KR101309485B1 - 비브리오 패혈증균 알티엑스에이원에 특이적인 단일클론항체, 이를 분비하는 하이브리도마 및 이를 포함하는 진단키트 - Google Patents

비브리오 패혈증균 알티엑스에이원에 특이적인 단일클론항체, 이를 분비하는 하이브리도마 및 이를 포함하는 진단키트 Download PDF

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Abstract

본 발명에 따른 하이브리도마 클론에서 생산되는 단일클론항체는 감수성 및 특이성이 우수하여, 비브리오 패혈증균 감염 여부를 신속, 정확하게 진단 및 예방과 치료 등에 매우 유용하게 사용 될 수 있다. 또한 대장균에서 발현된 재조합 단백질 RtxA1 항원은 감수성 및 특이성이 우수하여, 비브리오 패혈증균의 감염의 진단 및 예방과 치료 등에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
한편, 본 발명의 단일클론항체는 다른 종류의 비브리오 패혈증균에 대한 교차반응성이 우수할 뿐 아니라 열처리된 비브리오 패혈증균에도 결합할 수 있으므로, 검사자가 비브리오 패혈증균에 감염된 생체시료를 열처리하여 비브리오 패혈증균을 사멸시켜 감염의 위험성을 제거한 후 감염여부에 대한 진단을 수행할 수 있으므로 매우 안전하다.

Description

비브리오 패혈증균 알티엑스에이원에 특이적인 단일클론항체, 이를 분비하는 하이브리도마 및 이를 포함하는 진단키트{Monoclonal antibody specific to Vibrio vulnificus RtxA1, hybridoma producing the monoclonal antibody and diagnostic kit comprising the monoclonal antibody}
본 발명은 비브리오 패혈증균 RtxA1에 특이적인 단일클론항체, 이를 분비하는 하이브리도마 및 이를 포함하는 진단키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비브리오 패혈증균 RtxA1 및 열변성된 RtxA1에 높은 반응성을 가지며 다양한 진단법에 폭넓게 활용될 수 있는 비브리오 패혈증균 RtxA1에 특이적인 단일클론항체, 이를 분비하는 하이브리도마 및 이를 포함하는 진단키트에 관한 것이다.
비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus)은 주로 바다와 인접한 강하구에 서식하는 호염성 병원성박테리아이며 대부분의 해산물과 관련된 사망성 질환과 관련 되어있다. 비록 비브리오 패혈증균 감염증은 비교적 역사가 짧으나, 지구 온난화에 의해서 세계적으로 임상증례가 계속적으로 증가하고 있는 새로이 주목받고 있는 질환중의 하나이다. 특히 전세계적으로 절대적인 발병례는 콜레라나 살모넬라 식중독보다 적지만 높은 치사율과 비극적인 임상증상 때문에 심각한 사회적 문제를 야기하고 있다.
비브리오 패혈증균은 1976년 미국 질병통제센터 (Centers for Disease Control; 이하 CDC로 약함)의 홀리스 (Hollis)등이 11년 동안 사람에서 분리된 호염성, 병원성 비브리오 균의 세균학적 성상을 처음 보고한 이후, 유당(lactose)을 분해하는 특징 때문에 유당 분해 비브리오 (lactose-fermenting Vibrio 또는 Lac(+))라 명명되었다. 1979년 CDC의 블레이크 (Blake)등은 CDC에 보고된 39명의 환자들의 자료를 역학적으로 분석하여 임상증상에 따라 원발성 패혈증(primary septicemia)군과 창상감염(wound infection)군으로 분류하였다 (Blake, P.A., Merson, M.H., Weaver, R.E., Hollis, D.G., Heublein, P.C., N. Engl. J. Med. 300:1-6, 1979). 같은 해 파머 (Farmer)는 새로운 종으로서 Vibrio vulnificus (vulnus=wound, ficus=forming)라 명명하였으며, 오늘에 이르고 있다(Farmer, J.J. III, Lancet 2:903, 1979).
V. vulnificus 패혈증은 잠복기가 짧고, 일단 발병하면 전격적으로 진행하여 효과적 항균제 치료 타이밍을 놓치기 쉽다. V. vulnificus 패혈증은 대부분 40대 이상(약 90-95%)의 남자(90% 이상)에서 발생하며, 정상인에서는 거의 볼 수 없고, 기저질환을 가지고 있는 환자들에서 주로 발병한다. 전 세계의 발생증례를 분석해 보면 원발성 패혈증의 경우, 대부분의 환자들은 간장 질환과 음주벽 등 만성질환을 가지고 있으며, 간장 질환으로서는 간경변, 만성간염, 간암등이 주종을 이루고, 그 외 당뇨병, 폐결핵, 만성골수염, 류마티스성 관절염 등의 기저질환이 확인되었다. 그러나 5%이하에서는 특별한 기저질환을 찾을 수 없는 경우도 있다. 미국의 경우 당뇨병, 악성종양, 혈색소증 (hemochromatosis), 지중해빈혈 (thalassemia) 등의 빈도가 비교적 높게 나타난다. 최근에는 AIDS 환자들에서 V. vulnificus 패혈증의 발생보고가 나오고 있어, 미국 CDC에서는 AIDS 환자들에게 여름철에는 굴 등의 해산물을 생식하지 말 것을 권고하고 있다. 따라서, 비브리오 패혈증균의 감염을 신속히 판정하고, 질병의 빠른 확산 막고, 초기 치료의 효율성을 극대화하기 위해 감염여부를 초기에 진단할 수 있는 효과적이고 신속한 진단법의 개발이 절실히 요구된다.
1980년 중반 이후 시작 된 비브리오 패혈증균의 발변 기전 연구를 통하여 여러 가지 독력인자가 보고되었다. 즉, 용혈독소 (Kreger, A, Lockwood, D, Infect. Immun. 33:583-590, 1981), 금속단백분해효소 (Kothary, M.H., Kreger, A.S., J. Gen. Microbiol. 133:1783-1791, 1987), 포스포리파아제 A2 (Testa, J., Daniel, L.W., Kreger, A.S., Infect. Immun. 45:458-463, 1984), 다당질 협막 (Wright, A.C., Simpson, L.M., Oliver J.D., Morris, J.G., Jr., Infect. Immun. 58:1769-1773, 1990), 시데로포어 (Simpson, L.M., Oliver, J.D., Infect. Immun. 41:644-649, 1983), RtxA1 (Kim YR, Lee SE, Kook H, Yeom JA, Na HS, Kim SY, Chung SS, Choy HE, Rhee JH. Cell Microbiol 10:848-862, 2008)등이 알려져 있다. 이 중 RtxA1은 비브리오 패혈증균 감염초기에 분비되는 주요한 독력인자로 써, 장을 통한 혈액으로 비브리오 패혈증균의 전파와 세포의 사멸에 중요한 역할을 하고 있다. 이는 RtxA1이 초기 감염의 새로운 진단법과 치료제 개발에 유용한 표적임을 보여 주고 있다.
비브리오 패혈증의 조기 진단을 위해, 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용한 박테리아 핵산 검출법이 이용되어 왔다. 그러나 중합효소연쇄반응을 이용한 핵산 검출법은 초기 감염을 효율적으로 진단할 수 있지만, 상대적으로 비싸고 숙련된 전문 인력과 고가의 실험시설을 요구한다. 더욱이 중합효소반응을 이용한 핵산 진단법의 고도의 특이성 때문에 다양한 비브리오 패혈증균주를 진단하는 되는 한계가 있다. 따라서, 감염의 조기 진단과 위에서 언급한 문제점 해결을 위하여, 특이적인 항원에 대한 단일클론 항체의 생산 및 이를 이용한 진단제에 대한 개발의 요구가 지속되어 왔다.
나아가, 비브리오 패혈증을 진단하기 위해 환자로부터 샘플을 채취하여 분석하는 경우 검사 및 처리과정에서 검사자가 비브리오 패혈증에 감염되는 경우가 발생하는 문제가 있었다.
본 발명은 상술한 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 첫번째 해결하려는 과제는 비브리오 패혈증균 RtxA1에 특이적으로 결합하며 높은 교차반응성 및 열변성 RtxA1에도 결합할 수 있는 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 두번째 해결하려는 과제는 본 발명의 단일클론항체를 포함하는 진단키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 첫번째 과제를 해결하기 위하여 수탁번호 KCLRF-BP-00261의 하이브리도마 세포 및 수탁번호 KCLRF-BP-00262의 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 비브리오 패혈증균 RtxA1 항원 및 열처리된 비브리오 패혈증균 RtxA1 항원에 결합하는 단일클론항체를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 비브리오 패혈증균 RtxA1 항원의 3491번 내지 3980번 아미노산 부위에 결합할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상술한 단일클론항체를 포함하는 비브리오 패혈증균 검출을 위한 조성물을 제공한다.
