CN104513310B - 一种抗柯萨奇病毒a16型的单克隆抗体的制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗柯萨奇病毒A16型的单克隆抗体的制备及其应用。揭示了一种鼠源的抗CA16的单克隆抗体，其具有良好的结合特异性，能够应用于灵敏地检测柯萨奇A16型病毒，具有强大的抗病毒感染能力。

Description

一种抗柯萨奇病毒A16型的单克隆抗体的制备及其应用

技术领域

本发明属于生物技术和免疫学领域；更具体地，本发明涉及一种抗柯萨奇病毒A16型的单克隆抗体的制备及其应用。

背景技术

柯萨奇病毒A16型(Coxsackievirus A16，CA16)属于小RNA病毒科肠道病毒属，CA16是手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)的主要致病原之一，CA16感染的多数患者临床病症较轻微，大多能自愈，包括发热、口腔溃疡、手足部红色疱疹。但越来越多的证据显示CA16感染也能引起神经系统损伤等重症，甚至导致死亡。目前尚未有治疗CA16感染的抗病毒药物，疫苗也还处于研发阶段。部分原因是因为缺乏可用于CA16定性和定量分析的试剂，如CA16特异性抗体。

近期，本发明人制备了基于病毒样颗粒的CA16新型疫苗，该疫苗能在小鼠体内引起较好的中和抗体反应，所产生的抗血清在CA16病毒攻击实验中能够有效保护小鼠(Liu Q等，Vaccine2012Oct19;30(47):6642-8)。其他研究小组报道了CA16灭活病毒免疫小鼠所产生的中和性抗血清也能使小鼠在一定程度上抵抗致死剂量的病毒攻击(Mao Q等，JVirol.2012Nov;86(22):11967-76)。这些结果表明中和抗体在体内可以抵抗CA16病毒感染，提示可以通过制备中和性单克隆抗体的策略来开发针对CA16感染的预防和治疗性药物。但是，目前现有技术中并没有针对CA16的单克隆抗体，只有多克隆抗体，即抗血清。

综上，制备出特异性良好的抗CA16单克隆抗体，对于开发针对CA16感染的检测试剂盒以及治疗性单抗药物是必不可少的，将为有效预防和控制手足口病提供重要帮助。

发明内容

本发明的目的在于提供一种结合分子，其特异性结合柯萨奇病毒A16型；并且，其完全抑制细胞病变的浓度低于1ng/ml。

在本发明的第一方面，提供一种分离的结合分子，所述结合分子包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:8所示的重链CDR1，SEQ ID NO:9所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3，SEQ ID NO:14所示的轻链CDR1，SEQ ID NO:15所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:16所示的轻链CDR3。

在一个优选例中，所述的结合分子包含重链可变区，所述的重链可变区具有SEQID NO:2所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的结合分子包含轻链可变区，所述的轻链可变区具有SEQID NO:4所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的结合分子包含重链可变区和轻链可变区，其重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的结合分子包含重链恒定区和轻链恒定区，其重链恒定区具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；或其轻链恒定区具有SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的结合分子结合柯萨奇病毒16型的E颗粒和F颗粒。

在本发明的另一方面，提供编码所述的结合分子的核酸分子。

在本发明的另一方面，提供所述的结合分子在制备用于检测、治疗和/或预防柯萨奇病毒A16型感染的药物中的用途。

在另一优选例中，所述的结合分子识别的是构象表位。

在本发明的另一方面，提供一种表达载体，所述表达载体中含有编码所述的结合分子的DNA。

在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞中含有所述的表达载体。

在本发明的另一方面，提供一种组合物，它含有所述的单克隆抗体，以及药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的组合物中，所述的单克隆抗体是有效量的。

在本发明的另一方面，提供一种检测柯萨奇病毒A16型的试剂盒，其包括所述的结合分子。

在本发明的另一方面，提供一种抑制柯萨奇病毒A16型的方法，所述的方法包括给予患者有效量的所述的结合分子。

在本发明的另一方面，提供一种检测柯萨奇病毒A16型的方法，利用所述的结合分子与待测样品进行接触，通过检测所述的结合分子与受试样品的结合情况，获得柯萨奇病毒的存在情况以及存在量。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、10%还原SDS-PAGE鉴定从腹水中纯化的单抗9B5的纯度和分子量，其中，重链约为50KDa，轻链约为25KDa。

图2、免疫荧光染色，9B5可以如CVLP抗血清(Liu Q等，Vaccine2012Oct19;30(47):6642-8)一样特异性地检测到感染细胞的CA16，而且绿色荧光信号定位在细胞质。无关的抗HBsAg单抗2G9(参见Ku Z，Shi J等，J Virol Methods2012Dec；186(1-2):193-7)则检测不到相应的信号。

图3、50ng的9B5包板，可以捕获灭活的CA16病毒和病毒样颗粒。9B5-Biotin稀释两万倍可以检测到低至0.025ng/ul的CA16灭活病毒和病毒样颗粒，对EV71却无任何交叉反应。

图4、9B5可以特异检测出5#26#血清中的CA16-IgM抗体，而未与被EV71特异性抗体mD5(参见Ku Z，Shi J等，J Virol Methods2012Dec;186(1-2):193-7)检测出的38#53#64#173#EV71-IgM血清出现交叉反应。

图5、注射2ug和10ug的9B5均可以预防小鼠被CA16感染，对照抗体和PBS组在小鼠攻毒后三天开始出现临床症状，并逐步严重，继而开始瘫痪及死亡，存活率分别为43%和29%，而9B5单抗组，不但未出现小鼠死亡，而且所有小鼠未出现任何症状。

图6、小鼠感染CA1624小时后，注射9B5及对照抗体2G9来治疗，对照抗体和PBS组在小鼠攻毒后四天后开始反应迟缓，第五至六天出现共济失调、腿无力症状继而开始瘫痪及死亡，存活率分别为43%和29%，而9B5组未出现小鼠死亡，仅个别小鼠在第7天有轻微反应迟钝症状，但很快消失。

