WO2015122598A1 - 비브리오 패혈증균 알티엑스에이-1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도 - Google Patents

비브리오 패혈증균 알티엑스에이-1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도 Download PDF

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vibrio sepsis
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한국해양과학기술원
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Definitions

  • Vibrio vulnificus is a basophil pathogenic bacterium that lives primarily in the estuary adjacent to the ocean and is associated with most seafood-related deaths.
  • Vibrio sepsis infection is relatively short in history, global warming is one of the emerging hot spots of clinical cases.
  • the world's absolute cases are less than cholera and Salmonella food poisoning, but due to high mortality and tragic clinical symptoms cause serious social problems.
  • the term "primer” means a synthetic or natural oligonucleotide.
  • the primer serves as an initiation point for the synthesis under conditions in which the synthesis of the primer extension product complementary to the template is induced, i.e. the presence of polymers such as nucleotides and DNA polymerase, and conditions of suitable temperature and pH.
  • the primer is preferably single chain.
  • the primer is deoxyribonucleotide.
  • Primers of the invention may include naturally occurring dNMPs (ie, dAMP, dGMP, dCMP and dTMP), modified nucleotides or non-natural nucleotides.
  • the primer may also comprise ribonucleotides.
  • FIG. 7 is a diagram schematically showing a site where three groups of monoclonal antibodies bind to RtxA1 (3491-4701).
  • the serum obtained from CD-1 mice infected with Vibrio sepsis of Example 18 was diluted at a volume ratio of 1: 1000, and reacted at room temperature for 1 hour, followed by peroxidase-labeled IgG (Jackson labatory, USA) secondary.
  • Antibodies were diluted and used according to the manufacturer's instructions. After reacting with the primary and secondary antibodies, it was washed three times with phosphate buffer (PBS). The secondary antibody reaction and the washed nitrocellulose membrane were treated with ECL western blot substrate solution (Amersham, USA), and the results were analyzed using a LAS-1000 luminescent image analyzer (Fujifilm, Japan). The results are shown in FIG. 3.
  • lane 1 is the control GST protein and lane 2 is the recombinant RtxA1 (3491-4701) protein.
  • RtxA1 (3491-3980) comprising amino acid sequences 3491 to 3980 of RtxA1 are oligonucleotides and polymerase chains of two of the following (RA-3491F2 and RA-3980R) having EcoRI and XhoI restriction enzyme recognition sites; The reaction was amplified in the same manner as in Example 2.
  • RA-3491F2 5 ⁇ -ACATGAATTCATACCATGGCAGAGAAGTTTGGCGACTAC-3 ⁇ ⁇ (SEQ ID NO: 7, anterior primer)
  • Affinity analysis and epitope analysis of monoclonal antibodies used as useful information for the selection of diagnostic and therapeutic monoclonal antibodies were performed by fragments of recombinant RtxA1 (3491-4701) identified in Example 14 and ELISA.
  • CD1 female, 8-week old mice were intraperitoneally administered 2 x 10 6 / ml of the wild species Vibrio sepsis bacterium cultured in Example 17. After 1 hour, 200 ⁇ l of the serum containing polyclonal antibody against RtxA1 (3491-4701) protein was administered intraperitoneally and observed for 96 hours. The results are shown in FIG.
  • the 24RA was deposited with the Korean Cell Line Bank as accession number KCLRF-BP-00311, 47RA was deposited with the accession number KCLRF-BP-00309.

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Abstract

본 발명은 비브리오 패혈증균 알티엑스에이-1(RtxA1)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비브리오 패혈증균에 대한 고친화도의 특이적 결합능력으로 높은 감수성, 특이성 및 민감도를 가지며, 비브리오 패혈증균과 그에 관련된 감염에 의해서 유발되는 질병의 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있는 비브리오 패혈증균 알티엑스에이-1(RtxA1)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

비브리오 패혈증균 알티엑스에이-1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도
본 발명은 비브리오 패혈증균 알티엑스에이-1(RtxA1)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비브리오 패혈증균에 대한 고친화도의 특이적 결합능력으로 높은 감수성, 특이성 및 민감도를 가지며, 비브리오 패혈증균과 그에 관련된 감염에 의해서 유발되는 질병의 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있는 비브리오 패혈증균 알티엑스에이-1(RtxA1)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus)은 주로 바다와 인접한 강하구에 서식하는 호염성 병원성 박테리아이며 대부분의 해산물과 관련된 사망성 질환과 관련되어있다. 비록 비브리오 패혈증균 감염증은 비교적 역사가 짧으나, 지구 온난화에 의해서 세계적으로 임상증례가 계속 증가하고 있는 새로이 주목받고 있는 질환 중의 하나이다. 특히 전세계적으로 절대적인 발병 예는 콜레라나 살모넬라 식중독보다 적지만 높은 치사율과 비극적인 임상증상 때문에 심각한 사회적 문제를 야기하고 있다.
비브리오 패혈증균은 1976년 미국 질병통제센터(Centers for Disease Control; 이하 CDC로 약함)의 홀리스(Hollis) 등이 11년 동안 사람에서 분리된 호염성, 병원성 비브리오 균의 세균학적 성상을 처음 보고한 이후, 유당(lactose)을 분해하는 특징 때문에 유당 분해 비브리오(lactose-fermenting Vibrio 또는 Lac(+))라 명명되었다. 1979년 CDC의 블레이크 (Blake)등은 CDC에 보고된 39명의 환자들의 자료를 역학적으로 분석하여 임상증상에 따라 원발성 패혈증(primary septicemia)군과 창상감염(wound infection)군으로 분류하였다(Blake,P.A., Merson, M.H., Weaver, R.E., Hollis, D.G., Heublein, P.C., N. Engl. J. Med. 300:1-6, 1979). 같은 해 파머 (Farmer)는 새로운 종으로서 Vibrio vulnificus (vulnus=wound, ficus=forming)라 명명하였으며, 오늘에 이르고 있다(Farmer, J.J. III, Lancet 2:903, 1979).
비브리오 패혈증균 패혈증은 잠복기가 짧고, 다양한 항생제 치료에도 불구하고 50%이상의 치사율을 나타내고 있다. 비브리오 패혈증균 패혈증은 대부분 40대 이상(약 90-95%)의 남자(90% 이상)에서 발생하며, 정상인에서는 거의 볼 수 없고, 기저질환을 가지는 환자들에서 주로 발병한다. 전 세계의 발생 증례를 분석해 보면 원발성 패혈증의 경우, 대부분의 환자들은 간장 질환과 음주벽 등 만성질환을 가지고 있으며, 간장 질환으로서는 간경변, 만성간염, 간암 등이 주종을 이루고, 그 외 당뇨병, 폐결핵, 만성골수염, 류마티스성 관절염 등의 기저질환이 확인되었다. 그러나 5%이하에서는 특별한 기저질환을 찾을 수 없는 경우도 있다. 미 국의 경우 당뇨병, 악성종양, 혈색소증(hemochromatosis), 지중해빈혈(thalassemia) 등의 환자에서 빈도가 비교적 높게 나타난다. 최근에는 AIDS 환자들에서 비브리오 패혈증균 패혈증의 발생보고가 나오고 있어, 미국 CDC에서는 AIDS환자들에게 여름철에는 굴 등의 해산물을 생식하지 말 것을 권고하고 있다. 또한 허리케인 발생 지역의 만성질환자의 경우는 상처를 통한 비브리오 패혈증균 감염에 주의할 것을 권고하고 있다. 따라서, 비브리오 패혈증균와 관련 박테리아의 감염에 의한 패혈증의 예방과 치료를 위해서 새로운 항 박테리아 물질의 개발이 절실히 요구된다.
한편, 1980년 중반 이후 시작된 비브리오 패혈증균의 발병기전 연구를 통하여 여러 가지 독력인자가 보고되었다. 즉, capsular polysaccharide(VvCPS), iron assimilation system, flagella, pili, VvhA, VvpE, RtxA1등이 알려져 있다(Jones M.K., Oliver J.D. Infect Immun. 77:1723-1733. 2009). 이 중 RtxA1은 비브리오 패혈증균 감염초기에 분비되는 주요한 독력인자로써, 장을 통한 혈액으로 비브리오 패혈증균의 전파와 세포의 사멸에 중요한 역할을 하고 있다. 이는 RtxA1이 초기 감염의 새로운 진단법과 치료제 개발에 유용한 표적임을 시사하고 있다.
