUCI на ряде раковых человеческих клеток, и агонист TLR-4; имиквимод, агонист TLR-7; ресиквимод, агонист TLR-7/8; локсорибин, агонист TLR-7/8; и неметилированный динуклеотид CpG (CpG-ODN), агонист TLR-9.

Примерами агонистов TLR4 являются антитела-агонисты, специфически связывающие TLR4.

В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, антитела по изобретению вводят в комбинации с антителом, которое предлагает цену CSF-1R.

Примерами антител, которые связывают CSF-1R, являются те, которые описаны в международной патентной публикации № WO2013132044.

В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, антитела по изобрете- 92 045238 нию вводят в комбинации с агонистом LXRe.

В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, антитела по изобретению вводят в комбинации с агонистом DR4.

В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, антитела по изобретению вводят в комбинации с агонистом DR5.

Приемлемые агонисты DR4 и DR5 описаны, например, в международной патентной публикации № WO2014159562.

В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, антитела по изобретению вводят в комбинации с антителом к галектину-1.

Примерами антител к галектину-1, которые можно применять в комбинации с антителами по изобретению, являются те, которые описаны в международной патентной публикации № WO2015013389.

В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, антитела по изобретению вводят в комбинации с ингибитором ВТК.

В некоторых вариантах осуществления ингибитор BTK представляет собой IMBRUVICA® (ибрутиниб).

В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, антитела по изобретению вводят в комбинации с антителом к HER2.

В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, антитела по изобретению вводят в комбинации с антителом к CD20.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению вводят совместно с (например, до, одновременно или после) трансплантацией костного мозга, абляционной T-клеточной терапией с помощью химиотерапевтических агентов, таких как флударабин, дистанционной радиационной терапией (XRT), циклофосфамидом и/или антителами, такими как OKT3 или CAMPATH. В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению можно вводить после абляционной B-клеточной терапии, такой как с агентами, которые реагируют с CD20, например, ритуксаном. Например, в одном варианте осуществления субъекты могут проходить стандартное лечение высокодозной химиотерапией с последующей трансплантацией стволовых клеток периферической крови. В определенных вариантах осуществления после трансплантации субъекты получают антитела по изобретению.

В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, антитела по изобретению вводят до или после хирургической операции.

В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, антитела по изобретению вводят в комбинации с радиационной терапией.

Радиационную терапию можно проводить с помощью различных способов, включая дистанционную радиационную терапию, внутреннюю радиационную терапию, облучение с имплантатом, стереотаксическую радиохирургию, системную радиационную терапию, радиотерапию и постоянную или временную интерстициальную брахитерапию. К дистанционной радиационной терапии относятся трехмерная, конформная радиационная терапия, в которой формируется поле облучения, местное облучение (например, облучение, направленное на выбранную мишень или орган) или сфокусированное облучение. Сфокусированное облучение можно выбирать из стереотаксической радиохирургии, фракционированной стереотаксической радиохирургии или радиационной терапии с модуляцией интенсивности. В качестве источника радиации при сфокусированном облучении может использоваться пучок частиц (протоны), кобальт-60 (фотоны), линейный ускоритель (рентгеновские лучи) (например, см. WO 2012/177624). Термин брахитерапия относится к радиационной терапии с источником в пространственно-ограниченном радиоактивном материале, введенном в организм в или рядом с опухолью или другим местом пролиферативного заболевания ткани, и включает в себя воздействие радиоактивных изотопов (например, At-211, I-131, I-125, Y-90, Re-186, Re-188, Sm-153, Bi-212, P-32 и радиоактивных изотопов Lu). Приемлемые источники излучения для применения при кондиционировании клеток включают в себя как твердые вещества, так и жидкости. Источник излучения может представлять собой радионуклид, такой как твердые источники I-125, I-131, Yb-169, Ir-192, твердый источник I-125 или другие радионуклиды, которые испускают фотоны, бета-частицы, гамма-излучение или другие терапевтические лучи. Радиоактивный материал также может представлять собой жидкость из любого раствора радионуклида (-ов), например, раствора I-125 или I-131, или радиоактивную жидкость, которую можно получить из взвеси малых частиц приемлемых твердых радионуклидов, таких как Au-198, Y-90, в жидкости. Радионуклид(ы) можно заключать в гель или в радиоактивные микросферы.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению вводят в комбинации с декарбазином для лечения меланомы. Без стремления к ограничению конкретной теорией считается, что комбинированному применению блокады PD-1 и/или TIM-3 и химиотерапии способствует гибель клеток вследствие цитотоксической активности большинства химиотерапевтических соединений, что может приводить к повышению уровней опухолевого антигена на пути презентации антигена. Другими видами комбинированной терапии, которые могут приводить к синергии с блокадой PD-1 и/или TIM-3 посредством гибели клеток, являются облучение, хирургия и выключение эндокринной функции. Каждый из этих прото- 93 045238 колов создает источник опухолевого антигена в организме-хозяине. С блокадой PD-1 и/или TIM-3 можно также комбинировать ингибиторы ангиогенеза. Ингибирование ангиогенеза приводит к гибели опухолевых клеток, которые могут выделять опухолевый антиген на пути презентации антигена в организмехозяине.

Моноспецифические антитела PD-1 и/или TIM-3 по изобретению можно также применять в комбинации с биспецифическими антителами. Биспецифические антитела можно применять для нацеливания на два отдельных антигена. Например, для нацеливания макрофагов на очаги опухолей применяли биспецифические антитела к рецептору Fc/опухолевому антигену (например, Her-2/neu). Биспецифическое нацеливание может более эффективно активировать конкретные реакции на опухоль. Применение блокады PD-1 и/или TIM-3 усилило бы T-клеточный компонент этих реакций. Альтернативно антиген можно доставлять непосредственно в DC с помощью биспецифических антител, которые связывают опухолевый антиген и специфический маркер на поверхности дендритных клеток.

Антитела по изобретению можно применять в неконъюгированных формах или в конъюгированных со вторым агентом, например, цитотоксическим лекарственным средством, радиоизотопом или белком, например, белковым токсином или вирусным белком. Молекулы антитела можно применять для доставки разнообразных терапевтических агентов, например, цитотоксического вещества, например, терапевтического лекарственного средства, радиоизотопа, молекул растительного, грибкового или бактериального происхождения, или биологических белков (например, белковых токсинов), или частиц (например, рекомбинантных вирусных частиц, например, через белок вирусной оболочки), или их смесей.

Инфекционные заболевания.

В изобретении также предложен способ лечения субъекта, который подвергся воздействию конкретных токсинов или патогена, антителами по изобретению в течение времени, достаточного для лечения субъекта.

В изобретении также предложен способ лечения субъекта, имеющего инфекционное заболевание, который включает в себя введение терапевтически эффективного количества антитела по изобретению требующему этого субъекту в течение времени, достаточного для лечения инфекционного заболевания.

В изобретении также предложен способ лечения субъекта, имеющего вирусную инфекцию, который включает в себя введение терапевтически эффективного количества антитела по изобретению требующему этого субъекту в течение времени, достаточного для лечения вирусной инфекции.

В изобретении также предложен способ лечения субъекта, имеющего бактериальную инфекцию, который включает в себя введение терапевтически эффективного количества антитела по изобретению требующему этого субъекту в течение времени, достаточного для лечения бактериальной инфекции.

В изобретении также предложен способ лечения субъекта, имеющего грибковую инфекцию, который включает в себя введение терапевтически эффективного количества антитела по изобретению требующему этого субъекту в течение времени, достаточного для лечения грибковой инфекции.

При лечении инфекции (например, острой и/или хронической) введение антител по изобретению можно комбинировать с традиционными вариантами лечения в дополнение к стимуляции естественной иммунной защиты организма-хозяина против инфекции или вместо нее. Естественная иммунная защита организма-хозяина против инфекции включает в себя воспаление, повышение температуры, защиту организма посредством антител, защиту организма посредством T-лимфоцитов, включая секрецию лимфокинов и цитотоксических T-клеток (в особенности при вирусной инфекции), лизис и опсонизацию (облегченный фагоцитоз), опосредованные комплементом, и фагоцитоз. Способность антител по изобретению реактивировать дисфункциональные T-клетки была бы полезна для лечения хронических инфекций, в особенности тех, при которых для полного выздоровления важен клеточный иммунитет.

Аналогично применению к опухолям, как описано выше, антитела по изобретению можно применять отдельно или в качестве адъюванта, в комбинации с вакцинами, для стимуляции иммунного ответа на патогены, токсины и аутоантигены. Примеры патогенов, для которых этот терапевтический подход может быть полезным, включают в себя патогены, для которых в настоящее время не имеется эффективной вакцины, или патогены, для которых традиционные вакцины эффективны не полностью. Они включают в себя ВИЧ, гепатиты (A, B, C), грипп, герпес, лямблии, малярию, лейшманию, Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa. Блокада PD-1 и/или TIM-3 может быть полезна в отношении установленных инфекций такими агентами, как ВИЧ, которые во время течения инфекции презентируют измененные антигены. Эти новые эпитопы распознаются как чужеродные во время введения антител по изобретению, таким образом вызывая мощный T-клеточный ответ, который не ослаблен негативными сигналами через PD-1 или TIM-3.

Вирусы.

При инфекциях, вызванных заражением вирусами, антитела по изобретению можно комбинировать со стандартными видами терапии для лечения вирусных инфекций. Такие стандартные виды терапии варьируют в зависимости от типа вируса, хотя практически во всех случаях введение сыворотки человека, которая содержит специфичные к вирусу антитела (например, IgA, IgG), оказывается эффективным.

Примеры патогенных вирусов, вызывающих инфекции, которые можно лечить антителами по изобретению, включают в себя ВИЧ, гепатит (A, B, C), вирус герпеса (например, ВЗВ, ВПГ-1, ВГА-6, ВПГ- 94 045238

II, ЦМВ, вирус Эпштейна-Барр), аденовирус, вирус гриппа, флавивирусы, эховирус, риновирус, вирус коксаки, коронавирус, респираторно-синцитиальный вирус, вирус паротита, ротавирус, вирус кори, вирус краснухи, парвовирус, вирус коровьей оспы, вирус HTLV, вирус денге, вирус папилломы, вирус моллюска, полиовирус, вирус бешенства, вирус JC, вирус арбовирусного энцефалита.

В некоторых вариантах осуществления вирусной инфекцией является инфекция, вызванная вирусом гриппа. Инфекция вирусом гриппа приводит к повышению температуры, кашлю, миалгии, головной боли и слабости и часто происходит при сезонных эпидемиях. Грипп также вызывает ряд постинфекционных расстройств, таких как энцефалит, миоперикардит, синдром Гудпасчера, синдром Рейе. Инфекция гриппа также подавляет нормальную антибактериальную защиту в легких, так что выздоравливающие от гриппа пациенты имеют повышенный риск развития бактериальной пневмонии. Поверхностные белки вируса гриппа проявляют выраженную вариацию антигенов вследствие мутаций и рекомбинации. Таким образом, цитолизирующие T-лимфоциты являются первичным средством устранения вируса после инфекции в организме-хозяине. Вирус гриппа имеет три основных типа: A, B и C. Вирус гриппа A уникален тем, что заражает и человека, и многих других животных (например, свиней, лошадей, птиц и тюленей), и является главной причиной пандемии гриппа. Клетка может быть инфицирована двумя разными штаммами гриппа A, сегментированные геномы РНК двух типов исходных вирусов смешиваются во время репликации с образованием гибридного репликанта, что приводит к появлению новых эпидемических штаммов. Вирус гриппа B не размножается у животных и, таким образом, имеет меньше генетических вариаций, а вирус гриппа C имеет только один серотип.

Большинство традиционных видов терапии являются паллиативными в отношении симптомов, возникающих при инфекции, тогда как иммунный ответ организма-хозяина действительно устраняет заболевание. Однако определенные штаммы (например, вирус гриппа A) могут вызывать более тяжелую болезнь и летальный исход. Вирус гриппа A можно лечить как клинически, так и профилактически посредством введения ингибиторов - циклических аминов амантадина и римантадина, которые ингибируют репликацию вируса. Однако клиническая польза этих лекарственных средств ограничена вследствие относительно частого развития нежелательных реакций, узкого противовирусного спектра (только грипп A) и способности вируса к развитию резистентности. Введение сывороточного антитела IgG к основным белкам поверхности вируса гриппа - гемагглютинину и нейраминидазе может предотвращать легочную инфекцию, тогда как для предотвращения инфекции верхних дыхательных путей и трахеи необходим мукозный IgA. Самым эффективным современным лечением гриппа является вакцинация с введением вируса, инактивированного формалином или β-пропиолактоном.

В некоторых вариантах осуществления инфекцией является инфекция гепатита, например, инфекция гепатита B или C.

Вирус гепатита B (ВГВ) представляет собой самый инфекционный из известных гемоконтактных патогенов. Он является основной причиной острого и хронического гепатита, печеночной карциномы, а также хронической инфекции в течение всей жизни. После инфицирования вирус размножается в гепатоцитах, которые также затем рассеивают поверхностный антиген HBsAg. Обнаружение избыточных уровней HBsAg в сыворотке применяется в качестве стандартного способа диагностики инфекции гепатита B. Острая инфекция может излечиваться или развиваться в стойкую хроническую инфекцию. Современные варианты лечения хронического ВГВ включают в себя α-интерферон, который повышает экспрессию антигена лейкоцита человека (HLA) класса I на поверхности гепатоцитов, таким образом способствуя их распознаванию цитотоксическими T-лимфоцитами. Кроме того, аналоги нуклеозидов ганцикловир, фамцикловир и ламивудин в клинических испытаниях также показали некоторую эффективность в лечении инфекции ВГВ. Дополнительные варианты лечения ВГВ включают в себя пегилированный α-интерферон, аденфовир, энтекавир и телбивудин. Тогда как пассивный иммунитет можно привить посредством исходного введения сывороточных антител к HBsAg, резистентность к инфекции также достигается вакцинацией инактивированным или рекомбинантным HBsAg. Для обеспечения терапевтического преимущества антитела по изобретению можно комбинировать с традиционными вариантами лечения инфекций гепатита B.

Инфекция вируса гепатита C (ВГС) может приводить к развитию хронической формы гепатита, в результате чего развивается цирроз. Хотя его симптомы аналогичны инфекциям, вызываемым гепатитом B, существенное отличие от ВГВ заключается в том, что у инфицированных хозяев симптомы могут не проявляться в течение 10-20 лет. Антитела по изобретению можно вводить как монотерапию или в комбинации со стандартным лечением инфекции гепатита C. Например, антитела по изобретению можно вводить с одним или более из Sovaldi (софосбувир), Olysio (симпервир) плюс рибавирин или пегилированный интерферон. Хотя курсы лечения, которые включают в себя Incivek (телапревир) или Victrelis (боцепревир) плюс рибавирин и пегилированный интерферон, также одобрены, они связаны с существенными побочными эффектами и большей длительностью лечения.

Традиционное лечение инфекции ВГС включает в себя введение комбинации α-интерферона и рибавирина. Многообещающий потенциал в терапии инфекции ВГС имеет ингибитор протеазы телапревир (VX-960). Дополнительные варианты лечения включают в себя бавитуксимаб (антитело, которое связы- 95 045238 вает анионный фосфолипид фосфатидилсерин в зависимости от В2-гликопротеина I, компания Peregrine Pharmaceuticals), антитело(а) к белку E2 оболочки вируса ВГС (например, ATL 6865-Ab68+Ab65, компания XTL Pharmaceuticals) и Civacir® (поликлональный иммуноглобулин человека против ВГС). Для обеспечения терапевтического преимущества антитела по изобретению можно комбинировать с одним или более из этих вариантов лечения инфекций гепатита C. Ингибиторы протеазы, полимеразы и NS5A, которые можно применять в комбинации с антителами по изобретению для специфического лечения инфекции гепатита C, включают в себя те, которые описаны в US 2013/0045202.

В другом варианте осуществления инфекция представляет собой вирус кори. После инкубации в течение 9-11 дней в организмах-хозяевах, инфицированных вирусом кори, развивается повышенная температура, кашель, ринит и конъюнктивит. В течение 1-2 дней развивается эритематозная макулопапулезная сыпь, которая быстро распространяется по всему телу. Поскольку инфекция также подавляет клеточный иммунитет, у хозяина повышается риск развития бактериальных суперинфекций, включая воспаление среднего уха, пневмонию и постинфекционный энцефаломиелит. Острая инфекция связана со значительной заболеваемостью и смертностью, в особенности у подростков с неполноценным питанием.

Лечение кори включает в себя пассивное введение пулированного IgG человека, который может предотвращать инфекцию у неиммунных субъектов, даже если вводить его в течение срока до одной недели после воздействия. Однако предварительная иммунизация живым ослабленным вирусом является наиболее эффективным лечением и предотвращает заболевание у более 95% иммунизированных индивидов. Поскольку существует один серотип такого вируса, одна иммунизация или инфекция, как правило, приводит к пожизненной защите от последующей инфекции.

У малой доли инфицированных хозяев корь может развиваться в подострый склерозирующий панэнцефалит (SSPE), который представляет собой хроническое прогрессирующее неврологическое расстройство в результате персистирующей инфекции центральной нервной системы. SSPE вызывается клональными вариантами вируса кори с дефектами, которые препятствуют сборке и почкованию вирионов. Для этих пациентов было бы желательно реактивировать T-клетки с антителами по изобретению для облегчения устранения вируса.

В другом варианте осуществления инфекция представляет собой вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). ВИЧ поражает клетки CD4+, включая Т-лимфоциты, моноциты-макрофаги, фолликулярные дендритные клетки и клетки Лангерганса; хелперные/индукторные клетки CD4+ истощаются. В результате этого в организме-хозяине развивается тяжелая недостаточность опосредованного клетками иммунитета. ВИЧ-инфекция приводит к развитию СПИДа по меньшей мере у 50% индивидов. Она передается половым путем, при введении инфицированной крови или препаратов крови, искусственном оплодотворении инфицированной спермой, контакте с загрязненными кровью иглами или шприцами и передается от инфицированной матери младенцу во время родов.

ВИЧ-инфекция в организме-хозяине может быть бессимптомной или может развиваться в острое заболевание, напоминающее мононуклеоз, с повышением температуры, головной болью, фарингитом, слабостью и сыпью. Симптомы могут развиваться в прогрессирующую иммунную дисфункцию, включая устойчивый жар, ночное потение, потерю веса, беспричинную диарею, экзему, псориаз, себорейный дерматит, опоясывающий герпес, кандидоз ротовой полости и ворсистую лейкоплакию ротовой полости. У пациентов, инфекция которых развивается в СПИД, обычны оппортунистические инфекции, вызываемые множеством паразитов.

Варианты лечения ВИЧ включают в себя виды противовирусной терапии, в том числе аналоги нуклеозидов, зидовудин (AST) отдельно или в комбинации с диданозином или залцитабином, дидезоксиинозин, дидезоксицитидин, ламивудин, ставудин; ингибиторы обратной транскрипции, такие как делавирдин, невирапин, ловирид, и ингибиторы протеазы, такие как саквинавир, ритонавир, индинавир и нелфинавир. Варианты лечения ВИЧ включают в себя EDURANT® (рилпивирин). Для обеспечения терапевтического преимущества антитела по изобретению можно комбинировать с традиционными вариантами лечения ВИЧ-инфекций.

В другом варианте осуществления инфекция представляет собой инфекцию цитомегаловируса (ЦМВ). ЦМВ-инфекция часто связана с постоянной латентной и рецидивирующей инфекцией. ЦМВ инфицирует и остается латентным в моноцитах и клетках-предшественниках гранулоцитов-моноцитов. Клинические симптомы ЦМВ включают в себя симптомы, подобные мононуклеозу (т.е. повышение температуры, набухание гланд, слабость), и склонность к аллергическим кожным высыпаниям от антибиотиков. Вирус распространяется при прямом контакте: вирус распространяется с мочой, слюной, спермой и в меньшей степени с другими физиологическими текучими средами. Передача может также происходить от инфицированной матери к ее плоду или новорожденному, а также при переливании крови и трансплантации органов. ЦМВ-инфекция приводит к общему нарушению клеточного иммунитета, которое характеризуется нарушением бластогенных реакций на неспецифические митогены и специфические антигены ЦМВ и снижением цитотоксической способности.

Варианты лечения ЦМВ-инфекции включают в себя противовирусные препараты ганцикловир, фоскарнет и цидовир, но эти лекарственные средства, как правило, прописываются только пациентам с

- 96 045238 нарушением иммунитета. Для обеспечения терапевтического преимущества антитела по изобретению, описанные в настоящем документе, можно комбинировать с традиционными вариантами лечения инфекций цитомегаловируса.

В другом варианте осуществления инфекция представляет собой инфекцию вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ). ВЭБ может вызывать постоянные и латентные инфекции и в первую очередь атакует B-клетки. ВЭБ-инфекция приводит к клиническому состоянию инфекционного мононуклеоза, которое проявляется повышением температуры, воспалением горла, зачастую с экссудатом, общей лимфоаденопатией и спленомегалией. Также встречается гепатит, в результате которого может развиваться желтуха.

Хотя типичные варианты лечения ВЭБ-инфекций являются симптоматическими, ВЭБ связан с развитием определенных видов рака, таких как лимфома Беркитта и рак носоглотки. Таким образом, устранение вирусной инфекции до возникновения осложнений принесло бы большую пользу. Для обеспечения терапевтического преимущества антитела по изобретению можно комбинировать с традиционными вариантами лечения инфекций вируса Эпштейна-Барр.

В другом варианте осуществления инфекция представляет собой инфекцию вируса простого герпеса (ВПГ). ВПГ передается при прямом контакте с инфицированным хозяином. Прямая инфекция может быть бессимптомной, но обычно приводит к образованию пузырей, содержащих инфекционные частицы. Заболевание проявляется как циклы активных периодов заболевания, при которых поражения появляются и исчезают по мере того, как вирус латентно инфицирует нервный узел для последующих высыпаний. Поражения могут быть на лице, половых органах, глазах и/или руках. В некоторых случаях инфекция может также вызывать энцефалит.

Варианты лечения герпетических инфекций направлены, прежде всего, на излечение симптоматических высыпаний и включают в себя системные противовирусные лекарственные средства, такие как: ацикловир (например, Zovirax®), валацикловир, фамцикловир, пенцикловир, и местные лекарственные средства, такие как доконазол (Abreva®), тромантадин и зилактин. Устранение латентных герпетических инфекций принесло бы большую клиническую пользу. Для обеспечения терапевтического преимущества антитела по изобретению можно комбинировать с традиционными вариантами лечения инфекций вируса герпеса.

В другом варианте осуществления инфекция представляет собой T-лимфотропный вирус человека (HTLV-1, HTLV-2). HTLV передается половым путем, при грудном вскармливании или при контакте с зараженной кровью. Вирус активирует Th1-клетки, что приводит к их чрезмерной пролиферации и избыточной продукции связанных с Th1 цитокинов (например, ИФН-γ и ФНО-α). Это, в свою очередь, приводит к супрессии Th2-лимфоцитов и уменьшению продукции связанных с Th2 цитокинов (например, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13), вызывая снижение способности инфицированного хозяина к развитию соответствующего иммунного ответа на вторгающиеся организмы, для устранения которых требуется зависимый от Th2 ответ (например, заражение паразитами, продукция мукозных и гуморальных антител).

HTLV-инфекции приводят к оппортунистическим инфекциям, вызывающим бронхоэктаз, дерматит и суперинфекции Staphylococcus spp. и Strongyloides spp., которые вызывают летальный исход от полимикробного сепсиса. HTLV-инфекция может также непосредственно приводить к лейкозу/T-клеточной лимфоме у взрослых, а также к болезни прогрессивной демиелинизации верхних моторных нейронов, известной как HAM/TSP. Устранение латентной HTLV-инфекции принесло бы большую клиническую пользу. Для обеспечения терапевтического преимущества антитела по изобретению можно комбинировать с традиционными вариантами лечения HTLV-инфекций.

В другом варианте осуществления инфекция представляет собой вирус папилломы человека (ВПЧ). ВПЧ преимущественно поражает кератиноциты и встречается в двух формах: кожной и генитальной. Предполагается, что передача происходит при прямом контакте и/или половом акте. Как кожная, так и генитальная ВПЧ-инфекция может вызывать бородавки и латентные инфекции, а иногда рецидивирующие инфекции, с которыми борется иммунитет хозяина, который борется с симптомами и блокирует появление бородавок, но при этом хозяин остается способным передавать инфекцию другим.

ВПЧ-инфекция может также приводить к определенным видам рака, таким как рак шейки матки, ануса, вульвы, пениса и ротоглотки. Излечение от ВПЧ-инфекции неизвестно, но современное лечение включает в себя местное нанесение имиквимода, который стимулирует иммунную систему для атаки в пораженной области. Устранение латентных ВПЧ-инфекций принесло бы большую клиническую пользу. Для обеспечения терапевтического преимущества антитела по изобретению можно комбинировать с традиционными вариантами лечения ВПЧ-инфекций.

Бактериальные инфекции.

Некоторые примеры патогенных бактерий, вызывающих инфекции, которые можно лечить антителами по изобретению, включают в себя сифилис, хламидии, риккетсии, микобактерии, стафилококки, стрептококки, пневмококки, менингококки и гонококки, клебсиеллу, протей, серратию, псевдомонаду, легионеллу, дифтерию, сальмонеллу, бациллы, бактерии холеры, столбняка, ботулизма, сибирской язвы, чумы, лептоспироза, болезни Лайма. Антитела по изобретению можно применять в комбинации с существующими видами лечения вышеуказанных инфекций. Например, варианты лечения сифилиса включа- 97 045238 ют в себя пенициллин (например, пенициллин G.), тетрациклин, доксициклин, цефтриаксон и азитромицин.

Болезнь Лайма, которую вызывает Borrelia burgdorferi, передается человеку при укусах клещей. Заболевание первоначально проявляется как местная сыпь с последующими гриппоподобными симптомами, такими как слабость, повышение температуры, головная боль, ригидность шеи и артралгия. Последующие проявления могут включать в себя мигрирующий и полиартикулярный артрит, неврологические и кардиологические симптомы с параличами черепно-мозговых нервов и радикулопатией, миокардитом и аритмиями. Некоторые случаи болезни Лайма становятся постоянными, приводя к необратимым повреждениям, аналогичным третичному сифилису. Современная терапия болезни Лайма включает в себя в основном введение антибиотиков. Резистентные к антибиотику штаммы можно лечить гидроксихлорохином или метотрексатом. Пациентов с нейропатическими болями, устойчивых к лечению антибиотиками, можно лечить габапентином. Миноциклин может помогать при запущенной/хронической болезни Лайма с неврологическими или другими воспалительными проявлениями.

Другие формы боррелиозов, такие как вызванные B. recurentis, B. hermsii, B. turicatae, B. parikeri, B. hispanica, B. duttonii и B. persica, а также лептоспироз (например, от L. interrogans), обычно излечиваются самопроизвольно, если титры в крови не достигают концентраций, вызывающих внутрипеченочную об струкцию.

Грибы и паразиты.

Некоторые примеры патогенных грибов, вызывающих инфекции, которые можно лечить антителами по изобретению, включают в себя Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis и др.), Cryptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger и др.), род Mucorales (mucor, absidia, rhizophus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis и Histoplasma capsulatum.

Некоторые примеры патогенных паразитов, вызывающих инфекции, которые можно лечить антителами по изобретению, описанному в настоящем документе, включают в себя Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleria fowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondi и Nippostrongylus brasiliensis.

Диагностические применения и наборы.

Наборы.

В изобретении также предложен набор, содержащий антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, по изобретению.

В изобретении также предложен набор, содержащий антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, по изобретению.

В изобретении также предложен набор, содержащий биспецифическое антитело-антагонист PD1/TIM-3, которое содержит первый домен, специфически связывающий PD-1, и второй домен, специфически связывающий TIM-3, по изобретению.

Набор можно применять для терапевтических применений и в виде диагностических наборов.

Набор можно применять для обнаружения наличия PD-1, TIM-3 или PD-1 и TIM-3 в биологической пробе.

В некоторых вариантах осуществления набор содержит антитело по изобретению, описанное в настоящем документе, и реактивы для обнаружения антитела. Набор может включать в себя один или более других элементов, включающих в себя: инструкции по применению; другие реагенты, например, метку, терапевтический агент или агент, используемый для хелатирования или иного сочетания, антите ло для мечения, или терапевтический агент, или радиозащитную композицию; устройства или другие материалы для подготовки антитела к введению; фармацевтически приемлемые носители; а также уст ройства или другие материалы для введения субъекту.

В некоторых вариантах осуществления набор содержит антитело по изобретению, находящееся в контейнере, и инструкции по применению набора.

В некоторых вариантах осуществления антитело в наборе является меченым.

В некоторых вариантах осуществления набор содержит антитело-антагонист, специфически связы вающее PD-1, которое содержит

VH с SEQ ID NO VH с SEQ ID NO VH с SEQ ID NO VH с SEQ ID NO VH с SEQ ID NO VH с SEQ ID NO VH с SEQ ID NO VH с SEQ ID NO VH с SEQ ID NO VH с SEQ ID NO VH с SEQ ID NO и VL с SEQ ID NO и VL с SEQ ID NO и VL с SEQ ID NO и VL с SEQ ID NO и VL с SEQ ID NO и VL с SEQ ID NO и VL с SEQ ID NO и VL с SEQ ID NO и VL с SEQ ID NO и VL с SEQ ID NO и VL с SEQ ID NO

49;

50;

51;

52;

53;

49;

54;

50;

55;

56;

57;

- 98 045238

VH с SEQ ID NO VH с SEQ ID NO VH с SEQ ID NO VH с SEQ ID NO VH с SEQ ID NO VH с SEQ ID NO VH с SEQ ID NO VH с SEQ ID NO VH с SEQ ID NO VH с SEQ ID NO VH с SEQ ID NO VH с SEQ ID NO VH с SEQ ID NO VH с SEQ ID NO и VL с SEQ ID NO: 49;

и VL с SEQ ID NO: 49;

и VL с SEQ ID NO: 53;

и VL с SEQ ID NO: 52;

и VL с SEQ ID NO: 56;

и VL с SEQ ID NO: 58;

и VL с SEQ ID NO: 59;

и VL с SEQ ID NO: 60;

и VL с SEQ ID NO: 61;

и VL с SEQ ID NO: 62;

и VL с SEQ ID NO: 65; или и VL с SEQ ID NO: 65.

В некоторых вариантах осуществления набор содержит антитело-антагонист, специфически связы вающее PD-1, которое содержит VH с SEQ ID N0: 48 и VL с SEQ ID NO: 56.

В некоторых вариантах осуществления набор содержит антитело-антагонист, специфически связы вающее PD-1, которое содержит VH с SEQ ID NO: 64 и VL с SEQ ID NO: 65.

В некоторых вариантах осуществления набор содержит антитело-антагонист, специфически связы вающее TIM-3, которое содержит

VH с SEQ ID NO VH с SEQ ID NO VH с SEQ ID NO VH с SEQ ID NO VH с SEQ ID NO VH с SEQ ID NO VH с SEQ ID NO VH с SEQ ID NO VH с SEQ ID NO VH с SEQ ID NO VH с SEQ ID NO

145 и VL с SEQ ID NO

146 и VL с SEQ ID NO

148 и VL с SEQ ID NO

147 и VL с SEQ ID NO

149 и VL с SEQ ID NO

150 и VL с SEQ ID NO

151 и VL с SEQ ID NO

152 и VL с SEQ ID NO

153 и VL с SEQ ID NO

154 и VL с SEQ ID NO

172 и VL с SEQ ID NO

155;

156;

157;

155;

158;

159;

160;

161;

162;

163; или

173.

В некоторых вариантах осуществления набор содержит антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, которое содержит VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156.

В некоторых вариантах осуществления набор содержит антитело-антагонист, специфически связы вающее TIM-3, которое содержит VH с SEQ ID NO: 172 и VL с SEQ ID NO: 173.

В некоторых вариантах осуществления набор содержит биспецифическое антитело-антагонист PD1/TIM-3, содержащее HC1, LC1, HC2 и LC2 с

SEQ ID NO: 186, 188, 190 и 193 соответственно;

SEQ ID NO: 186, 188, 191 и 194 соответственно;

SEQ ID NO: 187, 189, 190 и 193 соответственно;

SEQ ID NO: 187, 189, 191, 194 соответственно;

SEQ ID NO: 186, 188, 192 и 195 соответственно;

SEQ ID NO: 186, 188, 248 и 194 соответственно;

SEQ ID NO: 241, 188, 244, 195 соответственно;

SEQ ID NO: 241, 188, 245, 194 соответственно;

SEQ ID NO: 242, 189, 246, 194 соответственно;

SEQ ID NO: 243, 188, 246, 194 соответственно; или

SEQ ID NO: 243, 188, 247, 195 соответственно.

Способы обнаружения PD-1, TIM-3 или PD-1 и TIM-3.

В изобретении также предложен способ обнаружения PD-1 в пробе, включающий в себя получение пробы, приведение пробы в контакт с антителом-антагонистом, специфически связывающим PD-1, по изобретению и обнаружение в пробе антитела, связанного с PD-1.

В изобретении также предложен способ обнаружения TIM-3 в пробе, включающий в себя получение пробы, приведение пробы в контакт с антителом-антагонистом, специфически связывающим TIM-3, по изобретению и обнаружение в пробе антитела, связанного с TIM-3.

В изобретении также предложен способ обнаружения PD-1 и TIM-3 в пробе, включающий в себя получение пробы, приведение пробы в контакт с биспецифическим антителом-антагонистом PD-1/TIM-3, которое содержит первый домен, специфически связывающий PD-1, и второй домен, специфически связывающий TIM-3, по изобретению и обнаружение антитела, связанного с PD-1 и TIM-3, в пробе.

В некоторых вариантах осуществления пробу можно получать из мочи, крови, сыворотки крови, плазмы крови, слюны, асцитной жидкости, циркулирующих клеток, циркулирующих опухолевых клеток, клеток, не связанных с тканями (т.е. свободных клеток), тканей (например, резецированной хирургиче- 99 045238 ским путем опухолевой ткани, материалов биопсии, включая полученные с помощью тонкоигольной аспирационной биопсии), гистологических препаратов и т. п.

Антитела по изобретению, связанные с PD-1, TIM-3 или PD-1 и TIM-3, можно обнаруживать с помощью известных способов. Примеры способов включают в себя прямое мечение антител с помощью флуоресцентных или хемилюминесцентных меток либо радиоактивных меток или присоединение к антителам по изобретению легко обнаруживаемой функциональной группы, такой как биотин, ферментов или эпитопных меток. Примерами меток и функциональных групп являются рутений, 111In-DOTA, 111In-диэтилентриаминпентауксусная кислота (DTPA), пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и бетагалактозидаза, полигистидин (HIS-метка), акридиновые красители, цианиновые красители, флуороновые красители, оксазиновые красители, фенантридиновые красители, родаминовые красители и красители Alexafluor®.

Антитела по изобретению можно применять в разнообразных анализах для обнаружения PD-1, TIM-3 или PD-1 и TIM-3 в пробе. Примерами анализов являются анализ методом вестерн-блоттинга, радиоиммунологический анализ, поверхностный плазмонный резонанс, иммунопреципитация, равновесный диализ, иммунодиффузия, электрохемилюминесцентный (ECL) иммуноанализ, иммуногистохимический анализ, сортировка флуоресцентно-активированных клеток (FACS) или твердофазный ИФА.

Дополнительные варианты осуществления изобретения: антитела, специфически связывающие PD-1.

Ниже представлены определенные дополнительные варианты осуществления изобретения в соответствии с раскрытиями, представленными в других разделах настоящего документа. Элементы из вариантов осуществления изобретения, изложенных выше, описанные как связанные с изобретением, раскрытым в настоящем документе, также относятся ко всем и каждому из этих дополнительно пронумерованных вариантов осуществления.

1) Выделенное антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1 и содержащее определяющие комплементарность области тяжелой цепи (HCDR) 1 (HCDR1), 2 (HCDR2) и 3 (HCDR3) с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 82, 83 и 84 соответственно или с SEQ ID NO: 82, 83 и 85 соответственно.

2) Антитело по варианту осуществления 1, которое содержит определяющие комплементарность области легкой цепи (LCDR) 1 (LCDR1), 2 (LCDR2) и 3 (LCDR3) с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 86, 87 и 88 соответственно.

3) Антитело по варианту осуществления 1 или 2, которое имеет одно, два, три, четыре или пять из следующих свойств:

4) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-3, которое содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, содержащиеся в пределах вариабельной области тяжелой цепи (VH) и имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 или 48, причем HCDR определяются по Chothia, Kabat или IMGT.

5) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-4, которое содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, содержащиеся в пределах вариабельной области легкой цепи (VL) и имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 или 62, причем LCDR определяются по Chothia, Kabat или IMGT.

6) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-5, содержащее

a) HCDR1 с SEQ ID NO: 10, 11 или 12;

b) HCDR2 с SEQ ID NO: 13, 14 или 15; и

c) HCDR3 с SEQ ID NO: 16, 17, 18 или 19.

7) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-6, содержащее

a) LCDR1 с SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23, 24 или 25;

b) LCDR2 с SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29 или 30; и

c) LCDR3 с SEQ ID NO: 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40.

8) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-7, причем антитело содержит каркас тяжелой цепи, полученный из VH1-69 (SEQ ID NO: 170) и каркас легкой цепи, полученный из IGKV3-11 (SEQ ID NO: 171).

9) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-8, содержащее HCDR1, HCDR2 и

- 100 045238

HCDR3 с

a) SEQ ID NO b) SEQ ID NO c) SEQ ID NO d) SEQ ID NO e) SEQ ID NO

10, 13 и 16 соответственно;

10, 14 и 16 соответственно;

10, 13 и 17 соответственно;

10, 13 и 18 соответственно;

11, 15 и 18 соответственно;

f) SEQ ID NO: 10, 13 и 19 соответственно;

g) SEQ ID NO: 12, 13 и 19 соответственно;

h) SEQ ID NO: 10, 13 и 16 соответственно; или i) SEQ ID NO: 10, 14 и 17 соответственно.

10) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-9, содержащее LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с

a) SEQ ID NO: 20, 26 и 31 соответственно;

b) SEQ ID NO: 21, 26 и 32 соответственно;

c) SEQ ID NO: 22, 27 и 33 соответственно;

d) SEQ ID NO: 22, 26 и 34 соответственно;

e) SEQ ID NO: 23, 28 и 35 соответственно;

f) SEQ ID NO: 20, 26 и 36 соответственно;

g) SEQ ID NO: 21, 27 и 37 соответственно;

h) SEQ ID NO: 23, 26 и 32 соответственно;

i) SEQ ID NO: 22, 26 и 32 соответственно;

j) SEQ ID NO: 24, 26 и 38 соответственно;

k) SEQ ID NO: 20, 29 и 39 соответственно;

l) SEQ ID NO: 20, 30 и 32 соответственно;

m) SEQ ID NO: 25, 26 и 40 соответственно;

n) SEQ ID NO: 24, 26 и 32 соответственно; или

o) SEQ ID NO: 69, 70 и 71 соответственно.

11) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-10, содержащее HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 13, 16, 20, 26 и 31 соответственно.

12) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-10, содержащее HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 13, 16, 21, 26 и 32 соответственно.

13) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-10, содержащее HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 14, 16, 22, 27 и 33 соответственно.

14) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-10, содержащее HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 14, 16, 22, 26 и 34 соответственно.

15) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-10, содержащее HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 14, 16, 23, 28 и 35 соответственно.

16) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-10, содержащее HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 13, 17, 20, 26 и 31 соответственно.

17) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-10, содержащее HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 13, 17, 20, 26 и 36 соответственно.

18) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-10, содержащее HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 13, 17, 21, 26 и 32 соответственно.

19) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-10, содержащее HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 13, 17, 21, 27 и 37 соответственно.

20) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-10, содержащее HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 13, 17, 23, 26 и 32 соответственно.

21) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-10, содержащее HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 13, 17, 22, 26 и 32 соответственно.

22) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-10, содержащее HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 13, 18, 20, 26 и 31 соответственно.

23) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-10, содержащее HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 11, 15, 18, 20, 26 и 31 соответственно.

24) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-10, содержащее HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 13, 19, 20, 26 и 31 соответственно.

25) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-10, содержащее HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 12, 13, 19, 20, 26 и 31 соответственно.

26) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-10, содержащее HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 14, 17, 23, 28 и 35 соответственно.

27) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-10, содержащее HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 14, 17, 22, 26 и 34 соответственно.

28) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-10, содержащее HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 14, 17, 23, 26 и 32 соответственно.

- 101 045238

29) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-10, содержащее HCDR1, HCDR2,

HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 12, 13, 19, 24, 26 и 38 соответственно.

30) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-10, содержащее HCDR1, HCDR2,

HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 12, 13, 19, 20, 29 и 39 соответственно.

31) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-10, содержащее HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 11, 15, 18, 20, 30 и 32 соответственно.

32) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-10, содержащее HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 11, 15, 18, 25, 26 и 40 соответственно.

33) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-10, содержащее HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 11, 15, 18, 24, 26 и 32 соответственно.

34) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-33, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (VH) с SEQ ID NO: 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 или 48, причем необязательно VH содержит одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать консервативных аминокислотных замен.

35) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-34, содержащее вариабельную область легкой цепи (VL) с SEQ ID NO: 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 или 62, причем необязательно VL содержит одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен.

36) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-35, содержащее VH с SEQ ID NO: 41 и VL с SEQ ID NO: 49, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен.

37) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-35, содержащее VH с SEQ ID NO: 41 и VL с SEQ ID NO: 50, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен.

38) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-35, содержащее VH с SEQ ID NO: 42 и VL с SEQ ID NO: 51, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен.

39) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-35, содержащее VH с SEQ ID NO: 42 и VL с SEQ ID NO: 52, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен.

40) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-35, содержащее VH с SEQ ID NO: 42 и VL с SEQ ID NO: 53, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен.

41) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-35, содержащее VH с SEQ ID NO: 43 и VL с SEQ ID NO: 49, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен.

42) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-35, содержащее VH с SEQ ID NO: 43 и VL с SEQ ID NO: 54, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен.

43) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-35, содержащее VH с SEQ ID NO: 43 и VL с SEQ ID NO: 50, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен.

44) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-35, содержащее VH с SEQ ID NO: 43 и VL с SEQ ID NO: 55, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен.

45) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-35, содержащее VH с SEQ ID NO: 43 и VL с SEQ ID NO: 56, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен.

46) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-35, содержащее VH с SEQ ID NO: 43 и VL с SEQ ID NO: 57, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен.

- 102 045238

47) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-35, содержащее VH с SEQ ID NO:

и VL с SEQ ID NO: 49, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен.

48) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-35, содержащее VH с SEQ ID NO: 45 и VL с SEQ ID NO: 49, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен.

49) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-35, содержащее VH с SEQ ID NO: 46 и VL с SEQ ID NO: 49, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен.

50) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-35, содержащее VH с SEQ ID NO: 47 и VL с SEQ ID NO: 49, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен.

51) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-35, содержащее VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID NO: 53, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен.

52) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-35, содержащее VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID NO: 52, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен.

53) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-35, содержащее VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID NO: 56, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен.

54) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-35, содержащее VH с SEQ ID NO: 47 и VL с SEQ ID NO: 58, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен.

55) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-35, содержащее VH с SEQ ID NO: 47 и VL с SEQ ID NO: 59, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен.

56) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-35, содержащее VH с SEQ ID NO: 45 и VL с SEQ ID NO: 60, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен.

57) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-35, содержащее VH с SEQ ID NO: 45 и VL с SEQ ID NO: 61, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен.

58) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-35, содержащее VH с SEQ ID NO: 45 и VL с SEQ ID NO: 62, причем VH, VL или как VH, так и VL необязательно содержат одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или пятнадцать аминокислотных замен.

59) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, содержащее HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 66, 67, 68, 69, 70 и 71 соответственно.

60) Антитело по варианту осуществления 59, причем антитело содержит VH с SEQ ID NO: 63 и VL с SEQ ID NO: 65 или VH с SEQ ID NO: 64 и VL с SEQ ID NO: 65.

61) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-60, которое является человеческим или гуманизированным.

62) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-61, в котором антитело относится к изотипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.

63) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-62, содержащее одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять замен в Fc антитела.

64) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-63, причем одна, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять замен приводят к увеличению периода полужизни антитела.

65) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-64, содержащее замены M252Y,

- 103 045238

S254T и T256E, причем нумерация остатков соответствует каталогу EU.

66) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-65, причем одна, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять замен приводят к уменьшению связывания антитела с активирующим рецептором Fcy (FcyR).

67) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-66, причем активирующим FcyR является FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIIa или FcyRIIIb.

68) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-67, содержащее

a) замены L234A, L235A, G237A, P238S, H268A, A330S и P331S;

b) замены V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S и P331S;

c) замены F234A, L235A, G237A, P238S и Q268A;

d) замены L234A, L235A или L234A и L235A;

e) замены F234A, L235A или F234A и L235A; или

f) замена V234A, причем нумерация остатков соответствует каталогу EU.

69) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-68, содержащее замены S228P, причем нумерация остатков соответствует каталогу EU.

70) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-69, которое является биспецифическим.

71) Антитело по варианту осуществления 70, причем антитело специфически связывает PD-L1, PDL2, LAG-3, TIM-3, CEACAM-1, CEACAM-5, OX-40, GITR, CD27, VISTA или CTLA-4.

72) Иммуноконъюгат, содержащий антитело или его антигенсвязывающий участок по любому одному из вариантов осуществления 1-71, связанный с терапевтическим агентом или визуализирующим агентом.

73) Фармацевтическая композиция, содержащая антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-71 или иммуноконъюгат по варианту осуществления 72 и фармацевтически приемлемый носитель.

74) Полинуклеотид, кодирующий VH антитела по варианту осуществления 34, VL антитела по варианту осуществления 35 или VH антитела и VL антитела по варианту осуществления 34 или 35.

75) Полинуклеотид, кодирующий VH антитела, VL антитела или VH и VL антитела по варианту осуществления 60.

76) Вектор, содержащий полинуклеотид по варианту осуществления 74 или 75.

77) Клетка-хозяин, содержащая вектор по варианту осуществления 76.

78) Способ продукции антитела по любому одному из вариантов осуществления 1-71, включающий в себя культивирование клетки-хозяина по варианту осуществления 77 в условиях экспрессии антитела и выделение антитела, продуцируемого клеткой-хозяином.

79) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-71, иммуноконъюгат по варианту осуществления 72 или фармацевтическая композиция по варианту осуществления 73 для применения в лечении рака.

80) Антитело, иммуноконъюгат или фармацевтическая композиция для применения по варианту осуществления 79, причем рак представляет собой солидную опухоль или гематологическую злокачественную опухоль.

81) Антитело, иммуноконъюгат или фармацевтическая композиция для применения по варианту осуществления 80, причем солидная опухоль представляет собой меланому, рак легкого, плоскоклеточный немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), неплоскоклеточный NSCLC, колоректальный рак, рак предстательной железы, устойчивый к кастрации рак предстательной железы, рак желудка, рак яичника, рак желудка, рак печени, рак поджелудочной железы, рак щитовидной железы, плоскоклеточную карциному головы и шеи, карциному пищевода или желудочно-кишечного тракта, рак молочной железы, рак фаллопиевой трубы, рак головного мозга, рак уретры, урогенитальный рак, эндометриоз, рак шейки матки или метастатическое раковое поражение.

82) Антитело, иммуноконъюгат или фармацевтическая композиция для применения по варианту осуществления 80, причем гематологическая злокачественная опухоль представляет собой лимфому, миелому или лейкоз.

83) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-71, иммуноконъюгат по варианту осуществления 72 или фармацевтическая композиция по варианту осуществления 73 для применения в усилении иммунного ответа у субъекта.

84) Антитело, иммуноконъюгат или фармацевтическая композиция для применения по варианту осуществления 83, причем субъект имеет рак или вирусную инфекцию.

85) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-71, иммуноконъюгат по варианту осуществления 72 или фармацевтическая композиция по варианту осуществления 73 для применения по любому одному из вариантов осуществления 70-84 в комбинации со вторым терапевтическим агентом.

86) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-71 для применения по варианту осуществления 85, причем второй терапевтический агент представляет собой стандартное лекарственное

- 104 045238 средство для лечения солидной опухоли или гематологической злокачественной опухоли.

87) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-71 для применения по варианту осуществления 85 или 86, причем второй терапевтический агент представляет собой агонист молекулы, активирующей T-клетки.

88) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-71 для применения по любому одному из вариантов осуществления 85-87, причем активирующая T-клетки молекула представляет собой CD86, CD80, CD28, ICOS, лиганд ICOS, TMIGD2, CD40, TL1A, лиганд GITR, лиганд 4-1BB, лиганд OX40, CD70, CD40L, TNFRSF25, LIGHT, GITR, OX-40, CD27, CD137, NKG2D, CD48, CD226 или MICA.

89) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-71 для применения по любому одному из вариантов осуществления 85-88, причем агонист представляет собой антитело, которое специфически связывает молекулу, активирующую T-клетки.

90) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-71 для применения по любому одному из вариантов осуществления 85 или 86, причем второй терапевтический агент представляет собой ингибитор молекулы, ингибирующей T-клетки.

91) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-71 для применения по любому одному из вариантов осуществления 85, 86 или 90, причем ингибирующая T-клетки молекула представляет собой PD-1, PD-L1, PD-L2, VISTA, BTNL2, B7-H3, B7-H4, HVEM, HHLA2, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, BTLA, CD160, CEACAM-1, LAIR1, TGF-P, IL-10, семейство Siglec, KIR, CD96, TIGIT, NKG2A, CD112, CD47, SIRPA или CD244.

92) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-71 для применения по любому одному из вариантов осуществления 85, 86, 90 или 91, причем ингибитор или ингибирующая T-клетки молекула представляет собой антитело, которое специфически связывает молекулу, ингибирующую T клетки.

93) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-71 для применения по любому од ному из вариантов осуществления 85, 86 или 90-92, причем антитело специфически связывает TIM-3 и блокирует связывание TIM-3 с галектином-9.

94) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-71 для применения по любому од ному из вариантов осуществления 85, 86 или 90-93, причем антитело, которое специфически связывает молекулу, ингибирующую T-клетки, содержит VH и VL с

a) SEQ ID NO b) SEQ ID NO c) SEQ ID NO d) SEQ ID NO e) SEQ ID NO

145 и 155 соответственно;

146 и 156 соответственно;

148 и 157 соответственно;

147 и 155 соответственно;

149 и 158 соответственно;

f) SEQ ID NO: 150 и 159 соответственно;

g) SEQ ID NO: 151 и 160 соответственно;

h) SEQ ID NO: 152 и 161 соответственно;

i) SEQ ID NO: 153 и 162 соответственно; или

j) SEQ ID NO: 154 и 163 соответственно.

95) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-71 для применения по варианту осуществления 85, причем второй терапевтический агент представляет собой ингибитор рецептора фактора роста фибробластов (FGFR).

96) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-71 для применения по варианту осуществления 85, причем второй терапевтический агент представляет собой вакцину.

97) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-71 для применения по варианту осуществления 85 или 96, причем вакцина представляет собой полипептид или его фрагмент либо ДНК или РНК, кодирующую полипептид или его фрагмент, экспрессируемый на опухолевых клетках.

98) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-71 для применения по любому одному из вариантов осуществления 85, 96 или 97, причем опухолевые клетки представляют собой клетки меланомы, рака легкого, плоскоклеточного немелкоклеточного рака легкого (NSCLC), неплоскоклеточного NSCLC, колоректального рака, рака предстательной железы, устойчивого к кастрации рака предста тельной железы, рака яичника, рака желудка, рака печени, рака поджелудочной железы, рака щитовидной железы, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, карциномы пищевода или желудочнокишечного тракта или рака молочной железы.

99) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-71 для применения по любому одному из вариантов осуществления 85 или 96-98, причем полипептид представляет собой PSMA, мезотелин, EGFR или EGFRvIII.

100) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-71 для применения по любому одному из вариантов осуществления 85-99, причем второй терапевтический агент вводят одновременно, последовательно или отдельно.

101) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-71 для применения по любому одному из вариантов осуществления 79-100, причем субъект получал или получает лечение радиационной

- 105 045238 терапией.

102) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-71 для применения по любому одному из вариантов осуществления 79-101, причем пациенту была или будет проведена операция.

103) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-71 для применения по любому одному из вариантов осуществления 79-102, причем выделенное антитело содержит VH с SEQ ID NO: 41 и VL с SEQ ID NO: 49.

104) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-71 для применения по любому одному из вариантов осуществления 79-102, причем выделенное антитело содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 14, 17, 23, 26 и 32 соответственно.

105) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-71 для применения по любому одному из вариантов осуществления 79-102, причем выделенное антитело содержит HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 66, 67, 68, 69, 70 и 71 соответственно.

106) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-71 для применения по любому одному из вариантов осуществления 79-102, причем выделенное антитело содержит VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID NO: 56.

107) Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-71 для применения по любому одному из вариантов осуществления 79-102, причем выделенное антитело содержит VH с SEQ ID NO: 64 и VL с SEQ ID NO: 65.

108) Полинуклеотид, кодирующий VH, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с SEQ ID NO: 10, 14 и 17 соответственно.

109) Полинуклеотид, кодирующий VL, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 23, 26 и 32 соответственно.

110) Полинуклеотид, кодирующий VH, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с SEQ ID NO: 10, 14 и 17 соответственно, и VL, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 23, 26 и 32 соответственно.

111) Полинуклеотид, кодирующий VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48.

112) Полинуклеотид, кодирующий VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56.

113) Полинуклеотид, кодирующий VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56.

114) Вектор, содержащий полинуклеотид по варианту осуществления 108.

115) Вектор, содержащий полинуклеотид по варианту осуществления 109.

116) Вектор, содержащий полинуклеотид по варианту осуществления 110.

117) Вектор, содержащий полинуклеотид по варианту осуществления 111.

118) Вектор, содержащий полинуклеотид по варианту осуществления 112.

119) Вектор, содержащий полинуклеотид по варианту осуществления 113.

120) Клетка-хозяин, содержащая вектор по варианту вектор по варианту осуществления 114.

121) Клетка-хозяин, содержащая вектор по варианту вектор по варианту осуществления 115.

122) Клетка-хозяин, содержащая вектор по варианту вектор по варианту осуществления 116.

123) Клетка-хозяин, содержащая вектор по варианту вектор по варианту осуществления 117.

124) Клетка-хозяин, содержащая вектор по варианту вектор по варианту осуществления 118.

125) Клетка-хозяин, содержащая вектор по варианту вектор по варианту осуществления 119.

126) Способ получения антитела, содержащего VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID NO: 56, включающий в себя культивирование клетки-хозяина по варианту осуществления 125 в условиях экспрессии антитела и выделение антитела, продуцируемого клеткой-хозяином.

127) Иммуноконъюгат, содержащий антитело или антигенсвязывающий участок антитела, который содержит VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID NO: 56, сшитое с терапевтическим агентом или визуализирующим агентом.

128) Фармацевтическая композиция, которая содержит антитело, содержащее VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID NO: 56, a также фармацевтически приемлемый носитель.

129) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, содержащее HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 10, 14, 17, 23, 26 и 32 соответственно, для применения в лечении рака.

130) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 129, причем антитело содержит VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID NO: 56.

131) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 129 или 130, причем рак представляет собой солидную опухоль.

132) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 129 или 130, причем солидная опухоль представляет собой меланому.

133) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 129 или 130, причем солидная опухоль представляет собой рак легкого.

- 106 045238

134) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 129 или 130, причем солидная опухоль представляет собой плоскоклеточный немелкоклеточный рак легкого (NSCLC).

135) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 129 или 130, причем солидная опухоль представляет собой неплоскоклеточный NSCLC.

136) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 129 или 130, причем солидная опухоль представляет собой колоректальный рак.

137) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 129 или 130, причем солидная опухоль представляет собой рак предстательной железы.

138) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 129 или 130, причем солидная опухоль представляет собой устойчивый к кастрации рак предстательной железы.

139) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 129 или 130, причем солидная опухоль представляет собой рак желудка.

140) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 129 или 130, причем солидная опухоль представляет собой рак яичника.

141) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 129 или 130, причем солидная опухоль представляет собой рак желудка.

142) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 129 или 130, причем солидная опухоль представляет собой рак печени.

143) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 129 или 130, причем солидная опухоль представляет собой рак поджелудочной железы.

144) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 129 или 130, причем солидная опухоль представляет собой рак щитовидной железы.

145) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 129 или 130, причем солидная опухоль представляет собой плоскоклеточную карциному головы и шеи.

146) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 129 или 130, причем солидная опухоль представляет собой карциному пищевода или желудочно-кишечного тракта.

147) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 129 или 130, причем солидная опухоль представляет собой рак молочной железы.

148) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 129 или 130, причем солидная опухоль представляет собой рак фаллопиевой трубы.

149) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 129 или 130, причем солидная опухоль представляет собой рак головного мозга.

150) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 129 или 130, причем солидная опухоль представляет собой рак уретры.

151) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 129 или 130, причем солидная опухоль представляет собой урогенитальный рак.

152) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 129 или 130, причем солидная опухоль представляет собой эндометриоз.

153) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 129 или 130, причем солидная опухоль представляет собой рак шейки матки.

154) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 129 или 130, причем солидная опухоль представляет собой метастатическое раковое поражение.

155) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 131 в комбинации со вторым терапевтическим агентом.

156) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 132 в комбинации со вторым терапевтическим агентом.

157) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 133 в комбинации со вторым терапевтическим агентом.

158) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 134 в комбинации со вторым терапевтическим агентом.

159) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по

- 107 045238 варианту осуществления 135 в комбинации со вторым терапевтическим агентом.

160) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 135 в комбинации со вторым терапевтическим агентом.

161) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 137 в комбинации со вторым терапевтическим агентом.

162) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 138 в комбинации со вторым терапевтическим агентом.

163) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 139 в комбинации со вторым терапевтическим агентом.

164) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 140 в комбинации со вторым терапевтическим агентом.

165) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 141 в комбинации со вторым терапевтическим агентом.

166) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 142 в комбинации со вторым терапевтическим агентом.

167) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 143 в комбинации со вторым терапевтическим агентом.

168) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 144 в комбинации со вторым терапевтическим агентом.

169) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 145 в комбинации со вторым терапевтическим агентом.

170) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 146 в комбинации со вторым терапевтическим агентом.

171) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 147 в комбинации со вторым терапевтическим агентом.

172) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 148 в комбинации со вторым терапевтическим агентом.

173) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 149 в комбинации со вторым терапевтическим агентом.

174) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 150 в комбинации со вторым терапевтическим агентом.

175) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 151 в комбинации со вторым терапевтическим агентом.

176) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 152 в комбинации со вторым терапевтическим агентом.

177) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 153 в комбинации со вторым терапевтическим агентом.

178) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 154 в комбинации со вторым терапевтическим агентом.

179) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 155, причем второй терапевтический агент представляет собой антителоантагонист, которое специфически связывает TIM-3, содержащее VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156.

180) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 156, причем второй терапевтический агент представляет собой антителоантагонист, которое специфически связывает TIM-3, содержащее VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156.

181) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 157, причем второй терапевтический агент представляет собой антителоантагонист, которое специфически связывает TIM-3, содержащее VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156.

182) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 158, причем второй терапевтический агент представляет собой антителоантагонист, которое специфически связывает TIM-3, содержащее VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156.

183) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 159, причем второй терапевтический агент представляет собой антителоантагонист, которое специфически связывает TIM-3, содержащее VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156.

184) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 160, причем второй терапевтический агент представляет собой антителоантагонист, которое специфически связывает TIM-3, содержащее VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID

- 108 045238

NO: 156.

185) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 161, причем второй терапевтический агент представляет собой антителоантагонист, которое специфически связывает TIM-3, содержащее VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156.

186) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 162, причем второй терапевтический агент представляет собой антителоантагонист, которое специфически связывает TIM-3, содержащее VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156.

187) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 163, причем второй терапевтический агент представляет собой антителоантагонист, которое специфически связывает TIM-3, содержащее VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156.

188) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 164, причем второй терапевтический агент представляет собой антителоантагонист, которое специфически связывает TIM-3, содержащее VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156.

189) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 165, причем второй терапевтический агент представляет собой антителоантагонист, которое специфически связывает TIM-3, содержащее VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156.

190) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 166, причем второй терапевтический агент представляет собой антителоантагонист, которое специфически связывает TIM-3, содержащее VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156.

191) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 167, причем второй терапевтический агент представляет собой антителоантагонист, которое специфически связывает TIM-3, содержащее VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156.

192) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 168, причем второй терапевтический агент представляет собой антителоантагонист, которое специфически связывает TIM-3, содержащее VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156.

193) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 169, причем второй терапевтический агент представляет собой антителоантагонист, которое специфически связывает TIM-3, содержащее VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156.

194) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 170, причем второй терапевтический агент представляет собой антителоантагонист, которое специфически связывает TIM-3, содержащее VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156.

195) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 171, причем второй терапевтический агент представляет собой антителоантагонист, которое специфически связывает TIM-3, содержащее VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156.

196) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 172, причем второй терапевтический агент представляет собой антителоантагонист, которое специфически связывает TIM-3, содержащее VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156.

197) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 173, причем второй терапевтический агент представляет собой антителоантагонист, которое специфически связывает TIM-3, содержащее VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156.

198) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 174, причем второй терапевтический агент представляет собой антителоантагонист, которое специфически связывает TIM-3, содержащее VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156.

199) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 175, причем второй терапевтический агент представляет собой антителоантагонист, которое специфически связывает TIM-3, содержащее VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156.

200) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по

- 109 045238 варианту осуществления 176, причем второй терапевтический агент представляет собой антителоантагонист, которое специфически связывает TIM-3, содержащее VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID

NO: 156.

201) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 177, причем второй терапевтический агент представляет собой антителоантагонист, которое специфически связывает TIM-3, содержащее VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156.

202) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 178, причем второй терапевтический агент представляет собой антителоантагонист, которое специфически связывает TIM-3, содержащее VH с SEQ ID NO: 146 и VL с SEQ ID NO: 156.

203) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 155, причем второй терапевтический агент представляет собой вакцину.

204) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 156, причем второй терапевтический агент представляет собой вакцину.

205) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 157, причем второй терапевтический агент представляет собой вакцину.

206) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 158, причем второй терапевтический агент представляет собой вакцину.

207) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 159, причем второй терапевтический агент представляет собой вакцину.

208) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 160, причем второй терапевтический агент представляет собой вакцину.

209) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 161, причем второй терапевтический агент представляет собой вакцину.

210) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 162, причем второй терапевтический агент представляет собой вакцину.

211) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 163, причем второй терапевтический агент представляет собой вакцину.

212) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 164, причем второй терапевтический агент представляет собой вакцину.

213) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 165, причем второй терапевтический агент представляет собой вакцину.

214) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 166, причем второй терапевтический агент представляет собой вакцину.

215) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 167, причем второй терапевтический агент представляет собой вакцину.

216) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 168, причем второй терапевтический агент представляет собой вакцину.

217) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 169, причем второй терапевтический агент представляет собой вакцину.

218) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 170, причем второй терапевтический агент представляет собой вакцину.

219) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 171, причем второй терапевтический агент представляет собой вакцину.

220) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 172, причем второй терапевтический агент представляет собой вакцину.

221) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 173, причем второй терапевтический агент представляет собой вакцину.

222) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 174, причем второй терапевтический агент представляет собой вакцину.

223) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 175, причем второй терапевтический агент представляет собой вакцину.

224) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 176, причем второй терапевтический агент представляет собой вакцину.

225) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 177, причем второй терапевтический агент представляет собой вакцину.

226) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 178, причем второй терапевтический агент представляет собой вакцину.

227) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 155, причем второй терапевтический агент представляет собой ингибитор рецептора фактора роста фибробластов (FGFR).

- 110 045238

228) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 156, причем второй терапевтический агент представляет собой ингибитор рецептора фактора роста фибробластов (FGFR).

229) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 157, причем второй терапевтический агент представляет собой ингибитор рецептора фактора роста фибробластов (FGFR).

230) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 158, причем второй терапевтический агент представляет собой ингибитор рецептора фактора роста фибробластов (FGFR).

231) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 159, причем второй терапевтический агент представляет собой ингибитор рецептора фактора роста фибробластов (FGFR).

232) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 160, причем второй терапевтический агент представляет собой ингибитор рецептора фактора роста фибробластов (FGFR).

233) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 161, причем второй терапевтический агент представляет собой ингибитор рецептора фактора роста фибробластов (FGFR).

234) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 162, причем второй терапевтический агент представляет собой ингибитор рецептора фактора роста фибробластов (FGFR).

235) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 163, причем второй терапевтический агент представляет собой ингибитор рецептора фактора роста фибробластов (FGFR).

236) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 164, причем второй терапевтический агент представляет собой ингибитор рецептора фактора роста фибробластов (FGFR).

237) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 165, причем второй терапевтический агент представляет собой ингибитор рецептора фактора роста фибробластов (FGFR).

238) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 166, причем второй терапевтический агент представляет собой ингибитор рецептора фактора роста фибробластов (FGFR).

239) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 167, причем второй терапевтический агент представляет собой ингибитор рецептора фактора роста фибробластов (FGFR).

240) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 168, причем второй терапевтический агент представляет собой ингибитор рецептора фактора роста фибробластов (FGFR).

241) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 169, причем второй терапевтический агент представляет собой ингибитор рецептора фактора роста фибробластов (FGFR).

242) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 170, причем второй терапевтический агент представляет собой ингибитор рецептора фактора роста фибробластов (FGFR).

243) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 171, причем второй терапевтический агент представляет собой ингибитор рецептора фактора роста фибробластов (FGFR).

244) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 172, причем второй терапевтический агент представляет собой ингибитор рецептора фактора роста фибробластов (FGFR).

245) Выделенное антитело-антагонист, которое специфически связывает PD-1, для применения по варианту осуществления 173, причем второй терапевтический агент представляет собой ингибитор рецептора фактора роста фибробластов (FGFR).

Далее настоящее изобретение будет описано со ссылкой на приведенные ниже конкретные примеры, не имеющие ограничительного характера.

Прим ер 1. Общие способы.

Реакция смешанной культуры очищенных лимфоцитов человека (MLR).

Реакцию смешанной культуры очищенных лимфоцитов человека (анализ MLR) применяли для измерения изменений в продукции цитокинов, индуцированные добавлением исследуемых антител в совместные культуры T-клеток CD4+ Т и дендритных клеток.

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) выделяли из лейкопака (компания Biologi- 111 045238 cal Specialty Corporation) с помощью градиента фиколла. Затем T-клетки CD4+ вновь выделяли посредством негативного отбора из PBMC с помощью Miltenyi AutoMACS и гранул для выделения T-клеток CD4+ согласно инструкциям изготовителя либо приобретали готовые в виде замороженных T-клеток CD4+ (компания Hemacare Corporation). Применяли дендритные клетки от одного донора (компания Hemacare Corporation). После выделения или размораживания T-клетки CD4+ и дендритные клетки промывали и ресуспендировали в среде анализа (среда RMPI1640 с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 1% пенициллина/стрептомицина, 1X заменимых аминокислот и 1X пирувата натрия компании Invitrogen). Очищенные T-клетки CD4+ человека разбавляли до 1x106 клеток/мл и засевали по 100000 клеток/100 мкл/лунка. Дендритные клетки разбавляли до 0,1x106 клеток/мл и засевали по 5000 клеток/50 мкл/лунка в планшетах с U-образным дном. Исследуемые антитела или контрольные антитела готовили в концентрации 4X в среде анализа, получив 1X, когда 50 мкл антитела добавляли к 150 мкл клеток.

В лунки добавляли 10-точечные последовательные разведения исследуемых или контрольных антител с конечной концентрацией: 30, 10, 3,33, 1,11, 0,37, 0,12, 0,04, 0,01, 0,0046 и 00015 нМ. T-клетки CD4+ с дендритными клетками и дендритные клетки отдельно включали в качестве контролей для измерения базальной секреции цитокинов. Клетки поддерживали при 37°C в 5% CO₂ в течение 5 суток. На день 5 из планшет с культурой отбирали 100 мкл супернатанта клеточной культуры и переносили на планшеты с V-образным дном. Супернатант замораживали при -80°C по меньшей мере в течение ночи. Совокупную продукцию цитокинов измеряли в супернатанте тканевой культуры с применением 10-местных планшет для Th1/Th2 цитокина человека Meso Scale Discovery (MSD) по протоколу изготовителя. Вкратце, планшеты MSD блокировали 1% блокатором B в течение ночи при 4°C. На следующий день удаляли блокатор и планшеты промывали на моющем устройстве для планшет Biotek 406. Готовили 8-точечную кривую стандарта и добавляли в планшеты в двух повторностях. Размороженный супернатант тканевой культуры добавляли по 25 мкл/лунка, планшеты плотно закрывали и энергично встряхивали в течение 1,5 часа. Не убирая стандарты или супернатант, добавляли по 25 мкл антитела для обнаружения в каждую лунку. Планшеты плотно закрывали и энергично встряхивали в течение 1,5 часа. Планшеты промывали, добавляли буферный раствор для считывания и считывали планшеты на устройстве для считывания планшет Meso Scale Discovery.