图7、小鼠感染CA1672小时后，注射9B5及对照抗体2G9来治疗，对照抗体和PBS组在小鼠攻毒后出现共济失调、腿无力症状继而开始瘫痪及死亡，存活率分别为37%和42%，而9B5组未出现小鼠死亡，亦未出现临床症状。

图8、小鼠感染CA16120小时后，出现2级及3级症状的小鼠再注射9B5及对照抗体2G9来治疗，9B5组小鼠症状得到缓解并逐渐消除，存活率也提高至85%，而对照抗体和PBS组小鼠的症状未缓解，出现瘫痪及死亡，存活率分别为37%和28%。

图9、9B5重链序列。

图10、9B5轻链序列。

图11A、重组表达的单抗9B5(9B5重组表达)与从腹水纯化出的9B5(9B5腹水纯化)一样，可以特异性结合CA16灭活病毒，而表达的对照抗体(阴性对照：mD5(Ku Z,Shi J等，JVirol Methods2012Dec;186(1-2):193-7)上清没有结合信号。

图11B、重组表达的单抗9B5(9B5重组表达)与从腹水纯化出的9B5(9B5腹水纯化)一样，可以特异性识别感染细胞的CA16病毒，而对照单抗2G9却检测不到结合信号。

图11C、重组表达的单抗9B5(9B5重组表达)与从腹水纯化出的9B5(9B5腹水纯化)一样，可以中和CA16病毒，阻止细胞出现病变，而对照单抗上清不能中和病毒，细胞出现严重病变。

图12、对照单抗2G9与CA16孵育后，不能阻止病毒结合至靶细胞上，而单抗9B5与病毒孵育后，可以成浓度依赖性抑制病毒结合到细胞上。

图13、最低3.125ug/ml的9B5即可完全阻止结合到靶细胞上的病毒感染细胞。

具体实施方式

本发明人经过深入研究和筛选，获得一种鼠源的抗CA16的单克隆抗体，命名为9B5。本发明的单克隆抗体具有良好的结合特异性，能够应用于灵敏地检测柯萨奇A16型病毒(CA16)，具有强大的抗病毒感染能力。

结合分子

本发明提供了能特异性结合柯萨奇病毒(较佳地位A16型病毒)的结合分子。

在本发明的实施例中，经验证，本发明的单克隆抗体能够特异性结合CA16病毒的E颗粒和F颗粒，能够特异性检测CA16感染的细胞，能够检测到低至0.05ng/ul的CA16病毒或病毒样颗粒，可以特异性检测出病人血清中的CA16特异性IgM抗体。并且，本发明的单克隆抗体具有强大的抗病毒感染能力，体外中和实验显示其IC95为1ng/ml；在致死剂量CA16病毒感染小鼠前一天，腹腔注射9B5单抗能够100%保护小鼠，显示出很好的预防效果；在致死剂量CA16病毒感染小鼠后一天及三天，腹腔注射9B5单抗也能够100%保护小鼠，在致死剂量CA16感染小鼠五天后，9B5依然可以减轻小鼠的临床症状并提高其存活率，表明9B5具有很强的治疗作用。综上所述，9B5单抗不仅可以用来开发针对CA16的诊断试剂，而且可以用于构建人源化单抗，以用于CA16感染所引起手足口病的预防和治疗。

本发明的结合分子可以是完整的免疫球蛋白分子，所述结合分子可以是抗原结合片段，包括但不限于Fab、F(ab’)、F(ab’)₂、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双特异双链抗体、三链抗体、四链抗体以及至少含有足以赋予与柯萨奇病毒毒株的特异性抗原结合免疫球蛋白的片段的(多)肽或其片段。

对于治疗和/或预防柯萨奇病毒的方法而言，所述结合分子优选能特异性结合柯萨奇病毒的表面可及蛋白质。在特定的实施方案中，本发明的结合分子能特异性结合柯萨奇病毒的E颗粒和F颗粒。

本发明还提供了所述的结合分子在制备诊断、预防和/或治疗柯萨奇病毒感染的药物中的应用。本发明提供了可以中和导致柯萨奇病毒感染的结合分子。

CDR区是免疫学感兴趣的蛋白质的序列。在本发明的实施方案中，结合分子可包含本文揭示的二、三、四、五或者所有六个CDR区。优选地，本发明的结合分子包含本文揭示的至少两个CDR区。

本发明的另一方面包括本文所述结合分子的功能变体。如果变体能与亲代结合分子竞争特异性结合柯萨奇病毒，则认为该变体分子是本发明结合分子的功能变体。换句话说，所述功能变体仍能结合柯萨奇病毒。功能变体包括但不限于一级结构序列基本相似、但是含有例如在亲代结合分子中未发现的体外或体内化学和/或生物化学修饰的衍生物。这种修饰包括乙酞化、酞化、核苷酸或者核苷酸衍生物的共价附着、脂质或者脂质衍生物的共价附着、交联、二硫键形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化等。换句话说，亲代结合分子的氨基酸和/或核苷酸序列中的修饰不显著影响或改变由所述核苷酸序列编码的或者含有所述氨基酸序列的所述结合分子的结合特性，即所述结合分子仍能识别并结合其靶位。

所述功能变体可以具有保守序列修饰，包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。这些修饰可以通过本领域己知的标准技术导入，例如定向诱变和随机PCR介导的诱变，并且可包含天然以及非天然核苷酸和氨基酸。

保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基由具有相似结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族己经在本领域中限定。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链氨基酸(例如天冬酞胺、谷氨酞胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半肤氨酸、色氨酸)、非极性侧链氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、分支侧链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香侧链氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本领域技术人员明白也可以使用除了上述家族之外的其它氨基酸残基家族分类方式。另外，变体可具有非保守的氨基酸取代，例如氨基酸由具有不同结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换。相似的小变异也可包括氨基酸缺失或者插入，或者这二者。使用本领域熟知的计算机程序可以发现确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或者缺失而不消除免疫学活性的指导。