상기 비브리오 패혈증균 검출방법 중 등록특허 10-1192130(공개일자: 2012.01.09)에는 비브리오 패혈증세균의 외막단백질을 특이적으로 인식하는 단쇄항체 및 상기 항체를 이용한 비브리오균 검출 키트 및 방법을 기재하고 있다. 그러나, 종래의 다양한 항생제를 이용한 치료법에도 불구하고, 50% 이상의 치사율을 가지는 비브리오 패혈증균의 감염에 대한 높은 치사율을 낮추기 위한 몇 가지 시도가 있었다. 그 예로 불활성 비브리오 패혈증균, VvCPS, VvpE을 이용한 예방차원의 백신 개발이 진행 되었다(Kreger A.S., Gray L.D., Testa J.Infect Immun. 45:537-543. 1984, Devi S.J., Hayat U., Frasch C.E., et al. Infect Immun. 63:2906-2911. 1995, Chen Y.C., Chang C.C., Chang S.Y., et al. Letters in applied microbiology 50:168-172. 2010). 하지만, 불활성 비브리오 패혈증균와 VvpE는 잠재적 부작용을 가지고 있으며(Chang A.K., Kim H.Y., Park J.E.,et al. J. Bacteriol. 187:6909-6916. 2005), VvCPS는 다양한 비브리오 패혈증균에 사용할 수 없는 한계를 가지고 있다(Devi S.J., Hayat U., Frasch CE, et al.Infect Immun. 63:2906-2911,1995).
나아가, 비브리오 패혈증균에 감염이 될 경우, 매우 높은 치사율에도 불구하고, 현재 비브리오 패혈증에 대한 효율적인 예방 및 치료가 이루어 지지 못하고 있는 문제점이 있다.
본 발명은 상술한 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 첫 번째 해결하려는 과제는 비브리오 패혈증균에 대하여 고친화도의 특이적 결합능력으로 비브리오 패혈증균과 그에 관련된 감염에 의해서 유발되는 질병의 예방 및 치료 효과가 우수한 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 두번째 해결하려는 과제는 본 발명의 단일클론항체를 포함하는 비브리오 패혈증 치료제, 비브리오 패혈증 예방제 및 비브리오 패혈증 진단키트를 제공하는 것이다.
본 발명은 비브리오 패혈증균 RtxA1 단백질에 대한 단일클론항체를 생산하는 것을 특징으로 하는 수탁번호 KCLRF-BP-00311인 하이브리도마 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 비브리오 패혈증균 RtxA1 단백질에 대한 단일클론 항체를 생산하는 것을 특징으로 하는 수탁번호 KCLRF-BP-00309인 하이브리도마 세포를 제공한다.
나아가, 본 발명은 수탁번호 KCLRF-BP-00311인 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 비브리오 패혈증균 RtxA1 단백질에 대한 단일클론항체 또는 이의 항원결합단편을 제공한다.
더불어, 본 발명은 수탁번호 KCLRF-BP-00309인 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 비브리오 패혈증균 RtxA1 단백질에 대한 단일클론항체 또는 이의 항원결합단편을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단일클론항체는 서열목록 4의 RtxA1 단백질의 3491 내지 3980번째 아미노산 서열 부위에 특이적으로 결합할 수 있다.
게다가, 본 발명은 단일클론항체 또는 이의 항원결합단편을 포함하는 비브리오 패혈증 치료제를 제공한다.
또한, 본 발명은 단일클론항체 또는 이의 항원결합단편을 포함하는 비브리오 패혈증 예방제를 제공한다.
나아가, 본 발명은 단일클론항체 또는 이의 항원결합단편을 포함하는 비브리오 패혈증 진단 키트를 제공한다.
이하, 본 명세서에서 사용된 용어에 대해 간략히 설명한다.
세포와 관련하여 사용되는 용어 "재조합(recombinant)"은 세포가 이형의 핵산을 복제하거나 이형의 핵산에 의해 코드화되는 펩타이드 또는 단백질을 발현하는 것을 가리킨다. 또한 재조합 세포는 세포의 본래 형태에서 발견되는 유전자를 발현시킬 수 있으나, 변형된 유전자가 인공적인 방법에 의해 세포로 재도입되기도 한다.
본 발명의 용어 "프라이머"는 합성 또는 자연의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머는 주형에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합체의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용한다. 증폭의 최대 효율을 위하여, 바람직하게는 프라이머는단일쇄이다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명의 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉,dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대,본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 펩타이드 핵산(PNA)(M. Egholm et al.,Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-,프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "벡터"는 외래 유전자를 숙주 세포 내로 안정적으로 운반할 수 있는 운반체로서의 DNA 분자를 말한다. 유용한 벡터가 되기 위해서는 복제될 수 있어야 하며, 숙주 세포 내로 유입할 수 있는 방안을 갖추어야 하고, 자신의 존재를 검출할 수 있는 수단을 구비하여 한다. 여기서 외래 유전자는 비브리오 패혈증균 RtxA1 항원의 3491-4701 아미노산 부위를 코딩하는 서열 또는 상기 서열의 말단에 정제를 용이하게 하기 위하여 poly His-tag 서열을 부가한 서열을 의미한다.
본 발명의 용어 "플라스미드"는 일반적으로 외래 유전자가 숙주 세포에서 발현될 수 있도록 벡터에 작동적으로 연결되어 형성된 환상의 DNA 분자를 말한다. 그러나, 플라스미드는 목적하는 유전자를 포함하는 플라스미드를 제작하기 위해 유전자 재조합에 의해 특정한 제한 효소에 의해 분해되고 새로운 유전자를 도입하는 벡터로 사용될 수 있다. 따라서, 본원에서는 플라스미드와 벡터는 상호교환적으로 사용되며, 유전공학 분야에 통상의 지식으로 가진 자라면 그들의 명칭을 구분하지 않더라도 그 의미를 충분히 이해할 것이다.
본 발명의 용어 "융합단백질"은 추후 단백질 정제의 편의를 위하여 C-말단에 His-tag를 부착하고 있는 비브리오 폐증균 RtxA1을 의미한다. 따라서 본 발명에서 "융합단백질"이라 표현하였지만, 그것이 반드시 poly His-tag가 부착된 것을 의미하는 것이 아니며, 단백질 정제의 불편함을 감수한다면 융합단백질을 사용하지 않을 수도 있다. 그러므로 본 발명에서 "재조합 비브리오 폐증균 RtxA1"란 용어는 "비브리오 패혈증균 RtxA1" 또는 "정제의 편의를 위한 사슬이 N-말단 또는 C-말단에 부가된 비브리오 패혈증균 RtxA1"의 약칭으로 정의된다.
본 발명에 따른 재조합 RtxA1(3491-4701)은 비브리오 패혈증균 RtxA1의 다클론항체 생성, 단일클론항체 생성 및 비브리오 패혈증 백신 생산에 매우 유용한 재조합 RtxA1 단백질 항원을 제공한다. 또한 이는 비브리오 패혈증균 RtxA1을 이용한 진단에 매우 유용한 재조합 RtxA1(3491-4701)단백질 항원을 제공하고, 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질 항원의 대량발현 및 정제가 용이하게 한다.
또한, 본 발명에 따른 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질에 대한 다클론항체는비브리오 패혈증균에 대한 고친화도의 특이적 결합능력으로 비브리오 패혈증균 감염 여부를 신속, 정확하게 진단, 예방 및 치료 등에 매우 유용하게 사용 될 수 있다. 또한 대장균에서 발현된 재조합 단백질 RtxA1 항원은 감수성 및 특이성이 우수하여, 비브리오 패혈증균의 감염에 대한 진단제 또는 진단키트 등에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
나아가, 본 발명에 따른 하이브리도마 세포에서 생산되는 단일클론항체는 비브리오 패혈증균에 대한 고친화도의 특이적 결합능력으로 비브리오 패혈증균 감염 여부를 신속, 정확하게 진단, 예방 및 치료 등에 매우 유용하게 사용 될 수 있다. 또한 대장균에서 발현된 재조합 단백질 RtxA1 항원은 감수성 및 특이성이 우수하여, 비브리오 패혈증균의 감염에 대한 진단제 또는 진단키트 등에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
더불어, 본 발명의 단일클론항체는 비브리오 패혈증균의 감염억제 효과, 비브리오 패혈증 감염에 대한 예방 및 치료효과뿐만 아니라 비브리오 패혈증의 감염 후 마우스 생존율 및 백신효과가 우수하여 비브리오 패혈증 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 재조합 RtxA1(3491-4701)을 도입된 재조합 RtxA1(3491-4701)발현 벡터의 개열지도이다.