Концентрации цитокинов вычисляли с помощью программного обеспечения MSD. Концентрацию цитокина в неизвестных пробах вычисляли путем сравнения выходного сигнала неизвестной пробы с выходным сигналом и известными концентрациями цитокина по стандартной кривой. Вычисленные концентрации загружали в программное обеспечение Spotfire TIBCO для визуализации. После визуальной проверки данных применяли процедуру MAD-медианных выбросов с пороговым значением 3,5 для выявления и исключения выбросов на логарифмированных данных. С каждым цитокином для каждого антитела проводили устойчивый анализ полумаксимальной эффективной концентрации (Robust EC50).

Анализ ЦМВ.

Анализ с антигеном цитомегаловируса (анализ ЦМВ) применяли для измерения изменений в продукции цитокинов, которые вызваны добавлением исследуемых антител к культурам мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) с цельным антигеном ЦМВ (для антител PD-1) или с пулом из 138 15-членных пептидов, перекрывающих фосфопротеин 65 кДа (pp65) (для mAb TIM-3 и биспецифических mAb PD-1/TIM-3).

PBMC (компании Astarte Biologies и Hemcare Corporation) после размораживания промывали и ресуспендировали в среде анализа (среда RMPI1640 с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 1% пенициллина/стрептомицина, 1X заменимых аминокислот и 1X пирувата натрия компании Invitrogen). PBMC разбавляли до 1,5x106 клеток/мл и засевали по 150000 клеток/100 мкл/лунка. Антиген ЦМВ (компания Astarte Biologies) готовили в концентрации 4X 0,4 мкг/мл в среде анализа, получив 0,1 мкг/мл, когда 50 мкл антитела добавили к 100 мкл клеток и 50 мкл антитела. Антитела готовили в концентрации 4X в среде анализа, получив 1X, когда 50 мкл антитела добавили к клеткам и пептиду.

Последовательные разведения исследуемых антител добавляли в лунки в конечной концентрации от 150 до 0,001 нМ. Клетки с антигеном ЦМВ или пулом pp65, отдельные клетки и изотипический контроль, приготовленный в конечной концентрации 50 или 30 нМ, были включены в качестве контролей при измерении базальной секреции цитокина. Клетки поддерживали при 37°C в 5% CO2 в течение 6 дней. Для анализа MSD в день 6 100 мкл супернатанта тканевой культуры отбирали из планшет с культурой и переносили на планшеты с V-образным дном. Супернатант замораживали при -80°C по меньшей мере в течение ночи. Совокупную продукцию цитокинов измеряли в супернатанте тканевой культуры с применением 10-местных планшет для Th1/Th2 цитокина человека Meso Scale Discovery (MSD) по протоколу изготовителя. Вкратце, планшеты MSD блокировали 1% блокатором B в течение ночи при 4°C. На следующий день удаляли блокатор и планшеты промывали на моющем устройстве для планшет Biotek 406. Готовили 8-точечную кривую стандарта и добавляли в планшеты в двух повторностях. Размороженный супернатант тканевой культуры добавляли по 25 мкл/лунка, планшеты плотно закрывали и энергично встряхивали в течение 1,5 часа. Не убирая стандарты или супернатант, добавляли по 25 мкл анти- 112 045238 тела для обнаружения в каждую лунку. Планшеты плотно закрывали и энергично встряхивали в течение

1,5 часа. Планшеты промывали, добавляли буферный раствор для считывания и считывали планшеты на устройстве для считывания планшет Meso Scale Discovery.

Что касается антител TIM-3 и биспецифических антител PD-1/TIM-3, то в день 6 после отбора супернатанта на анализ MSD клетки однократно промывали PBS, а впоследствии окрашивали для различения между живыми/мертвыми, а также представленных ниже маркеров клеточной поверхности: CD3, CD4, CD8, CD137, PD-1 и TIM-3. Выполняли проточную цитометрию на LSR Fortessa (BD). Данные анализировали с помощью программного обеспечения Flow Jo. Клетки CD137+ определяли на основании способа Fluorescence Minus One (FMO) на живых клетках CD8+ и CD4+, обработанных ЦМВ.

В экспериментах с последовательной обработкой анализы ЦМВ проводили так, как описано выше, со стимуляцией пулом пептидов pp65 в течение шести дней. На шестой день супернатант отбирали и клетки повторно стимулировали пулом pp65 в присутствии антител к TIM-3. Через двадцать четыре часа отбирали супернатант и измеряли уровни ИФН-γ с помощью MSD, как описано выше.

Анал из на ингибирование лиганда PD-1.

План анализа на ингибирование лиганда был основан на MSD (Mescoscale Discovery). Планшету для MSD непосредственно покрывали лигандом (PDL1-ECD яванского макака, PDL1-ECD человека или PDL2-ECD человека) и инкубировали в течение ночи при 4°C. На следующий день удаляли покрывающий раствор и блокировали планшету. Фиксированную концентрацию биотинилированного PD-1 (PD1ECD человека) преинкубировали с антителами или антителом изотипического контроля в качестве отрицательного контроля. В зависимости от панели антител, подлежащих исследованию, антитела исследовали в виде титрантов или при фиксированной концентрации. Планшету MSD промывали и добавляли смесь биотинилированного PD-1/антитела к лиганду, покрывающему планшету MSD. Планшету промывали и с помощью рутенилированного стрептавидина определяли биотинилированный PD-1, связанный с лигандом. Ингибирование связывания PD-1 антителом приводило к уменьшению сигнала в анализе MSD. Определяли максимальное связывание биотинилированного PD-1 в отсутствие ингибитора и иногда применяли его для нормализации данных к процентной доле от максимального сигнала биотинилированного PD-1. mAb, которые были положительными на ингибирование связывания лиганда при одной концентрации, также исследовали на дозозависимые эффекты при ингибировании различных лигандов PD-1.

Связывание с клетками Jurkat.

Клетки Jurkat стимулировали 20 нг/мл PHA в течение ночи, собирали, промывали и проверяли на жизнеспособность. Затем клетки инкубировали при 6-10°C в течение 45-60 минут с различными концентрациями исследуемых антител, промывали и инкубировали при 6-10°C в течение 45-60 минут с IgG козы против человека, меченным FITC. Клетки промывали и фиксировали в BD Cytofix, охлаждали в течение ночи и анализировали на проточном цитометре MACSQuant. Процентную долю положительных на PD-1 клеток при каждой концентрации антитела наносили на график в зависимости от логарифмической концентрации антитела и выводили значения EC50 в Prism.

Измерения аффинности.

mAb PD-1.

mAb к PD-1 исследовали на аффинность связывания с PD1-ECD человека и PD-1-ECD яванского макака. Измерения аффинности с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) выполняли с применением системы ProteOn XPR36. Готовили биосенсорную поверхность, связывая смесь Fc к IgG с поверхностью слоя модифицированного полимерного альгината на пластине GLC согласно инструкции изготовителя по реакциям аминного связывания. Исследуемые mAb захватывались, и их взаимодействия с аналитами (huPD1-ECD или cynoPD1-ECD) отслеживали в буферном растворе на основе PBS при 25°C. Собранные данные обрабатывали и приспосабливали к модели связывания Ленгмюра 1: 1. Результат для каждого mAb регистрировали в формате kon (скорость ассоциации), koff (скорость диссоциации) и KD (равновесная константа диссоциации).

Анал из ингибирования лиганда TIM-3.

Твердофазный конкурентный ИФА Т1М-3/галектина-9 выполняли посредством связывания 1 мкг/мл рекомбинантной химеры Fc-TIM-3 человека (№ по каталогу R&D Systems: 2365-TM-05) в PBS на одну лунку в 96-луночной планшете White Maxisorp (компания Nunc). Планшеты промывали и блокировали StartingBlock T20 (компания Pierce), а затем в лунки добавляли ингибитор в концентрации 10 мкг/мл. Без промывания в лунки добавляли 7,5 мкг/мл галектина-9 и инкубировали в течение 30 мин. Затем добавляли 0,5 мкг/мл поликлонального антитела к галектину-9-биотину (компания R&D Systems)

- 113 045238 и инкубировали в течение 30 минут. Планшеты промывали и добавляли конъюгат нейтравидина-HRP (компания Pierce); планшеты дополнительно инкубировали в течение 45 минут. Планшеты промывали и добавляли субстрат хемилюминесценции POD (компания Roche) непосредственно перед считыванием планшет; люминесценцию считывали на люминометре.

Создание антигенов, применяемых в исследовании.

Клонирование, экспрессию и очистку антигенов выполняли с помощью стандартных способов. Различные фрагменты белка экспрессировали в виде гексагистидинового тега или гибридных белков Fc. Аминокислотные последовательности применяемых белков без последовательностей тегов показаны в SEQ ID NO: 1-9, 138 и 89.

Полноразмерный человеческий PD1 (huPD1); SEQ ID NO: 1 pgwfIdspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdkl aafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelr vterraevptahpspsprpagqfqtlvvgvvggllgslvllvwvlavicsraargtigarrtgq plkedpsavpvfsvdygeldfqwrektpeppvpcvpeqteyativfpsgmgtssparrgsadgp rsaqplrpedghcswpl

Внеклеточный домен PD-1 человека (PD1-ECD человека); SEQ ID NO: 2

PGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKL AAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSWRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELR VTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTL

PD1 Macaca fascicularis (яванский макак, в настоящем документе обозначенный cyno) (cPD1); SEQ ID NO: 3).

PGWFLESPDRPWNAPTFSPALLLVTEGDNATFTCSFSNASESFVLNWYRMSPSNQTDKL AAFPEDRSQPGQDCRFRVTRLPNGRDFHMSWRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELR VTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQALWGWGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAAQGTIEARRTGQ PLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPAPCVPEQTEYATIVFPSGLGTSSPARRGSADGP RSPRPLRPEDGHCSWPL

Внеклеточный домен PD-1 яванского макака (cPD1-ECD); SEQ ID NO: 4

PGWFLESPDRPWNAPTFSPALLLVTEGDNATFTCSFSNASESFVLNWYRMSPSNQTDKL AAFPEDRSQPGQDCRFRVTRLPNGRDFHMSWRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELR VTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQAL

Полноразмерный PD-L1 человека (huPD-L1); SEQ ID NO: 5

FTVTVPKDLYWEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQ HSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRI LWDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNE IFYCT FRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNER

Внеклеточный домен PD-L1 человека (huPDL1-ECD); SEQ ID NO: 6

FTVTVPKDLYWEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQ HSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRI LWDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNE IFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERT

Внеклеточный домен PD-L1 яванского макака (cynoPDL1-ECD); SEQ ID NO: 7

AFTVTVPKDLYWEYGSNMTIECKFPVEKQLDLTSLIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKV QHSNYRQRAQLLKDQLSLGNAALRITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQR ILWDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLLNVTSTLRINTTAN EIEYCIFRRLDPEENHTAELVIPELPLALPPNERT

Внеклеточный домен PD-L2 человека (huPDL2-ECD); SEQ ID NO: 8

LFTVTVPKELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASLQKVENDTSPHRERATLLEE QLPLGKASFHIPQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDYKYLTLKVKASYRKINTHILKVPETDEVELT CQATGYPLAEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGLYQVTSVLRLKPPPGRNFSCVFWNTHVRELTLAS IDLQSQMEPRTHPT

Внеклеточный домен PD-1 мыши (cynoPDL1-ECD); SEQ ID NO: 9

LEVPNGPWRSLTFYPAWLTVSEGANATFTCSLSNWSEDLMLNWNRLSPSNQTEKQAAFC NGLSQPVQDARFQIIQLPNRHDFHMNILDTRRNDSGIYLCGAISLHPKAKIEESPGAELWTER ILETSTRYPSPSPKPEGRFQ

- 114 045238

Полноразмерный человеческий TIM-3, SEQ ID NO: 138

SEVEYRAEVGQNAYLPCFYTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFECGNWLRTDERDVNYWTS

RYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMNDEKFNLKLVIKPAKVTPAPTRQRDF TAAFPRMLTTRGHGPAETQTLGSLPDINLTQISTLANELRDSRLANDLRDSGATIRIGIYIGAG ICAGLALALIFGALIFKWYSHSKEKIQNLSLISLANLPPSGLANAVAEGIRSEENIYTIEENVY EVEEPNEYYCYVSSRQQPSQPLGCRFAMP

Внеклеточный домен TIM-3 человека (huTIM-3-ECD); SEQ ID NO: 89

SEVEYRAEVGQNAYLPCFYTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFECGNWLRTDERDVNYWTS

RYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMNDEKFNLKLVIKPAKVTPAPTRQRDF

TAAFPRMLTTRGHGPAETQTLGSLPDINLTQISTLANELRDSRLANDLRDSGATIR

Пример 2. Отбор антител к человеческому PD-1 из библиотек фаговых дисплеев.

Связывающие PD-1 Fab выбирали из получаемых de novo библиотек pIX-фаговых дисплеев, как описано в Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010; международной патентной публикации № WO2009/085462 и патентной публикации США № US2010/0021477. Вкратце, библиотеки создавали посредством диверсификации человеческих каркасов, в которых гены VH зародышевой линии IGHV169*01, IGHV3-23*01 и IGHV5-51*01 рекомбинировали с человеческим минигеном IGHJ-4 посредством петли H3, а человеческие гены VL-каппа зародышевой линии O12 (IGKV1-39*01), L6 (IGKV3-11*01), A27 (IGKV3-20*01) и B3 (IGKV4-1*01) рекомбинировали с минигеном IGKJ-1 для сборки полных доменов VH и VL. Для диверсификации выбирали положения вариабельных областей легкой и тяжелой цепи около петель H1, H2, L1, L2 и L3, соответствующие положениям, для которых был выявлен частый контакт с белковыми и пептидными антигенами. Диверсификация последовательности в выбранных положениях ограничивалась остатками, встречающимися в каждом положении в семействах генов зародышевой линии IGHV или IGLV для соответствующих генов IGHV или IGLV. Диверсификацию петли H3 создавали, используя синтетические короткие или средние петли длиной 7-14 аминокислот. Распределение аминокислот в H3 выполняли аналогично наблюдаемой вариации аминокислот в человеческих антителах. Конфигурация библиотеки подробно описана в Shi et al., (2010) J Mol Biol 397:385-96. Каркасы, использованные для создания библиотек, получали название в соответствии с их происхождением от человеческого гена зародышевой линии VH и VL. Три библиотеки тяжелых цепей комбинировали с четырьмя легкими цепями зародышевой линии или комбинировали с библиотеками диверсифицированных легких цепей, создав 12 уникальных комбинаций VH: VL. Позднее эти библиотеки комбинировали, дополнительно основываясь на версиях библиотек для создания дополнительных библиотек для экспериментов по пэннингу на PD-1.

Выполняли пэннинг библиотек против huPD1-ECD, cynoPD1-ECD, musPD1-ECD, huPD1-Fc и/или musPD1-Fc. Рекомбинантные белки биотинилировали (bt) и захватывали на магнитных гранулах стрептавидина (компания Dynal), а затем экспонировали с новыми библиотеками pIX Fab в конечной концентрации 100 нМ или 10 нМ. Неспецифические фаги отмывали в PBS-Tween, а связанные фаги выделяли посредством инфицирования клеток MC1061F' E.coli. Фаги амплифицировали из этих клеток в течение ночи и повторяли в общей сложности три или четыре цикла пэннинга. После завершающего цикла биопэннинга моноклональные Fab отбирали по связыванию huPD1-ECD, huPD1-Fc, musPD1-Fc и/или cynoPD1-Fc в двух форматах твердофазного ИФА. В формате 1 Fab захватывали на планшете для ИФА антителом к Fd и к захваченному Fab добавляли различные формы bt-PD-1 с последующим обнаружением bt-PD-1 с помощью стрептавидина-HRP. В формате 2 различные формы btPD-1 захватывали на планшетах для ИФА стрептавидином и к захваченному антигену добавляли секретированный Fab с последующим обнаружением Fab с помощью GoatAntiFab'2HRP. Клоны, которые демонстрировали связывание с белками, секвенировали в вариабельных областях тяжелой и легкой цепей.

Затем Fab из выбранных человеческих PD-1 или мышиных PD-1 исследовали на перекрестную реактивность с PD-1-Fc яванского макака, секретированным в супернатанте клеток млекопитающих. Fab захватывали на планшете для ИФА антителом к Fd и к захваченному Fab добавляли супернатант PD-1-Fc яванского макака с последующим обнаружением PD-1-Fc яванского макака с помощью GoatAntiHumanFc:HRP. На основании характеристик связывания с PD-1-Fc яванского макака выбранные антитела отбирали для дальнейшей характеризации.

Выбранные Fab отбирали для дальнейшей характеризации и клонировали как IgG2сигма/κ. IgG2сигма лишился эффекторных функций и имеет замены V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S и P331S по сравнению с IgG2 дикого типа. IgG2сигма представлен в патенте США № 8,961,967. Антитела оценивали на их способность блокировать связывание PD-1 человека с PD-L1 яванского макака, аффинности к белкам PD-1 человека и яванского макака, а также на их способность связываться с клетками, эндогенно экспрессирующими PD-1 человека (клетки Jurkat). Впоследствии антитела оценивали на их способность блокировать связывание человеческого PD-L1 и человеческого PD-L2 с человеческим PD-1.

На основании результатов были отобраны несколько антител для созревания аффинности. Характе- 115 045238 ристики выбранных антител, отобранных для созревания аффинности, показаны в табл. 7.

Таблица 7

mAb	Ингибирование лиганда; IC50 (мкг/мл)	Связывание Jurkat; ЕС50 (мкг/мл)	Аффинность в ProteOn SPR
cynoPD-Ll	huPD-Ll	huPD-L2	kon (1/Мс)	kof f d/c)	KD (нМ)
PD1B11	0,017- 0, 018	0,019	0, 029	0,03-0,24	4,68Е+05	8,96Е-03	19,2
PD1B70	0,010- 0, 021	0,040	0, 059	0,69-1,32	1,84Е+05	3,04Е-02	166
PD1B71	0,014- 0, 015	0,024	0, 035	0,13-0,47	2,31Е+05	2,77Е-02	120

Ни - человеческий

Супо - яванского макака

Пример 3. Созревание аффинности человеческих антител к PD-1.

Созревание аффинности антител PD1B70, PD1B71 и PD1B114 (близкий гомолог PD1B11) выполняли в формате Fab с применением библиотек фагового дисплея с разнообразием в выбранных положениях VL и в HCDR1 и HCDR2. Схема библиотек для созревания аффинности для каждого Fab показана в табл. 8. Нумерация остатков соответствует VH PD1B114 с SEQ ID NO: 41 в табл. 8.

Таблица 8

Диверсификация VH PD1B114, PD1B70 и PD1B71
Положение	Исходная аминокислота	Остатки, применяемые для диверсификации
30	S	D, К, S
31	S	D, N, S, Т
32	Y	A, D, S, Y
33	А	A, D, G, S, W, Y
35	S	Η, N, S
50	G	А, Е, G, N, R, Т, W, Y
52	I	A, D, I, N, R, S
54	I	Е, I, N, S, Y
55	F	Е, F, Q, S, Y
57	Т	D, N, R, S, Т, Y
59	N	Е, G, N, Q, R, Y

Диверсификация VL PD1B114, PD1B70 и PD1B71
Положение	Исходная аминокислота	Остатки, применяемые для диверсификации
30	S	D, N, R, S
31	S	N, S, Т
32	Y	D, N, R, S, Y
49	Y	Е, Н, К, Y
50	D	D, G, S, W, Y
53	N	D, N, S, Т, Y
91	R	A, D, Е, G, Η, N, R, S, W, Y
92	S	A, D, Е, G, Η, N, R, S, W, Y
93	N	A, D, Е, G, Η, N, R, S, W, Y
94	W	A, D, Е, G, Η, N, R, S, W, Y
96	L	F, I, L, N, R, W, Y

Были сконструированы библиотеки и создан фаг. Затем фаговые библиотеки VH и VL применяли для пэннинга фагов против биотинилированных рекомбинантных белков huPD1-ECD и cynoPD1-ECD. После пэннинга фагов растворимые Fab отбирали на связывание с PD-1 как человека, так и яванского макака. Отобранные Fab клонировали в виде изотипа IgG2сигма и характеризовали по их связыванию с клетками Jurkat и ингибированию лиганда PD-L1 яванского макака в концентрациях 1 мкг/мл и 10

- 116 045238 мкг/мл.

В табл. 9 показаны результаты характеризации исходных антител и антител с созреванием аффинности.

Таблица 9

mAb	Ингибирование лиганда в указанной концентрации*	Связывание с клетками Jurkat; ЕС50 (мкг/мл)
1 мкг/мл	10 мкг/мл
PD1B11	5%	5%	0, 05
PD1B114	8%	13%	0,47
PD1B149	7%	7%	0, 08
PD1B160	4%	3%	0, 08
PD1B162	7%	6%	0, 05
PD1B164	6%	3%	0, 06
PD1B183	5%	5%	0, 08
PD1B184	4%	4%	0, 08
PD1B185	8%	5%	0, 09
PD1B187	7%	5%	0, 09
PD1B192	5%	5%	0, 06
PD1B70	6%	6%	0, 69
PD1B175	6%	5%	0, 09
PD1B71	6%	9%	0, 13
PD1B177	7%	8%	0, 05

Значение указывает процент незаблокированного лиганда

Антитела с созревшей аффинностью оценивали в экспериментах по аффинности, как описано выше, с помощью анализа ProteOn SPR на связывание с huPD1-ECD и cynoPD1-ECD. Характеристики связывания mAb с PD-1 яванского макака показаны в табл. 10, а с PD-1 человека - в табл. 11. Стандартное отклонение (СТ. ОТКЛ.) вычисляли в 3 или более повторностях, полученных для белков человека и яванского макака. Если вычисляли менее 3 повторностей, то указывали интервал (RANGE). Интервал определяют как низкое и высокое значения для исследованных повторностей. Для проб в табл. 10 или табл. 11 без указания значения RANGE или СТ. ОТКЛ. выполняли только один эксперимент. Наилучшие варианты с созревшей аффинностью имели аффинность к PD-1 человека и яванского макака в интервале однозначных нМ с приростом аффинности ~ 4-20 раз по сравнению с их исходными mAb.

Таблица 10

Проба	Антиген: PD-1 яванского макака
коп	СТ . ОТКЛ., коп	kof f	СТ. ОТКЛ. kof f	KD	СТ. ОТКЛ. KD
(1/Мс)	или RANGE	(1/с)	или RANGE	(нМ)	или RANGE
PD1B70	2,10 Е+05	(1,99- 2,25) Е+05	2,58 Е02	(2,45- 2,75) Е-02	123	109-138
PD1B175	2,14 Е+05	(1,982,30) Е+05	6,40 Е03	(6,06- 6,73) Е-03	30	26-34
PD1B71	3, 04 Е+05	2,35 Е+04	2,03 Е- 02	7,27 Е-04	66, 8	5, 68
PD1B177	2,92 Е+05	(2,80- 3, 04) Е+05	1,89 Е- 03	(1,84- 1,93) Е-03	6, 47	6, 1-6, 9
PD1B114	2,94 Е+05	1,69 Е+04	2,39 Е- 02	1,45 Е-03	81,5	6, 8

- 117 045238

PD1B149	3,20 Е+05	(3,04- 3,36) Е + 05	3,57 Е- 03	(3,48- 3,65) Е-03	11,2	(10,9- 11,4)
PD1B160	3,17 Е+05	(3,16- 3,17) Е + 05	1,66 Е- 03	(1,63- 1,68) Е-03	5,23	5,1-5,3
PD1B162	3,87 Е+05	(3,84- 3, 89) Е + 05	9,79 Е- 04	(9,59- 9,98) Е-04	2,53	2,5-2,6
PD1B164	2,67 Е+05	(2,67- 2, 67) Е + 05	2,87 Е04	(2,82- 2,91) Е-04	1, 07	1,06-1,09
PD1B11	2,93 Е+05	(2,85- 3, 01) Е + 05	9,17 Е03	(0,8-1,00) Е-02	31,3	(27,7- 35,1)
PD1B183	3,20 Е+05	(3,04- 3,37) Е + 05	8,39 Е03	(8,01- 8,76) Е-03	26, 3	23,9-28,8
PD1B184	2,38 Е+05	(2,08- 2, 68) Е + 05	2,74 Е- 03	(2,55- 2,92) Е-03	11,5	9,5-14,1
PD1B185	3, 11 Е+05	(2,80- 3,43) Е + 05	9,47 Е03	(9,38- 9,55) Е-03	30,5	27,5-34,1
PD1B187	2,94 Е+05	(2,20- 3,70) Е + 05	1,57 Е- 03	(1,28- 1,85) Е-03	5, 32	3,5-8,4
PD1B192	3, 07 Е+05	(2,90- 3,24) Е + 05	5,04 Е03	(4,86- 5,22) Е-03	16, 4	15,0-18,0

Таблица 11

	Антиген: человеческий PD-1
Проба	коп	kof f	KD
(1/Мс)	(1/с)	(нМ)
PD1B70 PD1B175 PD1B71 PD1B177 PD1B114 PD1B149 PD1B160 PD1B162 PD1B164 PD1B11 PD1B183 PD1B184	4,15Е+05 4,22Е+05 5,48Е+05 5,15Е+05 5,17Е+05 5,32Е+05 5,40Е+05 6,49Е+05 4,48Е+05 5,16Е+05 5,27Е+05 4,45Е+05	4,18Е-02 9,72Е-03 2,73Е-02 2,57Е-03 2,79Е-02 6,20Е-03 3,71Е-03 3,86Е-03 1,31Е-03 8,52Е-03 8,44Е-03 5,09Е-03	101 23 49, 9 5 54,1 ~ 12* 6, 87 5, 95 2,92 ~ 17* 16 11,4
PD1B185	5,85Е+05	7,65Е-03	13, 1
PD1B187	5,35Е+05	2,78Е-03	5,2
PD1B192	5,41Е+05	1,17Е-02	~ 228
* Значения не отвечали критериям приемлемости данных (хиквадрат >20%) и поэтому считались приблизительными.

- 118 045238

Пример 4. Комбинаторный вариант продукции mAb PD-1.

После анализа результатов аффинности были рассмотрены комбинаторные последовательности.

PD1B11 и PD1B114 имели близко аналогичные последовательности. Поскольку PD1B11 имело приблизительно в 3 раза более высокую аффинность к человеческому PD-1 и в 2 раза более высокую аффинность к PD-1 яванского макака по сравнению с PD1B114, были получены антитела, имеющие комбинации их различных CDR. HCDR3 из PD1B11 помещали в PD1B164 и PD1B162 (варианты PD1B114 с созревшей аффинностью) с помощью направленного точечного мутагенеза, тогда как HCDR2 из PD1B164 (вариант PD1B114 с созревшей аффинностью) помещали в PD1B187 (вариант PD1B11 с созревшей аффинностью). Полученные тяжелые цепи объединяли в пары с исходными легкими цепями, получив в результате новые антитела PD1B194, PD1B195 и PD1B196 соответственно.

Оба из PD1B175 и PD1B177 содержали исходные легкие цепи, несмотря на то что антитела были получены с помощью диверсифицированных библиотек VL во время созревания аффинности.

В попытке повысить аффинности антител тяжелую цепь PD1B175 объединяли в пары с легкими цепями PD1L185 или PD1L187 с созревшей аффинностью, а тяжелую цепь PD1B177 объединяли в пары с легкими цепями PD1L86, PD1L168 или PD1L190 с созревшей аффинностью, получив в результате антитела PD1B197, PD1B198, PD1B199, PD1B200 и PD1B201. Объединение VH и VL антител в пары показано в табл. 20 в примере 5.

Последовательности HCDR, LCDR, VH и VL этих антител показаны в таблицах 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21 и 22 в примере 5. Антитела клонировали как mAb IgG2cHTMa/K и временно экспрессировали в клетках НЕК293 expi для измерений аффинности.

Аффинности полученных антител определяли так, как описано выше. В табл. 12 показаны измеренные аффинности комбинаторных вариантов mAb к PD-1 яванского макака, а в табл. 13 показаны аффинности к PD-1 человека. Стандартное отклонение (СТ. ОТКЛ.) вычисляли в 3 или более повторностях, полученных для белков человека и яванского макака. Если вычисляли менее 3 повторностей, то указывали интервал (RANGE). Интервал определяют как низкое и высокое значения для исследованных повторностей. Для проб без указания RANGE или СТ. ОТКЛ. выполняли только один эксперимент.

Таблица 12

Проба	Связывание PD-1 яванского макака
коп	СТ. ОТКЛ., коп	kof f	СТ. ОТКЛ., kof f	KD	СТ. ОТКЛ. KD
(1/Мс)	или RANGE	d/с)	или RANGE	(нМ)	ИЛИ RANGE
PD1B70 (исходный)	2,50Е+05	(2,25- 2,74) Е+05	2,22 Е-02	(2,18- 2,26) Е-02	88,98	(79,6- 100)
PD1B197	2,75Е+05	1,27 Е + 04	1,26 Е-03	4,04 Е-05	4,6	0,3
PD1B198	3,72Е+05	1,61 Е+04	4,16 Е-03	9,29 Е-05	11,18	0,54
PD1B11 (исходный)	3,50Е+05	(3,49- 3,50) Е+05	9,42 Е-03	(9,38- 9,46) Е-03	26, 95	(26,8- 27,1)
PD1B194	3,22Е+05	2,86 Е+04	1,93 Е-04	5,86Е-06	0,6	0, 06
PD1B195	4,32Е+05	(4,30- 4,34) Е+05	4,08 Е-04	(3,96- 4,19) Е-04	0, 94	(0,91- 0, 97)
PD1B196	3,03Е+05	6,66 Е + 03	1,76 Е-04	9,85 Е-06	0,58	0, 03
PD1B71 (исходный)	3,77Е+05	(3,37- 4,17) Е+05	1,96 Е-02	(1,85- 2,07) Е-02	51,99	(44,4- 61,4)
PD1B199	3,40Е+05	7,94 Е+03	1,77 Е-04	1,55 Е-05	0,52	0, 05
PD1B200	3,80Е+05	2,21 Е+04	4,22 Е-04	1,99 Е-05	1, 11	0, 08
PD1B201	3,05Е+05	1,80 Е+04	2,93 Е-04	2,35 Е-05	0, 96	0,1

- 119045238

Таблица 13

Проба	Связывание с PD-1 человека
коп	ст. откл., коп	kof f	СТ. ОТКЛ., kof f	KD	СТ. ОТКЛ. KD
	(1/Мс)	или RANGE	(1/с)	или RANGE	(нМ)	или RANGE
PD1B70 (исходный )	7, 69 Е+05	(7,37-8,00) Е+05	3,49 Е02	(3,41-3,56) Е-02	45,35	(42,6- 43,8)
PD1B197	6, 58 Е+05	2,26 Е+04	3,24 Е03	1,74 Е-04	4,9	0,3
PD1B198	8, 95 Е+05	6,44 Е+04	9,34 Е- 03	9,90 Е-04	10, 43	1,34
PD1B11 (исходный )	9, 33 Е+05	(8,84-9,82) Е+05	9,05 Е03	(8,67-9,43) Е-03	9, 7	(9,6-9,81)
PD1B194	8, 97 Е+05	1,45 Е+05	9,60 Е- 04	2,78 Е-05	1, 07	0,18
PD1B195	1,23 Е+06	1,79 Е+05	1,52 Е03	6,51 Е-05	1,23	0,19
PD1B196	8, 83 Е+0 5	6,39Е+04	3,66 Е04	2,01Е-05	0, 41	0,04
PD1B71 (исходный )	9, 55 Е+0 5	(9,33-9,76) Е+05	2,25 Е02	(2,19-2,30) Е-02	23,52	(22,4- 24,7)
PD1B199	9, 33 Е+0 5	6,92 Е+04	5,64 Е04	1,98 Е-05	0, 6	0,05
PD1B200	1, 05 Е+06	1,40 Е+05	1,22 Е03	3,21 Е-05	1, 17	0,16
PD1B201	8,58 Е+0 5	8,22 Е+04	9,57 Е- 04	3,06 Е-05	1, 12	0,11

Пример 5. Структурные характеристики антител к PD-1, полученных из библиотек фаговых дисплеев.

Последовательности кДНК и трансляции аминокислот антител получали с помощью стандартных методик в процессе создания антител с применением различных кампаний. После определения последовательности полипептидов некоторые кДНК антител, кодирующие вариабельные области или полноразмерные антитела, были оптимизированы по кодонам с помощью стандартных способов экспрессии в увеличенном количестве.

В табл. 14 показаны последовательности HCDR1 выбранных антител PD-1.

В табл. 15 показаны последовательности HCDR2 выбранных антител PD-1.

В табл. 16 показаны последовательности HCDR3 выбранных антител PD-1.

В табл. 17 показаны последовательности LCDR1 выбранных антител PD-1.

В табл. 18 показаны последовательности LCDR2 выбранных антител PD-1.

В табл. 19 показаны последовательности LCDR3 выбранных антител PD-1.

В табл. 20 показано объединение в пары VH и VL выбранных антител PD-1.

В табл. 21 показаны последовательности VH выбранных антител PD-1.

В табл. 22 показаны последовательности VL выбранных антител PD-1.

- 120 045238

Таблица 14

Антитело	HCDR1
Последовательность	SEQ ID NO:
PD1B114	S	Y	А	I	S	10
PD1B149	S	Y	А	I	S	10
PD1B160	S	Y	А	I	S	10
PD1B162	S	Y	А	I	S	10
PD1B164	S	Y	А	I	S	10
PD1B11	S	Y	А	I	S	10
PD1B183	S	Y	А	I	S	10
PD1B184	S	Y	А	I	S	10
PD1B185	S	Y	А	I	S	10
PD1B187	S	Y	А	I	S	10
PD1B192	S	Y	А	I	S	10
PD1B71	S	Y	А	I	S	10
PD1B177	D	Y	V	I	S	11
PD1B70	S	Y	А	I	S	10
PD1B175	S	Y	V	I	н	12
PD1B194	S	Y	А	I	S	10
PD1B195	S	Y	А	I	S	10
PD1B196	S	Y	А	I	S	10
PD1B197	S	Y	V	I	н	12
PD1B198	S	Y	V	I	н	12
PD1B199	D	Y	V	I	S	11
PD1B200	D	Y	V	I	S	11
PD1B201	D	Y	V	I	S	11

Таблица 15

Антитело

HCDR2

Последовательность

SEQ ID NO:

PD1B114

G

I

Р

I

F

G

Т

А

N

Y

А

Q

К

F

Q

G

13

PD1B149

G

I

Р

I

F

G

Т

А

N

Y

А

Q

К

F

Q

G

13

PD1B160

G

I

Р

I

F

D

Т

А

N

Y

А

Q

к

F

Q

G

14

PD1B162

G

I

P

I

F

D

T

A

N

Y

A

Q

К

F

Q

G

14

PD1B164

G

I

P

I

F

D

T

A

N

Y

A

Q

К

F

Q

G

14

PD1B11

G

I

P

I

F

G

T

A

N

Y

A

Q

К

F

Q

G

13

PD1B183

G

I

P

I

F

G

T

A

N

Y

A

Q

К

F

Q

G

13

PD1B184

G

I

P

I

F

G

T

A

N

Y

A

Q

К

F

Q

G

13

PD1B185

G

I

P

I

F

G

T

A

N

Y

A

Q

К

F

Q

G

13

PD1B187

G

I

P

I

F

G

T

A

N

Y

A

Q

К

F

Q

G

13

PD1B192

G

I

P

I

F

G

T

A

N

Y

A

Q

К

F

Q

G

13

PD1B71

G

I

P

I

F

G

T

A

N

Y

A

Q

К

F

Q

G

13

PD1B177

G

I

P

I

Y

G

T

A

N

Y

A

Q

К

F

Q

G

15

PD1B70

G

I

P

I

F

G

T

A

N

Y

A

Q

К

F

Q

G

13

PD1B175

G

I

P

I

F

G

T

A

N

Y

A

Q

К

F

Q

G

13

PD1B194

G

I

P

I

F

D

T

A

N

Y

A

Q

К

F

Q

G

14

PD1B195

G

I

P

I

F

D

T

A

N

Y

A

Q

К

F

Q

G

14

PD1B196

G

I

P

I

F

D

T

A

N

Y

A

Q

к

F

Q

G

14

PD1B197

G

I

P

I

F

G

T

A

N

Y

A

Q

к

F

Q

G

13

PD1B198

G

I

P

I

F

G

T

A

N

Y

A

Q

к

F

Q

G

13

PD1B199

G

I

P

I

Y

G

T

A

N

Y

A

Q

к

F

Q

G

15

PD1B200

G

I

P

I

Y

G

T

A

N

Y

A

Q

к

F

Q

G

15

PD1B201

G

I

P

I

Y

G

T

A

N

Y

A

Q

к

F

Q

G

15

- 121 045238

Таблица 16

Антитело

HCDR3

Последовательность

SEQ ID NO:

PD1B114

Р

G

L

А

Y

D

Т

G

N

L

D

Y

16

PD1B149

Р

G

L

А

Y

D

Т

G

N

L

D

Y

16

PD1B160

Р

G

L

А

Y

D

Т

G

N

L

D

Y

16

PD1B162

Р

G

L

А

Y

D

Т

G

N

L

D

Y

16

PD1B164

Р

G

L

А

Y

D

Т

G

N

L

D

Y

16

PD1B11

Р

G

L

А

Y

D

Т

G

S

L

D

Y

17

PD1B183

Р

G

L

А

Y

D

Т

G

S

L

D

Y

17

PD1B184

Р

G

L

А

Y

D

Т

G

S

L

D

Y

17

PD1B185

Р

G

L

А

Y

D

Т

G

S

L

D

Y

17

PD1B187

Р

G

L

А

Y

D

Т

G

S

L

D

Y

17

PD1B192

Р

G

L

А

Y

D

Т

G

S

L

D

Y

17

PD1B71

G

Т

L

D

R

Т

G

Н

L

D

Y

18

PD1B177

G

Т

L

D

R

Т

G

Н

L

D

Y

18

PD1B70

G

Y

V

R

А

Т

G

М

L

D

Y

19

PD1B175

G

Y

V

R

А

Т

G

М

L

D

Y

19

PD1B194

Р

G

L

А

Y

D

Т

G

S

L

D

Y

17

PD1B195

Р

G

L

А

Y

D

Т

G

S

L

D

Y

17

PD1B196

Р

G

L

А

Y

D

Т

G

S

L

D

Y

17

PD1B197

G

Y

V

R

А

Т

G

М

L

D

Y

19

PD1B198

G

Y

V

R

А

Т

G

М

L

D

Y

19

PD1B199

G

Т

L

D

R

Т

G

Н

L

D

Y

18

PD1B200

G

Т

L

D

R

Т

G

Н

L

D

Y

18

PD1B201

G

Т

L

D

R

Т

G

Н

L

D

Y

18

Таблица 17

Антитело

LCDR1

Последовательность

SEQ ID NO:

PD1B114

R

А

S

Q

S

V

S

Y

L

А

20

PD1B149

R

А

S

Q

S

V

R

N

Y

L

А

21

PD1B160

R

А

S

Q

S

V

D

S

Y

L

А

22

PD1B162

R

А

S

Q

S

V

D

S

Y

L

А

22

PD1B164

R

А

S

Q

S

V

R

S

Y

L

А

23

PD1B11

R

А

S

Q

S

V

S

Y

L

А

20

PD1B183

R

А

S

Q

S

V

S

Y

L

А

20

PD1B184

R

А

S

Q

S

V

R

N

Y

L

А

21

PD1B185

R

А

S

Q

S

V

R

N

Y

L

А

21

PD1B187

R

А

S

Q

S

V

R

S

Y

L

А

23

PD1B192

R

А

S

Q

S

V

D

S

Y

L

А

22

PD1B71

R

А

S

Q

S

V

S

Y

L

А

20

PD1B177

R

А

S

Q

S

V

S

Y

L

А

20

PD1B70

R

А

S

Q

S

V

S

Y

L

А

20

PD1B175

R

А

S

Q

S

V

S

Y

L

А

20

PD1B194

R

А

S

Q

S

V

R

S

Y

L

А

23

PD1B195

R

А

S

Q

S

V

D

S

Y

L

А

22

PD1B196

R

А

S

Q

S

V

R

S

Y

L

А

23

PD1B197

R

А

S

Q

S

V

S

N

Y

L

А

24

PD1B198

R

А

S

Q

S

V

S

Y

L

А

20

- 122 045238

PD1B199

R

A

S

Q

S

V

s

S

Y

L

A

20

PD1B200

R

A

S

Q

S

V

D

N

Y

L

A

25

PD1B201

R

A

S

Q

s

V

S

N

Y

L

A

24

Таблица 18

Антитело	LCDR2
Последовательность	SEQ ID NO:
PD1B114	D	A	S	N	R	A	T	26
PD1B149	D	A	S	N	R	A	T	26
PD1B160	D	A	S	D	R	A	T	27
PD1B162	D	A	S	N	R	A	T	26
PD1B164	D	A	S	Y	R	A	T	28
PD1B11	D	A	S	N	R	A	T	26
PD1B183	D	A	S	N	R	A	T	26
PD1B184	D	A	S	N	R	A	T	26
PD1B185	D	A	S	D	R	A	T	27
PD1B187	D	A	S	N	R	A	T	26
PD1B192	D	A	S	N	R	A	T	26
PD1B71	D	A	S	N	R	A	T	26
PD1B177	D	A	S	N	R	A	T	26
PD1B70	D	A	S	N	R	A	T	26
PD1B175	D	A	S	N	R	A	T	26
PD1B194	D	A	S	Y	R	A	T	28
PD1B195	D	A	S	N	R	A	T	26
PD1B196	D	A	S	N	R	A	T	26
PD1B197	D	A	S	N	R	A	T	26
PD1B198	D	A	S	S	R	A	T	29
PD1B199	D	A	S	T	R	A	T	30
PD1B200	D	A	S	N	R	A	T	26
PD1B201	D	A	S	N	R	A	T	26

- 123 045238

Таблица 19

Антитело	LCDR3
Последовательность	SEQ ID NO:
PD1B114	Q	Q	R	S	N	W	Р	L	Т	31
PD1B149	Q	Q	R	N	Y	W	Р	L	Т	32
PD1B160	Q	Q	R	G	N	W	Р	L	Т	33
PD1B162	Q	Q	R	Е	Y	W	Р	L	Т	34
PD1B164	Q	Q	R	D	Y	W	Р	L	Т	35
PD1B11	Q	Q	R	S	N	W	Р	L	Т	31
PD1B183	Q	Q	R	G	Y	W	Р	L	Т	36
PD1B184	Q	Q	R	N	Y	W	Р	L	Т	32
PD1B185	Q	Q	R	W	N	W	Р	L	Т	37
PD1B187	Q	Q	R	N	Y	W	Р	L	Т	32
PD1B192	Q	Q	R	N	Y	W	Р	L	Т	32
PD1B71	Q	Q	R	S	N	W	Р	L	Т	31
PD1B177	Q	Q	R	S	N	W	Р	L	Т	31
PD1B70	Q	Q	R	S	N	W	Р	L	Т	31
PD1B175	Q	Q	R	S	N	W	Р	L	Т	31
PD1B194	Q	Q	R	D	Y	W	Р	L	Т	35
PD1B195	Q	Q	R	Е	Y	W	Р	L	Т	34
PD1B196	Q	Q	R	N	Y	W	Р	L	Т	32
PD1B197	Q	Q	R	А	Y	W	Р	L	Т	38
PD1B198	Q	Q	R	А	Е	W	Р	L	Т	39
PD1B199	Q	Q	R	N	Y	W	Р	L	Т	32
PD1B200	Q	Q	R	S	А	W	Р	L	Т	40
PD1B201	Q	Q	R	N	Y	W	Р	L	Т	32

Таблица 20

Антитело	ИД пептида VH	VH с SEQ ID NO:	ИД пептида VL	VL с SEQ ID NO:

PD1B114	PD1H24	41	PH9L3	49
PD1B149	PD1H24	41	PD1L128	50
PD1B160	PD1H131	42	PD1L101	51
PD1B162	PD1H131	42	PD1L67	52
PD1B164	PD1H131	42	PD1L71	53

- 124 045238

PD1B11	PD1H3	43	PH9L3	49
PD1B183	PD1H3	43	PD1L109	54
PD1B184	PD1H3	43	PD1L128	50
PD1B185	PD1H3	43	PD1L132	55
PD1B187	PD1H3	43	PD1L148	56
PD1B192	PD1H3	43	PD1L133	57
PD1B71	PD1H108	44	PH9L3	49
PD1B177	PD1H164	45	PH9L3	49
PD1B70	PD1H107	46	PH9L3	49
PD1B175	PD1H163	47	PH9L3	49
PD1B194	PD1H170	48	PD1L71	53
PD1B195	PD1H170	48	PD1L67	52
PD1B196	PD1H170	48	PD1L148	56
PD1B197	PD1H163	47	PD1L185	58
PD1B198	PD1H163	47	PD1L187	59
PD1B199	PD1H164	45	PD1L86	60
PD1B200	PD1H164	45	PD1L168	61
PD1B201	PD1H164	45	PD1L190	62

Таблица 21

ИД пептида VH	VH с SEQ ID NO:	Последовательность VH
PD1H24	41	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQG LEWMGG11PIFGTANYAQKFQGRVTITADE STS TAYME L S S LRS EDTAVYYCARPGLAAAYDTGNLDYWGQGTLVTVSS
PD1H131	42	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQG LEWMGG11PIFDTANYAQKFQGRVTITADE STS TAYME L S S LRS EDTAVYYCARPGLAAAYDTGNLDYWGQGTLVTVSS
PD1H3	43	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQG LEWMGG11PIFGTANYAQKFQGRVTITADE STS TAYME L S S LRS EDTAVYYCARPGLAAAYDTGSLDYWGQGTLVTVSS
PD1H108	44	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQG LEWMGG11PIFGTANYAQKFQGRVTITADE STS TAYME L S S LRS EDTAVYYCARGTLDRTGHLDYWGQGTLVTVSS
PD1H164 PD1H107 PD1H163	45 46 47	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDYVISWVRQAPGQG LEWMGG11PIYGTANYAQKFQGRVTITADE STS TAYME L S S LRS EDTAVYYCARGTLDRTGHLDYWGQGTLVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQG LEWMGG11PIFGTANYAQKFQGRVTITADE STS TAYME L S S LRS EDTAVYYCARGYVRATGMLDYWGQGTLVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFKSYVIHWVRQAPGQG LEWMGG11PIFGTANYAQKFQGRVTITADE STS TAYME L S S LRS EDTAVYYCARGYVRATGMLDYWGQGTLVTVSS
PD1H170	48	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQG LEWMGG11PIFDTANYAQKFQGRVTITADE STS TAYME L S S LRS EDTAVYYCARPGLAAAYDTGSLDYWGQGTLVTVSS

- 125 045238

Таблица 22

ид	VL c
пептида	SEQ ID	Последовательность VL
VL	NO:
		EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAP
PH9L3	49	RLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC
		QQRSNWPLTFGQGTKVEIK
		EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRNYLAWYQQKPGQAP
PD1L128	50	RLLIHDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC
		QQRNYWPLTFGQGTKVEIK
		EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDSYLAWYQQKPGQAP
PD1L101	51	RLLIKDASDRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC
		QQRGNWPLTFGQGTKVEIK
		EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDSYLAWYQQKPGQAP
PD1L67	52	RLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC
		QQREYWPLTFGQGTKVEIK
		EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAP
PD1L71	53	RLLIYDASYRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC
		QQRDYWPLTFGQGTKVEIK
		EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAP
PD1L109	54	RLLIKDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC
		QQRGYWPLTFGQGTKVEIK
		EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRNYLAWYQQKPGQAP
PD1L132	55
		RLLIYDASDRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC
		QQRWNWPLTFGQGTKVEIK
		EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAP
PD1L148	56	RLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC
		QQRNYWPLTFGQGTKVEIK
		EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDSYLAWYQQKPGQAP
PD1L133	57	RLLIHDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC
		QQRNYWPLTFGQGTKVEIK
		EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSNYLAWYQQKPGQAP
PD1L185	58	RLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC
		QQRAYWPLTFGQGTKVEIK
		EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAP
PD1L187	59	RLLIEDASSRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC
		QQRAEWPLTFGQGTKVEIK
		EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAP
PD1L86	60	RLLIHDASTRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC
		QQRNYWPLTFGQGTKVEIK
		EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDNYLAWYQQKPGQAP
PD1L168	61	RLLIHDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC
		QQRSAWPLTFGQGTKVEIK
		EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSNYLAWYQQKPGQAP
PD1L190	62	RLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC
		QQRNYWPLTFGQGTKVEIK

Было выявлено, что все антитела к PD-1 имеют каркасы VH1-69 (SEQ ID NO: 170) и IGKV3-11 (L6) (SEQ ID NO: 171).

- 126 045238

SEQ ID NO: 170

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMG

G11PIFG T AN YAQK FQGRVTITADE STS TAYME LSSLRSED TAVYYCAR

SEQ ID NO: 171

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIP

ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWP

Пример 6. Создание и характеризация антител PD-1 у мышей.

Мышей BALB/c иммунизировали внутрибрюшинно, вводя huPDl-ECD и оценивая титры специфического IgG. После получения достаточных титров выделяли спленоциты и сливали их с клетками FO.

Полученные гибридомы высевали на 96-луночные планшеты и культивировали в течение 10 дней. Клоны, специфичные к антигену, выявляли стандартным ИФА с захватом на связывание с huPDl-ECD. Дополнительно гибридомы, специфичные к человеческому PD-1, исследовали на их аффинность к PD-1 человека и яванского макака, связывание с клетками Jurkat и ингибирование PD-L1 яванского макака. На основании результатов был выбран клон PD1B28 для гуманизации с применением адаптации каркаса.

Процесс адаптации каркаса был выполнен так, как по существу описано в патентной публикации США № 2009/0118127 и Fransson et al., (2010) J Mol Biol 398:214-231. Вкратце, последовательности тяжелой и легкой цепей сравнивали с человеческими последовательностями зародышевой линии (только аллели 01 по данным на 01 октября 2007 г.) с применением поиска BLAST по базе данных IMGT (Kaas, et al., (2004) Nucl Acids Res 32, D208-D210; Lefranc et al., (2005) Nucl Acid Res 33, D593-D597). Из данного набора человеческих генов зародышевой линии удаляли избыточные гены (100% идентичные на уровне аминокислот) и гены с непарными цистеиновыми остатками. Оставшиеся максимально соответствующие как по каркасным, так и по CDR-областям человеческие гены зародышевой линии выбирали в качестве акцепторных человеческих каркасов. На основе гомологии последовательностей и длины CDR, а также сходства CDR отбирали несколько человеческих каркасных последовательностей VL и VH зародышевой линии. FR-4 выбирали на основании сходства последовательностей в генах зародышевых линий IGHJ/IGJK. Затем CDR PD1B28 переносили в выбранные акцепторные человеческие каркасы с получением HFA-вариантов, за исключением области, соответствующей HCDR1 в VH. Для этой области комбинацию CDR и HV или более короткую HCDR2 (называемую Kabat-7, см. патентную публикацию США № 2009/0118127) переносили из нечеловеческого антитела в FR человека, поскольку остальные остатки в HCDR2 не были обнаружены в контакте в комплексах антиген-антитело с известной структурой (Almagro, (2004) J Mol Recognit 17:132). В определенных положениях остатков гуманизированных антител были встроены обратные мутации. Обратные мутации PD1B131: VH: V37I_Q39L_W47S_R98S, VL: Y49K. PD1B132: VH W47S R98S, VL: Y49K (нумерация остатков по Chothia).

Выбранные антитела экспрессировали как IgG2cnrMa/K. Полученные антитела характеризовали по их связыванию с рекомбинантным PD-1 и экспрессированным PD-1 на клетках (клетки Jurkat), а также по ингибированию их лигандов (PD-L1 яванского макака и PD-L1 человека). Характеристики выбранных гуманизированных антител показаны в табл. 23. Последовательности VH и VL созданных антител показаны в табл. 24 и табл. 25 соответственно.

Таблица 23

mAb	Связывание с клетками Jurkat относительно PD1B28	Аффинность PD-1 человека	Ингибирование PDLl, IC50 (нг/мл)
коп (1/Мс)	kof f (1/с)	KD (пМ)	PD-L1 человека	PD-L1 яванского макака
PD1B28	100%	9, 70 Е+05	1,18 Е-04	122	67	96
PD1B131	100%	8,27 Е+05	1,05 Е-04	127	79	96
PD1B132	100%	9, 14 Е+05	8,80 Е-05	96	55	79

- 127045238

Таблица 24

mAb	ИД VH	ИД VL	Последовательность VH	VH c SEQ ID NO:
PD1B131	PD1H130	PD1L62	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFAFSRYDMSWIRLAPGKGLESVAY ISGGGANTYYLDNVKGRFTISRDNA KNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASPY LSYFDVWGQGTLVTVSS	63
PD1B132	PD1H129	PD1L62	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFAFSRYDMSWVRQAPGKGLESVAY ISGGGANTYYLDNVKGRFTISRDNA KNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASPY LSYFDVWGQGTLVTVSS	64

Таблица 25

mAb	ИД VH	ИД VL	Последовательность VL	VL c SEQ ID NO:
PD1B131	PD1H130	PD1L62	EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRAS QSLSDYLHWYQQKPGQAPRLLIKSAS QSISGIPARFSGSGSGTEFTLTISSL QSEDFAVYYCQNGHSFPYTFGQGTKL EIK	65
PD1B132	PD1H129	PD1L62	EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRAS QSLSDYLHWYQQKPGQAPRLLIKSAS QSISGIPARFSGSGSGTEFTLTISSL QSEDFAVYYCQNGHSFPYTFGQGTKL EIK	65

Последовательности CDR из PD1B131 и PD1B132 показаны ниже:

HCDRl (SEQ ID NO: 66)

RYDMS

HCDR2 (SEQ ID NO: 67)

YIS GGGANTYYLDNVKG

HCDR3 (SEQ ID NO: 68)

PYLSYFDV

LCDR1 (SEQ ID NO: 69)

RASQSLSDYLH

LCDR2 (SEQ ID NO: 70)

SASQSIS

LCDR3 (SEQ ID NO: 71)

QNGHSFPYT

Пример 7. Влияние переключения изотипа на свойства антител к PD-1.

Вариабельные области антител PD1B196 и PD1B199 (изотипа IgG2cnrMa/K) клонировали как изотипы IgG4 S228P, а вариабельные области антител PD1B132 (изотипа IgG2) - как изотип IgG2cnrMa, чтобы оценить возможные различия по функциональности и перспективы разработки.

Антитела были названы PD1B244 (PD1B196 VH/VL на IgG4 S228P) PD1B245 (PD1B199 VH/VL на IgG4 S228P) и PD1B243 (PD1B132 VH/VL на IgG2cnr_Ma).

Переключение изотипа не оказывало существенного влияния на свойства антител, однако у некоторых антител наблюдались изменения значений ЕС50 в анализе ЦМВ.

Ниже приведены примеры аминокислотных последовательностей тяжелых цепей и легких цепей различных антител. В табл. 26 представлены сводные данные о последовательностях SEQ ID NO: для VH, VL, тяжелой цепи и легкой цепи выбранных антител.

- 128045238

Таблица 26

Антитело	ид пептида VH	VH c SEQ ID NO:	ИД пептида VL	VL c SEQ ID NO:	HC SEQ ID NO	LC SEQ ID NO:
PD1B114	PD1H24	41	PH9L3	49	212	213
PD1B149	PD1H24	41	PD1L128	50	214	215
PD1B160	PD1H131	42	PD1L101	51	216	217
PD1B162	PD1H131	42	PD1L67	52	218	219
PD1B164	PD1H131	42	PD1L71	53	220	221
PD1B183	PD1H3	43	PD1L109	54	222	223
PD1B184	PD1H3	43	PD1L128	50	224	225
PD1B185	PD1H3	43	PD1L132	55	226	227
PD1B192	PD1H3	43	PD1L133	57	228	229
PD1B243	PD1H129	64	PD1L62	65	74	75
PD1B244	PD1H170	48	PD1L148	56	72	73
PD1B245	PD1H164	45	PD1L86	60	76	77

SEQ ID NO: 72 НС PD1B244

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFDTAN YAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPGLAAAYDTGSLDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSLGK

SEQ ID NO: 73 LG PD1B244

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIP

- 129045238

ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRNYWPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 74 HC PD1B243

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSRYDMSWVRQAPGKGLESVAYISGGGANTY YLDNVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASPYLSYFDVWGQGTLVTVSSASTKGP SVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWT VPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG К

SEQ ID NO: 75 LG PD1B243

EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSLSDYLHWYQQKPGQAPRLLIKSASQSISGIP ARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQNGHSFPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 76 HC PD1B245

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDYVISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIYGTAN YAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGTLDRTGHLDYWGQGTLVTVSSAST KGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS WTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SLGK

SEQ ID NO: 77 LC PD1B245

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIHDASTRATGIP ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRNYWPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 212 HC PD1B114

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTAN YAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPGLAAAYDTGNLDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSWTVTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKD

- 130 045238

TLMISRTPEVTCWVDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPGK

SEQ ID NO: 213 LG PD1B114

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIP ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 214 HC PD1B149

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTAN YAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPGLAAAYDTGNLDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSWTVTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVWDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPGK

SEQ ID NO: 215 LG PD1B149

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRNYLAWYQQKPGQAPRLLIHDASNRATGIP ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRNYWPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 216 HC PD1B160

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFDTAN YAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPGLAAAYDTGNLDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSWTVTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCWVDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPGK

SEQ ID NO: 217 LC PD1B160

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDSYLAWYQQKPGQAPRLLIKDASDRATGIP ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRGNWPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE

- 131 045238

KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 218 HC PD1B162

SEQ ID NO: 219 LG PD1B162

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIP ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQREYWPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 220 HC PD1B164

SEQ ID NO: 221 LC PD1B164

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASYRATGIP ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRDYWPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 222 HC PD1B183

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTAN YAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPGLAAAYDTGSLDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSWTVTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCWVDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI

- 132 045238

AVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPGK

SEQ ID NO: 223 LC PD1B183

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIKDASNRATGIP ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRGYWPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKVYACEVTHQGLS S PVTKS FNRGEC

SEQ ID NO: 224 HO PD1B184

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTAN YAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPGLAAAYDTGSLDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSWTVTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVWDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPGK

SEQ ID NO: 225 LC PD1B184

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRNYLAWYQQKPGQAPRLLIHDASNRATGIP ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRNYWPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKVYACEVTHQGLS S PVTKS FNRGEC

SEQ ID NO: 226 HC PD1B185

SEQ ID NO: 227 LC PD1B185

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRNYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASDRATGIP ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRWNWPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKVYACEVTHQGLS S PVTKS FNRGEC

SEQ ID NO: 228 HC PD1B192

- 133 045238

SEQ ID NO: 229 LC PD1B192

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDSYLAWYQQKPGQAPRLLIHDASNRATGIP ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRNYWPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Пример 8. Характеризация антител PD-1 в клеточных анализах.

Выбранные антитела характеризовали в анализах MLR и ЦМВ по протоколам, описанным в примере 1. Значения EC50 для индукции ИФН-γ по анализам MLR и ЦМВ показаны в табл. 27. В большинстве случаев антитела к PD-1 показывали дозозависимое повышение уровней ИФН-γ как в анализе MLR, так и в анализе ЦМВ.

Таблица 27

Происхождение	mAb	MLR ЕС50	(нМ)	ЦМВ (нМ)	ЕС50
	PD1B3	0,29		0, 06
	PD1B91	0, 05		0, 03
	PD1B194	Н/и		Н/с
	PD1B195	Н/и		1, 64
Фаговый дисплей	PD1B196	0, 14		0,31
	PD1B199	0, 63		Н/с
	PD1B200	Н/и		3, 81
	PD1B201	Н/и		2, 60
	PD1B244	0, 08		0, 03
HFA	PD1B132	Н/и	0, 07
	PD1B243	0, 07	0, 02
	Н/и - не исследовали
	Н/с - нет сходимости

HFA - адаптация для человеческого каркаса

В дополнение к ИФН-γ блокада PD-1 также влияла на уровни секреции дополнительных цитокинов в двух анализах. После стимуляции ЦМВ антитела к PD-1 вызывали дозозависимую индукцию ФНО-α и IL-4, тогда как в анализе MLR они повышали уровни ФНО-α и ИЛ-2.

Пример 9. Создание антител к TIM-3 человека с помощью библиотек фаговых дисплеев.

Выполняли пэннинг de novo библиотек pIX Fab, описанных в примере 2, против внеклеточного домена рекомбинантного гибридного белка TIM-3-Fc человека (компания R&D Systems, № 2365-TM; остатки Ser22-Arg200 полноразмерного TIM-3) (huTIM-3-Fc).

Рекомбинантный белок биотинилировали (bt) и захватывали на магнитных гранулах стрептавидина (компания Dynal), а затем экспонировали с de novo библиотеками pIX Fab в конечной концентрации 100 нМ. Неспецифические фаги отмывали в PBS-Tween, а связанные фаги выделяли посредством инфицирования клеток MC1061F' E.coli. Фаги амплифицировали из этих клеток в течение ночи и повторяли в общей сложности три цикла пэннинга. После конечного цикла биопэннинга проводили скрининг моноклонального Fab на связывание с биотинилированным TIM-3-Fc человека, захваченным стрептавидином на планшетах твердофазного ИФА, и к захваченному антигену добавляли секретируемый Fab с последующим обнаружением Fab с помощью антитела козы к kappa:HRP человека. Выбранные антитела экспрессировали и клонировали на IgG с различными изотипами, как указано ниже, и дополнительно характери зовали.

Пример 10. Создание антител к TIM-3 у мышей.

Мышей Balb/c иммунизировали рекомбинантным гибридным белком TIM-3-Fc человека (компания R&D Systems, № 2365-TM по каталогу) в течение 18 дней. Собирали селезенки и сливали обогащенную B-клетками популяцию с клетками FO миеломы мыши для создания гибридом, секретирующих mAb. Проводили скрининг супернатантов гибридомы на связывание в твердофазном ИФА с белком TIM-3-Fc и посторонним IgG1 Fc человека. Затем анализировали специфичные к TIM-3 супернатанты на способность к связыванию с экспрессирующими TIM-3 клетками ТНР-1.

v-гены HC и LC выбранных mAb из положительных на TIM-3 гибридом клонировали с помощью стандартных методик молекулярной биологии (ОТ-ПЦР с последующим лигированием ПЦР-фрагмента в экспрессионные векторы плазмиды). Экспрессировали рекомбинантные mAb и повторяли ИФА для подтверждения специфического связывания TIM-3. Построение молекулярных моделей последовательностей антител мыши для адаптации к человеческому каркасу выполняли в MOE (CCG, г. Монреаль, Кана

- 134 045238 да), проверяли визуально. Выявляли потенциальные проблемные положения, которые могли повлиять на связывание антигена, упаковку VL/VH, и/или остатки в ядре, которые могли повлиять на стабильность доменов. Если выявлялись проблемные положения, то как для VL, так и для VH было предложено множество человеческих каркасов с обратными мутациями к последовательностям каркасов мыши или без них. Сконструированные последовательности клонировали в плазмиды тяжелых и легких цепей и экспрессировали в клетках Expi293F. Экспрессированное антитело в супернатантах культур определяли количественно и оценивали на связывание с клетками HEK293, трансфицированными рекомбинантным TIM-3 человека.

Пример 11. Изотипы антител к TIM-3.

В ходе характеризации антитела, чтобы оценить влияние, если оно имеется, переключения изотипа на функциональность или возможность разработки антител, VH и VL выделенных антител к TIM-3 клонировали на тяжелую цепь различных изотипов, необязательно с различными заменами в Fc, а также на аллотипы с легкими цепями к. Различные применяемые изотипы показаны в табл. 28.

Таблица 28

Изотип	Замена no сравнению c	Цель	замены
диким	типом*
IgG2сигма	V234A,	G237A,	Устранение	эффекторных
	P238S,	Н268А,	функций
	V309L,	A330S,
	P331S
	V2 34A,	G237A,	Устранение	эффекторных
	P238S,	Н268А,	функций,	улучшение
IgG2сигма K4 0 9R
	V309L,	A330S,	формирования	гетеродимера в
	P331S,	K409R	биспецифическом антителе
	V2 34A,	G237A,	Устранение	эффекторных
	P238S,	Н268А,	функций,	улучшение
1дС2сигма F405L
	V309L,	A330S,	формирования	гетеродимера в
	P331S,	F405L	биспецифическом антителе
			Стабильность	антитела,
	S228P,	F234A,
IgG4 PAA			устранение	эффекторных
	L2 35A
			функций
			Стабильность	антитела,
	S228P,	F234A,	устранение	эффекторных
IgG4
	L235A,	F450L,	функций,	улучшение
PAA F405L R409K
	R409K		формирования	гетеродимера в
			биспецифическом антителе
IgG4_S228P	S228P		Стабильность	антитела
IgGl	Дикий тип
	L234A,	L235A,
	G237A,	P238S,	Устранение	эффекторных
IgGlcnrMa
	H268A,	A330S,	функций
	P331S
	L234A,	L235A,	Устранение	эффекторных
	G237A,	P238S,	функций,	улучшение
IgGlcnrMa K409R
	H268A,	A330S,	формирования	гетеродимера в
	P331S,	K409R	биспецифическом антителе
	L234A,	L235A,	Устранение	эффекторных
	G237A,	P238S,	функций,	улучшение
IgGlcnrMa F405L
	H268A,	A330S,	формирования	гетеродимера в
	P331S,	F405L	биспецифическом антителе
			Устранение	эффекторных
IgGl AA	L234A,	L2 35A
			функций
	* Нумерация остатков соответствует каталогу
	EU

Различные аллотипы, применяемые в созданных антителах, показаны в табл. 29. Некоторые из ан- 135 045238 тител имели химерные аллотипы. Например, антитела ТМЗВ105 и TM3B403 различаются одной аминокислотной заменой в положении 189 в константной области. Последовательности SEQ ID NO: 240 и 79 соответственно тяжелой и легкой цепей ТМЗВ105; последовательности SEQ ID NO: 78 и 79 соответственно тяжелой и легкой цепей TM3B403. Ожидается, что два антитела имеют одинаковые характеристики.

Таблица 29

Изотип/аллотип/замены

IgG2cnrMa_G2m(n-)/(n)_K409R

IgG2 cnrMa_G2m(η-)_Κ4 0 9R

IgG2cnrMa_G2m(η-)/(η)

IgG2cnrMa_F4 05L

IgG2_K409R

IgG2 cnrMa_G2m(n-)

IgG2

IgG4_S228P

IgG4_S228P_F405L_R409K

IgG4_nG4m(a)_PAA_F405L_R409K

IgG4_PAA

IgGlcnrMa

IgGl_Glm(17)

IgGl_ Glm(17,1) _AA

В целом антитела к TIM-3 с Fc IgG2cnrMa в анализе ЦМВ имели более высокую активность, чем антитела к TIM-3 с Fc huIgG4. Кроме того, антитела с Fc huIgG2 демонстрировали функциональность, которая была промежуточной между IgG2cnrMa и IgG4. Аллотип не оказывал влияния на активность антитела.

Пример 12. Определение структурных характеристик антител к TIM-3.

Последовательности кДНК и трансляции аминокислот антител получали с помощью стандартных методик в процессе создания антител с применением различных кампаний. После определения последовательности полипептидов некоторые кДНК антител, кодирующие вариабельные области или полноразмерные антитела, были оптимизированы по кодонам с помощью стандартных способов экспрессии в увеличенном количестве. Антитела TM3B103, ТМЗВ105, МЗВ108, ТМЗВ109 и ТМЗВПЗ выделяли из библиотек фаговых дисплеев. Антитела ТМЗВ189, ТМЗВ190, TM3B193, ТМЗВ195 и ТМЗВ196 создавали посредством иммунизации мышей.

В табл. 30 показаны последовательности HCDR1 выбранных антител к TIM-3.

В табл. 31 показаны последовательности HCDR2 выбранных антител к TIM-3.

В табл. 32 показаны последовательности HCDR3 выбранных антител к TIM-3.

В табл. 33 показаны последовательности LCDR1 выбранных антител к TIM-3.

В табл. 34 показаны последовательности LCDR2 выбранных антител к TIM-3.

В табл. 35 показаны последовательности LCDR3 выбранных антител к TIM-3.

В табл. 36 показаны последовательности VH выбранных антител к TIM-3.

В табл. 37 показаны последовательности VL выбранных антител к TIM-3.

В табл. 38 показаны каркасы выбранных антител к TIM-3.