此外，功能变体可包含氨基酸序列在氨基末端或者羧基末端或者这两端的截短体。本发明的功能变体与亲代结合分子相比可具有相同或不同的、更高或更低的结合亲和性，但是仍能结合柯萨奇病毒。优选地，可变区包括但不限于构架区、高变区或CDR区的氨基酸序列被修饰。通常，轻链和重链可变区包含三个高变区，包括三个CDR，以及更保守的区域，即所谓的构架区((FR)。高变区包含来自CDR的氨基酸残基和来自高变环的氨基酸残基。在本发明范围内的功能变体与本文所述亲代结合分子具有至少大约50%至大约99%、优选至少大约60%至大约99%、更优选至少大约70%至大约99%、甚至更优选至少大约80%至大约99%、最优选至少大约90%至大约99%、特别是至少大约95%至大约99%，以及特别是至少大约97%至大约99%的氨基酸序列同源性。本领域技术人员已知的计算机算法如Gap或者Bestfit可用于最佳地排列氨基酸序列以进行对比以及明确相似或相同的氨基酸残基。功能变体可以通过使用本领域己知的普通分子生物学方法改变亲代结合分子或其一部分而获得，所述方法包括但不限于易错PCR、寡核苷酸指导的诱变、定点诱变以及重链和/或轻链改组法。在一个实施方案中，本发明的功能变体对于柯萨奇病毒具有中和活性。所述中和活性与亲代结合分子相比可以相同或者更高或更低。此后，当使用术语结合分子时，其也涵盖所述结合分子的功能变体。

抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为互补决定区(complementarity determining region，CDR)，所述的CDR区将可变区间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。

作为本发明的优选方式，所述的结合分子是单克隆抗体。所述的抗柯萨奇病毒单克隆抗体的重链可变区、轻链可变区以及位于重链可变区和轻链可变区的互补决定区(CDR)均具有独特的不同于现有技术的结构。

本发明包括：具有所述结合分子的相应氨基酸序列的单克隆抗体，具有所述结合分子可变区链的单克隆抗体。本发明还包括具有含所述的互补决定区(CDR)的轻链和重链的任何抗体，以及CDR区与本发明的CDR具有90%以上(较佳地95%以上)的同源性的任何抗体。

对于本发明的单克隆抗体重链和轻链序列，可以用常规方法测定。

经验证，本发明的抗柯萨奇病毒单克隆抗体的CDR区是全新的，其针对的是一个独特的柯萨奇病毒E颗粒或F颗粒上的抗原表位，技术构思不同于现有的抗柯萨奇病毒抗体。

另一方面，本发明包括免疫缀合物，即包含本文所述至少一个结合分子以及进一步包含至少一个标记如可检测的部分/物质的分子。本发明还涉及本发明免疫缀合物的混合物或者至少一种本发明免疫缀合物与另一分子的混合物，所述另一分子如治疗剂或者另一结合分子或免疫缀合物。本发明的免疫缀合物可包含一个以上的标记。这些标记可以彼此相同或不同，并且可以与结合分子非共价地结合/缀合。所述标记也可以通过共价键与所述结合分子直接结合/缀合。或者，所述标记可以通过一或多种连接化合物与所述结合分子结合/缀合。标记与结合分子的缀合技术为本领域技术人员所熟知。

本发明的免疫缀合物的标记可以是治疗剂，但是它们也可以是可检测的部分/物质。适于治疗和/或预防的标记可以是毒素或者其功能部分、抗生素、酶、增强吞噬作用或者免疫刺激作用的其它结合分子。包含可检测物质的免疫缀合物可诊断性地用于例如评定对象是否己经感染柯萨奇病毒毒株或者作为临床实验程序的一部分监测柯萨奇病毒感染的发生或进展以例如确定指定治疗方案的功效。然而，它们也可以用于其它检测和/或分析和/或诊断目的。可检测的部分/物质包括但不限于酶、辅基、荧光材料、发光材料，生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子。为了检测和/或分析和/或诊断目的用于标记结合分子的标记依赖于使用的特定检测/分析/诊断技术和/或方法例如免疫组织化学染色(组织)样品、流式细胞计量术、激光扫描细胞计量术检测、荧光免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、生物测定(例如吞噬作用测定)、蛋白质印迹应用等。对于本领域已知的检测/分析/诊断技术和/或方法合适的标记为本领域技术人员所熟知。

此外，本发明的结合分子或者免疫缀合物也可以附着于固体支持物上，其特别用于柯萨奇病毒的体外免疫测定或者纯化。这种固体支持物可以是多孔或者无孔的、平面或非平面的。本发明的结合分子可以与标记序列融合以便于纯化。所述标记序列的例子包括但不限于六组氨酸标记、myc标记或者flag标记。或者，一种抗体可以与另一种抗体缀合形成抗体异源缀合物(heteroconjugate)。

另一方面，本发明的结合分子可以与一或多个抗原缀合/附着。优选地，这些抗原是由给予了结合分子-抗原缀合物的对象的免疫系统识别的抗原。所述抗原可以彼此相同，但也可以是不同的。使附着抗原和结合分子的缀合方法为本领域所熟知，包括但不限于使用交联剂。本发明的结合分子结合柯萨奇病毒并且附着于结合分子的抗原将引发对于所述缀合物的有力T细胞攻击，最终导致柯萨奇病毒的破坏。

除了通过直接或间接(例如通过接头)缀合而化学产生免疫缀合物之外，所述免疫缀合物可以作为融合蛋白而产生，所述融合蛋白包含本发明的结合分子及合适的标记。融合蛋白可以通过本领域已知方法产生，例如通过构建核酸分子以及随后表达所述核酸分子而重组产生，所述核酸分子包含符合读框的编码结合分子的核苷酸序列以及编码合适标记的核苷酸序列。