본 발명의 두번째 과제를 달성하기 위하여 상술한 단일클론항체를 포함하는 비브리오 패혈증균 검출을 위한 진단키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단일클론항체를 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 비브리오 패혈증균을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 단일클론항체를 열처리된 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 비브리오 패혈증균을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 검출은 ELISA 또는 웨스턴 블롯일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 항체를 포함하는 비브리오 패혈증 치료제일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, (A) 비브리오 패혈증균 RtxA1 항원 유래의 서열번호 6의 재조합 단백질 또는 그 융합단백질을 사용하여 생쥐를 면역화하는 단계; (B) 상기 면역화된 생쥐의 비장 세포를 마이엘로마 세포와 융합하여 배양하는 단계; (C) 상기 융합된 하이브리도마 세포에서 비브리오 패혈증균 RtxA1 항원에 결합하는 단일 클론항체를 생산하는 수탁번호 KCLRF-BP-00262의 하이브리도마 세포를 선별하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 하이브리도마 세포의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 명세서에서 사용된 용어에 대해 간략히 설명한다.
별도로 설명되어 있지 않다면, 용어 '핵산(nucleic acid)'은 단일- 또는 이중나선 형태에서 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드를 가리키고, 자연 발생하는 뉴클레오타이드와 비슷한 방식에서 핵산과 결합하는 본래 뉴클레오
타이드의 알려진 유사체들을 포함하며, 특별한 언급이 없는 한, 특정 핵산 서열은 그들의 상보적 서열을 포함한다.
'작동적으로 결합된(operatively linked to)'은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독 과정을 조절하게 된다.
세포와 관련하여 사용되는 용어 '재조합(recombinant)'은 세포가 이형의 핵산을 복제하거나 이형의 핵산에 의해 코드화되는 펩타이드 또는 단백질을 발현하는 것을 가리킨다. 또한 재조합 세포는 세포의 본래 형태에서 발견되는 유전자를 발현시킬 수 있으나, 변형된 유전자가 인공적인 방법에 의해 세포로 재도입 되어지기도 한다.
'프라이머'는 합성 또는 자연의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머는 주형에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합체의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용한다. 증폭의 최대 효율을 위하여, 바람직하게는 프라이머는 단일쇄이다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명의 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 펩타이드 핵산(PNA)(M. Egholm et al.,Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-,프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.
'벡터'는 외래 유전자를 숙주 세포 내로 안정적으로 운반할 수 있는 운반체로서의 DNA 분자를 말한다. 유용한 벡터가 되기 위해서는 복제될 수 있어야 하며, 숙주 세포 내로 유입할 수 있는 방안을 갖추어야 하고, 자신의 존재를 검출할 수 있는 수단을 구비하여 한다. 여기서 외래 유전자는 비브리오 패혈증균 RtxA1 항원의 3491-4701 아미노산 부위를 코딩하는 서열 또는 상기 서열의 말단에 정제를 용이하게 하기 위하여 His-tag 서열을 부가한 서열을 의미한다.
'플라스미드'는 일반적으로 외래 유전자가 숙주 세포에서 발현될 수 있도록 벡터에 작동적으로 연결되어 형성된 환상의 DNA 분자를 말한다. 그러나, 플라스미드는 목적하는 유전자를 포함하는 플라스미드를 작제하기 위해 유전자 재조합에 의해 특정한 제한 효소에 의해 분해되고 새로운 유전자를 도입하는 벡터로 사용될 수 있다. 따라서, 본원에서는 플라스미드와 벡터는 상호교환적으로 사용되며, 유전공학 분야에 통상의 지식으로 가진 자라면 그들의 명칭을 구분하지 않더라도 그 의미를 충분히 이해할 것이다.
"융합단백질"은 추후 단백질 정제의 편의를 위하여 C-말단에 His-tag를 부착하고 있는 비브리오 폐증균 RtxA1을 의미한다. 따라서 본 발명에서 "융합단백질"이라 표현하였지만, 그것이 반드시 His-tag가 부착된 것을 의미하는 것이 아니며, 단백질 정제의 불편함을 감수한다면 융합단백질을 사용하지 않을 수도 있다. 그러므로 본 발명에서 "재조합 비브리오 폐증균 RtxA1"란 용어는 "비브리오 폐혈증균 RtxA1" 또는 "정제의 편의를 위한 사슬이 N-말단 또는 C-말단에 부가된 비브리오 폐혈증균 RtxA1"의 약칭으로 정의된다.
본 발명의 용어 ‘단일클론항체’란 당해 분야에 공지된 용어로서 단일 항원성 부위(에피토프)에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 통상적으로, 상이한 에피토프들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론항체와는 다르게, 단일클론항체는 항원상의 단일 에피토프에 대해서 지시된다. 단일클론항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 하이브리도마의 배양에 의해 생산되기 때문에 다른 면역글로블린에 의해 오염되지 않는 또 다른 장점을 갖는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "생물학적 시료"란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 뇨, 분비물 등을 포함한다. 이들 생물학적 시료를 열처리하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 항체와 반응시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항원-항체 복합체"는 생물학적 시료중의 비브리오 폐증균 RtxA1의 발현 여부를 확인하기 위하여 반응시킨 상기 비브리오 폐증균 RtxA1 단백질과 단일클론항체의 결합물을 의미한다.
본 발명에 따른 재조합 RtxA1(3491-4701)은 비브리오 폐혈증균 RtxA1의 단일클론항체 생성에 매우 유용한 재조합 RtxA1 단백질 항원을 제공한다. 또한 이는 비브리오 폐혈증균 RtxA1을 이용한 진단에 매우 유용한 재조합 RtxA1(3491-4701)단백질 항원을 제공하고, 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질 항원의 대량발현 및 정제가 용이하게 한다.
본 발명에 따른 하이브리도마 클론에서 생산되는 단일클론항체는 감수성 및 특이성이 우수하여, 비브리오 패혈증균 감염 여부를 신속, 정확하게 진단 및 예방 등에 매우 유용하게 사용 될 수 있다. 또한 대장균에서 발현된 재조합 단백질 RtxA1 항원은 감수성 및 특이성이 우수하여, 비브리오 패혈증균의 감염의 진단 및 예방 등에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
한편, 본 발명의 단일클론항체는 다른 종류의 비브리오 패혈증균 RtxA1에 대한 교차반응성이 우수할 뿐 아니라 열처리된 비브리오 패혈증균에도 결합할 수 있으므로, 검사자가 비브리오 패혈증균에 감염된 생체시료를 열처리하여 비브리오 패혈증균을 사멸시켜 감염의 위험성을 제거한 후 감염여부에 대한 진단을 수행할 수 있으므로 매우 안전하다.
도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 재조합 RtxA1 (3491-4701)을 도입된 재조합 RtxA1 (3491-4701)발현벡터의 개열지도이다.
도 2A는 비브리오 패혈증균의 재조합 RtxA1 (3491-4701)의 발현과 정제 과정을 10% SDS-PAEG로 확인한 결과를 나타낸다.
도 2B는 정제된 재조합 RtxA1 (3491-4701)단백질의 특이성을 면역블롯으로 분석한 결과이다
도 3은 정제된 5RA 단일클론 항체를 10% SDS-PAEG로 분석한 결과이다.
도 4A는 형질전환 대장균에서 발현된 재조합 RtxA1(3491-4701) 조각 단백질을 모식적으로 보여주고 있다
도 4B는 재조합 RtxA1(3491-4701) 조각 단백질의 발현을 10% SDS-PAEG로 확인한 결과를 나타낸다.
도 4C는 발현된 재조합 RtxA1 (3491-4701) 조각 단백질의 특이성을 면역블롯으로 분석한 결과이다
도 5는 야생종 비브리오 패혈증균에 대한 단일클론 항체 (1RA, 5RA, 11RA)의 반응성 분석을 면역블롯으로 분석한 결과이다.
도 6은 단일클론항체 (5RA와 11RA)의 여러 비브리오 패혈증균 균주에 대한 교차반응을 면역블롯으로 분석한 결과이다.