Таблица 30

Название mAb	HCDR1
	Последовательность	SEQ ID NO:
TM3B103	N	Y	W	М	S		90
ТМЗВ105	S	Y	А	М	S		91
ТМЗВ109	S	Y	А	М	S		91
ТМЗВ108	G	Y	W	М	Н		92
ТМЗВПЗ	D	Y	W	М	S		93
ТМЗВ189	S	Y	V	М	Y		94
ТМЗВ190	S	D	Y	А	W	N	95

- 136045238

TM3B193	D	Т	Y	L	Н	96
ТМЗВ195	S	Y	W	М	Q	97
ТМЗВ196	S	Y	G	V	н	98
ТМЗВ291	S	Y	W	М	Q	97

Таблица 31

mAb

HCDR2

Последовательность

SEQ ID NO:

TM3B103

А

I

S

G

S

G

S

Т

Y

А

D

S

V

К

G

99

ТМЗВ105

А

I

S

G

S

G

S

Т

Y

А

D

S

V

К

G

99

ТМЗВ109

А

I

S

G

S

G

S

Т

Y

А

D

Ξ

V

К

G

99

ТМЗВ108

А

I

S

Y

S

G

S

Т

Y

А

D

S

V

К

G

100

TM3B113

V

I

к

Y

S

G

S

К

Y

А

D

S

V

К

G

101

ТМЗВ189

Y

I

N

Р

Y

N

D

G

Т

к

Y

N

Е

К

F

К

G

102

ТМЗВ190

Y

I

N

Y

S

G

R

Т

S

Y

N

Р

S

L

К

S

103

TM3B193

R

I

D

Р

т

N

G

N

I

к

Y

D

Р

К

F

Q

G

104

ТМЗВ195

А

I

Y

Р

G

D

G

D

I

R

Y

Т

Q

N

F

К

G

105

ТМЗВ196

V

I

W

S

D

G

S

Т

т

Y

N

S

А

L

К

S

106

ТМЗВ291

А

I

Y

Р

G

D

G

D

I

R

Y

т

Q

N

F

к

G

105

Таблица 32

Таблица 33

mAb

LCDR1

Последовательность

SEQ ID NO:

TM3B103

R

А

S

Q

S

V

S

Y

L

А

117

ТМЗВ105

R

А

S

Q

S

V

N

D

Y

L

А

118

ТМЗВ109

К

S

Q

S

V

L

А

S

N

К

N

Y

L

А

119

ТМЗВ108

R

А

S

Q

S

V

S

Y

L

А

117

TM3B113

R

А

S

Q

S

V

S

N

S

т

L

А

120

ТМЗВ189

R

А

S

Е

S

L

D

S

Y

G

N

S

Y

I

Н

121

ТМЗВ190

Q

А

Т

Q

D

I

V

К

N

L

N

122

TM3B193

К

А

S

Q

D

V

N

т

А

V

А

123

ТМЗВ195

К

А

S

Е

N

V

G

т

F

V

S

124

ТМЗВ196

К

А

S

Q

S

V

D

Y

D

G

D

S

Y

М

N

125

ТМЗВ291

К

А

S

Е

N

V

G

т

F

V

S

124

- 137 045238

Таблица 34

mAb	LCDR2
Последовательность	SEQ ID NO:
TM3B103	G	А	S	S	R	А	т	126
ТМЗВ105	D	А	S	N	R	А	т	127
ТМЗВ109	W	А	S	Т	R	Е	S	128
ТМЗВ108	G	А	S	S	R	А	т	126
TM3B113	Т	А	S	S	R	А	т	129
ТМЗВ189	L	А	S	N	L	Е	S	130
ТМЗВ190	Y	V	Т	Е	L	А	Е	131
TM3B193	S	А	Т	Y	R	Y	Т	132
ТМЗВ195	G	А	S	N	R	Y	Т	133
ТМЗВ196	Т	А	А	N	L	Q	S	134
ТМЗВ291	G	А	S	N	R	Y	Т	133

Таблица 35

mAb	LCDR3
Последовательность	SEQ ID NO:
TM3B103	Q	Q	Y	G	S	S	Р	L	Т	135
ТМЗВ105	Q	Q	G	G	Н	А	Р	I	Т	136
ТМЗВ109	Q	Q	Y	Y	S	Т	Р	L	Т	137
ТМЗВ108	Q	Q	Y	G	S	S	Р	L	Т	135
TM3B113	Q	Q	S	Y	Т	S	Р	W	Т	139
ТМЗВ189	Q	Q	N	N	Е	D	Р	F	Т	140
ТМЗВ190	L	Q	F	Y	Е	F	Р	L	Т	141
TM3B193	Q	Q	Н	Y	S	Т	Р	Y	Т	142
ТМЗВ195	G	Q	S	Y	S	Y	Р	Т		143
ТМЗВ196	Q	Q	S	N	Е	D	Р	F	Т	144
ТМЗВ291	G	Q	S	Y	S	Y	Р	Т		143

- 138 045238

Таблица 36

Название mAb	Названи е VH	Последовательность VH	SEQ ID NO:
TM3B103	ТМЗН21	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMSW VRQAPGKGLEWVSAISGSGGS ТYYADSVKGRFTISR DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDHWDPNFLDY WGQGTLVTVSS	145
ТМЗВ105	ТМЗН24	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSW VRQAPGKGLEWVSAISGSGGS ТYYADSVKGRFTISR DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPYAPLDYWG QGTLVTVSS	146
ТМЗВ108	ТМЗНЗО	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYWMHW VRQAPGKGLEWVSAISYSGS S TYYADSVKGRFTISR DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGTNWLDYWGQ GTLVTVSS	147
ТМЗВ109	TM3H31	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSW VRQAPGKGLEWVSAISGSGGS TYYADSVKGRFTISR DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNEEPDDRLDY WGQGTLVTVSS	148
TM3B113	ТМЗН65	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMSW VRQAPGKGLEWVSVIKYSGGSKYYADSVKGRFTISR DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKELEGVFDYWG QGTLVTVSS	149
ТМЗВ189	ТМЗН141	EVQLQQSGPELLKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMYW VKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTS DKSSSTAYMELSRLTSEDSAVYYCTRDDYDVAPFAY WGQGTLVTVSA	150
ТМЗВ190	ТМЗН96	DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWN WIRQFPGNKLEWMGYINYSGRTSYNPSLKSRISITR DTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCTSGGNFDYWGQG TTLTVSS	151
TM3B193	ТМЗН99	EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFHIKDTYLHW VKQRPEQGLEWIGRIDPTNGNIKYDPKFQGKATITS DTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCARPYYGFFDYWG QGTTLTVSS	152
ТМЗВ195	ТМЗН144	EVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSYWMQW VKQRPGQGLEWIGAIYPGDGDIRYTQNFKGKATLTA DKS S S TAYMQLS S LASEDSAVYYCARWEKS T TVVQR NYFDYWGQGTTLTVSS ВЕРНО?	153
ТМЗВ196	ТМЗН102	QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTISGFSLTSYGVHW VRQPPGKGLEWLWIWSDGSTTYNSALKSRLSISKD NSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARQANYRYDSAMD YWGQGTSVTVSS	154
ТМЗВ291	ТМЗН162	EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWMQW VRQMPGKGLEWMGAIYPGDGDIRYTQNFKGQVTISA DKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARWEKSTTWQR NYFDYWGQGTTVTVSS	172

- 139045238

Таблица 37

Название mAb	Название VL	Последовательность VL	SEQ ID NO:
TM3B103	PH9L1	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAW YQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDF TLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGQGTKVEIK	155
ТМЗВ105	TM3L33	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVNDYLAWY QQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFT LTISSLEPEDFAVYYCQQGGHAPITFGQGTKVEIK	156
ТМЗВ108	PH9L1	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAW YQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDF	155
ТМЗВ109 TM3B113 ТМЗВ189 ТМЗВ190 TM3B193 ТМЗВ195 ТМЗВ196 ТМЗВ291	PYYL6 TM3L12 TM3L61 TM3L62 TM3L52 TM3L67 TM3L64 TM3L85	TLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGQGTKVEIK DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLASSNNK NYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSG SGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPLTFGQGT KVEIK EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSNSTLAW YQQKPGQAPRLLIYTASSRATGIPDRFSGSGSGTDF TLTISRLEPEDFAVYYCQQSYTSPWTFGQGTKVEIK DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESLDSYGNSY IHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSK TDFTLTIDPVEADDPATYYCQQNNEDPFTFGSGTKL EIK DIVMTQSPSSMSASLGDRITITCQATQDIVKNLNWY QQKPGKPPSFLIHYVTELAEGVPSRFSGSGSGSDYS LTISNLESEDFADYYCLQFYEFPLTFGAGTKLELK DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVNTAVAWY QQKPGQSPKLLIYSATYRYTGVPDRFTGSGSGTDFT FTISSVQAEDLAVYYCQQHYSTPYTFGSGTKLEIK DVQMIQSPKSMSMSVGERVTLSCKASENVGTFVSWY QQKPDQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFT LTISSVQAEDLADYHCGQSYSYPTFGSGTKLEM DIQMTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSY MNWYQQKPGQPPKLLIYTAANLQSGIPARFSGSGSG TDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPFTFGSGTKL EIK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASENVGTFVSWY QQKPGKAPKLLIYGASNRYTGVPSRFSGSGSGTDFT LTISSLQPEDFATYYCGQSYSYPTFGQGTKLEIK Таблица 38	157 158 159 160 161 162 163 173
Название mAb	Название VH	Каркас VH	Название VL	Каркас VL
Название	SEQ ID NO:	Название	SEQ ID NO:
TM3B103	ТМЗН21	IGHV3-23	174	PH9L1	IGKV3-20	180

- 140 045238

ТМЗВ105	ТМЗН24	IGHV3-23	174	TM3L33	IGKV3-11	171
ТМЗВ108	ТМЗНЗО	IGHV3-23	174	PH9L1	IGKV3-20	180
ТМЗВ109	TM3H31	IGHV3-23	174	PYYL6	IGKV4-1	181
TM3B113	ТМЗН65	IGHV3-23	174	TM3L12	IGKV3-20	180
ТМЗВ189	ТМЗН141	IGHV1-02	175	TM3L61	IGKV4-1	181
ТМЗВ190	ТМЗН96	IGHV4-30	176	TM3L62	IGKV1-39	182
TM3B193	ТМЗН99	IGHV1-03	177	TM3L52	IGKV1-33	183
ТМЗВ195	ТМЗН144	IGHV1-03	177	TM3L67	IGKV1-39	182
ТМЗВ196	ТМЗН102	IGHV2-26	178	TM3L64	IGKV4-1	181
ТМВ291	ТМЗН162	IGHV5-51	179	TM3L85	IGKV1-39	182

IGHV3-23 SEQ ID NO: 174

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS

AISGSGGSTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK

IGHV1-02 SEQ ID NO: 175

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMG

RINPNSGGTNYAQKFQGRVTSTRDTSISTAYMELSRLRSDDTWYYCAR

IGHV4-30 SEQ ID NO: 176

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGST

YYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR

IGHV1-03 SEQ ID NO: 177

QVQLVQS GAEVKKPGASVKVS OKAS GYT FT SYAMHWVRQAPGQRLEWMG

WINAGNGNTKYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR

IGHV2-26 SEQ ID NO: 178

QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSNARMGVSWIRQPPGKALEWLA

HIFSNDEKSYSTSLKSRLTISKDTSKSQWLTMTNMDPVDTATYYCARI

IGHV5-51 SEQ ID NO: 179

EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTR

YS PS FQGQVTISADKSIS TAYLQWS S LKAS DTAMYYCAR

IGKV3-20 SEQ ID NO: 180

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY

GASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSP

IGKV3-11 SEQ ID NO: 171

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIP

ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWP

IGKV4-1SEQ ID NO: 181

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY

GASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSP

IGKV1-39 SEQ ID NO: 182

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIY

AASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPI

GKV1-33 SEQ ID NO: 183

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIY

DASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLP

Пример 13. Характеризация антител к TIM-3.

Выбранные антитела характеризовали на их связывание с клетками человека или яванского макака, а также на их способность блокировать связывание лиганда галектина-9. В табл. 39 показаны характеристики выбранных антител в этих анализах. Данные по связыванию клеток представляют расчетные значения EC50 связывания антител с клетками, трансфицированными указанным рекомбинантным белком TIM-3, выраженные в единицах мкг/мл. Ингибирование галектина-9 представляет максимальный уровень ингибирования связывания галектина-9 с TIM-3 человека, наблюдаемый с указанными антителами. Исследуемые антитела исследовали как изотипы IgG2сигма.

Анализы по картированию эпитопа выполняли путем покрытия планшет MSD рекомбинантным белком huTIM-3-Fc. Планшеты блокировали и промывали с последующим добавлением смеси mAb к

- 141 045238

TIM-3, меченных тегом MSD и инкубированных с возрастающими концентрациями не меченых шАЪ к TIM-3. После инкубации с легким встряхиванием при комнатной температуре планшеты промывали и анализировали с помощью SECTOR Imager 6000. Антитела, которые конкурировали друг с другом за связывание с TIM-3 человека, считались связывающими аналогичные эпитопы. Положительное ингибирование отмечали, если связывание ингибировалось на > 75%. Частичным ингибированием считалось 4075% ингибирования. < 40% ингибирования обозначали как отрицательное.

Таблица 39

mAb	ЕС50 связывания с клетками, мкг/мл	Ингибирование галектина-9, %	Эпитопная группа
	Клетки человека	Клетки яванского макака	ингибирования
TM3B103	0, 71	0,09	71,2	1
ТМЗВ105	0,46	0,03	69, 8	1
ТМЗВ107			74,8	2
ТМЗВ108	0, 42	0,03	64,2	1
ТМЗВ109			77,0	1
TM3B113			75, 6	2
ТМЗВ189	0, 74	0, 19	76,4	3
ТМЗВ190	0, 35	0,08	60,7	1
TM3B193			47,4	3
ТМЗВ219	0, 60	0,10	38,0	3
ТМЗВ196			57,0	4

Пример 14. Разработка функционального анализа in vitro для характеризации антител к TIM-3.

Функциональную оценку ингибиторных рецепторов, таких как PD-1, можно выполнять с применением Т-клеток от нормального донора, которые стимулируются аллогенными дендритными клетками или специфическими антигенами, например, анатоксином столбняка или ЦМВ. В таких условиях изменения функции Т-клеток при обработке антителом можно обнаруживать посредством измерения уровней цитокина в супернатанте либо по активации маркеров Т-клеток. Влияния антител к TIM-3 в этих типах анализов могут значительно варьировать при незначительном общем изменении состояния активации или функциональности общей массы Т-клеток (неспецифичных к антигену). С другой стороны, применение тетрамерных подходов для слежения за одиночными субпопуляциями/клонами Т-клеток не обеспечивает разрешения, необходимого в этих анализах для обнаружения функционального влияния антител к TIM-3, вследствие низкой частоты и гетерогенного функционального профиля этих клонов Тклеток. Кроме того, при данном подходе необходима предварительная идентификация эпитопов, распознаваемых специфичными к ЦМВ Т-клетками от каждого донора.

Недавно CD 137 был описан как суррогатный маркер для активированных специфичных к антигену Т-клеток (Wolf et al., (2007) Blood ПО (1): 201-210; Klinger et al., (2013) PLoS One 8(9): e74231). В наших анализах применение CD137 позволяло выявить специфичные к антигену Т-клетки CD8+ и CD4+, которые распространяются в ответ на стимуляцию антигеном ЦМВ, и позволяло обнаруживать функциональные эффекты антител к TIM-3. В дополнение к экспрессии CD 137 в этих анализах также оценивали секрецию цитокинов по MSD.

Активность выбранных антител к TIM-3 исследовали на РВМС, стимулированных рр65 ЦМВ. В этих анализах антитела к TIM-3 повышали активацию Т-клеток, как демонстрировала усиленная экспрессия CD 137 на Т-клетках как CD8+, так и CD4+. Кроме того, выбранные антитела к TIM-3 в этом анализе также усиливали секрецию ИФН-γ и ФНО-ог

В табл. 40 показаны результаты анализа ЦМВ, в котором для выбранных антител к TIM-3 усиленную экспрессию CD 137 на поверхности оценивали на клетках CD8+ или CD4+. В таблице показаны рзначения, полученные по двустороннему Т-критерию (неравномерная дисперсия).

- 142045238

Таблица 40

	CD8+ CD137+, р-значения	CD4+ CD137+, p-значения
	Среднее	Станд. ОТКЛ .	η	Среднее	Станд. ОТКЛ .	η
TM3B103	0, 043	0, 025	5	0, 071	0, 112	3
TM3B105 TM3B107 TM3B108 TM3B109 TM3B113 TM3B189 TM3B190 TM3B193 TM3B195 TM3B196 TM3B197	0, 029 0, 182 0, 022 0, 035 0, 082 0, 027 0, 078 0,467 0, 035 0,328 0,473	0, 036 0, 188 0, 018 0, 041 0, 064 0, 026 0, 159 0, 252 0, 043 0, 183 0, 303	6 5 5 5 6 6 6 3 7 6 4	0, 01 0, 157 0, 01 0, 017 0, 05 0, 007 0, 004 0, 1 0, 01 0,733 0,3	0, 017 0, 125 0, 01 0, 015 0, 026 0, 011 0, 005 Н/п 0, 01 0, 058 Н/п	3 3 3 3 3 3 3 1 3 3 1

Пример 15. Создание биспецифических антител PD-1/TIM-3.

Выбранные моноспецифические антитела к PD-1 и TIM-3 экспрессировали как IgG1/K, IgG2/K или IgG4/K. Замены были выполнены в положениях 405 и 409 (нумерация по EU) в моноспецифических антителах для содействия последующему обмену плеч in vitro и формированию биспецифических антител. Антитела IgG1 и IgG2 к PD-1 и к TIM-3 конструировали с наличием замен F405L и K409R соответственно для содействия обмену плеч и созданию биспецифических антител. На IgG4 в положении 409 WT находится R; следовательно, антитело IgG4 к PD-1 не было сконструированным, а антитело IgG4 к TIM-3 было сконструированным с наличием замен F405L и R409K. В дополнение к заменам в положениях 405 и 409 mAb IgG4 были сконструированы с заменой S228P, а антитела IgG2 были необязательно сконструированы с включением замены IgG2сигма (V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S и P331S).

Моноспецифические антитела экспрессировали и очищали с помощью стандартных способов, применяя колонку Protein A (колонку HiTrap MabSelect SuRe). После элюирования пулы диализировали в DPBS, pH 7,2.

Биспецифические антитела PD-1/TIM-3 создавали, комбинируя моноспецифическое mAb к PD-1 и моноспецифическое mAb к TIM-3 при обмене плечами Fab in vitro, как описано в международной патентной публикации № WO2011/131746. Вкратце, около 1-20 мг/мл каждого антитела в молярном соотношении 1: 1 в PBS, pH 7-7,4, и 75 мМ 2-меркаптоэтаноламина (2-MEA) смешивали вместе и инкубировали при 25-37°C в течение 2-6 ч, после чего удаляли 2-MEA посредством диализа, диафильтрации, тангенциальной поточной фильтрации и/или фильтрации в вихревой ячейке с применением стандартных способов.

Биспецифические антитела после обмена плечами Fab in vitro дополнительно очищали стандартными способами, применяя гидрофобную хроматографию, чтобы свести к минимуму остаточное содержание исходных антител PD-1 и TIM-3.

Выбранные моноспецифические антитела к PD-1 и к TIM-3 комбинировали в матриксе при обмене плечами Fab in vitro с созданием биспецифических антител. В табл. 41, табл. 42 и табл. 43 показаны последовательности VH, VL, HC и LC созданных биспецифических антител и их изотипы. Аллотипами антител G2 были G2m(n)/(n-) или G2m(n-).

В некоторых экспериментах применяли контрольные антитела, которые были моновалентными для либо PD-1, либо TIM-3, со вторым инертным плечом, связывающимся с gp120. Связывающее gp120 плечо имело VH с SEQ ID NO: 184 и VL с SEQ ID NO: 185. В табл. 44 показаны созданные контрольные антитела.

SEQ ID NO: 184 VH mAb, связывающего gpl20

Qvqlvqsgaevkkpgasvkvscqasgyrfsnfvihwvrqapgqrfewmgwinpyngnke fsakfqdrvtftadtsantaymelrslrsadtavyycarvgpyswddspqdnyymdvwgkgttv ivss

SEQ ID NO: 185 VL mAb, связывающего gpl20

Eivltqspgtlslspgeratfscrsshsirsrrvawyqhkpgqaprlvihgvsnrasgisdrfs gsgsgtdftltitrvepedfalyycqvygassytfgqgtklerk

- 143 045238

Таблица 41

mAb	Плечо, связывающее PD-1
VH1	VH1 SEQ ID NO:	VL1	VL1 SEQ ID NO:	Изотип
PTBB14	PD1H170	48	PD1L148	56	1дС2сигма
PTBB15	PD1H170	48	PD1L148	56	1дС2сигма
PTBB16	PD1H129	64	PD1L62	65	1дС2сигма
PTBB17	PD1H129	64	PD1L62	65	1дС2сигма
PTBB24	PD1H170	48	PD1L148	56	IgG2сигма
PTBB30	PD1H170	48	PD1L148	56	IgG2сигма
PTBB27	PD1H170	48	PD1L148	56	IqG2
PTBB28	PD1H170	48	PD1L148	56	IgG2
PTBB18	PD1H129	64	PD1L62	65	IqG4 S228P
PTBB20	PD1H170	48	PD1L148	56	IqG4 S228P
PTBB21	PD1H170	48	PD1L148	56	IqG4 S228P

Таблица 42

mAb	Плечо, связывающее TIM-3
VH2	VH2 SEQ ID NO:	VL2	VL2 SEQ ID NO:	Изотип
PTBB14	TM3H144	153	TM3L67	162	1дС2сигма
PTBB15	TM3H24	146	TM3L33	156	1дС2сигма
PTBB16	TM3H144	153	TM3L67	162	1дС2сигма
PTBB17	TM3H24	146	TM3L33	156	1дС2сигма
PTBB24	TM3H162	172	TM3L85	173	IgG2сигма
PTBB30	TM3H24	146	TM3L33	156	IgG2сигма
PTBB27	TM3H162	172	TM3L85	173	IgG2
PTBB28	TM3H24	146	TM3L33	156	IgG2
PTBB18	TM3H24	146	TM3L33	156	IgG4 S228P
PTBB20	TM3H24	146	TM3L33	156	IgG4 S228P
PTBB21	TM3H162	172	TM3L85	173	IqG4 S228P

Таблица 43

mAb	SEQ ID NO:
Плечо, связывающее PD-1	Плечо, связывающее TIM-3
HC1	LC1	HC2	LC2
PTBB14	186	188	190	193
PTBB15	186	188	191	194
PTBB16	187	189	190	193
PTBB17	187	189	191	194
PTBB24	186	188	192	195
PTBB30	186	188	248	194
PTBB27	241	188	244	195
PTBB28	241	188	245	194
PTBB18	242	189	246	194
PTBB20	243	188	246	194
PTBB21	243	188	247	195

SEQ ID NO: 186

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFDTAN YAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPGLAAAYDTGSLDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSWTVTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVWDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPGK

SEQ ID NO: 187

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSRYDMSWVRQAPGKGLESVAYISGGGANTY YLDNVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASPYLSYFDVWGQGTLVTVSSASTKGP SVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWT VTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVWDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES

- 144 045238

NGQPENNYKTTPPMLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 188

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIP ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRNYWPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 189

EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSLSDYLHWYQQKPGQAPRLLIKSASQSISGIP ARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQNGHSFPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 190

EVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSYWMQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGDGDIR YTQNFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCARWEKSTTWQRNYFDYWGQGTTLTVS SASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSWTVTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCWVDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPGK

SEQ ID NO: 191

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTY YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPYAPLDYWGQGTLVTVSSASTKGP SVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWT VTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVVVDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 192

EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWMQWVRQMPGKGLEWMGAIYPGDGDIR YTQNFKGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARWEKSTTWQRNYFDYWGQGTTVTVS SASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSWTVTSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCWVDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD lAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS

- 145 045238

LSLSPGK

SEQ ID NO: 193

DVQMIQSPKSMSMSVGERVTLSCKASENVGTFVSWYQQKPDQSPKLLIYGASNRYTGVP DRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQSYSYPTFGSGTKLEMKRTVAAPSVFIFPPSDEQ LKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 194

SEQ ID NO: 195

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASENVGTFVSWYQQKPGKAPKLLIYGASNRYTGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGQSYSYPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQ LKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 241

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFDTAN YAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPGLAAAYDTGSLDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPGK

SEQ ID NO: 242

SEQ ID NO: 243

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFDTAN

- 146 045238

YAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPGLAAAYDTGSLDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSLGK

SEQ ID NO: 244

EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWMQWVRQMPGKGLEWMGAIYPGDGDIR YTQNFKGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARWEKSTTVVQRNYFDYWGQGTTVTVS SASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQD WLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPGK

SEQ ID NO: 245

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTY YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPYAPLDYWGQGTLVTVSSASTKGP SVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWT VPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEY KCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 246

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTY YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPYAPLDYWGQGTLVTVSSASTKGP SVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWT VPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG К

SEQ ID NO: 247

EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWMQWVRQMPGKGLEWMGAIYPGDGDIR YTQNFKGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARWEKSTTVVQRNYFDYWGQGTTVTVS SASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSLGK

SEQ ID NO: 248

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTY YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPYAPLDYWGQGTLVTVSSASTKGP SVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWT VPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVWDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

- 147 045238

Таблица 44

Контрольное mAb	VH/VL плеча 1 с заменой F405L	VH/VL плеча 2 с заменой K409R	Изотип
TM3B342	др120	ТМЗВ195	IgG2сигма
TM3B343	др120	ТМЗВ299	IgG2сигма
В23В74	др120	В23В32	IgG2сигма
РТВВ23	др120	ТМЗВ291	IgG2сигма
PD1B355	PD1B246	др120	IgG2сигма
PD1B356	PD1B248	др120	IgG2сигма

Пример 16. Характеризация биспецифических антител PD-1/TIM-3.

Созданные биспецифические антитела-антагонисты исследовали в анализе ЦМВ на их способность к усилению ответа специфичных к антигену T-клеток. Функциональность измеряли по оценке экспрессии CD137 на T-клетках как CD4 + , так и CD+, а также по уровням ИФН-γ и ФНО-α в супернатантах культуры, как описано в примере 14. В табл. 45 и табл. 46 представлена активность биспецифических антител PD-1/TIM-3 в данном анализе по разным показателям. Как показано в этой таблице, выбранные биспецифические молекулы приводили к значительным повышениям экспрессии CD137 на T-клетках CD4+ и CD8+, а также секретируемых уровней ИФН-γ и ФНО-α. В целом, биспецифические антитела PD-1/TIM-3 с Fc huIgG2сигма имели самую высокую активность, за ними следовали антитела с huIgG2, а затем - с huIgG4.

Таблица 45

mAb	Статистическая значимость
CD4+CD137+	CD8+CD137+
Изотип	Название	Среднее рзначение	Ст. откл.	Среднее рзначение	Ст. откл.
IgG2сигма	PTBB14	0,1144	0,1591	0,0002	0,0001
IgG2сигма	PTBB15	0,0467	0,0988	0,0001	0,0000
IgG2сигма	PTBB16	0,0017	0,0023	0,0001	0,0000
IgG2сигма	PTBB17	0,4148	0,5051	0,0001	0,0001
IgG2сигма	PTBB24	0,0031	0,0051	0,0001	0,0000
IgG2	PTBB27	0,0009	0, ООН	0,0001	0,0000
IgG2	PTBB28	0,0003	0,0002	0,0001	0,0000
IgG4	PTBB18*	0,0353		0,0071
IgG4	PTBB20	0,6025	0,1710	0,0004	0,0004
IgG4	PTBB21	0,1071	0,1372	0,0059	0,0081
* Показано	одно p-значение

Таблица 46

mAb	Статистическая значимость
ИФН-γ	ФНО-а
Изотип	Название	Среднее рзначение	Ст. откл.	Среднее рзначение	Ст. откл.
IgG2сигма	РТВВ14	0,0001	0,0000	0,0112	0,0157
IgG2сигма	РТВВ15	0,0001	0,0000	0,0005	0,0008
IgG2сигма	РТВВ16	0,0001	0,0000	0,0012	0,0016
IgG2сигма	РТВВ17	0,0001	0,0000	0,0001	0,0000
IgG2сигма	РТВВ24	0,0001	0,0001	0,0008	0,0008
IgG2	РТВВ27	0,0026	0,0030	0,3406	0,4757

- 148 045238

IgG2	РТВВ28	0,0001	0,0000	0,1437	0, 1229
IgG4	РТВВ18	0,0001	#DIV/0!	0,0008	#DIV/0!
IgG4	РТВВ20	0,0544	0,0768	0,1754	0,2140
IgG4	РТВВ21	0,0174	0,0245	0,2685	0,1103
* Показано одно p-значение

Пример 17. Антитела к PD-1 усиливают экспрессию TIM-3 в опухолях.

Влияние лечения антителом к PD-1 на экспрессию TIM-3 в опухолях оценивали на модели мышей с карциномой толстой кишки CT26 или MC38.

Мышам Balb/c подкожно имплантировали 1x106 опухолевых клеток карциномы толстой кишки CT26. Через семь дней после имплантации опухолевых клеток опухоли измеряли и мышей случайно распределяли по размеру опухоли. Обработка PBS или 10 мг/кг антител к PD-1 мыши (клон RMP1-14, BioXCell) начинали в день 7 после имплантации опухолевых клеток и повторяли с интервалом две недели остальное время исследования. Для анализа экспрессии TIM-3 на T-клетках опухоли извлекали на день 22 и диссоциировали с помощью GentleMACS (компания Miltenyi). Окрашивание для проточной цитометрии проводили с Live/Dead и маркерами на CD3, CD4, CD8, TIM-3. Выполняли проточную цитометрию на LSR Fortessa (BD). Данные анализировали с помощью программного обеспечения Flow Jo.

Самкам мышей C57Bl/6 дикого типа подкожно имплантировали 5x105 клеток карциномы толстой кишки MC-38, суспендированных в PBS. Опухоли измеряли и мышей рандомизировали по размеру опухоли (50-100 мм3). Обработка PBS или 10 мг/кг антитела к PD-1 мыши (клон RMP1-14, BioXCell) начинали после рандомизации и повторяли два раза в неделю остальное время исследования. Для создания профиля инфильтрированных в опухоль T-клеток опухоли собирали и диссоциировали с помощью GentleMACS (компания Miltenyi) через 12, 15, 19 или 22 дня после имплантации.

Окрашивание для проточной цитометрии проводили с Live/Dead и маркерами на CD45, Thy1, CD3, CD4, CD8, TIM-3, CD137, OX40, GITR, TIGIT. Данные проточной цитометрии собирали на LSR Fortessa (BD). Данные анализировали в программном обеспечении FlowJo (v9.9.4) и визуализировали в GraphPad Prism. Статистику формировали в GraphPad Prism.

Анализ экспрессии TIM-3 на T-клетках CD8+, выделенных из опухолей CT26 на день 22, показал повышение экспрессии TIM-3 в пробах с обработкой PD-1 по сравнению с контролем с PBS. На фиг. 1A показана средняя интенсивность флуоресценции экспрессии TIM-3 в двух опытных группах.

Экспрессия TIM-3 также повышалась в опухолях MC-38 в пробах с обработкой mAb к PD-1 по сравнению с контролем с PBS. На фиг. 1B показана геометрическая средняя интенсивность флуоресценции экспрессии TIM-3 в популяции TIL CD8+. На фиг. 1C показано процентное значение (%) относительной частоты клеток TIM-3+ CD8+ из всех TIL CD8+.

Эти данные показывают, что TIM-3 усиливается в ответ на обработку антителом к PD-1, что подкрепляет обоснование для нацеливания на TIM-3 у субъектов, получавших обработку PD-1.

Экспрессию CD137, OX40 и GITR также анализировали на T-клетках CD8+, инфильтрирующих опухоли MC38, выделенные у мышей после обработки антителами к PD-1 мыши. Эти результаты показали, что как частота, так и уровень (гСИФ) экспрессии костимуляторных рецепторов CD137, OX40 и GITR семейства ФНО повышался после блокады PD-1. На фиг. 2A и фиг. 2B показаны гСИФ и относительная частота экспрессии CD137 на TIL CD8 соответственно. На фиг. 3A и фиг. 3B показаны гСИФ и относительная частота экспрессии OX40 на TIL CD8 соответственно, а на фиг. 4A и фиг. 4B показаны гСИФ и относительная экспрессия GITR на TIL CD8 соответственно.

Эти данные подкрепляют обоснование для нацеливания на CD137, OX40 и/или GITR у субъектов, получавших обработку PD-1.

Пример 18. Активность антител к TIM-3 после блокады PD-1.

Также исследовали активность антител к TIM-3 после блокады антитела к PD-1 в анализе ЦМВ. В этих экспериментах PBMC от одного нормального донора (ЦМВ-серопозитивного) инкубировали с пулами пептидов pp65 и антителами к PD-1 в течение 5 дней. В день 5 супернатанты отбирали и клетки повторно стимулировали пулом пептидов pp65 в присутствии антитела либо к TIM-3, либо к PD-1. Уровни ИФН-γ в супернатанте измеряли через 24 часа. Обработка антителами к TIM-3 после 5 дней блокады антителом к PD-1 привела к значительному повышению уровней ИФН-γ. Этот эффект был значительным (p=0,0183) по сравнению с непрерывной обработкой антителом к PD-1. В этом эксперименте применяли антитело TM3B403 к TIM-3 и антитело PD1B244 к PD-1. На фиг. 5 показаны повышенные уровни ИФН-γ в анализе ЦМВ, где PBMC обрабатывали антителом TM3B105 к TIM-3 после 5 дней обработки антителом PD1B244 к PD-1. Значения представляют собой средние из шести биологических повторностей, применяемых для каждого условия.

Пример 19. Картирование эпитопов антител к TIM-3.

Для выявления связывающих эпитопов ТМВ403 и ТМВ291 выполняли обмен водорода/дейтерия в растворе с масс-спектрометрией (HDX-MS). Для этих экспериментов VH и VL TM3B403 и TM3B291 клонировали как Fab IgG1 с гексагистидиновой меткой на C-конце. Fab создавали в результате времен- 149 045238 ных трансфекций клеток HEK293 Expi во флаконах со встряхиванием суспензии. Применяли химеру Fc

TIM-3 IgG1, Ser22-Arg200 (поступление № Q8TDQ0), созданную в клеточной линии миеломы мыши (выведенной из NS0) от компании R&D Systems (№ 2365-TM по каталогу).

При обмене H/D процедуры, применяемые для анализа возмущения Fab, были аналогичны описанным ранее (Hamuro et al., Biomolecular Techniques 14: 171-182, 2003; Horn et al., Biochemistry 45: 84888498, 2006) с некоторыми модификациями. Вкратце, дегликозилированный гибридный белок TIM-3/Fc человека или смесь дегликозилированного TIM-3-Fc человека плюс Fab инкубировали с буфером, метящим оксидом дейтерия, при 0°C в течение разных значений времени до 2 часов. Обмен дейтерием гасили посредством добавления гидрохлорида гуанидина и гашеную пробу подвергали расщеплению пепсином в колонке и анализу ЖХ-МС. Масс-спектры регистрировали только в режиме МС. Для вычисления включения дейтерия масс-спектры для данного пептида комбинировали по выделенным ионной хроматографией пикам и рассчитывали средневзвешенные m/z. Увеличение массы от массы нативного пептида (0 мин) до средневзвешенной массы соответствует уровню включения дейтерия. Около 98,4% белка можно было картировать относительно конкретных пептидов.

Уровни дейтерия в выявленных пептидах отслеживали по сдвигу масс на ЖХ-МС. Были построены выбранные кривые накопления дейтерия, которые показывают значительную разницу в уровнях дейтерия и/или наклоне за время обмена. Дегликозилированный гибридный белок TIM-3/Fc человека показал значительное снижение захвата дейтерия после связывания с антителом TM3B403 в последовательностях 32WGKGACPVFECGNVVL47 (SEQ ID NO: 261) и после связывания с антителом TM3B291 в последовательностях 90RIQIPGIMNDEKF102 (SEQ ID NO: 262). Таким образом, эти области со значительным снижением захвата дейтерия после связывания Fab можно рассматривать как главные эпитопы mAb.

Сегмент 50DERDVNY56 (SEQ ID NO: 263) демонстрировал умеренное снижение обмена дейтерия после связывания с TM3B403 или TM3B291. Эту область можно также рассматривать как потенциальный эпитоп для обоих антител.

Основные связывающие эпитопы для TM3B403 или TM3B291 различаются, однако они могут иметь общую аналогичную область умеренной защиты, 50DERDVNY56, (SEQ ID NO: 263), на основании результатов картирования по HDX. Чтобы оценить, участвует ли эта область в общей связывающей области эпитопа в обеих молекулах Fab, выполняли конкурентный ИФА. Рекомбинантный белок TIM-3/Fc человека наносили непосредственно на планшеты, которые затем блокировали и промывали. Вносили смесь меченного рутением (Ru) Fab TM3B291, которую предварительно инкубировали с разными концентрациями не меченого TM3B105 или TM3B291. Планшеты инкубировали, промывали и вносили в каждую лунку буфер MSD Read Buffer T с последующим считыванием на приборе SECTOR Imager 6000 (компания Meso Scale Discovery, г. Гейтерсберг, штат Мэриленд, США).

Конкурентный анализ продемонстрировал, что TM3B403 конкурировало с TM3B291 за связывание с TIM-3. Этот результат может показывать, что умеренно защищенная область DERDVNY (SEQ ID NO: 263) является частью эпитопа в обоих антителах или что антитела могут стерически блокировать связывание друг друга вследствие тесной близости их эпитопов.

Пример 20. Блокада TIM-3 повышает экспрессию TIGIT на TIL CD8+.

Влияние обработки антителом к TIM-3 на экспрессию TIGIT в опухолях оценивали на модели мышей с карциномой толстой кишки CT26 или MC38. Исследования проводили так, как описано в примере 17, за исключением того, что применяли 10 мг/мл антитела RMT3-23 (компания Bioxcell) к TIM-3.

Экспрессия TIGIT на TIL CD8+ (фиг. 19A, фиг. 20A) и относительная частота TIL TIGIT+ (фиг. 19B, фиг. 20B) были повышены в моделях опухоли как CT26 (фиг. 19A, фиг. 19B), так и MC38 (фиг. 20A, фиг. 20B) после блокирования TIM-3.

Пример 21. Экспрессия TIM-3 повышается после блокады PD-1 ex vivo в PBMC от пациента с меланомой.

PBMC от ранее не получавших лечения пациентов с меланомой стимулировали пептидными пулами антигенов меланомы (NY-ESO, gp100, MART-1) в присутствии блокирующих функцию антител к PD1 или к TIM-3. Экспрессию TIM-3 оценивали на повторно стимулированных пептидами клетках на день 6. Результаты показали значительное повышение частоты T-клеток TIM-3+ CD8+ в пробах PBMC, обработанных антителом к PD-1, по сравнению с контрольными или обработанными антителами к TIM-3 (фиг. 21).

В день 0 замороженные PBMC от ранее не получавших лечения пациентов с меланомой быстро оттаивали на водяной бане при 37°C. Клетки оттаивали, промывали и подсчитывали в полной среде RPMI (RPMI+10% FBS+1% пируват натрия+1% NEAA+1% пенициллин/стрептомицин). Клетки вносили в планшеты на 96 лунок с U-образным дном, по 200000 клеток на лунку, в присутствии или в отсутствие блокирующих функцию антител к PD-1 или к TIM-3 (PD1B244 и TM3B403 соответственно) и с 1 мкг/мл пептидных пулов антигенов меланомы (NY-ESO, gp100, MART-1) в течение 6 дней при 37°C. Клетки повторно стимулировали пептидным пулом на день 6 и анализировали проточной цитометрией на экспрессию PD-1 и TIM-3, а также на маркеры активации и пролиферации T-клеток.

- 150 045238

Пример 22. Антитела к TIM-3 повышают частоту активированных NK-клеток в PBMC, стимулированных IL-2.

Влияния антитела TM3B403 к TIM-3 на частоту активированных NK-клеток определяли в анализах, где PBMC человека стимулировали IL-2 (20U). Частоту CD69 и CD25, маркеров активации NK-клеток, оценивали проточной цитометрией через 48 часов после обработки при диапазоне концентраций mAb. TM3B403 повышало частоту активированных NK-клеток, когда активацию оценивали по процентной доле CD69-положительных клеток (фиг. 22А) или по процентной доле CD25-положительных клеток (фиг. 22B).

Перечень последовательностей < 110> DeAngelis, Nikki A

Powers, Gordon

Sabins, Nina Chi

Santulli-Marotto, Sandra

Verona, Raluca Wiehagen, Karla R < 120> Антитела, специфически связывающие PD-1, и их применение < 130> JBI5071WOPCT <140> Переуступка прав <141> 2016-11-01 <150> 62/250,095 <151> 2015-11-03 <160>312 < 170> PatentIn, версия 3.5 < 210>1 <211>268 < 212> PRT < 213> Homo sapiens < 400>1

Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr 1 5 1015

Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe

2530

Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr

4045

Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu 50 5560

Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu 65 70 7580

Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn 85 9095

- 151 045238

Asp Ser Gly

Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala 100 105

Gln Ile Lys

115

Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr

120 125

Pro Lys Ala 110

Glu Arg Arg

Ala Glu Val

130

Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg

135 140

Pro Ala Gly

Gln Phe Gln 145

Thr Leu Val Val

150

Gly Val Val Gly Gly Leu Leu Gly Ser

155 160

Leu Val Leu

Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys Ser Arg Ala Ala

165 170 175

Arg Gly Thr

Ile Gly Ala Arg Arg Thr

180 185

Gly Gln Pro Leu Lys Glu Asp 190

Pro Ser Ala

195

Val Pro Val Phe Ser Val

200

Asp Tyr Gly Glu Leu Asp Phe

205

Gln Trp Arg

210

Glu Lys Thr Pro Glu Pro

215

Pro Val Pro Cys Val Pro Glu 220

Gln Thr Glu 225

Ser Pro Ala

Tyr Ala Thr Ile Val Phe 230

Arg Arg Gly Ser Ala Asp 245

Pro Ser Gly Met Gly Thr Ser

235 240

Gly Pro Arg Ser Ala Gln Pro

250 255

Leu Arg Pro

Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu

260 265 <210>2 <211>149 <212> PRT <213> Homo <400>2

Pro Gly Trp 1 sapiens

Phe Leu Asp Ser Pro 5

Asp Arg Pro Trp Asn Pro 10

Pro Thr 15

Phe Ser Pro

Ala Leu Leu Val Val 20

Thr Glu Gly Asp Asn Ala

30

Thr Phe

Thr Cys Ser 35

Phe Ser Asn Thr Ser

Glu Ser Phe Val Leu Asn

Trp Tyr

- 152 045238

Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp

55

Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys 65 70

Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser 85

Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala

100 105

Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu

115 120

Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser

130 135

Gln Phe Gln Thr Leu 145 <210>3 <211>268 < 212> PRT < 213> Macaca fascicularis < 400>3

Pro Gly Trp Phe Leu Glu Ser Pro Asp 15

Phe Ser Pro Ala Leu Leu Leu Val Thr

25

Thr Cys Ser Phe Ser Asn Ala Ser Glu

40

Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp

55

Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys 65 70

Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser 85

Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala

100 105

Leu Ala Ala Phe Pro Glu

Phe Arg Val Thr Gln Leu 75 80

Val Arg Ala Arg Arg Asn 95

Ser Leu Ala Pro Lys Ala

110

Arg Val Thr Glu Arg Arg

125

Ser Pro Arg Pro Ala Gly

140

Pro Trp Asn Ala Pro Thr

Gly Asp Asn Ala Thr Phe 30

Phe Val Leu Asn Trp Tyr 45

Leu Ala Ala Phe Pro Glu

Phe Arg Val Thr Arg Leu 75 80

Val Arg Ala Arg Arg Asn 95

Ser Leu Ala Pro Lys Ala

110

- 153 045238

Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu

115 120

Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser

130 135

Gln Phe Gln Ala Leu Val Val Gly Val 145 150

Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala

165

Gln Gly Thr Ile Glu Ala Arg Arg Thr

180 185

Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val

195 200

Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro

210 215

Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe

225 230

Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp

245

Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser

260 265 <210>4 <211>149 < 212> PRT < 213> Macaca fascicularis < 400>4

Pro Gly Trp Phe Leu Glu Ser Pro Asp 15

Phe Ser Pro Ala Leu Leu Leu Val Thr

25

Thr Cys Ser Phe Ser Asn Ala Ser Glu

40

Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp

55

Arg Val Thr Glu Arg Arg

125

Ser Pro Arg Pro Ala Gly

140

Gly Gly Leu Leu Gly Ser

155 160

Ile Cys Ser Arg Ala Ala

175

Gln Pro Leu Lys Glu Asp

190

Tyr Gly Glu Leu Asp Phe

205

Ala Pro Cys Val Pro Glu

220

Ser Gly Leu Gly Thr Ser

235 240

Pro Arg Ser Pro Arg Pro

255

Pro Leu

Pro Trp Asn Ala Pro Thr

Gly Asp Asn Ala Thr Phe 30

Phe Val Leu Asn Trp Tyr 45

Leu Ala Ala Phe Pro Glu

- 154 045238

Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys 65 70

Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser 85

Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala

100 105

Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu

115 120

Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser

130 135

Gln Phe Gln Ala Leu 145 <210>5 <211>220 < 212> PRT < 213> Homo sapiens < 400>5

Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu 15

Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro 20 25

Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met

40

Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys

55

Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln 65 70

Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln 85

Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr

100 105

Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln

115 120

Phe Arg Val Thr Arg Leu 75 80

Val Arg Ala Arg Arg Asn 95

Ser Leu Ala Pro Lys Ala

110

Arg Val Thr Glu Arg Arg

125

Ser Pro Arg Pro Ala Gly

140

Val Val Glu Tyr Gly Ser

Glu Lys Gln Leu Asp Leu 30

Asp Lys Asn Ile Ile Gln 45

Gln His Ser Ser Tyr Arg 60

Ser Leu Gly Asn Ala Ala

80

Ala Gly Val Tyr Arg Cys 95

Arg Ile Thr Val Lys Val

110

Ile Leu Val Val Asp Pro

125

- 155 045238

Val Thr Ser

130

Glu His

Ala Glu Val 145

Ile Trp

Thr Thr Thr

Thr Asn

165

Glu Leu Thr Cys

135

Thr Ser Ser Asp 150

Ser Lys Arg Glu

Gln	Ala	Glu 140	Gly	Tyr	Pro	Lys
His	Gln 155	Val	Leu	Ser	Gly	Lys 160
Glu 170	Lys	Leu	Phe	Asn	Val 175	Thr

Ser Thr Leu

Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn

180 185

Phe Arg Arg

195

Leu Asp Pro Glu Glu Asn His

200

Pro Glu Leu

210

Pro Leu Ala His Pro Pro Asn

215

Glu Ile Phe Tyr Cys Thr 190

Thr Ala Glu Leu Val Ile 205

Glu Arg

220 <210>6 <211>221 <212> PRT <213> Homo <400>6

Phe Thr Val 1 sapiens

Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser

10 15

Asn Met Thr

Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu 20 25 30

Ala Ala Leu

Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln 40 45

Phe Val His

Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg 55 60

Gln Arg Ala 65

Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala

75 80

Leu Gln Ile

Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys

90 95

Met Ile Ser

Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val

100 105 110

Asn Ala Pro

115

Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro

120 125

- 156 045238

Val Thr Ser

130

Glu His

Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys

135 140

Ala Glu Val 145

Ile Trp

Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys

150 155 160

Thr Thr Thr

Thr Asn

165

Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr

170 175

Ser Thr Leu Arg Ile Asn 180

Phe Arg Arg Leu Asp Pro 195

Pro Glu Leu Pro Leu Ala 210

Thr Thr Thr Asn

185

Glu Glu Asn His

200

His Pro Pro Asn 215

Glu Ile Phe Tyr Cys Thr 190

Thr Ala Glu Leu Val Ile

205

Glu Arg Thr

220 <210>7 <211>222 < 212> PRT < 213> Macaca fascicularis < 400>7

Ala Phe Thr Val 1

Thr Val Pro Lys 5

Asp Leu Tyr Val 10

Val Glu Tyr Gly

Ser Asn Met Thr

Ile Glu Cys Lys

Phe Pro Val Glu 25

Lys Gln Leu Asp 30

Leu Thr Ser Leu

Ile Val Tyr Trp 40

Glu Met Glu Asp

Lys Asn Ile Ile 45

Gln Phe Val His 50

Gly Glu Glu Asp 55

Leu Lys Val Gln 60

His Ser Asn Tyr

Arg Gln Arg Ala 65

Gln Leu Leu Lys 70

Asp Gln Leu Ser 75

Leu Gly Asn Ala 80

Ala Leu Arg Ile

Thr Asp Val Lys 85

Leu Gln Asp Ala 90

Gly Val Tyr Arg 95

Cys Met Ile Ser

100

Tyr Gly Gly Ala

Asp Tyr Lys Arg 105

Ile Thr Val Lys

110

Val Asn Ala Pro

115

Tyr Asn Lys Ile

120

Asn Gln Arg Ile

Leu Val Val Asp

125

- 157 045238

Pro Val Thr

130

Ser

Glu

His

Glu

135

Leu

Thr

Cys

Gln

Ala

140

Glu

Gly

Tyr

Pro

Lys Ala Glu 145

Val

Ile

Trp 150

Thr

Ser

Asp

His

155

Gln

Val

Leu

Ser

Gly 160

Lys Thr Thr

Thr

165

Asn

Ser

Lys

Arg

Glu

170

Glu

Lys

Leu

Asn

175

Val

Thr Ser Thr

Leu

180

Arg

Ile

Asn

Thr

185

Ala

Asn

Glu

Ile

Phe

190

Tyr

Cys

Ile Phe Arg

195

Arg

Leu

Asp

Pro

Glu 200

Glu

Asn

His

Thr

Ala

205

Glu

Leu

Val

Ile Pro Glu

210

Leu

Pro

Leu

Ala

215

Leu

Pro

Asn

Glu

220

Arg

Thr <210>8 <211>201 <212> PRT <213> Homo <400>8

Leu Phe Thr 1 sapiens

Val

Thr 5

Val

Pro

Lys

Glu

Leu 10

Tyr

Ile

Glu

His 15

Gly

Ser Asn Val

Thr 20

Leu

Glu

Cys

Asn

Phe 25

Asp

Thr

Gly

Ser

His 30

Val

Asn

Leu Gly Ala

Ile

Thr

Ala

Ser

Leu 40

Gln

Lys

Val

Glu

Asn 45

Asp

Thr

Ser

Pro His Arg 50

Glu

Arg

Ala

Thr 55

Leu

Glu

Gln 60

Leu

Pro

Leu

Gly

Lys Ala Ser 65

Phe

His

Ile 70

Pro

Gln

Val

Gln

Val 75

Arg

Asp

Glu

Gly

Gln 80

Tyr Gln Cys

Ile

Ile 85

Ile

Tyr

Gly

Val

Ala 90

Trp

Asp

Tyr

Lys

Tyr 95

Leu

Thr Leu Lys

Val

100

Lys

Ala

Ser

Tyr

Arg 105

Lys

Ile

Asn

Thr

His

110

Ile

Leu

Lys Val Pro

115

Glu

Thr

Asp

Glu

Val

120

Glu

Leu

Thr

Cys

Gln

125

Ala

Thr

Gly

- 158 045238

Tyr

Pro 130

Leu

Ala

Glu

Val

Ser 135

Trp

Pro

Asn

Val

Ser 140

Val

Pro

Ala

Asn

Thr 145

Ser

His

Ser

Arg

Thr 150

Pro

Glu

Gly

Leu

Tyr 155

Gln

Val

Thr

Ser

Val 160

Leu

Arg

Leu

Lys

Pro 165

Pro

Gly

Arg

Asn 170

Phe

Ser

Cys

Val

Phe 175

Trp

Asn

Thr

His

Val 180

Arg

Glu

Leu

Thr

Leu 185

Ala

Ser

Ile

Asp

Leu 190

Gln

Ser

Gln

Met

Glu 195

Pro

Arg

Thr

His

Pro 200

Thr

<210>9 <211>143 <212> PRT <213> Mus musculus <400>9

Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala 1 5 1015

Trp Leu Thr Val 20

Ser Glu Gly Ala Asn Ala Thr Phe Thr Cys

2530

Ser Leu

Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met

40

Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro 45

Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala

55

Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln 60

Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln 65 70

Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His

80

Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp 85

Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile

95

Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

100

His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu

105 110

Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val

115 120

Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser

125

Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro

130 135

Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln

140

- 159 045238 <210> 10 < 211> 5 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HCDR1 антитела к PD-1 < 400>10

Ser Tyr Ala Ile Ser <210>11 <211>5 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HCDR1 антитела к PD-1 < 400>11

Asp Tyr Val Ile Ser <210>12 < 211>5 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HCDR1 антитела к PD-1 < 400>12

Ser Tyr Val Ile His <210>13 <211>17 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HCDR2 антитела к PD-1 < 400>13

Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

5 1015

Gly <210>14 <211>17 <212> PRT

- 160 045238 <213> Искусственная последовательность <220>

<223> HCDR2 антитела к PD-1 <400>14

Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Ala Asn 1 510

Gly <210>15 <211>17 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> HCDR2 антитела к PD-1 <400>15

Gly Ile Ile Pro Ile Tyr Gly Thr Ala Asn 1 510

Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

Gly <210>16 <211>14 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> HCDR3 антитела к PD-1 <400>16

Pro Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Asp Thr Gly Asn Leu Asp Tyr

510 <210>17 <211>14 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> HCDR3 антитела к PD-1 <400>17

Pro Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Asp Thr Gly Ser Leu Asp Tyr

510 <210>18 <211>11

- 161 045238 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> HCDR3 антитела к PD-1 <400>18

Gly Thr Leu Asp Arg Thr Gly His Leu Asp Tyr

510 <210>19 <211>11 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> HCDR3 антитела к PD-1 <400>19

Gly Tyr Val Arg Ala Thr Gly Met Leu Asp Tyr

510 <210>20 <211>11 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> LCDR1 антитела к PD-1 <400>20

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala

510 <210>21 <211>11 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> LCDR1 антитела к PD-1 <400>21

Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Asn Tyr Leu Ala

510 <210>22 <211>11 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR1 антитела к PD-1 <400> 22

- 162 045238

Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Ser Tyr Leu Ala

510 <210>23 <211>11 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

<223> LCDR1 антитела к PD-1 <400>23

Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Tyr Leu Ala

510 <210>24 <211>11 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> LCDR1 антитела к PD-1 <400>24

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Tyr Leu Ala

510 <210>25 <211>11 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> LCDR1 антитела к PD-1 <400>25

Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Asn Tyr Leu Ala

510 <210>26 <211>7 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR2 антитела к PD-1 < 400>26

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr <210>27 <211>7

- 163 045238 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR2 антитела к PD-1 < 400>27

Asp Ala Ser Asp Arg Ala Thr <210>28 <211>7 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR2 антитела к PD-1 < 400>28

Asp Ala Ser Tyr Arg Ala Thr <210>29 <211>7 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR2 антитела к PD-1 < 400>29

Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr <210>30 <211>7 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR2 антитела к PD-1 < 400>30

Asp Ala Ser Thr Arg Ala Thr <210>31 <211>9 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR3 антитела к PD-1 <400> 31

- 164 045238

Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr 15 <210>32 <211>9 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR3 антитела к PD-1 < 400>32

Gln Gln Arg Asn Tyr Trp Pro Leu Thr <210>33 <211>9 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR3 антитела к PD-1 < 400>33

Gln Gln Arg Gly Asn Trp Pro Leu Thr <210>34 <211>9 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR3 антитела к PD-1 < 400>34

Gln Gln Arg Glu Tyr Trp Pro Leu Thr <210>35 <211>9 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR3 антитела к PD-1 < 400>35

Gln Gln Arg Asp Tyr Trp Pro Leu Thr <210>36 <211>9

- 165 045238 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR3 антитела к PD-1 < 400>36

Gln Gln Arg Gly Tyr Trp Pro Leu Thr <210>37 <211>9 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR3 антитела к PD-1 < 400>37

Gln Gln Arg Trp Asn Trp Pro Leu Thr <210>38 <211>9 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR3 антитела к PD-1 < 400>38

Gln Gln Arg Ala Tyr Trp Pro Leu Thr <210>39 <211>9 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR3 антитела к PD-1 < 400>39

Gln Gln Arg Ala Glu Trp Pro Leu Thr <210>40 <211>9 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR3 антитела к PD-1 <400> 40

- 166 045238

Gln Gln Arg Ser Ala Trp Pro Leu Thr <210> 41 <211> 123 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> PD1H24 < 400> 41

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly 1 5

Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala 20

Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala

40

Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly

55

Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala 65 70

Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 85

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

95

Ala Arg Pro Gly Leu Ala Ala Ala

100

Tyr Asp Thr Gly Asn Leu Asp Tyr

105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

115 120

Val Ser Ser <210> 42 <211> 123 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> PD1H131 <400> 42

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 1 5 10

Lys Lys Pro Gly Ser

Ser Val Lys Val

Ser Cys Lys Ala Ser

Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

- 167 045238

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala

40

Pro Gly Gln

Gly Leu Glu Trp Met

Gly Gly Ile Ile 50

Pro Ile Phe Asp Thr Ala Asn Tyr Ala

60

Gln Lys Phe

Gln Gly Arg Val 65

Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser

75

Thr Ala Tyr

Met Glu Leu Ser

Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 85 90

Tyr Tyr Cys 95

Ala Arg Pro Gly

100

Leu Ala Ala Ala Tyr Asp Thr Gly Asn 105

Leu Asp Tyr 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 <210> 43 <211> 123 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> PD1H3 < 400> 43

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Pro Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Asp Thr Gly Ser Leu Asp Tyr

100 105 110

- 168 045238

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115120 < 210>44 < 211>120 < 212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> PD1H108 <400>44

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

5 1015

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 2530

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 4045

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 5560

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 7580

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 9095

Ala Arg Gly Thr Leu Asp Arg Thr Gly His Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115120 <210>45 <211>120 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> PD1H164 <400> 45

Gln Val Gln Leu 1

Val Gln Ser Gly 5

Ala Glu Val Lys 10

Lys Pro Gly Ser 15

Ser Val Lys Val

Ser Cys Lys Ala Ser

Gly Gly Thr Phe Ser Asp Tyr

- 169 045238

Val Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln

40

Gly Leu Glu Trp Met

Gly Gly Ile Ile 50

Pro Ile Tyr Gly Thr Ala Asn Tyr Ala

60

Gln Lys Phe

Gln Gly Arg Val 65

Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser

75

Thr Ala Tyr

Met Glu Leu Ser

Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 85 90

Tyr Tyr Cys 95

Ala Arg Gly Thr

100

Leu Asp Arg Thr Gly His Leu Asp Tyr 105

Trp Gly Gln 110

Gly Thr Leu Val Thr Val

115

Ser Ser

120 <210> 46 <211> 120 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

<223> PD1H107 < 400> 46

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Val Arg Ala Thr Gly Met Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

- 170 045238

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

120 <210> 47 < 211> 120 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> PD1H163 < 400> 47

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Lys Ser Tyr 20 25 30

Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Val Arg Ala Thr Gly Met Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 <210> 48 <211> 123 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> PD1H170 <400> 48

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 1 5 10

Lys Lys Pro Gly Ser

Ser Val Lys Val

Ser Cys Lys Ala Ser

Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

- 171 045238

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala

40

Pro Gly Gln

Gly Leu Glu Trp Met

Gly Gly Ile Ile 50

Pro Ile Phe Asp Thr Ala Asn Tyr Ala

60

Gln Lys Phe

Gln Gly Arg Val 65

Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser

75

Thr Ala Tyr

Met Glu Leu Ser

Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 85 90

Tyr Tyr Cys 95

Ala Arg Pro Gly

100

Leu Ala Ala Ala Tyr Asp Thr Gly Ser 105

Leu Asp Tyr 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 <210> 49 <211> 107 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> PH9L3 <400> 49

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro 1 5

Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg 20

Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

40

Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr

55

Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 85

Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu

95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val

100

Glu Ile Lys 105

- 172 045238 <210> 50 <211> 107 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> PD1L128 <400>50

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro 1 5 1015

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Asn

2530

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 4045

His Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser 50 5560

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 7075

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Asn Tyr Trp Pro 85 9095

Gly

Tyr

Ile

Gly

Pro 80

Leu

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100105 <210>51 <211>107 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> PD1L101 <400> 51

Glu Ile Val 1

Leu Thr Gln Ser Pro Ala

Thr Leu Ser Leu Ser Pro

15

Glu Arg Ala

Thr Leu Ser Cys Arg Ala

25

Ser Gln Ser Val Asp Ser 30

Leu Ala Trp

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

Gln Ala Pro Arg Leu Leu 45

Lys Asp Ala 50

Ser Asp Arg Ala Thr Gly 55

Ile Pro Ala Arg Phe Ser 60

Gly

Tyr

Ile

Gly

- 173 045238

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 85

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val 100

Gln Gln Arg Gly Asn Trp Pro

95

Glu Ile Lys 105

Pro 80

Leu <210> 52 <211> 107 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> PD1L67 <400>52

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro 1 5 1015

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Ser

2530

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 4045

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser 50 5560

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 7075

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Glu Tyr Trp Pro 85 9095

Gly

Tyr

Ile

Gly

Pro 80

Leu

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100105 <210>53 < 211>107 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

<223> PD1L71 <400> 53

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro

Gly

- 174 045238

Glu Arg Ala

Thr Leu Ser Cys Arg Ala

25

Leu Ala Trp

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

Tyr Asp Ala 50

Ser Tyr Arg Ala Thr Gly 55

Ser Gln Ser Val Arg Ser 30

Gln Ala Pro Arg Leu Leu 45

Ile Pro Ala Arg Phe Ser 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 85

Gln Gln Arg Asp Tyr Trp Pro

95

Tyr

Ile

Gly

Pro 80

Leu

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val

100

Glu Ile Lys 105 <210> 54 <211> 107 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> PD1L109 <400>54

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro 1 5 1015

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser

2530

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 4045

Lys Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser 50 5560

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 7075

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Gly Tyr Trp Pro 85 9095

Gly

Tyr

Ile

Gly

Pro 80

Leu

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

- 175 045238 <210> 55 <211> 107 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> PD1L132 <400> 55

Glu Ile Val Leu Thr 1 5

Gln Ser Pro Ala Thr

Leu Ser Leu Ser Pro

Glu Arg Ala Thr Leu 20

Ser Cys Arg Ala Ser

Gln Ser Val Arg Asn 30

Leu Ala Trp Tyr Gln 35

Gln Lys Pro Gly Gln 40

Ala Pro Arg Leu Leu 45

Tyr Asp Ala Ser Asp 50

Arg Ala Thr Gly Ile 55

Pro Ala Arg Phe Ser 60

Ser Gly Ser Gly Thr 65

Asp Phe Thr Leu Thr 70

Ile Ser Ser Leu Glu 75

Glu Asp Phe Ala Val 85

Tyr Tyr Cys Gln Gln 90

Arg Trp Asn Trp Pro 95

Gly

Tyr

Ile

Gly

Pro 80

Leu

Thr Phe Gly Gln Gly

100

Thr Lys Val Glu Ile

105

Lys <210> 56 <211> 107 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> PD1L148 <400> 56

Glu Ile Val 1

Glu Arg Ala

Leu Ala Trp 35

Tyr Asp Ala

Leu Thr Gln 5

Thr Leu Ser 20

Tyr Gln Gln

Ser Asn Arg

Ser Pro Ala

Cys Arg Ala 25

Lys Pro Gly 40

Ala Thr Gly

Thr Leu Ser 10

Ser Gln Ser

Gln Ala Pro

Ile Pro Ala

Leu Ser Pro

Val Arg Ser

Arg Leu Leu 45

Gly

Tyr

Ile

Gly

Arg Phe Ser

- 176 045238

Ser Gly Ser Gly 65

Glu Asp Phe Ala

Thr Phe Gly Gln

100

Thr Asp Phe Thr 70

Val Tyr Tyr Cys 85

Gly Thr Lys Val

Leu Thr Ile Ser

Gln Gln Arg Asn 90

Ser Leu Glu Pro 80

Tyr Trp Pro Leu 95

Glu Ile Lys 105 <210> 57 <211> 107 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> PD1L133 <400> 57

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala 1 5

Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala 20 25

Ser Gln Ser Val Asp Ser Tyr 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

40

Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 45

His Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly

55

Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 65 70

Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln 85

Gln Arg Asn Tyr Trp Pro Leu 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 <210> 58 < 211> 107 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> PD1L185 <400> 58

- 177 045238

Glu Ile Val 1

Leu Thr Gln Ser Pro Ala

Thr Leu Ser Leu Ser Pro

15

Glu Arg Ala

Thr Leu Ser Cys Arg Ala

25

Ser Gln Ser Val Ser Asn

Leu Ala Trp

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

Gln Ala Pro Arg Leu Leu 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr

55

Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 75

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 85

Gln Gln Arg Ala Tyr Trp Pro

95

Gly

Tyr

Ile

Gly

Pro 80

Leu

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val

100

Glu Ile Lys 105 <210> 59 <211> 107 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> PD1L187 <400>59

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro 1 5 1015

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser

2530

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 4045

Glu Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser 50 5560

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 7075

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ala Glu Trp Pro 85 9095

Gly

Tyr

Ile

Gly

Pro 80

Leu

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

- 178 045238

100

105 <210> 60 <211> 107 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> PD1L86 <400> 60

Glu Ile Val Leu Thr 1 5

Gln Ser Pro Ala Thr

Leu Ser Leu Ser Pro

Glu Arg Ala Thr Leu 20

Ser Cys Arg Ala Ser

Gln Ser Val Ser Ser

Leu Ala Trp Tyr Gln 35

Gln Lys Pro Gly Gln 40

Ala Pro Arg Leu Leu 45

His Asp Ala Ser Thr 50

Arg Ala Thr Gly Ile 55

Pro Ala Arg Phe Ser 60

Ser Gly Ser Gly Thr 65

Asp Phe Thr Leu Thr 70

Ile Ser Ser Leu Glu 75

Glu Asp Phe Ala Val 85

Tyr Tyr Cys Gln Gln 90

Arg Asn Tyr Trp Pro 95

Gly

Tyr

Ile

Gly

Pro 80

Leu

Thr Phe Gly Gln Gly

100

Thr Lys Val Glu Ile

105

Lys <210> 61 <211> 107 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> PD1L168 <400> 61

Glu Ile Val 1

Leu Thr Gln Ser Pro Ala

Thr Leu Ser Leu Ser Pro

15

Glu Arg Ala

Thr Leu Ser Cys Arg Ala

25

Ser Gln Ser Val Asp Asn 30

Leu Ala Trp

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 40

Gln Ala Pro Arg Leu Leu 45

Gly

Tyr

Ile

- 179 045238

His Asp Ala Ser Asn Arg Ala

55

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr 85

Thr	Gly	Ile	Pro	Ala 60	Arg	Phe	Ser	Gly
Thr	Leu	Thr	Ile 75	Ser	Ser	Leu	Glu	Pro 80
Cys	Gln	Gln 90	Arg	Ser	Ala	Trp	Pro 95	Leu

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val

100

Glu Ile Lys 105 <210> 62 <211> 107 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> PD1L190 <400> 62

Glu Ile Val 1

Leu Thr Gln

Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

15

Glu Arg Ala

Thr Leu Ser Cys Arg Ala

25

Leu Ala Trp

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 40

Tyr Asp Ala 50

Ser Asn Arg Ala 55

Thr Gly

Ser Gln Ser Val Ser Asn Tyr 30

Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 45

Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr 85

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 7580

Cys Gln Gln Arg Asn Tyr Trp Pro Leu 9095

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100105 <210>63 <211>117 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> PD1H130 <400> 63

- 180 045238

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Arg

25 30

Asp Met Ser Trp Ile Arg Leu Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Ser 35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Leu Asp Asn 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu 65 70 75

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Ala Ser Pro Tyr Leu Ser Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Gly

Tyr

Val

Tyr 80

Cys

Leu

Val Thr Val Ser Ser

115 <210> 64 <211> 117 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> PD1H129 <400>64

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Arg

2530

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Ser 35 4045

Ala Tyr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Leu Asp Asn 50 5560

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu 65 7075

Gly

Tyr

Val

Tyr 80

- 181 045238

Leu Gln Met Asn

Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

90

Ala Val Tyr Tyr Cys

Ala Ser Pro Tyr Leu Ser Tyr Phe Asp Val

100

Trp Gly Gln Gly Thr Leu

110

105

Val Thr Val Ser Ser

115 <210> 65 <211> 107 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> PD1L62 <400> 65

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro 1 5

Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg

Ala Ser Gln Ser Leu Ser Asp Tyr 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

40

Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 45

Lys Ser Ala Ser Gln Ser Ile Ser

55

Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr 65 70

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 85

Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Tyr

95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu

100

Glu Ile Lys 105 <210> 66 <211> 5 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HCDR1 антитела к PD1 < 400> 66

Arg Tyr Asp Met Ser

- 182 045238 < 210> 67 < 211> 17 < 212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HCDR2 антитела к PD1 < 400>67

Tyr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Leu Asp Asn Val Lys

5 1015

Gly < 210>68 < 211>8 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HCDR3 антитела к PD1 < 400>68

Pro Tyr Leu Ser Tyr Phe Asp Val < 210>69 < 211>11 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR1 антитела к PD1 < 400>69

Arg Ala Ser Gln Ser Leu Ser Asp Tyr Leu His

510 < 210>70 < 211>7 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR2 антитела к PD1 < 400>70