本发明另一方面提供了编码本发明的至少一种结合分子、其功能变体或者免疫缀合物的核酸分子。这种核酸分子可以用作中间物以进行克隆，例如用于如上述的亲和力成熟方法中。在一个优选的实施方案中，所述核酸分子是分离或纯化的。DNA分子的序列可以用常规技术，或利用杂交瘤技术获得。

本领域技术人员将意识到这些核酸分子的功能变体也是本发明的一部分。功能变体是这样的核酸序列，通过使用标准遗传密码可以将其直接翻译以提供与从亲代核酸分子中翻译的序列相同的氨基酸序列。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明的结合分子(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明的结合分子的序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。优选的，本发明的载体是例如含病毒启动子的质粒表达载体，且在所述表达载体中分别插入了抗柯萨奇病毒单克隆抗体重链可变区(VH)与恒定区序列和轻链可变区VL与恒定区融合序列。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：细菌细胞如大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9；动物细胞如CHO、COS7、NSO或Bowes黑素瘤细胞等。特别适用于本发明的宿主细胞是真核宿主细胞，尤其是哺乳动物细胞，如293细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，或常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的结合分子。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

本发明的结合分子优选的是采用哺乳动物细胞来生产，哺乳动物细胞通常需要在含血清的培养基中进行培养。需要对细胞进行无血清的适应过程后，方可让细胞在无血清培养基中正常的生长。

如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的结合分子也可以在转基因非人哺乳动物如兔、山羊或者牛中产生，并且分泌进例如其乳中。

药物组合物

本发明的结合分子可用于制备抑制柯萨奇病毒的组合物。

基于本发明的新发现，还提供了一种可抑制柯萨奇病毒或柯萨奇病毒感染疾病的组合物，其包含：有效量的本发明所述的结合分子；以及药学上可接受的载体。

本文所用的术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的结合分子相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低组合物的效果。

可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。

本发明的组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它治疗方式。

本发明的结合分子可以以未分离的或者分离的形式使用。此外，本发明的结合分子可以单独应用或者于包含至少一种本发明的结合分子(或其变体或片段)的混合物中应用。换句话说，所述结合分子可以组合应用，例如作为包含两或更多种本发明的结合分子、其变体或片段的药物组合物。例如，具有不同但互补活性的结合分子可以组合在一个治疗方案中以达到希望的预防、治疗或诊断作用，但是或者也可以将具有相同活性的结合分子组合在一个治疗方案中以达到希望的预防、治疗或诊断作用。任选地，所述混合物进一步包含至少一种其它治疗剂。优选地，所述治疗剂如利巴韦林，可用于预防和/或治疗柯萨奇病毒感染。

所述药物组合物可包含两或多个对于柯萨奇病毒具有中和活性的结合分子。在一个实施方案中，当组合应用时，所述结合分子呈现协同中和活性。换句话说，所述组合物包含至少两种具有中和活性的结合分子，特征在于所述结合分子在中和柯萨奇病毒中起协同作用。如本文所用，术语“协同”是指当组合应用时，结合分子的组合作用高于单独应用时的加合作用。所述协同作用的结合分子可以结合柯萨奇病毒的相同或不同片段上的不同结构。计算协同作用的方式是通过组合指数计算。组合指数(CI)的概念己经由Chou andTalalay(1984)描述。

可以调整给药方案以提供最佳的所需应答(例如治疗应答)。合适的剂量范围可例如是0.01-100mg/kg体重，优选0.1-15mg/kg体重。此外，例如可以给予一次推注、随时间给予多次分开剂量或者根据治疗情况的紧急性而可以按比例降低或增加剂量。本发明的分子和组合物优选是无菌的。使得这些分子和组合物无菌的方法为本领域所熟知。用于诊断、预防和/或治疗的其它分子可以以与本发明的结合分子相似的给药方案给予。如果单独给予其它分子，则可以在给予本发明的一或多种人结合分子或药物组合物之前、同时或者之后给予患者。对于人患者的精确给药方案通常在临床实验期间挑选出。

检测试剂和试剂盒

本发明的结合分子可用于制备检测柯萨奇病毒的试剂或试剂盒。

如本文所用，术语“待测样品”涵盖了多种样品类型，包括生物学来源的血液及其它体液样品，实体组织样品如活检组织样品或者组织培养物，或者衍生自其中的细胞或者其后代。该术语还包括在获得后已经通过任何方式处理的样品，例如用试剂处理、溶解、或者富集某些成分如蛋白质或者多核苷酸。该术语涵盖了得自任何物种的各种临床样品，也包括培养的细胞、细胞上清和细胞溶解产物。术语“待测样品”也包括其它非诊断目的的待测样品，如可能包含病毒的器皿、物品、食品、药品。

以所述的结合分子为基础，可制备方便、快速且准确地检测柯萨奇病毒的试剂盒。

因此，本发明提供了一种用于检测样品中是否存在柯萨奇病毒的检测试剂盒，该试剂盒中含有本发明的抗柯萨奇病毒的结合分子。

在获得了本发明提供的结合分子后，可以方便地制备出用于特异性检测柯萨奇病毒的检测试剂盒。

作为本发明的一种检测方式，采用间接ELISA法，将待测的抗原包被于固相载体上，利用本发明的结合分子进行检测。

作为本发明的一种优选方式，所述的结合分子是抗体，可根据双抗夹心法的原理来检测。双抗夹心法常规的做法是将一抗(如本发明的单克隆抗体)固定于载体，然后使一抗与抗原反应，洗涤后再与二抗反应(所述的二抗携带可检测信号，或可与携带可检测信号的物质结合)，最后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。双抗夹心法特别适用于具有两个或两个以上表位的抗原的检测。

为了在检测时更方便，所述试剂盒中除了含有本发明的结合分子以外，还可以包含其它检测试剂或辅助试剂，所述的辅助试剂例如是ELISA试剂盒中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的，如显色剂、标记物、二抗、抗抗体、增敏剂等。本领域人员应理解，各种变化形式的检测试剂盒均是包含在本发明中的，只要在其中利用了本发明的结合分子作为识别柯萨奇病毒的试剂。