도 7은 비브리오 패혈증균에 감염된 세포에서 단일클론 항체(1RA, 4RA, 5RA, 11RA)의 반응성 분석을 면역형광항체법으로 분석한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명자들은 비브리오 감염초기에 분비되는 특이적인 독소 항원으로 판정된, 대장균에서 발현된 재조합 RtxA1 항원을 면역원으로 이용하여 마우스에 면역시키고, 면역된 마우스의 비장세포와 B-임프아세포(B-lymphoblast)인 P3X63Ag8.653가 융합된 하이브리도마 클론을 제조하고 이로부터 비브리오 패혈증균 RtxA1 항원에 대한 단일클론 항체를 생산함으로 써 본 발명을 완성하였다. 본 발명에 따른 단일클론 항체는 비브리오 패혈증균 RtxA1 항원에 대해 우수한 반응성을 보였다. 특히 일부 단일클론 항체는 열변성 RtxA1 항원과 여러 비브리오 패혈증균주에 대한 교차반응을 나타냈다. 이는 본 발명의 단일클론 항체가 간접면역형광항체,면역블롯법 및 효소면역항체법 등의 다양한 진단법에 이용 가능한 진단용 항체임을 보여 주고 있다. 또한 본 발명의 단일클론 항체는 독력인자 RtxA1의 중화 항체로 이용이 가능하므로 치료제로 사용될 수 있다.
한편, 재조합 RtxA1 단백질을 면역원으로 이용하여 융합된 하이브리도마 세포 10개에서 생산된 각각의 단일클론항체들은 비브리오 패혈증균의 RtxA1의 아미노산 결합부위에 따라 3491번 ~ 3980번째 아미노산에 결합하는 단일클론항체들, 3981 ~ 4380번째 아미노산에 결합하는 단일클론항체들 및 4381 ~ 4701번째 아미노산에 결합하는 단일클론항체들로 분류할 수 있다. 이 중 이소타입에 따른 대량생산가능성, 열변성 항원에 대한 반응성 및 RtxA1 항원과의 친화도 및 다른 종류의 비브리오 패혈증균에 대한 교차가능성 등을 종합하면 5RA(3981 ~ 4380번째 아미노산에 결합), 11RA(3491번 ~ 3980번째 아미노산에 결합 가 가장 우수한 효과를 나타내었다. 따라서, 상기 5RA는 한국세포주연구재단(Korean Cell Line Research Foundation)에 기탁번호 KCLRF-BP-00261로 기탁하고, 11RA는 기탁번호 KCLRF-BP-00262로 기탁하였다(표 1 참조).
단일클론항체는 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있는 융합 방법(fusion method)에 의해 만들어질 수 있다(Kohler et al., European Journal of Immunology 6;511-519). 일반적으로, 단일클론항체를 분비하는 하이브리도마 세포는 항원 단백질을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 면역 세포와 암 세포주를 융합함으로써 만들어진다. 이런 두 집단의 세포 융합은 폴리에틸렌글리콜과 같이 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있는 방법을 이용하여 융합시키고 항체 생산 세포를 표준적인 배양 방법에 의해 증식시킬 수 있다. 한계 희석법(limited dilution)에 의한 서브 클로닝을 실시하여 균일한 세포 집단을 수득하고 난 뒤 항원에 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포를 시험관 또는 생체 내에서 대량으로 배양할 수 있다.
본 발명의 단일클론항체는 정제하지 않은 상태로 사용될 수 있으며, 또한 다양한 통상의 방법, 예를 들면 투석, 염 침전, 이온교환크로마토그래피, 크기배제크로마토그래피, 친화성크로마토그래피 등을 이용하여 고순도로 정제하여 사용될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 서열번호 4의 비브리오 패혈증균 RtxA1 단백질을 코딩하는 서열번호 3으로 표시되는 서열을 주형으로 하고 비브리오 패혈증균 RtxA1의 아미노산 서열 중 3491번 ~ 4701번 위치의 아미노산 부위를 선택적으로 증폭하기 위하여 신규한 프라이머 서열인 서열번호 1 및 2의 전방 및 후방 프라이머로 하여 PCR을 수행한다. 그 뒤 상기 증폭된 비브리오 패혈증균 RtxA1의 아미노산 서열 중 3491번 ~ 4701번 위치의 아미노산을 코딩하는 서열(서열번호 5) 또는 상기 서열의 말단에 정제를 용이하게 하기 위하여 통상의 His-tag 서열을 첨가한 서열을 플라스미드 벡터에 삽입하고 이를 숙주세포에 형질전환한다. 이후 발현된 단백질을 정제하고 이를 마우스의 복강에 주사한 후 비장세포를 적출하여 이를 마이엘로마 세포와 융합하고 이를 배양하여 다수개의 하이브리도마 세포를 수득한다. 이후 상기 하이브리도마 세포에서 생산된 단일클론항체들에 대하여 대량생산 가능성, 교차반응성 및 열처리된 비브리오 패혈증균 RtxA1 단백질의 결합능 등을 종합적으로 평가하고 가장 우수한 5RA, 11RA를 한국세포주연구재단에 각각 KCLRF-BP-00261 및 KCLRF-BP-00262로 기탁하였다. 이렇게 생산된 11RA 단일클론항체는 비브리오 패혈증균 RtxA1의 아미노산 서열 중 3491번 ~ 3980번째 아미노산 부위에 특이적으로 결합할 수 있다.
단일클론항체를 분비하는 하이브리도마는 이를 시험관 내에서 또는 생체 내에서 대량으로 배양할 수 있다. 상기한 하이브리도마가 생산하는 단일클론항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해 서는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 95% 이상)로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 투석, 염 침전, 크로마토그래피 등의 정제방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액(ascites fluid)으로부터 분리될 수 있다.
본 발명의 단일클론항체는 항원과 결합하여 그 작용을 억제하거나 중화 (neutralization)시키며, 나아가 병원체와 병원체에 감염된 세포를 죽일 수 있다. 예를 들어, 비브리오 폐혈증균의 독소부분인 RtxA1를 특이적으로 인식하는 단일클론항체는 이에 결합하여 그 작용을 억제하거나 중화할 수 있고, 항원과 결합된 항체는 보체를 활성화시킬 수 있으며, 활성화된 보체에 의하여 항원이 제거되도록 할 수 있다. 또한, 단일클론항체는 항원에 결합하여 그 항원이 식균세포에 의하여 더욱 잘 잡아먹히게 만들 수도 있다. 또한, 단일클론항체가 결합되어 있는 항원 세포는 자연살해세포(NK cell)에 의해 보다 쉽게 살해당함으로써, 상기 단일클론항체를 면역반응을 통한 항원과 이 항원을 생성하는 비브리오 패혈증균의 제거에 이용할 수 있다. 따라서, 항체 자체만으로 면역반응을 통한 항원 및 비브리오 폐혈증균의 제거와 감소의 결과를 기대할 수 있어 본 발명의 항체는 비브리오 폐혈증균의 진단 또는 치료에 사용할 수 있다.
당업자라면, 본 발명에 따른 단일클론항체가 인체에 적용하기 위해 면역원성을 감소시킨 카이메릭 항체, 인간화 항체 및 인간 단일클론항체로 전환될 수 있음을 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 이러한 카이메릭 항체는 본 발명의 단일클론항체의 가변 영역을 인간 항체의 불변 영역과 재조합시킨 것이고, 인간화 항체는 본 발명의 단일클론항체의 가변 영역에서 항원과 직접적으로 결합하는 상보성 결정 영역(complementarity determining regions : CDRs) 또는 상보성 결정 영역 중에서도 항원 결합 특이성에 관여하는 아미노산 잔기들(specificity determining residues : SDRs)만을 인간 항체에 이식시킨 것이다.
인간 항체는 본 발명의 단일클론항체의 가변 영역 중 중쇄 가변영역이나 경쇄 가변영역을 인간 항체의 중쇄 가변영역이나 경쇄 가변영역대신 치환하고, 그 결과 항원결합능을 나타내는 하이브리드(hybrid: 생쥐 중쇄/인간 경쇄 혹은 생쥐 경쇄/인간 중쇄) 항체로부터 생쥐 중쇄 가변영역이나 경쇄 가변영역을 다시 인간 중쇄 가변영역이나 경쇄 가변영역으로 치환하여 항원결합능을 나타내는 완전 인간 항체 가변영역을 골라낸 후 이를 인간 항체불변영역과 연결시키는 등의 공지의 방법을 사용하여 본 발명의 단일클론항체로부터 용이하게 제조가능하며, 이러한 변이체가 본 발명의 범위에 속함은 당연하다. 위와 같이 제조된 카이메릭 항체, 인간화항체 및 인간 단일클론항체는 공지의 방법을 사용하여 동물세포에서 생산할 수 있다.
또한 본 발명의 단일클론항체는, 상기한 바와 같은 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편으로서 비브리오 폐혈증 치료 및 진단에 사용될 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 본 발명은 상기한 단일클론항체를 포함하는 비브리오 패혈증 진단 키트를 제공한다. 본 발명의 비브리오 패혈증의 검출을 위한 진단키트에 사용되는 단일클론항체는, 이 항체가 비브리오 패혈증균의 RtxA1 항원을 선별적으로 인지할 수 있는 한, 단일클론항체의 단편도 사용할 수 있다. 이러한 항체 단편은 F(ab')2, Fab, Fab', Fv 단편 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 비브리오 패혈증 진단키트에는 RtxA1 항원을 선별적으로 인지하는 단일클론항체 또는 이의 단편 및 면역학적 분석에 사용되는 도구/시약이 포함될 수 있다.