Ser Ala Ser Gln Ser Ile Ser <210>71 <211>9

- 183 045238 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> LCDR3 антитела к PD1 <400> 71

Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Tyr Thr <210> 72 <211> 450 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HC PD1B244 < 400> 72

Gln Val Gln Leu Val

5

Gln Ser Gly Ala Glu

Val Lys Lys Pro Gly

Ser Val Lys Val Ser

Cys Lys Ala Ser Gly

Gly Thr Phe Ser Ser 30

Ala Ile Ser Trp Val 35

Arg Gln Ala Pro Gly 40

Gln Gly Leu Glu Trp 45

Gly Gly Ile Ile Pro 50

Ile Phe Asp Thr Ala 55

Asn Tyr Ala Gln Lys 60

Gln Gly Arg Val Thr 65

Ile Thr Ala Asp Glu 70

Ser Thr Ser Thr Ala 75

Met Glu Leu Ser Ser

Leu Arg Ser Glu Asp 90

Thr Ala Val Tyr Tyr 95

Ala Arg Pro Gly Leu

100

Ala Ala Ala Tyr Asp

105

Thr Gly Ser Leu Asp

110

Trp Gly Gln Gly Thr 115

Leu Val Thr Val Ser

120

Ser Ala Ser Thr Lys

125

Pro Ser Val Phe Pro

130

Leu Ala Pro Cys Ser

135

Arg Ser Thr Ser Glu

140

Thr Ala Ala Leu Gly 145

Cys Leu Val Lys Asp 150

Tyr Phe Pro Glu Pro 155

Thr Val Ser Trp Asn

Ser Gly Ala Leu Thr

Ser Gly Val His Thr

Ser

Tyr

Met

Phe

Tyr 80

Cys

Tyr

Gly

Ser

Val 160

Phe

- 184 045238

165

170

175

Pro

Thr

Asp

Tyr 225

Pro

Ser

Asp

Asn

Val 305

Glu

Lys

Thr

Glu 385

Leu

Ala Val Leu

180

Val Pro Ser

195

His Lys Pro 210

Gly Pro Pro

Ser Val Phe

Arg Thr Pro

260

Pro Glu Val

275

Ala Lys Thr 290

Val Ser Val

Tyr Lys Cys

Thr Ile Ser

340

Leu Pro Pro

355

Cys Leu Val 370

Ser Asn Gly

Asp Ser Asp

Gln Ser Ser

Gly Leu Tyr

185

Ser Leu Ser

Ser Val Val 190

Ser Ser Leu

Ser Asn Thr

215

Cys Pro Pro

230

Leu Phe Pro 245

Glu Val Thr

Gln Phe Asn

Lys Pro Arg

295

Leu Thr Val

310

Lys Val Ser 325

Lys Ala Lys

Ser Gln Glu

Lys Gly Phe

375

Gln Pro Glu

390

Gly Ser Phe 405

Gly Thr Lys 200

Thr Tyr Thr

205

Cys Asn Val

Lys Val Asp

Lys Arg Val

220

Glu Ser Lys

Cys Pro Ala

Pro Lys Pro

250

Cys Val Val

265

Trp Tyr Val 280

Glu Glu Gln

Leu His Gln

Asn Lys Gly

330

Gly Gln Pro

345

Glu Met Thr 360

Tyr Pro Ser

Asn Asn Tyr

Phe Leu Tyr

410

Pro Glu Phe 235

Leu Gly Gly

240

Lys Asp Thr

Leu Met Ile

255

Val Asp Val

Asp Gly Val

285

Phe Asn Ser

300

Asp Trp Leu 315

Leu Pro Ser

Arg Glu Pro

Lys Asn Gln

365

Asp Ile Ala

380

Lys Thr Thr 395

Ser Arg Leu

Ser Gln Glu 270

Glu Val His

Thr Tyr Arg

Asn Gly Lys

320

Ser Ile Glu

335

Gln Val Tyr 350

Val Ser Leu

Val Glu Trp

Pro Pro Val

400

Thr Val Asp

415

- 185 045238

Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

420 425

Cys Ser Val Met

430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

His

Leu

Gly Lys

450 <210> 73 <211> 214 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LC PD1B244 < 400> 73

Glu Ile Val Leu Thr

5

Gln Ser Pro Ala Thr

Leu Ser Leu Ser Pro

Glu Arg Ala Thr Leu 20

Ser Cys Arg Ala Ser

Gln Ser Val Arg Ser 30

Leu Ala Trp Tyr Gln 35

Gln Lys Pro Gly Gln 40

Ala Pro Arg Leu Leu 45

Tyr Asp Ala Ser Asn 50

Arg Ala Thr Gly Ile 55

Pro Ala Arg Phe Ser 60

Ser Gly Ser Gly Thr 65

Asp Phe Thr Leu Thr 70

Ile Ser Ser Leu Glu 75

Glu Asp Phe Ala Val 85

Tyr Tyr Cys Gln Gln 90

Arg Asn Tyr Trp Pro 95

Thr Phe Gly Gln Gly

100

Thr Lys Val Glu Ile

105

Lys Arg Thr Val Ala

110

Pro Ser Val Phe Ile

115

Phe Pro Pro Ser Asp 120

Glu Gln Leu Lys Ser 125

Thr Ala Ser Val Val

130

Cys Leu Leu Asn Asn

135

Phe Tyr Pro Arg Glu

140

Lys Val Gln Trp Lys 145

Val Asp Asn Ala Leu 150

Gln Ser Gly Asn Ser 155

Glu Ser Val Thr Glu

Gln Asp Ser Lys Asp

Ser Thr Tyr Ser Leu

Gly

Tyr

Ile

Gly

Pro 80

Leu

Ala

Gly

Ala

Gln 160

Ser

- 186 045238

165

170

175

Ser

Thr

Leu

Thr 180

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp 185

Tyr

Glu

Lys

His

Lys 190

Val

Ala

Cys

Glu 195

Val

Thr

His

Gln

Gly 200

Leu

Ser

Pro

Val 205

Thr

Lys

Phe

Asn 210

Arg

Gly

Glu

Cys

Tyr

Ser <210> 74 <211> 444 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HC PD1B243 < 400> 74

Glu Val Gln Leu Val

5

Glu Ser Gly Gly Gly

Leu Val Gln Pro Gly

Ser Leu Arg Leu Ser

Cys Ala Ala Ser Gly

Phe Ala Phe Ser Arg 30

Asp Met Ser Trp Val 35

Arg Gln Ala Pro Gly 40

Lys Gly Leu Glu Ser 45

Ala Tyr Ile Ser Gly 50

Gly Gly Ala Asn Thr 55

Tyr Tyr Leu Asp Asn 60

Lys Gly Arg Phe Thr 65

Ile Ser Arg Asp Asn 70

Ala Lys Asn Ser Leu 75

Leu Gln Met Asn Ser

Leu Arg Ala Glu Asp 90

Thr Ala Val Tyr Tyr 95

Ala Ser Pro Tyr Leu

100

Ser Tyr Phe Asp Val

105

Trp Gly Gln Gly Thr

110

Val Thr Val Ser Ser

115

Ala Ser Thr Lys Gly 120

Pro Ser Val Phe Pro

125

Ala Pro Cys Ser Arg 130

Ser Thr Ser Glu Ser

135

Thr Ala Ala Leu Gly 140

Leu Val Lys Asp Tyr 145

Phe Pro Glu Pro Val 150

Thr Val Ser Trp Asn 155

Gly

Tyr

Val

Tyr 80

Cys

Leu

Cys

Ser 160

- 187 045238

Gly

Ser

Leu

Thr

Pro 225

Pro

Thr

Asn

Arg

Val 305

Ser

Lys

Glu

Phe

Glu 385

Phe

Ala Leu

Gly Leu

Gly Thr

195

Lys Val 210

Cys Pro

Pro Lys

Cys Val

Trp Tyr

275

Glu Glu

290

Leu His

Asn Lys

Gly Gln

Glu Met

355

Tyr Pro 370

Asn Asn

Phe Leu

Thr Ser

165

Tyr Ser 180

Lys Thr

Asp Lys

Ala Pro

Pro Lys

245

Val Val 260

Val Asp

Gln Phe

Gln Asp

Gly Leu

325

Pro Arg 340

Thr Lys

Ser Asp

Tyr Lys

Tyr Ser

Gly Val

Leu Ser

Tyr Thr

Arg Val

215

Glu Phe

230

Asp Thr

Asp Val

Gly Val

Asn Ser

295

Trp Leu 310

Pro Ser

Glu Pro

Asn Gln

Ile Ala

375

Thr Thr 390

Arg Leu

His Thr

Ser Val

185

Cys Asn 200

Glu Ser

Leu Gly

Leu Met

Ser Gln

265

Glu Val

280

Thr Tyr

Asn Gly

Ser Ile

Gln Val

345

Val Ser 360

Val Glu

Pro Pro

Thr Val

Phe Pro 170

Val Thr

Val Asp

Lys Tyr

Gly Pro 235

Ile Ser 250

Glu Asp

His Asn

Arg Val

Lys Glu 315

Glu Lys 330

Tyr Thr

Leu Thr

Trp Glu

Val Leu

395

Asp Lys

Ala Val

Val Pro

His Lys

205

Gly Pro 220

Ser Val

Arg Thr

Pro Glu

Ala Lys

285

Val Ser 300

Tyr Lys

Thr Ile

Leu Pro

Cys Leu

365

Ser Asn

380

Asp Ser

Ser Arg

Leu Gln

175

Ser Ser 190

Pro Ser

Pro Cys

Phe Leu

Pro Glu

255

Val Gln 270

Thr Lys

Val Leu

Cys Lys

Ser Lys

335

Pro Ser 350

Val Lys

Gly Gln

Asp Gly

Trp Gln

Ser

Asn

Pro

Phe 240

Val

Phe

Pro

Thr

Val 320

Ala

Gln

Gly

Pro

Ser 400

Glu

- 188 045238

405 410 415

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His

Tyr Thr Gln Lys

435

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

440 <210> 75 <211> 214 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LC PD1B243 < 400> 75

Glu Ile Val Met Thr

5

Gln Ser Pro Ala Thr

Leu Ser Val Ser Pro

Glu Arg Ala Thr Leu 20

Ser Cys Arg Ala Ser

Gln Ser Leu Ser Asp 30

Leu His Trp Tyr Gln 35

Gln Lys Pro Gly Gln 40

Ala Pro Arg Leu Leu 45

Lys Ser Ala Ser Gln 50

Ser Ile Ser Gly Ile 55

Pro Ala Arg Phe Ser 60

Ser Gly Ser Gly Thr 65

Glu Phe Thr Leu Thr 70

Ile Ser Ser Leu Gln 75

Glu Asp Phe Ala Val 85

Tyr Tyr Cys Gln Asn 90

Gly His Ser Phe Pro 95

Thr Phe Gly Gln Gly

100

Thr Lys Leu Glu Ile

105

Lys Arg Thr Val Ala

110

Pro Ser Val Phe Ile

115

Phe Pro Pro Ser Asp

120

Glu Gln Leu Lys Ser 125

Thr Ala Ser Val Val

130

Cys Leu Leu Asn Asn

135

Phe Tyr Pro Arg Glu 140

Lys Val Gln Trp Lys 145

Val Asp Asn Ala Leu 150

Gln Ser Gly Asn Ser 155

Glu Ser Val Thr Glu

165

Gln Asp Ser Lys Asp

170

Ser Thr Tyr Ser Leu

175

Gly

Tyr

Ile

Gly

Ser 80

Tyr

Ala

Gly

Ala

Gln 160

Ser

- 189 045238

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200

Lys His Lys Val 190

Pro Val Thr Lys 205

Tyr

Ser

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 <210> 76 <211> 447 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HC PD1B245 < 400> 76

Gln Val Gln Leu Val

5

Gln Ser Gly Ala Glu

Val Lys Lys Pro Gly

Ser Val Lys Val Ser

Cys Lys Ala Ser Gly

Gly Thr Phe Ser Asp 30

Val Ile Ser Trp Val 35

Arg Gln Ala Pro Gly 40

Gln Gly Leu Glu Trp 45

Gly Gly Ile Ile Pro 50

Ile Tyr Gly Thr Ala 55

Asn Tyr Ala Gln Lys 60

Gln Gly Arg Val Thr 65

Ile Thr Ala Asp Glu 70

Ser Thr Ser Thr Ala 75

Met Glu Leu Ser Ser

Leu Arg Ser Glu Asp 90

Thr Ala Val Tyr Tyr 95

Ala Arg Gly Thr Leu

100

Asp Arg Thr Gly His

105

Leu Asp Tyr Trp Gly

110

Gly Thr Leu Val Thr 115

Val Ser Ser Ala Ser

120

Thr Lys Gly Pro Ser

125

Phe Pro Leu Ala Pro

130

Cys Ser Arg Ser Thr

135

Ser Glu Ser Thr Ala

140

Leu Gly Cys Leu Val 145

Lys Asp Tyr Phe Pro 150

Glu Pro Val Thr Val 155

Ser

Tyr

Met

Phe

Tyr 80

Cys

Gln

Val

Ala

Ser 160

- 190 045238

Trp

Leu

Ser

Pro

Pro 225

Phe

Pro

Val

Thr

Val 305

Cys

Ser

Pro

Val

Gly 385

Asp

Asn Ser Gly

Gln Ser Ser

180

Ser Ser Leu

195

Ser Asn Thr 210

Cys Pro Pro

Leu Phe Pro

Glu Val Thr

260

Gln Phe Asn

275

Lys Pro Arg 290

Leu Thr Val

Lys Val Ser

Lys Ala Lys

340

Ser Gln Glu

355

Lys Gly Phe 370

Gln Pro Glu

Gly Ser Phe

Ala Leu Thr 165

Gly Leu Tyr

Gly Thr Lys

Lys Val Asp

215

Cys Pro Ala

230

Pro Lys Pro 245

Cys Val Val

Trp Tyr Val

Glu Glu Gln

295

Leu His Gln

310

Asn Lys Gly 325

Gly Gln Pro

Glu Met Thr

Tyr Pro Ser

375

Asn Asn Tyr

390

Phe Leu Tyr 405

Ser Gly Val

170

Ser Leu Ser

185

Thr Tyr Thr 200

Lys Arg Val

Pro Glu Phe

Lys Asp Thr

250

Val Asp Val

265

Asp Gly Val 280

Phe Asn Ser

Asp Trp Leu

Leu Pro Ser

330

Arg Glu Pro

345

Lys Asn Gln 360

Asp Ile Ala

Lys Thr Thr

Ser Arg Leu

410

His Thr Phe

Ser Val Val

Cys Asn Val

205

Glu Ser Lys

220

Leu Gly Gly 235

Leu Met Ile

Ser Gln Glu

Glu Val His

285

Thr Tyr Arg

300

Asn Gly Lys 315

Ser Ile Glu

Gln Val Tyr

Val Ser Leu

365

Val Glu Trp

380

Pro Pro Val 395

Thr Val Asp

Pro Ala Val

175

Thr Val Pro 190

Asp His Lys

Tyr Gly Pro

Pro Ser Val

240

Ser Arg Thr

255

Asp Pro Glu 270

Asn Ala Lys

Val Val Ser

Glu Tyr Lys

320

Lys Thr Ile

335

Thr Leu Pro 350

Thr Cys Leu

Glu Ser Asn

Leu Asp Ser

400

Lys Ser Arg

415

- 191 045238

Trp Gln Glu

Gly Asn Val Phe Ser 420

Cys Ser Val Met His Glu Ala

425 430

Leu

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445 <210> 77 <211> 214 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LC PD1B245 < 400> 77

Glu Ile Val Leu Thr

5

Gln Ser Pro Ala Thr

Leu Ser Leu Ser Pro

Glu Arg Ala Thr Leu

Ser Cys Arg Ala Ser

Gln Ser Val Ser Ser

Leu Ala Trp Tyr Gln 35

Gln Lys Pro Gly Gln 40

Ala Pro Arg Leu Leu 45

His Asp Ala Ser Thr 50

Arg Ala Thr Gly Ile 55

Pro Ala Arg Phe Ser 60

Ser Gly Ser Gly Thr 65

Asp Phe Thr Leu Thr 70

Ile Ser Ser Leu Glu 75

Glu Asp Phe Ala Val 85

Tyr Tyr Cys Gln Gln 90

Arg Asn Tyr Trp Pro 95

Thr Phe Gly Gln Gly

100

Thr Lys Val Glu Ile

105

Lys Arg Thr Val Ala

110

Pro Ser Val Phe Ile

115

Phe Pro Pro Ser Asp 120

Glu Gln Leu Lys Ser 125

Thr Ala Ser Val Val

130

Cys Leu Leu Asn Asn

135

Phe Tyr Pro Arg Glu 140

Lys Val Gln Trp Lys 145

Val Asp Asn Ala Leu 150

Gln Ser Gly Asn Ser 155

Glu Ser Val Thr Glu

165

Gln Asp Ser Lys Asp

170

Ser Thr Tyr Ser Leu

175

Gly

Tyr

Ile

Gly

Pro 80

Leu

Ala

Gly

Ala

Gln 160

Ser

- 192 045238

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200

Lys His Lys Val 190

Pro Val Thr Lys 205

Tyr

Ser

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 <210> 78 <211> 443 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Тяжелая цепь антитела TIM3 < 400> 78

Glu Val Gln Leu Leu

5

Glu Ser Gly Gly Gly

Leu Val Gln Pro Gly

Ser Leu Arg Leu Ser

Cys Ala Ala Ser Gly

Phe Thr Phe Ser Ser

Ala Met Ser Trp Val 35

Arg Gln Ala Pro Gly 40

Lys Gly Leu Glu Trp 45

Ser Ala Ile Ser Gly 50

Ser Gly Gly Ser Thr 55

Tyr Tyr Ala Asp Ser 60

Lys Gly Arg Phe Thr 65

Ile Ser Arg Asp Asn 70

Ser Lys Asn Thr Leu 75

Leu Gln Met Asn Ser

Leu Arg Ala Glu Asp 90

Thr Ala Val Tyr Tyr 95

Ala Lys Ser Pro Tyr

100

Ala Pro Leu Asp Tyr

105

Trp Gly Gln Gly Thr

110

Val Thr Val Ser Ser

115

Ala Ser Thr Lys Gly 120

Pro Ser Val Phe Pro

125

Ala Pro Cys Ser Arg 130

Ser Thr Ser Glu Ser

135

Thr Ala Ala Leu Gly 140

Leu Val Lys Asp Tyr 145

Phe Pro Glu Pro Val 150

Thr Val Ser Trp Asn 155

Gly

Tyr

Val

Tyr 80

Cys

Leu

Cys

Ser 160

- 193 045238

Gly

Ser

Phe

Thr

Pro 225

Pro

Cys

Trp

Glu

Leu 305

Asn

Gly

Glu

Tyr

Asn 385

Phe

Ala Leu

Gly Leu

Gly Thr

195

Lys Val 210

Cys Pro

Lys Pro

Val Val

Tyr Val

275

Glu Gln

290

His Gln

Lys Gly

Gln Pro

Met Thr

355

Pro Ser 370

Asn Tyr

Leu Tyr

Thr Ser

165

Tyr Ser 180

Gln Thr

Asp Lys

Ala Pro

Lys Asp

245

Val Asp 260

Asp Gly

Phe Asn

Asp Trp

Leu Pro

325

Arg Glu 340

Lys Asn

Asp Ile

Lys Thr

Ser Lys

405

Gly Val

Leu Ser

Tyr Thr

Thr Val

215

Pro Ala 230

Thr Leu

Val Ser

Val Glu

Ser Thr

295

Leu Asn 310

Ser Ser

Pro Gln

Gln Val

Ala Val

375

Thr Pro 390

Leu Thr

His Thr

Ser Val

185

Cys Asn 200

Glu Arg

Ala Ala

Met Ile

Ala Glu

265

Val His 280

Phe Arg

Gly Lys

Ile Glu

Val Tyr

345

Ser Leu

360

Glu Trp

Pro Met

Val Asp

Phe Pro 170

Val Thr

Val Asp

Lys Cys

Ala Val

Val Pro

His Lys

205

Cys Val 220

Ser Ser

235

Ser Arg 250

Asp Pro

Asn Ala

Val Val

Glu Tyr

315

Lys Thr 330

Thr Leu

Thr Cys

Glu Ser

Leu Asp

395

Lys Ser 410

Val Phe

Thr Pro

Glu Val

Lys Thr

285

Ser Val

300

Lys Cys

Ile Ser

Pro Pro

Leu Val

365

Asn Gly 380

Ser Asp

Arg Trp

Leu Gln

175

Ser Ser 190

Pro Ser

Glu Cys

Leu Phe

Glu Val

255

Gln Phe

270

Lys Pro

Leu Thr

Lys Val

Lys Thr

335

Ser Arg 350

Lys Gly

Gln Pro

Gly Ser

Gln Gln

415

Ser

Asn

Pro

Pro 240

Thr

Asn

Arg

Val

Ser 320

Lys

Glu

Phe

Glu

Phe 400

Gly

- 194 045238

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

420 425 430

Tyr

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 <210> 79 <211> 214 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Легкая цепь антитела TIM-3 <400>79

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu SerPro

5 1015

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val AsnAsp

2530

Leu Ala Trp Tyr Gln 35

Gln Lys Pro Gly Gln 40

Ala Pro Arg Leu Leu 45

Tyr Asp Ala Ser Asn 50

Arg Ala Thr Gly Ile 55

Pro Ala Arg Phe Ser 60

Ser Gly Ser Gly Thr 65

Asp Phe Thr Leu Thr 70

Ile Ser Ser Leu Glu 75

Glu Asp Phe Ala Val 85

Tyr Tyr Cys Gln Gln 90

Gly Gly His Ala Pro 95

Thr Phe Gly Gln Gly

100

Thr Lys Val Glu Ile

105

Lys Arg Thr Val Ala

110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120

Gln Leu Lys Ser 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135

Tyr Pro Arg Glu 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155

Ser Gly Asn Ser

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170

Thr Tyr Ser Leu

175

Gly

Tyr

Ile

Gly

Pro 80

Ile

Ala

Gly

Ala

Gln 160

Ser

- 195 045238

Ser Thr Leu Thr Leu Ser 180

Ala Cys Glu Val Thr His 195

Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 185

Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

200 205

Lys Val 190

Thr Lys

Tyr

Ser

Phe Asn Arg

210

Gly Glu Cys <210> 80 <211> 450 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Тяжелая цепь антитела TIM-3 < 400> 80

Glu Val Gln Leu Val

5

Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly

15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser

25

Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Met Pro 35 40

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp 50 55

Lys Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp 65 70

Gly Tyr Ser Phe Thr Ser 30

Gly Lys Gly Leu Glu Trp 45

Ile Arg Tyr Thr Gln Asn 60

Lys Ser Ile Ser Thr Ala 75

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr 85 90 95

Ala Arg Trp Glu Lys

100

Ser Thr Thr Val Val Gln Arg Asn Tyr Phe

105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val

115 120

Ser Ser Ala Ser Thr

125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

130 135

Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 145 150

Cys Ser Arg Ser Thr Ser 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 155

Glu

Tyr

Met

Phe

Tyr 80

Cys

Asp

Lys

Glu

Pro 160

Thr

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

Ser Gly Val His

- 196 045238

165

175

170

Phe

Val

Lys 225

Ser

Asp

Asn

Val 305

Glu

Lys

Thr

Glu

385

Leu

Pro Ala Val

180

Thr Val Pro

195

Asp His Lys 210

Cys Cys Val

Ser Val Phe

Arg Thr Pro

260

Pro Glu Val

275

Ala Lys Thr 290

Val Ser Val

Tyr Lys Cys

Thr Ile Ser

340

Leu Pro Pro

355

Cys Leu Val 370

Ser Asn Gly

Asp Ser Asp

Leu Gln Ser

Ser Gly Leu

185

Tyr Ser Leu

Ser Ser Val 190

Ser Ser Asn

Pro Ser Asn

215

Glu Cys Pro

230

Leu Phe Pro 245

Glu Val Thr

Gln Phe Asn

Lys Pro Arg

295

Leu Thr Val

310

Lys Val Ser 325

Lys Thr Lys

Ser Arg Glu

Lys Gly Phe

375

Gln Pro Glu

390

Gly Ser Phe 405

Phe Gly Thr 200

Gln Thr Tyr

205

Thr Cys Asn

Thr Lys Val

Pro Cys Pro

Pro Lys Pro

250

Cys Val Val

265

Trp Tyr Val 280

Glu Glu Gln

Leu His Gln

Asn Lys Gly

330

Gly Gln Pro

345

Glu Met Thr 360

Tyr Pro Ser

Asn Asn Tyr

Phe Leu Tyr

410

Asp Lys Thr 220

Ala Pro Pro 235

Lys Asp Thr

Val Asp Val

Asp Gly Val

285

Phe Asn Ser

300

Asp Trp Leu 315

Leu Pro Ser

Arg Glu Pro

Lys Asn Gln

365

Asp Ile Ala

380

Lys Thr Thr 395

Ser Arg Leu

Val Glu Arg

Ala Ala Ala

240

Leu Met Ile

255

Ser Ala Glu 270

Glu Val His

Thr Phe Arg

Asn Gly Lys

320

Ser Ile Glu

335

Gln Val Tyr 350

Val Ser Leu

Val Glu Trp

Pro Pro Met

400

Thr Val Asp

415

- 197 045238

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

420 425

Cys Ser Val Met

430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

His

Pro

Gly Lys

450 <210> 81 <211> 213 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Легкая цепь антитела TIM-3 < 400> 81

Asp Ile Gln Met Thr 1 5

Gln Ser Pro Ser Ser

Leu Ser Ala Ser Val

Asp Arg Val Thr Ile

Thr Cys Lys Ala Ser

Glu Asn Val Gly Thr 30

Val Ser Trp Tyr Gln 35

Gln Lys Pro Gly Lys 40

Ala Pro Lys Leu Leu 45

Tyr Gly Ala Ser Asn 50

Arg Tyr Thr Gly Val 55

Pro Ser Arg Phe Ser 60

Ser Gly Ser Gly Thr 65

Asp Phe Thr Leu Thr 70

Ile Ser Ser Leu Gln 75

Glu Asp Phe Ala Thr 85

Tyr Tyr Cys Gly Gln 90

Ser Tyr Ser Tyr Pro 95

Phe Gly Gln Gly Thr

100

Lys Leu Glu Ile Lys

105

Arg Thr Val Ala Ala

110

Ser Val Phe Ile Phe

115

Pro Pro Ser Asp Glu 120

Gln Leu Lys Ser Gly 125

Ala Ser Val Val Cys

130

Leu Leu Asn Asn Phe

135

Tyr Pro Arg Glu Ala

140

Val Gln Trp Lys Val 145

Asp Asn Ala Leu Gln 150

Ser Gly Asn Ser Gln 155

Ser Val Thr Glu Gln

Asp Ser Lys Asp Ser

Thr Tyr Ser Leu Ser

Gly

Phe

Ile

Gly

Pro 80

Thr

Pro

Thr

Lys

Glu 160

Ser

- 198 045238

165

175

170

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200205

Asn Arg Gly Glu Cys

210 <210>82 <211>5 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Род HCDR1 PD-1 <220>

< 221> 1MISC_FEATURE < 222> (1)..(1) < 223> Xaa может представлять собой Ser или Asp <220>

< 221> 1MISC_FEATURE < 222> (3)..(3) < 223> Xaa может представлять собой Val или Ala <220>

< 221> 1MISC_FEATURE < 222> (5)..(5) < 223> Xaa может представлять собой His или Ser < 400>82

Xaa Tyr Xaa Ile Xaa <210>83 <211>17 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Род HCDR2 PD-1 <220>

< 221> MISC_FEATURE < 222> (6)..(6) < 223> Xaa может представлять собой Tyr или Phe <220>

< 221> MISC_FEATURE < 222> (7)..(7) <223> Xaa может представлять собой Gly или Asp

- 199 045238 <400>83

Gly Ile Ile Pro Ile Xaa Xaa Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

5 1015

Gly <210>84 <211>14 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Род 1 HCDR3 PD-1 <220>

< 221> MISC_FEATURE < 222> (11)..(11) <223> Xaa представляет собой Asn или Ser <400>84

Pro Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Asp Thr Gly Xaa Leu Asp Tyr

510 <210>85 <211>11 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Род 2 HCDR3 PD-1 <220>

< 221> MISC_FEATURE < 222> (2)..(2) < 223> Xaa представляет собой Thr или Tyr <220>

< 221> MISC_FEATURE < 222> (3)..(3) < 223> Xaa представляет собой Leu или Val <220>

< 221> MISC_FEATURE < 222> (4)..(4) < 223> Xaa представляет собой Asp или Arg <220>

< 221> MISC_FEATURE < 222> (5)..(5) < 223> Xaa представляет собой Arg или Ala <220>

< 221> MISC_FEATURE < 222> (8)..(8)

- 200 045238 < 223> Xaa представляет собой His или Met <400>85

Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Gly Xaa Leu Asp Tyr <210>86 <211>11 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Род LCDR1 PD-1 <220>

<221>

<222>

<223>

MISC_FEATURE (7) . . (7)

Xaa представляет собой Ser, Arg или Asp <220>

< 221> MISC_FEATURE < 222> (8)..(8) <223> Xaa представляет собой Ser или Asn <400>86

Arg Ala Ser Gln Ser Val Xaa Xaa Tyr Leu Ala

510 <210>87 <211>7 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Род LCDR2 PD-1 <220>

< 221> MISC_FEATURE < 222> (4)..(4) < 223> Xaa представляет собой Asn, Asp, Tyr, Ser или Thr < 400>87

Asp Ala Ser Xaa Arg Ala Thr <210>88 <211>9 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Род LCDR3 PD-1 <220>

- 201 045238 < 221> MISC_FEATURE < 222> (4) .. (4) < 223> Xaa представляет собой Ser, Asn, Gly, Glu, Asp, Trp или Ala <220>

< 221> MISC_FEATURE < 222> (5)..(5) < 223> Xaa представляет собой Asn, Tyr, Glu или Ala < 400>88

Gln Gln Arg Xaa Xaa Trp Pro Leu Thr <210>89 <211>179 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>89

Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu 1 5

Val Gly Gln Asn Ala Tyr Leu Pro

15

Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro 20

Gly Asn Leu Val Pro Val Cys Trp 25 30

Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe

40

Glu Cys Gly Asn Val Val Leu Arg 45

Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr

55

Trp Thr Ser Arg Tyr Trp Leu Asn 60

Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val 65 70

Ser Leu Thr Ile Glu Asn Val Thr

80

Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys 85

Cys Arg Ile Gln Ile Pro Gly Ile

95

Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu

100

Lys Leu Val Ile Lys Pro Ala Lys

105 110

Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln

115 120

Arg Asp Phe Thr Ala Ala Phe Pro

125

Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His

130 135

Gly Pro Ala Glu Thr Gln Thr Leu

140

Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu

145 150

Thr Gln Ile Ser Thr Leu Ala Asn

155 160

Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala

Asn Asp Leu Arg Asp Ser Gly Ala

- 202 045238

165

175

170

Thr Ile Arg <210> 90 <211> 5 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HCDR1 антитела к TIM-3 <400>90

Asn Tyr Trp Met Ser <210>91 <211>5 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HCDR1 антитела к TIM-3 < 400>91

Ser Tyr Ala Met Ser <210>92 <211>5 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> HCDR1 антитела к TIM-3 <400>92

Gly Tyr Trp Met His <210>93 <211>5 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> HCDR1 антитела к TIM-3 <400> 93

Asp Tyr Trp Met Ser

5

- 203 045238 <210> 94 <211> 5 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HCDR1 антитела к TIM-3 < 400>94

Ser Tyr Val Met Tyr <210>95 <211>6 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HCDR1 антитела к TIM-3 < 400>95

Ser Asp Tyr Ala Trp Asn <210>96 <211>5 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HCDR1 антитела к TIM-3 < 400>96

Asp Thr Tyr Leu His <210>97 <211>5 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HCDR1 антитела к TIM-3 < 400>97

Ser Tyr Trp Met Gln <210>98 <211>5 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> HCDR1 антитела к TIM-3

- 204 045238 <400>98

Ser Tyr Gly Val His 15 <210>99 <211>17 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> HCDR2 антитела к TIM-3 <400>99

Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp 1 510

Gly <210>100 <211>17 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> HCDR2 антитела к TIM-3 <400>100

Ala Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp 1 510

Ser Val Lys 15

Gly <210>101 <211>17 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HCDR2 антитела к TIM-3 < 400> 101

Val Ile Lys Tyr Ser Gly Gly Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly <210> 102 <211> 17

- 205 045238 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

<223> HCDR2 антитела к TIM-3 <400>102

Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 1 5 1015

Gly <210>103 <211>16 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> HCDR2 антитела к TIM-3 <400>103

Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Arg Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 1 5 1015 <210>104 <211>17 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HCDR2 антитела к TIM-3 <400>104

Arg Ile Asp Pro Thr Asn Gly Asn Ile Lys Tyr Asp Pro Lys Phe

5 1015

Gly <210>105 < 211>17 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

<223> HCDR2 антитела к TIM-3 <400> 105

Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ile Arg Tyr Thr Gln Asn Phe

5 10 15

Lys

Ser

Gln

Lys

Gly

- 206 045238 <210> 106 <211> 16 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> HCDR2 антитела к TIM-3 <400>106

Val Ile Trp Ser Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser

5 1015 <210>107 <211>10 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HCDR2 антитела к TIM-3 < 400>107

Asp His Trp Asp Pro Asn Phe Leu Asp Tyr

510 < 210>108 < 211>8 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

<223> HCDR3 антитела к TIM-3 <400>108

Ser Pro Tyr Ala Pro Leu Asp Tyr 15 <210>109 <211>10 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> HCDR3 антитела к TIM-3 <400>109

Asn Glu Glu Pro Asp Asp Arg Leu Asp Tyr

510 <210>110 <211>7 <212> PRT <213> Искусственная последовательность

- 207 045238 <220>

<223> HCDR3 антитела к TIM-3 <400>110

Gly Thr Asn Trp Leu Asp Tyr 15 <210>111 < 211>8 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HCDR3 антитела к TIM-3 < 400>111

Glu Leu Glu Gly Val Phe Asp Tyr <210>112 <211>10 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HCDR3 антитела к TIM-3 < 400>112

Asp Asp Tyr Asp Val Ala Pro Phe Ala Tyr 1 510 < 210>113 < 211>6 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HCDR3 антитела к TIM-3 < 400>113

Gly Gly Asn Phe Asp Tyr <210>114 <211>8 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HCDR3 антитела к TIM-3 < 400> 114

Pro Tyr Tyr Gly Phe Phe Asp Tyr

- 208 045238 < 210> 115 < 211> 15 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HCDR3 антитела к TIM-3 < 400>115

Trp Glu Lys Ser Thr Thr Val Val Gln Arg Asn Tyr Phe Asp Tyr 1 5 1015 < 210>116 < 211>12 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HCDR3 антитела к TIM-3 < 400>116

Gln Ala Asn Tyr Arg Tyr Asp Ser Ala Met Asp Tyr

510 < 210>117 < 211>12 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

<223> LCDR1 антитела к TIM-3 <400>117

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala

510 <210>118 <211>11 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> LCDR1 антитела к TIM-3 <400>118

Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Asp Tyr Leu Ala

510 <210>119 <211>17 <212> PRT <213> Искусственная последовательность

- 209 045238 <220>

<223> LCDR1 антитела к TIM-3 <400>119

Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Ala Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu 1 5 1015

Ala <210>120 <211>12 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> LCDR1 антитела к TIM-3 <400>120

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Ser Thr Leu Ala

510 <210>121 <211>15 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> LCDR1 антитела к TIM-3 <400>121

Arg Ala Ser Glu Ser Leu Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Tyr Ile His

5 1015 <210>122 <211>11 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> LCDR1 антитела к TIM-3 <400>122

Gln Ala Thr Gln Asp Ile Val Lys Asn Leu Asn

510 <210>123 <211>11 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR1 антитела к TIM-3

- 210 045238 <400>123

Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala 1 510 < 210>124 < 211>11 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR1 антитела к TIM-3 < 400>124

Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Phe Val Ser

510 < 210>125 < 211>15 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR1 антитела к TIM-3 < 400>125

Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn 1 5 1015 < 210>126 < 211>7 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR2 антитела к TIM-3 < 400>126

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr <210>127 <211>7 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR2 антитела к TIM-3 < 400> 127

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr

5

- 211 045238 <210> 128 <211> 7 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR2 антитела к TIM-3 < 400>128

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser <210>129 <211>7 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR2 антитела к TIM-3 < 400>129

Thr Ala Ser Ser Arg Ala Thr <210>130 <211>7 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR2 антитела к TIM-3 < 400>130

Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser <210>131 <211>7 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR2 антитела к TIM-3 < 400>131

Tyr Val Thr Glu Leu Ala Glu <210>132 <211>7 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> LCDR2 антитела к TIM-3

- 212 045238 <400>132

Ser Ala Thr Tyr Arg Tyr Thr 15 <210>133 <211>7 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR2 антитела к TIM-3 < 400>133

Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr <210>134 <211>7 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR2 антитела к TIM-3 < 400>134

Thr Ala Ala Asn Leu Gln Ser < 210>135 < 211>9 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR3 антитела к TIM-3 < 400>135

Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Thr <210>136 <211>9 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR3 антитела к TIM-3 < 400> 136

Gln Gln Gly Gly His Ala Pro Ile Thr

5

- 213 045238 <210> 137 <211> 9 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR3 антитела к TIM-3 <400> 137

Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr 1 5 <210>138 <211>280 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>138

Ser Glu Val Glu Tyr 1 5

Arg Ala Glu Val Gly

Gln Asn Ala Tyr Leu

Cys Phe Tyr Thr Pro 20

Ala Ala Pro Gly Asn

Leu Val Pro Val Cys 30

Gly Lys Gly Ala Cys 35

Pro Val Phe Glu Cys 40

Gly Asn Val Val Leu 45

Thr Asp Glu Arg Asp 50

Val Asn Tyr Trp Thr 55

Ser Arg Tyr Trp Leu 60

Gly Asp Phe Arg Lys 65

Gly Asp Val Ser Leu 70

Thr Ile Glu Asn Val 75

Leu Ala Asp Ser Gly 85

Ile Tyr Cys Cys Arg 90

Ile Gln Ile Pro Gly 95

Met Asn Asp Glu Lys

100

Phe Asn Leu Lys Leu

105

Val Ile Lys Pro Ala

110

Val Thr Pro Ala Pro

115

Thr Arg Gln Arg Asp

120

Phe Thr Ala Ala Phe

125

Arg Met Leu Thr Thr 130

Arg Gly His Gly Pro 135

Ala Glu Thr Gln Thr

140

Gly Ser Leu Pro Asp 145

Ile Asn Leu Thr Gln 150

Ile Ser Thr Leu Ala 155

Glu Leu Arg Asp Ser

165

Arg Leu Ala Asn Asp

170

Leu Arg Asp Ser Gly

175

Pro

Trp

Arg

Asn

Thr 80

Ile

Lys

Pro

Leu

Asn 160

Ala

- 214 045238

Thr Ile Arg Ile Gly

180

Ile Tyr Ile Gly Ala

185

Gly Ile Cys Ala Gly

190

Ala Leu Ala Leu Ile

195

Phe Gly Ala Leu Ile 200

Phe Lys Trp Tyr Ser

205

Ser Lys Glu Lys Ile 210

Gln Asn Leu Ser Leu

215

Ile Ser Leu Ala Asn

220

Pro Pro Ser Gly Leu 225

Ala Asn Ala Val Ala 230

Glu Gly Ile Arg Ser 235

Glu Asn Ile Tyr Thr

245

Ile Glu Glu Asn Val

250

Tyr Glu Val Glu Glu

255

Asn Glu Tyr Tyr Cys

260

Tyr Val Ser Ser Arg

265

Gln Gln Pro Ser Gln

270

Leu

His

Leu

Glu 240

Pro

Leu Gly Cys Arg Phe Ala Met Pro

275280 <210>139 <211>9 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR3 антитела к TIM-3 < 400>139

Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Trp Thr < 210>140 < 211>9 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR3 антитела к TIM-3 < 400>140

Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Phe Thr <210>141 <211>9 <212> PRT <213> Искусственная последовательность

- 215 045238 <220>

< 223> LCDR3 антитела к TIM-3 < 400>141

Leu Gln Phe Tyr Glu Phe Pro Leu Thr 15 < 210>142 < 211>9 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR3 антитела к TIM-3 < 400>142

Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr < 210>143 < 211>8 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR3 антитела к TIM-3 < 400>143

Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Thr < 210>144 < 211>8 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LCDR3 антитела к TIM-3 < 400>144

Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Thr < 210>145 < 211>119 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность < 220>

< 223> TM3H21 < 400> 145

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

5 10 15

- 216 045238

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 20 25

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 35 40

Thr Phe Ser Asn Tyr 30

Gly Leu Glu Trp Val 45

Ser Ala Ile Ser

Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp 55 60

Ser Val

Lys Gly Arg Phe 65

Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

75

Leu Tyr 80

Leu Gln Met Asn

Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90

Tyr Cys 95

Ala Lys Asp His

100

Trp Asp Pro Asn Phe Leu Asp Tyr Trp Gly

105 110

Gln Gly

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 <210> 146 <211> 117 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> TM3H24 < 400> 146

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly 1 5

Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20

Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala

40

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly

55

Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 65 70

Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala 85

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

95

- 217 045238

Ala Lys Ser Pro Tyr Ala Pro Leu Asp Tyr Trp

100105

Gly Gln Gly Thr Leu

110

Val Thr Val Ser Ser

115 < 210>147 < 211>116 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность < 220>

< 223> TM3H30 < 400>147

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 2530

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 4045

Ser Ala Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 5560

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 7580

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 9095

Ala Lys Gly Thr Asn Trp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105110

Thr Val Ser Ser

115 < 210>148 < 211>119 < 212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> TM3H31 <400> 148

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

5 10 15

- 218 045238

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20

Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30

Ala Met

Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 35 40

Gly Leu Glu Trp Val

Ser Ala Ile Ser

Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp 55 60

Ser Val

Lys Gly Arg Phe 65

Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

75

Leu Tyr 80

Leu Gln Met Asn

Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90

Tyr Cys 95

Ala Lys Asn Glu

100

Glu Pro Asp Asp Arg Leu Asp Tyr Trp Gly

105 110

Gln Gly

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 < 210> 149 < 211> 117 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> TM3H65 < 400> 149

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly 1 5

Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20

Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala

40

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 45

Ser Val Ile Lys Tyr Ser Gly Gly

55

Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 65 70

Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala 85

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

95

- 219 045238

Ala Lys Glu

Leu Glu Gly Val Phe Asp Tyr Trp

100 105

Gly Gln Gly Thr Leu

110

Val Thr Val Ser Ser

115 <210> 150 <211> 119 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> TM3H141 <400>150

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Leu Lys Pro Gly Ala

5 1015

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 2530

Val Met Tyr Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 4045

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 5560

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 7580

Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 9095

Thr Arg Asp Asp Tyr Asp Val Ala Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 <210>151 <211>115 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> TM3H96 <400> 151

Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

5 10 15

- 220 045238

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val 20

Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser

30

Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro

40

Gly Asn Lys Leu Glu 45

Met Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Arg Thr

55

Ser Tyr Asn Pro Ser 60

Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr 65 70

Ser Lys Asn Gln Phe 75

Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp 85 90

Thr Ala Thr Tyr Tyr 95

Thr Ser Gly Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105

Gln Gly Thr Thr Leu

110

Asp

Trp

Leu

Phe 80

Cys

Thr

Val Ser Ser

115 <210>

<211>

<212>

<213>

152

117

PRT

Искусственная последовательность <220>

<223> TM3H99 <400> 152

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly

5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe His Ile Lys Asp

25 30

Tyr Leu His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp 35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Thr Asn Gly Asn Ile Lys Tyr Asp Pro Lys 50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ser Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala 65 70 75

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Ala

Thr

Ile

Phe

Tyr 80

Cys

- 221 045238

Ala Arg Pro

Tyr Tyr Gly Phe Phe Asp Tyr Trp

100 105

Gly Gln Gly Thr Thr

110

Leu Thr Val Ser Ser

115 <210> 153 <211> 130 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> TM3H144 <400> 153

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ile Arg Tyr Thr Gln Asn Phe 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Trp Glu Lys Ser Thr Thr Val Val Gln Arg Asn Tyr Phe Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser

115 120

Ser Cys Arg Arg Glu

125

Cys Thr

130 <210> 154 <211> 120 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> TM3H102

- 222 045238 <400> 154

Gln Val Gln Leu Lys 1 5

Glu Ser Gly Pro Gly

Leu Val Ala Pro Ser

Ser Leu Ser Ile Thr

Cys Thr Ile Ser Gly 25

Phe Ser Leu Thr Ser

Gly Val His Trp Val 35

Arg Gln Pro Pro Gly 40

Lys Gly Leu Glu Trp 45

Val Val Ile Trp Ser 50

Asp Gly Ser Thr Thr 55

Tyr Asn Ser Ala Leu 60

Ser Arg Leu Ser Ile 65

Ser Lys Asp Asn Ser 70

Lys Ser Gln Val Phe 75

Lys Met Asn Ser Leu 85

Gln Thr Asp Asp Thr 90

Ala Met Tyr Tyr Cys 95

Arg Gln Ala Asn Tyr

100

Arg Tyr Asp Ser Ala

105

Met Asp Tyr Trp Gly

110

Gln

Tyr

Leu

Lys

Leu 80

Ala

Gln

Gly Thr Ser Val Thr 115

Val Ser Ser

120 <210>

<211>

<212>

<213>

155

108

PRT

Искусственная последовательность <220>

<223> PH9L1 <400> 155

Glu Ile Val Leu 1

Thr Gln Ser Pro Gly 5

Thr Leu Ser Leu Ser Pro

15

Glu Arg Ala Thr 20

Leu Ser Cys Arg Ala

Ser Gln Ser Val Ser Ser

Tyr Leu Ala Trp

Tyr Gln Gln Lys Pro

Ile Tyr Gly Ala 50

Ser Ser Arg Ala Thr 55

Gly Ser Gly Ser 65

Gly Thr Asp Phe Thr 70

Gly Gln Ala Pro Arg Leu 45

Gly Ile Pro Asp Arg Phe 60

Leu Thr Ile Ser Arg Leu 75

Gly

Ser

Leu

Ser

Glu 80

- 223 045238

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser 85 9095

Pro

Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100105 <210>156 <211>107 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> TM3L33 <400>156

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro

5 1015

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Asp

2530

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 4045

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser 50 5560

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 7075

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gly His Ala Pro 85 9095

Gly

Tyr

Ile

Gly

Pro 80

Ile

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100105 <210> 157 <211> 113 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> PYYL6 <400> 157

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu

5 10 15

Glu Arg Ala Thr

Ile Asn Cys Lys Ser

Ser Gln Ser Val Leu Ala

Gly

Ser

- 224 045238

Ser Asn Asn Lys Asn Tyr 35

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 40

Pro Pro Lys Leu Leu Ile 50

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 55 60

Lys Pro Gly 45

Glu Ser Gly

Pro Asp Arg Phe Ser Gly 65 70

Ser Gly Ser Gly Thr Asp 75

Phe Thr Leu

Ile Ser Ser Leu Gln Ala

Glu Asp Val Ala Val Tyr 90

Tyr Cys Gln 95

Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu

100

Thr Phe Gly Gln Gly Thr

105

Lys Val Glu

110

Gln

Val

Thr 80

Gln

Ile

Lys <210> 158 <211> 108 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> TM3L12 <400> 158

Glu Ile Val Leu Thr 1 5

Gln Ser Pro Gly Thr

Leu Ser Leu Ser Pro

Glu Arg Ala Thr Leu 20

Ser Cys Arg Ala Ser

Gln Ser Val Ser Asn

Thr Leu Ala Trp Tyr 35

Gln Gln Lys Pro Gly 40

Gln Ala Pro Arg Leu 45

Ile Tyr Thr Ala Ser 50

Ser Arg Ala Thr Gly 55

Ile Pro Asp Arg Phe 60

Gly Ser Gly Ser Gly 65

Thr Asp Phe Thr Leu 70

Thr Ile Ser Arg Leu 75

Pro Glu Asp Phe Ala 85

Val Tyr Tyr Cys Gln 90

Gln Ser Tyr Thr Ser 95

Gly

Ser

Leu

Ser

Glu 80

Pro

Trp Thr Phe Gly Gln

100

Gly Thr Lys Val Glu

105

Ile Lys

- 225 045238 <210> 159 <211> 111 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> TM3L61 <400> 159

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser 1 5 10

Leu Ala Val Ser Leu

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser

25

Glu Ser Leu Asp Ser 30

Gly Asn Ser Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln

40

Lys Pro Gly Gln Pro 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu

55

Glu Ser Gly Val Pro 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp 65 70

Phe Thr Leu Thr Ile 75

Pro Val Glu Ala Asp Asp Pro Ala Thr Tyr 85 90

Tyr Cys Gln Gln Asn 95

Gly

Tyr

Pro

Ala

Asp 80

Asn

Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr

100 105

Lys Leu Glu Ile Lys

110 <210>

<211>

<212>

<213>

160

107

PRT

Искусственная последовательность <220>

<223> TM3L62 <400> 160

Asp Ile Val Met Thr

5

Gln Ser

Pro Ser Ser Met Ser Ala Ser Leu

15

Asp Arg Ile Thr Ile 20

Thr Cys

Gln Ala Thr Gln Asp Ile Val Lys

30

Leu Asn Trp Tyr Gln 35

Gln Lys

Pro Gly Lys Pro Pro Ser Phe Leu 40 45

His Tyr Val Thr Glu 50

Leu Ala

Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 60

Gly

Asn

Ile

Gly

- 226 045238

Ser Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu 65 70 75

Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Tyr Glu Phe Pro 85 90 95

Ser 80

Leu

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 <210> 161 <211> 107 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> TM3L52 <400> 161

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val 1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr

25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu 35 40 45

Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln 65 70 75

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro 85 90 95

Gly

Ala

Ile

Gly

Ala 80

Tyr

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 <210> 162 <211> 105 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> TM3L67 < 400> 162

Asp Val Gln Met Ile Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val

Gly

- 227 045238

Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr

25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr 50 55 60

Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln 65 70 75

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro 85 90 95

Phe

Ile

Gly

Ala 80

Thr

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Met

100 105 <210> 163 <211> 111 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> TM3L64 <400> 163

Asp Ile Gln Met 1

Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu

10 15

Gln Arg Ala Thr 20

Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr 25 30

Gly Asp Ser Tyr

Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro

45

Lys Leu Leu Ile 50

Tyr Thr Ala Ala Asn Leu Gln Ser Gly Ile Pro

60

Arg Phe Ser Gly 65

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile

75

Pro Val Glu Glu

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser 85 90 95

Gly

Asp

Pro

Ala

His 80

Asn

Glu Asp Pro Phe

100

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

105 110

- 228 045238 <210> 164 <211> 5 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Род HCDR1 TIM-3 <220>

< 221> MISC_FEATURE < 222> (1)..(1) < 223> Xaa представляет собой Asn, Ser, Gly или Asp <220>

< 221> MISC_FEATURE < 222> (3)..(3) < 223> Xaa представляет собой Trp или Ala <220>

< 221> MISC_FEATURE < 222> (5)..(5) < 223> Xaa представляет собой Ser или His < 400>164

Xaa Tyr Xaa Met Xaa <210>165 <211>17 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Род HCDR2 TIM-3 <220>

< 221> MISC_FEATURE < 222> (1)..(1) < 223> Xaa представляет собой Ala или Val <220>

< 221> MISC_FEATURE < 222> (3)..(3) < 223> Xaa представляет собой Ser или Lys <220>

< 221> MISC_FEATURE < 222> (4)..(4) < 223> Xaa представляет собой Gly или Tyr <220>

< 221> MISC_FEATURE < 222> (9)..(9) < 223> Xaa представляет собой Thr или Lys < 400> 165

- 229 045238

Xaa Ile Xaa Xaa Ser Gly Gly Ser Xaa Tyr 1 5 10

Tyr Ala Asp Ser Val Lys

Gly <210> 166 <211> 10 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Род HCDR3 TIM-3 <220>

< 221> MISC_FEATURE < 222> (1)..(1) < 223> Xaa представляет собой < 220>

< 221> MISC_FEATURE < 222> (2)..(2) < 223> Xaa представляет собой < 220>

< 221> MISC_FEATURE < 222> (3)..(3) < 223> Xaa представляет собой < 220>

< 221> MISC_FEATURE < 222> (4)..(4) < 223> Xaa представляет собой < 220>

< 221> MISC_FEATURE < 222> (5)..(5) < 223> Xaa представляет собой < 220>

< 221> MISC_FEATURE < 222> (6)..(6) < 223> Xaa представляет собой < 220>

< 221> MISC_FEATURE < 222> (7) .. (7) < 223> Xaa представляет собой < 220>

< 221> MISC_FEATURE < 222> (8)..(8) < 223> Xaa представляет собой < 400> 166

Asp, Ser, Asn, Gly или Glu

His, Pro, Glu, Thr или Leu

Trp, Glu, Asn или удален

Asp, Pro или удален

Pro, Tyr, Asp или удален

Asn, Ala, Asp, Gly или удален

Phe, Pro, Arg, Trp или Val

Leu или Phe

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr 1 5 10

- 230 045238 <210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<223>

167

PRT

Искусственная последовательность

Род LCDR1 TIM-3 <220>

<221>

<222>

<223>

<220>

<221>

<222>

<223>

<220>

<221>

<222>

<223>

<220>

<221>

<222>

<223>

<220>

<221>

<222>

<223>

<220>

<221>

<222>

<223>

<220>

<221>

<222>

<223>

<220>

<221>

<222>

<223>

<220>

<221>

<222>

<223>

<220>

<221>

<222>

<223>

<220>

<221>

<222>

<223>

MISC_FEATURE (1) . . (1)

Xaa представляет собой Arg или Lys

MISC_FEATURE (2) .. (2)

Xaa представляет собой Ala или Ser

MISC_FEATURE (7) . . (7)

Xaa представляет собой Ser, Asn или Leu

MISC_FEATURE (8) . . (8)

Xaa представляет собой Ser, Ala, Asn или

MISC_FEATURE (9) . . (9)

Xaa представляет собой Ser или удален

MISC_FEATURE (10)..(10)

Xaa представляет собой Ser или удален

MISC_FEATURE (11)..(11)

Xaa представляет собой Asn или удален

MISC_FEATURE (12)..(12)

Xaa представляет собой Asn или удален

MISC_FEATURE (13)..(13)

Xaa представляет собой Lys или удален

MISC_FEATURE (14) . . (14)

Xaa представляет собой Ser, Asn или Asp

MISC_FEATURE (15)..(15)

Xaa представляет собой Tyr или Thr удален

- 231 045238 <400>167

Xaa Xaa Ser Gln Ser Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu

5 1015

Ala <210>168 <211>7 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Род LCDR2 TIM-3 <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1)

<223>	Xaa	представляет	собой	Gly,	Asp, Trp или Thr
<220> <221> <222> <223>	MISC (4) . Xaa	_FEATURE . (4) представляет	собой	Ser,	Asn или Thr
<220> <221> <222> <223>	MISC (6) . Xaa	_FEATURE . (6) представляет	собой	Ala	или Glu
<220> <221> <222> <223>	MISC (7) . Xaa	_FEATURE . (7) представляет	собой	Thr	или Ser

<400> 168

Xaa Ala Ser Xaa Arg Xaa Xaa 15 <210>169 <211>9 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Род LCDR3 TIM-3 <220>

< 221> MISC_FEATURE < 222> (3)..(3) < 223> Xaa представляет собой Tyr, Gly или Ser <220>

< 221> MISC_FEATURE < 222> (4)..(4)

- 232 045238 < 223> Xaa представляет собой Gly или Tyr <220>

< 221> MISC_FEATURE < 222> (5)..(5) < 223> Xaa представляет собой Ser, His или Thr <220>

< 221> MISC_FEATURE < 222> (6)..(6) < 223> Xaa представляет собой Ser, Ala или Thr <220>

< 221> MISC_FEATURE < 222> (8)..(8) < 223> Xaa представляет собой Leu, Ile или Trp < 400>169

Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr < 210>170 < 211>98 < 212> PRT < 213> Homo sapiens <400>170

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

5 1015

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 2530

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 4045

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 5560

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 7580

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 9095

Ala Arg <210>171 <211>95 <212> PRT <213> Homo sapiens

- 233 045238 <400> 171

Glu Ile Val 1

Glu Arg Ala

Leu Thr Gln

Thr Leu Ser 20

Leu Ala Trp

Tyr Gln Gln

Tyr Asp Ala 50

Ser Asn Arg

Ser Gly Ser 65

Gly Thr Asp

Glu Asp Phe

Ala Val Tyr

Ser Pro Ala

Cys Arg Ala 25

Lys Pro Gly 40

Ala Thr Gly 55

Phe Thr Leu

Tyr Cys Gln

Thr Leu Ser 10

Ser Gln Ser

Gln Ala Pro

Ile Pro Ala

Thr Ile Ser

Gln Arg Ser 90

Leu Ser Pro

Val Ser Ser

Arg Leu Leu 45

Arg Phe Ser

Ser Leu Glu

Asn Trp Pro <210>

<211>

<212>

<213>

172

124

PRT

Искусственная последовательность <220>

<223> TM3H162 <400> 172

Glu Val Gln Leu Val 1 5

Gln Ser Gly Ala Glu

Val Lys Lys Pro Gly

Ser Leu Lys Ile Ser 20

Cys Lys Gly Ser Gly 25

Tyr Ser Phe Thr Ser 30

Trp Met Gln Trp Val 35

Arg Gln Met Pro Gly 40

Lys Gly Leu Glu Trp 45

Gly Ala Ile Tyr Pro 50

Gly Asp Gly Asp Ile 55

Arg Tyr Thr Gln Asn 60

Lys Gly Gln Val Thr 65

Ile Ser Ala Asp Lys 70

Ser Ile Ser Thr Ala 75

Leu Gln Trp Ser Ser 85

Leu Lys Ala Ser Asp 90

Thr Ala Met Tyr Tyr 95

Ala Arg Trp Glu Lys

100

Ser Thr Thr Val Val

105

Gln Arg Asn Tyr Phe

110

Gly

Tyr

Ile

Gly

Pro 80

Glu

Tyr

Met

Phe

Tyr 80

Cys

Asp

- 234 045238

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

120 < 210> 173 < 211> 106 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> TM3L85 <400> 173

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro 1 5

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys 20

Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Phe 25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

40

Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr

55

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 85

Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Thr

95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu

100

Ile Lys 105 <210>174 <211>98 < 212> PRT < 213> Homo sapiens < 400>174

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly 1 5

Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro

40

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly

Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

- 235 045238

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

65

70

75

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

85

90

95

Ala

Lys

Tyr 80

Cys <210>175 <211>98 < 212> PRT < 213> Homo sapiens <400>175

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly

5 1015

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly

2530

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp 35 4045

Gly Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys 50 5560

Gln Gly Arg Val Thr Ser Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala 65 7075

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Val Val Tyr Tyr 85 9095

Ala

Tyr

Met

Phe

Tyr 80

Cys

Ala Arg <210>176 <211>99 < 212> PRT < 213> Homo sapiens <400>176

Gln Val Gln Leu Gln Glu

5

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val 20

Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 10 15

Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser 25 30

Gln

Gly

- 236 045238

Asp Tyr Tyr

Trp Ser Trp Ile

Arg Gln Pro Pro 40

Gly Lys Gly Leu 45

Trp Ile Gly 50

Tyr Ile Tyr Tyr 55

Ser Gly Ser Thr

Tyr Tyr Asn Pro 60

Leu Lys Ser 65

Arg Val Thr Ile

Ser Val Asp Thr 75

Ser Lys Asn Gln

Ser Leu Lys

Leu Ser Ser Val

Thr Ala Ala Asp 90

Thr Ala Val Tyr 95

Glu

Ser

Phe 80

Tyr

Cys Ala Arg <210>177 <211>98 <212> PRT <213> Homo <400>177

Gln Val Gln 1 sapiens

Leu Val Gln Ser

Gly Ala Glu Val

Lys Lys Pro Gly 15

Ser Val Lys

Val Ser Cys Lys 20

Ala Ser Gly Tyr 25

Thr Phe Thr Ser

Ala Met His

Trp Val Arg Gln

Ala Pro Gly Gln 40

Arg Leu Glu Trp 45

Gly Trp Ile 50

Asn Ala Gly Asn 55

Gly Asn Thr Lys

Tyr Ser Gln Lys 60

Gln Gly Arg 65

Val Thr Ile Thr

Arg Asp Thr Ser 75

Ala Ser Thr Ala

Met Glu Leu

Ser Ser Leu Arg 85

Ser Glu Asp Thr 90

Ala Val Tyr Tyr 95

Ala

Tyr

Met

Phe

Tyr 80

Cys

Ala Arg <210> 178 <211> 100 <212> PRT <213> Homo <400> 178 sapiens

- 237 045238

Gln 1	Val	Thr	Leu	Lys 5	Glu	Ser	Gly	Pro
Thr	Leu	Thr	Leu 20	Thr	Cys	Thr	Val	Ser 25
Arg	Met	Gly 35	Val	Ser	Trp	Ile	Arg 40	Gln
Trp	Leu 50	Ala	His	Ile	Phe	Ser 55	Asn	Asp
Leu 65	Lys	Ser	Arg	Leu	Thr 70	Ile	Ser	Lys
Val Leu Cys Ala <210> <211> <212> <213> <400>	Thr Arg 179 98 PRT Homo 179	Met Thr 85 Ile 100 sapiens	Asn	Met	Asp	Pro
Glu 1	Val	Gln	Leu	Val 5	Gln	Ser	Gly	Ala
Ser	Leu	Lys	Ile 20	Ser	Cys	Lys	Gly	Ser 25
Trp	Ile	Gly 35	Trp	Val	Arg	Gln	Met 40	Pro
Gly	Ile 50	Ile	Tyr	Pro	Gly	Asp 55	Ser	Asp
Gln 65	Gly	Gln	Val	Thr	Ile 70	Ser	Ala	Asp
Leu	Gln	Trp	Ser	Ser 85	Leu	Lys	Ala	Ser

Leu Val Lys Pro Thr Glu

Phe Ser Leu Ser Asn Ala

Pro Gly Lys Ala Leu Glu 45

Lys Ser Tyr Ser Thr Ser 60

Thr Ser Lys Ser Gln Val 75 80

Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 95

Val Lys Lys Pro Gly Glu

Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 30

Lys Gly Leu Glu Trp Met 45

Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 60

Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

80

Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 95

Ala Arg

- 238 045238 <210>180 <211>96 < 212> PRT < 213> Homo sapiens < 400>180

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala 20 25

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

40

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

55

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 85 <210>181 <211>96 < 212> PRT < 213> Homo sapiens < 400>181

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala 20 25

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

40

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

55

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 85

Leu Ser Leu Ser Pro Gly

Gln Ser Val Ser Ser Ser

Gln Ala Pro Arg Leu Leu 45

Ile Pro Asp Arg Phe Ser 60

Thr Ile Ser Arg Leu Glu 75 80

Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 95

Leu Ser Leu Ser Pro Gly

Gln Ser Val Ser Ser Ser

Gln Ala Pro Arg Leu Leu 45

Ile Pro Asp Arg Phe Ser 60

Thr Ile Ser Arg Leu Glu 75 80

Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 95

- 239 045238 <210>182 <211>96 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>182

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala 20 25

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

40

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly

55

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 65 70

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 85 <210>183 <211>95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>183

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala 20 25

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

40

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly

55

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe 65 70

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 85

Leu Ser Ala Ser Val Gly

Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 30

Ala Pro Lys Leu Leu Ile 45

Pro Ser Arg Phe Ser Gly 60

Ile Ser Ser Leu Gln Pro

80

Ser Tyr Ser Thr Pro Ile 95

Leu Ser Ala Ser Val Gly

Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 30

Ala Pro Lys Leu Leu Ile 45

Pro Ser Arg Phe Ser Gly 60

Ile Ser Ser Leu Gln Pro

80

Tyr Asp Asn Leu Pro 95 <210> 184

- 240 045238 <211> 127 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> VH mAb, связывающего gp120 <400>184

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 1015

Ser Val Lys Val Ser Cys Gln Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Ser Asn Phe 20 2530

Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Phe Glu Trp Met

4045

Gly Trp Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asn Lys Glu Phe Ser Ala Lys Phe 50 5560

Gln Asp Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr 65 70 7580

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 9095

Ala Arg Val Gly Pro Tyr Ser Trp Asp Asp Ser Pro Gln Asp Asn Tyr

100 105110

Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Ile Val Ser Ser

115 120125 <210>185 <211>108 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> VL mAb, связывающего gp120 <400>185

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

5 1015

Glu Arg Ala Thr Phe Ser Cys Arg Ser 2025

Arg Val Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro 3540

Ser His Ser Ile Arg Ser Arg 30

Gly Gln Ala Pro Arg Leu Val 45

- 241 045238

Ile

His 50

Gly

Val

Ser

Asn Arg 55

Ala

Ser

Gly

Ile

Ser 60

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly 65

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr 70

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr 75

Ile

Thr

Arg

Val

Glu 80

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala 85

Leu

Tyr

Cys

Gln 90

Val

Tyr

Gly

Ala

Ser 95

Ser

Tyr

Thr

Phe

Gly 100

Gln

Gly

Thr

Lys

Leu 105

Glu

Arg

Lys

<210> 186 <211> 449 <212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HC1 биспецифического mAb < 400> 186

Gln Val 1

Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala 5

Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

15

Ser Val

Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser

25

Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 30

Ala Ile

Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro

40

Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 45

Gly Gly Ile 50

Ile Pro

Ile Phe Asp Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

60

Gln Gly Arg Val 65

Thr

Ile Thr Ala Asp Glu

Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 9095

Ala Arg Pro Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Asp Thr Gly Ser Leu Asp Tyr

100 105110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser

130 135140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

- 242 045238

145

Thr

Pro

Thr

Asp

Cys 225

Ser

Arg

Pro

Ala

Val 305

Tyr

Thr

Leu

Cys

Ser

385

150

155

160

Val Ser Trp Asn Ser

165

Ala Val Leu Gln Ser

180

Val Thr Ser Ser Asn

195

His Lys Pro Ser Asn 210

Cys Val Glu Cys Pro

230

Val Phe Leu Phe Pro

245

Thr Pro Glu Val Thr

260

Glu Val Gln Phe Asn

275

Lys Thr Lys Pro Arg 290

Ser Val Leu Thr Val

310

Lys Cys Lys Val Ser

325

Ile Ser Lys Thr Lys 340

Pro Pro Ser Arg Glu

355

Leu Val Lys Gly Phe 370

Asn Gly Gln Pro Glu

390

Gly Ala Leu Thr Ser

170

Gly Val His Thr Phe

175

Ser Gly Leu Tyr Ser

185

Leu Ser Ser Val Val

190

Phe Gly Thr Gln Thr

200

Tyr Thr Cys Asn Val

205

Thr Lys Val Asp Lys 215

Thr Val Glu Arg Lys 220

Pro Cys Pro Ala Pro

235

Pro Ala Ala Ala Ser

240

Pro Lys Pro Lys Asp

250

Thr Leu Met Ile Ser

255

Cys Val Val Val Asp

265

Trp Tyr Val Asp Gly

280

Glu Glu Gln Phe Asn 295

Leu His Gln Asp Trp

315

Asn Lys Gly Leu Pro

330

Gly Gln Pro Arg Glu

345

Glu Met Thr Lys Asn 360

Tyr Pro Ser Asp Ile 375

Asn Asn Tyr Lys Thr

395

Val Ser Ala Glu Asp

270

Val Glu Val His Asn

285

Ser Thr Phe Arg Val 300

Leu Asn Gly Lys Glu

320

Ser Ser Ile Glu Lys

335

Pro Gln Val Tyr Thr

350

Gln Val Ser Leu Thr

365

Ala Val Glu Trp Glu 380

Thr Pro Pro Met Leu

400

- 243 045238

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser 405

Phe

Leu

Tyr

Ser 410

Lys

Leu

Thr

Val

Asp 415

Ser

Arg

Trp

Gln

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

420

425

430

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gln

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

435

440

445

Lys

Glu

Gly

Lys <210> 187 < 211> 443 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HC1 биспецифического mAb < 400> 187