도 2는 비브리오 패혈증균의 정제된 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질을 10% SDS-PAEG로 확인한 전기영동의 결과이다.(레인 1: 정제된 대조군 Glutathione Stransferase(GST)단백질, 레인 2: 정제된 RtxA1(3491-4701)단백질)
도 3은 정제된 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질의 특이성을 면역블롯으로 분석한 전기영동의 결과이다.(레인 1: 대조군 GST단백질, 레인 2: 재조합 RtxA1(3491-4701)단백질)
도 4는 형질전환 대장균에서 발현된 재조합 RtxA1(3491-4701) 단편 단백질을 모식적으로 나타낸 그림이다.
도 5는 재조합 RtxA1(3491-4701) 단편 단백질의 발현을 SDS-PAEG로 확인한 전기영동의 결과이다.(레인 1: 대조군 재조합 단백질, 레인 2:재조합 RtxA1(3491-4701)단백질, 레인 3: 재조합 RtxA1(3491-4380)단백질 및 레인 4: 재조합RtxA1(3491-3980)단백질)
도 6은 발현된 재조합 RtxA1(3491-4701) 단편 단백질의 특이성을 면역블롯으로 분석한 전기영동의 결과이다.(레인 1: 대조군 재조합 단백질, 레인 2: 재조합RtxA1(3491-4701)단백질, 레인 3: 재조합 RtxA1(3491-4380)단백질 및 레인 4: 재조합 RtxA1(3491-3980)단백질)
도 7은 3그룹의 단일클론항체가 RtxA1(3491-4701)에 결합하는 부위를 모식적으로 나타낸 그림이다.
도 8은 실시예 23에서 비브리오 패혈증균에 대한 치료효과 조사를 위해서 사용한 단일클론항체(13RA, 21RA, 24RA, 47RA)및 10RA와 Biotin-축합 47RA의 경쟁적 결합 분석에 대한 결과를 나타낸 결과 그래프이다.
도 9는 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질에 대한 백신효과를 나타낸 결과 그래프이다. 실선과 점선으로 표시된 RtxA1-C와 GST는 각각 RtxA1(3491-4701)과 GST 단백질로 면역한 그룹을 의미한다.
도 10은 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질의 백신네이션이 혈중 비브리오 패혈증균 개수에 미치는 영향을 나타낸 결과 그래프이다. 사각형과 동그라미로 표시된 RtxA1-C와 GST는 각각 RtxA1(3491-4701)과 GST 단백질로 면역한 그룹을 의미한다.
도 11은 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질에 대한 다중클론항체의 비브리오 패혈증 감염에 대한 예방효과를 실험동물의 생존율로 나타낸 결과 그래프이다. 실선과 점선으로 표시된 α-RtxA1-C와 α-GST는 각각 RtxA1(3491-4701)과 GST 단백질의 다중클론항체를 투여한 그룹을 의미한다.
도 12는 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질에 대한 다중클론항체의 비브리오 패혈증 감염에 대한 치료 효과를 실험동물의 생존율로 나타낸 결과 그래프이다. 직선과 점선으로 표시된 α-RtxA1-C와 α-GST는 각각 RtxA1(3491-4701)과 GST 단백질의 다중클론항체를 투여한 그룹을 의미한다.
도 13는 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질에 대한 단일클론항체의 비브리오 패혈증 감염에 대한 예방효과를 나타낸 결과 그래프이다.
도 14는 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질에 대한 단일클론항체의 비브리오 패혈증 감염에 대한 치료효과를 실험동물의 생존율로 나타낸 결과 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 비브리오 패혈증균에 감염이 될 경우, 매우 높은 치사율에도 불구하고, 현재 비브리오 패혈증에 대한 효율적인 예방 및 치료가 이루어 지지 못하고 있는 문제점이 있다.
이에 본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 비브리오 패혈증균 RtxA1 단백질에 대한 단일클론항체를 생산하는 것을 특징으로 하는 수탁번호 KCLRF-BP-00309 및 KCLRF-BP-00311인 하이브리도마 세포를 제공하여 상술한 문제의 해결을 모색하였다.
본 발명은 비브리오 감염 초기에 분비되는 특이적인 독소 항원으로 판정된, RtxA1의 C-말단 부위에 대한 대장균 발현 재조합 RtxA1(3491-4701)을 면역원으로 이용하여 마우스에 면역시키고, 면역된 마우스의 비장세포와 B-임프아세포 (B-lymphoblast)인 P3X63Ag8.653가 융합된 하이브리도마 세포를 제조하고, 이로부터 비브리오 패혈증균 RtxA1 항원에 대한 단일클론항체를 생산하였다. 본 발명에 따른 단일클론항체는 비브리오 패혈증균 RtxA1 항원에 대해 우수한 반응성을 보였다. 이는 본 발명의 단일클론항체가 간접면역 형광항체, 면역블롯법 및 효소면역 항체법 등의 다양한 진단법에 이용 가능한 진단용 항체임을 보여 주고 있다. 또한 본 발명의 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질에 대한 다클론항체와 단일클론항체는 비브리오 패혈증 감염 억제 효과, 비브리오 패혈증 감염에 대한 예방 및 치료효과 뿐만 아니라 비브리오 패혈증의 감염 후 마우스 생존율이 우수하여 비브리오 패혈증 치료제로 사용될 수 있다.
구체적으로, 서열번호 4의 비브리오 패혈증균 RtxA1 단백질을 코딩하는 서열번호 3으로 표시되는 서열을 주형으로 하고 비브리오 패혈증균 RtxA1의 아미노산 서열 중 3491번-4701번 위치의 아미노산 부위를 선택적으로 증폭하기 위하여 신규한 프라이머 서열인 서열번호 1 및 2의 전방 및 후방 프라이머로 하여 PCR을 수행한다. 그 뒤 상기 증폭된 비브리오 패혈증균 RtxA1의 아미노산 서열 중 3491번-4701번 위치의 아미노산을 코딩하는 서열(서열번호 5) 또는 상기 서열의 말단에 정제를 용이하게 하기 위하여 통상의 poly His-tag(6x-His)서열을 첨가한 서열을 플라스미드 벡터에 삽입하고 이를 숙주세포에 형질전환 하였다. 이후 발현된 단백질을 정제하고 이를 마우스의 복강에 주사한 후 비장세포를 적출하여 이를 골수종세포(myeloma)와 융합하고 이를 배양하여 다수개의 하이브리도마 세포를 수득한다. 이후 상기 하이브리도마 세포에서 생산된 단일클론항체들에 대하여 이소타입에 따른 대량생산가능성, 단일클론항체들간의 경쟁적 결합, 단일클론항체의 비브리오 패혈증 감염에 대한 예방 및 치료효과, 백신효과, 비브리오 패혈증 감염 후 마우스 생존율 등을 종합적으로 평가하고, 이를 통하여 우수한 24RA 및 47RA를 한국세포주은행에 각각 기탁번호KCLRF-BP-00311 및 기탁번호KCLRF-BP-00309로 기탁하였다. 이렇게 생산된 24RA 및 47RA 단일클론항체는 비브리오 패혈증균 RtxA1의 아미노산 서열 중 3491번-3980번째 아미노산 부위에 특이적으로 결합할 수 있다. 하지만, 실시예 16과 도 8을 통하여 서로 다른 에피토프에 결합하는 단일클론항체임을 알 수 있었다.
본 발명의 단일클론항체를 분비하는 하이브리도마 세포는 이를 시험관 내에서 또는 생체 내에서 대량으로 배양할 수 있다. 상기한 하이브리도마 세포가 생산하는 단일클론항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 95% 이상)로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 투석, 염 침전, 이온교환크로마토그래피, 크기배제크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 정제방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액(ascites fluid)으로부터 분리될 수 있다.