면역학적 분석에 사용되는 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제 등이 포함될 수 있다. 또한, 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.
적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소
수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 항원-항체 복합체 형성에 대한 검출 방법 및 진단키트에 사용하기 위한 검정 시스템은, 이에 한정되는 것은 아니나, ELISA 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피 시험 스트립 및 방사 분할 면역검정 디바이스, 및 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 등을 포함한다. 바람직하게는 항원-항체 복합체 형성은 조직면역 염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법 (ELISA), 웨스턴 블럿(Western Blotting), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법(Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip)등이 있으며 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 단일클론항체를 포함하는 약학 조성물은 이미 사용되고 있는 항히스타민제, 소염진통제 및 항생제 등의 약제와 함께 제제화하거나 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
<실시예 1> 비브리오 패혈증균의 재조합 RtxA1 합성을 위한 올리고 뉴클레오타이드 합성
NheI 및 XhoI 제한효소 인식부위를 갖는 하기 2개의 올리고 뉴클레오타이드를 합성하였다. 또한 RA-4701R 올리고 뉴클레오타이드는 재조합 RtxA1의 정제 과정 중 히스티딘-결합 레진을 이용한 크로마토그래프에 의한 정제과정을 추가 포함하기 위하여 6개의 히스티딘을 포함하고 있다.
RA-3491F: 5'-ACATGAATTCATGCAGAGAAGTTTGGCGACTAC-3' (서열번호: 1, 전방 프라이머)
RA-4701R: 5'-CTCCTCGAGCTAATGATGATGATGATGATGCACCGTTATACCCTTTTTATG-3' (서열번호: 2, 후방 프라이머)
상기 뉴클레오티드를 후속하는 비브리오 패혈증균 RtxA1 유전자의 증폭 (하기 실시예 2) 및 재조합 RtxA1 단백질 생산을 위한 재조합벡터의 제조에 이용하였다.
<실시예 2> 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction (PCR))
중합효소 및 상기 실시예 1에서 합성한 전방 프라이머(서열번호 1) 및 후방 프라이머(서열번호 2)를 혼합한 반응용액에 비브리오 패혈증균 RtxA1 전장 DNA(서열번호 3, 14106bp)를 주형 (template)으로 혼합하여 중합효소연쇄반응을 수행하여 비브리오 패혈증균 RtxA1의 아미노산 서열 3491부터 4701부분을 증폭(RtxA1(3491-4701)로 명명함)하였다. 서열번호 4는 전장 비브리오 패혈증균 RtxA1의 아미노산 서열이다. 중화연쇄반응을 위하여 써멀 싸이클러 (Thermal cycler(PTC-100), MJ Research. Inc, 미국)를 사용하였으며 94℃에서 3분간 사전변성 (predenaturation) 시킨 후, 94℃에서 1분간 변성(denaturation), 55℃에서 1분간 결합(annealing), 및 72℃에서 4분간 연장 (extension)을 30회 반복 실시하고, 마지막으로 72℃에서 10분간 추가반응시켰다. 다음 중합효소와 비특이 증폭산물을 제거하기 위해 아가로즈 겔에서 전기영동 후 목적하는 원하는 증폭산물 밴드 부위를 조각내어 겔 추출 키트 (Geneall, 한국)를 이용하여 정제하였다.
<실시예 3> 재조합 RtxA1 제조용 벡터의 제작
도 1의 개열지도를 갖는 재조합 RtxA1 플라스미드 벡터를 제작하였다. 구체적으로, 상기 실시예 2에서 정제된 C-말단에 His-tag 서열인 CATCATCATCATCATCAT이 삽입 된 RtxA1(3491-4701)의 증폭산물을 EcoRI (Fermentas, 캐나다)으로 절단 후 대장균 중합효소인 Klenow (New England Biolab, 미국)을 이용하여 절단면을 채우고 (fill in), XhoI (Fermentas, 캐나다)으로 절단하였다. 또한 pET-21(a) (Novagen, 미국) 벡터는 NheI (Fermentas, 캐나다)으로 절단 후 대장균 중합효소인 Klenow (New England Biolab, 미국)을 이용하여 절단면을 채우고 (fill in), XhoI (Fermentas, 캐나다)으로 절단하였다. 절단된 단편과 벡터는 상기 실시예 2에서 이용된 겔 추출 키트 (Geneall, 한국)를 이용하여 정제한 후 정제된 RtxA1 유전자 단편 1 μg과 pET-21(a) 단편 30 ng을 혼합하고, 10배 농도의 접합 농축액 (10 mM DTT, 100 mM MgCl2, 10 mM ATP, 600 mM Tris-HCl, pH7.5) 1 ㎕ 및 T4 DNA 연결효소 (ligase, Takara) 10 단위 (unit)를 가하여 전체 부피를 10 ㎕로 조정하고 상온에서 16시간 반응시켜, pET-21(a) 벡터에 재조합 RtxA1 유전자(서열번호 5+His-tag 서열)가 삽입된 9,027bp의 도 1의 개열지도를 갖는 환형 플라스미드 (pET-RtxA1(3491-4701)로 명명)를 제조하였다. 다음 플라스미드를 증폭하고, RtxA1(3491-4701) 유전자(서열번호 5)가 삽입된 pET-RtxA1(3491-4701)만을 순수분리하기 위해 대장균 DH5α (Invitrogen, 미국)에 삽입하였다. 형질전환된 대장균으로부터 재조합 pET-RtxA1(3491-4701)을 재추출한 후 DNA 염기서열 분석과 제한효소 처리하고 아가로스 겔 전기영동을 실시하여 pET-RtxA1(3491-4701)에 비브리오 패혈증균 RtxA1(3491-4701) 유전자의 존재유무를 확인하였다.
<실시예 4> 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질의 발현
상기 실시예 3에서 제조한 재조합 RtxA1 벡터 pET-RtxA1(3491-4701)의 발현을 위해 대장균 BL21(DE3)/pLy S (Invitrogen, 미국)에 삽입하였다. 형질전환 된 대장균을 37℃ 진탕 배양기에서 4시간 배양한 후 1mM IPTG을 첨가하여 다시 3시간을 더 배양하였다. 이렇게 배양한 형질전환된 대장균을 8,000 rpm에서 30분간 원심분리한 후, 대장균침전물은 용출완축액 (300 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl(pH 7.5), 10% glycerol, 0.1% Tween-20)으로 현탁하였다. 단백질 추출을 위해 현탁된 대장균침전물을 초음파분쇄기 (sonicator)를 이용하여 파쇄한 후 원심분리에 의해 상등의 단백질 추출액을 수집하고, 세포 파쇄액에 대해 10% SDS-PAGE를 실시하였다 (도 2A). 도 2A에서 분자량은 도 2A의 오늘 쪽에 표시되어 있고, 제 1과 2 레인은 각각 재조합 RtxA1 벡터 pET-RtxA1(3491-4701)로 형질전환된 대장균에서 재조합 RtxA1 단백질를 발현하기 전과 후 추출된 단백질이다.
화살표는 발현된 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질의 위치를 나타낸다. 도 2A에서 확인되는 바와 같이 pET-RtxA1(3491-4701)로 형질전환된 대장균에서 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질이 발현됨을 알 수 있다.
<실시예 5> 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질의 정제
재조합 RtxA1(3491-4701) 제조용 벡터 pET-RtxA1(3491-4701)으로 형질전환된 대장균에서 상기 실시예 4의 방법으로 단백질을 추출한 후, Ni-NTA 크로마토그래피 (Qiagen, 미국)를 제조자의 지시에 따라 이용하여 단백질 추출액으로부터 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질을 1차적으로 정제하였다. Ni-NTA 크로마토그래피를 이용하여 1차 정제한 재조합 RtxA1(3491-4701)단백질을 겔 여과 액체크로마토그래피(size exclusion-HPLC) (GE Healthcare, 미국)을 이용하여 2차적으로 순수 정제하여 재조합 RtxA1(3491-4701)단백질(서열번호 6+His-tag) 을 생산하였다. 정제 양상과 정제 효율은 SDS-PAGE를 실시하여 확인하였다 (도 2A). 도 2A에서 레인 3와 4는 각각 Ni-NTA 크로마토그래피와 겔 여과 액체크로마토그래피에서 정제된 단백질이고, 화살표는 정제된 재조합 RtxA1 (3491-4701) 단백질의 위치를 나타낸다. 도 2A의 레인 4에서 확인되는 바와 같이 정제된 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질은 98%의 순도를 보였다.