此外，在所述试剂盒中还可包含使用说明书，用于说明其中装载的试剂的使用方法。

在获得了本发明提供的结合分子和/或试剂盒后，可以利用多种免疫学相关方法来检测样品中柯萨奇病毒的存在与否或其含量，这些方法均被包含在本发明中。较佳地，所述的方法是以非疾病诊断为目的的。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

I.材料与方法

细胞和病毒

RD细胞(购自中国科学院细胞库)和Vero细胞(购自中国科学院细胞库)均用含有10%血清和100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的DMEM培养基培养。

SP2/0细胞(购自中国科学院细胞库)用含有10%血清和100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的1640培养基培养。

CA16病毒株SZ05(CA16/SZ05)(参见Liu F等，Virol J2011；8:534)和G08(参见LiuQ，Yan K等，Vaccine2012Oct19；30(47):6642-8)及EV71病毒株G082(参见Ku Z等，J VirolMethods2012Jul4)在RD和Vero细胞上扩增。病毒滴度测定采用微量滴定法在RD细胞上进行，并且表示为半数组织感染量TCID50。

抗原制备及小鼠免疫

CA16/SZ05灭活病毒的制备参见Cai Y等，Vaccine2013Apr26；31(18):2215-21。将4ug的灭活病毒(50ul体积)与等体积铝佐剂和25ug CpG佐剂混合后腹腔免疫6周雌性Balb/c小鼠，在0周、2周、4周、6周各免疫一次。在第7周时，采取小鼠血清检测中和滴度。第8周时中和滴度最高的一只小鼠通过尾静脉加强免疫10ug的灭活CA16病毒。3天后，取小鼠脾脏用于制备杂交瘤细胞。

杂交瘤细胞株的制备和筛选

小鼠尾静脉加强免疫3天后，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0通过PEG1500融合，制备杂交瘤细胞。9天之后，通过ELISA和微量中和滴定实验筛选特异性分泌针对CA16的中和性抗体。简言之，CA16F颗粒包被96孔板，每孔1ng，4℃包被过夜，用含有5%脱脂牛奶的PBST封闭，每孔加70ul杂交瘤细胞培养液在37℃孵育2小时，接着用HRP标记的二抗孵育1小时，最后进行显色反应，读取OD450的吸光值。同时，在VERO细胞上进行中和试验来筛选分泌中和性抗体的细胞株。中和试验参照Liu Q等，Vaccine2012Oct19；30(47):6642-8。

腹水制备和抗体纯化

雌性Balb/c小鼠腹腔注射500ul液体石蜡油，两周后，每只小鼠腹腔注射30万个杂交瘤细胞。7天后，12号针头收集腹水，10,000rpm离心10min，去除上层油脂和下层沉淀，取澄清的腹水进行抗体纯化。根据说明书，利用HiTrap HiTrapTM Protein G亲和柱(GEhealth care)纯化腹水获得抗体。

生物素标记单克隆抗体

将纯化后的单抗透析成PBS缓冲液，取1ml浓度为2mg/ml的9B5加入27ul的浓度为10mM Sulfo-NHS-LC-Biotin(thermo，Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit)，4℃轻轻震荡混合2小时。然后用脱盐柱置换缓冲液将多余的生物素除去。将偶联后的单抗加等体积的甘油，保存-20℃。

酶联免疫吸附实验鉴定单克隆抗体

每孔1ng CA16F颗粒4℃过夜包被96孔ELISA板，鉴定单抗的结合能力。ELISA板经含5%脱脂牛奶的PBST在37℃封闭2小时后，按每孔10ng入单抗37℃孵育2小时，接着用HRP标记的抗鼠二抗进行孵育，最后读取吸光值OD450。

免疫荧光染色

经CA16感染的Vero细胞用4%多聚甲醛固定20min，接着用1%NP40在室温处理10min。固定的细胞用含有10%FBS和10%BSA的PBS37℃封闭1小时。将单抗用含1%BSA的PBS稀释到最终浓度10ng/ul后与细胞进行37℃孵育。然后，将Alexa488标记的抗鼠IgG(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)为检测二抗。用5μg/ml4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)室温孵育5分钟对细胞染色。每一步中间都用PBS清洗3遍。染色细胞用免疫荧光显微镜(Leica,Wetzlar，Germany)观察。

夹心ELISA检测CA16灭活病毒和病毒样颗粒

用9B5包被ELISA板，1ng/ul，50ul/孔，37℃2小时；含5%脱脂牛奶的PBST37℃封闭1小时后，将灭活的CA16和EV71以及病毒样颗粒加入ELISA板中，20ng/50ul/孔起始，2倍比稀释12个浓度，37℃1小时；然后将生物素标记的9B51:20000稀释，50ul/孔，37℃1小时；最后用HRP-Avidin1:2000稀释，50ul/孔，37℃作用半小时，最后TMB显色15分钟，读取吸光值OD450。

捕获ELISA早期诊断患者血清里的特异性IgM抗体

将抗人IgM抗体(购于Sigma)5ug/ml，50ul/孔于PBS中包被ELISA板，37℃2小时；含5%脱脂牛奶的PBST37℃封闭1小时后，用含1%脱脂牛奶的PBST稀释1ul的人血清至50ul，加到ELISA板中，37℃2小时；随后加入100ng的CA16和EV71灭活病毒，50ul/孔，37℃2小时；然后将9B5和D5单抗(参见Ku Z等，J Virol Methods2012Jul4)8ng/孔加入板中，37℃1小时；最后用HRP标记的抗鼠IgG二抗1:5000稀释，50ul/孔，37℃作用1小时，结果为TMB显色15分钟，读取吸光值OD450。