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Ser

Leu

Arg

Leu 20

Ser

Cys

Ala

Ser 25

Gly

Phe

Ala

Phe

Ser 30

Arg

Asp

Met

Ser 35

Trp

Val

Arg

Gln

Ala 40

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu 45

Glu

Ser

Ala

Tyr 50

Ile

Ser

Gly

Gly 55

Ala

Asn

Thr

Tyr

Tyr 60

Leu

Asp

Asn

Lys Gly Arg Phe Thr

Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu 70 75

Leu Gln Met Asn

Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Ala Ser Pro

Val Thr Val

115

Tyr Leu Ser 100

Ser Ser Ala

Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr

105 110

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

120 125

Ala Pro Cys

130

Ser Arg Ser

Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 135 140

Gly

Tyr

Val

Tyr 80

Cys

Leu

Cys

Ser

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

- 244 045238

145

Gly

Ser

Phe

Thr

Pro 225

Pro

Cys

Trp

Glu

Leu 305

Asn

Gly

Glu

Tyr

Asn 385

Ala Leu Thr

Gly Leu Tyr

180

Gly Thr Gln

195

Lys Val Asp 210

Cys Pro Ala

Lys Pro Lys

Val Val Val

260

Tyr Val Asp

275

Glu Gln Phe 290

His Gln Asp

Lys Gly Leu

Gln Pro Arg

340

Met Thr Lys

355

Pro Ser Asp 370

Asn Tyr Lys

150

155

160

Ser Gly Val 165

Ser Leu Ser

Thr Tyr Thr

Lys Thr Val

215

Pro Pro Ala

230

Asp Thr Leu 245

Asp Val Ser

Gly Val Glu

Asn Ser Thr

295

Trp Leu Asn

310

Pro Ser Ser 325

Glu Pro Gln

Asn Gln Val

Ile Ala Val

375

Thr Thr Pro

390

His Thr Phe

170

Pro Ala Val

Leu Gln Ser

175

Ser Val Val

185

Cys Asn Val 200

Glu Arg Lys

Ala Ala Ser

Met Ile Ser

250

Ala Glu Asp

265

Val His Asn 280

Phe Arg Val

Gly Lys Glu

Ile Glu Lys

330

Val Tyr Thr

345

Ser Leu Thr 360

Glu Trp Glu

Pro Met Leu

Thr Val Thr

Ser Ser Asn 190

Asp His Lys

205

Pro Ser Asn

Cys Cys Val

220

Ser Val Phe 235

Arg Thr Pro

Pro Glu Val

Ala Lys Thr

285

Val Ser Val

300

Tyr Lys Cys 315

Thr Ile Ser

Leu Pro Pro

Cys Leu Val

365

Ser Asn Gly

380

Asp Ser Asp 395

Glu Cys Pro

Leu Phe Pro

240

Glu Val Thr

255

Gln Phe Asn 270

Lys Pro Arg

Leu Thr Val

Lys Val Ser

320

Lys Thr Lys

335

Ser Arg Glu 350

Lys Gly Phe

Gln Pro Glu

Gly Ser Phe

400

- 245 045238

Leu Leu Tyr

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410

Trp Gln Gln

415

Asn Val Phe

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425

His Asn His

430

Gly

Tyr

Thr Gln Lys

435

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

440 <210> 188 <211> 214 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> LC1 биспецифического mAb <400> 188

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro 1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu 20

Ser Cys Arg Ala Ser

Gln Ser Val Arg Ser 30

Leu Ala Trp Tyr Gln 35

Gln Lys Pro Gly Gln 40

Ala Pro Arg Leu Leu 45

Tyr Asp Ala Ser Asn 50

Arg Ala Thr Gly Ile 55

Pro Ala Arg Phe Ser 60

Ser Gly Ser Gly Thr 65

Asp Phe Thr Leu Thr 70

Ile Ser Ser Leu Glu 75

Glu Asp Phe Ala Val 85

Tyr Tyr Cys Gln Gln 90

Arg Asn Tyr Trp Pro 95

Thr Phe Gly Gln Gly

100

Thr Lys Val Glu Ile

105

Lys Arg Thr Val Ala

110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

Glu

Phe

Gln 155

Ser

Gln Leu Lys Ser 125

Tyr Pro Arg Glu 140

Ser Gly Asn Ser

Thr Tyr Ser Leu

Gly

Tyr

Ile

Gly

Pro 80

Leu

Ala

Gly

Ala

Gln 160

Ser

- 246 045238

165

170

175

Ser

Thr

Leu

Thr 180

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp 185

Tyr

Glu

Lys

His

Lys 190

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu 195

Val

Thr

His

Gln

Gly 200

Leu

Ser

Pro

Val 205

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn 210

Arg

Gly

Glu

Cys

<210> 189 <211> 214 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> LC1 биспецифического mAb <400> 189

Glu Ile Val Met 1

Thr Gln 5

Glu Arg Ala Thr 20

Leu Ser

Leu His Trp Tyr

Gln Gln

Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro 1015

Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Ser Asp 2530

Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 4045

Gly

Tyr

Ile

Lys

Ser 65

Ser Ala 50

Gly Ser

Ser Gln

Gly Thr

Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

60

Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 85

Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Tyr

95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu

100

Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

115 120

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

125

Thr Ala

130

Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

135

Tyr Pro Arg Glu Ala 140

Lys Val 145

Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

150 155

Ser Gly Asn Ser Gln

160

- 247 045238

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 <210>190 <211>450 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HC2 биспецифического mAb < 400>190

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

5 1015

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 2530

Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 4045

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ile Arg Tyr Thr Gln Asn Phe 50 5560

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 7580

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 9095

Ala Arg Trp Glu Lys Ser Thr Thr Val Val Gln Arg Asn Tyr Phe Asp

100 105110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu

130 135140

- 248 045238

Ser 145

Val

Phe

Val

Lys 225

Ser

Asp

Asn

Val 305

Glu

Lys

Thr

Glu 385

Thr Ala Ala

Thr Val Ser

Pro Ala Val

180

Thr Val Thr

195

Asp His Lys 210

Cys Cys Val

Ser Val Phe

Arg Thr Pro

260

Pro Glu Val

275

Ala Lys Thr 290

Val Ser Val

Tyr Lys Cys

Thr Ile Ser

340

Leu Pro Pro

355

Cys Leu Val 370

Ser Asn Gly

Leu Gly Cys

150

Trp Asn Ser 165

Leu Gln Ser

Ser Ser Asn

Pro Ser Asn

215

Glu Cys Pro

230

Leu Phe Pro 245

Glu Val Thr

Gln Phe Asn

Lys Pro Arg

295

Leu Thr Val

310

Lys Val Ser 325

Lys Thr Lys

Ser Arg Glu

Lys Gly Phe

375

Gln Pro Glu

390

Leu Val Lys

Gly Ala Leu

170

Ser Gly Leu

185

Phe Gly Thr 200

Thr Lys Val

Pro Cys Pro

Pro Lys Pro

250

Cys Val Val

265

Trp Tyr Val 280

Glu Glu Gln

Leu His Gln

Asn Lys Gly 330

Gly Gln Pro 345

Glu Met Thr 360

Tyr Pro Ser

Asn Asn Tyr

Asp Tyr Phe 155

Thr Ser Gly

Tyr Ser Leu

Gln Thr Tyr

205

Asp Lys Thr 220

Ala Pro Pro 235

Lys Asp Thr

Val Asp Val

Asp Gly Val

285

Phe Asn Ser

300

Asp Trp Leu 315

Leu Pro Ser

Arg Glu Pro

Lys Asn Gln

365

Asp Ile Ala

380

Lys Thr Thr 395

Pro Glu Pro

160

Val His Thr

175

Ser Ser Val 190

Thr Cys Asn

Val Glu Arg

Ala Ala Ala

240

Leu Met Ile

255

Ser Ala Glu 270

Glu Val His

Thr Phe Arg

Asn Gly Lys

320

Ser Ile Glu

335

Gln Val Tyr 350

Val Ser Leu

Val Glu Trp

Pro Pro Met

400

- 249 045238

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp 405 410415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440445

Gly Lys

450 <210>191 <211>443 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HC2 биспецифического mAb < 400> 191

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly 1 5

Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20

Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala

40

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly

55

Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 65 70

Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala 85

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

95

Ala Lys Ser Pro Tyr Ala Pro Leu

100

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

115 120

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

125

Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser

130 135

Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys

140

- 250 045238

Leu 145

Gly

Ser

Phe

Thr

Pro 225

Pro

Cys

Trp

Glu

Leu 305

Asn

Gly

Glu

Tyr

Asn 385

Val Lys Asp

Ala Leu Thr

Gly Leu Tyr

180

Gly Thr Gln

195

Lys Val Asp 210

Cys Pro Ala

Lys Pro Lys

Val Val Val

260

Tyr Val Asp

275

Glu Gln Phe 290

His Gln Asp

Lys Gly Leu

Gln Pro Arg

340

Met Thr Lys

355

Pro Ser Asp 370

Asn Tyr Lys

Tyr Phe Pro

150

Glu Pro Val

Thr Val Ser 155

Trp Asn Ser

160

Ser Gly Val 165

Ser Leu Ser

Thr Tyr Thr

Lys Thr Val

215

Pro Pro Ala

230

Asp Thr Leu 245

Asp Val Ser

Gly Val Glu

Asn Ser Thr

295

Trp Leu Asn

310

Pro Ser Ser 325

Glu Pro Gln

Asn Gln Val

Ile Ala Val

375

Thr Thr Pro

390

His Thr Phe

170

Pro Ala Val

Leu Gln Ser

175

Ser Val Val

185

Cys Asn Val 200

Glu Arg Lys

Ala Ala Ser

Met Ile Ser

250

Ala Glu Asp

265

Val His Asn 280

Phe Arg Val

Gly Lys Glu

Ile Glu Lys

330

Val Tyr Thr

345

Ser Leu Thr 360

Glu Trp Glu

Pro Met Leu

Thr Val Thr

Ser Ser Asn 190

Asp His Lys

205

Pro Ser Asn

Cys Cys Val

220

Ser Val Phe 235

Arg Thr Pro

Pro Glu Val

Ala Lys Thr

285

Val Ser Val

300

Tyr Lys Cys 315

Thr Ile Ser

Leu Pro Pro

Cys Leu Val

365

Ser Asn Gly

380

Asp Ser Asp 395

Glu Cys Pro

Leu Phe Pro

240

Glu Val Thr

255

Gln Phe Asn 270

Lys Pro Arg

Leu Thr Val

Lys Val Ser

320

Lys Thr Lys

335

Ser Arg Glu 350

Lys Gly Phe

Gln Pro Glu

Gly Ser Phe

400

- 251 045238

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp 405

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425

Lys Ser Arg 410

Glu Ala Leu

Trp Gln Gln Gly

415

His Asn His Tyr 430

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435440

Gly Lys <210>192 <211>450 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HC2 биспецифического mAb < 400> 192

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Gln

Ser

Gly

Ala

Glu 10

Val

Lys

Pro

Gly 15

Glu

Ser

Leu

Lys

Ile 20

Ser

Cys

Lys

Gly

Ser 25

Gly

Tyr

Ser

Phe

Thr 30

Ser

Tyr

Trp

Met

Gln 35

Trp

Val

Arg

Gln

Met 40

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu 45

Glu

Trp

Met

Gly

Ala 50

Ile

Tyr

Pro

Gly

Asp 55

Gly

Asp

Ile

Arg

Tyr 60

Thr

Gln

Asn

Phe

Lys 65

Gly

Gln

Val

Thr

Ile 70

Ser

Ala

Asp

Lys

Ser 75

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr 80

Leu

Gln

Trp

Ser

Ser 85

Leu

Lys

Ala

Ser

Asp 90

Thr

Ala

Met

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Arg

Trp

Glu 100

Lys

Ser

Thr

Val 105

Val

Gln

Arg

Asn

Tyr 110

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly 115

Gln

Gly

Thr

Val 120

Thr

Val

Ser

Ala 125

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro 130

Ser

Val

Phe

Pro

Leu 135

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg 140

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser 145

Thr

Ala

Leu

Gly 150

Cys

Leu

Val

Lys

Asp 155

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro 160

- 252 045238

Val

Phe

Val

Lys 225

Ser

Asp

Asn

Val 305

Glu

Lys

Thr

Glu

385

Leu

Thr Val Ser

Trp Asn Ser 165

Gly Ala Leu

170

Thr Ser Gly

Val His Thr

175

Pro Ala Val

180

Thr Val Thr

195

Asp His Lys 210

Cys Cys Val

Ser Val Phe

Arg Thr Pro

260

Pro Glu Val

275

Ala Lys Thr 290

Val Ser Val

Tyr Lys Cys

Thr Ile Ser

340

Leu Pro Pro

355

Cys Leu Val 370

Ser Asn Gly

Asp Ser Asp

Leu Gln Ser

Ser Gly Leu

185

Tyr Ser Leu

Ser Ser Val 190

Ser Ser Asn

Pro Ser Asn

215

Glu Cys Pro

230

Leu Phe Pro 245

Glu Val Thr

Gln Phe Asn

Lys Pro Arg

295

Leu Thr Val

310

Lys Val Ser 325

Lys Thr Lys

Ser Arg Glu

Lys Gly Phe

375

Gln Pro Glu

390

Gly Ser Phe 405

Phe Gly Thr 200

Gln Thr Tyr

205

Thr Cys Asn

Thr Lys Val

Pro Cys Pro

Pro Lys Pro

250

Cys Val Val

265

Trp Tyr Val 280

Glu Glu Gln

Leu His Gln

Asn Lys Gly 330

Gly Gln Pro 345

Glu Met Thr 360

Tyr Pro Ser

Asn Asn Tyr

Phe Leu Tyr

410

Asp Lys Thr 220

Ala Pro Pro 235

Lys Asp Thr

Val Asp Val

Asp Gly Val

285

Phe Asn Ser

300

Asp Trp Leu 315

Leu Pro Ser

Arg Glu Pro

Lys Asn Gln

365

Asp Ile Ala

380

Lys Thr Thr 395

Ser Arg Leu

Val Glu Arg

Ala Ala Ala

240

Leu Met Ile

255

Ser Ala Glu 270

Glu Val His

Thr Phe Arg

Asn Gly Lys

320

Ser Ile Glu

335

Gln Val Tyr 350

Val Ser Leu

Val Glu Trp

Pro Pro Met

400

Thr Val Asp

415

- 253 045238

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

420 425

Cys Ser Val Met His

430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

435 440

Ser Leu Ser Leu Ser Pro

445

Gly Lys

450 <210> 193 <211> 213 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> LC2 биспецифического mAb <400> 193

Asp Val Gln Met Ile Gln Ser Pro Lys 1 5

Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala 20 25

Ser 10	Met	Ser	Met	Ser	Val 15	Gly
Ser	Glu	Asn	Val	Gly 30	Thr	Phe

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe 65 70

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His 85

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu

100

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 7580

Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Thr 9095

Glu Met Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 105110

Ser

Val

Phe

115

Ile

Phe

Pro

Ser

120

Asp

Glu

Gln

Leu

Lys 125

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

130

Val

Cys

Leu

135

Asn

Phe

Tyr

Pro

140

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

145

Gln

Trp

Lys

Val

Asp

150

Asn

Ala

Leu

Gln

Ser

155

Gly

Asn

Ser

Gln

Glu

160

- 254 045238

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Ser

Ala

Phe

Asn Arg Gly Glu Cys

210 <210> 194 <211> 214 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> LC2 биспецифического mAb <400> 194

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro 1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu

Ser Cys Arg Ala Ser

Gln Ser Val Asn Asp 30

Leu Ala Trp Tyr Gln 35

Gln Lys Pro Gly Gln 40

Ala Pro Arg Leu Leu 45

Tyr Asp Ala Ser Asn 50

Arg Ala Thr Gly Ile 55

Pro Ala Arg Phe Ser 60

Ser Gly Ser Gly Thr 65

Asp Phe Thr Leu Thr 70

Ile Ser Ser Leu Glu 75

Glu Asp Phe Ala Val 85

Tyr Tyr Cys Gln Gln 90

Gly Gly His Ala Pro 95

Thr Phe Gly Gln Gly

100

Thr Lys Val Glu Ile

105

Lys Arg Thr Val Ala

110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

Ser Asp Glu

Gln Leu Lys Ser

115

120

125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

130 135

Asn Asn Phe

Tyr Pro Arg Glu 140

Gly

Tyr

Ile

Gly

Pro 80

Ile

Ala

Gly

Ala

- 255 045238

Lys

145

Val

Gln

Trp

Lys

Val

150

Asp

Asn

Ala

Leu

Gln

155

Ser

Gly

Asn

Ser

Gln

160

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

165

Gln

Asp

Ser

Lys

Asp

170

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

175

Ser

Thr

Leu

Thr

180

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

185

Tyr

Glu

Lys

His

Lys 190

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

195

Val

Thr

His

Gln

Gly 200

Leu

Ser

Pro

Val

205

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

210

Arg

Gly

Glu

Cys <210> 195 <211> 213 <212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LC2 биспецифического mAb <400> 195

Asp Ile Gln Met

Thr Gln 5

Asp Arg Val Thr

Ile Thr

Val Ser Trp Tyr

Gln Gln

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 10

Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val 25

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 40 45

Ser Val Gly

Gly Thr Phe 30

Leu Leu Ile

Tyr Gly Ala 50

Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro 55

Ser Arg Phe Ser Gly

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70

Ile Ser Ser Leu Gln Pro

80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 85

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu

100

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

115

Cys	Gly	Gln 90	Ser	Tyr	Ser	Tyr	Pro 95	Thr
Glu	Ile 105	Lys	Arg	Thr	Val	Ala 110	Ala	Pro
Ser 120	Asp	Glu	Gln	Leu	Lys 125	Ser	Gly	Thr

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

- 256 045238

130

135

140

Val Gln Trp 145

Ser Val Thr

Thr Leu Thr

Cys Glu Val 195

Lys Val Asp Asn Ala Leu

150

Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165

Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185

Thr His Gln Gly Leu Ser

200

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

155 160

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

170 175

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 190

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

205

Asn Arg Gly Glu Cys

210 < 210> 196 < 211> 369 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> ДНК PD1H170 < 400>196 caggtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaaagtg60 agctgcaaag cgagcggcgg cacctttagc agctatgcga ttagctgggt gcgccaggcg120 ccgggccagg gcctggaatg gatgggcggc attattccga tttttgacac cgcgaactat180 gcgcagaaat ttcagggccg cgtgaccatt accgcggatg aaagcaccag caccgcgtat240 atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgcggtgt attattgcgc gcgccctggt300 ctcgctgcgg cttatgatac tggttccttg gactattggg gccagggcac cctggtgacc360 gtgagcagc369 < 210>197 < 211>321 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> ДНК PD1L148 < 400>197 gaaattgtgc tgacccagag cccggcgacc ctgagcctga gcccgggcga acgcgcgacc60 ctgagctgcc gcgcgagcca gagcgttcgc tcctacctgg cgtggtatca gcagaaaccg120 ggccaggcgc cgcgcctgct gatctacgac gcgagcaatc gtgcgaccgg cattccggcg180 cgctttagcg gctccggtag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctggaaccg240

- 257 045238 gaagattttg cggtgtatta ttgccagcaa cgtaattatt ggccgctgac ctttggccag

300

321 ggcaccaaag tggaaattaa a <210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<223> ДНК <400> 198 gaagtgcagc agctgtgccg cctggcaaag ctggacaacg ctgcagatga ctgagctact

198

351

ДНК

Искусственная последовательность

PD1H129 tggtggaatc ccagcggctt gactggaaag tgaagggccg actccctgcg tcgacgtgtg tggcggcgga cgccttcagc cgtggcctac gttcaccatc ggccgaggac gggccagggc ctggtgcagc agatacgaca atctctggcg agccgggaca accgccgtgt acactcgtga ctggcggatc tgagctgggt gaggcgccaa acgccaagaa actattgcgc ccgtgtcatc tctgagactg gcgccaggcc cacctactac cagcctgtac ctccccctac t

120

180

240

300

351

199

321 <210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<223> ДНК <400> 199 gagatcgtga ctgagctgca ggccaggccc agattttctg gaggacttcg ggcaccaagc

ДНК

Искусственная последовательность

PD1L62 tgacccagag gagccagcca ccagactgct gcagcggctc ccgtgtacta tggaaatcaa ccctgccacc gagcctgagc gatcaagtct cggcaccgag ctgccagaac g ctgtccgtgt gactacctgc gccagccagt ttcaccctga ggccacagct ctccaggcga actggtatca ccatcagcgg caatcagcag tcccttacac aagagccacc gcagaagccc catccccgcc cctgcagagc cttcggccag

120

180

240

300

321 <210> 200 <211> 360 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> ДНК PD1H163 < 400> 200 caggtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaaagtg agctgcaaag cgagcggcgg caccttcaag tcctatgtga ttcattgggt gcgccaggcg

120

- 258 045238 ccgggccagg gcctggaatg gatgggcggt attatcccaa tttttggcac cgccaattat

180 gcgcagaaat ttcagggccg cgtgaccatt accgctgatg aaagcaccag caccgcgtat atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgcggtgt attattgcgc gcgcggttat gtgcgggcta cgggcatgtt ggactattgg ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc

240

300

360 <210> 201 < 211> 321 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность < 220>

< 223> ДНК PD1L185 < 400>201 gaaattgtgc tgacccagag cccggcgacc ctgagcctga gcccgggcga acgcgcgacc60 ctgagctgcc gcgcgagcca gagcgttagc aattatctgg cgtggtatca gcagaaaccg120 ggccaggcgc cgcgcctgct gatctacgac gccagcaatc gcgcgaccgg cattccggcg180 cgctttagcg gctccggtag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctggaaccg240 gaagattttg cggtgtatta ttgccagcaa cgtgcatatt ggccgctgac ctttggccag300 ggcaccaaag tggaaattaa a321 < 210>202 < 211>360 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность < 220>

< 223> ДНК PD1H164 < 400>202 caggtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaaagtg60 agctgcaaag cgagcggcgg caccttcagc gattatgtga tttcctgggt gcgccaggcg120 ccgggccagg gcctggaatg gatgggcggt attatcccga tttacgggac cgctaactat180 gcgcagaaat ttcagggccg cgtgaccatt accgctgatg aaagcaccag caccgcgtat240 atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgcggtgt attattgcgc gcgcggtacc300 ctcgaccgga ccgggcattt ggactattgg ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc360 < 210>203 < 211>321 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность < 220>

< 223> ДНК PD1L86 <400> 203 gaaattgtgc tgacccagag cccggcgacc ctgagcctga gcccgggcga acgcgcgacc 60

- 259 045238

ctgagctgcc	gcgcgagcca	gagcgtctcc	tcctaccttg	cgtggtatca	gcagaaaccg	120
ggccaggcgc	cgcgcctgct	gatccacgac	gcctctacgc	gtgcgaccgg	cattccggcg	180
cgctttagcg	gctccggtag	cggcaccgat	tttaccctga	ccattagcag	cctggaaccg	240
gaagattttg	cggtgtatta	ttgccagcaa	cgtaattatt	ggccgctcac	ctttggccag	300
ggcaccaaag	tggaaattaa	a				321

<210> 204 <211> 351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ДНК TM3H24 <400>204 gaagtgcagc tgctggaaag cggcggcggc ctggtgcagc cgggcggcag cctgcgcctg60 agctgcgcgg caagcggctt tacctttagc agctatgcga tgagctgggt gcgccaggcg120 ccgggcaaag gcctggaatg ggtgagcgcg attagcggca gcggcggcag cacctattat180 gcggatagcg tgaaaggccg ctttaccatt agccgcgata acagcaaaaa caccctgtat240 ctgcagatga acagcctgcg cgcggaagat accgcggtgt attattgcgc gaaatccccg300 tacgcgccct tggactattg gggccagggc accctggtga ccgtgagcag c351 <210>205 <211>321 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ДНК TM3L33 <400>205 gaaattgtgc tgacccagag cccggcgacc ctgagcctga gcccgggcga acgcgcgacc60 cttagctgcc gtgcaagtca gagtgtgaac gactacctgg cgtggtatca gcagaaaccg120 ggccaggcgc cgcgcctgct gatttatgat gcgagcaacc gcgcgaccgg cattccggcg180 cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctggaaccg240 gaagattttg cggtgtatta ttgccagcag ggtggtcacg cgccgatcac ctttggccag300 ggcaccaaag tggaaattaa a321 <210>206 <211>372 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ДНК TM3H162

- 260 045238 <400> 206 gaagtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaagc ctggcgagag cctgaagatc 60 agctgcaagg gcagcggcta cagcttcacc agctactgga tgcagtgggt gcgccagatg120 cctggcaagg gcctggaatg gatgggcgcc atctatcccg gcgacggcga catcagatac180 acccagaact tcaagggcca agtgaccatc agcgccgaca agagcatcag caccgcctac240 ctgcagtggt ccagcctgaa ggccagcgac accgccatgt actactgtgc cagatgggag300 aagtccacca ccgtggtgca gcggaactac ttcgactact ggggccaggg caccacagtg360 accgtgtcta gt372 <210>207 <211>318 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ДНК TM3L85 <400>207 gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc60 atcacatgca aggccagcga gaacgtgggc accttcgtgt cctggtatca gcagaagccc120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacggc gccagcaaca gatacaccgg cgtgcccagc180 agattcagcg gctctggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatctctag cctgcagccc240 gaggacttcg ccacctacta ctgcggccag agctacagct accccacctt tggccagggc300 accaagctgg aaatcaag318 <210>208 <211>357 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> ДНК TM3H21 < 400>208 gaagtgcagc tgctggaaag cggcggcggc ctggtgcagc cgggcggcag cctgcgcctg60 agctgcgcgg cgagcggctt tacctttagc aactattgga tgagctgggt gcgccaggcg120 ccgggcaaag gcctggaatg ggtgagcgcg attagcggca gcggcggcag cacctattat180 gcggatagcg tgaaaggccg ctttaccatt agccgcgata acagcaaaaa caccctgtat240 ctgcagatga acagcctgcg cgcggaagat accgcggtgt attattgcgc gaaagatcat300 tgggatccca attttttgga ctattggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcagc357 <210> 209 <211> 324

- 261 045238 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

<223> ДНК PH9L1 <400>209 gaaattgtgc tgacccagag cccgggcacc ctgagcctga gcccgggcga acgcgcgacc60 ctgagctgcc gcgcgagcca gagcgtgagc agcagctatc tggcgtggta tcagcagaaa120 ccgggccagg cgccgcgcct gctgatttat ggcgcgagca gccgcgcgac cggcattccg180 gatcgcttta gcggcagcgg cagcggcacc gattttaccc tgaccattag ccgcctggaa240 ccggaagatt ttgcggtgta ttattgccag cagtatggca gcagcccgct gacctttggc300 cagggcacca aagtggaaat taaa324 <210>210 <211>351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223>

ДНК TM3H65 <400>

210 gaagtgcagc tgctggaaag cggcggcggc ctggtgcagc cgggcggcag cctgcgcctg agctgcgcgg cgagcggctt tacctttagc gactattgga tgagctgggt gcgccaggcg

120 ccgggcaaag gcctggaatg ggtgagcgtg atcaagtata gcggtggctc caaatattat

180 gcggatagcg tgaaaggccg ctttaccatt agccgcgata acagcaaaaa caccctgtat

240 ctgcagatga acagcctgcg cgcggaagat accgcggtgt attattgcgc gaaagagctg

300 gagggggtgt tcgactattg gggccagggc accctggtga ccgtgagcag c

351 <210> 211 <211> 324 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> ДНК TM3L12 < 400>211 gaaattgtgc tgacccagag cccgggcacc ctgagcctga gcccgggcga acgcgcgacc60 ctgagctgcc gcgcgagcca gagcgttagc aatagcactc tggcgtggta tcagcagaaa120 ccgggccagg cgccgcgcct gctgatttat actgcgagca gccgcgcgac cggcattccg180 gatcgcttta gcggcagcgg cagcggcacc gattttaccc tgaccattag ccgcctggaa240 ccggaagatt ttgcggtgta ttattgccag cagtcttaca catctccgtg gacttttggc300 cagggcacca aagtggaaat taaa324

- 262 045238 <210> 212 <211> 449 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HC PD1B114 < 400> 212

Gln Val Gln Leu Val

5

Gln Ser Gly Ala Glu

Val Lys Lys Pro Gly

Ser Val Lys Val Ser

Cys Lys Ala Ser Gly

Gly Thr Phe Ser Ser 30

Ala Ile Ser Trp Val 35

Arg Gln Ala Pro Gly 40

Gln Gly Leu Glu Trp 45

Gly Gly Ile Ile Pro 50

Ile Phe Gly Thr Ala 55

Asn Tyr Ala Gln Lys 60

Gln Gly Arg Val Thr 65

Ile Thr Ala Asp Glu 70

Ser Thr Ser Thr Ala 75

Met Glu Leu Ser Ser

Leu Arg Ser Glu Asp 90

Thr Ala Val Tyr Tyr 95

Ala Arg Pro Gly Leu

100

Ala Ala Ala Tyr Asp

105

Thr Gly Asn Leu Asp

110

Trp Gly Gln Gly Thr 115

Leu Val Thr Val Ser

120

Ser Ala Ser Thr Lys

125

Pro Ser Val Phe Pro

130

Leu Ala Pro Cys Ser

135

Arg Ser Thr Ser Glu 140

Thr Ala Ala Leu Gly 145

Cys Leu Val Lys Asp 150

Tyr Phe Pro Glu Pro 155

Thr Val Ser Trp Asn

165

Ser Gly Ala Leu Thr

170

Ser Gly Val His Thr

175

Pro Ala Val Leu Gln

180

Ser Ser Gly Leu Tyr

185

Ser Leu Ser Ser Val

190

Thr Val Thr Ser Ser

195

Asn Phe Gly Thr Gln 200

Thr Tyr Thr Cys Asn

205

Ser

Tyr

Met

Phe

Tyr 80

Cys

Tyr

Gly

Ser

Val 160

Phe

Val

- 263 045238

Asp

Cys 225

Ser

Arg

Pro

Ala

Val 305

Tyr

Thr

Leu

Cys

Ser 385

Asp

Ser

Ala

Lys

His Lys Pro 210

Cys Val Glu

Val Phe Leu

Thr Pro Glu

260

Glu Val Gln

275

Lys Thr Lys 290

Ser Val Leu

Lys Cys Lys

Ile Ser Lys

340

Pro Pro Ser

355

Leu Val Lys 370

Asn Gly Gln

Ser Asp Gly

Arg Trp Gln

420

Leu His Asn

435

Ser Asn Thr

215

Cys Pro Pro

230

Phe Pro Pro 245

Val Thr Cys

Phe Asn Trp

Pro Arg Glu

295

Thr Val Leu

310

Val Ser Asn 325

Thr Lys Gly

Arg Glu Glu

Gly Phe Tyr

375

Pro Glu Asn

390

Ser Phe Phe 405

Gln Gly Asn

His Tyr Thr

Lys Val Asp

Cys Pro Ala

Lys Pro Lys

250

Val Val Val

265

Tyr Val Asp 280

Glu Gln Phe

His Gln Asp

Lys Gly Leu

330

Gln Pro Arg

345

Met Thr Lys 360

Pro Ser Asp

Asn Tyr Lys

Leu Tyr Ser

410

Val Phe Ser

425

Gln Lys Ser 440

Lys Thr Val

220

Glu Arg Lys

Pro Pro Ala 235

Ala Ala Ser

240

Asp Thr Leu

Asp Val Ser

Gly Val Glu

285

Asn Ser Thr

300

Trp Leu Asn 315

Pro Ser Ser

Glu Pro Gln

Asn Gln Val

365

Ile Ala Val

380

Thr Thr Pro 395

Lys Leu Thr

Cys Ser Val

Leu Ser Leu

445

Met Ile Ser

255

Ala Glu Asp 270

Val His Asn

Phe Arg Val

Gly Lys Glu

320

Ile Glu Lys

335

Val Tyr Thr 350

Ser Leu Thr

Glu Trp Glu

Pro Met Leu

400

Val Asp Lys

415

Met His Glu 430

Ser Pro Gly

- 264 045238 <210> 213 <211> 214 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LC PD1B114 < 400> 213

Glu Ile Val Leu Thr

5

Gln Ser Pro Ala Thr

Leu Ser Leu Ser Pro

Glu Arg Ala Thr Leu 20

Ser Cys Arg Ala Ser

Gln Ser Val Ser Ser

Leu Ala Trp Tyr Gln 35

Gln Lys Pro Gly Gln 40

Ala Pro Arg Leu Leu 45

Tyr Asp Ala Ser Asn 50

Arg Ala Thr Gly Ile 55

Pro Ala Arg Phe Ser 60

Ser Gly Ser Gly Thr 65

Asp Phe Thr Leu Thr 70

Ile Ser Ser Leu Glu 75

Glu Asp Phe Ala Val 85

Tyr Tyr Cys Gln Gln 90

Arg Ser Asn Trp Pro 95

Thr Phe Gly Gln Gly

100

Thr Lys Val Glu Ile

105

Lys Arg Thr Val Ala

110

Pro Ser Val Phe Ile

115

Phe Pro Pro Ser Asp

120

Glu Gln Leu Lys Ser 125

Thr Ala Ser Val Val

130

Cys Leu Leu Asn Asn

135

Phe Tyr Pro Arg Glu 140

Lys Val Gln Trp Lys 145

Val Asp Asn Ala Leu 150

Gln Ser Gly Asn Ser 155

Glu Ser Val Thr Glu

165

Gln Asp Ser Lys Asp

170

Ser Thr Tyr Ser Leu

175

Ser Thr Leu Thr Leu

180

Ser Lys Ala Asp Tyr

185

Glu Lys His Lys Val

190

Ala Cys Glu Val Thr 195

His Gln Gly Leu Ser 200

Ser Pro Val Thr Lys

205

Gly

Tyr

Ile

Gly

Pro 80

Leu

Ala

Gly

Ala

Gln 160

Ser

Tyr

Ser

- 265 045238

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 <210> 214 <211> 449 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HC PD1B149 < 400> 214

Gln Val Gln Leu Val

5

Gln Ser Gly Ala Glu

Val Lys Lys Pro Gly

Ser Val Lys Val Ser

Cys Lys Ala Ser Gly

Gly Thr Phe Ser Ser 30

Ala Ile Ser Trp Val 35

Arg Gln Ala Pro Gly 40

Gln Gly Leu Glu Trp 45

Gly Gly Ile Ile Pro 50

Ile Phe Gly Thr Ala 55

Asn Tyr Ala Gln Lys 60

Gln Gly Arg Val Thr 65

Ile Thr Ala Asp Glu 70

Ser Thr Ser Thr Ala 75

Met Glu Leu Ser Ser

Leu Arg Ser Glu Asp 90

Thr Ala Val Tyr Tyr 95

Ala Arg Pro Gly Leu

100

Ala Ala Ala Tyr Asp

105

Thr Gly Asn Leu Asp

110

Trp Gly Gln Gly Thr 115

Leu Val Thr Val Ser

120

Ser Ala Ser Thr Lys

125

Pro Ser Val Phe Pro

130

Leu Ala Pro Cys Ser

135

Arg Ser Thr Ser Glu 140

Thr Ala Ala Leu Gly 145

Cys Leu Val Lys Asp 150

Tyr Phe Pro Glu Pro 155

Thr Val Ser Trp Asn

165

Ser Gly Ala Leu Thr

170

Ser Gly Val His Thr

175

Pro Ala Val Leu Gln

180

Ser Ser Gly Leu Tyr

185

Ser Leu Ser Ser Val

190

Thr Val Thr Ser Ser

Asn Phe Gly Thr Gln

Thr Tyr Thr Cys Asn

Ser

Tyr

Met

Phe

Tyr 80

Cys

Tyr

Gly

Ser

Val 160

Phe

Val

- 266 045238

195

200

205

Asp

Cys 225

Ser

Arg

Pro

Ala

Val 305

Tyr

Thr

Leu

Cys

Ser 385

Asp

Ser

Ala

His Lys Pro 210

Cys Val Glu

Val Phe Leu

Thr Pro Glu

260

Glu Val Gln

275

Lys Thr Lys 290

Ser Val Leu

Lys Cys Lys

Ile Ser Lys

340

Pro Pro Ser

355

Leu Val Lys 370

Asn Gly Gln

Ser Asp Gly

Arg Trp Gln

420

Leu His Asn

435

Ser Asn Thr

215

Cys Pro Pro

230

Phe Pro Pro 245

Val Thr Cys

Phe Asn Trp

Pro Arg Glu

295

Thr Val Leu

310

Val Ser Asn 325

Thr Lys Gly

Arg Glu Glu

Gly Phe Tyr

375

Pro Glu Asn

390

Ser Phe Phe 405

Gln Gly Asn

His Tyr Thr

Lys Val Asp

Lys Thr Val

220

Glu Arg Lys

Cys Pro Ala

Lys Pro Lys

250

Val Val Val

265

Tyr Val Asp 280

Glu Gln Phe

His Gln Asp

Lys Gly Leu

330

Gln Pro Arg

345

Met Thr Lys 360

Pro Ser Asp

Asn Tyr Lys

Leu Tyr Ser

410

Val Phe Ser

425

Gln Lys Ser 440

Pro Pro Ala 235

Ala Ala Ser

240

Asp Thr Leu

Asp Val Ser

Gly Val Glu

285

Asn Ser Thr

300

Trp Leu Asn 315

Pro Ser Ser

Glu Pro Gln

Asn Gln Val

365

Ile Ala Val

380

Thr Thr Pro 395

Lys Leu Thr

Cys Ser Val

Leu Ser Leu

445

Met Ile Ser

255

Ala Glu Asp 270

Val His Asn

Phe Arg Val

Gly Lys Glu

320

Ile Glu Lys

335

Val Tyr Thr 350

Ser Leu Thr

Glu Trp Glu

Pro Met Leu

400

Val Asp Lys

415

Met His Glu 430

Ser Pro Gly

- 267 045238

Lys <210> 215 <211> 214 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LC PD1B149 < 400> 215

Glu Ile Val Leu Thr

5

Gln Ser Pro Ala Thr

Leu Ser Leu Ser Pro

Glu Arg Ala Thr Leu 20

Ser Cys Arg Ala Ser

Gln Ser Val Arg Asn 30

Leu Ala Trp Tyr Gln 35

Gln Lys Pro Gly Gln 40

Ala Pro Arg Leu Leu 45

His Asp Ala Ser Asn 50

Arg Ala Thr Gly Ile 55

Pro Ala Arg Phe Ser 60

Ser Gly Ser Gly Thr 65

Asp Phe Thr Leu Thr 70

Ile Ser Ser Leu Glu 75

Glu Asp Phe Ala Val 85

Tyr Tyr Cys Gln Gln 90

Arg Asn Tyr Trp Pro 95

Thr Phe Gly Gln Gly

100

Thr Lys Val Glu Ile

105

Lys Arg Thr Val Ala

110

Pro Ser Val Phe Ile

115

Phe Pro Pro Ser Asp 120

Glu Gln Leu Lys Ser 125

Thr Ala Ser Val Val

130

Cys Leu Leu Asn Asn

135

Phe Tyr Pro Arg Glu 140

Lys Val Gln Trp Lys 145

Val Asp Asn Ala Leu 150

Gln Ser Gly Asn Ser 155

Glu Ser Val Thr Glu

165

Gln Asp Ser Lys Asp

170

Ser Thr Tyr Ser Leu

175

Ser Thr Leu Thr Leu

180

Ser Lys Ala Asp Tyr

185

Glu Lys His Lys Val

190

Ala Cys Glu Val Thr

His Gln Gly Leu Ser

Ser Pro Val Thr Lys

Gly

Tyr

Ile

Gly

Pro 80

Leu

Ala

Gly

Ala

Gln 160

Ser

Tyr

Ser

- 268 045238

195

200

205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 <210> 216 <211> 449 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HC PD1B160 < 400> 216

Gln Val Gln Leu Val

5

Gln Ser Gly Ala Glu

Val Lys Lys Pro Gly

Ser Val Lys Val Ser

Cys Lys Ala Ser Gly

Gly Thr Phe Ser Ser 30

Ala Ile Ser Trp Val 35

Arg Gln Ala Pro Gly 40

Gln Gly Leu Glu Trp 45

Gly Gly Ile Ile Pro 50

Ile Phe Asp Thr Ala 55

Asn Tyr Ala Gln Lys 60

Gln Gly Arg Val Thr 65

Ile Thr Ala Asp Glu 70

Ser Thr Ser Thr Ala 75

Met Glu Leu Ser Ser

Leu Arg Ser Glu Asp 90

Thr Ala Val Tyr Tyr 95

Ala Arg Pro Gly Leu

100

Ala Ala Ala Tyr Asp

105

Thr Gly Asn Leu Asp

110

Trp Gly Gln Gly Thr 115

Leu Val Thr Val Ser

120

Ser Ala Ser Thr Lys

125

Pro Ser Val Phe Pro

130

Leu Ala Pro Cys Ser

135

Arg Ser Thr Ser Glu 140

Thr Ala Ala Leu Gly 145

Cys Leu Val Lys Asp 150

Tyr Phe Pro Glu Pro 155

Thr Val Ser Trp Asn

165

Ser Gly Ala Leu Thr

170

Ser Gly Val His Thr

175

Pro Ala Val Leu Gln

180

Ser Ser Gly Leu Tyr

185

Ser Leu Ser Ser Val

190

Ser

Tyr

Met

Phe

Tyr 80

Cys

Tyr

Gly

Ser

Val 160

Phe

Val

- 269 045238

Thr

Asp

Cys 225

Ser

Arg

Pro

Ala

Val 305

Tyr

Thr

Leu

Cys

Ser 385

Asp

Ser

Ala

Val Thr Ser

195

His Lys Pro 210

Cys Val Glu

Val Phe Leu

Thr Pro Glu

260

Glu Val Gln

275

Lys Thr Lys 290

Ser Val Leu

Lys Cys Lys

Ile Ser Lys

340

Pro Pro Ser

355

Leu Val Lys 370

Asn Gly Gln

Ser Asp Gly

Arg Trp Gln

420

Leu His Asn

Ser Asn Phe

Ser Asn Thr

215

Cys Pro Pro

230

Phe Pro Pro 245

Val Thr Cys

Phe Asn Trp

Pro Arg Glu

295

Thr Val Leu

310

Val Ser Asn 325

Thr Lys Gly

Arg Glu Glu

Gly Phe Tyr

375

Pro Glu Asn

390

Ser Phe Phe 405

Gln Gly Asn

His Tyr Thr

Gly Thr Gln 200

Lys Val Asp

Cys Pro Ala

Lys Pro Lys

250

Val Val Val

265

Tyr Val Asp 280

Glu Gln Phe

His Gln Asp

Lys Gly Leu 330

Gln Pro Arg 345

Met Thr Lys 360

Pro Ser Asp

Asn Tyr Lys

Leu Tyr Ser 410

Val Phe Ser 425

Gln Lys Ser

Thr Tyr Thr

205

Lys Thr Val

220

Pro Pro Ala 235

Asp Thr Leu

Asp Val Ser

Gly Val Glu

285

Asn Ser Thr

300

Trp Leu Asn 315

Pro Ser Ser

Glu Pro Gln

Asn Gln Val

365

Ile Ala Val

380

Thr Thr Pro 395

Lys Leu Thr

Cys Ser Val

Leu Ser Leu

Cys Asn Val

Glu Arg Lys

Ala Ala Ser

240

Met Ile Ser

255

Ala Glu Asp 270

Val His Asn

Phe Arg Val

Gly Lys Glu

320

Ile Glu Lys

335

Val Tyr Thr 350

Ser Leu Thr

Glu Trp Glu

Pro Met Leu

400

Val Asp Lys

415

Met His Glu 430

Ser Pro Gly

- 270 045238

435

440

445

Lys <210> 217 <211> 214 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LC PD1B160 < 400> 217

Glu Ile Val Leu Thr

5

Gln Ser Pro Ala Thr

Leu Ser Leu Ser Pro

Glu Arg Ala Thr Leu 20

Ser Cys Arg Ala Ser

Gln Ser Val Asp Ser 30

Leu Ala Trp Tyr Gln 35

Gln Lys Pro Gly Gln 40

Ala Pro Arg Leu Leu 45

Lys Asp Ala Ser Asp 50

Arg Ala Thr Gly Ile 55

Pro Ala Arg Phe Ser 60

Ser Gly Ser Gly Thr 65

Asp Phe Thr Leu Thr 70

Ile Ser Ser Leu Glu 75

Glu Asp Phe Ala Val 85

Tyr Tyr Cys Gln Gln 90

Arg Gly Asn Trp Pro 95

Thr Phe Gly Gln Gly

100

Thr Lys Val Glu Ile

105

Lys Arg Thr Val Ala

110

Pro Ser Val Phe Ile

115

Phe Pro Pro Ser Asp 120

Glu Gln Leu Lys Ser 125

Thr Ala Ser Val Val

130

Cys Leu Leu Asn Asn

135

Phe Tyr Pro Arg Glu

140

Lys Val Gln Trp Lys 145

Val Asp Asn Ala Leu 150

Gln Ser Gly Asn Ser 155

Glu Ser Val Thr Glu

165

Gln Asp Ser Lys Asp

170

Ser Thr Tyr Ser Leu

175

Ser Thr Leu Thr Leu

180

Ser Lys Ala Asp Tyr

185

Glu Lys His Lys Val

190

Gly

Tyr

Ile

Gly

Pro 80

Leu

Ala

Gly

Ala

Gln 160

Ser

Tyr

- 271 045238

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 <210> 218 <211> 449 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HC PD1B162 < 400> 218

Gln Val Gln Leu Val

5

Gln Ser Gly Ala Glu

Val Lys Lys Pro Gly

Ser Val Lys Val Ser

Cys Lys Ala Ser Gly

Gly Thr Phe Ser Ser 30

Ala Ile Ser Trp Val 35

Arg Gln Ala Pro Gly 40

Gln Gly Leu Glu Trp 45

Gly Gly Ile Ile Pro 50

Ile Phe Asp Thr Ala 55

Asn Tyr Ala Gln Lys 60

Gln Gly Arg Val Thr 65

Ile Thr Ala Asp Glu 70

Ser Thr Ser Thr Ala 75

Met Glu Leu Ser Ser

Leu Arg Ser Glu Asp 90

Thr Ala Val Tyr Tyr 95

Ala Arg Pro Gly Leu

100

Ala Ala Ala Tyr Asp

105

Thr Gly Asn Leu Asp

110

Trp Gly Gln Gly Thr 115

Leu Val Thr Val Ser

120

Ser Ala Ser Thr Lys

125

Pro Ser Val Phe Pro

130

Leu Ala Pro Cys Ser

135

Arg Ser Thr Ser Glu 140

Thr Ala Ala Leu Gly 145

Cys Leu Val Lys Asp 150

Tyr Phe Pro Glu Pro 155

Thr Val Ser Trp Asn

165

Ser Gly Ala Leu Thr

170

Ser Gly Val His Thr

175

Ser

Tyr

Met

Phe

Tyr 80

Cys

Tyr

Gly

Ser

Val 160

Phe

- 272 045238

Pro

Thr

Asp

Cys 225

Ser

Arg

Pro

Ala

Val 305

Tyr

Thr

Leu

Cys

Ser 385

Asp

Ser

Ala Val Leu

180

Val Thr Ser

195

His Lys Pro 210

Cys Val Glu

Val Phe Leu

Thr Pro Glu

260

Glu Val Gln

275

Lys Thr Lys 290

Ser Val Leu

Lys Cys Lys

Ile Ser Lys

340

Pro Pro Ser

355

Leu Val Lys 370

Asn Gly Gln

Ser Asp Gly

Arg Trp Gln

420

Gln Ser Ser

Ser Asn Phe

Ser Asn Thr

215

Cys Pro Pro

230

Phe Pro Pro 245

Val Thr Cys

Phe Asn Trp

Pro Arg Glu

295

Thr Val Leu

310

Val Ser Asn 325

Thr Lys Gly

Arg Glu Glu

Gly Phe Tyr

375

Pro Glu Asn

390

Ser Phe Phe 405

Gln Gly Asn

Gly Leu Tyr

185

Gly Thr Gln 200

Lys Val Asp

Cys Pro Ala

Lys Pro Lys

250

Val Val Val

265

Tyr Val Asp 280

Glu Gln Phe

His Gln Asp

Lys Gly Leu

330

Gln Pro Arg

345

Met Thr Lys 360

Pro Ser Asp

Asn Tyr Lys

Leu Tyr Ser

410

Val Phe Ser

425

Ser Leu Ser

Ser Val Val 190

Thr Tyr Thr

205

Lys Thr Val

220

Pro Pro Ala 235

Asp Thr Leu

Asp Val Ser

Gly Val Glu

285

Asn Ser Thr

300

Trp Leu Asn 315

Pro Ser Ser

Glu Pro Gln

Asn Gln Val

365

Ile Ala Val

380

Thr Thr Pro 395

Lys Leu Thr

Cys Ser Val

Cys Asn Val

Glu Arg Lys

Ala Ala Ser

240

Met Ile Ser

255

Ala Glu Asp 270

Val His Asn

Phe Arg Val

Gly Lys Glu

320

Ile Glu Lys

335

Val Tyr Thr 350

Ser Leu Thr

Glu Trp Glu

Pro Met Leu

400

Val Asp Lys

415

Met His Glu 430

- 273 045238

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

Lys <210> 219 <211> 214 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LC PD1B162 < 400> 219

Glu Ile Val Leu Thr

5

Gln Ser Pro Ala Thr

Leu Ser Leu Ser Pro

Glu Arg Ala Thr Leu

Ser Cys Arg Ala Ser

Gln Ser Val Asp Ser 30

Leu Ala Trp Tyr Gln 35

Gln Lys Pro Gly Gln 40

Ala Pro Arg Leu Leu 45

Tyr Asp Ala Ser Asn 50

Arg Ala Thr Gly Ile 55

Pro Ala Arg Phe Ser 60

Ser Gly Ser Gly Thr 65

Asp Phe Thr Leu Thr 70

Ile Ser Ser Leu Glu 75

Glu Asp Phe Ala Val 85

Tyr Tyr Cys Gln Gln 90

Arg Glu Tyr Trp Pro 95

Thr Phe Gly Gln Gly

100

Thr Lys Val Glu Ile

105

Lys Arg Thr Val Ala

110

Pro Ser Val Phe Ile

115

Phe Pro Pro Ser Asp

120

Glu Gln Leu Lys Ser 125

Thr Ala Ser Val Val

130

Cys Leu Leu Asn Asn

135

Phe Tyr Pro Arg Glu 140

Lys Val Gln Trp Lys 145

Val Asp Asn Ala Leu 150

Gln Ser Gly Asn Ser 155

Glu Ser Val Thr Glu

165

Gln Asp Ser Lys Asp

170

Ser Thr Tyr Ser Leu

175

Gly

Tyr

Ile

Gly

Pro 80

Leu

Ala

Gly

Ala

Gln 160

Ser

- 274 045238

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200

Lys His Lys Val 190

Pro Val Thr Lys 205

Tyr

Ser

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 <210> 220 <211> 449 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HC PD1B164 < 400> 220

Gln Val Gln Leu Val

5

Gln Ser Gly Ala Glu

Val Lys Lys Pro Gly

Ser Val Lys Val Ser

Cys Lys Ala Ser Gly

Gly Thr Phe Ser Ser 30

Ala Ile Ser Trp Val 35

Arg Gln Ala Pro Gly 40

Gln Gly Leu Glu Trp 45

Gly Gly Ile Ile Pro 50

Ile Phe Asp Thr Ala 55

Asn Tyr Ala Gln Lys 60

Gln Gly Arg Val Thr 65

Ile Thr Ala Asp Glu 70

Ser Thr Ser Thr Ala 75

Met Glu Leu Ser Ser

Leu Arg Ser Glu Asp 90

Thr Ala Val Tyr Tyr 95

Ala Arg Pro Gly Leu

100

Ala Ala Ala Tyr Asp

105

Thr Gly Asn Leu Asp

110

Trp Gly Gln Gly Thr 115

Leu Val Thr Val Ser

120

Ser Ala Ser Thr Lys

125

Pro Ser Val Phe Pro

130

Leu Ala Pro Cys Ser

135

Arg Ser Thr Ser Glu 140

Thr Ala Ala Leu Gly 145

Cys Leu Val Lys Asp 150

Tyr Phe Pro Glu Pro 155

Ser

Tyr

Met

Phe

Tyr 80

Cys

Tyr

Gly

Ser

Val 160

- 275 045238

Thr

Pro

Thr

Asp

Cys 225

Ser

Arg

Pro

Ala

Val 305

Tyr

Thr

Leu

Cys

Ser 385

Asp

Val Ser Trp

Ala Val Leu

180

Val Thr Ser

195

His Lys Pro 210

Cys Val Glu

Val Phe Leu

Thr Pro Glu

260

Glu Val Gln

275

Lys Thr Lys 290

Ser Val Leu

Lys Cys Lys

Ile Ser Lys

340

Pro Pro Ser

355

Leu Val Lys 370

Asn Gly Gln

Ser Asp Gly

Asn Ser Gly 165

Gln Ser Ser

Ser Asn Phe

Ser Asn Thr

215

Cys Pro Pro

230

Phe Pro Pro 245

Val Thr Cys

Phe Asn Trp

Pro Arg Glu

295

Thr Val Leu

310

Val Ser Asn 325

Thr Lys Gly

Arg Glu Glu

Gly Phe Tyr

375

Pro Glu Asn

390

Ser Phe Phe 405

Ala Leu Thr

170

Gly Leu Tyr

185

Gly Thr Gln 200

Lys Val Asp

Cys Pro Ala

Lys Pro Lys

250

Val Val Val

265

Tyr Val Asp 280

Glu Gln Phe

His Gln Asp

Lys Gly Leu

330

Gln Pro Arg

345

Met Thr Lys 360

Pro Ser Asp

Asn Tyr Lys

Leu Tyr Ser

410

Ser Gly Val

Ser Leu Ser

Thr Tyr Thr

205

Lys Thr Val

220

Pro Pro Ala 235

Asp Thr Leu

Asp Val Ser

Gly Val Glu

285

Asn Ser Thr

300

Trp Leu Asn 315

Pro Ser Ser

Glu Pro Gln

Asn Gln Val

365

Ile Ala Val

380

Thr Thr Pro 395

Lys Leu Thr

His Thr Phe

175

Ser Val Val 190

Cys Asn Val

Glu Arg Lys

Ala Ala Ser

240

Met Ile Ser

255

Ala Glu Asp 270

Val His Asn

Phe Arg Val

Gly Lys Glu

320

Ile Glu Lys

335

Val Tyr Thr 350

Ser Leu Thr

Glu Trp Glu

Pro Met Leu

400

Val Asp Lys

415

- 276 045238

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

420 425

Ser Val Met His

430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Glu

Gly

Lys <210> 221 <211> 214 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LC PD1B164 < 400> 221

Glu Ile Val Leu Thr

5

Gln Ser Pro Ala Thr

Leu Ser Leu Ser Pro

Glu Arg Ala Thr Leu 20

Ser Cys Arg Ala Ser

Gln Ser Val Arg Ser 30

Leu Ala Trp Tyr Gln 35

Gln Lys Pro Gly Gln 40

Ala Pro Arg Leu Leu 45

Tyr Asp Ala Ser Tyr 50

Arg Ala Thr Gly Ile 55

Pro Ala Arg Phe Ser 60

Ser Gly Ser Gly Thr 65

Asp Phe Thr Leu Thr 70

Ile Ser Ser Leu Glu 75

Glu Asp Phe Ala Val 85

Tyr Tyr Cys Gln Gln 90

Arg Asp Tyr Trp Pro 95

Thr Phe Gly Gln Gly

100

Thr Lys Val Glu Ile

105

Lys Arg Thr Val Ala

110

Pro Ser Val Phe Ile

115

Phe Pro Pro Ser Asp 120

Glu Gln Leu Lys Ser 125

Thr Ala Ser Val Val

130

Cys Leu Leu Asn Asn

135

Phe Tyr Pro Arg Glu 140

Lys Val Gln Trp Lys 145

Val Asp Asn Ala Leu 150

Gln Ser Gly Asn Ser 155

Gly

Tyr

Ile

Gly

Pro 80

Leu

Ala

Gly

Ala

Gln 160

- 277 045238

Glu Ser Val Thr

Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Thr

Leu Thr

180

Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

185 190

Ala Cys

Glu Val 195

Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

200 205

Ser

Tyr

Ser

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 <210> 222 <211> 449 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HC PD1B183 < 400> 222

Gln Val Gln Leu Val

5

Gln Ser Gly Ala Glu

Val Lys Lys Pro Gly

Ser Val Lys Val Ser

Cys Lys Ala Ser Gly

Gly Thr Phe Ser Ser 30

Ala Ile Ser Trp Val 35

Arg Gln Ala Pro Gly 40

Gln Gly Leu Glu Trp 45

Gly Gly Ile Ile Pro 50

Ile Phe Gly Thr Ala 55

Asn Tyr Ala Gln Lys 60

Gln Gly Arg Val Thr 65

Ile Thr Ala Asp Glu 70

Ser Thr Ser Thr Ala 75

Met Glu Leu Ser Ser

Leu Arg Ser Glu Asp 90

Thr Ala Val Tyr Tyr 95

Ala Arg Pro Gly Leu

100

Ala Ala Ala Tyr Asp

105

Thr Gly Ser Leu Asp

110

Trp Gly Gln Gly Thr 115

Leu Val Thr Val Ser

120

Ser Ala Ser Thr Lys

125

Pro Ser Val Phe Pro

130

Leu Ala Pro Cys Ser

135

Arg Ser Thr Ser Glu 140

Thr Ala Ala Leu Gly

Cys Leu Val Lys Asp

Tyr Phe Pro Glu Pro

Ser

Tyr

Met

Phe

Tyr 80

Cys

Tyr

Gly

Ser

Val

- 278 045238

150

155

160

145

Thr

Pro

Thr

Asp

Cys 225

Ser

Arg

Pro

Ala

Val 305

Tyr

Thr

Leu

Cys

Ser

385

Val Ser Trp Asn Ser

165

Ala Val Leu Gln Ser

180

Val Thr Ser Ser Asn

195

His Lys Pro Ser Asn 210

Cys Val Glu Cys Pro

230

Val Phe Leu Phe Pro

245

Thr Pro Glu Val Thr

260

Glu Val Gln Phe Asn

275

Lys Thr Lys Pro Arg 290

Ser Val Leu Thr Val

310

Lys Cys Lys Val Ser

325

Ile Ser Lys Thr Lys 340

Pro Pro Ser Arg Glu

355

Leu Val Lys Gly Phe 370

Asn Gly Gln Pro Glu

390

Gly Ala Leu Thr Ser

170

Ser Gly Leu Tyr Ser

185

Phe Gly Thr Gln Thr

200

Thr Lys Val Asp Lys 215

Pro Cys Pro Ala Pro

235

Pro Lys Pro Lys Asp

250

Cys Val Val Val Asp

265

Trp Tyr Val Asp Gly

280

Glu Glu Gln Phe Asn 295

Leu His Gln Asp Trp

315

Asn Lys Gly Leu Pro

330

Gly Gln Pro Arg Glu

345

Glu Met Thr Lys Asn 360

Tyr Pro Ser Asp Ile 375

Asn Asn Tyr Lys Thr

395

Gly Val His Thr Phe

175

Leu Ser Ser Val Val

190

Tyr Thr Cys Asn Val

205

Thr Val Glu Arg Lys 220

Pro Ala Ala Ala Ser

240

Thr Leu Met Ile Ser

255

Val Ser Ala Glu Asp

270

Val Glu Val His Asn

285

Ser Thr Phe Arg Val 300

Leu Asn Gly Lys Glu

320

Ser Ser Ile Glu Lys

335

Pro Gln Val Tyr Thr

350

Gln Val Ser Leu Thr

365

Ala Val Glu Trp Glu 380

Thr Pro Pro Met Leu

400

- 279 045238

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser 405

Phe

Leu

Tyr

Ser 410

Lys

Leu

Thr

Val

Asp 415

Ser

Arg

Trp

Gln

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

420

425

430

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gln

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

435

440

445

Lys

Glu

Gly

Lys <210> 223 <211> 214 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LC PD1B183 < 400> 223

Glu Ile Val Leu Thr

5

Gln Ser Pro Ala Thr

Leu Ser Leu Ser Pro

Glu Arg Ala Thr Leu 20

Ser Cys Arg Ala Ser

Gln Ser Val Ser Ser

Leu Ala Trp Tyr Gln 35

Gln Lys Pro Gly Gln 40

Ala Pro Arg Leu Leu 45

Lys Asp Ala Ser Asn 50

Arg Ala Thr Gly Ile 55

Pro Ala Arg Phe Ser 60

Ser Gly Ser Gly Thr 65

Asp Phe Thr Leu Thr 70

Ile Ser Ser Leu Glu 75

Glu Asp Phe Ala Val 85

Tyr Tyr Cys Gln Gln 90

Arg Gly Tyr Trp Pro 95

Thr Phe Gly Gln Gly

100

Thr Lys Val Glu Ile

105

Lys Arg Thr Val Ala

110

Pro Ser Val Phe Ile

115

Phe Pro Pro Ser Asp

120

Glu Gln Leu Lys Ser 125

Thr Ala Ser Val Val

130

Cys Leu Leu Asn Asn

135

Phe Tyr Pro Arg Glu 140

Lys Val Gln Trp Lys

Val Asp Asn Ala Leu

Gln Ser Gly Asn Ser

Gly

Tyr

Ile

Gly

Pro 80

Leu

Ala

Gly

Ala

Gln

- 280 045238

145

150

155

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

165

Gln

Asp

Ser

Lys

Asp

170

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

175

Ser

Thr

Leu

Thr

180

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

185

Tyr

Glu

Lys

His

Lys 190

Val

Ala

Cys

Glu

195

Val

Thr

His

Gln

Gly 200

Leu

Ser

Pro

Val

205

Thr

Lys

160

Ser

Tyr

Ser

Phe

Asn

210

Arg

Gly

Glu

Cys <210> 224 <211> 449 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HC PD1B184 < 400> 224

Gln Val Gln Leu Val

5

Gln Ser Gly Ala Glu

Val Lys Lys Pro Gly

Ser Val Lys Val Ser

Cys Lys Ala Ser Gly

Gly Thr Phe Ser Ser 30

Ala Ile Ser Trp Val 35

Arg Gln Ala Pro Gly 40

Gln Gly Leu Glu Trp 45

Gly Gly Ile Ile Pro 50

Ile Phe Gly Thr Ala 55

Asn Tyr Ala Gln Lys 60

Gln Gly Arg Val Thr 65

Ile Thr Ala Asp Glu 70

Ser Thr Ser Thr Ala 75

Met Glu Leu Ser Ser

Leu Arg Ser Glu Asp 90

Thr Ala Val Tyr Tyr 95

Ala Arg Pro Gly Leu

100

Ala Ala Ala Tyr Asp

105

Thr Gly Ser Leu Asp

110

Trp Gly Gln Gly Thr 115

Leu Val Thr Val Ser

120

Ser Ala Ser Thr Lys

125

Pro Ser Val Phe Pro

130

Leu Ala Pro Cys Ser

135

Arg Ser Thr Ser Glu 140

Ser

Tyr

Met

Phe

Tyr 80

Cys

Tyr

Gly

Ser

- 281 045238

Thr 145

Thr

Pro

Thr

Asp

Cys 225

Ser

Arg

Pro

Ala

Val 305

Tyr

Thr

Leu

Cys

Ser

Ala Ala Leu

Val Ser Trp

Ala Val Leu

180

Val Thr Ser

195

His Lys Pro 210

Cys Val Glu

Val Phe Leu

Thr Pro Glu

260

Glu Val Gln

275

Lys Thr Lys 290

Ser Val Leu

Lys Cys Lys

Ile Ser Lys

340

Pro Pro Ser

355

Leu Val Lys 370

Gly Cys Leu

150

Asn Ser Gly 165

Gln Ser Ser

Ser Asn Phe

Ser Asn Thr

215

Cys Pro Pro

230

Phe Pro Pro 245

Val Thr Cys

Phe Asn Trp

Pro Arg Glu

295

Thr Val Leu

310

Val Ser Asn 325

Thr Lys Gly

Arg Glu Glu

Gly Phe Tyr

375

Val Lys Asp

Ala Leu Thr

170

Gly Leu Tyr

185

Gly Thr Gln 200

Lys Val Asp

Cys Pro Ala

Lys Pro Lys

250

Val Val Val

265

Tyr Val Asp 280

Glu Gln Phe

His Gln Asp

Lys Gly Leu 330

Gln Pro Arg 345

Met Thr Lys 360

Pro Ser Asp

Asn Tyr Lys

Tyr Phe Pro 155

Ser Gly Val

Ser Leu Ser

Thr Tyr Thr

205

Lys Thr Val

220

Pro Pro Ala 235

Asp Thr Leu

Asp Val Ser

Gly Val Glu

285

Asn Ser Thr

300

Trp Leu Asn 315

Pro Ser Ser

Glu Pro Gln

Asn Gln Val

365

Ile Ala Val

380

Glu Pro Val

160

His Thr Phe

175

Ser Val Val 190

Cys Asn Val

Glu Arg Lys

Ala Ala Ser

240

Met Ile Ser

255

Ala Glu Asp 270

Val His Asn

Phe Arg Val

Gly Lys Glu

320

Ile Glu Lys

335

Val Tyr Thr 350

Ser Leu Thr

Glu Trp Glu

Asn Gly Gln

Pro Glu Asn

Thr Thr Pro

Pro Met Leu

- 282 045238

385

390

395

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser 405

Phe

Leu

Tyr

Ser 410

Lys

Leu

Thr

Val

Asp 415

Ser

Arg

Trp

Gln 420

Gln

Gly

Asn

Val

Phe 425

Ser

Cys

Ser

Val

Met 430

His

Ala Lys

Leu

His 435

Asn

His

Tyr

Thr

Gln 440

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu 445

Ser

Pro

400

Lys

Glu

Gly <210> 225 <211> 214 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LC PD1B184 < 400> 225

Glu Ile Val Leu Thr

5

Gln Ser Pro Ala Thr

Leu Ser Leu Ser Pro

Glu Arg Ala Thr Leu 20

Ser Cys Arg Ala Ser

Gln Ser Val Arg Asn 30

Leu Ala Trp Tyr Gln 35

Gln Lys Pro Gly Gln 40

Ala Pro Arg Leu Leu 45

His Asp Ala Ser Asn 50

Arg Ala Thr Gly Ile 55

Pro Ala Arg Phe Ser 60

Ser Gly Ser Gly Thr 65

Asp Phe Thr Leu Thr 70

Ile Ser Ser Leu Glu 75

Glu Asp Phe Ala Val 85

Tyr Tyr Cys Gln Gln 90

Arg Asn Tyr Trp Pro 95

Thr Phe Gly Gln Gly

100

Thr Lys Val Glu Ile

105

Lys Arg Thr Val Ala

110

Pro Ser Val Phe Ile

115

Phe Pro Pro Ser Asp 120

Glu Gln Leu Lys Ser 125

Thr Ala Ser Val Val

130

Cys Leu Leu Asn Asn

135

Phe Tyr Pro Arg Glu 140

Gly

Tyr

Ile

Gly

Pro 80

Leu

Ala

Gly

Ala

- 283 045238

Lys Val Gln Trp 145

Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

150 155

Glu Ser Val Thr

Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Thr Leu Thr

180

Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

185 190

Ala Cys Glu Val

195

Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

200 205

Gln 160

Ser

Tyr

Ser

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 <210> 226 <211> 449 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> HC PD1B185 <400> 226