비브리오 패혈증균 RtxA1 단백질을 선택적으로 인식하는 단일클론을 선별하기 위하여 통상 사용되는 다양한 방법, 예를 들면, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역흡착법(ELISA), 면역형광법(Immunofluorescence), 웨스턴 블랏팅(Western blotting) 및 유세포 분석법 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에 의하면, 효소면역흡착법(ELISA)에 의해 단일클론을 선별할 수 있다.
재조합 RtxA1 단백질을 면역원으로 이용하여 융합된 하이브리도마세포 37개에서 생산된 각각의 단일클론항체들은 비브리오 패혈증균의 RtxA1의 아미노산 결합부위에 따라 3491번-3980번째 아미노산에 결합하는 단일클론항체들, 3981-4380번째 아미노산에 결합하는 단일클론항체들 및 4381-4701번째 아미노산에 결합하는 단일클론항체들로 분류할 수 있다. 이 중 재조합 RtxA1 단백질을 면역원으로 이용하여 융합된 하이브리도마 세포 37개에서 생산된 각각의 단일클론항체 중 이소타입에 따른 대량생산가능성, 단일클론항체들 간의 경쟁적 결합, 단일클론항체의 비브리오 패혈증 감염에 대한 예방 및 치료효과, 비브리오 패혈증 감염 후 마우스 생존율 등을 종합해 볼 때, 항원에 대한 항체의 결합부위, 이소타입 서브클래스 및 치료효과가 각각 다른 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질 단일클론항체 24RA 및 47RA가 우수한 효과를 나타내었다. 따라서, 상기 24RA와 47RA는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank)에 241RA는 기탁번호 KCLRF-BP-00311로, 47RA는 기탁번호 KCLRF-BP-00309로 기탁하였다(표 1 참조).
본 발명의 바람직한 다른 구현예에 따르면, 기탁번호 KCLRF-BP-00309 및 기탁번호 KCLRF-BP-00311인 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 비브리오 패혈증균 RtxA1 단백질에 대한 단일클론항체 또는 이의 항원결합단편을 제공하여 상술한 문제의 해결을 모색하였다.
본 발명의 단일클론 항체는 비브리오 패혈증균 RtxA1 단백질에 고친화도를 가지면서 특이적으로 결합한다.
본 발명의 단일클론항체는 서열목록 4의 RtxA1 단백질의 3491 내지 3980번째 아미노산 서열 부위에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 용어 "항체"는 비브리오 폐증균 RtxA1 단백질에 대한 특이 항체로서, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함하는 의미이다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다.중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다(Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed., Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4,pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).
항체 분자의 항원 결합 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄Fv (two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수 분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명에서 항체는 바람직하게는 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv로 이루어진 군 중 하나의 형태이거나 완전한 항체 형태이다.
상기 "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
또한, 상기 "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
본 발명의 용어 "단일클론항체"는 당해 분야에 공지된 용어로서 단일 항원성 부위(에피토프)에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 통상적으로, 상이한 에피토프들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론항체와는 다르게, 단일클론항체는 항원상의 단일 에피토프에 대해서 지시된다. 단일클론항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 하이브리도마의 배양에 의해 생산되기 때문에 대량 생산이 용이하고 다른 면역글로블린에 의해 오염되지 않는 또 다른 장점을 갖는다.
본 발명의 단일클론항체는 당해 기술분야에서 공지된 세포융합방법에 의해 생성된 하이브리도마 세포로부터 얻을 수 있다. 일반적으로 단일클론항체를 분비하는 하이브리도마 세포는 항원 단백질을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 면역세포와 암 세포주를 융합함으로써 만들어진다. 이러한 두 가지 세포의 융합은 당업계에서 공지되어 있는 폴리에틸렌클리콜(polyethyleneglycol)을 이용하는 방법을 통해 융합시키고 항체 생산 세포를 표준적인 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution)에 의한 서브클로닝을 실시하여 균일한 세포 집단을 수득하고 난 후, 항원에 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포를 시험관 또는 생체 내에서 대량으로 배양한다. 세포 융합에 사용되는 골수종 세포로는 마우스 유래의 p3/x63-Ag8, p3-U1, NS-1, MPC-11, SP-2/0, F0, P3x63Ag8.653, V653, S194, 랫트 유래의 R210 등 다양한 세포주를 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적 실시예에서 사용된 세포주는 골수종 세포 P3x63Ag8.653이다.
본 발명의 단일클론항체는 항원과 결합하여 그 작용을 억제하거나 중화 (neutralization)시키며, 나아가 병원체와 병원체에 감염된 세포를 죽일 수 있다. 예를 들어, 비브리오 패혈증균의 독소부분인 RtxA1를 특이적으로 인식하는 단일클론항체는 이에 결합하여 그 작용을 억제하거나 중화할 수 있고, 항원과 결합된 항체는 보체를 활성화시킬 수 있으며, 활성화된 보체에 의하여 항원이 제거되도록 할 수 있다. 또한, 단일클론항체는 항원에 결합하여 그 항원이 식균세포에 의하여 더욱 잘 잡아먹히게 만들 수도 있다. 또한, 단일클론항체가 결합되어 있는 항원세포는 자연살해세포(NK cell)에 의해 보다 쉽게 살해당함으로써, 상기 단일클론항체를 면역반응을 통한 항원과 이 항원을 생성하는 비브리오 패혈증균의 제거에 이용할 수 있다. 따라서, 항체 자체만으로 면역반응을 통한 항원 및 비브리오 패혈증균의 제거와 감소의 결과를 기대할 수 있어 본 발명의 항체는 비브리오 패혈증균의 진단, 예방 및/또는 치료에 사용할 수 있다.
또한 본 발명의 단일클론항체는, 상기한 바와 같은 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편으로서 비브리오 패혈증 치료, 예방 및/또는 진단에 사용될 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 구현예에 따르면, 상술한 단일클론항체 또는 이의 항원결합단편을 포함하는 비브리오 패혈증 치료제를 제공하여 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 본 발명의 단일클론항체는 비브리오 패혈증균의 중화능력을 나타내므로 항체 단독 또는 통상의 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 비브리오 패혈증 감염에 대한 예방 및 치료 조성물로 사용가능하다.
상기 비브리오 패혈증 치료제는 본 발명의 단일클론항체를 포함하는 비브리오 패혈증 감염에 대한 예방 및 치료용 약제학적 조성물일 수 있으며, 본 발명의 단일클론항체를 포함하는 약학 조성물은 이미 사용되고 있는 항히스타민제, 소염진통제 및 항생제 등의 약제와 함께 제제화하거나 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한 약제학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001 ~ 100 ㎎/㎏이다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 비브리오 패혈증의 감염을 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제,붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 항체 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
항체는 항체-치료제 결합체 형태로 생체내로 투입하여 박테리아 감염 치료에 이용할 수 있다. 치료제는 화학 치료제, 방사성핵종, 면역치료제, 사이토킨, 케모킨, 독소, 생물작용제 및 효소 저해물질 등을 포함한다. 항생제를 항체에 결합시키는 방법은, 예를 들면 문헌 G. Gregoriadies, ed., Academic Press London, (1979); Arnon et al., Recent Results in Cancer Res.,75: 236(1980); 및 Moolton et al., Immunolog. Res.,62:47(1982))에 기재되어 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편과 커플링 시키기에 바람직한 약품은 항세균, 구충, 항진균 및 관련 약제들이고, 예를 들면 설폰아미드, 페니실린 및 세팔로스포린, 아미노글리코시드, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 피페라진, 클로로퀸, 디아미노피라딘, 메트로니아지드, 이소니아지드, 리팜핀, 스트렙토마이신, 설폰, 에리트로마이신, 폴리믹신, 나이스타틴, 암포테리신, 5-플루오로사이토신, 5-요오드-2'-데옥시우리딘, 1-아다만타아민, 아데닌아라비노사이드, 암만니틴, 리바바린 및 아지도티미딘(AZT)이며, 바람직하게는 리바바린이다. 약제를 특이적 표적 부위로 표적화하는데 적당하고 바람직한 여러 가지 조건은 예를 들어 문헌 Trouetet al., Plenum Press, New York and London, 19-30(1982)에 보고 되어 있다. 유효한 치료제를 미생물 항원에 대해 제조된 매우 특이성이 있는 항체를 사용하여 감염 병소에 직접 타겟팅하여 감염균을 선택적으로 죽임으로써 약품에 내성이 있는 감염을 치료할 때에 발생하는 많은 문제점을 해결할 수 있다. 또한 병소로 타겟팅된 약품은 감염 부위에서는 높은 농도로 약효를 상승시킬 수 있다.