体外中和实验

纯化的单克隆抗体用含2%FBS的DMEM进行二倍比稀释。CA16病毒稀释到工作浓2TCID50/ul。中和实验在96孔板中进行，每孔加入50ul稀释的抗体和50ul病毒液，37℃孵育1小时。将100ul抗体病毒混合物加至含有10,000RD细胞中，37℃孵育。72小时后，观察细胞病变，并记录能够完全抑制细胞病变的最低单抗浓度。

抗体预防CA16感染小鼠

1日龄ICR小鼠，腹腔注射2ug和10ug单克隆抗体和对照抗体2G9(参见Ku Z,Shi J等，J Virol Methods2012Dec;186(1-2):193-7)及PBS对照。24小时后，腹腔注射CA16/G08(TCID50:2.7*10⁷/ml)10ul，之后连续18天每天记录各组的临床症状评分和死亡率。临床病症分级如下：0级，健康；1级，反应迟缓；2级，平衡失调，肌无力；3级，瘫痪；4级，死亡。

抗体治疗感染CA16的小鼠

2日龄ICR小鼠，腹腔注射CA16/G08(TCID50:2.7*10⁷/ml)10ul。攻毒24小时后，腹腔注射2ug和10ug单克隆抗体9B5和对照抗体(鼠源单抗2G9，针对HBsAg)及PBS对照，为“一天治疗组”；攻毒后72小时腹腔注射10ug单克隆抗体9B5和对照抗体及PBS对照，为“三天后治疗组”；攻毒后120小时腹腔注射10ug单克隆抗体9B5和对照抗体及PBS对照，为“五天后治疗组”。注射抗体之后连续18天每天记录各组的临床症状评分和死亡率。临床病症分级如下：0级，健康；1级，反应迟缓；2级，平衡失调，肌无力；3级，瘫痪；4级，死亡。

单克隆抗体的基因序列分离及鉴定

从生长良好的杂交瘤细胞株用Trizol试剂提取总RNA，逆转录合成cDNA，然后PCR扩增出轻、重链可变区基因。分别以鼠源kappa链和gamma2B恒定区序列设计引物，用5’Race方法扩增轻重链可变区序列。扩增出的轻、重链可变区基因分别克隆到pGEM-T载体(Progema)中，筛选阳性克隆测序。将扩增出的抗体序列从信号肽端及恒定区末端设计引物，通过RT-PCR扩增抗体全长基因，在5’端和3’端分别引入HindIII和EcoRI酶切位点，PCR产物用HindIII和EcoRI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收目的片段，连入相同酶切的质粒pcDNA3.1(Progema)中，构建成真核表达载体pcDNA3.1-(m9B5H)和pcDNA3.1-(m9B5L)。将pcDNA3.1-(m9B5H)和pcDNA3.1-(m9B5L)脂质体法共转染CHO细胞，72小时后取培养上清进行分析，用ELISA方法确定培养上清中抗体的表达，具体ELISA方法如下：每孔10ng CA16F颗粒4℃过夜包被96孔ELISA板，鉴定重组单抗的结合能力。ELISA板经含5%脱脂牛奶的PBST在37℃封闭2小时后，将重组表达的抗体上清(9B5重组表达)50ul每孔，同时由杂交瘤分泌并纯化所得的9B5(9B5腹水纯化)按每孔10ng加入作阳性对照，37℃孵育2小时，接着用HRP标记的抗鼠二抗进行孵育，最后读取吸光值OD450。

同时通过免疫荧光染色实验检测重组表达的9B5识别感染细胞的CA16病毒,通过微量中和实验来检测重组表达的9B5中和CA16病毒。

单抗9B5对病毒结合至靶细胞的作用

将100ul的100ug，10ug，1ug9B5及100ug对照抗体2G9分别与150ul的500MOI CA16病毒混合，37℃孵育1小时后，在4℃预冷，然后将抗体病毒混合物加至已经预冷的VERO细胞上，4℃孵育1小时，用预冷的PBS洗细胞两遍除去未结合的病毒，然后收获样品，用兔抗CA16VP1(参见Liu Q，等JVirol Methods2011Apr；173(1):115-20)及抗β-actin的抗体通过Western检测结合上的病毒及细胞内参。

病毒结合至靶细胞后单抗9B5的中和能力测定

CA16病毒稀释到工作浓度2TCID50/ul，将50ul加至预冷的含有10,000RD细胞中，4℃孵育1小时，用预冷的PBS洗两遍细胞，然后将单抗用含2%FBS的DMEM进行二倍比稀释，每孔加入50ul稀释的抗体，4℃孵育1小时后，再将细胞用预冷的PBS洗两遍，加入100ul含2%FBS的DMEM，37℃孵育。抗体病毒混合物37℃孵育。72小时后，观察细胞病变，并记录能够完全抑制细胞病变的最低单抗浓度。加入MTT，测定细胞活性，具体方法参见Shi J等，Vaccine201331:2130-6。

II.具体实施例

实施例1、杂交瘤细胞株9B5的建立

灭活CA16免疫小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合后获得杂交瘤细胞。通过ELISA和微量中和滴定实验对杂交瘤细胞上清进行分析，筛选到一个杂交瘤细胞株，其分泌的抗体能够结合CA16病毒并且具有体外中和作用，命名该杂交瘤细胞株为9B5。

实施例2、单抗9B5的特性分析

对杂交瘤细胞株9B5分泌的单抗进行特性分析。亚型鉴定显示，单抗9B5的轻链均属于kappa链，重链属于IgG2B。

SDS-PAGE分析显示单抗9B5的重链和轻链分别为50KD和25KD左右，如图1。

通过ELISA检测了单抗9B5与不同抗原的反应活性，结果显示，9B5与灭活CA16病毒反应，但不与灭活EV71病毒反应，说明该抗体特异性识别CA16。另外，该单抗均不与大肠杆菌重组表达的CA16衣壳蛋白VP0，VP1，或VP3反应，提示该单抗识别的是构象表位。