<실시예 6> 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질의 특이성 분석
상기 실시예 5에서 확인된 130 kDa의 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질과 대조군 우혈청알부민(BSA) 단백질을 SDS-PAGE를 실시하고, 전기영동 종료 후 겔 상 단백질을 토우빈 (Towbin)의 (Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Proc Natl Acad Sci USA 1979; 76:4350-4354)방법에 따라 Nitrocellulose 막 (Bio-Rad)으로 옮겼다. 단백질이 이적된 막을 5% 탈지유 (skim milk)가 함유된 인산완충용액으로 비특이반응을 차단하였다. 여기에 실시예 7의 재조합 RtxA1 항원단백질을 Sigma adjuvant와 동량(부피비로 1:1)으로 혼합한 다음 3주 간격으로 4차례 BALB/C(암컷, 8 주령) 마우스의 복강에 200㎕씩 주사한 후 한 달 후 마우스 혈청에서 얻은 비브리오 폐혈증균 RtxA1 단백질에 대한 다클론항체(polyclonal antibody)를 1:1000으로 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응시키고, 퍼옥시다제로 표지된 IgG (Jackson labatory, 미국) 2차 항체를 제조사의 지시에 따라 희석하여 사용하였다. 1차와 2차 항체로 반응시킨 후에는 인산완충용액으로 3회에 걸쳐 세척하였다. 2차 항체반응 및 세척이 끝난 막에 ECL 웨스턴 블럿 (western blot) 기질액 (Amersham, 미국)을 처리하고, 발광영상분석기(LAS-1000 luminescent image analyzer; Fujifilm, 일본)를 이용하여 결과를 분석하였다 (도 2B). 도 2B서 제 1 레인은 대조군 우혈청알부민(BSA) 단백질이고, 레인 2은 제조합 RtxA1(3491-4701) 단백질이다. 도 2B에서 확인되는 바와 같이 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질은 비브리오 패혈증균 RtxA1 단백질에 대한 항체에 대해서 양성반응을 보이나, 대조군 우혈철알부민은 반응하지 않았다. 따라서, 실시예 5에서 순수 정제된 130 kDa의 재조합 단백질은 RtxA1(3491-4701) 단백질임이 확인되었다.
결국, 본 발명에 따른 재조합 RtxA1(3491-4701)은 비브리오 폐혈증균 RtxA1의 단일클론항체 생성에 매우 유용한 재조합 RtxA1 단백질 항원을 제공한다. 또한 이는 비브리오 폐혈증균 RtxA1을 이용한 진단에 매우 유용한 재조합 RtxA1(3491-4701)단백질 항원을 제공하고, 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질 항원의 대량발현 및 정제가 용이하게 한다. 따라서 이와 같은 형질전환 대장균에서 발현된 재조합 RtxA1(3491-4701)단백질은 비브리오패혈증균에 대한 진단제 또는 진단키트, 비브리오 패혈증 예방 또는 치료용 백신의 제조, 및 비브리오 패혈증균에 대한 항체 생산 등에 이용될 수 있다.
<실시예 7> 단일클론 항체 생산 세포주 제작을 위한 마우스 면역
실시예 5에서 제조된 RtxA1(3491-4701) 재조합 항원단백질(서열번호 6+His tag)을 Sigma adjuvant(Sigma, 미국)와 동량(부피비로 1:1)으로 혼합한 다음 3주 간격으로 4차례 BALB/C(암컷, 8 주령) 마우스의 복강에 200㎕씩 주사하였다. 4번째 면역 후 한 달 후 꼬리 정맥으로 정제된 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질을 투여한 3일 후에 비장을 적출하여 세포융합에 사용하였다.
<실시예 8> B-임프아세포(B-lymphoblast)인 P3X63Ag8.653 배양
세포융합하기 4~5일 전에 질소통에서 myeloma 세포인 P3X63Ag8.653 (ATCC accession number CRL-1580)를 꺼내 10% 우태아혈청이 첨가된 IMDM(Invitrogen, 미국) 배지에 현탁시키고 1,000rmp에서 5분간 원심분리하였다. 상층액을 버리고 침전세포를 조심스럽게 10% 우태아혈청이 첨가된 IMDM에 다시 현탁시켜 5% 탄산가스가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였다.
<실시예 9> 세포융합
세포융합은 폴리에틸렌글리콜을 사용하는 일반적인 방법 (Ed Harlow, David Lane : Antibodis, A laboratory manual. Cold Springs Harbor press, 1988 P139-244)에 따라 다음과 같이 실시하였다. 실시예 7에서 적출한 비장에서 비장세포들(splenocytes)을 cell strainer(Falcon, 미국)를 이용하여 분리하고 1x108 세포/㎖의 농도로 희석하였다. 1x107 세포/㎖의 myeloma 세포와 1㎖의 PEG1500(Sigma, 미국)을 동량으로 혼합하여 융합시켰다. 융합이 완료된 세포를 200㎖의 HAT(Sigma, 미국) 배지에 희석시킨 후 96 웰 마이크로플레이트에 100 ㎕씩 분주하고, 5% 탄산가스가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였다.
<실시예 10> 세포융합 하이브리도마에서 RtxA1(3491-4701)항체생성 조사
융합된 세포의 항체 생성 여부는 대장균에서 발현된 재조합 RtxA1(3491-4701) 항원과 융합된 세포 배양액을 이용하여 ELISA를 실시하여 조사하였다. 재조합 RtxA1(3491-4701) 항원 단백질을 탄산염 완충액 (carbonate buffer) (pH 9.4)으로 10 ㎍/㎖ 농도로 희석한 다음 Maxisorp ELISA 플레이트 (Nunc, 미국)의 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고, 4℃에서 16시간 반응시켜 항원을 코팅하였다. 항원이 코팅된 각 웰에 1% BSA 가 포함된 블러킹완충용액 (PBS, 0.05% Tween-20, 1% BSA, 3% 열 비활성 말 혈청)을 처리하여 37℃에서 1시간 동안 비특이 반응을 차단하였다. 각 웰에 융합된 세포배양액을 50 ㎕씩 첨가하고, 4℃에서 1 시간 반응한 다음 세척완충용액(PBS, 0.05% Tween-20, 0.05% BSA)으로 3회 세척하였다. 세척 후 1:1000배 희석한 Biotin-축합 항-마우스 IgG+IgA+IgM 항체 (1:2,000; Sigma, 미국)를 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 1 시간 반응시킨 다음 세척완충용액으로 3회 세척하였다. 세척 후 HRP (Horseradish peroxidase)-축합 streptavidin (Invitrogen, 미국)를 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 1 시간 반응시킨 후 다시 세척완충용액으로 3회 세척한후 연이어 TMB (3,3',5,5' - tetramethyl-benzidine) (Sigma, 미국) 기질용액을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하고 암소에서 30분간 반응시켜 발색한 후 2N H2SO4를 처리하여 효소반응을 정지시켰다. 반응 후 ELISA 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과 비브리오 패혈증균 RtxA1(3491-4701) 항원과 반응하는 10개의 하이브리도마를 얻었다 (표 1).
<실시예 11> 하이브리도마 세포의 클로닝
융합된 10개의 하이브리도마 세포의 클로닝을 위하여 실시예 5에서 얻은 비브리오 패혈증균 RtxA1(3491-4701) 항원과 반응하는 하이브리도마를 96 웰 플레이트의 첫 번째 웰에 약 10개의 세포가 들어가도록 세포 부유액을 넣은 후 행으로 2배 단계 희석하고, 이를 다시 열로 2배 단계 희석하는 방법으로 2회 클로닝 하였다. 선별 된 하이브리도마 클론은 30% 우태아 혈청과 7.5% DMSO (dimethyl sulfoxide)가 함유된 IMDM배지에 현탁시켜 액체질소에 보관하였다.
<실시예 12> 단일클론 항체의 정제
항체를 생성하는 클로닝된 10개의 하이브리도마 세포를 37℃, 5% 탄산가스 항온기에서 배양 후 상등액에서 항체를 정제하였다. 항체의 정제는 단백질 A 또는 G 크로마토그래피(Peptron, 한국)를 이용하였으며, 실험과정은 제조사의 방법에 따라 수행하였다. 정제 후 SDS-PAGE를 실시하여 정제도가 98%이상임을 알 수 있었다 (도 3). 도 3의 1레인에는 단백질표준 분자량 표지되어 있고, 레인 2은 단백질 A 크로마토그래피에서 정제된 항체를 보여 준다.