Gln Val Gln Leu Val

5

Gln Ser Gly Ala Glu

Val Lys Lys Pro Gly

Ser Val Lys Val Ser

Cys Lys Ala Ser Gly

Gly Thr Phe Ser Ser 30

Ala Ile Ser Trp Val 35

Arg Gln Ala Pro Gly 40

Gln Gly Leu Glu Trp 45

Gly Gly Ile Ile Pro 50

Ile Phe Gly Thr Ala 55

Asn Tyr Ala Gln Lys 60

Gln Gly Arg Val Thr 65

Ile Thr Ala Asp Glu 70

Ser Thr Ser Thr Ala 75

Met Glu Leu Ser Ser

Leu Arg Ser Glu Asp 90

Thr Ala Val Tyr Tyr 95

Ala Arg Pro Gly Leu

100

Ala Ala Ala Tyr Asp

105

Thr Gly Ser Leu Asp

110

Trp Gly Gln Gly Thr 115

Leu Val Thr Val Ser

120

Ser Ala Ser Thr Lys

125

Ser

Tyr

Met

Phe

Tyr 80

Cys

Tyr

Gly

- 284 045238

Pro

Thr 145

Thr

Pro

Thr

Asp

Cys 225

Ser

Arg

Pro

Ala

Val 305

Tyr

Thr

Leu

Cys

Ser Val Phe 130

Ala Ala Leu

Val Ser Trp

Ala Val Leu

180

Val Thr Ser

195

His Lys Pro 210

Cys Val Glu

Val Phe Leu

Thr Pro Glu

260

Glu Val Gln

275

Lys Thr Lys 290

Ser Val Leu

Lys Cys Lys

Ile Ser Lys

340

Pro Pro Ser

355

Leu Val Lys 370

Pro Leu Ala

135

Pro Cys Ser

Arg Ser Thr

140

Ser Glu Ser

Gly Cys Leu

150

Asn Ser Gly 165

Gln Ser Ser

Ser Asn Phe

Ser Asn Thr

215

Cys Pro Pro

230

Phe Pro Pro 245

Val Thr Cys

Phe Asn Trp

Pro Arg Glu

295

Thr Val Leu

310

Val Ser Asn 325

Thr Lys Gly

Arg Glu Glu

Gly Phe Tyr

375

Val Lys Asp

Ala Leu Thr

170

Gly Leu Tyr

185

Gly Thr Gln 200

Lys Val Asp

Cys Pro Ala

Lys Pro Lys

250

Val Val Val

265

Tyr Val Asp 280

Glu Gln Phe

His Gln Asp

Lys Gly Leu 330

Gln Pro Arg 345

Met Thr Lys 360

Pro Ser Asp

Tyr Phe Pro 155

Glu Pro Val

160

Ser Gly Val

Ser Leu Ser

Thr Tyr Thr

205

Lys Thr Val

220

Pro Pro Ala 235

Asp Thr Leu

Asp Val Ser

Gly Val Glu

285

Asn Ser Thr

300

Trp Leu Asn 315

Pro Ser Ser

Glu Pro Gln

Asn Gln Val

365

Ile Ala Val

380

His Thr Phe

175

Ser Val Val 190

Cys Asn Val

Glu Arg Lys

Ala Ala Ser

240

Met Ile Ser

255

Ala Glu Asp 270

Val His Asn

Phe Arg Val

Gly Lys Glu

320

Ile Glu Lys

335

Val Tyr Thr 350

Ser Leu Thr

Glu Trp Glu

- 285 045238

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

385 390

Lys Thr

395

Thr Pro Pro Met

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 405

Ser Lys 410

Leu Thr Val Asp

415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

420 425

Ser Cys

Ser Val Met His

430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

435 440

Ser Leu

Ser Leu Ser Pro

445

Leu 400

Lys

Glu

Gly

Lys <210> 227 <211> 214 <212> PRT <213> Искусственная <220>

<223> LC PD1B185 <400> 227

Glu Ile Val Leu Thr 1 5 последовательность

Gln Ser Pro Ala Thr

Leu Ser Leu Ser Pro

Glu Arg Ala Thr Leu 20

Ser Cys Arg Ala Ser

Gln Ser Val Arg Asn 30

Leu Ala Trp Tyr Gln 35

Gln Lys Pro Gly Gln 40

Ala Pro Arg Leu Leu 45

Tyr Asp Ala Ser Asp 50

Arg Ala Thr Gly Ile 55

Pro Ala Arg Phe Ser 60

Ser Gly Ser Gly Thr 65

Asp Phe Thr Leu Thr 70

Ile Ser Ser Leu Glu 75

Glu Asp Phe Ala Val 85

Tyr Tyr Cys Gln Gln 90

Arg Trp Asn Trp Pro 95

Thr Phe Gly Gln Gly

100

Thr Lys Val Glu Ile

105

Lys Arg Thr Val Ala

110

Pro Ser Val Phe Ile

115

Phe Pro Pro Ser Asp 120

Glu Gln Leu Lys Ser 125

Gly

Tyr

Ile

Gly

Pro 80

Leu

Ala

Gly

- 286 045238

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135

Tyr Pro Arg Glu 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155

Ser Gly Asn Ser

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170

Thr Tyr Ser Leu

175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185

Lys His Lys Val

190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200

Pro Val Thr Lys

205

Ala

Gln 160

Ser

Tyr

Ser

Phe Asn Arg

210

Gly Glu Cys <210> 228 <211> 449 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HC PD1B192 < 400> 228

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala 1 5

Glu Val Lys Lys Pro Gly 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 20 25

Gly Gly Thr Phe Ser Ser 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro

40

Gly Gln Gly Leu Glu Trp 45

Gly Gly Ile Ile 50

Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala

60

Gln Lys

Gln Gly Arg Val 65

Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser

75

Thr Ala

Met Glu Leu Ser

Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 85 90

Tyr Tyr

Ala Arg Pro Gly

100

Leu Ala Ala Ala Tyr Asp Thr Gly Ser 105

Leu Asp 110

Ser

Tyr

Met

Phe

Tyr 80

Cys

Tyr

- 287 045238

Trp

Pro

Thr 145

Thr

Pro

Thr

Asp

Cys 225

Ser

Arg

Pro

Ala

Val 305

Tyr

Thr

Leu

Gly Gln Gly 115

Thr Leu Val

Thr Val Ser 120

Ser Ala Ser

125

Thr Lys Gly

Ser Val Phe 130

Pro Leu Ala

135

Pro Cys Ser

Arg Ser Thr

140

Ser Glu Ser

Ala Ala Leu

Val Ser Trp

Ala Val Leu

180

Val Thr Ser

195

His Lys Pro 210

Cys Val Glu

Val Phe Leu

Thr Pro Glu

260

Glu Val Gln

275

Lys Thr Lys 290

Ser Val Leu

Lys Cys Lys

Ile Ser Lys

340

Pro Pro Ser

355

Gly Cys Leu

150

Asn Ser Gly 165

Gln Ser Ser

Ser Asn Phe

Ser Asn Thr

215

Cys Pro Pro

230

Phe Pro Pro 245

Val Thr Cys

Phe Asn Trp

Pro Arg Glu

295

Thr Val Leu

310

Val Ser Asn 325

Thr Lys Gly

Arg Glu Glu

Val Lys Asp

Ala Leu Thr

170

Gly Leu Tyr

185

Gly Thr Gln 200

Lys Val Asp

Cys Pro Ala

Lys Pro Lys

250

Val Val Val

265

Tyr Val Asp 280

Glu Gln Phe

His Gln Asp

Lys Gly Leu

330

Gln Pro Arg

345

Met Thr Lys 360

Tyr Phe Pro 155

Glu Pro Val

160

Ser Gly Val

Ser Leu Ser

Thr Tyr Thr

205

Lys Thr Val

220

Pro Pro Ala 235

Asp Thr Leu

Asp Val Ser

Gly Val Glu

285

Asn Ser Thr

300

Trp Leu Asn 315

Pro Ser Ser

Glu Pro Gln

Asn Gln Val

365

His Thr Phe

175

Ser Val Val 190

Cys Asn Val

Glu Arg Lys

Ala Ala Ser

240

Met Ile Ser

255

Ala Glu Asp 270

Val His Asn

Phe Arg Val

Gly Lys Glu

320

Ile Glu Lys

335

Val Tyr Thr 350

Ser Leu Thr

- 288 045238

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

370 375

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

385 390

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu

395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

405

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 420

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

435 440

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

445

Lys <210> 229 < 211> 214 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> LC or PD1B192 <400> 229

Glu Ile Val 1

Leu Thr Gln Ser Pro Ala

Thr Leu Ser Leu Ser Pro

15

Gly

Glu Arg Ala

Thr Leu Ser Cys Arg Ala

25

Ser Gln Ser Val Asp Ser 30

Tyr

Leu Ala Trp

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

Gln Ala Pro Arg Leu Leu 45

Ile

His Asp Ala 50

Ser Asn Arg Ala Thr Gly 55

Ile Pro Ala Arg Phe Ser 60

Gly

Ser Gly Ser Gly 65

Thr Asp Phe Thr 70

Leu Thr Ile Ser

Ser Leu Glu Pro

Glu Asp Phe Ala

Val Tyr Tyr Cys 85

Gln Gln Arg Asn 90

Tyr Trp Pro Leu 95

Thr Phe Gly Gln

100

Gly Thr Lys Val

Glu Ile Lys Arg 105

Thr Val Ala Ala

110

- 289 045238

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120

Gln Leu Lys Ser 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135

Tyr Pro Arg Glu 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155

Ser Gly Asn Ser

Glu Ser Val Thr

Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Thr

Leu Thr

180

Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

185 190

Ala Cys

Glu Val 195

Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

200 205

Gly

Ala

Gln 160

Ser

Tyr

Ser

Phe Asn Arg

210

Gly Glu Cys <210> 230 <211> 120 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> VH Keytruda <400>230

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly

5 1015

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn

2530

Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp 35 4045

Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys 50 5560

Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala 65 7075

Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 9095

Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly

Ala

Tyr

Met

Phe

Tyr 80

Cys

Gln

- 290 045238

100

105

110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

120 <210> 231 <211> 111 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> VL Keytruda <400>231

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro 1 5 1015

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr

2530

Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 35 4045

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro

5560

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 7075

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser 85 9095

Gly

Ser

Pro

Ala

Ser 80

Arg

Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105110 <210> 232 <211> 113 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> VH ниволумаба <400> 232

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly

5 10 15

Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser

Gly Ile Thr Phe Ser Asn 30

Arg

Ser

- 291 045238

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 35 40

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr 50 55

Gly Leu Glu Trp Val 45

Tyr Ala Asp Ser Val 60

Lys Gly Arg Phe Thr 65

Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

75 80

Leu Gln Met Asn Ser

Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 90 95

Ala Thr Asn Asp Asp

100

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

105 110

Ser <210> 233 <211> 107 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> VL ниволумаба < 400> 233

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro 1 5

Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg 20

Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

40

Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr

55

Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 85

Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg

95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val

100

Glu Ile Lys 105 <210> 234

- 292 045238 <211> 121 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> VH дурвалумаба <400> 234

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 1 5

Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20

Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala

40

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 45

Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser

55

Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 65 70

Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala 85

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

95

Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly

100

Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly

105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115120

Ser <210>235 <211>108 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> VL дурвалумаба <400> 235

Glu Ile Val Leu

Thr Gln Ser Pro 5

Gly Thr Leu Ser 10

Leu Ser Pro Gly 15

Glu Arg Ala Thr 20

Leu Ser Cys Arg

Ala Ser Gln Arg 25

Val Ser Ser Ser

Tyr Leu Ala Trp

Tyr Gln Gln Lys 40

Pro Gly Gln Ala

Pro Arg Leu Leu 45

- 293 045238

Ile

Tyr Asp 50

Ala

Ser

Arg 55

Ala

Thr

Gly

Ile

Pro 60

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly 65

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr 70

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr 75

Ile

Ser

Arg

Leu

Glu 80

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala 85

Val

Tyr

Cys

Gln 90

Gln

Tyr

Gly

Ser

Leu 95

Pro

Trp

Thr

Phe

Gly 100

Gln

Gly

Thr

Lys

Val 105

Glu

Ile

Lys

<210> 236 <211> 118 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> VH атезолизумаба <400>236

Glu Val Gln Leu Val

5

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 2025

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro 3540

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser 5055

Gly	Phe	Thr	Phe	Ser 30	Asp	Ser
Gly	Lys	Gly	Leu 45	Glu	Trp	Val
Thr	Tyr	Tyr 60	Ala	Asp	Ser	Val

Lys Gly Arg Phe 65

Thr Ile Ser Ala Asp Thr 70

Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

80

Leu Gln Met Asn

Ser Leu Arg Ala Glu Asp 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 95

Ala Arg Arg His

100

Trp Pro Gly Gly Phe Asp

105

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115 <210> 237 <211> 107 <212> PRT <213> Искусственная последовательность

- 294 045238 <220>

<223>

VL атезолизумаба <400>

237

Asp

Ile

Gln

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Asp

Arg

Val

Thr 20

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala 25

Ser

Gln

Asp

Val

Ser 30

Thr

Val

Ala

Trp 35

Tyr

Gln

Lys

Pro 40

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys 45

Leu

Tyr

Ser 50

Ala

Ser

Phe

Leu

Tyr 55

Ser

Gly

Val

Pro

Ser 60

Arg

Phe

Ser

Ser 65

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp 70

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile 75

Ser

Leu

Gln

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr 85

Tyr

Cys

Gln

Gln 90

Tyr

Leu

Tyr

His

Pro 95

Gly

Ala

Ile

Gly

Pro 80

Ala

Thr

Phe

Gly

Gln

100

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

105

Ile

Lys <210>

<211>

<212>

<213>

238

120

PRT

Искусственная последовательность <220>

<223>

VH авелумаба <400>

238

Glu

Val

Gln

Leu

Leu 5

Glu

Ser

Gly

Leu

Val

Gln

Pro

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu 20

Ser

Cys

Ala

Ser 25

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser 30

Ser

Ile

Met

Met 35

Trp

Val

Arg

Gln

Ala 40

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu 45

Glu

Trp

Ser

Ser 50

Ile

Tyr

Pro

Ser

Gly 55

Gly

Ile

Thr

Phe

Tyr 60

Ala

Asp

Thr

Lys 65

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile 70

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser 75

Lys

Asn

Thr

Leu

Gly

Tyr

Val

Tyr 80

- 295 045238

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 8590

Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val

100105

Ala Val Tyr Tyr Cys

Asp Tyr Trp Gly Gln 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115120 <210>239 <211>110 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

< 223> VL авелумаба < 400>239

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

5 1015

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 2530

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 4045

Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 5560

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 7580

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser 85 9095

Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100 105110 < 210>240 < 211>443 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность < 220>

< 223> Тяжелая цепь TM3B105 < 400> 240

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

5 10 15

- 296 045238

Ser

Ala

Ser

Lys 65

Leu

Ala

Val

Ala

Leu 145

Gly

Ser

Phe

Thr

Pro 225

Pro

Cys

Leu Arg

Met Ser

Ala Ile 50

Gly Arg

Gln Met

Lys Ser

Thr Val

115

Pro Cys 130

Val Lys

Ala Leu

Gly Leu

Gly Thr

195

Lys Val 210

Cys Pro

Lys Pro

Val Val

Leu Ser 20

Trp Val

Ser Gly

Phe Thr

Cys Ala

Arg Gln

Ser Gly 55

Ile Ser 70

Asn Ser

Pro Tyr 100

Ser Ser

Ser Arg

Asp Tyr

Thr Ser

165

Tyr Ser 180

Gln Thr

Asp Lys

Ala Pro

Lys Asp

245

Val Asp 260

Leu Arg

Ala Pro

Ala Ser

Ser Thr

135

Phe Pro 150

Gly Val

Leu Ser

Tyr Thr

Thr Val

215

Pro Ala 230

Thr Leu

Val Ser

Ala Ser 25

Ala Pro 40

Gly Ser

Arg Asp

Ala Glu

Leu Asp

105

Thr Lys 120

Ser Glu

Glu Pro

His Thr

Ser Val

185

Cys Asn 200

Glu Arg

Ala Ala

Met Ile

Ala Glu

265

Gly Phe

Gly Lys

Thr Tyr

Asn Ser

Asp Thr 90

Tyr Trp

Gly Pro

Ser Thr

Val Thr

155

Phe Pro 170

Val Thr

Val Asp

Lys Cys

Ser Ser

235

Ser Arg 250

Asp Pro

Thr Phe

Gly Leu 45

Tyr Ala 60

Lys Asn

Ala Val

Gly Gln

Ser Val

125

Ala Ala

140

Val Ser

Ala Val

Val Thr

His Lys

205

Cys Val 220

Val Phe

Thr Pro

Glu Val

Ser Ser 30

Glu Trp

Asp Ser

Thr Leu

Tyr Tyr

Gly Thr 110

Phe Pro

Leu Gly

Trp Asn

Leu Gln

175

Ser Ser 190

Pro Ser

Glu Cys

Leu Phe

Glu Val

255

Gln Phe

270

Tyr

Val

Tyr 80

Cys

Leu

Cys

Ser 160

Ser

Asn

Pro

Pro 240

Thr

Asn

- 297 045238

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

285

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

290 295300

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

305 310 315320

Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys

325 330335

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

340 345350

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

355 360365

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

370 375380

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

385 390 395400

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

405 410415

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

420 425430

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435440

<210> <211> <212> <213>	241 449 PRT Искусственная последовательность
<220> <223>	HC1	биспецифического	mAb
<400>	241
Gln Val 1	Gln	Leu Val Gln Ser 5	Gly	Ala	Glu 10	Val	Lys	Lys	Pro	Gly 15	Ser
Ser Val	Lys	Val Ser Cys Lys 20	Ala	Ser 25	Gly	Gly	Thr	Phe	Ser 30	Ser	Tyr

- 298 045238

Ala

Gly

Gln 65

Met

Ala

Trp

Pro

Thr 145

Thr

Pro

Thr

Asp

Cys 225

Ser

Arg

Pro

Ile Ser Trp Val Arg 35

Gly Ile Ile Pro Ile 50

Gly Arg Val Thr Ile 70

Glu Leu Ser Ser Leu

Arg Pro Gly Leu Ala 100

Gly Gln Gly Thr Leu 115

Ser Val Phe Pro Leu 130

Ala Ala Leu Gly Cys

150

Val Ser Trp Asn Ser

165

Ala Val Leu Gln Ser

180

Val Pro Ser Ser Asn

195

His Lys Pro Ser Asn 210

Cys Val Glu Cys Pro

230

Val Phe Leu Phe Pro

245

Thr Pro Glu Val Thr

260

Glu Val Gln Phe Asn

275

Gln Ala Pro Gly Gln 40

Phe Asp Thr Ala Asn 55

Thr Ala Asp Glu Ser

Arg Ser Glu Asp Thr

Ala Ala Tyr Asp Thr 105

Val Thr Val Ser Ser

120

Ala Pro Cys Ser Arg 135

Leu Val Lys Asp Tyr

155

Gly Ala Leu Thr Ser

170

Ser Gly Leu Tyr Ser

185

Phe Gly Thr Gln Thr 200

Thr Lys Val Asp Lys 215

Pro Cys Pro Ala Pro

235

Pro Lys Pro Lys Asp

250

Cys Val Val Val Asp

265

Trp Tyr Val Asp Gly

280

Gly Leu Glu Trp Met 45

Tyr Ala Gln Lys Phe 60

Thr Ser Thr Ala Tyr 80

Ala Val Tyr Tyr Cys 95

Gly Ser Leu Asp Tyr

110

Ala Ser Thr Lys Gly 125

Ser Thr Ser Glu Ser 140

Phe Pro Glu Pro Val

160

Gly Val His Thr Phe

175

Leu Ser Ser Val Val

190

Tyr Thr Cys Asn Val

205

Thr Val Glu Arg Lys 220

Pro Val Ala Gly Pro

240

Thr Leu Met Ile Ser

255

Val Ser His Glu Asp

270

Val Glu Val His Asn

285

- 299 045238

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

290 295

Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val 300

Val Ser Val Leu Thr Val Val His

305 310

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

325

Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

330 335

Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 340

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

355 360

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

370 375

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

385 390

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu

395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Leu Leu 405

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 420

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

435 440

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

445

Lys <210> 242 <211> 444 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> HC1 биспецифического mAb <400> 242

Glu Val Gln Leu 1

Val Glu Ser Gly 5

Gly Gly Leu Val 10

Gln Pro Gly Gly

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20

Ser Gly Phe Ala Phe Ser Arg Tyr 25 30

- 300 045238

Asp

Ala

Lys 65

Leu

Ala

Val

Ala

Leu 145

Gly

Ser

Leu

Thr

Pro 225

Pro

Thr

Asn

Met Ser Trp Val Arg 35

Tyr Ile Ser Gly Gly 50

Gly Arg Phe Thr Ile 70

Gln Met Asn Ser Leu

Ser Pro Tyr Leu Ser 100

Thr Val Ser Ser Ala

115

Pro Cys Ser Arg Ser 130

Val Lys Asp Tyr Phe

150

Ala Leu Thr Ser Gly

165

Gly Leu Tyr Ser Leu

180

Gly Thr Lys Thr Tyr

195

Lys Val Asp Lys Arg 210

Cys Pro Ala Pro Glu

230

Pro Lys Pro Lys Asp

245

Cys Val Val Val Asp

260

Trp Tyr Val Asp Gly

275

Gln Ala Pro Gly Lys 40

Gly Ala Asn Thr Tyr 55

Ser Arg Asp Asn Ala

Arg Ala Glu Asp Thr

Tyr Phe Asp Val Trp 105

Ser Thr Lys Gly Pro 120

Thr Ser Glu Ser Thr 135

Pro Glu Pro Val Thr

155

Val His Thr Phe Pro

170

Ser Ser Val Val Thr

185

Thr Cys Asn Val Asp

200

Val Glu Ser Lys Tyr 215

Phe Leu Gly Gly Pro

235

Thr Leu Met Ile Ser

250

Val Ser Gln Glu Asp

265

Val Glu Val His Asn

280

Gly Leu Glu Ser Val 45

Tyr Leu Asp Asn Val 60

Lys Asn Ser Leu Tyr 80

Ala Val Tyr Tyr Cys 95

Gly Gln Gly Thr Leu

110

Ser Val Phe Pro Leu

125

Ala Ala Leu Gly Cys 140

Val Ser Trp Asn Ser

160

Ala Val Leu Gln Ser

175

Val Pro Ser Ser Ser

190

His Lys Pro Ser Asn

205

Gly Pro Pro Cys Pro 220

Ser Val Phe Leu Phe

240

Arg Thr Pro Glu Val

255

Pro Glu Val Gln Phe

270

Ala Lys Thr Lys Pro

285

- 301 045238

Arg Glu Glu Gln Phe 290

Asn Ser Thr Tyr Arg 295

Val Val Ser Val Leu

300

Val Leu His Gln Asp 305

Trp Leu Asn Gly Lys 310

Glu Tyr Lys Cys Lys 315

Ser Asn Lys Gly Leu

325

Pro Ser Ser Ile Glu

330

Lys Thr Ile Ser Lys

335

Lys Gly Gln Pro Arg

340

Glu Pro Gln Val Tyr

345

Thr Leu Pro Pro Ser

350

Glu Glu Met Thr Lys

355

Asn Gln Val Ser Leu

360

Thr Cys Leu Val Lys

365

Phe Tyr Pro Ser Asp

370

Ile Ala Val Glu Trp

375

Glu Ser Asn Gly Gln 380

Glu Asn Asn Tyr Lys 385

Thr Thr Pro Pro Val 390

Leu Asp Ser Asp Gly 395

Phe Phe Leu Tyr Ser

405

Arg Leu Thr Val Asp

410

Lys Ser Arg Trp Gln

415

Gly Asn Val Phe Ser

420

Cys Ser Val Met His

425

Glu Ala Leu His Asn

430

Thr

Val 320

Ala

Gln

Gly

Pro

Ser 400

Glu

His

Tyr Thr Gln Lys Ser 435

Leu Ser Leu Ser Leu

440

Gly Lys <210> 243 <211> 450 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> HC1 биспецифического mAb <400> 243

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly

5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 20 25

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro

40

Gly Gly Thr Phe Ser Ser 30

Gly Gln Gly Leu Glu Trp 45

Ser

Tyr

Met

- 302 045238

Gly Gly Ile Ile Pro 50

Ile Phe Asp Thr Ala 55

Asn Tyr Ala Gln Lys 60

Gln Gly Arg Val Thr 65

Ile Thr Ala Asp Glu 70

Ser Thr Ser Thr Ala 75

Met Glu Leu Ser Ser

Leu Arg Ser Glu Asp 90

Thr Ala Val Tyr Tyr 95

Ala Arg Pro Gly Leu

100

Ala Ala Ala Tyr Asp

105

Thr Gly Ser Leu Asp

110

Trp Gly Gln Gly Thr 115

Leu Val Thr Val Ser

120

Ser Ala Ser Thr Lys

125

Pro Ser Val Phe Pro

130

Leu Ala Pro Cys Ser

135

Arg Ser Thr Ser Glu 140

Thr Ala Ala Leu Gly 145

Cys Leu Val Lys Asp 150

Tyr Phe Pro Glu Pro 155

Thr Val Ser Trp Asn

165

Ser Gly Ala Leu Thr

170

Ser Gly Val His Thr

175

Pro Ala Val Leu Gln

180

Ser Ser Gly Leu Tyr

185

Ser Leu Ser Ser Val

190

Thr Val Pro Ser Ser

195

Ser Leu Gly Thr Lys

200

Thr Tyr Thr Cys Asn

205

Asp His Lys Pro Ser 210

Asn Thr Lys Val Asp 215

Lys Arg Val Glu Ser

220

Tyr Gly Pro Pro Cys 225

Pro Pro Cys Pro Ala 230

Pro Glu Phe Leu Gly 235

Pro Ser Val Phe Leu

245

Phe Pro Pro Lys Pro

250

Lys Asp Thr Leu Met

255

Ser Arg Thr Pro Glu

260

Val Thr Cys Val Val

265

Val Asp Val Ser Gln

270

Asp Pro Glu Val Gln

275

Phe Asn Trp Tyr Val

280

Asp Gly Val Glu Val

285

Asn Ala Lys Thr Lys 290

Pro Arg Glu Glu Gln

295

Phe Asn Ser Thr Tyr

300

Phe

Tyr 80

Cys

Tyr

Gly

Ser

Val 160

Phe

Val

Lys

Gly 240

Ile

Glu

His

Arg

- 303 045238

Val Val Ser Val Leu 305

Thr Val Leu His Gln 310

Asp Trp Leu Asn Gly 315

Glu Tyr Lys Cys Lys

325

Val Ser Asn Lys Gly

330

Leu Pro Ser Ser Ile

335

Lys Thr Ile Ser Lys

340

Ala Lys Gly Gln Pro

345

Arg Glu Pro Gln Val

350

Thr Leu Pro Pro Ser

355

Gln Glu Glu Met Thr

360

Lys Asn Gln Val Ser

365

Thr Cys Leu Val Lys

370

Gly Phe Tyr Pro Ser

375

Asp Ile Ala Val Glu

380

Glu Ser Asn Gly Gln 385

Pro Glu Asn Asn Tyr 390

Lys Thr Thr Pro Pro 395

Leu Asp Ser Asp Gly

405

Ser Phe Phe Leu Tyr

410

Ser Arg Leu Thr Val

415

Lys Ser Arg Trp Gln

420

Glu Gly Asn Val Phe

425

Ser Cys Ser Val Met

430

Glu Ala Leu His Asn

435

His Tyr Thr Gln Lys

440

Ser Leu Ser Leu Ser

445

Lys 320

Glu

Tyr

Leu

Trp

Val 400

Asp

His

Leu

Gly Lys

450 <210> 244 <211> 450 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> HC2 биспецифического mAb <400> 244

Glu Val Gln 1

Leu Val Gln Ser Gly Ala 5

Glu Val Lys Lys Pro Gly 10 15

Ser Leu Lys

Ile Ser Cys Lys Gly Ser

25

Trp Met Gln

Trp Val Arg Gln Met Pro

Gly Tyr Ser Phe Thr Ser 30

Gly Lys Gly Leu Glu Trp 45

Glu

Tyr

Met

- 304 045238

Gly

Lys 65

Leu

Ala

Tyr

Gly

Ser 145

Val

Phe

Val

Lys 225

Pro

Ser

Asp

Asn

Ala Ile Tyr 50

Gly Gln Val

Gln Trp Ser

Arg Trp Glu

100

Trp Gly Gln 115

Pro Ser Val 130

Thr Ala Ala

Thr Val Ser

Pro Ala Val

180

Thr Val Pro

195

Asp His Lys 210

Cys Cys Val

Ser Val Phe

Arg Thr Pro

260

Pro Glu Val

275

Ala Lys Thr 290

Pro Gly Asp

Thr Ile Ser

Ser Leu Lys 85

Lys Ser Thr

Gly Thr Thr

Phe Pro Leu

135

Leu Gly Cys

150

Trp Asn Ser 165

Leu Gln Ser

Ser Ser Asn

Pro Ser Asn

215

Glu Cys Pro

230

Leu Phe Pro 245

Glu Val Thr

Gln Phe Asn

Lys Pro Arg

295

Gly Asp Ile

Ala Asp Lys

Ala Ser Asp

Thr Val Val

105

Val Thr Val 120

Ala Pro Cys

Leu Val Lys

Gly Ala Leu

170

Ser Gly Leu

185

Phe Gly Thr 200

Thr Lys Val

Pro Cys Pro

Pro Lys Pro

250

Cys Val Val

265

Trp Tyr Val 280

Glu Glu Gln

Arg Tyr Thr 60

Gln Asn Phe

Ser Ile Ser 75

Thr Ala Tyr

Thr Ala Met

Tyr Tyr Cys 95

Gln Arg Asn

Tyr Phe Asp 110

Ser Ser Ala

125

Ser Arg Ser

140

Asp Tyr Phe 155

Thr Ser Gly

Tyr Ser Leu

Gln Thr Tyr

205

Asp Lys Thr 220

Ala Pro Pro 235

Lys Asp Thr

Val Asp Val

Asp Gly Val

285

Phe Asn Ser

300

Ser Thr Lys

Thr Ser Glu

Pro Glu Pro

160

Val His Thr

175

Ser Ser Val 190

Thr Cys Asn

Val Glu Arg

Val Ala Gly

240

Leu Met Ile

255

Ser His Glu 270

Glu Val His

Thr Phe Arg

- 305 045238

Val Val Ser Val Leu 305

Thr Val Val His Gln 310

Asp Trp Leu Asn Gly 315

Glu Tyr Lys Cys Lys

325

Val Ser Asn Lys Gly

330

Leu Pro Ala Pro Ile

335

Lys Thr Ile Ser Lys

340

Thr Lys Gly Gln Pro

345

Arg Glu Pro Gln Val

350

Thr Leu Pro Pro Ser

355

Arg Glu Glu Met Thr 360

Lys Asn Gln Val Ser

365

Thr Cys Leu Val Lys

370

Gly Phe Tyr Pro Ser

375

Asp Ile Ala Val Glu

380

Glu Ser Asn Gly Gln 385

Pro Glu Asn Asn Tyr 390

Lys Thr Thr Pro Pro 395

Leu Asp Ser Asp Gly

405

Ser Phe Phe Leu Tyr

410

Ser Arg Leu Thr Val

415

Lys Ser Arg Trp Gln

420

Gln Gly Asn Val Phe

425

Ser Cys Ser Val Met

430

Glu Ala Leu His Asn

435

His Tyr Thr Gln Lys

440

Ser Leu Ser Leu Ser

445

Lys 320

Glu

Tyr

Leu

Trp

Met 400

Asp

His

Pro

Gly Lys

450 <210> 245 <211> 443 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> HC2 биспецифического mAb <400> 245

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly 1 5

Gly Leu Val Gln Pro Gly 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro

40

Gly Phe Thr Phe Ser Ser 30

Gly Lys Gly Leu Glu Trp 45

Gly

Tyr

Val

- 306 045238

Ser

Lys 65

Leu

Ala

Val

Ala

Leu 145

Gly

Ser

Phe

Thr

Pro 225

Pro

Cys

Trp

Glu

Ala Ile Ser 50

Gly Arg Phe

Gln Met Asn

Lys Ser Pro

100

Thr Val Ser

115

Pro Cys Ser 130

Val Lys Asp

Ala Leu Thr

Gly Leu Tyr

180

Gly Thr Gln

195

Lys Val Asp 210

Cys Pro Ala

Lys Pro Lys

Val Val Val

260

Tyr Val Asp

275

Glu Gln Phe 290

Gly Ser Gly 55

Thr Ile Ser

Ser Leu Arg 85

Tyr Ala Pro

Ser Ala Ser

Arg Ser Thr

135

Tyr Phe Pro

150

Ser Gly Val 165

Ser Leu Ser

Thr Tyr Thr

Lys Thr Val

215

Pro Pro Val

230

Asp Thr Leu 245

Asp Val Ser

Gly Val Glu

Asn Ser Thr

295

Gly Ser Thr

Arg Asp Asn

Ala Glu Asp

Leu Asp Tyr

105

Thr Lys Gly 120

Ser Glu Ser

Glu Pro Val

His Thr Phe

170

Ser Val Val

185

Cys Asn Val 200

Glu Arg Lys

Ala Gly Pro

Met Ile Ser

250

His Glu Asp

265

Val His Asn 280

Phe Arg Val

Tyr Tyr Ala 60

Ser Lys Asn 75

Thr Ala Val

Trp Gly Gln

Pro Ser Val

125

Thr Ala Ala

140

Thr Val Ser 155

Pro Ala Val

Thr Val Pro

Asp His Lys

205

Cys Cys Val

220

Ser Val Phe 235

Arg Thr Pro

Pro Glu Val

Ala Lys Thr

285

Val Ser Val

300

Asp Ser Val

Thr Leu Tyr

Tyr Tyr Cys 95

Gly Thr Leu 110

Phe Pro Leu

Leu Gly Cys

Trp Asn Ser

160

Leu Gln Ser

175

Ser Ser Asn 190

Pro Ser Asn

Glu Cys Pro

Leu Phe Pro

240

Glu Val Thr

255

Gln Phe Asn 270

Lys Pro Arg

Leu Thr Val

- 307 045238

Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310315

Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro

325

Lys Cys Lys Val Ser

320

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys

330335

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

340 345350

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

355 360365

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

370 375380

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

385 390 395400

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

405 410415

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

420 425430

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435440 <210>246 <211>444 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HC2 биспецифического mAb < 400> 246

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly 1 5

Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20

Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala

40

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly

55

Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 60

- 308 045238

Lys 65

Leu

Ala

Val

Ala

Leu 145

Gly

Ser

Leu

Thr

Pro 225

Pro

Thr

Asn

Arg

Val 305

Gly Arg

Gln Met

Lys Ser

Thr Val

115

Pro Cys 130

Val Lys

Ala Leu

Gly Leu

Gly Thr

195

Lys Val 210

Cys Pro

Pro Lys

Cys Val

Trp Tyr

275

Glu Glu

290

Leu His

Phe Thr

Asn Ser

Pro Tyr 100

Ser Ser

Ser Arg

Asp Tyr

Thr Ser

165

Tyr Ser 180

Lys Thr

Asp Lys

Ala Pro

Pro Lys

245

Val Val 260

Val Asp

Gln Phe

Gln Asp

Ile Ser 70

Leu Arg

Ala Pro

Ala Ser

Arg Asp

Asn Ser

Lys Asn

Thr Leu

Ser Thr

135

Phe Pro 150

Gly Val

Leu Ser

Tyr Thr

Arg Val

215

Glu Phe

230

Asp Thr

Asp Val

Gly Val

Asn Ser

295

Trp Leu 310

Ala Glu

Leu Asp 105

Thr Lys 120

Ser Glu

Glu Pro

His Thr

Asp Thr 90

Ala Val

Tyr Tyr

Tyr Trp

Gly Gln

Gly Thr 110

Gly Pro

Ser Val

125

Phe Pro

Ser Thr

Val Thr

155

Phe Pro 170

Ala Ala 140

Val Ser

Ala Val

Leu Gly

Trp Asn

Leu Gln

175

Ser Val

185

Cys Asn 200

Glu Ser

Leu Gly

Leu Met

Ser Gln

265

Glu Val

280

Thr Tyr

Asn Gly

Val Thr

Val Asp

Lys Tyr

Gly Pro

235

Ile Ser 250

Glu Asp

His Asn

Arg Val

Lys Glu

315

Val Pro

His Lys

205

Gly Pro 220

Ser Val

Arg Thr

Pro Glu

Ala Lys

285

Val Ser 300

Tyr Lys

Ser Ser 190

Pro Ser

Pro Cys

Phe Leu

Pro Glu

255

Val Gln 270

Thr Lys

Val Leu

Cys Lys

Tyr 80

Cys

Leu

Cys

Ser 160

Ser

Asn

Pro

Phe 240

Val

Phe

Pro

Thr

Val 320

- 309 045238

Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

325

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

330 335

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 340

Gln Val

345

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln

350

Glu Glu Met

355

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 360

Thr Cys Leu Val Lys Gly 365

Phe Tyr Pro

370

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

375

Glu Ser Asn Gly Gln Pro

380

Glu Asn Asn 385

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 390

Leu Asp Ser Asp Gly Ser

395 400

Phe

Leu

Tyr

Ser

405

Lys

Leu

Thr

Val

Asp 410

Lys

Ser

Arg

Trp

Gln

415

Glu

Gly

Asn

Val

Phe

420

Ser

Cys

Ser

Val

Met

425

His

Glu

Ala

Leu

His

430

Asn

His

Tyr

Thr

Gln

435

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

440

Ser

Leu

Gly

Lys <210> 247 <211> 451 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> HC2 биспецифического mAb <400> 247

Glu Val Gln Leu 1

Val Gln Ser Gly 5

Ala Glu Val Lys 10

Ser Leu Lys Ile 20

Ser Cys Lys Gly

Ser Gly Tyr Ser 25

Lys Pro Gly Glu 15

Phe Thr Ser Tyr 30

Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Met Pro

40

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp

55

Lys Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp 65 70

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 45

Ile Arg Tyr Thr Gln Asn Phe 60

Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 75 80

- 310 045238

Leu

Ala

Tyr

Gly

Ser 145

Val

Phe

Val

Lys 225

Gly

Ile

Glu

His

Arg 305

Lys

Gln Trp Ser

Ser Leu Lys 85

Ala Ser Asp

Thr Ala Met

Tyr Tyr Cys 95

Arg Trp Glu

100

Trp Gly Gln 115

Pro Ser Val 130

Thr Ala Ala

Thr Val Ser

Pro Ala Val

180

Thr Val Pro

195

Asp His Lys 210

Tyr Gly Pro

Pro Ser Val

Ser Arg Thr

260

Asp Pro Glu

275

Asn Ala Lys 290

Val Val Ser

Glu Tyr Lys

Lys Ser Thr

Thr Val Val

105

Gln Arg Asn

Tyr Phe Asp 110

Gly Thr Thr

Phe Pro Leu

135

Leu Gly Cys

150

Trp Asn Ser 165

Leu Gln Ser

Ser Ser Ser

Pro Ser Asn

215

Pro Cys Pro

230

Phe Leu Phe 245

Pro Glu Val

Val Gln Phe

Thr Lys Pro

295

Val Leu Thr

310

Cys Lys Val 325

Val Thr Val 120

Ala Pro Cys

Leu Val Lys

Gly Ala Leu

170

Ser Gly Leu

185

Leu Gly Thr 200

Thr Lys Val

Pro Cys Pro

Pro Pro Lys

250

Thr Cys Val

265

Asn Trp Tyr 280

Arg Glu Glu

Val Leu His

Ser Asn Lys

330

Ser Ser Ala

125

Ser Arg Ser

140

Asp Tyr Phe 155

Thr Ser Gly

Tyr Ser Leu

Lys Thr Tyr

205

Asp Lys Arg

220

Ala Pro Glu 235

Pro Lys Asp

Val Val Asp

Val Asp Gly

285

Gln Phe Asn

300

Gln Asp Trp 315

Gly Leu Pro

Ser Thr Lys

Thr Ser Glu

Pro Glu Pro

160

Val His Thr

175

Ser Ser Val 190

Thr Cys Asn

Val Glu Ser

Phe Leu Gly

240

Thr Leu Met

255

Val Ser Gln 270

Val Glu Val

Ser Thr Tyr

Leu Asn Gly

320

Ser Ser Ile

335

- 311 045238

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 340

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 355 360

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

345 350

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 365

Leu

Trp 385

Val

Asp

His

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

370 375

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 390

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Leu Leu

405 410

Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val

420 425

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

435 440

Ser Asp

380

Tyr Lys 395

Tyr Ser

Phe Ser

Lys Ser

Ile Ala Val

Thr Thr Pro

Lys Leu Thr

415

Cys Ser Val

430

Leu Ser Leu 445

Val

Ser

Glu

Pro 400

Val

Met

Ser

Leu Gly Lys

450 <210> 248 <211> 443 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> HC2 биспецифического mAb < 400>248

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser

2530

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 4045

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 50 5560

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 65 7075

Gly

Tyr

Val

Tyr 80

- 312 045238

Leu

Ala

Val

Ala

Leu 145

Gly

Ser

Phe

Thr

Pro 225

Pro

Cys

Trp

Glu

Leu 305

Asn

Gln Met Asn

Lys Ser Pro

100

Thr Val Ser

115

Pro Cys Ser 130

Val Lys Asp

Ala Leu Thr

Gly Leu Tyr

180

Gly Thr Gln

195

Lys Val Asp 210

Cys Pro Ala

Lys Pro Lys

Val Val Val

260

Tyr Val Asp

275

Glu Gln Phe 290

His Gln Asp

Lys Gly Leu

Ser Leu Arg 85

Tyr Ala Pro

Ser Ala Ser

Arg Ser Thr

135

Tyr Phe Pro

150

Ser Gly Val 165

Ser Leu Ser

Thr Tyr Thr

Lys Thr Val

215

Pro Pro Ala

230

Asp Thr Leu 245

Asp Val Ser

Gly Val Glu

Asn Ser Thr

295

Trp Leu Asn

310

Pro Ser Ser 325

Ala Glu Asp

Leu Asp Tyr

105

Thr Lys Gly 120

Ser Glu Ser

Glu Pro Val

His Thr Phe

170

Ser Val Val

185

Cys Asn Val 200

Glu Arg Lys

Ala Ala Ser

Met Ile Ser

250

Ala Glu Asp

265

Val His Asn 280

Phe Arg Val

Gly Lys Glu

Ile Glu Lys

330

Thr Ala Val

Trp Gly Gln

Pro Ser Val

125

Thr Ala Ala

140

Thr Val Ser 155

Pro Ala Val

Thr Val Pro

Asp His Lys

205

Cys Cys Val

220

Ser Val Phe 235

Arg Thr Pro

Pro Glu Val

Ala Lys Thr

285

Val Ser Val

300

Tyr Lys Cys 315

Thr Ile Ser

Tyr Tyr Cys 95

Gly Thr Leu 110

Phe Pro Leu

Leu Gly Cys

Trp Asn Ser

160

Leu Gln Ser

175

Ser Ser Asn 190

Pro Ser Asn

Glu Cys Pro

Leu Phe Pro

240

Glu Val Thr

255

Gln Phe Asn 270

Lys Pro Arg

Leu Thr Val

Lys Val Ser

320

Lys Thr Lys

335

- 313 045238

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

345 350

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 355

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

360 365

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 380

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met 385 390

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

395 400

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp 405

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

410 415

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425

Glu Ala Leu His Asn His Tyr 430

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 <210> 249 <211> 455 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> HC1 mAb EM1 <400> 249

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Val Ile Trp Asp Asp Gly Ser Tyr Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

- 314 045238

Ala

Asp

Lys

Gly 145

Pro

Thr

Val

Asn

Pro 225

Glu

Asp

Gly

Asn 305

Trp

Pro

Arg Asp Gly

100

Tyr Trp Gly 115

Gly Pro Ser 130

Gly Thr Ala

Val Thr Val

Phe Pro Ala

180

Val Thr Val

195

Val Asn His 210

Lys Ser Cys

Leu Leu Gly

Thr Leu Met

260

Val Ser His

275

Val Glu Val 290

Ser Thr Tyr

Leu Asn Gly

Ala Pro Ile

340

Ile Thr Met

Gln Gly Thr

Val Phe Pro

135

Ala Leu Gly

150

Ser Trp Asn 165

Val Leu Gln

Pro Ser Ser

Lys Pro Ser

215

Asp Lys Thr 230

Gly Pro Ser 245

Ile Ser Arg

Glu Asp Pro

His Asn Ala

295

Arg Val Val

310

Lys Glu Tyr 325

Glu Lys Thr

Val Arg Gly

105

Val Met Lys

Asp Tyr Phe 110

Leu Val Thr 120

Leu Ala Pro

Cys Leu Val

Ser Gly Ala

170

Ser Ser Gly

185

Ser Leu Gly 200

Asn Thr Lys

His Thr Cys

Val Phe Leu

250

Thr Pro Glu

265

Glu Val Lys 280

Lys Thr Lys

Ser Val Leu

Lys Cys Lys

330

Ile Ser Lys

345

Val Ser Ser

125

Ala Ser Thr

Ser Ser Lys

140

Ser Thr Ser

Lys Asp Tyr 155

Leu Thr Ser

Leu Tyr Ser

Thr Gln Thr

205

Val Asp Lys

220

Pro Pro Cys 235

Phe Pro Pro

Val Thr Cys

Phe Asn Trp

285

Pro Arg Glu

300

Thr Val Leu 315

Val Ser Asn

Ala Lys Gly

Phe Pro Glu

160

Gly Val His

175

Leu Ser Ser 190

Tyr Ile Cys

Arg Val Glu

Pro Ala Pro

240

Lys Pro Lys

255

Val Val Val 270

Tyr Val Asp

Glu Gln Tyr

His Gln Asp

320

Lys Ala Leu

335

Gln Pro Arg 350

- 315 045238

Glu Pro Gln Val Tyr

355

Thr Leu Pro Pro Ser

360

Arg Glu Glu Met Thr 365

Asn Gln Val Ser Leu

370

Thr Cys Leu Val Lys

375

Gly Phe Tyr Pro Ser

380

Ile Ala Val Glu Trp 385

Glu Ser Asn Gly Gln 390

Pro Glu Asn Asn Tyr 395

Thr Thr Pro Pro Val

405

Leu Asp Ser Asp Gly

410

Ser Phe Leu Leu Tyr

415

Lys Leu Thr Val Asp

420

Lys Ser Arg Trp Gln

425

Gln Gly Asn Val Phe

430

Cys Ser Val Met His

435

Glu Ala Leu His Asn

440

His Tyr Thr Gln Lys 445

Lys

Asp

Lys 400

Ser

Leu Ser Leu Ser Pro

450

Gly Lys

455 <210> 250 <211> 214 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> LC1 mAb EM1 <400> 250

Ala Ile Gln Leu Thr 1 5

Gln Ser Pro Ser Ser

Leu Ser Ala Ser Val

Asp Arg Val Thr Ile

Thr Cys Arg Ala Ser

Gln Asp Ile Ser Ser 30

Leu Val Trp Tyr Gln 35

Gln Lys Pro Gly Lys 40

Ala Pro Lys Leu Leu 45

Tyr Asp Ala Ser Ser 50

Leu Glu Ser Gly Val 55

Pro Ser Arg Phe Ser 60

Ser Glu Ser Gly Thr 65

Asp Phe Thr Leu Thr 70

Ile Ser Ser Leu Gln 75

Glu Asp Phe Ala Thr 85

Tyr Tyr Cys Gln Gln 90

Phe Asn Ser Tyr Pro 95

Gly

Ala

Ile

Gly

Pro 80

Leu

- 316 045238

Thr Phe Gly Gly Gly

100

Thr Lys Val Glu Ile

105

Lys Arg Thr Val Ala

110

Pro Ser Val Phe Ile

115

Phe Pro Pro Ser Asp 120

Glu Gln Leu Lys Ser 125

Thr Ala Ser Val Val

130

Cys Leu Leu Asn Asn

135

Phe Tyr Pro Arg Glu

140

Lys Val Gln Trp Lys 145

Val Asp Asn Ala Leu 150

Gln Ser Gly Asn Ser 155

Glu Ser Val Thr Glu

165

Gln Asp Ser Lys Asp

170

Ser Thr Tyr Ser Leu

175

Ser Thr Leu Thr Leu

180

Ser Lys Ala Asp Tyr

185

Glu Lys His Lys Val

190

Ala Cys Glu Val Thr 195

His Gln Gly Leu Ser 200

Ser Pro Val Thr Lys

205

Ala

Gly

Ala

Gln 160

Ser

Tyr

Ser

Phe Asn Arg Gly Glu

210

Cys <210> 251 <211> 449 < 212> PRT < 213> Искусственная <220>

< 223> HC2 mAb EM1 < 400> 251

Gln Val Gln Leu Val 1 5 последовательность

Gln Ser Gly Ala Glu 10

Val Lys Lys Pro Gly

Ser Val Lys Val Ser

Cys Glu Thr Ser Gly 25

Tyr Thr Phe Thr Ser 30

Gly Ile Ser Trp Val 35

Arg Gln Ala Pro Gly 40

His Gly Leu Glu Trp 45

Gly Trp Ile Ser Ala 50

Tyr Asn Gly Tyr Thr 55

Asn Tyr Ala Gln Lys 60

Gln Gly Arg Val Thr 65

Met Thr Thr Asp Thr 70

Ser Thr Ser Thr Ala 75

Ala

Tyr

Met

Leu

Tyr 80

- 317 045238

Met

Ala

Thr

Pro

Gly 145

Asn

Gln

Ser

Thr 225

Ser

Arg

Pro

Ala

Val 305

Tyr

Glu Leu Arg

Ser Leu Arg 85

Ser Asp Asp

Thr Ala Val

Tyr Tyr Cys 95

Arg Asp Leu

100

Arg Gly Thr

Asn Tyr Phe

105

Asp Tyr Trp

Gly Gln Gly 110

Leu Val Thr

115

Leu Ala Pro 130

Cys Leu Val

Ser Gly Ala

Ser Ser Gly

180

Ser Leu Gly

195

Asn Thr Lys 210

His Thr Cys

Val Phe Leu

Thr Pro Glu

260

Glu Val Lys

275

Lys Thr Lys 290

Ser Val Leu

Lys Cys Lys

Val Ser Ser

Ala Ser Thr 120

Lys Gly Pro

125

Ser Val Phe

Ser Ser Lys

135

Ser Thr Ser

Gly Gly Thr

140

Ala Ala Leu

Lys Asp Tyr

150

Leu Thr Ser 165

Leu Tyr Ser

Thr Gln Thr

Val Asp Lys

215

Pro Pro Cys

230

Phe Pro Pro 245

Val Thr Cys

Phe Asn Trp

Pro Arg Glu

295

Thr Val Leu

310

Val Ser Asn 325

Phe Pro Glu

Pro Val Thr 155

Val Ser Trp

160

Gly Val His

170

Leu Ser Ser

185

Tyr Ile Cys 200

Arg Val Glu

Pro Ala Pro

Lys Pro Lys

250

Val Val Val

265

Tyr Val Asp 280

Glu Gln Tyr

His Gln Asp

Lys Ala Leu

330

Thr Phe Pro

Ala Val Leu

175

Val Val Thr

Val Pro Ser 190

Asn Val Asn

205

Pro Lys Ser

220

Glu Leu Leu 235

Asp Thr Leu

Asp Val Ser

Gly Val Glu

285

Asn Ser Thr

300

Trp Leu Asn 315

Pro Ala Pro

His Lys Pro

Cys Asp Lys

Gly Gly Pro

240

Met Ile Ser

255

His Glu Asp 270

Val His Asn

Tyr Arg Val

Gly Lys Glu

320

Ile Glu Lys

335

- 318 045238

Thr

Ile

Ser

Lys 340

Ala

Lys

Gly

Gln

Pro

345

Arg

Glu

Pro

Gln

Val

350

Tyr

Leu

Pro

355

Ser

Arg

Glu

Met

360

Thr

Lys

Asn

Gln

Val

365

Ser

Leu

Cys

Leu

370

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

375

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

380

Val

Glu

Trp

Ser

385

Asn

Gly

Gln

Pro

Glu

390

Asn

Tyr

Lys

Thr

395

Thr

Pro

Val

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

405

Phe

Leu

Tyr

Ser

410

Arg

Leu

Thr

Val

Asp

415

Ser

Arg

Trp

Gln

420

Gln

Gly

Asn

Val

Phe

425

Ser

Cys

Ser

Val

Met

430

His

Ala

Leu

His

435

Asn

His

Tyr

Thr

Gln

440

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

445

Ser

Pro

Thr

Glu

Leu 400

Lys

Glu

Gly

Lys <210>

<211>

<212>

<213>

252

214

PRT

Искусственная последовательность <220>

<223>

LC2 mAb EM1 <400>

252

Asp

Ile

Gln

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Val

Ser

Ala

Ser

Val 15

Asp

Arg

Val

Thr 20

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala 25

Ser

Gln

Gly

Ile

Ser 30

Asn

Leu

Ala

Trp 35

Phe

Gln

His

Lys

Pro 40

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys 45

Leu

Tyr

Ala 50

Ala

Ser

Leu

Leu 55

Ser

Gly

Val

Pro

Ser 60

Arg

Phe

Ser

Ser 65

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp 70

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile 75

Ser

Leu

Gln

Gly

Trp

Ile

Gly

Pro 80

- 319 045238

Glu Asp

Phe Ala

Thr Phe

Gly Gln

100

Pro Ser

Val Phe

115

Thr Ala

130

Ser Val

Thr Tyr 85

Gly Thr

Ile Phe

Val Cys

Tyr Cys

Arg Leu

Pro Pro

120

Leu Leu 135

Gln Gln

Glu Ile 105

Ser Asp

Asn Asn

Ala Asn

Lys Arg

Glu Gln

Phe Tyr

140

Ser Phe

Thr Val

110

Leu Lys 125

Pro Arg

Lys Val 145

Gln Trp

Lys Val

150

Asp Asn

Ala Leu

Gln Ser 155

Gly Asn

Glu Ser

Val Thr

Glu Gln 165

Asp Ser

Lys Asp

170

Ser Thr

Tyr Ser

Ser Thr

Leu Thr

180

Leu Ser

Lys Ala

Asp Tyr 185

Glu Lys

His Lys

190

Ala Cys

Glu Val 195

Thr His

Gln Gly

200

Leu Ser

Ser Pro

Val Thr 205

Pro Ile 95

Ala Ala

Ser Gly

Glu Ala

Ser Gln 160

Leu Ser 175

Val Tyr

Lys Ser

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 <210> 253 <211> 1807 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ДНК <400> 253 cagctgagtt ggtggagggc tagctgacag acacgaagct cccaaagtat gcagcagcgt gctgggtgcg ttgacaccgc gcaccagcac

HC1 PTBB28 gttgtgttct agtgtagtct actaacagac tgccgccacc acaggcccag gaaagtgagc ccaggcgccg gaactatgcg cgcgtatatg gataagagtc gagcagtact tgttcctttc atggcttggg gtgcagctgg tgcaaagcga ggccagggcc cagaaatttc gaactgagca agaggtaact cgttgctgcc catgggtctt tgtggacctt tgcagagcgg gcggcggcac tggaatggat agggccgcgt gcctgcgcag cccgttgcgg gcgcgcgcca ttctgcagtc gctattcctg cgcggaagtg ctttagcagc gggcggcatt gaccattacc cgaagatacc tgctgttaac ccagacataa accgtccttg atggcagctg aaaaaaccgg tatgcgatta attccgattt gcggatgaaa gcggtgtatt

120

180

240

300

360

420

480

540

- 320 045238

attgcgcgcg	ccctggtctc	gctgcggctt	atgatactgg	ttccttggac	tattggggcc	600
agggcaccct	ggtgaccgtg	agcagcgcct	ccaccaaggg	cccatcggtc	ttccccctgg	660
cgccctgctc	caggagcacc	tccgagagca	cagccgccct	gggctgcctg	gtcaaggact	720
acttccccga	accggtgacg	gtgtcgtgga	actcaggcgc	tctgaccagc	ggcgtgcaca	780
ccttcccagc	tgtcctacag	tcctcaggac	tctactccct	cagcagcgtg	gtgaccgtgc	840
cctccagcaa	cttcggcacc	cagacctaca	cctgcaacgt	agatcacaag	cccagcaaca	900
ccaaggtgga	caagacagtt	gagcgcaaat	gttgtgtcga	gtgcccaccg	tgcccagcac	960
cacctgtggc	aggaccgtca	gtcttcctct	tccccccaaa	acccaaggac	accctcatga	1020
tctcccggac	ccctgaggtc	acgtgcgtgg	tggtggacgt	gagccacgaa	gaccccgagg	1080
tccagttcaa	ctggtacgtg	gacggcgtgg	aggtgcataa	tgccaagaca	aagccacggg	1140
aggagcagtt	caacagcacg	ttccgtgtgg	tcagcgtcct	caccgttgtg	caccaggact	1200
ggctgaacgg	caaggagtac	aagtgcaagg	tctccaacaa	aggcctccca	gcccccatcg	1260
agaaaaccat	ctccaaaacc	aaagggcagc	cccgagaacc	acaggtgtac	accctgcccc	1320
catcccggga	ggagatgacc	aagaaccagg	tcagcctgac	ctgcctggtc	aaaggcttct	1380
accccagcga	catcgccgtg	gagtgggaga	gcaatgggca	gccggagaac	aactacaaga	1440
ccacacctcc	catgctggac	tccgacggct	ccttcctgct	ctacagcaag	ctcaccgtgg	1500
acaagagcag	gtggcagcag	gggaacgtct	tctcatgctc	cgtgatgcat	gaggctctgc	1560
acaaccacta	cacgcagaag	agcctctccc	tgtctccggg	taaatgatag	ttcgaattca	1620
ttgatcataa	tcagccatac	cacatttgta	gaggttttac	ttgctttaaa	aaacctccca	1680
cacctccccc	tgaacctgaa	acataaaatg	aatgcaattg	ttgttgttaa	cttgtttatt	1740
gcagcttata	atggttacaa	ataaagcaat	agcatcacaa	atttcacaaa	taaagcattt	1800
ttttcac						1807

<210> 254 <211> 1105 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ДНК LC1 PTBB28 <400>254 cagctgagtt gttgtgttct gataagagtc agaggtaact cccgttgcgg tgctgttaac60 ggtggagggc agtgtagtct gagcagtact cgttgctgcc gcgcgcgcca ccagacataa120 tagctgacag actaacagac tgttcctttc catgggtctt ttctgcagtc accgtccttg180 acacgaagct tgccgccacc atggagacac attctcaggt ctttgtatac atgttgctgt240 ggttgtctgg tgtcgaggga gaaattgtgc tgacccagag cccggcgacc ctgagcctga300

- 321 045238

gcccgggcga	acgcgcgacc	ctgagctgcc	gcgcgagcca	gagcgttcgc	tcctacctgg	360
cgtggtatca	gcagaaaccg	ggccaggcgc	cgcgcctgct	gatctacgac	gcgagcaatc	420
gtgcgaccgg	cattccggcg	cgctttagcg	gctccggtag	cggcaccgat	tttaccctga	480
ccattagcag	cctggaaccg	gaagattttg	cggtgtatta	ttgccagcaa	cgtaattatt	540
ggccgctgac	ctttggccag	ggcaccaaag	tggaaattaa	acgtacggtg	gctgcaccat	600
ctgtcttcat	cttcccgcca	tctgatgagc	agttgaaatc	tggaactgcc	tctgttgtgt	660
gcctgctgaa	taacttctat	cccagagagg	ccaaagtaca	gtggaaggtg	gataacgccc	720
tccaatcggg	taactcccag	gagagtgtca	cagagcagga	cagcaaggac	agcacctaca	780
gcctcagcag	caccctgacg	ctgagcaaag	cagactacga	gaaacacaaa	gtctacgcct	840
gcgaagtcac	ccatcagggc	ctgagctcgc	ccgtcacaaa	gagcttcaac	aggggagagt	900
gttagtgatt	cgaatgatca	taatcagcca	taccacattt	gtagaggttt	tacttgcttt	960
aaaaaacctc	ccacacctcc	ccctgaacct	gaaacataaa	atgaatgcaa	ttgttgttgt	1020
taacttgttt	attgcagctt	ataatggtta	caaataaagc	aatagcatca	caaatttcac	1080
aaataaagca	tttttttcac	tgcat				1105

<210> 255 <211> 1789 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ДНК	HC2 PTBB28
<400> 255 cagctgagtt	gttgtgttct	gataagagtc	agaggtaact	cccgttgcgg	tgctgttaac	60
ggtggagggc	agtgtagtct	gagcagtact	cgttgctgcc	gcgcgcgcca	ccagacataa	120
tagctgacag	actaacagac	tgttcctttc	catgggtctt	ttctgcagtc	accgtccttg	180
acacgaagct	tgccgccacc	atggcttggg	tgtggacctt	gctattcctg	atggcagctg	240
cccaaagtat	acaggccgaa	gtgcagctgc	tggaaagcgg	cggcggcctg	gtgcagccgg	300
gcggcagcct	gcgcctgagc	tgcgcggcaa	gcggctttac	ctttagcagc	tatgcgatga	360
gctgggtgcg	ccaggcgccg	ggcaaaggcc	tggaatgggt	gagcgcgatt	agcggcagcg	420
gcggcagcac	ctattatgcg	gatagcgtga	aaggccgctt	taccattagc	cgcgataaca	480
gcaaaaacac	cctgtatctg	cagatgaaca	gcctgcgcgc	ggaagatacc	gcggtgtatt	540
attgcgcgaa	atccccgtac	gcgcccttgg	actattgggg	ccagggcacc	ctggtgaccg	600
tgagcagcgc	ctccaccaag	ggcccatcgg	tcttccccct	ggcgccctgc	tccaggagca	660
cctccgagag	cacagccgcc	ctgggctgcc	tggtcaagga	ctacttcccc	gaaccggtga	720

- 322 045238

cggtgtcgtg	gaactcaggc	gctctgacca	gcggcgtgca	caccttccca	gctgtcctac	780
agtcctcagg	actctactcc	ctcagcagcg	tggtgaccgt	gccctccagc	aacttcggca	840
cccagaccta	cacctgcaac	gtagatcaca	agcccagcaa	caccaaggtg	gacaagacag	900
ttgagcgcaa	atgttgtgtc	gagtgcccac	cgtgcccagc	accacctgtg	gcaggaccgt	960
cagtcttcct	cttcccccca	aaacccaagg	acaccctcat	gatctcccgg	acccctgagg	1020
tcacgtgcgt	ggtggtggac	gtgagccacg	aagaccccga	ggtccagttc	aactggtacg	1080
tggacggcgt	ggaggtgcat	aatgccaaga	caaagccacg	ggaggagcag	ttcaacagca	1140
cgttccgtgt	ggtcagcgtc	ctcaccgttg	tgcaccagga	ctggctgaac	ggcaaggagt	1200
acaagtgcaa	ggtctccaac	aaaggcctcc	cagcccccat	cgagaaaacc	atctccaaaa	1260
ccaaagggca	gccccgagaa	ccacaggtgt	acaccctgcc	cccatcccgg	gaggagatga	1320
ccaagaacca	ggtcagcctg	acctgcctgg	tcaaaggctt	ctaccccagc	gacatcgccg	1380
tggagtggga	gagcaatggg	cagccggaga	acaactacaa	gaccacacct	cccatgctgg	1440
actccgacgg	ctccttcttc	ctctacagcc	ggctcaccgt	ggacaagagc	aggtggcagc	1500
aggggaacgt	cttctcatgc	tccgtgatgc	atgaggctct	gcacaaccac	tacacgcaga	1560
agagcctctc	cctgtctccg	ggtaaatgat	agttcgaatt	cattgatcat	aatcagccat	1620
accacatttg	tagaggtttt	acttgcttta	aaaaacctcc	cacacctccc	cctgaacctg	1680
aaacataaaa	tgaatgcaat	tgttgttgtt	aacttgttta	ttgcagctta	taatggttac	1740
aaataaagca	atagcatcac	aaatttcaca	aataaagcat	ttttttcac		1789

<210> 256 <211> 1105 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> ДНК LC2 PTBB28 <400>256 cagctgagtt gttgtgttct gataagagtc agaggtaact cccgttgcgg tgctgttaac60 ggtggagggc agtgtagtct gagcagtact cgttgctgcc gcgcgcgcca ccagacataa120 tagctgacag actaacagac tgttcctttc catgggtctt ttctgcagtc accgtccttg180 acacgaagct tgccgccacc atggagacac attctcaggt ctttgtatac atgttgctgt240 ggttgtctgg tgtcgaggga gaaattgtgc tgacccagag cccggcgacc ctgagcctga300 gcccgggcga acgcgcgacc cttagctgcc gtgcaagtca gagtgtgaac gactacctgg360 cgtggtatca gcagaaaccg ggccaggcgc cgcgcctgct gatttatgat gcgagcaacc420 gcgcgaccgg cattccggcg cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga480 ccattagcag cctggaaccg gaagattttg cggtgtatta ttgccagcag ggtggtcacg540

- 323 045238

cgccgatcac	ctttggccag	ggcaccaaag	tggaaattaa	acgtacggtg	gctgcaccat	600
ctgtcttcat	cttcccgcca	tctgatgagc	agttgaaatc	tggaactgcc	tctgttgtgt	660
gcctgctgaa	taacttctat	cccagagagg	ccaaagtaca	gtggaaggtg	gataacgccc	720
tccaatcggg	taactcccag	gagagtgtca	cagagcagga	cagcaaggac	agcacctaca	780
gcctcagcag	caccctgacg	ctgagcaaag	cagactacga	gaaacacaaa	gtctacgcct	840
gcgaagtcac	ccatcagggc	ctgagctcgc	ccgtcacaaa	gagcttcaac	aggggagagt	900
gttagtgatt	cgaatgatca	taatcagcca	taccacattt	gtagaggttt	tacttgcttt	960
aaaaaacctc	ccacacctcc	ccctgaacct	gaaacataaa	atgaatgcaa	ttgttgttgt	1020
taacttgttt	attgcagctt	ataatggtta	caaataaagc	aatagcatca	caaatttcac	1080
aaataaagca	tttttttcac	tgcat				1105

<210> 257 <211> 1807 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ДНК HC1 PTBB30

<400> 257 cagctgagtt	gttgtgttct	gataagagtc	agaggtaact	cccgttgcgg	tgctgttaac	60
ggtggagggc	agtgtagtct	gagcagtact	cgttgctgcc	gcgcgcgcca	ccagacataa	120
tagctgacag	actaacagac	tgttcctttc	catgggtctt	ttctgcagtc	accgtccttg	180
acacgaagct	tgccgccacc	atggcttggg	tgtggacctt	gctattcctg	atggcagctg	240
cccaaagtat	acaggcccag	gtgcagctgg	tgcagagcgg	cgcggaagtg	aaaaaaccgg	300
gcagcagcgt	gaaagtgagc	tgcaaagcga	gcggcggcac	ctttagcagc	tatgcgatta	360
gctgggtgcg	ccaggcgccg	ggccagggcc	tggaatggat	gggcggcatt	attccgattt	420
ttgacaccgc	gaactatgcg	cagaaatttc	agggccgcgt	gaccattacc	gcggatgaaa	480
gcaccagcac	cgcgtatatg	gaactgagca	gcctgcgcag	cgaagatacc	gcggtgtatt	540
attgcgcgcg	ccctggtctc	gctgcggctt	atgatactgg	ttccttggac	tattggggcc	600
agggcaccct	ggtgaccgtg	agcagcgcct	ccaccaaggg	cccatcggtc	ttccccctgg	660
cgccctgctc	caggagcacc	tccgagagca	cagccgccct	gggctgcctg	gtcaaggact	720
acttccccga	accggtgacg	gtgtcgtgga	actcaggcgc	tctgaccagc	ggcgtgcaca	780
ccttcccagc	tgtcctacag	tcctcaggac	tctactccct	cagcagcgtg	gtgaccgtgc	840
cctccagcaa	cttcggcacc	cagacctaca	cctgcaacgt	agatcacaag	cccagcaaca	900
ccaaggtgga	caagacagtt	gagcgcaaat	gttgtgtcga	gtgcccaccg	tgcccagcac	960

- 324 045238

cacctgccgc	agccagctca	gtcttcctct	tccccccaaa	acccaaggac	accctcatga	1020
tctcccggac	ccctgaggtc	acgtgcgtgg	tggtggacgt	gagcgccgaa	gaccccgagg	1080
tccagttcaa	ctggtacgtg	gacggcgtgg	aggtgcataa	tgccaagaca	aagccacggg	1140
aggagcagtt	caacagcacg	ttccgtgtgg	tcagcgtcct	caccgttctg	caccaggact	1200
ggctgaacgg	caaggagtac	aagtgcaagg	tctccaacaa	aggcctccca	tcctccatcg	1260
agaaaaccat	ctccaaaacc	aaagggcagc	cccgagaacc	acaggtgtac	accctgcccc	1320
catcccggga	ggagatgacc	aagaaccagg	tcagcctgac	ctgcctggtc	aaaggcttct	1380
accccagcga	catcgccgtg	gagtgggaga	gcaatgggca	gccggagaac	aactacaaga	1440
ccacacctcc	catgctggac	tccgacggct	ccttcctgct	ctacagcaag	ctcaccgtgg	1500
acaagagcag	gtggcagcag	gggaacgtct	tctcatgctc	cgtgatgcat	gaggctctgc	1560
acaaccacta	cacgcagaag	agcctctccc	tgtctccggg	taaatgatag	ttcgaattca	1620
ttgatcataa	tcagccatac	cacatttgta	gaggttttac	ttgctttaaa	aaacctccca	1680
cacctccccc	tgaacctgaa	acataaaatg	aatgcaattg	ttgttgttaa	cttgtttatt	1740
gcagcttata	atggttacaa	ataaagcaat	agcatcacaa	atttcacaaa	taaagcattt	1800

ttttcac

1807 <210> 258 <211> 1105 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ДНК LC1 PTBB30 <400>258 cagctgagtt gttgtgttct gataagagtc agaggtaact cccgttgcgg tgctgttaac60 ggtggagggc agtgtagtct gagcagtact cgttgctgcc gcgcgcgcca ccagacataa120 tagctgacag actaacagac tgttcctttc catgggtctt ttctgcagtc accgtccttg180 acacgaagct tgccgccacc atggagacac attctcaggt ctttgtatac atgttgctgt240 ggttgtctgg tgtcgaggga gaaattgtgc tgacccagag cccggcgacc ctgagcctga300 gcccgggcga acgcgcgacc ctgagctgcc gcgcgagcca gagcgttcgc tcctacctgg360 cgtggtatca gcagaaaccg ggccaggcgc cgcgcctgct gatctacgac gcgagcaatc420 gtgcgaccgg cattccggcg cgctttagcg gctccggtag cggcaccgat tttaccctga480 ccattagcag cctggaaccg gaagattttg cggtgtatta ttgccagcaa cgtaattatt540 ggccgctgac ctttggccag ggcaccaaag tggaaattaa acgtacggtg gctgcaccat600 ctgtcttcat cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt660 gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc720

- 325 045238

tccaatcggg	taactcccag	gagagtgtca	cagagcagga	cagcaaggac	agcacctaca	780
gcctcagcag	caccctgacg	ctgagcaaag	cagactacga	gaaacacaaa	gtctacgcct	840
gcgaagtcac	ccatcagggc	ctgagctcgc	ccgtcacaaa	gagcttcaac	aggggagagt	900
gttagtgatt	cgaatgatca	taatcagcca	taccacattt	gtagaggttt	tacttgcttt	960
aaaaaacctc	ccacacctcc	ccctgaacct	gaaacataaa	atgaatgcaa	ttgttgttgt	1020
taacttgttt	attgcagctt	ataatggtta	caaataaagc	aatagcatca	caaatttcac	1080
aaataaagca	tttttttcac	tgcat				1105