상기 항체-치료제 결합체에서 치료제로 이용될 수 있는 면역조절제는 림포카인 및 사이토카인를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
결국, 본 발명은 비브리오 패혈증균 RtxA1 단백질에 대한 다클론항체 및 단일클론항체 및 상기 항체를 생산하는 하이브리도마세포주를 제공하며, 본 발명의 비브리오 패혈증균 RtxA1 단백질에 대한 다클론항체 및 단일클론항체는 비브리오 패혈증균 RtxA1 단백질에 대한 고친화도의 특이적 결합능력을 가지므로, 비브리오 패혈증의 진단 및 진단용 키트 제조에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 다클론항체 및 단일클론항체의 비브리오 패혈증 감염 억제 효과, 비브리오 패혈증 감염에 대한 예방 및 치료 효과뿐만 아니라, 비브리오 패혈증 감염 후 마우스 생존율이 우수하여 비브리오 패혈증에 대한 치료제로 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
[실시예]
실시예 1: 비브리오 패혈증균의 재조합 RtxA1 합성을 위한 올리고뉴클레오타이드 합성
NheI 및 XhoI 제한효소 인식부위를 갖는 하기 2개의 올리고 뉴클레오타이드를 합성하였다. 또한 RA-4701R 올리고 뉴클레오타이드는 재조합 RtxA1의 정제 과정 중 히스티딘-결합 레진을 이용한 크로마토그래프에 의한 정제과정을 추가 포함하기 위하여 6개의 히스티딘(6x-His tag)을 포함하고 있다.
RA-3491F:5'-ACATGAATTCATGCAGAGAAGTTTGGCGACTAC-3'(서열번호: 1, 전방 프라이머)
RA-4701R:5'-CTCCTCGAGCTAATGATGATGATGATGATGCACCGTTATACCCTTTTTATG-3' (서열번호: 2, 후방 프라이머)
상기 뉴클레오티드를 후속하는 비브리오 패혈증균 RtxA1 유전자의 증폭 (하기 실시예 2) 및 재조합 RtxA1 단백질 생산을 위한 재조합벡터의 제조에 이용하였다.
실시예 2: 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction (PCR))
중합효소 및 상기 실시예 1에서 합성한 전방 프라이머(서열번호 1) 및 후방 프라이머(서열번호 2)를 혼합한 반응용액에 비브리오 패혈증균 RtxA1 전장 DNA(서열번호 3, 14106bp)-(NCBI accession No. CP002470.1)를 주형 (template)으로 혼합하여 중합효소연쇄반응을 수행하여 비브리오 패혈증균 RtxA1의 아미노산 서열 3491부터 4701부분을 증폭(RtxA1(3491-4701)로 명명함)하였다. 서열번호 4는 전장 비브리오 패혈증균 RtxA1의 아미노산 서열-(NCBI accession No.YP_004191172.1)이다. 중합효소연쇄반응을 위하여 써멀싸이클러(Thermalcycler(PTC-100), MJ Research. Inc, 미국)를 사용하였으며 94℃에서 3분간 사전변성(predenaturation) 시킨 후, 94℃에서 1분간 변성(denaturation), 55℃에서 1분간 결합(annealing) 및 72℃에서 4분간 연장(extension)을 30회 반복 실시하고, 마지막으로 72℃에서 10분간 추가 반응시켰다. 다음 중합효소와 비특이적 증폭산물을 제거하기 위해 아가로즈 겔에서 전기영동 후 원하는 증폭산물 밴드 부위를 조각내어 겔 추출 키트(Geneall, 한국)를 이용하여 정제하였다.
실시예 3: 재조합 RtxA1(3491-4701) 발현 벡터의 제작
도 1의 개열 지도를 갖는 재조합 RtxA1 플라스미드 벡터를 제작하였다. 구체적으로, 상기 실시예 2에서 정제된 C-말단에 poly his tag 서열인 CATCATCATCATCATCAT(6x-His tag)을 삽입한 RtxA1(3491-4701)의 증폭산물을 EcoRI(Fermentas, 캐나다)으로 절단 후 대장균 중합효소인 Klenow(New England Biolab, 미국)을 이용하여 절단면을 채우고(fill in), XhoI (Fermentas, 캐나다)으로 절단하였다. 또한, pET-21(a) (Novagen, 미국) 벡터는 NheI (Fermentas, 캐나다)으로 절단 후 대장균 중합효소인 Klenow(New England Biolab, 미국)을 이용하여 절단면을 채우고(fill in), XhoI(Fermentas, 캐나다)으로 절단하였다. 절단된 단편과 벡터는 상기 실시예 2에서 이용된 겔 추출 키트 (Geneall, 한국)를 이용하여 정제한 후 정제된 RtxA1 유전자 단편 1 ㎍과 pET-21(a) 단편 30 ng을 혼합하고, 10배 농도의 접합 농축액(10 mM DTT, 100 mM MgCl2, 10 mM ATP, 600 mM Tris-HCl, pH7.5) 1㎕ 및 T4 DNA 연결효소 (ligase, Takara) 10 단위(unit)를 가하여 전체 부피를 10㎕로 조정하고 상온에서 16시간 반응시켜, pET-21(a) 벡터에 재조합 RtxA1 유전자(서열번호 5 + 6x-His tag)가 삽입된 9,027bp의 도 1의 개열지도를 갖는 환형 플라스미드(pET-RtxA1(3491-4701)로 명명)를 제조하였다. 다음 플라스미드를 증폭하고, RtxA1(3491-4701) 유전자(서열번호 5)가 삽입된 pET-RtxA1(3491-4701)만을 순수분리하기 위해 대장균 DH5α(Invitrogen, 미국)에 삽입하였다. 형질전환된 대장균으로부터 재조합 pET-RtxA1(3491-4701)을 재추출한 후 DNA 염기서열 분석과 제한효소를 처리하고 아가로스 겔 전기영동을 실시하여 pET-RtxA1(3491-4701)에 비브리오패혈증균 RtxA1(3491-4701) 유전자의 존재 유무를 확인하였다.
실시예 4: 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질의 발현
상기 실시예 3에서 제조한 재조합 RtxA1 벡터 pET-RtxA1(3491-4701)의 발현을 위해 대장균 BL21(DE3)/pLyS(Invitrogen, 미국)에 삽입하였다. 형질전환된 대장균을 37℃ 진탕 배양기에서 4시간 배양한 후 1 mM IPTG을 첨가하여 다시 3시간을 더 배양하였다. 이렇게 배양한 형질전환된 대장균을 8,000 rpm에서 30분간 원심분리한 후, 대장균침전물은 용출완축액(300 mMNaCl, 25 mM Tris-HCl(pH 7.5), 10% glycerol, 0.1% Tween-20)으로 현탁하였다. 단백질 추출을 위해 현탁한 대장균침전물을 초음파분쇄기(sonicator)를 이용하여 파쇄한 후 원심분리에 의해 상등의 단백질 추출액을 수집하였다.
실시예 5: 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질의 정제
재조합 RtxA1(3491-4701) 제조용 벡터 pET-RtxA1(3491-4701)으로형질전환된 대장균에서 상기 실시예 4의 방법으로 단백질을 추출한 후, Ni-NTA크로마토그래피 (Qiagen, 미국)를 제조자의 지시에 따라 단백질 추출액으로부터 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질을 1차적으로 정제하였다. Ni-NTA 크로마토그래피를 이용하여 1차 정제한 재조합 RtxA1(3491-4701)단백질을 겔 여과 액체크로마토그래피(size exclusion-FPLC) (GE Healthcare, 미국)을 이용하여 2차적으로 순수 정제하여 재조합 RtxA1(3491-4701)단백질(서열번호 6 + 6x-His tag)을 생산하였다. 정제양상과 정제 효율은 SDS-PAGE를 수행하여 확인하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 레인 1은 정제된 대조군 Glutathione Stransferase(GST로 명명) 단백질이고, 별표는 대조군 단백질 GST의 위치를 나타낸다. 또한, 레인 2는 Ni-NTA 크로마토그래피와 겔 여과 액체크로마토그래피에서 정제된 RtxA1(3491-4701)단백질이고, 화살표는 정제된 재조합 RtxA1 (3491-4701) 단백질의 위치를 나타낸다. 레인 2에서 확인되는 바와 같이 정제된 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질은 98%의 순도를 보였다.