实施例3、单抗9B5能够通过免疫荧光染色检测CA16病毒感染细胞

如图2所示，在免疫荧光染色实验中，单抗9B5可以检测CA16感染细胞中的病毒，在细胞质中产生绿色荧光信号。而用无关的抗HBsAg对照单抗(2G9)检测则不产生绿色荧光。

实施例4、基于9B5的夹心ELISA可以特异灵敏地检测到CA16病毒或病毒样颗粒

本发明人设计了一个基于9B5的夹心ELISA，即用50ng/孔的9B5作为捕获抗体包被ELISA板，用Biotin偶联的9B5(9B5-Biotin)作为检测抗体。图3显示，该方法可以检测到低至0.025ug/ml的CA16灭活病毒或病毒样颗粒，且对EV71灭活病毒或病毒样颗粒无任何交叉反应。因此，9B5可以作为特异性检测CA16的试剂，且检测灵敏度极高，可检测到极微量的病毒。

实施例5、单抗9B5可以用于检测病人血清中CA16特异性IgM抗体

本发明人设计了一个用于检测病人血清中CA16特异性IgM抗体的ELISA，先用抗人IgM抗体包被ELISA板以捕获人血清里的IgM，其中CA16特异性IgM将与预先制备的灭活CA16病毒/9B5抗原抗体复合物结合，通过检测9B5即可确定是否存在CA16特异性IgM。图4显示，该方法检测出5#和26#血清中的CA16-IgM抗体为阳性，与EV71特异性抗体D5检测出的38#、53#、64#和173#的EV71-IgM阳性结果没有交叉反应，与7#阴性血清也无交叉反应，表明该方法能够特异性检测CA16-IgM。

实施例6、单抗9B5的体外抗病毒活性

体外的病毒中和实验显示单抗9B5能够高效中和CA16感染，针对CA16/SZ05和CA16/G08病毒株的最低抑制浓度均为1ng/ml。

实施例7、单抗9B5的体内抗病毒活性

单抗9B5的体内抗病毒活性在CA16/G08感染小鼠模型上进行评价。在单抗的预防效果评价实验中，对照抗体(2G9)组和PBS组小鼠在攻毒后3天开始反应迟缓，第4至5天出现共济失调、腿无力症状继而出现瘫痪及死亡，存活率分别为43%和29%(图5)；而2ug和10ug剂量的9B5单抗组，不但未出现小鼠死亡，而且所有小鼠未出现任何症状(图5)，表明9B5单抗可以预防小鼠被CA16感染，预防效果极其优异。

在单抗的治疗效果评价实验中，1天治疗组中的对照抗体(2G9)和PBS处理小鼠在攻毒后四天开始反应迟缓，第5至6天出现共济失调、腿无力症状继而出现瘫痪及死亡，存活率分别为43%和29%(图6)，而注射2ug和10ug的9B5单抗均可以100%保护被CA16感染的小鼠，未出现小鼠死亡，仅个别小鼠在第7天有轻微反应迟钝症状，但很快消失(图6)；3天治疗组中，注射10ug的9B5单抗亦可以100%保护被CA16感染三天的小鼠，小鼠未出现临床症状及死亡，而对照抗体(2G9)组和PBS组小鼠却出现共济失调、腿无力症状继而出现瘫痪及死亡，存活率分别为37%和42%(图7)；在小鼠感染CA165天后，已出现二级及三级临床症状，再注射5ug/g的9B5，可以减轻其临床症状，并有85%的存活率，而对照抗体(2G9)组和PBS组小鼠却出现严重临床症状，存活率仅仅为37%和28%(图8)。

这些结果表明，9B5不仅在体外有很好的中和活性，更重要的是具有强大的针对CA16感染的体内预防和治疗作用，是进一步构建人源化单抗的理想靶标。

实施例8、单抗9B5的序列

本发明人成功克隆出了9B5单抗的轻链和重链序列，其中，9B5重链属于Igh-VJ558VH1家族，分离获得的全长重链(包括信号肽编码序列(1-57位)、可变区(58-420位)和恒定区(421-1428位))具体序列见图9；9B5轻链为IGKV12/13亚群，分离获得的全长轻链(包括信号肽编码序列(1-60位)、可变区(61-384位)和恒定区(385-702位))具体序列见图10。

9B5重链可变区核苷酸序列如下(SEQ ID NO:1)：

GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGACTTCTGGATACAC ATTCACTGAAAACACC ATGCACTGGGTGAGGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGGTATCTA TCCTAAGAATGATGATACT AAGTATAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACTTTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTGCATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGATTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGGAGATT ACGAGAATTATTTCTATGCTATGGACTAC TGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA

备注：其中使用下划线标注的为重链基因可变区中的高变区序列，依次为重链基因CDR1(SEQ ID NO:5)，CDR2(SEQ ID NO:6)，CDR3(SEQ ID NO:7)序列。

9B5重链可变区氨基酸序列如下(SEQ ID NO:2)：

EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKTSGYTFTENT MHWVRQSHGKSLEWIGGIYPKNDDT KYNQKFKGKATLTVDKSSSTACMELRSLTSEDSAVYYCARGDYENYFYAMDY WGQGTSVTVSS