<210> 259 <211> 1789 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность

<220> <223> ДНК	HC2 PTBB30
<400> 259 cagctgagtt	gttgtgttct	gataagagtc	agaggtaact	cccgttgcgg	tgctgttaac	60
ggtggagggc	agtgtagtct	gagcagtact	cgttgctgcc	gcgcgcgcca	ccagacataa	120
tagctgacag	actaacagac	tgttcctttc	catgggtctt	ttctgcagtc	accgtccttg	180
acacgaagct	tgccgccacc	atggcttggg	tgtggacctt	gctattcctg	atggcagctg	240
cccaaagtat	acaggccgaa	gtgcagctgc	tggaaagcgg	cggcggcctg	gtgcagccgg	300
gcggcagcct	gcgcctgagc	tgcgcggcaa	gcggctttac	ctttagcagc	tatgcgatga	360
gctgggtgcg	ccaggcgccg	ggcaaaggcc	tggaatgggt	gagcgcgatt	agcggcagcg	420
gcggcagcac	ctattatgcg	gatagcgtga	aaggccgctt	taccattagc	cgcgataaca	480
gcaaaaacac	cctgtatctg	cagatgaaca	gcctgcgcgc	ggaagatacc	gcggtgtatt	540
attgcgcgaa	atccccgtac	gcgcccttgg	actattgggg	ccagggcacc	ctggtgaccg	600
tgagcagcgc	ctccaccaag	ggcccatcgg	tcttccccct	ggcgccctgc	tccaggagca	660
cctccgagag	cacagccgcc	ctgggctgcc	tggtcaagga	ctacttcccc	gaaccggtga	720
cggtgtcgtg	gaactcaggc	gctctgacca	gcggcgtgca	caccttccca	gctgtcctac	780
agtcctcagg	actctactcc	ctcagcagcg	tggtgaccgt	gccctccagc	aacttcggca	840
cccagaccta	cacctgcaac	gtagatcaca	agcccagcaa	caccaaggtg	gacaagacag	900
ttgagcgcaa	atgttgtgtc	gagtgcccac	cgtgcccagc	accacctgcc	gcagccagct	960
cagtcttcct	cttcccccca	aaacccaagg	acaccctcat	gatctcccgg	acccctgagg	1020
tcacgtgcgt	ggtggtggac	gtgagcgccg	aagaccccga	ggtccagttc	aactggtacg	1080
tggacggcgt	ggaggtgcat	aatgccaaga	caaagccacg	ggaggagcag	ttcaacagca	1140

- 326 045238

cgttccgtgt	ggtcagcgtc	ctcaccgttc	tgcaccagga	ctggctgaac	ggcaaggagt	1200
acaagtgcaa	ggtctccaac	aaaggcctcc	catcctccat	cgagaaaacc	atctccaaaa	1260
ccaaagggca	gccccgagaa	ccacaggtgt	acaccctgcc	cccatcccgg	gaggagatga	1320
ccaagaacca	ggtcagcctg	acctgcctgg	tcaaaggctt	ctaccccagc	gacatcgccg	1380
tggagtggga	gagcaatggg	cagccggaga	acaactacaa	gaccacacct	cccatgctgg	1440
actccgacgg	ctccttcttc	ctctacagcc	ggctcaccgt	ggacaagagc	aggtggcagc	1500
aggggaacgt	cttctcatgc	tccgtgatgc	atgaggctct	gcacaaccac	tacacgcaga	1560
agagcctctc	cctgtctccg	ggtaaatgat	agttcgaatt	cattgatcat	aatcagccat	1620
accacatttg	tagaggtttt	acttgcttta	aaaaacctcc	cacacctccc	cctgaacctg	1680
aaacataaaa	tgaatgcaat	tgttgttgtt	aacttgttta	ttgcagctta	taatggttac	1740
aaataaagca	atagcatcac	aaatttcaca	aataaagcat	ttttttcac		1789

<210> 260 <211> 1105 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ДНК LC2 PTBB30

<400> 260 cagctgagtt	gttgtgttct	gataagagtc	agaggtaact	cccgttgcgg	tgctgttaac	60
ggtggagggc	agtgtagtct	gagcagtact	cgttgctgcc	gcgcgcgcca	ccagacataa	120
tagctgacag	actaacagac	tgttcctttc	catgggtctt	ttctgcagtc	accgtccttg	180
acacgaagct	tgccgccacc	atggagacac	attctcaggt	ctttgtatac	atgttgctgt	240
ggttgtctgg	tgtcgaggga	gaaattgtgc	tgacccagag	cccggcgacc	ctgagcctga	300
gcccgggcga	acgcgcgacc	cttagctgcc	gtgcaagtca	gagtgtgaac	gactacctgg	360
cgtggtatca	gcagaaaccg	ggccaggcgc	cgcgcctgct	gatttatgat	gcgagcaacc	420
gcgcgaccgg	cattccggcg	cgctttagcg	gcagcggcag	cggcaccgat	tttaccctga	480
ccattagcag	cctggaaccg	gaagattttg	cggtgtatta	ttgccagcag	ggtggtcacg	540
cgccgatcac	ctttggccag	ggcaccaaag	tggaaattaa	acgtacggtg	gctgcaccat	600
ctgtcttcat	cttcccgcca	tctgatgagc	agttgaaatc	tggaactgcc	tctgttgtgt	660
gcctgctgaa	taacttctat	cccagagagg	ccaaagtaca	gtggaaggtg	gataacgccc	720
tccaatcggg	taactcccag	gagagtgtca	cagagcagga	cagcaaggac	agcacctaca	780
gcctcagcag	caccctgacg	ctgagcaaag	cagactacga	gaaacacaaa	gtctacgcct	840
gcgaagtcac	ccatcagggc	ctgagctcgc	ccgtcacaaa	gagcttcaac	aggggagagt	900
gttagtgatt	cgaatgatca	taatcagcca	taccacattt	gtagaggttt	tacttgcttt	960

- 327 045238

aaaaaacctc	ccacacctcc	ccctgaacct	gaaacataaa	atgaatgcaa	ttgttgttgt	1020
taacttgttt	attgcagctt	ataatggtta	caaataaagc	aatagcatca	caaatttcac	1080
aaataaagca	tttttttcac	tgcat				1105

<210>261 <211>16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>261

Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly Asn Val Val Leu

5 1015 <210>262 <211>7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>262

Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr 15 <210>263 <211>13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>263

Arg Ile Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe

510 <210>264 <211>306 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>264

Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro

5 1015

Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Val Val 20 2530

Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly 35 4045

Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser 50 5560

- 328 045238

Phe Asp Ser Asp Ser 65

Trp Thr Leu Arg Leu 70

His Asn Leu Gln Ile 75

Asp Lys Gly Leu Tyr 85

Gln Cys Ile Ile His 90

His Lys Lys Pro Thr 95

Met Ile Arg Ile His

100

Gln Met Asn Ser Glu

105

Leu Ser Val Leu Ala

110

Phe Ser Gln Pro Glu

115

Ile Val Pro Ile Ser

120

Asn Ile Thr Glu Asn

125

Tyr Ile Asn Leu Thr 130

Cys Ser Ser Ile His 135

Gly Tyr Pro Glu Pro 140

Lys Met Ser Val Leu 145

Leu Arg Thr Lys Asn 150

Ser Thr Ile Glu Tyr 155

Gly Val Met Gln Lys

165

Ser Gln Asp Asn Val

170

Thr Glu Leu Tyr Asp

175

Ser Ile Ser Leu Ser

180

Val Ser Phe Pro Asp

185

Val Thr Ser Asn Met

190

Ile Phe Cys Ile Leu 195

Glu Thr Asp Lys Thr 200

Arg Leu Leu Ser Ser 205

Phe Ser Ile Glu Leu

210

Glu Asp Pro Gln Pro

215

Pro Pro Asp His Ile 220

Trp Ile Thr Ala Val 225

Leu Pro Thr Val Ile 230

Ile Cys Val Met Val 235

Cys Leu Ile Leu Trp

245

Lys Trp Lys Lys Lys

250

Lys Arg Pro Arg Asn

255

Tyr Lys Cys Gly Thr

260

Asn Thr Met Glu Arg

265

Glu Glu Ser Glu Gln

270

Lys Lys Arg Glu Lys

275

Ile His Ile Pro Glu

280

Arg Ser Asp Glu Ala

285

Arg Val Phe Lys Ser 290

Ser Lys Thr Ser Ser

295

Cys Asp Lys Ser Asp

300

Lys 80

Gly

Asn

Val

Lys

Asp 160

Val

Thr

Pro

Phe 240

Ser

Thr

Gln

Thr

Cys Phe 305

- 329 045238 <210>265 <211>254 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>265

Val Ile His Val Thr

5

Lys Glu Val Lys Glu

Val Ala Thr Leu Ser

Gly His Asn Val Ser 20

Val Glu Glu Leu Ala

Gln Thr Arg Ile Tyr 30

Gln Lys Glu Lys Lys 35

Met Val Leu Thr Met

Met Ser Gly Asp Met 45

Ile Trp Pro Glu Tyr 50

Lys Asn Arg Thr Ile 55

Phe Asp Ile Thr Asn 60

Leu Ser Ile Val Ile 65

Leu Ala Leu Arg Pro 70

Ser Asp Glu Gly Thr 75

Glu Cys Val Val Leu 85

Lys Tyr Glu Lys Asp 90

Ala Phe Lys Arg Glu 95

Leu Ala Glu Val Thr

100

Leu Ser Val Lys Ala

105

Asp Phe Pro Thr Pro

110

Ile Ser Asp Phe Glu 115

Ile Pro Thr Ser Asn

120

Ile Arg Arg Ile Ile

125

Ser Thr Ser Gly Gly 130

Phe Pro Glu Pro His

135

Leu Ser Trp Leu Glu 140

Gly Glu Glu Leu Asn 145

Ala Ile Asn Thr Thr 150

Val Ser Gln Asp Pro 155

Thr Glu Leu Tyr Ala

165

Val Ser Ser Lys Leu

170

Asp Phe Asn Met Thr

175

Asn His Ser Phe Met

180

Cys Leu Ile Lys Tyr

185

Gly His Leu Arg Val

190

Gln Thr Phe Asn Trp 195

Asn Thr Thr Lys Gln 200

Glu His Phe Pro Asp

205

Leu Leu Pro Ser Trp

210

Ala Ile Thr Leu Ile

215

Ser Val Asn Gly Ile

220

Cys

Trp

Asn

Tyr 80

His

Ser

Cys

Asn

Glu 160

Thr

Asn

Phe

- 330 045238

Val Ile Cys 225

Cys Leu

Thr

230

Tyr

Cys

Phe

Ala

Pro

235

Arg

Cys

Arg

Glu

Arg 240

Arg Arg Asn

Glu Arg

245

Leu

Arg

Glu

Ser 250

Val

Arg

Pro

Val <210>

<211>

<212>

<213>

266 202 PRT Homo sapiens <400>

266

Asn

Lys

Ile

Leu

Val 5

Lys

Gln

Ser

Pro

Met

Leu

Val

Ala

Tyr

Asp 15

Ala

Val

Asn

Leu 20

Ser

Cys

Lys

Tyr

Ser 25

Tyr

Asn

Leu

Phe

Ser 30

Arg

Phe

Arg

Ala 35

Ser

Leu

His

Lys

Gly 40

Leu

Asp

Ser

Ala

Val 45

Glu

Val

Val 50

Tyr

Gly

Asn

Tyr

Ser 55

Gln

Leu

Gln

Val 60

Tyr

Ser

Lys

Gly 65

Phe

Asn

Cys

Asp

Gly 70

Lys

Leu

Gly

Asn

Glu 75

Ser

Val

Thr

Phe

Leu

Gln

Asn

Leu

Tyr 85

Val

Asn

Gln

Thr

Asp 90

Ile

Tyr

Phe

Cys

Lys 95

Glu

Val

Met

Tyr 100

Pro

Tyr

Leu

105

Asp

Asn

Glu

Lys

Ser

110

Asn

Thr

Ile

115

His

Val

Lys

Gly

Lys 120

His

Leu

Cys

Pro

Ser

125

Pro

Leu

Pro

Gly 130

Pro

Ser

Lys

Pro

Phe

135

Trp

Val

Leu

Val

140

Val

Gly

Leu

145

Ala

Cys

Tyr

Ser

Leu

150

Leu

Val

Thr

Val

Ala

155

Phe

Ile

Phe

Val

Arg

Ser

Lys

Arg 165

Ser

Arg

Leu

His

170

Ser

Asp

Tyr

Met

Asn

175

Thr

Pro

Arg

Arg 180

Pro

Gly

Pro

Thr

Arg 185

Lys

His

Tyr

Gln

Pro

190

Tyr

Asn

Glu

Cys

Thr

Tyr 80

Ile

Gly

Phe

Val

Trp 160

Met

Ala

- 331 045238

Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg

195 200 <210>267 < 211>179 < 212> PRT < 213> Homo sapiens < 400>267

Glu Ile Asn Gly Ser Ala Asn Tyr Glu 15

Gly Val Gln Ile Leu Cys Lys Tyr Pro 20 25

Met Gln Leu Leu Lys Gly Gly Gln Ile

40

Lys Gly Ser Gly Asn Thr Val Ser Ile

55

Ser Gln Leu Ser Asn Asn Ser Val Ser 65 70

His Ser His Ala Asn Tyr Tyr Phe Cys 85

Pro Pro Phe Lys Val Thr Leu Thr Gly

100 105

Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu Lys Phe

115 120

Ala Phe Val Val Val Cys Ile Leu Gly

130 135

Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val 145 150

Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala

165

Val Thr Leu <210> 268 <211> 284

Phe Ile Phe His Asn Gly 15

Ile Val Gln Gln Phe Lys 30

Cys Asp Leu Thr Lys Thr 45

Ser Leu Lys Phe Cys His 60

Phe Leu Tyr Asn Leu Asp 75 80

Leu Ser Ile Phe Asp Pro 95

Tyr Leu His Ile Tyr Glu 110

Leu Pro Ile Gly Cys Ala

125

Ile Leu Ile Cys Trp Leu 140

Asp Pro Asn Gly Glu Tyr

155 160

Lys Ser Arg Leu Thr Asp

175 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 268

Asp Thr Gln Glu 1

Lys Glu Val Arg 5

Ala Met Val Gly 10

Ser Asp Val Glu 15

Leu Ser Cys Ala 20

Cys Pro Glu Gly

Ser Arg Phe Asp 25

Leu Asn Asp Val 30

Tyr Val Tyr Trp

Gln Thr Ser Glu

Ser Lys Thr Val

Val Thr Tyr His 45

Ile Pro Gln Asn

Ser Ser Leu Glu

Asn Val Asp Ser 60

Arg Tyr Arg Asn

Arg Ala Leu Met 65

Ser Pro Ala Gly 70

Met Leu Arg Gly

Asp Phe Ser Leu 80

Arg Leu Phe Asn

Val Thr Pro Gln 85

Asp Glu Gln Lys 90

Phe His Cys Leu 95

Val Leu Ser Gln

100

Ser Leu Gly Phe

Gln Glu Val Leu 105

Ser Val Glu Val

110

Thr Leu His Val

115

Ala Ala Asn Phe

120

Ser Val Pro Val

Val Ser Ala Pro 125

His Ser Pro Ser

130

Gln Asp Glu Leu

135

Thr Phe Thr Cys

140

Thr Ser Ile Asn

Gly Tyr Pro Arg 145

Pro Asn Val Tyr 150

Trp Ile Asn Lys

155

Thr Asp Asn Ser

160

Leu Leu Asp Gln

Ala Leu Gln Asn 165

Asp Thr Val Phe 170

Leu Asn Met Arg

175

Gly Leu Tyr Asp

180

Val Val Ser Val

Leu Arg Ile Ala 185

Arg Thr Pro Ser

190

Val Asn Ile Gly

195

Cys Cys Ile Glu

200

Asn Val Leu Leu

Gln Gln Asn Leu 205

Thr Val Gly Ser Gln

210

Thr Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp Lys Ile

215 220

Thr Glu Asn Pro Val

Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr Trp Ser

230 235 240

225

- 333 045238

Ile Leu Ala Val Leu Cys Leu Leu Val

245

Trp Val Cys Arg Asp Arg Cys Leu Gln

260 265

Ala Val Ser Pro Glu Thr Glu Leu Thr

275 280 <210>269 <211>260 < 212> PRT < 213> Homo sapiens < 400>269

Leu Ser Val Gln Gln Gly Pro Asn Leu 15

Gln Ala Thr Leu Val Cys Gln Val Asp 20 25

Leu Arg Val Lys Trp Thr Lys Asp Gly

40

Ile Thr Asn Gly Ser Leu Ser Leu Gly

55

Leu Ser Trp Gln Ala Pro Ser His Leu 65 70

Ser Leu Asn His Ser Gly Ala Tyr Val 85

Pro Glu Leu Glu Glu Ala Glu Gly Asn

100 105

Pro Asp Asp Pro Thr Gln Asn Arg Asn

115 120

Phe Leu Phe Val Leu Leu Gly Val Gly

130 135

Val Trp Gly Ala Trp Phe Trp Gly Arg

145 150

Ser Gly Asn Ser Pro Gly Asn Ala Phe

165

Val Ala Val Ala Ile Gly

255

Ser Tyr Ala Gly Ala Trp

270

His Val

Gln Val Arg Gln Gly Ser

Ala Thr Ala Trp Glu Arg 30

Ile Leu Cys Gln Pro Tyr 45

Cys Gly Pro Gln Gly Arg 60

Leu Gln Leu Asp Pro Val 75 80

Trp Ala Ala Val Glu Ile 95

Thr Arg Leu Phe Val Asp

110

Ile Ala Ser Phe Pro Gly

125

Met Gly Val Ala Ala Ile 140

Ser Cys Gln Gln Arg Asp

155 160

Ser Asn Val Leu Tyr Arg

175

- 334 045238

Pro Arg Gly Ala Pro Lys Lys Ser Glu Asp Cys

180 185

Ser Gly Glu Gly

190

Asp Gln Arg Gly Gln Ser Ile Tyr Ser Thr Ser

195 200

Phe Pro Gln Pro

205

Pro Arg Gln Pro His Leu Ala Ser Arg Pro Cys

210 215

Pro Ser Pro Arg 220

Cys Pro Ser Pro Arg Pro Gly His Pro Val Ser

225 230 235

Met Val Arg Val

Pro Arg Pro Ser Pro Thr Gln Gln Pro Arg Pro

245 250

Lys Gly Phe Pro

255

Lys

Ala

Pro

Ser 240

Lys

Val Gly Glu Glu

260 <210>270 <211>257 < 212> PRT < 213> Homo sapiens < 400>270

Glu Pro Pro Thr Ala 15

Cys Arg Glu Lys Gln

Tyr Leu Ile Asn Ser

Cys Cys Ser Leu Cys

Gln Pro Gly Gln Lys

Leu Val Ser Asp Cys 30

Glu Phe Thr Glu Thr

Glu Cys Leu Pro Cys 40

Gly Glu Ser Glu Phe 45

Asp Thr Trp Asn Arg 50

Glu Thr His Cys His 55

Gln His Lys Tyr Cys 60

Pro Asn Leu Gly Leu 65

Arg Val Gln Gln Lys 70

Gly Thr Ser Glu Thr 75

Thr Ile Cys Thr Cys 85

Glu Glu Gly Trp His 90

Cys Thr Ser Glu Ala 95

Glu Ser Cys Val Leu

100

His Arg Ser Cys Ser

105

Pro Gly Phe Gly Val

110

Gln Ile Ala Thr Gly 115

Val Ser Asp Thr Ile 120

Cys Glu Pro Cys Pro 125

Gln

Thr

Leu

Asp

Asp 80

Cys

Lys

Val

- 335 045238

Gly Phe Phe Ser Asn 130

Val Ser Ser Ala Phe

135

Glu Lys Cys His Pro 140

Thr Ser Cys Glu Thr 145

Lys Asp Leu Val Val 150

Gln Gln Ala Gly Thr 155

Lys Thr Asp Val Val

165

Cys Gly Pro Gln Asp

170

Arg Leu Arg Ala Leu

175

Val Ile Pro Ile Ile

180

Phe Gly Ile Leu Phe

185

Ala Ile Leu Leu Val

190

Val Phe Ile Lys Lys 195

Val Ala Lys Lys Pro

200

Thr Asn Lys Ala Pro

205

Pro Lys Gln Glu Pro 210

Gln Glu Ile Asn Phe

215

Pro Asp Asp Leu Pro 220

Ser Asn Thr Ala Ala 225

Pro Val Gln Glu Thr 230

Leu His Gly Cys Gln 235

Val Thr Gln Glu Asp

245

Gly Lys Glu Ser Arg

250

Ile Ser Val Gln Glu

255

Trp

Asn 160

Val

Leu

His

Gly

Pro 240

Arg

Gln <210>271 <211>216 <212> PRT <213> Homo <400>271

Gln Arg Pro 1

Gly Thr Gly

Cys Arg Asp

Cys Val Gln 50

Arg His His 65 sapiens

Thr Gly Gly 5

Thr Asp Ala 20

Tyr Pro Gly

Pro Glu Phe

Pro Cys Pro 70

Pro Gly Cys

Gly Pro Gly 10

Arg Leu Leu 15

Arg Cys Cys

Arg Val His

Thr Thr Arg 30

Glu Glu Cys 40

Cys Ser Glu

Trp Asp Cys 45

His Cys Gly 55

Pro Gly Gln

Asp Pro Cys

Cys Thr Thr

Gly Val Gln

Ser Gln Gly

Leu

Cys

Met

Cys

Lys 80

- 336 045238

Phe Ser Phe Gly Phe 85

Gln Cys Ile Asp Cys 90

Ala Ser Gly Thr Phe 95

Gly Gly His Glu Gly

100

His Cys Lys Pro Trp

105

Thr Asp Cys Thr Gln

110

Gly Phe Leu Thr Val 115

Phe Pro Gly Asn Lys 120

Thr His Asn Ala Val

125

Val Pro Gly Ser Pro

130

Pro Ala Glu Pro Leu

135

Gly Trp Leu Thr Val

140

Leu Leu Ala Val Ala 145

Ala Cys Val Leu Leu 150

Leu Thr Ser Ala Gln 155

Gly Leu His Ile Trp

165

Gln Leu Arg Ser Gln

170

Cys Met Trp Pro Arg

175

Thr Gln Leu Leu Leu

180

Glu Val Pro Pro Ser

185

Thr Glu Asp Ala Arg

190

Cys Gln Phe Pro Glu 195

Glu Glu Arg Gly Glu 200

Arg Ser Ala Glu Glu 205

Ser

Phe

Cys

Val

Leu 160

Glu

Ser

Lys

Gly Arg Leu Gly Asp

210

Leu Trp Val

215 <210>272 <211>254 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>272

Met Glu Tyr Ala Ser 15

Asp Ala Ser Leu Asp

Pro Glu Ala Pro Trp

Pro Ala Pro Arg Ala

Arg Ala Cys Arg Val

Leu Pro Trp Ala Leu

Ala Gly Leu Leu Leu 35

Leu Leu Leu Leu Ala

Ala Ala Cys Ala Val 45

Leu Ala Cys Pro Trp 50

Ala Val Ser Gly Ala 55

Arg Ala Ser Pro Gly 60

Ala Ala Ser Pro Arg 65

Leu Arg Glu Gly Pro 70

Glu Leu Ser Pro Asp 75

Pro

Val

Phe

Ser

Asp 80

- 337 045238

Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln 85

Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly

100 105

Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr

115 120

Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys

130 135

Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val 145 150

Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro

165

Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu

180 185

Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly

195 200

Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His

210 215

Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr 225 230

Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro

245 <210>273 <211>183 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>273

Met Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu Glu 15

Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys Leu Leu 20 25

Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr

40

Met Phe Ala Gln Leu Val

Leu Ser Trp Tyr Ser Asp

110

Gly Leu Ser Tyr Lys Glu

125

Gly Val Tyr Tyr Val Phe

140

Gly Glu Gly Ser Gly Ser

155 160

Arg Ser Ala Ala Gly Ala

175

Pro Ala Ser Ser Glu Ala

190

Leu Leu His Leu Ser Ala

205

Glu Ala Arg Ala Arg His

220

Leu Gly Leu Phe Arg Val

235 240

Pro Arg Ser Glu

Val Gly Asn Ala Ala Arg

Val Ala Ser Val Ile Gln

Ile Cys Leu His Phe Ser 45

- 338 045238

Ala

Leu 50

Gln

Val

Ser

His

Arg 55

Tyr

Pro

Arg

Ile

Gln 60

Ser

Ile

Lys

Gln 65

Phe

Thr

Glu

Tyr

Lys 70

Lys

Glu

Lys

Gly

Phe 75

Ile

Leu

Thr

Ser

Lys

Glu

Asp

Glu

Ile 85

Met

Lys

Val

Gln

Asn 90

Asn

Ser

Val

Ile

Ile 95

Cys

Asp

Gly

Phe

100

Tyr

Leu

Ile

Ser

Leu

105

Lys

Gly

Tyr

Phe

Ser

110

Gln

Val

Asn

Ile

115

Ser

Leu

His

Tyr

Gln

120

Lys

Asp

Glu

Pro

125

Leu

Phe

Leu

Lys 130

Lys

Val

Arg

Ser

Val

135

Asn

Ser

Leu

Met

Val

140

Ala

Ser

Leu

Tyr

145

Lys

Asp

Lys

Val

Tyr 150

Leu

Asn

Val

Thr

155

Asp

Asn

Thr

Ser

Asp

Phe

His

Val

165

Asn

Gly

Glu

Leu

170

Ile

Leu

Ile

His

Gln

175

Val

Gln 80

Asn

Glu

Gln

Thr

Leu 160

Asn

Pro

Gly

Glu

Phe

180

Cys

Val

Leu <210>274 <211>155 < 212> PRT < 213> Homo sapiens < 400>274

Gln Arg Phe Ala Gln 15

Ala Gln Gln Gln Leu

Pro Leu Glu Ser Leu

Trp Asp Val Ala Glu

Leu Gln Leu Asn His

Thr Gly Pro Gln Gln 30

Pro Arg Leu Tyr Trp 35

Gln Gly Gly Pro Ala 40

Leu Gly Arg Ser Phe 45

His Gly Pro Glu Leu 50

Asp Lys Gly Gln Leu 55

Arg Ile His Arg Asp 60

Ile Tyr Met Val His 65

Ile Gln Val Thr Leu 70

Ala Ile Cys Ser Ser 75

Gly

Asp

Leu

Gly

Thr 80

- 339 045238

Thr Ala Ser

Arg His His 85

Pro Thr Thr

Leu Ala Val 90

Gly Ile Cys 95

Pro Ala Ser

Arg Ser Ile 100

Ser Leu Leu

105

Arg Leu Ser

Phe His Gln

110

Cys Thr Ile

115

Ala Ser Gln

Arg Leu Thr

120

Pro Leu Ala

Arg Gly Asp 125

Leu Cys Thr

130

Asn Leu Thr

Gly Thr Leu 135

Leu Pro Ser

140

Arg Asn Thr

Ser

Gly

Thr

Asp

Glu Thr Phe 145

Phe Gly Val

150

Gln Trp Val

Arg Pro

155 <210>275 <211>240 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>275

Met Ile Glu Thr Tyr 15

Asn Gln Thr Ser Pro

Arg Ser Ala Ala Thr

Leu Pro Ile Ser Met

Lys Ile Phe Met Tyr

Leu Leu Thr Val Phe

Ile Thr Gln Met Ile

Gly Ser Ala Leu Phe 40

Ala Val Tyr Leu His 45

Arg Leu Asp Lys Ile 50

Glu Asp Glu Arg Asn 55

Leu His Glu Asp Phe 60

Phe Met Lys Thr Ile 65

Gln Arg Cys Asn Thr 70

Gly Glu Arg Ser Leu 75

Leu Leu Asn Cys Glu 85

Glu Ile Lys Ser Gln 90

Phe Glu Gly Phe Val 95

Asp Ile Met Leu Asn

100

Lys Glu Glu Thr Lys

105

Lys Glu Asn Ser Phe

110

Met Gln Lys Val Leu 115

Gln Trp Ala Glu Lys 120

Gly Tyr Tyr Thr Met 125

Asn Asn Leu Val Thr

130

Leu Glu Asn Gly Lys

135

Gln Leu Thr Val Lys

140

Gly

Leu

Arg

Val

Ser 80

Lys

Glu

Ser

Arg

- 340 045238

Gln

145

Gly

Leu

Tyr

Ile

150

Tyr

Ala

Gln

Val

Thr

155

Phe

Cys

Ser

Asn

Glu

Ala

Ser

Gln

165

Ala

Pro

Phe

Ile

Ala

170

Ser

Leu

Cys

Leu

Lys

175

Pro

Gly

Arg

Phe

180

Glu

Arg

Ile

Leu

185

Arg

Ala

Asn

Thr

190

His

Ser

Ala

Lys 195

Pro

Cys

Gly

Gln

200

Ser

Ile

His

Leu

Gly 205

Gly

Val

Glu

Leu

210

Gln

Pro

Gly

Ala

Ser 215

Val

Phe

Val

Asn

Val

220

Thr

Asp

Pro

Gln

225

Val

Ser

His

Gly

Thr 230

Gly

Phe

Thr

Ser

Phe

235

Gly

Leu

Lys <210>

<211>

<212>

<213>

276 393 PRT Homo sapiens <400>

276

Gln

Gly

Thr

Arg 5

Ser

Pro

Arg

Cys

Asp 10

Cys

Ala

Gly

Asp

Phe 15

Lys

Ile

Gly

Leu

Phe

Cys

Arg 25

Gly

Cys

Pro

Ala

Gly 30

His

Leu

Lys

Ala 35

Pro

Cys

Thr

Glu

Pro 40

Cys

Gly

Asn

Ser

Thr 45

Cys

Leu

Cys

Pro 50

Gln

Asp

Thr

Phe

Leu 55

Ala

Trp

Glu

Asn

His 60

His

Asn

Ser

Cys 65

Ala

Arg

Cys

Gln

Ala 70

Cys

Asp

Glu

Gln

Ala 75

Ser

Gln

Val

Ala

Glu

Asn

Cys

Ser

Ala 85

Val

Ala

Asp

Thr

Arg 90

Cys

Gly

Cys

Lys

Pro 95

Trp

Phe

Val

Glu

100

Cys

Gln

Val

Ser

Gln

105

Cys

Val

Ser

110

Pro

Tyr

Cys

Gln

115

Pro

Cys

Leu

Asp

Cys

120

Gly

Ala

Leu

His

Arg

125

His

Thr

Arg 160

Ser

Phe

Ser

Leu 240

His

Tyr

Val

Glu

Leu 80

Gly

Phe

Arg

- 341 045238

Leu

Phe 145

Gly

Phe

Gly

Leu

Ala 225

Pro

Trp

Thr

Ala

Leu 305

Arg

Ile

Glu

Val

Leu Cys Ser 130

Tyr Glu His

Ser Cys Pro

Trp Val Gln

180

Ala Thr Leu

195

Val Thr Ala 210

Thr His Leu

Asp Ser Ser

Thr Pro Gly

260

Trp Ser Trp

275

Pro Thr Leu 290

Gln Pro Gly

Arg Trp Lys

Glu Ala Val

340

Met Leu Lys

355

Tyr Ala Ala

Arg Arg Asp

135

Gly Asp Gly

150

Glu Arg Cys 165

Val Leu Leu

Thr Tyr Thr

Asp Glu Ala

215

Ser Pro Leu

230

Glu Lys Ile 245

Tyr Pro Glu

Asp Gln Leu

Ser Pro Glu

295

Pro Gln Leu

310

Glu Phe Val 325

Glu Val Glu

Arg Trp Arg

Leu Glu Arg

Thr Asp Cys

Cys Val Ser

Ala Ala Val

170

Ala Gly Leu

185

Tyr Arg His 200

Gly Met Glu

Asp Ser Ala

Cys Thr Val

250

Thr Gln Glu

265

Pro Ser Arg 280

Ser Pro Ala

Tyr Asp Val

Arg Thr Leu

330

Ile Gly Arg

345

Gln Gln Gln 360

Met Gly Leu

Gly Thr Cys

140

Cys Pro Thr 155

Cys Gly Trp

Val Val Pro

Cys Trp Pro

205

Ala Leu Thr

220

His Thr Leu 235

Gln Leu Val

Ala Leu Cys

Ala Leu Gly

285

Gly Ser Pro

300

Met Asp Ala 315

Gly Leu Arg

Phe Arg Asp

Pro Ala Gly

365

Asp Gly Cys

Leu Pro Gly

Ser Thr Leu

160

Arg Gln Met

175

Leu Leu Leu 190

His Lys Pro

Pro Pro Pro

Leu Ala Pro

240

Gly Asn Ser

255

Pro Gln Val 270

Pro Ala Ala

Ala Met Met

Val Pro Ala

320

Glu Ala Glu

335

Gln Gln Tyr 350

Leu Gly Ala

Val Glu Asp

- 342 045238

	370	375
Leu	Arg Ser Arg	Leu Gln Arg Gly Pro
385 390 <210> 277 <211> 240 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 277 Met Glu Glu Ser Val Val Arg Pro Ser
1 Thr	Asp Ile Pro	5 Phe Thr Arg Leu Gly
Cys	20 Ser Val Ala	25 Arg Val Gly Leu Gly
Ala	35 Gly Leu Ala	40 Val Gln Gly Trp Phe
Leu	50 Gly Glu Met	55 Val Thr Arg Leu Pro
65 Glu	Gln Leu Ile	70 Gln Glu Arg Arg Ser
His	Leu Thr Gly	85 Ala Asn Ser Ser Leu
Leu	100 Trp Glu Thr	105 Gln Leu Gly Leu Ala
His	115 Asp Gly Ala	120 Leu Val Val Thr Lys
Ser	130 Lys Val Gln	135 Leu Gly Gly Val Gly
145 Thr	Ile Thr His	150 Gly Leu Tyr Lys Arg
Leu	Glu Leu Leu	165 Val Ser Gln Gln Ser
Ser	180 Ser Arg Val	185 Trp Trp Asp Ser Ser

380

Phe Val Val Asp Gly Gln

Ser His Arg Arg Gln Ser 30

Leu Leu Leu Leu Met Gly 45

Leu Gln Leu His Trp Arg 60

Gly Pro Ala Gly Ser Trp 75 80

Glu Val Asn Pro Ala Ala

Gly Ser Gly Gly Pro Leu

110

Leu Arg Gly Leu Ser Tyr

125

Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr 140

Pro Leu Gly Leu Ala Ser

155 160

Pro Arg Tyr Pro Glu Glu

175

Cys Gly Arg Ala Thr Ser

190

Leu Gly Gly Val Val His

- 343 045238

195

200

205

Leu Glu Ala

210

Gly

Glu

Lys

Val

215

Val

Arg

Val

Leu

220

Asp

Glu

Arg

Val Arg Leu 225

Arg

Asp

Gly 230

Thr

Arg

Ser

Tyr

Phe

235

Gly

Ala

Phe

Met <210>278 <211>199 <212> PRT <213> Homo <400>278

Met Thr Leu 1 sapiens

His

Pro 5

Ser

Pro

Ile

Thr

Cys 10

Glu

Phe

Leu

Phe

Ser 15

Ala Leu Ile

Ser 20

Pro

Lys

Met

Cys

Leu 25

Ser

His

Leu

Glu

Asn 30

Met

Leu Ser His

Ser

Arg

Thr

Gln

Gly 40

Ala

Gln

Arg

Ser

Ser 45

Trp

Lys

Trp Leu Phe 50

Cys

Ser

Ile

Val 55

Met

Leu

Phe

Leu 60

Cys

Ser

Phe

Trp Leu Ile 65

Phe

Ile

Phe 70

Leu

Gln

Leu

Glu

Thr 75

Ala

Lys

Glu

Pro

Met Ala Lys

Phe

Gly 85

Pro

Leu

Pro

Ser

Lys 90

Trp

Gln

Met

Ala

Ser 95

Glu Pro Pro

Cys 100

Val

Asn

Lys

Val

Ser

105

Asp

Trp

Lys

Leu

Glu

110

Ile

Gln Asn Gly

115

Leu

Tyr

Leu

Ile

Tyr 120

Gly

Gln

Val

Ala

Pro

125

Asn

Ala

Tyr Asn Asp

130

Val

Ala

Pro

Phe

135

Glu

Val

Arg

Leu

Tyr 140

Lys

Asn

Lys

Met Ile Gln 145

Thr

Leu

Thr

150

Asn

Lys

Ser

Lys

Ile

155

Gln

Asn

Val

Gly

Thr Tyr Glu

Leu

His

165

Val

Gly

Asp

Thr

Ile

170

Asp

Leu

Ile

Phe

Asn

175

Glu His Gln

Val

Leu

Lys

Asn

Thr

Tyr

Trp

Gly

Ile

Leu

Val 240

Thr

Pro

Leu

Ser

Cys 80

Ser

Leu

Asn

Asp

Gly 160

Ser

Leu

- 344 045238

180

185

190

Ala Asn Pro

195

Gln Phe Ile

Ser <210>279 <211>277 <212> PRT <213> Homo <400>279

Met Cys Val 1 sapiens

Gly Ala Arg 5

Leu Leu Leu

Gly Leu Gly 20

Gly Asp Thr

Tyr Pro Ser

Gly Asn Gly 50

Met Val Ser

Arg Pro Cys 65

Gly Pro Gly

Cys Lys Pro

Cys Thr Trp 85

Gln Leu Cys

Thr Ala Thr 100

Thr Gln Pro

115

Leu Asp Ser

Pro Pro Gly

130

His Phe Ser

Thr Asn Cys 145

Thr Leu Ala

150

Ser Ser Asp

Ala Ile Cys

165

Gln Glu Thr

Gln Gly Pro 180

Glu Ala Trp

Pro Arg Thr

Arg Leu Gly

Leu Ser Thr 25

Asn Asp Arg 40

Arg Cys Ser 55

Phe Tyr Asn

Cys Asn Leu

Gln Asp Thr 105

Tyr Lys Pro 120

Pro Gly Asp 135

Gly Lys His

Glu Asp Arg

Pro Ala Arg

185

Ser Gln Gly

Arg Gly Pro 10

Val Thr Gly

Cys Cys His

Arg Ser Gln 60

Asp Val Val

Arg Ser Gly 90

Val Cys Arg

Gly Val Asp

Asn Gln Ala

140

Thr Leu Gln

155

Asp Pro Pro 170

Pro Ile Thr

Pro Ser Thr

Cys Ala Ala

Leu His Cys 30

Glu Cys Arg 45

Asn Thr Val

Ser Ser Lys

Ser Glu Arg

Cys Arg Ala

110

Cys Ala Pro 125

Cys Lys Pro

Pro Ala Ser

Ala Thr Gln

175

Val Gln Pro

190

Arg Pro Val

Leu

Val

Pro

Cys

Pro 80

Lys

Gly

Cys

Trp

Asn 160

Pro

Thr

Glu

- 345 045238

195

200

205

Val

Pro

210

Gly

Arg

Ala

Val

215

Ala

Ile

Leu

Gly 220

Leu

Gly

Leu

Val

Leu

225

Gly

Leu

Gly

Pro

230

Leu

Ala

Ile

Leu

235

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu 240

Arg

Asp

Gln

Arg 245

Leu

Pro

Asp

Ala

250

His

Lys

Pro

Gly 255

Gly

Ser

Phe

Arg 260

Thr

Pro

Ile

Gln

Glu

265

Glu

Gln

Ala

Asp

Ala

270

His

Ser

Thr Leu Ala Lys Ile

275 <210>280 <211>260 < 212> PRT < 213> Homo sapiens < 400>280

Met 1

Ala

Arg

Pro

His 5

Pro

Trp

Leu

Cys 10

Val

Leu

Gly

Thr

Leu 15

Val

Gly

Leu

Ser

Ala 20

Thr

Pro

Ala

Pro

Lys 25

Ser

Cys

Pro

Glu

Arg 30

His

Tyr

Trp

Ala

Gln 35

Gly

Lys

Leu

Cys

Cys 40

Gln

Met

Cys

Glu

Pro 45

Gly

Thr

Phe

Leu

Val 50

Lys

Asp

Cys

Asp

Gln 55

His

Arg

Lys

Ala

Ala 60

Gln

Cys

Asp

Pro

Cys 65

Ile

Pro

Gly

Val

Ser 70

Phe

Ser

Pro

Asp

His 75

His

Thr

Arg

Pro

His 80

Cys

Glu

Ser

Cys

Arg 85

His

Cys

Asn

Ser

Gly 90

Leu

Val

Arg

Asn 95

Cys

Thr

Ile

Thr

Ala 100

Asn

Ala

Glu

Cys

Ala 105

Cys

Arg

Asn

Gly

Trp 110

Gln

Cys

Arg

Asp

Lys 115

Glu

Cys

Thr

Glu

Cys 120

Asp

Pro

Leu

Pro

Asn 125

Pro

Ser

Leu

Thr

Ala

Arg

Ser

Gln

Ala

Leu

Ser

Pro

His

Pro

Gln

Pro

Thr

His

- 346 045238

130

135

140

Leu Pro Tyr Val Ser 145

Glu Met Leu Glu Ala 150

Arg Thr Ala Gly His 155

Gln Thr Leu Ala Asp

165

Phe Arg Gln Leu Pro

170

Ala Arg Thr Leu Ser

175

His Trp Pro Pro Gln

180

Arg Ser Leu Cys Ser

185

Ser Asp Phe Ile Arg

190

Leu Val Ile Phe Ser

195

Gly Met Phe Leu Val 200

Phe Thr Leu Ala Gly

205

Leu Phe Leu His Gln

210

Arg Arg Lys Tyr Arg

215

Ser Asn Lys Gly Glu

220

Pro Val Glu Pro Ala 225

Glu Pro Cys His Tyr 230

Ser Cys Pro Arg Glu 235

Glu Gly Ser Thr Ile

245

Pro Ile Gln Glu Asp

250

Tyr Arg Lys Pro Glu

255

Met 160

Thr

Ile

Ala

Ser

Glu 240

Pro

Ala Cys Ser Pro

260 <210>281 <211>255 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>281

Met Gly Asn Ser Cys 15

Tyr Asn Ile Val Ala

Thr Leu Leu Leu Val

Asn Phe Glu Arg Thr 20

Arg Ser Leu Gln Asp

Pro Cys Ser Asn Cys

Ala Gly Thr Phe Cys 35

Asp Asn Asn Arg Asn

Gln Ile Cys Ser Pro 45

Pro Pro Asn Ser Phe 50

Ser Ser Ala Gly Gly 55

Gln Arg Thr Cys Asp 60

Cys Arg Gln Cys Lys 65

Gly Val Phe Arg Thr 70

Arg Lys Glu Cys Ser 75

Leu

Pro

Cys

Ile

Ser 80

Gly

Thr Ser Asn Ala Glu

Cys Asp Cys Thr Pro

Gly Phe His Cys Leu

- 347 045238

Ala Gly Cys

Ser Met Cys 100

Glu Gln Asp

105

Thr Lys Lys

115

Gly Cys Lys

Asp Cys Cys 120

Lys Arg Gly

130

Ile Cys Arg

Pro Trp Thr 135

Ser Val Leu 145

Val Asn Gly

150

Thr Lys Glu

Ser Pro Ala

Asp Leu Ser 165

Pro Gly Ala

Pro Ala Arg

Glu Pro Gly 180

His Ser Pro

185

Cys Lys Gln

Phe Gly Thr

Asn Cys Ser 140

Arg Asp Val 155

Ser Ser Val 170

Gln Ile Ile

Gly Gln Glu

110

Phe Asn Asp 125

Leu Asp Gly

Val Cys Gly

Thr Pro Pro

175

Ser Phe Phe

190

Ala Leu Thr

195

Ser Thr Ala

Leu Leu Phe

200

Leu Leu Phe

Phe Leu Thr 205

Arg Phe Ser

210

Val Val Lys

Arg Gly Arg 215

Lys Lys Leu

220

Leu Tyr Ile

Lys Gln Pro 225

Phe Met Arg

230

Pro Val Gln

Thr Thr Gln

235

Glu Glu Asp

Leu

Gln

Lys

Pro 160

Ala

Leu

Phe

Gly 240

Cys Ser Cys

Arg Phe Pro

245

Glu Glu Glu

Glu Gly Gly 250

Cys Glu Leu

255 <210>282 <211>216 <212> PRT <213> Homo <400>282

Met Gly Trp 1 sapiens

Glu Phe His

Arg Trp Gln

Asn Ala Ser

Ile Arg Gly Arg 5

Asn Tyr Asn Leu 20

Lys Gln Arg Cys

Pro Phe Phe Phe

Arg Ser Arg His Ser 10

Asp Leu Lys Lys Ser 25

Pro Val Val Lys Ser 40

Cys Cys Phe Ile Ala

Trp Glu Met

Asp Phe Ser 30

Lys Cys Arg 45

Val Ala Met

Ser

Thr

Glu

Gly

- 348 045238

Ile Arg Phe Ile Ile 65

Met Val Ala Ile Trp 70

Ser Ala Val Phe Leu 75

Ser Leu Phe Asn Gln

Glu Val Gln Ile Pro

Leu Thr Glu Ser Tyr 95

Gly Pro Cys Pro Lys

100

Asn Trp Ile Cys Tyr

105

Lys Asn Asn Cys Tyr

110

Phe Phe Asp Glu Ser 115

Lys Asn Trp Tyr Glu

120

Ser Gln Ala Ser Cys 125

Ser Gln Asn Ala Ser

130

Leu Leu Lys Val Tyr

135

Ser Lys Glu Asp Gln

140

Leu Leu Lys Leu Val 145

Lys Ser Tyr His Trp 150

Met Gly Leu Val His 155

Pro Thr Asn Gly Ser

165

Trp Gln Trp Glu Asp

170

Gly Ser Ile Leu Ser

175

Asn Leu Leu Thr Ile

180

Ile Glu Met Gln Lys

185

Gly Asp Cys Ala Leu

190

Ala Ser Ser Phe Lys 195

Gly Tyr Ile Glu Asn 200

Cys Ser Thr Pro Asn

205

Asn 80

Cys

Gln

Met

Asp

Ile 160

Pro

Tyr

Thr

Tyr Ile Cys Met Gln 210

Arg Thr Val

215 <210>283 <211>194 <212> PRT <213> Homo <400>283

Gln Gly His 1

Leu Asn Ile

Phe Tyr Thr 35

Lys Tyr Phe sapiens

Leu Val His 5

Ser Glu Ser 20

Phe Asp Gln

Glu Ser Lys

Met Thr Val

Leu Pro Glu 25

Lys Ile Val 40

Phe Lys Gly

Val Ser Gly 10

Asn Tyr Lys

Glu Trp Asp

Arg Val Arg

Ser Asn Val

Gln Leu Thr

Ser Arg Lys 45

Thr

Trp

Ser

Gln

Leu Asp Pro

- 349 045238

Ser Gly Ala 65

Leu Tyr

Tyr Ile Met

Arg Val

Ile Lys Leu

Gln Val 100

Glu Lys Ile

115

Glu Asp

Val Ile Pro

130

Gly Glu

Pro Phe Pro 145

Lys Glu

Pro His Asn

Tyr Ser

165

Ser Ser Lys

Asn Gly 180

Ile Ser 70

Leu Lys

Leu Asp

Met Asp

Ser Val

135

Leu Gln 150

Arg Cys

Thr Val

Lys Val

Lys Thr

Pro Val

105

Asp Asn 120

Asn Tyr

Asn Ser

Tyr Thr

Cys Leu

185

Arg Ser <210>284 <211>318 <212> PRT <213> Homo <400>284

Glu Glu Val 1

Leu Glu Cys

Phe Lys Ile

His Gly Met 50

Asn Ser Thr sapiens

Leu Trp His Thr 5

Val Tyr Pro Ser 20

Gly Thr Gln Gln

Val Ile Arg Lys 55

Met Ala Ser Asn

Gln Lys 75

Gly Asn 90

Pro Lys

Cys Tyr

Thr Trp

Val Leu

155

Cys Gln 170

Ser Pro

Ser Val Pro Phe

Met Gly Ile Leu 25

Asp Ser Ile Ala 40

Pro Tyr Ala Glu

Asn Met Thr Leu

Glu Asp

Glu Gln

Pro Val

Leu Lys

125

Tyr Gly 140

Glu Thr

Val Ser

Pro Cys

Asn Ser

Glu Trp

Ile Lys 110

Leu Ser

Asp Lys

Thr Leu

Asn Ser

175

Thr Leu 190

Ala Glu Asn Met

Thr Gln Val Glu

Ile Phe Ser Pro

Arg Val Tyr Phe 60

Phe Phe Arg Asn

Thr 80

Lys

Ile

Cys

Arg

Met 160

Val

Ala

Ser

Trp

Thr

Leu

Ala

- 350 045238

Ser

Gln

Glu

Asn

Val 145

Cys

Ile

Asp

Ser

Gly 225

Leu

Trp

Ser

Val 305

Glu Asp Asp

Gly Thr Trp

100

Ala Ala Val

115

Val Thr Leu 130

Arg Trp Glu

Asn Leu Val

Val Ser Asn

180

Val Thr Val

195

Ala Gly Glu 210

Lys Thr Asp

Leu Leu Leu

Asn Arg Arg

260

Asp Thr Gln

275

Gln Pro Thr 290

Asn Tyr Pro

Val Gly Tyr 85

Gln Lys Val

Pro Ser Asn

Thr Cys Gln

135

Lys Ile Gln

150

His Gly Arg 165

Cys Ser His

Ser Asp Ser

Asn Glu Thr

215

Asn Gln Tyr

230

Phe Val Ile 245

Arg Arg Arg

Lys Ala Pro

Asn Gln Ser

295

Thr Phe Ser

310

Tyr Ser Cys 90

Ser Leu Tyr

Ile Gln Val

105

Ser His Ile 120

Pro Gln Met

Pro Arg Gln

Asn Phe Thr

170

Gly Arg Trp

185

Gly Leu Tyr 200

Phe Val Met

Thr Leu Phe

Ser Ile Thr

250

Glu Arg Arg

265

Asn Asn Tyr 280

Met Asp Asp

Arg Arg Pro

Val Gln Ser

Val Ser Glu

125

Thr Trp Pro

140

Ile Asp Leu 155

Ser Lys Phe

Ser Val Ile

Arg Cys Tyr

205

Arg Leu Thr

220

Val Ala Gly 235

Thr Ile Ile

Asp Leu Phe

Arg Ser Pro

285

Thr Arg Glu

300

Lys Thr Arg 315

Thr Tyr Pro 95

Asp Ser Phe 110

Pro Gly Lys

Val Gln Ala

Leu Thr Tyr 160

Pro Arg Gln 175

Val Ile Pro 190

Leu Gln Ala

Val Ala Glu

Gly Thr Val 240

Val Ile Phe 255

Thr Glu Ser 270

Ile Ser Thr

Asp Ile Tyr

Val

- 351 045238 <210>285 <211>360 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>285

Glu Pro His Ser Leu 1 5

Arg Tyr Asn Leu Thr

Val Leu Ser Trp Asp

Ser Val Gln Ser Gly 20

Phe Leu Thr Glu Val

His Leu Asp Gly Gln 30

Phe Leu Arg Cys Asp 35

Arg Gln Lys Cys Arg 40

Ala Lys Pro Gln Gly 45

Trp Ala Glu Asp Val 50

Leu Gly Asn Lys Thr 55

Trp Asp Arg Glu Thr 60

Asp Leu Thr Gly Asn 65

Gly Lys Asp Leu Arg 70

Met Thr Leu Ala His 75

Lys Asp Gln Lys Glu 85

Gly Leu His Ser Leu 90

Gln Glu Ile Arg Val 95

Glu Ile His Glu Asp

100

Asn Ser Thr Arg Ser

105

Ser Gln His Phe Tyr

110

Asp Gly Glu Leu Phe 115

Leu Ser Gln Asn Leu

120

Glu Thr Lys Glu Trp 125

Met Pro Gln Ser Ser

130

Arg Ala Gln Thr Leu

135

Ala Met Asn Val Arg

140

Phe Leu Lys Glu Asp 145

Ala Met Lys Thr Lys 150

Thr His Tyr His Ala 155

His Ala Asp Cys Leu

165

Gln Glu Leu Arg Arg

170

Tyr Leu Lys Ser Gly

175

Val Leu Arg Arg Thr

180

Val Pro Pro Met Val

185

Asn Val Thr Arg Ser

190

Ala Ser Glu Gly Asn 195

Ile Thr Val Thr Cys 200

Arg Ala Ser Gly Phe 205

Pro Trp Asn Ile Thr

210

Leu Ser Trp Arg Gln

215

Asp Gly Val Ser Leu

220

Gly

Pro

Gln

Arg

Ile 80

Cys

Tyr

Thr

Asn

Met 160

Val

Glu

Tyr

Ser

- 352 045238

His Asp Thr 225

Gln Gln Trp Gly Asp Val Leu Pro Asp

230 235

Gly Asn Gly Thr

240

Tyr Gln Thr

Trp Val Ala Thr Arg Ile Cys Gln Gly

245 250

Glu Glu Gln Arg

255

Phe Thr Cys

Tyr Met Glu His Ser Gly Asn His Ser

260 265

Thr His Pro Val

270

Pro Ser Gly

275

Lys Val Leu Val Leu Gln Ser His Trp

280

Gln Thr Phe His 285

Val Ser Ala

290

Val Ala Ala Ala Ala Ile Phe Val Ile

295 300

Ile Ile Phe Tyr

Val Arg Cys 305

Cys Lys

Lys Lys Thr Ser Ala Ala Glu Gly Pro Glu Leu

310 315 320

Val Ser Leu

Gln Val

325

Leu Asp Gln His Pro Val Gly Thr Ser Asp His

330 335

Arg Asp Ala

Thr Gln 340

Leu Gly Phe Gln Pro Leu Met Ser Asp Leu Gly

345 350

Ser Thr Gly

355

Ser Thr Glu Gly Ala

360 <210>286 <211>279 <212> PRT <213> Homo <400>286

Phe Lys Val 1 sapiens

Asn Val Thr

Asp Val Thr

Gln Thr Cys 50

Ala

Leu 20

Phe

Ser

Thr Pro Tyr Ser 5

Thr Cys Arg Leu

Tyr Lys Thr Trp 40

Glu Arg Arg Pro

Leu Tyr Val Cys Pro Glu Gly Gln

15

Leu Gly Pro Val Asp Lys Gly His 25 30

Tyr Arg Ser Ser Arg Gly Glu Val 45

Ile Arg Asn Leu Thr Phe Gln Asp 60

Leu His Leu 65

His His Gly Gly His 70

Gln Ala Ala Asn Thr Ser His Asp

80

- 353 045238

Leu Ala Gln

Arg His 85

Gly Leu

Glu Ser

Phe Ser Ile

Thr Met 100

Arg Asn

Leu Thr

105

Cys Cys Leu

115

Val Val

Glu Ile

Arg His 120

His Gly Ala

130

Met Glu

Leu Gln

135

Val Gln

Ala Ser 90

Leu Leu

His His

Thr Gly

Asp His

Asp Ser

Ser Glu

125

Lys Asp 140

Asn Cys Val 145

Val Tyr

Pro Ser 150

Ser Ser

Gln Asp

155

Ser Glu

His Gly 95

Gly Leu 110

His Arg

Ala Pro

Asn Ile

Ala Ala Ala

Leu Ala

165

Thr Gly

Ala Cys

Ile Val

170

Gly Ile

Leu Cys

175

Pro Leu Ile

Leu Leu 180

Leu Val

Tyr Lys

185

Gln Arg

Gln Ala

Ala Ser 190

Arg Arg Ala

195

Gln Glu

Leu Val

Arg Met 200

Asp Ser

Asn Ile

205

Gln Gly

Glu Asn Pro

210

Gly Phe

Glu Ala

215

Ser Pro

Pro Ala

Gln Gly 220

Ile Pro

Ala Lys Val 225

Arg His

Pro Leu 230

Ser Tyr

Val Ala

235

Gln Arg

Gln Pro

Glu Ser Gly

Arg His

245

Leu Leu

Ser Glu

Pro Ser 250

Thr Pro

Leu Ser

255

Pro Gly Pro

Gly Asp 260

Val Phe

Phe Pro

265

Ser Leu

Asp Pro

Val Pro 270

Asn

Tyr

Val

Ser

Thr 160

Leu

Asn

Ile

Glu

Ser 240

Pro

Asp

Ser Pro Asn

275

Phe Glu

Val Ile <210>287 <211>432 <212> PRT <213> Homo <400>287

Lys Gln Ser 1 sapiens

Glu Asp Phe Arg Val 5

Ile Gly Pro Ala His Pro Ile

15

Leu

- 354 045238

Ala Gly Val Gly Glu 20

Asp Ala Leu Leu Thr

Cys Gln Leu Leu Pro 30

Arg Thr Thr Met His 35

Val Glu Val Arg Trp 40

Tyr Arg Ser Glu Pro 45

Thr Pro Val Phe Val

His Arg Asp Gly Val 55

Glu Val Thr Glu Met 60

Met Glu Glu Tyr Arg 65

Gly Trp Val Glu Trp 70

Ile Glu Asn Gly Ile 75

Lys Gly Asn Val Ala 85

Leu Lys Ile His Asn 90

Ile Gln Pro Ser Asp 95

Gly Gln Tyr Trp Cys

100

His Phe Gln Asp Gly

105

Asn Tyr Cys Gly Glu

110

Ser Leu Leu Leu Lys 115

Val Ala Gly Leu Gly

120

Ser Ala Pro Ser Ile

125

Met Glu Gly Pro Gly 130

Glu Ser Gly Val Gln

135

Leu Val Cys Thr Ala 140

Gly Trp Phe Pro Glu 145

Pro Gln Val Tyr Trp 150

Glu Asp Ile Arg Gly 155

Lys Leu Leu Ala Val

165

Ser Glu His Arg Ile

170

Gln Asp Lys Asp Gly

175

Phe Tyr Ala Glu Ala

180

Thr Leu Val Val Arg

185

Asn Ala Ser Ala Glu

190

Val Ser Cys Leu Val

195

His Asn Pro Val Leu

200

Thr Glu Glu Lys Gly

205

Val Ile Ser Leu Pro

210

Glu Lys Leu Gln Thr

215

Glu Leu Ala Ser Leu

220

Val Asn Gly Pro Ser 225

Gln Pro Ile Leu Val 230

Arg Val Gly Glu Asp 235

Gln Leu Thr Cys Tyr

245

Leu Ser Pro Lys Ala

250

Asn Ala Gln Ser Met

255

Val Arg Trp Asp Arg

260

Ser His Arg Tyr Pro

265

Ala Val His Val Tyr

270

Lys

Ser

Gln

Ala 80

Asn

Thr

His

Arg

Glu 160

Leu

Ser

Lys

Ile 240

Glu

Met

- 355 045238

Asp Gly Asp

275

His Val

Ala Gly

Thr Val Leu

290

Val Ser

Asp Ala

295

Ile Leu Ser 305

Ala Arg

Pro Ser 310

Glu Lys Asp

Asp Val

325

Tyr Gln

Ser Leu Gly

Ser Ser 340

Pro Leu

Glu Met Gln

355

Pro Met

Cys Ser

Val Pro Trp

370

Arg Asp

Met Glu

375

Ala Leu Thr 385

Gln Gly

Ser His

390

Arg Val Thr

Asn Ile

405

Ser Ala

Pro Phe Leu

Gly Glu 420

Glu Lys

Glu Gln 280

Ile Asp

Asp Asp

Glu Ala

Ile Thr 345

Ser Asp 360

Gly Lys

Gly Leu

Val Asp

Ile Ala

425

Met Ala

Glu Gly

Gly Gln

315

Ser Leu

330

Val Glu

Gly Trp

Thr Ile

Phe His

395

Val Thr 410

Thr Phe

Glu Tyr

285

Arg Leu 300

Tyr Arg

Asp Leu

Gly Gln

Phe Pro

365

Pro Ser 380

Val Gln

Cys Ser

Ser Leu

Arg Gly

Thr Leu

Cys Leu

Lys Val

335

Glu Asp 350

Gln Pro

Ser Ser

Thr Leu

Ile Ser

415

Ser Gly 430

Arg

Gln

Phe 320

Val

Gly

His

Gln

Leu 400

Ile

Trp <210>288 <211>506 <212> PRT <213> Homo <400>288

Leu Glu Val 1

Asp Ala Thr

Ala Gln Leu

His Ser Phe sapiens

Gln Val 5

Leu Cys 20

Asn Leu

Ala Glu

Pro Glu

Cys Ser

Ile Trp

Gly Gln

Asp Pro

Phe Ser

Gln Leu 40

Asp Gln

Val Val 10

Pro Glu

Thr Asp

Gly Ser

Ala Leu

Val Gly

Pro Gly

Phe Ser 30

Thr Lys 45

Gln Leu

Ala Tyr 60

Ala Asn

Thr

Leu

Val

Arg

- 356 045238

Thr 65

Leu

Ser

Pro

Glu 145

Asn

His

Leu

Ile

Glu 225

Ser

Trp

Arg

Leu

Ala 305

Ala Leu Phe

Gln Arg Val

Ile Arg Asp

100

Tyr Ser Lys 115

Gly Asp Thr 130

Ala Glu Val

Val Thr Thr

Ser Ile Leu

180

Val Arg Asn

195

Thr Pro Gln 210

Asp Pro Val

Phe Ser Pro

Gln Leu Thr

260

Asp Gln Gly

275

Leu Ala Gln 290

Asp Glu Gly

Pro Asp Leu 70

Leu Ala Gln

Gly Asn Ala 75

Ser Leu Arg 80

Arg Val Ala 85

Asp Glu Gly

Ser Phe Thr

Cys Phe Val 95

Phe Gly Ser

Pro Ser Met

Val Thr Ile

135

Phe Trp Gln

150

Ser Gln Met 165

Arg Val Val

Pro Val Leu

Arg Ser Pro

215

Val Ala Leu

230

Glu Pro Gly 245

Asp Thr Lys

Ser Ala Tyr

Gly Asn Ala

295

Ser Phe Thr

310

Ala Ala Val

105

Thr Leu Glu 120

Thr Cys Ser

Asp Gly Gln

Ala Asn Glu

170

Leu Gly Ala

185

Gln Gln Asp 200

Thr Gly Ala

Val Gly Thr

Phe Ser Leu

250

Gln Leu Val

265

Ala Asn Arg 280

Ser Leu Arg

Cys Phe Val

Ser Leu Gln

Pro Asn Lys

125

Ser Tyr Gln

140

Gly Val Pro 155

Gln Gly Leu

Asn Gly Thr

Ala His Ser

205

Val Glu Val

220

Asp Ala Thr 235

Ala Gln Leu

His Ser Phe

Thr Ala Leu

285

Leu Gln Arg

300

Ser Ile Arg 315

Val Ala Ala 110

Asp Leu Arg

Gly Tyr Pro

Leu Thr Gly

160

Phe Asp Val

175

Tyr Ser Cys 190

Ser Val Thr

Gln Val Pro

Leu Arg Cys

240

Asn Leu Ile

255

Thr Glu Gly 270

Phe Pro Asp

Val Arg Val

Asp Phe Gly

320

- 357 045238

Ser Ala Ala

Val Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro

325 330

Tyr Ser

Lys Pro

335

Met Thr Leu

Glu Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro

340 345

Gly Asp

Thr Val 350

Ile Thr Cys

355

Ser Ser Tyr Arg

Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val Phe

360 365

Gln Asp Gly

370

Met Ala Asn 385

Gln Gly Val Pro 375

Glu Gln Gly Leu 390

Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr Ser 380

Phe Asp Val His Ser Val Leu Arg 395

Val Leu Gly

Ala Asn Gly Thr Tyr Ser 405

Cys Leu Val Arg Asn Pro

410 415

Leu Gln Gln

Asp Ala His Gly Ser Val

420 425

Thr Ile Thr Gly Gln Pro

430

Thr Phe Pro

435

Leu Ile Ala

450

Lys Gln Ser 465

Glu Gly Glu

Pro Glu Ala Leu Trp Val 440

Leu Leu Val Ala Leu Ala 455

Cys Glu Glu Glu Asn Ala 470

Gly Ser Lys Thr Ala Leu 485

Thr Val Gly Leu Ser Val 445

Phe Val Cys Trp Arg Lys

460

Gly Ala Glu Asp Gln Asp

475

Gln Pro Leu Lys His Ser

490 495

Ser

Thr

Trp

Gln

Val 400

Val

Met

Cys

Ile

Gly 480

Asp

Ser Lys Glu

Asp Asp Gly Gln Glu Ile Ala

500 505 <210>289 <211>258 <212> PRT <213> Homo <400>289

Leu Ile Ile 1 sapiens

Gly Phe Gly Ile 5

Ser Gly Arg His Ser Ile Thr Val

15

Thr Val Ala

Ser Ala Gly Asn 20

Ile Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser

30

Thr

Cys

- 358 045238

Thr Phe Glu Pro Asp 35

Ile Lys Leu Ser Asp 40

Ile Val Ile Gln Trp 45

Lys Glu Gly Val Leu 50

Gly Leu Val His Glu 55

Phe Lys Glu Gly Lys 60

Glu Leu Ser Glu Gln 65

Asp Glu Met Phe Arg 70

Gly Arg Thr Ala Val 75

Ala Asp Gln Val Ile 85

Val Gly Asn Ala Ser 90

Leu Arg Leu Lys Asn 95

Gln Leu Thr Asp Ala

100

Gly Thr Tyr Lys Cys

105

Tyr Ile Ile Thr Ser

110

Gly Lys Gly Asn Ala 115

Asn Leu Glu Tyr Lys 120

Thr Gly Ala Phe Ser 125

Pro Glu Val Asn Val

130

Asp Tyr Asn Ala Ser 135

Ser Glu Thr Leu Arg 140

Glu Ala Pro Arg Trp 145

Phe Pro Gln Pro Thr 150

Val Val Trp Ala Ser 155

Val Asp Gln Gly Ala

165

Asn Phe Ser Glu Val

170

Ser Asn Thr Ser Phe

175

Leu Asn Ser Glu Asn

180

Val Thr Met Lys Val

185

Val Ser Val Leu Tyr

190

Val Thr Ile Asn Asn

195

Thr Tyr Ser Cys Met 200

Ile Glu Asn Asp Ile 205

Lys Ala Thr Gly Asp

210

Ile Lys Val Thr Glu

215

Ser Glu Ile Lys Arg

220

Ser His Leu Gln Leu 225

Leu Asn Ser Lys Ala 230

Ser Leu Cys Val Ser 235

Phe Phe Ala Ile Ser

245

Trp Ala Leu Leu Pro

250

Leu Ser Pro Tyr Leu

255

Leu

Asp

Phe 80

Val

Lys

Met

Cys

Gln 160

Glu

Asn

Ala

Arg

Ser 240

Met

Leu Lys <210> 290

- 359 045238 <211>245 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>290

Leu Pro Ser Cys Lys 15

Glu Asp Glu Tyr Pro

Val Gly Ser Glu Cys

Pro Lys Cys Ser Pro

Gly Tyr Arg Val Lys

Glu Ala Cys Gly Glu 30

Thr Gly Thr Val Cys 35

Glu Pro Cys Pro Pro 40

Gly Thr Tyr Ile Ala 45

Leu Asn Gly Leu Ser 50

Lys Cys Leu Gln Cys 55

Gln Met Cys Asp Pro 60

Met Gly Leu Arg Ala 65

Ser Arg Asn Cys Ser 70

Arg Thr Glu Asn Ala 75

Cys Gly Cys Ser Pro 85

Gly His Phe Cys Ile 90

Val Gln Asp Gly Asp 95

Cys Ala Ala Cys Arg

100

Ala Tyr Ala Thr Ser

105

Ser Pro Gly Gln Arg

110

Gln Lys Gly Gly Thr 115

Glu Ser Gln Asp Thr

120

Leu Cys Gln Asn Cys 125

Pro Gly Thr Phe Ser 130

Pro Asn Gly Thr Leu

135

Glu Glu Cys Gln His 140

Thr Lys Cys Ser Trp 145

Leu Val Thr Lys Ala 150

Gly Ala Gly Thr Ser 155

Ser His Trp Val Trp

165

Trp Phe Leu Ser Gly

170

Ser Leu Val Ile Val

175

Val Cys Ser Thr Val

180

Gly Leu Ile Ile Cys

185

Val Lys Arg Arg Lys

190

Arg Gly Asp Val Val 195

Lys Val Ile Val Ser

200

Val Gln Arg Lys Arg

205

Glu Ala Glu Gly Glu

210

Ala Thr Val Ile Glu

215

Ala Leu Gln Ala Pro

220

Asp Val Thr Thr Val

Ala Val Glu Glu Thr

Ile Pro Ser Phe Thr

Cys

Leu

His

Ala

Val 80

His

Val

Pro

Gln

Ser 160

Ile

Pro

Gln

Pro

Gly

- 360 045238

225

230

235

240

Arg Ser Pro

Asn His

245 <210>291 <211>392 <212> PRT <213> Homo <400>291

Ile Phe Pro 1 sapiens

Val Ile Gly

Arg Gly Ser

Val His Ser

Arg Tyr Ala 65

Leu Ala 5

Arg Leu 20

Glu Val

Tyr Tyr

Asn Arg

Phe Phe

Asp Glu

Val Ile

Lys Gly 55

Thr Ser 70

Ile Tyr

Asp Ile 25

His Trp 40

Ser Asp

Leu Phe

Asn Ala Ser

Leu Phe

Phe Arg

Arg Val

Tyr Thr Cys

Tyr Val 100

Gly Thr

Ala Ile

105

Val Leu Lys

115

Val Gly

Val Phe

Leu Thr 120

Arg Asn Thr

130

Asn Ser

Phe Leu

135

Ile Cys

Arg Pro Ile 145

Ile Thr

Trp Lys 150

Asn Met Glu

Glu Thr

165

Gly Ser

Leu Asn Ile

Thr Gly 180

Ser Asn

Ser Leu Leu

Lys Gln

Thr Trp

Met Asp

Leu Asp

Ser Ser

185

Thr Gly

Val Pro 10

Ile Leu

Lys Tyr

His Leu

Met Asn

Pro Ser

Gln Asp 45

Glu Ser 60

Tyr Asn

Glu Ile

Ser Leu 90

Leu Asp

Gln Val

Pro Val

Ser Val

Asn Thr

155

Ser Phe 170

Tyr Glu

Arg Trp

Ile Thr

Met Lys

125

Leu Ser 140

Pro Ile

Ser Ile

Cys Thr

Thr Met

Glu Gln

Ser Phe 30

Ser Tyr

Gln Asp

Gln Asn

Glu Gly 95

Asn Lys 110

Tyr Glu

Val Tyr

Ser Glu

Asn Ser

175

Ile Glu

190

Lys Asp

Ile

Glu

Lys

Pro

Gly 80

Ile

Val

Lys

Pro

Asn 160

Pro

Asn

Gly

- 361 045238

195

200

205

Leu His Lys Met Gln Ser Glu His Val Ser Leu Ser Cys Gln Pro Val

210 215220

Asn Asp Tyr Phe Ser Pro Asn Gln Asp Phe Lys Val Thr Trp Ser Arg

225 230 235240

Met Lys Ser Gly Thr Phe Ser Val Leu Ala Tyr Tyr Leu Ser Ser Ser

245 250255

Gln Asn Thr Ile Ile Asn Glu Ser Arg Phe Ser Trp Asn Lys Glu Leu

260 265270

Ile Asn Gln Ser Asp Phe Ser Met Asn Leu Met Asp Leu Asn Leu Ser

275 280285

Asp Ser Gly Glu Tyr Leu Cys Asn Ile Ser Ser Asp Glu Tyr Thr Leu

290 295300

Leu Thr Ile His Thr Val His Val Glu Pro Ser Gln Glu Thr Ala Ser

305 310 315320

His Asn Lys Gly Leu Trp Ile Leu Val Pro Ser Ala Ile Leu Ala Ala

325 330335

Phe Leu Leu Ile Trp Ser Val Lys Cys Cys Arg Ala Gln Leu Glu Ala

340 345350

Arg Arg Ser Arg His Pro Ala Asp Gly Ala Gln Gln Glu Arg Cys Cys

355 360365

Val Pro Pro Gly Glu Arg Cys Pro

370 375

Ser Ala Pro Asp Asn Gly Glu Glu 380

Asn Val Pro Leu Ser Gly Lys Val

385 390

<210> <211> <212> <213> <400> Lys Ala 1

292 188 PRT Homo 292 Met

sapiens

Pro

Ala

Val 10

Val

Leu

Ala

Ser

Ser 15

Arg

His

Val 5

Ala

Gln

Gly Ile

Ala

Ser

Phe

Val

Cys

Glu

Tyr

Ala

Ser

Pro

Gly

Lys

Ala

Thr

- 362 045238

Glu Val Arg

Val Thr Val

Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu

45

Val Cys Ala 50

Ala Thr Tyr Met Met

Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp 60

Asp Ser Ile 65

Cys Thr Gly Thr Ser Ser 70

Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr

80

Ile Gln Gly

Leu Arg Ala Met Asp Thr 85

Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val 90 95

Glu Leu Met

Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr

100 105

Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr

110

Gln Ile Tyr

115

Val Ile Asp Pro Glu Pro

120

Cys Pro Asp Ser Asp Phe Leu

125

Leu Trp Ile

130

Leu Ala Ala Val

135

Ser Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe

140

Leu Leu Thr 145

Ala Val Ser Leu

150

Leu Thr Thr

Gly Val Tyr Val

165

Glu Lys Gln

Phe Gln Pro Tyr 180

Ser Lys Met Leu Lys Lys Arg Ser Pro

155 160

Lys Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Cys

170 175

Phe Ile Pro Ile Asn

185 <210>293 <211>497 <212> PRT <213> Homo <400>293

Val Pro Val 1 sapiens

Val Trp Ala

Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys

15

Ser Pro Thr

Val Thr Trp

Gly His Pro

Ile Pro

Gln His

Leu Ala

Leu	Gln	Asp	Leu 25	Ser	Leu	Leu	Arg	Arg 30	Ala	Gly
Gln	Pro	Asp 40	Ser	Gly	Pro	Pro	Ala 45	Ala	Ala	Pro
Pro	Gly	Pro	His	Pro	Ala	Ala	Pro	Ser	Ser	Trp