실시예 6: 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질의 특이성 분석
상기 실시예 5에서 확인된 130 kDa의 재조합 RtxA1(3491-4701)단백질과 대조군 GST 단백질을 SDS-PAGE를 실시하고, 전기영동 종료 후 겔 상 단백질을 토우빈 (Towbin)의 (Towbin H, Staehelin T, Gordon J. ProcNatlAcadSci USA 1979; 76:4350-4354)방법에 따라 니트로셀룰로오스 막(Nitrocellulose membrane)(Bio-Rad)으로 옮겼다. 단백질이 이적된 니트로셀룰로오스 막을 5% 탈지유(skim milk)가함유된 인산완충용액으로 비특이적 반응을 차단하였다. 여기에 실시예 18의 비브리오 패혈증균에 감염된 CD-1 쥐에서 얻은 혈청을 1:1000의 부피비로 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응시키고, 퍼옥시다제로표지된 IgG (Jackson labatory, 미국) 2차 항체를 제조사의 지시에 따라 희석하여 사용하였다. 1차와 2차 항체로 반응시킨 후에는 인산완충용액(PBS)으로 3회에 걸쳐 세척하였다. 2차 항체반응 및 세척이 끝난 니트로셀룰로오스 막에 ECL 웨스턴 블럿 (western blot) 기질액(Amersham, 미국)을 처리하고, 발광영상분석기(LAS-1000 luminescent image analyzer; Fujifilm, 일본)를 이용하여 결과를 분석하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이, 레인 1은 대조군 GST 단백질이고, 레인 2는 재조합 RtxA1(3491-4701)단백질이다.
도 3에서 확인되는 바와 같이 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질은 야생종 비브리오 패혈증균 감염 혈청에 대해서 양성반응을 보이나, 대조군 GST은 반응하지 않았다. 따라서, 실시예 5에서 순수 정제된 130kDa의 재조합 단백질은 비브리오 패혈증균 RtxA1(3491-4701) 단백질임이 확인되었다.
결국, 본 발명에 따른 재조합 RtxA1(3491-4701) 발현 벡터는 비브리오 패혈증균 RtxA1단백질에 대한 단일클론항체 생성에 매우 유용한 재조합 RtxA1 단백질 항원을 제공한다. 또한, 이는 비브리오 패혈증균 RtxA1을 이용한 진단에 매우 유용한 재조합 RtxA1(3491-4701)단백질을 제공하고, 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질의 대량 발현 및 정제가 용이하게 한다. 따라서 이와 같은 형질전환 대장균에서 발현된 재조합 RtxA1(3491-4701)단백질은 비브리오 패혈증균에 대한 진단제 또는 진단키트, 비브리오 패혈증 예방 또는 치료용 백신의 제조, 및 비브리오 패혈증균에 대한 항체 생산 등에 이용될 수 있다.
실시예 7: 단일클론항체 생산 세포주 제작을 위한 마우스 면역
실시예 5에서 제조된 RtxA1(3491-4701) 재조합 항원 단백질(서열 번호 6+6x-His tag)을 Sigma adjuvant(Sigma, 미국)와 동량(1:1의 부피비로)으로 혼합한 다음, 3주 간격으로 4차례 BALB/C(암컷, 8 주령) 마우스의 복강에 200㎕씩 주사하였다. 4번째 면역 한 달 후 꼬리 정맥으로 정제된 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질을 투여한 3일 후에 비장을 적출하여 세포융합에 사용하였다.
실시예 8: B-임프아세포(B-lymphoblast)인 P3X63Ag8.653의 배양
세포융합 5일 전에 질소통에서 보관된 골수종세포(myeloma)인 P3X63Ag8.653 (ATCC accession number CRL-1580)를 꺼내어 10% 우태아혈청(FBS)이 첨가된 IMDM(Invitrogen, 미국) 배지에 현탁시키고, 1,000 rmp에서 5분간 원심분리하였다. 상층액을 버리고 침전세포를 조심스럽게 10% 우태아혈청이 첨가된 IMDM에 다시 현탁 시켜 5% 탄산가스가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였다.
실시예 9: 세포융합(cell fusion)
세포융합은 폴리에틸렌글리콜을 사용하는 일반적인 방법 (EdHarlow, David Lane :Antibodis, A laboratory manual. Cold Springs Harbor press, 1988 P139-244)에 따라 다음과 같이 실시하였다. 실시예 7에서 적출한 비장에서 비장세포들(splenocytes)을 cell strainer(Falcon, 미국)를 이용하여 분리하고, 1 × 108 세포/㎖의 농도로 희석하였다. 1 × 107 세포/㎖의 골수종(myeloma) 세포와 1㎖의 PEG1500(Sigma, 미국)을 혼합하여 융합시켰다. 융합이 완료된 세포를 200㎖의 HAT(Sigma, 미국) 배지에 희석시킨 후 96 웰 마이크로 플레이트에 100 ㎕씩 분주하고, 5% 탄산가스가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였다.
실시예 10: 세포융합된 하이브리도마 세포에서 RtxA1(3491-4701)항체 생성 확인
융합된 세포의 항체 생성 여부는 대장균에서 발현된 재조합 RtxA1(3491-4701) 항원과 융합된 세포 배양액을 이용하여 ELISA를 수행하여 확인하였다. 재조합 RtxA1(3491-4701) 항원 단백질을 탄산염 완충액(carbonate buffer)(pH 9.4)으로 10 ㎍/㎖ 농도로 희석한 다음, Maxisorp ELISA 플레이트(Nunc, 미국)의 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고, 4℃에서 16시간 반응시켜 항원을 코팅하였다. 항원이 코팅된 각 웰에 1% BSA 가 포함된 블러킹완충용액 (PBS, 0.05% Tween-20, 1% BSA, 3% 열 비활성 말 혈청)을 처리하여 37℃에서 1시간 동안 비특이적 반응을 차단하였다. 각 웰에 융합된 세포배양액을 50 ㎕씩 첨가하고, 4℃에서 1시간 반응한 다음 세척완충용액(PBS, 0.05% Tween-20, 0.05% BSA)으로 3회 세척하였다. 세척 후 1:1000배 희석한 Biotin-축합 항-마우스 IgG+IgA+IgM 항체(1:2,000; Sigma, 미국)를 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 1 시간 반응시킨 다음 세척완충용액으로 3회 세척하였다. 세척 후, HRP(Horseradish peroxidase)-축합 streptavidin(Invitrogen, 미국)를 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 1 시간 반응시킨 후 다시 세척완충용액으로 3회 세척한 후, 연이어 TMB (3,3',5,5' -tetramethylbenzidine)(Sigma, 미국) 기질용액을 각 웰(well)에 100 ㎕씩 첨가하고 암소에서 30분간 반응시켜 발색한 후 2N H2SO4를 처리하여 효소반응을 정지시켰다. 반응 후, ELISA 리더기를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 비브리오 패혈증균 RtxA1(3491-4701) 항원과 반응하는 37개의 하이브리도마 세포를 얻었다.
실시예 11: 하이브리도마 세포의 클로닝
융합된 37개의 하이브리도마 세포의 클로닝을 위하여 실시예 5에서 얻은 재조합 RtxA1(3491-4701) 항원과 반응하는 하이브리도마를 96 웰 플레이트의 첫 번째 웰에 약 10개의 세포가 들어가도록 세포 부유액을 넣은 후, 행으로 2배 단계 희석하고, 이를 다시 열로 2배 단계 희석하는 방법으로 2회 클로닝 하였다. 선별된 하이브리도마 클론은 30% 우태아 혈청과 7.5% DMSO(dimethyl sulfoxide)가 함유된 IMDM배지에 현탁 시켜 액체질소에 보관하였다.