<실시예 13> 이소타이핑에 의한 단일클론 항체의 선별
선별된 10개의 하이브리도마 클론으로부터 단일클론 항체의 이소타입 (isotype)의 결정은 ELISA를 실시하여 조사하였다. 이소타입 결정을 위하여, 토끼에서 생선 된 각각의 mouse 이소타입에 대한 정제된 항체가 탄산염 완충액 (carbonate buffer) (pH 9.4)로 10 ㎍/㎖ 농도로 희석한 다음 Maxisorp ELISA 플레이트 (Nunc, 미국)의 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고, 4℃에서 16시간 반응시켜 항체를 코팅하였다. 각각의 이소타입 항체가 코팅된 각 웰에 1% BSA가 포함된 블러킹완충용액 (PBS, 0.05% Tween-20, 1% BSA, 3% 열 비활성 말 혈청)을 처리하여 37℃에서 1시간 동안 비특이 반응을 차단하였다. 각 웰에 융합된 세포배양액을 50 ㎕씩 첨가하고, 4℃에서 1 시간 반응한 다음 세척완충용액(PBS, 0.05% Tween-20, 0.05% BSA)으로 3회 세척하였다. 실세척 후 1:1000배 희석한 HRP (Horseradish peroxidase)-축합 항-마우스 IgG+IgA+IgM 항체 (1:2000; Sigma, 미국)를 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 1 시간 반응시킨 다음 세척완충용액으로 3회 세척하였다. 세척 후 TMB (3,3',5,5' - tetramethylbenzidine) (Sigma, 미국) 기질용액을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하고 암소에서 30분간 반응시켜 발색한 후 2N H2SO4를 처리하여 효소반응을 정지시켰다. 반응 후 ELISA 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이소타입을 결정한 결과, 하기 표 1에 정리된 바와 같이 중쇄 (heavy chain)의 서브클래스에 따라서 분류하면 6개는 IgG1 서브클래스, 3개는 IgG2a 서브클래스, 나머지 1개는 IgG2b 서브클래스였다. 일반적으로 IgM 항체는 진단제 개발을 위해 이용되는 고상표면이나 표적 (target) 항원 이외의 다른 성분과 비특이적으로 흡착하는 특성을 갖고 있다. 따라서 본 발명을 통해 얻어진 10개의 모든 단일클론항체는 진단용 단일클론 항체로 이용 가능한 항체로 선정하였다. 이후 제반실험에서는 이 항체만을 이용하여 특성분석을 실시하였다.
<실시예 14>: 단일클론 항체의 친화도 분석 및 항원결정기 분석을 위한 RtxA1(3491-4701) 조각의 발현
비브리오 패혈증균 RtxA1의 아미노산 서열 3491부터 4701을 포함하는 재조합 RtxA1 (3491-4701) 단백질은 실시예 4에서 발현된 것을 사용했다. 비브리오 패혈증균 RtxA1의 아미노산 서열 3491부터 4380을 포함하는 RtxA1 (3491-4380)의 유전자 부위는 EcoRI 및 XhoI 제한효소 인식부위를 갖는 하기 2개 (RA-3491F2와 RA-4308R)의 올리고 뉴클레오타이드와 중합효소연쇄반응를 이용하여 실시예 2와 같은 방법으로 증폭하였다.
RA-3491F2: 5´-ACATGAATTCATACCATGGCAGAGAAGTTTGGCGACTAC-3´(서열번호 7, 전방 프라이머)
RA-4380R: 5´-CCATTCTCGAGCTAATGATGATGATGATGATGCGTGCCTGTTGCGTAGAACAC-3´ (서열번호 8, 후방 프라이머)
또한 RtxA1의 아미노산 서열 3491부터 3980을 포함하는 RtxA1 (3491-3980)의 유전자 부위는 EcoRI 및 XhoI 제한효소 인식부위를 갖는 하기 2개 (RA-3491F2와 RA-3980R)의 올리고 뉴클레오타이드와 중합효소연쇄반응을 이용하여 실시예 2와 같은 방법으로 증폭하였다.
RA-3491F2: 5´-ACATGAATTCATACCATGGCAGAGAAGTTTGGCGACTAC-3´´(서열번호 9, 전방 프라이머)
RA-3980R: 5´-CCATTCTCGAGCTAATGATGATGATGATGATGCTCACCCGAGGTGGCAATGC-3´ (서열번호 10, 후방 프라이머)
증폭된 RtxA1 (3491-4380)과 RtxA1 (3491-3980) 유전자 부위는 실시예 3과 같은 방법으로 pET-21(a) 벡터에 삽입되고, 실시예 4와 같은 방법을 이용하여 형질 전환된 대장균을 이용하여 재조합 RtxA1 (3491-4380)과 RtxA1 (3491-3980) 단백질이 발현하고 추출하였다 (도 4B). 추출된 재조합 단백질의 특이성 분석은 실시예 6과 같은 방법을 이용하여 확인 되었다 (도 4C). 도 4A는 혈질 전환 대장균에서 발현된 재조합 RtxA1(3491-4701) 조각 단백질을 모식적으로 보여 주고 있다. 도 4B에서 분자량 크기는 도의 왼쪽에 표시 되어 있고, 제1레인, 2레인, 3레인과 4레인은 각각 대조군 재조합 단백질과 재조합 RtxA1 (3491-4701), RtxA1 (3491-4380), RtxA1(3491-3980)을 발현하는 형질 전환 대장균에서 추출된 단백질이다. 화살표는 발현된 재조합 RtxA1 (3491-4701), RtxA1 (3491-4380), RtxA1(3491-3980) 단백질의 위치를 나타낸다. 도 4C에서는 비브리오 패혈증균 RtxA1 단백질에 대한 항체를 이용하여 재조합 RtxA1 (3491-4701), RtxA1 (3491-4380), RtxA1 (3491-3980) 단백질의 특이성을 분석하였다. 분자량 크기는 도의 왼쪽에 표시 되어 있고, 제1레인, 2레인, 3레인과 4레인은 각각 대조군 재조합 단백질, 재조합 RtxA1 (3491-4701), RtxA1 (3491-4380), RtxA1(3491-3980)을 발현하는 형질 전환 대장균에서 추출된 단백질이다. 화살표는 RtxA1 단백질에 대한 항체가 양성 반응 보이는 RtxA1 (3491-4701), RtxA1 (3491-4380), RtxA1 (3491-3980) 단백질의 위치를 나타낸다. 도 4B와 4C를 통해 재조합 RtxA1 (3491-4701), RtxA1 (3491-4380), RtxA1(3491-3980)이 확인되었다.
<실시예 15> 단일클론 항체의 친화도 분석 및 항원결정기 분석
진단과 치료용 단일클론 항체의 선별에 유용한 정보로 사용되는 단일클론 항체의 친화도 분석 및 항원결정기 분석은 실시예 14에서 확인 된 재조합 RtxA1 (3491-4701)의 조각과 ELISA법에 의해 실시되었다. 재조합 RtxA1 (3491-4701), RtxA1 (3491-4380), RtxA1 (3491-3980) 단백질을 발현하는 형질전환 대장균 추출물을 각각 탄산염 완충액 (carbonate buffer) (pH 9.4)으로 희석한 다음 Maxisorp ELISA 플레이트 (Nunc, 미국)의 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고, 4℃에서 16시간 반응시켜 각각의 재조합 단백질을 코팅하였다. 각각의 재조합 단백질이 코팅된 각 웰에 1% BSA가 포함된 블로킹완충용액 (PBS, 0.05% Tween-20, 1% BSA, 3% 열 비활성 말 혈청)을 처리하여 37℃에서 1시간 동안 비특이 반응을 차단하였다. 각 웰에 단일클론 항체를 포함한 세포배양액을 50 ㎕씩 첨가하고, 4℃에서 1 시간 반응한 다음 세척완충용액(PBS, 0.05% Tween-20, 0.05% BSA)으로 3회 세척하였다. 세척 후 1:1000배 희석한 Biotin-축합 항-마우스 IgG+IgA+IgM 항체 (1: 2,000; Sigma, 미국)를 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 1 시간 반응시킨 다음 세척완충용액으로 3회 세척하였다. 세척 후 HRP (Horseradish peroxidase)-축합 streptavidin를 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 1 시간 반응시키 후 다시 세척완충용액으로 3회 세철한후 연이어 TMB (3,3',5,5' - tetramethyl-benzidine) (Sigma, 미국) 기질용액을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하고 암소에서 30분간 반응시켜 발색한 후 2N H2SO4를 처리하여 효소반응을 정지시켰다. 반응 후 ELISA 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다 (표 1). 단일클론 항체의 친화도 분석 및 항원결정기 분석결과, 표 1에 정리된 바와 같이 5개 (5RA, 7RA, 8RA, 9RA,11RA)는 재조합 단백질 RtxA1 (3491-4701) 항원을 강하게 인식했다. 반면, 1RA와 10RA 단일클론 항체는 RtxA1 (3491-4701) 항원을 중간 정도의 강도로 인식 했고, 2RA, 3RA와 4RA 단일클론 항체는 RtxA1 (3491-4701) 항원을 약하게 인식했다. 2RA, 3RA, 8RA와 11RA 단일클론 항체는 RtxA1의 아미노산 서열 3491부터 3980부분을 인식하였고, 1RA, 5RA, 7RA와 9RA 단일클론항체는 RtxA1의 아미노산 서열 3981부터 4380부분에 결합하였다. 4RA와 10RA에 단일클론항체는 RtxA1의 아미노산 서열 4381부터 4701부분을 인식하였다. 따라서 본 발명을 통해 항원결정기가 다른 3 그룹의 단일클론 항체를 확보할 수 있었으며 각 그룹의 단일클론 항체들은 비브리오 패혈증균의 항원진단제 개발뿐만 아니라 비브리오 패혈증균에 대한 기초연구에서도 유용하게 이용될 수 있다.