- 363 045238

Gly 65

Leu

Arg

Ala

Ala 145

Cys

Asn

Leu

Gly

Ile 225

Thr

Pro

Thr

Pro Arg Pro

Arg Arg Tyr 70

Thr Val Leu

Ser Val Gly 75

Pro Gly Gly 80

Arg Ser Gly

Arg Leu Pro 85

Leu Gln Pro

Arg Val Gln

Leu Asp Glu 95

Gly Arg Gln

100

Ala Asp Ala

115

Leu Ser Cys 130

Ser Pro Pro

Ser Phe Ser

Arg Gly Gln

180

Ala Glu Ser

195

Pro Trp Gly 210

Met Tyr Asn

Val Tyr Ala

Ala Gly Val

260

Gly Gly Gly

275

Leu Arg Leu 290

Arg Gly Asp

Phe Ser Leu

105

Trp Leu Arg

Pro Ala Arg 110

Gly Glu Tyr

Arg Leu Arg

135

Gly Ser Leu

150

Arg Pro Asp 165

Gly Arg Val

Phe Leu Phe

Cys Ile Leu

215

Leu Thr Val

230

Gly Ala Gly 245

Gly Thr Arg

Pro Asp Leu

Glu Asp Val

295

Arg Ala Ala 120

Val His Leu

125

Arg Asp Arg

Leu Arg Leu

Gly Gln Ala

140

Ser Met Thr

Arg Ala Ser

Asp Trp Val 155

Ile Leu Asn

160

Arg Pro Ala

170

Pro Val Arg

185

Leu Pro Gln 200

Thr Tyr Arg

Leu Gly Leu

Ser Arg Val

250

Ser Phe Leu

265

Leu Val Thr 280

Ser Gln Ala

Ser Val His

Trp Phe Arg

175

Glu Ser Pro

His His His 190

Val Ser Pro

205

Asp Gly Phe

220

Glu Pro Pro 235

Gly Leu Pro

Thr Ala Lys

Gly Asp Asn

285

Gln Ala Gly

300

Met Asp Ser

Asn Val Ser

Thr Pro Leu

240

Cys Arg Leu

255

Trp Thr Pro 270

Gly Asp Phe

Thr Tyr Thr

- 364 045238

Cys His Ile 305

His Leu

Ala Ile Ile

Thr Val

325

Gly Lys Leu

Leu Cys 340

Val Trp Ser

355

Ser Leu

Gln Glu 310

Thr Pro

Glu Val

Asp Thr

Gln Gln

Lys Ser

Thr Pro

345

Pro Ser 360

Leu Asn

315

Phe Gly 330

Val Ser

Gln Arg

Ala Thr

Ser Pro

Gly Gln

Ser Phe

365

Val Thr

Gly Ser

335

Glu Arg 350

Ser Gly

Trp Leu Glu

370

Ala Gln

Glu Ala

375

Gln Leu

Leu Ser

Gln Pro 380

Trp Gln

Gln Leu Tyr 385

Gln Gly

Glu Arg 390

Leu Leu

Gly Ala

395

Ala Val

Tyr Phe

Glu Leu Ser

Ser Pro

405

Gly Ala

Gln Arg

Ser Gly 410

Arg Ala

Pro Gly

415

Leu Pro Ala

Gly His 420

Leu Leu

Leu Phe

425

Leu Ile

Leu Gly

Val Leu 430

Leu Leu Leu

435

Leu Val

Thr Gly

Ala Phe 440

Gly Phe

His Leu

445

Trp Arg

Gln Trp Arg

450

Pro Arg

Arg Phe

455

Ser Ala

Leu Glu

Gln Gly 460

Ile His

Pro Gln Ala 465

Gln Ser

Lys Ile 470

Glu Glu

Leu Glu

475

Gln Glu

Pro Glu

Glu Pro Glu

Pro Glu

485

Pro Glu

Pro Glu 490

Pro Glu

495

Leu 320

Leu

Phe

Pro

Cys

Thr 400

Ala

Ser

Arg

Pro

Pro 480

Gln

Leu <210>294 <211>259 <212> PRT <213> Homo <400>294

Lys Glu Ser 1 sapiens

Cys Asp Val Gln Leu Tyr 5

Ile Lys Arg Gln Ser Glu

15

His

- 365 045238

Ser

Cys

Ile 65

Gly

His

Pro

Leu

Phe 145

Thr

Gln

Thr

Gly

Ile 225

Leu

Val

Ile Leu

Ala Asn

Val Lys 50

Ser Phe

Ser Tyr

Ser Thr

Ser Lys

115

Pro Leu 130

Cys Cys

Ala Gly

Thr Glu

Gly Ile

195

Ser Glu 210

Val Tyr

Ala Arg

Arg Ser

Ala Gly 20

Arg Pro

Leu Glu

Phe Ile

Arg Cys 85

Thr Leu 100

Asp Glu

Gly Gly

Leu Arg

Arg Glu

165

Ala Ser 180

Tyr Asp

Val Tyr

Ala Ser

Asn Val

245

Asp Pro

His Val

Asp Arg 55

Leu His 70

Ser Ala

Tyr Val

Met Ala

Leu Pro

135

Arg His 150

Ile Asn

Thr Arg

Asn Asp

Ser Asn

215

Leu Asn

230

Lys Glu

Phe Glu 25

Thr Trp 40

Gln Thr

Phe Glu

Asn Phe

Thr Asp

105

Ser Arg 120

Leu Leu

Gln Gly

Leu Val

Gln Asn

185

Pro Asp 200

Pro Cys

His Ser

Ala Pro

Leu Glu

Cys Lys

Ser Trp

Pro Val

Gln Ser 90

Val Lys

Pro Trp

Ile Thr

Lys Gln

155

Asp Ala 170

Ser Gln

Leu Cys

Leu Glu

Val Ile

235

Thr Glu

250

Cys Pro

Leu Asn

Lys Glu 60

Leu Pro

Asn Leu

Ser Ala

Leu Leu

125

Thr Cys 140

Asn Glu

His Leu

Val Leu

Phe Arg

205

Glu Asn

220

Gly Pro

Tyr Ala

Val Lys 30

Gly Thr

Glu Lys

Asn Asp

Ile Glu

Ser Glu 110

Tyr Arg

Phe Cys

Leu Ser

Lys Ser

175

Leu Ser 190

Met Gln

Lys Pro

Asn Ser

Ser Ile

255

Tyr

Thr

Asn

Asn 80

Ser

Arg

Leu

Asp 160

Glu

Gly

Arg 240

Cys

- 366 045238 <210>295 < 211>133 < 212> PRT < 213> Homo sapiens < 400>295

Ile Asn Ile Thr Ser Ser Ala Ser Gln 15

Ile Cys Thr Val Trp His Lys Lys Glu 20 25

Phe Leu Cys Lys Asp Arg Ser Gly Asp

40

Lys Gln Leu Arg Leu Lys Arg Asp Pro

55

Ile Ser Ser Gln Leu Met Phe Thr Ile 65 70

Ser Gly Thr Tyr Gln Cys Cys Ala Arg 85

Leu Gln Gly His Phe Phe Ser Ile Leu

100 105

Thr Val Thr Gly Leu Lys Gln Arg Gln

115 120

Glu Gly Thr Leu Ser 130 <210>296 <211>492 < 212> PRT < 213> Homo sapiens < 400>296

Gln Leu Thr Thr Glu Ser Met Pro Phe 15

Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro

25

Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly

40

Gly Thr Arg Leu Asn Leu

Ala Glu Gly Phe Val Val 30

Ser Pro Glu Thr Ser Leu

Ile Asp Gly Val Gly Glu 60

Gln Val Thr Pro Leu His

80

Gln Lys Ser Gly Ile Arg 95

Thr Glu Thr Gly Asn Tyr

110

Leu Glu Phe Ser His Asn

125

Val Ala Glu Gly Lys Glu

Gln Leu Phe Gly Tyr Ser 30

Arg Gln Ile Val Gly Tyr 45

- 367 045238

Ala Ile Gly Thr Gln 50

Gln Ala Thr Pro Gly 55

Pro Ala Asn Ser Gly 60

Glu Thr Ile Tyr Pro 65

Asn Ala Ser Leu Leu 70

Ile Gln Asn Val Thr 75

Asn Asp Thr Gly Phe 85

Tyr Thr Leu Gln Val 90

Ile Lys Ser Asp Leu 95

Asn Glu Glu Ala Thr

100

Gly Gln Phe His Val

105

Tyr Pro Glu Leu Pro

110

Pro Ser Ile Ser Ser

115

Asn Asn Ser Asn Pro

120

Val Glu Asp Lys Asp

125

Val Ala Phe Thr Cys

130

Glu Pro Glu Thr Gln

135

Asp Thr Thr Tyr Leu 140

Trp Ile Asn Asn Gln 145

Ser Leu Pro Val Ser 150

Pro Arg Leu Gln Leu 155

Asn Gly Asn Arg Thr

165

Leu Thr Leu Leu Ser

170

Val Thr Arg Asn Asp

175

Gly Pro Tyr Glu Cys

180

Glu Ile Gln Asn Pro

185

Val Ser Ala Asn Arg

190

Asp Pro Val Thr Leu 195

Asn Val Thr Tyr Gly

200

Pro Asp Thr Pro Thr

205

Ser Pro Ser Asp Thr

210

Tyr Tyr Arg Pro Gly

215

Ala Asn Leu Ser Leu

220

Cys Tyr Ala Ala Ser 225

Asn Pro Pro Ala Gln 230

Tyr Ser Trp Leu Ile 235

Gly Thr Phe Gln Gln

245

Ser Thr Gln Glu Leu

250

Phe Ile Pro Asn Ile

255

Val Asn Asn Ser Gly

260

Ser Tyr Thr Cys His

265

Ala Asn Asn Ser Val

270

Gly Cys Asn Arg Thr

275

Thr Val Lys Thr Ile 280

Ile Val Thr Glu Leu

285

Pro Val Val Ala Lys 290

Pro Gln Ile Lys Ala

295

Ser Lys Thr Thr Val

300

Arg

Gln 80

Val

Lys

Ala

Trp

Ser 160

Thr

Ser

Ile

Ser

Asn 240

Thr

Ser

Thr

- 368 045238

Gly Asp Lys 305

Asp Ser Val

310

Ile Ser Ile

Arg Trp Phe

325

Arg Met Lys

Leu Ser Gln 340

Lys Arg Glu

355

Asp Ala Gly

Ser Lys Asn

370

Gln Ser Asp

Leu Pro Gln 385

Glu Asn Gly

390

Ile Gly Val

Val Ala Leu

405

Phe Leu His

Phe Gly Lys 420

Thr Glu His

435

Lys Pro Ser

Asp Pro Pro

450

Asn Lys Met

Glu Ala Gln 465

Gln Pro Thr

470

Ala Thr Glu

Ile Ile Tyr

485

Asn Leu Thr

Phe Lys Asn

Gly Asn Thr 345

Thr Tyr Trp 360

Pro Ile Met 375

Leu Ser Pro

Val Ala Leu

Thr Gly Arg 425

Val Ser Asn 440

Asn Glu Val 455

Gln Pro Thr

Ser Glu Val

Cys Ser Thr

315

Gln Ser Leu 330

Thr Leu Ser

Cys Glu Val

Leu Asn Val

380

Gly Ala Ile

395

Ile Ala Val 410

Ala Ser Asp

His Thr Gln

Thr Tyr Ser

460

Ser Ala Ser

475

Lys Lys Gln 490

Asn Asp Thr

Pro Ser Ser

335

Ile Asn Pro

350

Phe Asn Pro 365

Asn Tyr Asn

Ala Gly Ile

Ala Leu Ala

415

Gln Arg Asp

430

Asp His Ser 445

Thr Leu Asn

Pro Ser Leu

Gly 320

Glu

Val

Ile

Ala

Val 400

Cys

Leu

Asn

Phe

Thr 480 <210>297 <211>266 <212> PRT <213> Homo <400>297

Gln Glu Glu 1 sapiens

Asp Leu Pro Arg Pro 5

Ser Ile Ser Ala Glu Pro Gly

15

Val Ile Pro

Leu Gly Ser His Val 20

Thr Phe Val Cys Arg Gly Pro

30

Thr

Val

- 369 045238

Gly

Asp

Phe 65

Ile

Leu

Pro

Asn

Ile 145

Val

Arg

Val

Pro

Ser 225

Arg

Ser

Val Gln Thr Phe Arg 35

Thr Glu Asp Val Ser 50

Arg Ile Asp Ser Val 70

Tyr Tyr Lys Pro Pro

Leu Val Lys Glu Thr

100

Gly Ser Ser Ala Gly 115

Glu His Ala Pro Ala 130

Leu Ile Gly Val Ser

150

Leu Phe Cys Leu His

165

Ser Lys Asp Glu Glu 180

Asp Val Leu Glu Arg 195

Glu Lys Asp Arg Glu 210

Gln Glu Val Thr Tyr

230

Thr Ala Arg Ala Val

245

Ile Thr Tyr Ala Ala

260 <210> 298 <211> 390

Leu Glu Arg Glu Ser 40

Gln Ala Ser Pro Ser 55

Ser Glu Gly Asn Ala

Lys Trp Ser Glu Gln 90

Ser Gly Gly Pro Asp

105

Pro Thr Gln Arg Pro 120

Ser Gln Gly Leu Lys 135

Val Val Phe Leu Phe

155

Arg Gln Asn Gln Ile

170

Gln Lys Pro Gln Gln 185

Thr Ala Asp Lys Ala

200

Thr Asp Thr Ser Ala 215

Ala Gln Leu Asp His

235

Ser Pro Gln Ser Thr

250

Val Ala Arg His

265

Arg Ser Thr Tyr Asn 45

Glu Ser Glu Ala Arg 60

Gly Pro Tyr Arg Cys 80

Ser Asp Tyr Leu Glu 95

Ser Pro Asp Thr Glu 110

Ser Asp Asn Ser His

125

Ala Glu His Leu Tyr 140

Cys Leu Leu Leu Leu

160

Lys Gln Gly Pro Pro

175

Arg Pro Asp Leu Ala 190

Thr Val Asn Gly Leu

205

Leu Ala Ala Gly Ser 220

Trp Ala Leu Thr Gln

240

Lys Pro Met Ala Glu

255

- 370 045238 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 298

Met Pro Pro Ser Gly 1 5

Leu Arg Leu Leu Leu

Leu Leu Leu Pro Leu 15

Trp Leu Leu Val Leu

Thr Pro Gly Arg Pro

Ala Ala Gly Leu Ser

Cys Lys Thr Ile Asp 35

Met Glu Leu Val Lys 40

Arg Lys Arg Ile Glu 45

Ile Arg Gly Gln Ile 50

Leu Ser Lys Leu Arg 55

Leu Ala Ser Pro Pro 60

Gln Gly Glu Val Pro 65

Pro Gly Pro Leu Pro 70

Glu Ala Val Leu Ala 75

Tyr Asn Ser Thr Arg 85

Asp Arg Val Ala Gly 90

Glu Ser Ala Glu Pro

Pro Glu Pro Glu Ala

100

Asp Tyr Tyr Ala Lys

105

Glu Val Thr Arg Val

110

Met Val Glu Thr His

115

Asn Glu Ile Tyr Asp 120

Lys Phe Lys Gln Ser 125

His Ser Ile Tyr Met 130

Phe Phe Asn Thr Ser

135

Glu Leu Arg Glu Ala 140

Pro Glu Pro Val Leu 145

Leu Ser Arg Ala Glu 150

Leu Arg Leu Leu Arg 155

Lys Leu Lys Val Glu

165

Gln His Val Glu Leu

170

Tyr Gln Lys Tyr Ser

175

Asn Ser Trp Arg Tyr

180

Leu Ser Asn Arg Leu

185

Leu Ala Pro Ser Asp

190

Pro Glu Trp Leu Ser 195

Phe Asp Val Thr Gly 200

Val Val Arg Gln Trp

205

Ser Arg Gly Gly Glu

210

Ile Glu Gly Phe Arg

215

Leu Ser Ala His Cys

220

Cys Asp Ser Arg Asp 225

Asn Thr Leu Gln Val 230

Asp Ile Asn Gly Phe 235

Leu

Thr

Ala

Ser

Leu 80

Glu

Leu

Thr

Val

Leu 160

Asn

Ser

Leu

Ser

Thr 240

- 371 045238

Thr Gly Arg

Arg Gly Asp Leu Ala Thr

245

Ile His Gly Met Asn Arg

250 255

Phe Leu Leu

Leu Met Ala Thr Pro Leu

260 265

Glu Arg Ala Gln His Leu

270

Ser Ser Arg

275

His Arg Arg Ala Leu Asp

280

Thr Asn Tyr Cys Phe Ser

285

Thr Glu Lys

290

Asn Cys Cys Val Arg Gln

295

Leu Tyr Ile Asp Phe Arg

300

Asp Leu Gly 305

Trp Lys Trp Ile His Glu 310

Pro Lys Gly Tyr His Ala

315

Phe Cys Leu

Gly Pro Cys Pro Tyr Ile

325

Trp Ser Leu Asp Thr Gln

330 335

Ser Lys Val

Leu Ala Leu Tyr Asn Gln

340 345

His Asn Pro Gly Ala Ser

350

Ala Pro Cys

355

Cys Val Pro Gln Ala Leu

360

Glu Pro Leu Pro Ile Val

365

Tyr Val Gly

370

Arg Lys Pro Lys Val Glu

375

Gln Leu Ser Asn Met Ile

380

Pro

Gln

Ser

Lys

Asn 320

Tyr

Ala

Tyr

Val

Arg Ser Cys 385

Lys Cys Ser

390 <210>299 <211>160 <212> PRT <213> Homo <400>299

Ser Pro Gly 1 sapiens

Gln

Gly 5

Thr

Gln

Ser

Glu

Asn

Ser

Cys

Thr

His

Phe 15

Gly Asn Leu

Pro 20

Asn

Met

Leu

Arg

Asp 25

Leu

Arg

Asp

Ala

Phe 30

Ser

Val Lys Thr

Phe

Gln

Met

Lys 40

Asp

Gln

Leu

Asp

Asn 45

Leu

Lys Glu Ser 50

Leu

Glu

Asp 55

Phe

Lys

Gly

Tyr

Leu 60

Gly

Cys

Gln

Pro

Arg

Leu

Ala

- 372 045238

Leu Ser Glu Met Ile 65

Gln Phe Tyr Leu Glu 70

Glu Val Met Pro Gln 75

Glu Asn Gln Asp Pro 85

Asp Ile Lys Ala His 90

Val Asn Ser Leu Gly 95

Asn Leu Lys Thr Leu

100

Arg Leu Arg Leu Arg

105

Arg Cys His Arg Phe

110

Pro Cys Glu Asn Lys 115

Ser Lys Ala Val Glu

120

Gln Val Lys Asn Ala

125

Asn Lys Leu Gln Glu 130

Lys Gly Ile Tyr Lys

135

Ala Met Ser Glu Phe

140

Ile Phe Ile Asn Tyr 145

Ile Glu Ala Tyr Met 150

Thr Met Lys Ile Arg 155 <210>

<211>

<212>

<213>

300 564 PRT Homo sapiens <400>

300

Val 1

Trp

Glu

Lys

Thr 5

Val

Asn

Thr

Glu

Glu 10

Asn

Val

Tyr

Ala

Thr 15

Gly

Ser

Asp

Val 20

Asn

Leu

Thr

Cys

Gln 25

Thr

Gln

Thr

Val

Gly 30

Phe

Val

Gln

Met 35

Gln

Trp

Ser

Lys

Val 40

Thr

Asn

Lys

Ile

Asp 45

Leu

Ile

Val

Tyr 50

His

Pro

Gln

Tyr

Gly 55

Phe

Tyr

Cys

Ala

Tyr 60

Gly

Arg

Pro

Glu 65

Ser

Leu

Val

Thr

Phe 70

Thr

Glu

Thr

Pro

Glu 75

Asn

Gly

Ser

Lys

Thr

Leu

His

Leu

Arg 85

Asn

Met

Ser

Cys

Ser 90

Val

Ser

Gly

Arg

Tyr 95

Cys

Met

Leu

Val

100

Leu

Tyr

Pro

Glu

Gly 105

Ile

Gln

Thr

Lys

Ile

110

Tyr

Leu

Ile

115

Gln

Thr

His

Val

Thr

120

Ala

Asp

Glu

Trp

Asn

125

Ser

Asn

Ala 80

Glu

Leu

Phe

Asp

Asn 160

Leu

Phe

Ala

Cys

Trp 80

Glu

Asn

His

- 373 045238

Thr

Asn 145

Glu

Ser

Arg

Ser 225

Thr

Asn

Leu

Gly 305

Ser

Leu

Ile

Ser

Ile Glu 130

Ser Ser

Asn Ser

Asp Asn

Asn Ser 195

Leu His 210

Cys His

Val Lys

Ser Thr

Val Phe

275

His Asp 290

Lys Asp

Asn Lys

Ser Pro

Thr Phe

355

Val Thr

Ile Glu

Ser Lys

Ser Thr

165

Gly Thr 180

Thr Leu

Leu Ser

Ile Arg

Val Phe

245

Asp Val 260

Pro Lys

Glu Lys

Gly Phe

Pro Ala

325

Val Pro 340

Leu Leu

Ile Asn

135

Ile Ser

150

Asp Ser

Gln Glu

Leu Lys

Pro Val

215

Val Gly 230

Ala Lys

Leu Val

Ala Asn

Glu Gly

295

Leu Glu 310

Gln Ser

Gly Asn

Gly Ser

Gln Thr

Ser Glu

Trp Val

Thr Leu

185

Asp Arg 200

Gln Ile

Pro Asn

Pro Glu

Glu Arg

265

Ile Thr

280

Ile Tyr

Leu Lys

Asp Asn

Lys Val

345

Glu Ile 360

Leu Glu

Phe Thr

155

Leu Leu 170

Ile Ser

Val Lys

Phe Asp

Lys Ile

235

Ile Pro

250

Arg Phe

Trp Phe

Ile Thr

Ser Val

315

Leu Thr 330

Trp Asn

Ser Ser

Ile Pro 140

Tyr Ala

Ser Lys

Gln Asn

Leu Gly

205

Asp Gly 220

Leu Arg

Val Ile

Thr Cys

Ile Asp

285

Asn Glu 300

Leu Thr

Ile Trp

Ile Ser

Thr Asp

365

Ser Pro

Cys Phe

Trp Ser

Gly Ile

175

His Leu 190

Thr Asp

Arg Lys

Ser Ser

Val Glu

255

Leu Leu

270

Gly Ser

Glu Arg

Arg Val

Cys Met

335

Ser Glu

350

Pro Pro

Gln

Val 160

Lys

Ile

Tyr

Phe

Thr 240

Asn

Lys

Phe

Lys

His 320

Ala

Lys

Leu

Ser

Glu Ser

Thr Leu

Asp Thr

Gln Pro

Ala Ser

- 374 045238

370

375

380

Val Ser Pro Ala Arg 385

Tyr Pro Ala Thr Ser 390

Ser Val Thr Leu Val 395

Val Ser Ala Leu Arg

405

Pro Asn Thr Thr Pro

410

Gln Pro Ser Asn Ser

415

Met Thr Thr Arg Gly

420

Phe Asn Tyr Pro Trp

425

Thr Ser Ser Gly Thr

430

Thr Lys Lys Ser Val

435

Ser Arg Ile Pro Ser 440

Glu Thr Tyr Ser Ser 445

Pro Ser Gly Ala Gly

450

Ser Thr Leu His Asp 455

Asn Val Phe Thr Ser

460

Ala Arg Ala Phe Ser 465

Glu Val Pro Thr Thr 470

Ala Asn Gly Ser Thr 475

Thr Asn His Val His

485

Ile Thr Gly Ile Val

490

Val Asn Lys Pro Lys

495

Gly Met Ser Trp Pro

500

Val Ile Val Ala Ala

505

Leu Leu Phe Cys Cys

510

Ile Leu Phe Gly Leu 515

Gly Val Arg Lys Trp

520

Cys Gln Tyr Gln Lys

525

Ile Met Glu Arg Pro

530

Pro Pro Phe Lys Pro

535

Pro Pro Pro Pro Ile

540

Tyr Thr Cys Ile Gln 545

Glu Pro Asn Glu Ser 550

Asp Leu Pro Tyr His 555

Asp 400

Ser

Asp

Ser

Thr

Lys 480

Asp

Met

Glu

Lys

Glu 560

Met Glu Thr Leu <210>301 <211>223 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>301

Met Met Thr Gly Thr

Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu

15

Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His

Leu Ser Ser Thr Thr Ala

Lys

Gln

- 375 045238

Val Thr Gln Val Asn

Trp Glu Gln Gln Asp 40

Gln Leu Leu Ala Ile

Asn Ala Asp Leu Gly 50

Trp His Ile Ser Pro 55

Ser Phe Lys Asp Arg 60

Ala Pro Gly Pro Gly 65

Leu Gly Leu Thr Leu 70

Gln Ser Leu Thr Val 75

Asp Thr Gly Glu Tyr 85

Phe Cys Ile Tyr His 90

Thr Tyr Pro Asp Gly 95

Tyr Thr Gly Arg Ile

100

Phe Leu Glu Val Leu

105

Glu Ser Ser Val Ala

110

His Gly Ala Arg Phe 115

Gln Ile Pro Leu Leu

120

Gly Ala Met Ala Ala

125

Leu Val Val Ile Cys 130

Thr Ala Val Ile Val

135

Val Val Ala Leu Thr

140

Lys Lys Lys Ala Leu 145

Arg Ile His Ser Val 150

Glu Gly Asp Leu Arg 155

Lys Ser Ala Gly Gln

165

Glu Glu Trp Ser Pro

170

Ser Ala Pro Ser Pro

175

Gly Ser Cys Val Gln

180

Ala Glu Ala Ala Pro

185

Ala Gly Leu Cys Gly

190

Gln Arg Gly Glu Asp 195

Cys Ala Glu Leu His

200

Asp Tyr Phe Asn Val 205

Cys

Val

Asn 80

Thr

Glu

Thr

Arg

Arg 160

Pro

Glu

Leu

Ser Tyr Arg Ser Leu

210

Gly Asn Cys Ser Phe

215

Phe Thr Glu Thr Gly

220 <210>302 <211>233 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>302

Met Asp Asn Gln Gly Val 1 5

Ile Tyr Ser Asp Leu Asn Leu Pro Pro 10 15

Pro Lys Arg Gln Gln Arg Lys Pro Lys

Gly Asn Lys Asn Ser Ile

Asn

Leu

- 376 045238

Ala Thr Glu

Gln

Glu

Ile

Thr

Tyr 40

Ala

Glu

Leu

Asn

Leu 45

Gln

Lys

Ala

Ser Gln Asp 50

Phe

Gln

Gly

Asn 55

Asp

Lys

Thr

Tyr

His 60

Cys

Lys

Asp

Leu

Pro Ser Ala 65

Pro

Glu

Lys 70

Leu

Ile

Val

Gly

Ile 75

Leu

Gly

Ile

Cys 80

Leu Ile Leu

Met

Ala 85

Ser

Val

Thr

Ile 90

Val

Ile

Pro

Ser 95

Thr

Leu Ile Gln

Arg

100

His

Asn

Ser

105

Leu

Asn

Thr

Arg

Thr

110

Gln

Lys

Ala Arg His

115

Cys

Gly

His

Cys

Pro

120

Glu

Trp

Ile

Thr

125

Tyr

Ser

Asn

Ser Cys Tyr 130

Tyr

Ile

Gly

Lys 135

Glu

Arg

Thr

Trp 140

Glu

Ser

Leu

Leu Ala Cys 145

Thr

Ser

Lys 150

Asn

Ser

Leu

155

Ser

Ile

Asp

Asn

Glu

160

Glu Glu Met

Lys

Phe

165

Leu

Ser

Ile

Ser

170

Pro

Ser

Trp

Ile

175

Gly

Val Phe Arg

Asn

180

Ser

His

Pro

185

Trp

Val

Thr

Met

Asn

190

Gly

Leu

Ala Phe Lys

195

His

Glu

Ile

Lys

Asp 200

Ser

Asp

Asn

Ala

Glu

205

Leu

Asn

Cys

Ala Val Leu

210

Gln

Val

Asn

Arg

215

Leu

Lys

Ser

Ala

Gln

220

Cys

Gly

Ser

Ile Ile Tyr 225

His

Cys

Lys 230

His

Lys

Leu <210>303 <211>507 <212> PRT <213> Homo <400>303

Gln Asp Val sapiens

Arg Val

Gln

Val

Leu

Pro

Glu

Val

Arg

Gly

Gln

Leu

Gly

- 377 045238

Gly

Tyr

Gln

Pro 65

Thr

His

Thr

Ala

Asp 145

Ala

Gln

Thr

Val

Ser 225

Trp

Thr Val Glu Leu Pro

Ile Ser Leu Val Thr

Asn Val Ala Ala Phe 50

Lys Pro Gly Ser Glu 70

Gly Gln Asp Thr Glu 85

Gly Leu Thr Val Glu 100

Phe Pro Lys Gly Ser 115

Lys Pro Lys Asn Gln 130

Pro Thr Thr Val Ala

150

Arg Ile Ser Trp Leu

165

Val Ser Gly Thr Leu 180

Leu Val Pro Ser Gly

195

Glu His Glu Ser Phe 210

Val Arg Tyr Pro Pro

230

Tyr Leu Gly Arg Thr

245

Cys His Leu Leu Pro 25

Trp Gln Arg Pro Asp 40

His Pro Lys Met Gly 55

Arg Leu Ser Phe Val

Ala Glu Leu Gln Asp

Asp Glu Gly Asn Tyr 105

Val Arg Gly Met Thr

120

Ala Glu Ala Gln Lys 135

Leu Cys Ile Ser Lys

155

Ser Ser Leu Asp Trp

170

Ala Gly Thr Val Thr 185

Arg Ala Asp Gly Val 200

Glu Glu Pro Ala Leu 215

Glu Val Ser Ile Ser

235

Asp Ala Thr Leu Ser

250

Pro Val Pro Gly Leu 30

Ala Pro Ala Asn His 45

Pro Ser Phe Pro Ser 60

Ser Ala Lys Gln Ser 80

Ala Thr Leu Ala Leu

Thr Cys Glu Phe Ala

110

Trp Leu Arg Val Ile

125

Val Thr Phe Ser Gln 140

Glu Gly Arg Pro Pro

160

Glu Ala Lys Glu Thr

175

Val Thr Ser Arg Phe

190

Thr Val Thr Cys Lys

205

Ile Pro Val Thr Leu 220

Gly Tyr Asp Asp Asn

240

Cys Asp Val Arg Ser

255

- 378 045238

Asn

Pro

Asp

Gly 305

Thr

Ala

Gln

Leu

Glu 385

His

Glu

Ser

Val

Asp 465

Ile

Lys

Pro Glu

Thr Ser

275

Ser Leu 290

Met Gly

Ala Gly

Ile Ile

Gln Arg

355

Glu Gly 370

Ala Gln

Ser Pro

Gln Glu

Gly Pro

435

Pro Pro 450

Glu Glu

Tyr Asp

Gly Phe

Pro Thr 260

Ala Val

Phe Asn

Arg Ala

Ala Gly

325

Ala Thr 340

Lys Glu

Pro Pro

Glu Met

Leu Lys

405

Met Pro 420

Leu His

Gly Pro

Gly Glu

Ala Leu

485

Val Met 500

Gly Tyr

Ala Gln

Thr Thr

295

Glu Gln 310

Ala Thr

Ala Val

Gln Thr

Ser Tyr

375

Pro Ser 390

Thr Pro

Arg Tyr

Pro Gly

Pro Ala

455

Glu Glu 470

Ser Tyr

Ser Arg

Asp Trp

265

Gly Ser 280

Phe Val

Val Ile

Gly Gly

Ala Ala

345

Leu Gln 360

Lys Pro

Gln Leu

Tyr Phe

His Glu

425

Ala Thr 440

Val Glu

Glu Glu

Ser Ser

Ala Met

505

Ser Thr

Gln Leu

Cys Thr

Phe Val

315

Ile Ile

330

Thr Gly

Gly Ala

Pro Thr

Phe Thr

395

Asp Ala 410

Leu Pro

Ser Leu

Asp Val

Tyr Leu

475

Pro Ser 490

Tyr Val

Thr Ser

Val Ile

285

Val Thr 300

Arg Glu

Gly Gly

Ile Leu

Glu Glu

365

Pro Lys 380

Leu Gly

Gly Ala

Thr Leu

Gly Ser

445

Ser Leu

460

Asp Lys

Asp Ser

Gly Thr 270

His Ala

Asn Ala

Thr Pro

Ile Ile

335

Ile Cys 350

Asp Glu

Ala Lys

Ala Ser

Ser Cys

415

Glu Glu 430

Pro Ile

Asp Leu

Ile Asn

Tyr Gln

495

Phe

Val

Asn 320

Ala

Arg

Asp

Leu

Glu 400

Thr

Arg

Pro

Glu

Pro 480

Gly

- 379 045238 <210>304 <211>305 <212> PRT <213> Homo <400>304

Gln Leu Leu 1 sapiens

Asp Thr Val

Thr Thr Glu

Thr Phe Asp 50

Ser Ala Lys 65

Phe Asn 5

Val Ile 20

Val Tyr

Gly Ala

Ile Glu

Lys Thr

Lys Ser

Pro Cys

Phe Val

Val Lys

Leu Asn

Val Ser 70

Lys Met Asp

Lys Ser 85

Asp Ala

Glu Val Thr

Glu Leu 100

Thr Arg

Trp Lys 40

Lys Ser

Gln Leu

Val Ser

Glu Gly

105

Tyr Arg Val

115

Val Ser

Trp Phe

Ser Pro 120

Ile Phe Pro

130

Ile Phe

Ala Ile

135

Leu Leu

Lys Thr Leu 145

Lys Tyr

Arg Ser 150

Gly Gly

Leu Leu Val

Ala Gly

165

Leu Val

Ile Thr

Ile Leu Phe

Val Pro 180

Gly Glu

Tyr Ser

185

Gly Leu Ile

195

Val Thr

Ser Thr

Gly Ile 200

Val Phe Ser

210

Thr Ala

Ile Gly

215

Leu Thr

Val Glu 10

Thr Asn

Phe Lys

Thr Val

Phe Thr

Met Glu

Gly Arg 45

Pro Thr 60

Phe Cys 15

Ala Gln 30

Asp Ile

Asp Phe

Leu Lys 75

Gly Asp

Ala Ser

His Thr 90

Glu Thr

Asn Glu

Phe Trp

Met Asp

155

Val Ile 170

Leu Lys

Leu Ile

Ser Phe

Gly Asn

Tyr Thr

Ile Ile

Glu Leu 110

Asn Ile

125

Gly Gln 140

Glu Lys

Val Ile

Asn Ala

Leu Leu

205

Val Ile 220

Leu Ile

Phe Gly

Thr Ile

Val Gly

175

Thr Gly 190

His Tyr

Ala Ile

Asn

Tyr

Ser

Leu 80

Cys

Lys

Val

Ile

Ala 160

Ala

Leu

Tyr

Leu

- 380 045238

Val Ile Gln 225

Val

Ile

Ala

230

Tyr

Ile

Leu

Ala

Val

235

Val

Gly

Leu

Ser

Cys Ile Ala

Ala

Cys 245

Ile

Pro

Met

His

Gly 250

Pro

Leu

Ile

Ser

255

Leu Ser Ile

Leu

260

Ala

Leu

Ala

Gln

Leu

265

Leu

Gly

Leu

Val

Tyr 270

Met

Phe Val Ala

275

Ser

Asn

Gln

Lys

Thr

280

Ile

Gln

Pro

Arg 285

Lys

Ala

Glu Glu Pro

290

Leu

Asn

Ala

Phe

295

Lys

Glu

Ser

Lys

Gly 300

Met

Asn

Leu 240

Gly

Lys

Val

Asp

Glu

305 <210>305 <211>474 <212> PRT <213> Homo <400>305

Glu Glu Glu 1 sapiens

Leu

Gln 5

Val

Ile

Gln

Pro

Asp 10

Lys

Ser

Val

Leu

Val 15

Ala Gly Glu

Thr 20

Ala

Thr

Leu

Arg

Cys 25

Thr

Ala

Thr

Ser

Leu 30

Ile

Val Gly Pro

Ile

Gln

Trp

Phe

Arg 40

Gly

Ala

Gly

Pro

Gly 45

Arg

Glu

Ile Tyr Asn 50

Gln

Lys

Glu

Gly 55

His

Phe

Pro

Arg

Val 60

Thr

Val

Asp Leu Thr 65

Lys

Arg

Asn 70

Asn

Met

Asp

Phe

Ser 75

Ile

Arg

Ile

Gly

Ile Thr Pro

Ala

Asp 85

Ala

Gly

Thr

Tyr

Tyr 90

Cys

Val

Lys

Phe

Arg 95

Gly Ser Pro

Asp

100

Asp

Val

Glu

Phe

Lys 105

Ser

Gly

Ala

Gly

Thr

110

Glu

Ser Val Arg

115

Ala

Lys

Pro

Ser

Ala

120

Pro

Val

Ser

Gly 125

Pro

Ala

Pro

Leu

Ser

Asn 80

Lys

Leu

Ala

- 381 045238

Arg

Phe 145

Leu

Tyr

His

Pro

Thr 225

Val

Trp

Thr

Asn

His 305

Ala

Ser

Leu

Lys

Ala Thr 130

Ser Pro

Ser Asp

Ser Ile

Pro Gln

Arg Asp

Phe Gln

165

His Ser 180

Ser Gln

195

Leu Arg 210

Leu Glu

Thr Cys

Leu Glu

Glu Asn

275

Val Ser 290

Asp Gly

His Pro

Asn Glu

Val Ala

355

Lys Ala 370

Val Ile

Gly Thr

Val Thr

Gln Val

245

Asn Gly 260

Lys Asp

Ala His

Gln Pro

Lys Glu

325

Arg Asn 340

Leu Leu

Gln Gly

His Thr

135

Val Ser

Phe Thr

Ile Thr

150

Leu Lys

Trp Phe

155

Thr Asn

Thr Ala

Cys Glu

Ala Asn

215

Gln Gln

230

Arg Lys

Asn Val

Gly Thr

Arg Asp

295

Ala Val 310

Gln Gly

Ile Tyr

Met Ala

Ser Thr

375

Val Asp

Pro Val 170

Lys Val

185

Val Ala 200

Leu Ser

Pro Val

Phe Tyr

Ser Arg

265

Tyr Asn 280

Asp Val

Ser Lys

Ser Asn

Ile Val

345

Ala Leu 360

Ser Ser

Val Leu

His Val

Glu Thr

Arg Ala

235

Pro Gln 250

Thr Glu

Trp Met

Lys Leu

Ser His

315

Thr Ala 330

Val Gly

Tyr Leu

Thr Arg

Cys Glu 140

Lys Asn

Gly Glu

Thr Arg

Thr Leu

205

Ile Arg 220

Glu Asn

Arg Leu

Thr Ala

Ser Trp

285

Thr Cys 300

Asp Leu

Ala Glu

Val Val

Val Arg

365

Leu His 380

Ser His

Gly Asn

Ser Val

175

Glu Asp 190

Gln Gly

Val Pro

Gln Val

Gln Leu

255

Ser Thr

270

Leu Leu

Gln Val

Lys Val

Asn Thr

335

Cys Thr 350

Ile Arg

Glu Pro

Gly

Glu 160

Ser

Val

Asp

Pro

Asn 240

Thr

Val

Glu

Ser 320

Gly

Leu

Gln

Glu

- 382 045238

Lys Asn Ala Arg Glu Ile Thr Gln Asp

385 390

Asp Leu Asn Leu Pro Lys Gly Lys Lys 405

Pro Asn Asn His Thr Glu Tyr Ala Ser

420 425

Ala Ser Glu Asp Thr Leu Thr Tyr Ala

435 440

Asn Arg Thr Pro Lys Gln Pro Ala Pro

450 455

Glu Tyr Ala Ser Val Gln Val Pro Arg

465 470 <210>306 <211>349 < 212> PRT < 213> Homo sapiens < 400>306

Cys Gln Gly Ser Ala Asp His Val Val 15

Gln Leu Gln Pro Asn Ser Ile Gln Thr

25

Lys Lys Leu Leu Pro Ser Gln Asn Gly

40

Glu Asn Gly Ser Leu Pro Ser Asn Thr

55

Ile Val Lys Asn Leu Ser Leu Leu Ile 65 70

Ser Gly Leu Tyr Cys Leu Glu Val Thr 85

Thr Ala Thr Phe Gln Val Phe Val Phe

100 105

Val Glu Lys Pro Arg Leu Gln Gly Gln

115 120

Asn Asp Ile Thr Tyr Ala

395 400

Ala Pro Gln Ala Ala Glu

415

Gln Thr Ser Pro Gln Pro

430

Leu Asp Met Val His Leu 445

Pro Glu Pro Ser Phe Ser

460

Ile Ser Gly Val Pro Leu

Val Asp Ser Ile Ala Trp 30

His His Ile Leu Lys Trp 45

Asn Asp Arg Phe Ser Phe 60

Ala Ala Gln Gln Gln Asp 75 80

Ile Ser Gly Lys Val Gln 95

Ser Leu Leu Pro Asp Lys

110

Lys Ile Leu Asp Arg Gly

125

- 383 045238

Arg Cys Gln Val Ala 130

Leu Ser Cys Leu Val

135

Ser Arg Asp Gly Asn 140

Ser Tyr Ala Trp Tyr 145

Arg Gly Ser Lys Leu 150

Ile Gln Thr Ala Gly 155

Leu Thr Tyr Leu Asp

165

Glu Glu Val Asp Ile

170

Asn Gly Thr His Thr

175

Thr Cys Asn Val Ser

180

Asn Pro Val Ser Trp

185

Glu Ser His Thr Leu

190

Leu Thr Gln Asp Cys 195

Gln Asn Ala His Gln

200

Glu Phe Arg Phe Trp

205

Phe Leu Val Ile Ile

210

Val Ile Leu Ser Ala

215

Leu Phe Leu Gly Thr

220

Ala Cys Phe Cys Val 225

Trp Arg Arg Lys Arg 230

Lys Glu Lys Gln Ser 235

Thr Ser Pro Lys Glu

245

Phe Leu Thr Ile Tyr

250

Glu Asp Val Lys Asp

255

Lys Thr Arg Arg Asn

260

His Glu Gln Glu Gln

265

Thr Phe Pro Gly Gly

270

Ser Thr Ile Tyr Ser

275

Met Ile Gln Ser Gln

280

Ser Ser Ala Pro Thr

285

Gln Glu Pro Ala Tyr

290

Thr Leu Tyr Ser Leu

295

Ile Gln Pro Ser Arg

300

Ser Gly Ser Arg Lys 305

Arg Asn His Ser Pro 310

Ser Phe Asn Ser Thr 315

Tyr Glu Val Ile Gly

325

Lys Ser Gln Pro Lys

330

Ala Gln Asn Pro Ala

335

Val

Asn 160

Tyr

Asn

Pro

Leu

Glu 240

Leu

Gly

Ser

Lys

Ile 320

Arg

Leu Ser Arg Lys Glu

340

Leu Glu Asn Phe Asp

345

Val Tyr Ser <210> 307 <211> 651 <212> PRT <213> Homo sapiens

- 384 045238 <400> 307

Lys Leu Thr Ile Glu 1 5

Ser Thr Pro Phe Asn

Val Ala Glu Gly Lys

Val Leu Leu Leu Val

His Asn Leu Pro Gln

His Leu Phe Gly Tyr 30

Trp Tyr Lys Gly Glu 35

Arg Val Asp Gly Asn 40

Arg Gln Ile Ile Gly 45

Val Ile Gly Thr Gln 50

Gln Ala Thr Pro Gly 55

Pro Ala Tyr Ser Gly 60

Glu Ile Ile Tyr Pro 65

Asn Ala Ser Leu Leu 70

Ile Gln Asn Ile Ile 75

Asn Asp Thr Gly Phe 85

Tyr Thr Leu His Val 90

Ile Lys Ser Asp Leu 95

Asn Glu Glu Ala Thr

100

Gly Gln Phe Arg Val

105

Tyr Pro Glu Leu Pro

110

Pro Ser Ile Ser Ser

115

Asn Asn Ser Lys Pro 120

Val Glu Asp Lys Asp

125

Val Ala Phe Thr Cys

130

Glu Pro Glu Thr Gln

135

Asp Ala Thr Tyr Leu

140

Trp Val Asn Asn Gln 145

Ser Leu Pro Val Ser 150

Pro Arg Leu Gln Leu 155

Asn Gly Asn Arg Thr

165

Leu Thr Leu Phe Asn

170

Val Thr Arg Asn Asp

175

Ala Ser Tyr Lys Cys

180

Glu Thr Gln Asn Pro

185

Val Ser Ala Arg Arg

190

Asp Ser Val Ile Leu 195

Asn Val Leu Tyr Gly

200

Pro Asp Ala Pro Thr

205

Ser Pro Leu Asn Thr

210

Ser Tyr Arg Ser Gly

215

Glu Asn Leu Asn Leu

220

Cys His Ala Ala Ser 225

Asn Pro Pro Ala Gln 230

Tyr Ser Trp Phe Val 235

Gly Thr Phe Gln Gln

Ser Thr Gln Glu Leu

Phe Ile Pro Asn Ile

Glu

Ser

Tyr

Arg

Gln 80

Val

Lys

Ala

Trp

Ser 160

Thr

Ser

Ile

Ser

Asn 240

Thr

- 385 045238

245

250

255

Val

Gly

Pro

Asp 305

Leu

Asp

His

Thr 385

Leu

Ile

Ala

Glu 465

Asp

Asn Asn Ser Gly Ser 260

Leu Asn Arg Thr Thr

275

Lys Pro Phe Ile Thr 290

Ala Val Ala Leu Thr

310

Trp Trp Val Asn Asn

325

Ser Asn Asp Asn Arg 340

Val Gly Pro Tyr Glu

355

Ser Asp Pro Val Ile 370

Ile Ser Pro Ser Tyr

390

Ser Cys His Ala Ala

405

Asp Gly Asn Ile Gln 420

Thr Glu Lys Asn Ser

435

Ser Gly His Ser Arg 450

Leu Pro Lys Pro Ser

470

Lys Asp Ala Val Ala

485

Tyr Thr Cys Gln Ala

265

His Asn Ser Asp Thr 270

Val Thr Thr Ile Thr

280

Val Tyr Ala Glu Pro

285

Ser Asn Asn Ser Asn 295

Cys Glu Pro Glu Ile

315

Gln Ser Leu Pro Val

330

Thr Leu Thr Leu Leu

345

Cys Gly Ile Gln Asn

360

Leu Asn Val Leu Tyr 375

Thr Tyr Tyr Arg Pro

395

Ser Asn Pro Pro Ala

410

Gln His Thr Gln Glu

425

Gly Leu Tyr Thr Cys 440

Thr Thr Val Lys Thr 455

Ile Ser Ser Asn Asn

475

Phe Thr Cys Glu Pro

490

Pro Val Glu Asp Glu 300

Gln Asn Thr Thr Tyr

320

Ser Pro Arg Leu Gln

335

Ser Val Thr Arg Asn 350

Lys Leu Ser Val Asp

365

Gly Pro Asp Asp Pro 380

Gly Val Asn Leu Ser

400

Gln Tyr Ser Trp Leu

415

Leu Phe Ile Ser Asn

430

Gln Ala Asn Asn Ser

445

Ile Thr Val Ser Ala 460

Ser Lys Pro Val Glu

480

Glu Ala Gln Asn Thr

495

- 386 045238

Thr Tyr Leu

Trp 500

Trp

Val

Asn

Gly

Gln

505

Ser

Leu

Pro

Val

Ser 510

Pro

Arg

Leu Gln Leu

515

Ser

Asn

Gly

Asn

Arg 520

Thr

Leu

Thr

Leu

Phe

525

Asn

Val

Thr

Arg Asn Asp

530

Ala

Arg

Ala

Tyr

535

Val

Cys

Gly

Ile

Gln

540

Asn

Ser

Val

Ser

Ala Asn Arg 545

Ser

Asp

Pro

550

Val

Thr

Leu

Asp

Val

555

Leu

Tyr

Gly

Pro

Asp 560

Thr Pro Ile

Ile

Ser

565

Pro

Asp

Ser

570

Tyr

Leu

Ser

Gly

Ala

575

Asn

Leu Asn Leu

Ser

580

Cys

His

Ser

Ala

Ser

585

Asn

Pro

Ser

Pro

Gln

590

Tyr

Ser

Trp Arg Ile

595

Asn

Gly

Ile

Pro

Gln

600

Gln

His

Thr

Gln

Val

605

Leu

Phe

Ile

Ala Lys Ile 610

Thr

Pro

Asn

615

Asn

Gly

Thr

Tyr

Ala

620

Cys

Phe

Val

Ser

Asn Leu Ala 625

Thr

Gly

Arg 630

Asn

Ser

Ile

Val

635

Lys

Ser

Ile

Thr

Val

640

Ser Ala Ser

Gly

Thr

645

Ser

Pro

Gly

Leu

Ser

650

Ala <210>308 <211>355 <212> PRT <213> Homo <400>308

Met Ala Phe 1 sapiens

Ser

Gly 5

Ser

Gln

Ala

Pro

Tyr 10

Leu

Ser

Pro

Ala

Val 15

Pro

Phe Ser Gly

Thr 20

Ile

Gln

Gly

Leu 25

Gln

Asp

Gly

Leu

Gln 30

Ile

Thr

Val Asn Gly

Thr

Val

Leu

Ser

Ser 40

Ser

Gly

Thr

Arg

Phe 45

Ala

Val

Asn

Phe Gln Thr

Gly

Phe

Ser

Gly 55

Asn

Asp

Ile

Ala

Phe 60

His

Phe

Asn

Pro

- 387 045238

Arg 65

Ser

Met

His

Ile 145

Thr

Arg

Thr

Ser

Met 225

Ile

Asn

Asp

Ser

Ser 305

Phe Glu Asp

Trp Gly Pro

Pro Phe Asp

100

Val Asn Gly

115

Arg Val Asp 130

Ser Phe Gln

Val Pro Phe

Arg Gln Lys

180

Gln Thr Val

195

Thr Pro Ala 210

Pro Phe Ile

Leu Leu Ser

Leu Cys Ser

260

Glu Asn Ala

275

Glu Glu Arg 290

Phe Ser Val

Gly Gly Tyr

Glu Glu Arg 85

Leu Cys Phe

Ile Leu Phe

Thr Ile Ser

135

Asn Pro Arg

150

Ser Gln Pro 165

Pro Pro Gly

Ile His Thr

Ile Pro Pro

215

Thr Thr Ile

230

Gly Thr Val 245

Gly Asn His

Val Val Arg

Ser Leu Pro

295

Trp Ile Leu

310

Val Val Cys

Asn Thr Arg 75

Gln Asn Gly 80

Lys Thr His

Leu Val Gln

105

Val Gln Tyr 120

Val Asn Gly

Thr Val Pro

Val Cys Phe

170

Val Trp Pro

185

Val Gln Ser 200

Met Met Tyr

Leu Gly Gly

Leu Pro Ser

250

Ile Ala Phe

265

Asn Thr Gln 280

Arg Lys Met

Cys Glu Ala

Met Pro Phe

Gln Lys Gly 95

Ser Ser Asp

Phe His Arg

125

Ser Val Gln

140

Val Gln Pro 155

Pro Pro Arg

Ala Asn Pro

Ala Pro Gly

205

Pro His Pro

220

Leu Tyr Pro 235

Ala Gln Arg

His Leu Asn

Ile Asp Asn

285

Pro Phe Val

300

His Cys Leu 315

Phe Lys Val 110

Val Pro Phe

Leu Ser Tyr

Ala Phe Ser

160

Pro Arg Gly

175

Ala Pro Ile 190

Gln Met Phe

Ala Tyr Pro

Ser Lys Ser

240

Phe His Ile

255

Pro Arg Phe 270

Ser Trp Gly

Arg Gly Gln

Lys Val Ala

320

- 388 045238

Val Asp Gly Gln His Leu Phe Glu Tyr Tyr His

325 330

Arg Leu Arg Asn Leu

335

Pro Thr

Ile Asn Arg Leu Glu Val Gly Gly Asp Ile Gln Leu Thr His

340 345 350

Val Gln Thr

355 < 210> 309 < 211> 119 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность < 220>

< 223> VH антитела к OX40 < 400> 309

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 <210> 310 <211> 107 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> VL антитела к OX40

- 389 045238 <400> 310

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr 20

Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp 25

Ile Ser Asn Tyr 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

40

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser

55

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr 65 70

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys 85

Gly Lys Ala Val Lys Leu Leu Ile 45

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 60

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 75 80

Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100105 < 210>311 < 211>121 < 212> PRT < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> VH антитела к OX40 < 400> 311

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly 1 5

Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala 20

Ser Gly Tyr Thr Phe Lys Asp Tyr 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala

40

Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 45

Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Asn Gly

55

Gly Ser Thr Tyr Asn Gln Asn Phe 60

Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala 65 70

Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 85

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

95

- 390 045238

Ala Arg Met

Gly Tyr His Gly Pro His Leu Asp

100 105

Phe Asp Val Trp Gly

110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

120 <210> 312 <211> 107 <212> PRT <213> Искусственная последовательность <220>

<223> VL антитела к OX40 <400> 312

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro 1 5

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys

Ala Ser Gln Asp Val Gly Ala Ala 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

40

Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr

55

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 85

Gln Gln Tyr Ile Asn Tyr Pro Leu

95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

Claims

1. Выделенное антитело-антагонист, специфически связывающее PD-1, или его антигенсвязывающий участок, содержащее определяющую комплементарность область тяжелой цепи 1 (HCDR1), HCDR2 и HCDR3 с SEQ ID NO: 10, 14 и 17, соответственно, и определяющую комплементарность область легкой цепи 1 (LCDR1), LCDR2 и LCDR3 с SEQ ID NO: 23, 26 и 32, соответственно.

2. Антитело или его антигенсвязывающий участок по п.1, где антитело имеет одно, два, три, четыре или пять из следующих свойств:

a) усиливает активацию специфичных к антигену T-клеток CD4+ или CD8+ дозозависимым образом, где активацию измеряют с помощью анализа с антигеном цитомегаловируса (анализ ЦМВ);

b) связывает PD-1 человека с равновесной константой диссоциации (K_D) менее около 100 нМ, где K_D измеряют с помощью системы ProteOn XPR36 при +25°C;

c) связывает PD-1 человека с K_D менее около 1 нМ, где K_D измеряют с помощью системы ProteOn XPR36 при +25°C;

d) связывает PD-1 яванского макака с SEQ ID NO: 3 с K_D менее около 100 нМ, где K_D измеряют с помощью системы ProteOn XPR36 при +25°C; или

e) связывает PD-1 яванского макака с SEQ ID NO: 3 с K_D менее около 1 нМ, где K_D измеряют с по

- 391 045238 мощью системы ProteOn XPR36 при + 25°C.

3. Антитело или его антигенсвязывающий участок по п.1 или 2, содержащие

a) вариабельную область тяжелой цепи (VH) с SEQ ID NO: 48;

b) вариабельную область легкой цепи (VL) с SEQ ID NO: 56; или

c) VH с SEQ ID NO: 48 и VL с SEQ ID NO: 56.

4. Антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.1-3, где антитело является человеческим или гуманизированным.

5. Антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.1-4, где антитело относится к

a) изотипу IgG1, содержащему одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять замен в области Fc;

b) изотипу IgG2, содержащему одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять замен в области Fc;

c) изотипу IgG3, содержащему одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять замен в области Fc;

d) изотипу IgG4, содержащему одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять замен в области Fc;

e) изотипу IgG1, содержащему замены L234A, L235A, G237A, P238S, H268A, A330S и P331S;

f) изотипу IgG2, содержащему замены V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S и P331S;

g) изотипу IgG4, содержащему замены F234A, L235A, G237A, P238S и Q268A;

h) изотипу IgG1, содержащему замены L234A, L235A или L234A, и L235A;

i) изотипу IgG4, содержащему замены F234A, L235A или F234A, и L235A;

j) изотипу IgG2, содержащему замену V234A;

k) изотипу IgG4, содержащему замену S228P; или

l) изотипу IgG4, содержащему замены S228P, F234A и L235A, где нумерация остатков соответствует каталогу EU.

6. Антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.1-5, содержащие тяжелую цепь (HC) с SEQ ID NO: 72 и легкую цепь (LC) с SEQ ID NO: 73.

7. Биспецифическое антитело, содержащее антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.1-6, где антитело связывается с PD-L1 (SEQ ID NO: 5), PD-L2 (SEQ ID NO: 8), LAG-3 (SEQ ID NO: 293), TIM-3 (SEQ ID NO: 138), CEACAM-1 (SEQ ID NO: 296), CEACAM-5 (SEQ ID NO: 307), OX-40 (SEQ ID NO: 279), GITR (SEQ ID NO: 271), CD27 (SEQ ID NO: 280), VISTA (SEQ ID NO: 286), CD137 (SEQ ID NO: 281), TIGIT (SEQ ID NO: 301) или CTLA-4 (SEQ ID NO: 292).

8. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.1-6 или биспецифическое антитело по п.7 и фармацевтически приемлемый носитель.

9. Полинуклеотид, кодирующий вариабельные области тяжелой и легкой цепей антитела или его антегенсвязывающего участка по любому из пп.1-6, причем VH характеризуется SEQ ID NO: 48, a VL SEQ ID NO: 56.

10. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по п.9.

11. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.10.

12. Способ получения антитела-антагониста, специфически связывающего PD-1, или его антигенсвязывающего участка, который включает в себя культивирование клетки-хозяина по п.11 в условиях, когда экспрессируется антитело, его антигенсвязывающий участок, и выделение антитела или его антигенсвязывающего участка, продуцируемого клеткой-хозяином.

13. Способ лечения рака у индивида, включающий в себя введение терапевтически эффективного количества выделенного антитела или его антигенсвязывающего участка по любому из пп.1-6 или биспецифического антитела по п.7 или фармацевтической композиции по п.8 этому индивиду в течение времени, достаточного для лечения рака.

14. Способ по п.13, в котором рак представляет собой солидную опухоль или гематологическую злокачественную опухоль.

15. Способ по п.13 или 14, в котором солидная опухоль представляет собой меланому, рак легкого, плоскоклеточный немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), неплоскоклеточный NSCLC, колоректальный рак, рак предстательной железы, устойчивый к кастрации рак предстательной железы, рак желудка, рак яичника, рак желудка, рак печени, рак поджелудочной железы, рак щитовидной железы, плоскоклеточную карциному головы и шеи, карциномы пищевода или желудочно-кишечного тракта, рак молочной железы, рак фаллопиевой трубы, рак головного мозга, рак уретры, урогенитальный рак, эндометриоз, рак шейки матки или метастатическое раковое поражение.

16. Способ по п.13 или 14, в котором гематологическая злокачественная опухоль представляет собой лимфому, миелому или лейкоз.

17. Способ усиления иммунного ответа у субъекта, включающий в себя введение терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего участка по любому из пп.1-6 или биспецифического антитело по п.7 или фармацевтической композиции по п.8 требующему этого субъекту в течение времени, достаточного для усиления иммунного ответа.

- 392 045238

18. Способ по п.17, в котором субъект имеет рак или вирусную инфекцию.

19. Способ по любому из пп.13-18, предусматривающий дополнительное введение второго терапевтического агента, который представляет собой

a) стандартное лекарственное средство для лечения солидной опухоли или гематологической злокачественной опухоли;

b) агонист молекулы, активирующей T-клетки;

c) агонист CD86 (SEQ ID NO: 264), CD80 (SEQ ID NO: 265), CD28 (SEQ ID NO: 266), ICOS (SEQ ID NO: 267), лиганд ICOS (SEQ ID NO: 268), TMIGD2 (SEQ ID NO: 269), CD40 (SEQ ID NO: 270), GITR (SEQ ID NO: 271), лиганд 4-1BB (SEQ ID NO: 271), лиганд OX40 (SEQ ID NO: 272), CD70 (SEQ ID NO: 274), CD40L (SEQ ID NO: 275), TNFRSF25 (SEQ ID NO: 264), LIGHT (SEQ ID NO: 277), лиганд GITR (SEQ ID NO: 278), OX-40 (SEQ ID NO: 279), CD27 (SEQ ID NO: 280), CD137 (SEQ ID NO: 281), NKG2D (SEQ ID NO: 282), CD48 (SEQ ID NO: 283), CD226 (SEQ ID NO: 284) или MICA (SEQ ID NO: 285);

d) ингибитор молекулы, ингибирующей T-клетки;

e) ингибитор PD-1 (SEQ ID NO: 1), PD-L1 (SEQ ID NO: 5), PD-L2 (SEQ ID NO: 8), VISTA (SEQ ID NO: 286), BTNL2 (SEQ ID NO: 287), B7-H3 (SEQ ID NO: 288), B7-H4 (SEQ ID NO: 289), HVEM (SEQ ID NO: 290), HHLA2 (SEQ ID NO: 291), CTLA-4 (SEQ ID NO: 292), LAG-3 (SEQ ID NO: 293), TIM-3 (SEQ ID NO: 138), BTLA (SEQ ID NO: 294), CD160 (SEQ ID NO: 295), CEACAM-1 (SEQ ID NO: 296), LAIR1 (SEQ ID NO: 297), TGFe (SEQ ID NO: 298), IL-10 (SEQ ID NO: 299), CD96 (SEQ ID NO: 300), TIGIT (SEQ ID NO: 301), NKG2A (SEQ ID NO: 302), CD112 (SEQ ID NO: 303), CD47 (SEQ ID NO: 304), SIRPA (SEQ ID NO: 305) или CD244 (SEQ ID NO: 306);

f) антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3;

g) антитело-антагонист, специфически связывающее TIM-3, которое содержит VH и VL с

i) SEQ ID NO: 145 и 155, соответственно;

ii) SEQ ID NO: 146 и 156, соответственно;

iii) SEQ ID NO: 148 и 157, соответственно;

iv) SEQ ID NO: 147 и 155, соответственно;

v) SEQ ID NO: 149 и 158, соответственно;

vi) SEQ ID NO: 150 и 159, соответственно;

vii) SEQ ID NO: 151 и 160, соответственно;

viii) SEQ ID NO: 152 и 161, соответственно;

ix) SEQ ID NO: 153 и 162, соответственно;

x) SEQ ID NO: 154 и 163, соответственно; или xi) SEQ ID NO: 172 и 173, соответственно;

h) ингибитор рецептора фактора роста фибробластов (FGFR);

i) вакцину;

j) антитело-агонист, специфически связывающее GITR;

k) антитело-агонист, специфически связывающее OX40;

l) антитело-агонист, специфически связывающее OX40, которое содержит VH и VL с SEQ ID NO: 309 и 310 соответственно;

m) антитело-агонист, специфически связывающее OX40, которое содержит VH и VL с SEQ ID NO: 311 и 312 соответственно;

n) антитело-агонист, специфически связывающее CD137.

20. Способ по п.19, где второй терапевтический агент представляет собой гемцитабин.

21. Способ по любому из пп.13-20, в котором антитело или его антигенсвязывающий участок и второй терапевтический агент вводят одновременно или раздельно.

22. Способ по п.21, в котором антитело или его антигенсвязывающий участок и второй терапевтический агент вводят последовательно.

23. Способ по любому из пп.13-18, предусматривающий дополнительную радиационную терапию или хирургию.

24. Антиидиотипическое антитело, связывающееся с антителом или его антигенсвязывающим участком по любому из пп.1-6 или с биспецифическим антителом по п.7.

25. Диагностический набор, содержащий антитело по любому из пп.1-6 или биспецифическое антитело по п.7 и инструкцию по применению.