실시예 12: 단일클론항체의 복수(ascites) 생산 및 정제
단일클론항체의 복수 생산을 위하여, 실시예 11에서 선발된 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마를 배양하여 프리스텐(Sigma, 미국)으로 프라이밍(priming)한 BALB/C (암컷, 8 주령) 마우스의 복강내에 1 × 106 세포/㎖의 농도로 0.5 ㎖ 주입하고, 마우스의 복강내에 복수가 생성되면 채취하였다. 수확한 복수를 1500 rpm으로 10분간 원심분리하고, 상층액을 수확하여 -80℃ 초저온 냉동고에서 보관하였다.
또한, 단일클론항체의 정제를 위해서는 실시예 11에서 선발된 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 37℃, 5% 탄산가스 항온기에서 배양 후, 상등액에서 항체를 정제하였다. 항체의 정제는 단백질 A 또는 G 크로마토그래피(Peptron, 한국)를 이용하였으며, 실험과정은 제조사의 방법에 따라 수행하였다.
실시예 13: 이소타이핑(isotyping)에 의한 단일클론항체의 선별
단일클론항체의 이소타입(isotype)의 결정은 ELISA를 실시하여 조사하였다.
이소타입 결정을 위하여, 토끼에서 생선 된 각각의 쥐(mice)의 이소타입에 대한 정제된 항체가 탄산염 완충액(carbonate buffer, pH 9.4)로 10 ㎍/㎖ 농도로 희석한 다음 Maxisorp ELISA 플레이트(Nunc, 미국)의 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고, 4℃에서 16시간 반응시켜 항체를 코팅하였다. 각각의 이소타입 항체가 코팅된 각 웰에 1% BSA가 포함된 블러킹 완충용액(PBS, 0.05% Tween-20, 1% BSA, 3% 열 비활성 말 혈청)을 처리하여 37℃에서 1시간 동안 비특이적 반응을 차단하였다.각 웰에 단일클론항체 생성 하이브리도마 세포배양액을 50 ㎕씩 첨가하고, 4℃에서 1 시간 반응한 다음, 세척완충용액(PBS, 0.05% Tween-20, 0.05% BSA)으로 3회 세척하였다. 세척 후 1:1000배 희석한 HRP (Horseradish peroxidase)-축합 항-마우스 IgG+IgA+IgM 항체 (1:2000; Sigma, 미국)를 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 1 시간 반응시킨 다음 세척완충용액으로 3회 세척하였다. 세척 후 TMB (3,3',5,5'- tetramethylbenzidine) (Sigma, 미국) 기질용액을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하고 암소에서 30분간 반응시켜 발색한 후, 2N H2SO4를 처리하여 효소반응을 정지시켰다.반응 후 ELISA 리더를 이용하여 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.
표 1에 나타난 바와 같이, 이소타입을 분석한 결과, 중쇄(heavy chain)의 서브클래스에 따라 분류할 수 있었으며, 16개는 IgG1 서브클래스, 18개는 IgG2a 서브 클래스 및 나머지 3개는 IgG2b 서브클래스의 이소타입을 가짐을 확인할 수 있었다.
실시예 14: 단일클론항체의 친화도 분석 및 항원결정기 분석을 위한 RtxA1(3491-4701) 단편의 발현
비브리오 패혈증균 RtxA1의 아미노산 서열 3491부터 4701을 포함하는 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질은 실시예 4에서 발현된 것을 사용했다. 비브리오 패혈증균 RtxA1의 아미노산 서열 3491부터 4380을 포함하는 RtxA1(3491-4380)의 유전자 부위는 EcoRI 및 XhoI 제한효소 인식부위를 갖는 하기 2개(RA-3491F2와 RA-4380R)의 올리고 뉴클레오타이드와 중합효소연쇄반응를 이용하여 실시예 2와 같은 방법으로 증폭하였다.
RA-3491F2:5´-ACATGAATTCATACCATGGCAGAGAAGTTTGGCGACTAC-3´(서열번호 7, 전방 프라이머)
RA-4380R:5´-CCATTCTCGAGCTAATGATGATGATGATGATGCGTGCCTGTTGCGTAGAACAC-3´ (서열번호 8, 후방 프라이머)
또한, RtxA1의 아미노산 서열 3491부터 3980을 포함하는 RtxA1(3491-3980)의 유전자 부위는 EcoRI 및 XhoI 제한효소 인식부위를 갖는 하기 2개(RA-3491F2와 RA-3980R)의 올리고 뉴클레오타이드와 중합효소연쇄반응을 이용하여 실시예 2와 같은 방법으로 증폭하였다.
RA-3491F2: 5´-ACATGAATTCATACCATGGCAGAGAAGTTTGGCGACTAC-3´´(서열번호 7, 전방 프라이머)
RA-3980R:5´-CCATTCTCGAGCTAATGATGATGATGATGATGCTCACCCGAGGTGGCAATGC-3´ (서열번호 9, 후방프라이머)
증폭된 RtxA1(3491-4380) 및 RtxA1(3491-3980) 유전자 부위는 실시예 3과 같은 방법으로 pET-21(a) 벡터에 삽입되고, 실시예 4와 같은 방법으로 형질전환된 대장균을 이용하여 재조합 RtxA1(3491-4380)과 RtxA1(3491-3980) 단백질을 발현하고 추출하였다(도 5). 추출된 재조합 단백질의 특이성 분석은 실시예 6과 같은 방법을 이용하여 확인 하였다(도 6). 그 결과를 도 5 내지 6에 나타내었다.
도 4는 형질전환 대장균에서 발현된 재조합 RtxA1(3491-4701) 단편 단백질을 모식적으로 보여 주고 있다.
또한, 도 5는 분자량 크기는 도의 왼쪽에 표시되어 있고, 제1레인, 2레인, 3레인 및 4레인은 각각 대조군 재조합 단백질과 재조합 RtxA1(3491-4701), RtxA1(3491-4380) 및 RtxA1(3491-3980)을 발현하는 형질 전환 대장균에서 추출된 단백질을 나타낸다. 화살표는 발현된 재조합 RtxA1(3491-4701), RtxA1 (3491-4380) 및 RtxA1(3491-3980) 단백질의 위치를 나타낸다.
나아가, 도 6은 비브리오 패혈증균 RtxA1 단백질에 대한 항체를 이용하여 재조합 RtxA1(3491-4701), RtxA1 (3491-4380) 및 RtxA1(3491-3980) 단백질의 특이성을 분석한 결과이다. 분자량 크기는 도의 왼쪽에 표시되어 있고, 레인 1, 레인 2, 레인3 과 레인 4는 각각 대조군 재조합 단백질, 재조합 RtxA1(3491-4701), RtxA1 (3491-4380) 및 RtxA1(3491-3980)을 발현하는 형질 전환 대장균에서 추출된 단백질을 나타낸다. 화살표는 RtxA1 단백질에 대한 항체가 양성 반응 보이는 RtxA1(3491-4701), RtxA1(3491-4380) 및 RtxA1(3491-3980) 단백질의 위치를 나타낸다.
따라서, 도 5 및 도 6을 통해 재조합 RtxA1(3491-4701), RtxA1(3491-4380) 및 RtxA1(3491-3980)단백질이 확인되었다.
실시예 15: 단일클론항체의 친화도 분석 및 항원결정기 분석
진단 및 치료용 단일클론항체의 선별에 유용한 정보로 사용되는 단일클론항체의 친화도 분석 및 항원결정기 분석은 실시예 14에서 확인한 재조합 RtxA1(3491-4701)의 단편과 ELISA법에 의해 수행되었다.