<실시예 16> 열변성 RtxA1 (3491-4701)항원에 대한 단일클론 항체의 반응성 분석.
특정 항원에 특이적인 단일클론 항체는 감염 표본의 고온처럼 변성조건에서 항원을 검출하는 진단제 개발에 이용될 수 있다. 이에 본 발명에서는 재조합 RtxA1 (3491-4071) 항원을 100℃에서 3분간 열처리하여 열변성 RtxA1 (3491-4701) 항원을 얻은 후 ELISA을 실시하여 각 단일클론 항체의 반응성을 조사하였다. 열변성 재조합 RtxA1 (3491-4701) 항원을 탄산염 완충액 (carbonate buffer) (pH 9.4)으로 희석한 다음 Maxisorp ELISA 플레이트 (Nunc, 미국)의 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고, 4℃에서 16시간 반응시켜 각각의 재조합 단백질을 코팅하였다. 각각의 재조합 단백질이 코팅된 각 웰에 1% BSA가 포함된 블러킹완충용액 (PBS, 0.05% Tween-20, 1% BSA, 3% 열 비활성 말 혈청)을 처리하여 37℃에서 1시간 동안 비특이 반응을 차단하였다. 각 웰에 단일클론 항체를 포함한 세포배양액을 50 ㎕씩 첨가하고, 4℃에서 1 시간 반응한 다음 세척완충용액(PBS, 0.05% Tween-20, 0.05% BSA)으로 3회 세척하였다. 세척 후 1:1000배 희석한 Biotin-축합 항-마우스 IgG+IgA+IgM 항체 (1:2,000, Sigma, 미국)를 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 1 시간 반응시킨 다음 세척완충용액으로 3회 세척하였다. 세척 후 HRP (Horseradish peroxidase)-축합 streptavidin를 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 1 시간 반응시킨 후 다시 세척완충용액으로 3회 세척한후 연이어 TMB (3,3',5,5' - tetramethyl-benzidine) (Sigma, 미국) 기질용액을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하고 암소에서 30분간 반응시켜 발색한 후 2N H2SO4를 처리하여 효소반응을 정지시켰다. 반응 후 ELISA 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각각의 단일클론 항체의 열변성 RtxA1 (3491-4701)항원에 대한 단일클론 항체의 반응석 분석결과, 표 1에 정리 된 바와 같이 1RA, 2RA, 3RA, 5RA, 7RA, 8RA, 9RA와 11RA는 열변성 RtxA1 (3491-4701)항원을 인식하였지만, 4RA와 10RA는 열변성 RtxA1 (3491-4701)항원을 인식하지 못 했다. 따라서, 본 발명에서 확보된 단일클론 항체는 검사 표본의 고온처리 후 변성된 항원검출을 위한 진단제 개발에 유용하게 사용할 수 있을 것이다.
<실시예 17> 야생종 비브리오 패혈증균에 대한 단일클론 항체의 반응성 분석.
야생종 비브리오 패혈증균에서 생성되는 RtxA1 독소 단백질에 대한 단일클론 항체의 반응성을 분석하기 위해서 면역블럿 (Immunoblot)을 수행 하였다. 야생종 비브리오 패혈증균 M06-24/O 균주를 (Reddy GP, Hayat U, Abeygunawardana C, Fox C, Wright AC, Maneval DR, Jr., Bush CA, Morris JG, Jr. J Bacteriol 1992;174:2620-2630) 2.5% NaCl을 포함한 HI 배지에 접종 후 37℃ 진탕 배양기에서 16시간 배양하였다. 이 배양액을 1/200로 다시 2.5% NaCl이 포함한 HI 배지에 접종한 후 37℃ 진탕 배양기에서 2 시간 본 배양을 시행하였다. 이렇게 배양한 본 배양액을 12,000rpm에서 10분간 원심분리한 후, 상등액 300 ㎕ 와 차가운 아세톤 (Sigma, 미국) 1,200 ㎕ 을 혼합해서 -20℃에 30분간 처리 하였다. 이렇게 30분 처리한 배양 상등액과 아세톤 혼합물을 12,000rpm에서 15분간 원심분리 한 후 침전물을 수집하고, 이 침전물을 20 ㎕ 2x 샘플 완충용액에 용출시킨 후 10% SDS-PAGE를 실시하였다. SDS-PAGE 종료 후 겔 상 단백질을 토우빈 (Towbin)의 (Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Proc Natl Acad Sci USA 1979; 76:4350-4354) 방법에 따라 Nitrocellulose 막 (Bio-Rad, 미국)으로 옮겼다. 단백질이 이적된 막을 5% 탈지유 (skim milk)가 함유된 인산완충용액으로 비특이반응을 차단하였다. 여기에 50 ㎍/㎖로 희석한 비브리오 패혈증균 RtxA1 단일클론 항체를 이용하여 실온에서 1시간 동안 반응시키고, 퍼옥시다제로 표지된 IgG (Jackson labatory, 미국) 2차 항체를 제조사의 지시에 따라 희석하여 사용하였다. 1차와 2차 항체로 반응시킨 후에는 인산완충용액으로 3회에 걸쳐 세척하였다. 2차 항체반응 및 세척이 끝난 막에 ECL 웨스턴 블럿 (western blot) 기질액 (Amersham, 미국)를 처리하고, 발광영상분석기(LAS-1000 luminescent image analyzer; Fujifilm, 일본)를 이용하여 결과를 분석하였다 (도 5). 도 5에서 제 1 레인은 대조군으로 RtxA1 유전가 삭제된 돌연변이 비브리오 패혈증균주 CMM744 (Kim YR, Lee SE, Kook H, Yeom JA, Na HS, Kim SY, Chung SS, Choy HE, Rhee JH. Cell Microbiol 2008;10:848-862)의 배양액이고, 레인 2는 야생종 비브리오 패혈증균의 배양액이다. 도 5에서 확인되는 바와 같이 1RA, 5RA, 11RA 단일클론 항체는 양생종 비브리오 패혈증균 배양액에 대해서 130 kDa 크기에서 양성 반응을 보였다. 따라서, 1RA, 5RA, 11RA 단일클론 항체는 비브리오 패혈증균 RtxA1 항원의 검출용 진단제 개발을 위해 유용할 것이다.
<실시예 18> 단일클론 항체의 여러 비브리오 패혈증균 균주에 대한 교차반응.