备注：其中使用下划线标注的依次为重链CDR1(SEQ ID NO:8)，CDR2(SEQ ID NO:9)，CDR3(SEQ ID NO:10)序列。

9B5重链恒定区核苷酸序列如下(SEQ ID NO:17)：

GCCAAAACAACACCCCCATCAGTCTATCCACTGGCCCCTGGGTGTGGAGATACAACTGGTTCCTCCGTGACTCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTACTTCCCTGAGTCAGTGACTGTGACTTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCAGTGTGCACACCTTCCCAGCTCTCCTGCAGTCTGGACTCTACACTATGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCAAGTCAGACCGTCACCTGCAGCGTTGCTCACCCAGCCAGCAGCACCACGGTGGACAAAAAACTTGAGCCCAGCGGGCCCATTTCAACAATCAACCCCTGTCCTCCATGCAAGGAGTGTCACAAATGCCCAGCTCCTAACCTCGAGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAATATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGACACCCAAGGTCACGTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGACGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTATCCGGGTGGTCAGCACCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCATCACCCATCGAGAGAACCATCTCAAAAATTAAAGGGCTAGTCAGAGCTCCACAAGTATACATCTTGCCGCCACCAGCAGAGCAGTTGTCCAGGAAAGATGTCAGTCTCACTTGCCTGGTCGTGGGCTTCAACCCTGGAGACATCAGTGTGGAGTGGACCAGCAATGGGCATACAGAGGAGAACTACAAGGACACCGCACCAGTCCTGGACTCTGACGGTTCTTACTTCATATATAGCAAGCTCAATATGAAAACAAGCAAGTGGGAGAAAACAGATTCCTTCTCATGCAACGTGAGACACGAGGGTCTGAAAAATTACTACCTGAAGAAGACCATCTCCCGGTCTCCGGGTAAA

9B5重链恒定区氨基酸序列如下(SEQ ID NO:18)：

AKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK

9B5轻链可变区核苷酸序列如下(SEQ ID NO:3)：

GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGTATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGA AAATATTTACAGTAAT TTAGCATGGTATCAACAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAACTCCTGGTCTATGCT GCAACA AATTTAGCAGATGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTATTCCCTCAAGATCAACAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGGGACCTATTACTGTCAGCAGTTTTGGGATACTCCATTCACG TTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGCAATAAAACGG

备注：其中下划线标注的为轻链基因可变区中的高变区序列，依次为CDR1(SEQ IDNO:11)，CDR2(SEQ ID NO:12)，CDR3(SEQ ID NO:13)序列。

9B5轻链可变区氨基酸序列序列如下(SEQ ID NO:4)：

DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASENIYSN LAWYQQKQGKSPQLLVYAAT NLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGTYYCQQFWDTPFT FGSGTKLAIKR

备注：其中使用下划线标注的依次为轻链CDR1(SEQ ID NO:14)，CDR2(SEQ ID NO:15)，CDR3(SEQ ID NO:16)序列。

9B5轻链恒定区核苷酸序列如下(SEQ ID NO:19)：

GCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGT

9B5轻链恒定区氨基酸序列如下(SEQ ID NO:20)：

ADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC

为了验证所克隆的9B5单抗的基因是否正确，将重链的编码序列和轻链的编码序列分别插入到pcDNA3.1中，构建表达载体pcDNA3.1-(m9B5H)和pcDNA3.1-(m9B5L)，然后共同转染CHO细胞，并通过ELISA检测细胞上清中是否有特异性结合CA16的抗体存在。结果如图11A图所示，重组表达的单抗9B5(9B5重组表达)与从腹水纯化出的9B5(9B5腹水纯化)具有一样的效果，可以特异性识别CA16灭活病毒，而表达的对照抗体上清没有结合信号。该结果证实了所扩增和表达的序列确实是9B5抗体基因。

免疫荧光实验证实，重组表达的单抗9B5(9B5重组表达)与从腹水纯化出的9B5(9B5腹水纯化)一样可以识别感染细胞内的CA16病毒，而对照抗体则没有结合信号，如图11B所示；

通过微量中和实验发现，重组表达的单抗9B5(9B5重组表达)与从腹水纯化出的9B5(9B5腹水纯化)一样可以阻止CA16病毒感染细胞，而对照抗体则不能中和病毒而出现严重细胞病变，如图11C所示

实施例9、单抗9B5抑制病毒结合靶细胞

对照单抗2G9与CA16孵育后，不能阻止病毒结合至靶细胞上，而单抗9B5与病毒孵育后，可以呈浓度依赖性抑制病毒结合到细胞上。如图12所示。

实施例10、单抗9B5在病毒结合靶细胞后仍然能够中和病毒

本发明人还测定了病毒结合至靶细胞后单抗9B5的中和能力。在病毒结合到RD细胞上后，9B5依然可以阻止病毒感染细胞。如图13所示，3.125ug/ml的9B5可以完全阻止结合到靶细胞上的病毒感染细胞。

结论

(1)本发明获得一个针对CA16的中和性单克隆抗体，命名为9B5；

(2)单抗9B5可用于CA16病毒蛋白的特异性检测和定量；

(3)单抗9B5可用于组装CA16-IgM的检测试剂盒；

(4)单抗9B5具有强大的体内抗病毒功能，是开发抗CA16人源化单抗药物的理想靶标。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (12)

1.一种分离的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包含以下的氨基酸序列：SEQID NO:8所示的重链CDR1，SEQ ID NO:9所示的重链CDR2和SEQ ID NO:10所示的重链CDR3，SEQ ID NO:14所示的轻链CDR1，SEQ ID NO:15所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:16所示的轻链CDR3。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，包含重链可变区，所述的重链可变区具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，包含轻链可变区，所述的轻链可变区具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，包含重链可变区和轻链可变区，其重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

5.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，包含重链恒定区和轻链恒定区，其重链恒定区具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；或其轻链恒定区具有SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。

6.编码权利要求1-5任一所述的单克隆抗体的核酸分子。

7.权利要求1-5任一所述的单克隆抗体在制备用于检测、治疗和/或预防柯萨奇病毒A16型感染的药物中的用途。

8.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体中含有编码权利要求1-5任一所述的单克隆抗体的DNA。

9.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中含有权利要求8所述的表达载体。

10.一种组合物，其特征在于，它含有权利要求1-5任一所述的单克隆抗体，以及药学上可接受的载体。

11.一种检测柯萨奇病毒A16型的试剂盒，其包括权利要求1-5任一所述的单克隆抗体。

12.一种非诊断性的检测柯萨奇病毒A16型的方法，其特征在于，利用权利要求1-5任一所述的单克隆抗体与待测样品进行接触，通过检测所述的单克隆抗体与受试样品的结合情况，获得柯萨奇病毒的存在情况以及存在量。