효율적이고 유용한 비브리오 패혈증균의 검출용 진단제 개발을 위해서는 단일클론 항체가 여러 비브리오 패혈증균 균주에 대한 교차반응을 보여야 하기 때문에 본 발명에서 확보된 단일클론 항체들과 여러 비브리오 패혈증균주의 교차 반응성을 조사 하였다. 이를 위하여, 환자에서 분리된 비브리오 패혈증균주(ATCC 29307 (ATCC, 미국), CMCP6 (Kim YR, Lee SE, Kim CM, Kim SY, Shin EK, Shin DH, Chung SS, Choy HE, Progulske-Fox A, Hillman JD, Handfield M, Rhee JH. Infect Immun 2003;71:5461-5471), YJ016 (Chen CY, Wu KM, Chang YC, Chang CH, Tsai HC, Liao TL, Liu YM, Chen HJ, Shen AB, Li JC, Su TL, Shao CP, Lee CT, Hor LI, Tsai SF. Genome Res 2003;13:2577-2587))와 환경 균주(Env1 (Rosche TM, Smith B, Oliver JD. Appl Environ Microbiol 2006;72:4356-4359.))을 각각 2.5% NaCl을 포함한 HI 배지에 접종 후 37℃ 진탕 배양기에서 16시간 배양하였다. 이 배양액을 1/200로 다시 2.5% NaCl이 포함한 HI 배지에 접종한 후 37℃ 진탕 배양기에서 2 시간 본 배양을 시행하였다. 이렇게 배양한 본 배양액을 12,000rpm에서 10분간 원심분리한 후, 상등액 300 ㎕ 와 차가운 아세톤 (Sigma, 미국) 1,200 ㎕ 을 혼합해서 -20℃에 30분간 처리하였다. 이렇게 30분 처리한 배양 상등액과 아세톤 혼합물을 12,000rpm에서 15분간 원심분리 한 후 침전물을 수집하고, 이 침전물을 20 ㎕ 2x sample 완충용액에 용출시킨 후 10% SDS-PAGE를 실시하였다. SDS-PAGE 종료 후 겔 상 단백질을 토우빈 (Towbin)의 (Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Proc Natl Acad Sci USA 1979; 76:4350-4354) 방법에 따라 Nitrocellulose 막 (Bio-Rad, 미국)으로 옮겼다. 단백질이 이적된 막을 5% 탈지유 (skim milk)가 함유된 인산완충용액으로 비특이반응을 차단하였다. 여기에 50 ㎍/㎖로 희석한 비브리오 패혈증균 RtxA1 단일클론 항체를 이용하여 실온에서 1시간 동안 반응시키고, 퍼옥시다제로 표지된 IgG (Jackson labatory, 미국) 2차 항체를 제조사의 지시에 따라 희석하여 사용하였다. 1차와 2차 항체로 반응시킨 후에는 인산완충용액으로 3회에 걸쳐 세척하였다. 2차 항체반응 및 세척이 끝난 막에 ECL 웨스턴 블럿 (western blot) 기질액 (Amersham, 미국)를 처리하고, 발광영상분석기(LAS-1000 luminescent image analyzer; Fujifilm, 일본)를 이용하여 결과를 분석하였다 (도 6). 도 6A와 6B에서 제 1 레인은 대조군으로 RtxA1 유전가 삭제된 돌연변이 비브리오 패혈증균주 CMM744의 배양액, 레인 2는 ATCC 29307 비브리오 패혈증균주의 배양액, 레인 3는 CMCP6 비브리오 패혈증균주의 배양액, 레인 4는 YJ016 비브리오 패혈증균주의 배양액, 레인 5는 Env1 비브리오 패혈증균주의 배양액이다. 도 6A에서 확인되는 바와 같이 5RA 단일클론 항체는 ATCC 29307, CMCP6와 YJ016 비브리오 패혈증균주 배양액에 대해서 130 kDa 크기에서 양성 반응을 보였고, 도 6B에서 11RA 단일클론항체는 ATCC 29307, CMCP6, YJ016와 Env1 비브리오 패혈증균주의 배양액에 대해서 130 kDa 크기에서 양성 반응을 보였다, 따라서, 5RA와 11RA 단일클론 항체는 여러 비브리오 패혈증균주들에 RtxA1 항원의 검출용 진단제 개발을 위해 유용할 것이다.
<실시예 19> 비브리오 패혈증균에 감염된 세포에서 단일클론 항체의 반응성 분석
최근까지는 박테리아의 조직 감염 진단을 위해 표준진단법으로 면역형광항체법 (immunofluorescence assay)이 널리 이용되어 왔기 때문에 본 발명에서 확보된 단일클론 항체와 비브리오 패혈증균의 반응성을 조사하기 위해 비브리오 패혈증균이 접종된 헬라 (HeLa)세포 (ATCC, 미국)를 이용하여 간접면역형광항체법을 수행하였다. 비브리오 패혈증균를 FA (fluorescence assay)용 슬라이드(Nunc, 미국)에서 단층배양된 헬라세포에 100 MOI로 1시간 접종하고, 3.7% 포름알데하이드 (formaldehyde)로 감염된 세포를 고정하였다. 고정된 비브리오 패혈증균 감염세포는 0.2% 트리이톤 액스-100 (Triton X-100)을 처리한 후 각 단일클론 항체를 1% BSA가 포함된 인산완충용액을 이용하여 10~50 ㎍/㎖ 농도로 희석하여 처리하고, 37 ℃에서 30분간 반응시킨 후 인산완충용액을 이용해서 3회 세척하였다. 세척 후 Alexa Flour 488 축합 항-마우스 IgG항체 (20 ㎍/㎖; Invitrogen, 미국)를 처리하고, 37 ℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 인산 완충용액으로 3회 세척하고, DAPI을 포함한 ProLong Gold anti-fade (Invitrgen, 미국) 용액으로 mounting 한 후 형광현미경하에서 관찰하였다. 도 7에서 보는 바와 같이, RtxA1 돌연변이 비브리오 패혈증균주 CMM744에서는 단일클론 항체가 음성 반응을 보였지만, 야생종 비브리오 패혈증균이 감염된 세포에서는 분명한 양성 반응을 보였다. 따라서, 1RA, 4RA, 5RA, 11RA 단일클론 항체는 비브리오 패혈증균이 감염된 세포에서 RtxA1 항원의 검출용 진단제 개발을 위해 유용할 것이다.
단일클론항체
 이소타입

 열변성 항원에 대한 반응성
 친화도(Binding activity)
RtxA1(3491-4701) RtxA1(3491-4380) RtxA1(3491-3980)
1RA IgG1 양성 중 약 음성
2RA IgG2a 양성 약 약 중
3RA IgG1 양성 약 약 중
4RA IgG1 음성 약 음성 음성
5RA IgG2a 양성 강 약 음성
7RA IgG1 양성 강 약 음성
8RA IgG2b 양성 강 강 강
9RA IgG1 양성 강 약 음성
10RA IgG1 음성 중 음성 음성
11RA IgG2a 양성 강 중 강
상기 표 1을 통해 알 수 있듯이, 재조합 RtxA1 단백질을 면역원으로 이용하여 융합된 하이브리도마 세포 10개에서 생산된 각각의 단일클론항체 중 이소타입에 따른 대량생산가능성, 열변성 항원에 대한 반응성 및 RtxA1 항원과의 친화도 및 다른 종류의 비브리오 패혈증균에 대한 교차가능성 등을 종합하면 5RA, 11RA 가 가장 우수한 효과를 나타내었다. 따라서, 상기 5RA는 한국세포주연구재단(Korean Cell Line Research Foundation)에 기탁번호 KCLRF-BP-00261로 기탁하고, 11RA는 기탁번호 KCLRF-BP-00262로 기탁하였다.
본 발명을 통해 비브리오 패혈증균에 대한 진단, 예방 및 치료 용이하게 수행할 수 있으므로 의료산업에 폭넓게 이용될 수 있다.
한국세포주연구재단 KCLRFBP00262 20110328
서열목록 전자파일 첨부

Claims (10)

  1. 비브리오 패혈증균 RtxA1 항원의 3491번 내지 3980번 아미노산 부위에 결합하는 것을 특징으로 하는 수탁번호 KCLRF-BP-00262의 하이브리도마 세포.
  2. 수탁번호 KCLRF-BP-00262의 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 비브리오 패혈증균 RtxA1 항원 및 열처리된 비브리오 패혈증균 RtxA1 항원의 3491번 내지 3980번 아미노산 부위에 결합하는 단일클론항체.
  3. 삭제
  4. 제2항의 단일클론항체를 포함하는 비브리오 패혈증균 검출을 위한 조성물.
  5. 제2항의 단일클론항체를 포함하는 비브리오 패혈증균 검출을 위한 진단키트.
  6. 제2항의 단일클론항체를 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 비브리오 패혈증균을 검출하는 방법.
  7. 제2항의 단일클론항체를 열처리된 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 비브리오 패혈증균을 검출하는 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 검출은 ELISA 또는 웨스턴 블롯으로 검출하는 방법.
  9. 제2항의 항체를 포함하는 비브리오 패혈증 치료제.
  10. (A) 비브리오 패혈증균 RtxA1 항원 유래의 서열번호 6의 재조합 단백질 또는 그 융합단백질을 사용하여 생쥐를 면역화하는 단계;
    (B) 상기 면역화된 생쥐의 비장 세포를 마이엘로마 세포와 융합하여 배양하는 단계; 및
    (C) 상기 융합된 하이브리도마 세포에서 비브리오 패혈증균 RtxA1 항원의 3491번 내지 3980번 아미노산 부위에 결합하는 단일 클론항체를 생산하는 수탁번호 KCLRF-BP-00262의 하이브리도마 세포를 선별하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 하이브리도마 세포의 제조방법.
KR1020110031354A 2011-04-05 2011-04-05 비브리오 패혈증균 알티엑스에이원에 특이적인 단일클론항체, 이를 분비하는 하이브리도마 및 이를 포함하는 진단키트 KR101309485B1 (ko)

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