재조합 RtxA1(3491-4701), RtxA1 (3491-4380) 및 RtxA1(3491-3980) 단백질을 발현하는 형질전환 대장균 추출물을 각각 탄산염 완충액 (carbonate buffer) (pH 9.4)으로 희석한 다음, Maxisorp ELISA 플레이트 (Nunc, 미국)의 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고, 4℃에서 16 시간 반응시켜 각각의 재조합 단백질을 코팅하였다. 각각의 재조합 단백질이 코팅된 각 웰에 1% BSA가 포함된 블로킹완충용액(PBS, 0.05% Tween-20, 1% BSA, 3% 열비활성 말 혈청)을 처리하여 37℃에서 1시간 동안 비특이적 반응을 차단하였다. 각 웰에 단일클론항체를 포함한 세포배양액을 50 ㎕씩 첨가하고, 4℃에서 1 시간 반응한 다음 세척완충용액(PBS, 0.05% Tween-20, 0.05% BSA)으로 3회 세척하였다. 세척 후 1:1000배 희석한 Biotin-축합 항-마우스 IgG+IgA+IgM 항체(1: 2,000; Sigma, 미국)를 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 1 시간 반응시킨 다음, 세척완충용액으로 3회 세척하였다. 세척 후 HRP(Horseradish peroxidase)-축합 streptavidin를 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 1 시간 반응시킨 후, 다시 세척완충용액으로 3회 세척하고, 연이어 TMB(3,3',5,5' - tetramethyl-benzidine)(Sigma, 미국) 기질용액을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하여 암소에서 30분간 반응시켜 발색한 다음, 2N H2SO4를 처리하여 효소반응을 정지시켰다. 반응 후 ELISA 리더를 이용하여 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.
하기 표 1에서 확인되는 바와 같이, 단일클론항체의 항원결정기 분석 결과, 10개는 재조합 단백질 RtxA1(3491-4701) 항원을 강하게 인식하였고, 13개는 RtxA1(3491-4380) 및 RtxA1(3491-4701)항원을 동시에 인식하였다. 또한, 14개는 RtxA1(3491-3980)항원, RtxA1(3491-4380)항원 및 RtxA1(3491-4701)항원을 모두 인식하였다.
이를 통하여 14개(2RA, 3RA, 8RA, 11RA, 19RA, 21RA, 22RA, 23RA, 24RA, 32RA, 40RA, 46RA, 47RA, 50RA)는 RtxA1(3491-3980)을 인식하고, 13개(1RA, 5RA, 7RA, 9RA, 12RA, 13RA, 14RA, 20RA, 26RA, 28RA, 29RA, 38RA, 44RA)는 RtxA1(3981-4380)을 인식하고, 10개(4RA, 10RA, 16RA, 27RA, 30RA, 41RA, 42RA, 45RA, 48RA, 45RA, 48RA, 52RA)는 RtxA1(4381-4701)을 인식함을 알 수 있었다(도 7).
따라서, 본 발명을 통해 항원결정기가 다른 3그룹의 단일클론항체를 확보할 수 있었으며, 각 그룹의 단일클론항체들은 비브리오 패혈증균의 예방 및 치료용 단일클론항체 및 비브리오 패혈증균의 항원진단제 개발뿐만 아니라, 단일클론항체를 이용한 비브리오 패혈증균에 대한 기초연구에 유용하게 이용될 수 있다.
실시예 16: 단일클론항체들간의 경쟁적 결합 분석
RtxA1(3491-3980)을 인식하는 47RA 단일클론항체와 실시예 23에서 치료효과 조사를 위해 사용한 3개(13RA, 21RA, 24RA)및 10RA의 단일클론항체와 결합부위가 상이한지를 알아보기 위해서, Biotin로 표지(labeling)된 47RA(Biotin-축합 47RA로 명명)을 이용하여, 단일클론항체들간의 경쟁적 결합 분석을 수행하였다.
Biotin-축합 47RA을 생성하기 위해서, 실시예 12에서 정제한 47RA와 항체 Biotin labeling kit(FluoReporter Biotin-XX Protein labelling kit, Molecular Probes, 미국)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 수행하였으며, Biotin-축합 47RA을 생성 하였다.
단일클론항체 47RA와 4개(10RA, 13RA, 21RA, 24RA)의 단일클론항체들간의 경쟁적 결합분석을 위하여, 실시예 5에서 정제된 재조합 RtxA1(3491-4701)와 Biotin-축합 47RA을 이용한 경쟁적 ELISA을 수행하였다.
실시예 5에서 정제된 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질을 탄산염 완충액 (carbonate buffer, pH 9.4)으로 2 ㎍/㎖로 희석한 다음 Maxisorp ELISA 플레이트 (Nunc, 미국)의 각 웰 당 55 ㎕씩 첨가하고, 4℃에서 16시간 반응시켜 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질을 코팅하였다. 재조합 단백질을 코팅한 각 웰에 1% BSA가 포함된 블로킹완충용액 (PBS, 0.05% Tween-20, 1% BSA, 3% 열비활성 말 혈청)을 처리하여 37℃에서 1시간 동안 비특이적 반응을 차단하였다. 각 웰에 단일클론항체를 포함한 세포배양액을 50 ㎕씩 첨가하고, 4℃에서 1 시간 반응한 다음, 4 ㎍/㎖의 Biotin-축합 47RA을 15 ㎕씩 추가로 첨가하고 4℃에서 1 시간 반응시켰다. 그 후, 세척완충용액(PBS, 0.05% Tween-20, 0.05% BSA)으로 3회 세척하고, HRP(Horseradish peroxidase)-축합 streptavidin를 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 1 시간 반응시킨 후, 다시 세척완충용액으로 3회 세척하고 연이어 TMB(3,3',5,5' - tetramethyl-benzidine)(Sigma, 미국) 기질용액을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하여 암소에서 30분간 반응시켜 발색한 후 2N H2SO4를 처리하여 효소반응을 정지시켰다. 반응 후 ELISA 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하고, 각각의 단일클론항체가 존재할 때의 Biotin-축합 47RA 결합 강도를 %로 나타내었다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, 결과적으로 Biotin-축합 47RA는 4개(10RA, 13RA, 21RA, 24RA)의 단일클론항체와 재조합 RtxA1(3491-4701)단백질에 경쟁적 결합을 하지 않았다.
따라서, 단일클론항체 47RA는 상기 4개(10RA, 13RA, 21RA, 24RA) 단일클론항체와 서로 다른 부위(에페토프)에 결합함을 나타낸다.
실시예 17: 야생종 비브리오 패혈증균의 배양
야생종 비브리오 패혈증균 M06-24/O 균주(Reddy GP, Hayat U, Abeygunawardana C, Fox C, et al. J Bacteriol. 174:2620-2630,1992)를 2.5% NaCl을 포함한 HI(heart infusion) 배지에 접종한 후, 37℃ 진탕 배양기에서 16시간 배양하였다. 이 배양액의 1/200을 다시 2.5% NaCl이 포함한 HI 배지(Difco Co.)에 접종한 후, 37℃ 진탕 배양기에서 4시간 동안 본 배양을 수행하였다.
실시예 18: 야생종 비브리오 패혈증균 감염 혈청 생성
CD1(암컷, 8 주령) 마우스에 실시예 17에서 배양한 야생종 비브리오 패혈증균 1 × 106/㎖를 복강 내에 투여하고, 3주 후에 액와정맥(axillary vein) 절개를 통하여 혈액을 얻고, 12000 rpm에서 3분간 원심분리 하여 야생종 비브리오 패혈증균 감염 혈청을 생성하였다.
실시예 19: 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질 항원의 백신 효과
실시예 5에서 제조된 RtxA1(3491-4701) 재조합 항원단백질(서열 번호 6+6x-His tag tag) 20 ㎍을 실시예 7과 같은 방법으로 Sigma adjuvant(Sigma,미국)와 혼합한 다음, 3주 간격으로 2차례 CD1(암컷, 8 주령) 마우스의 복강에 주사하였다. 2번째 면역 후 14일 후에 실시예 17에서 배양한 야생종 비브리오 패혈증균 8 × 106/㎖을 복강으로 투여하고 치사 여부를 96시간 동안 관찰하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질(도 9에는 "RtxA1-C"로 표시함)로 백신네이션(또는 면역)된 마우스는 93.3%의 생존율을 보였으며, 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질 항원의 우수한 백신 효과를 확인할 수 있었다. 하지만, 대조군 재조합 GST 단백질로 면역된 그룹은 6.7%의 매우 낮은 생존율을 보였다.
실시예 20: 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질 항원의 백신네이션(또는 면역된)이 혈중 비브리오 패혈증균 개수에 미치는 효과
실시예 19와 같이 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질 항원과 Sigma adjuvant(Sigma, 미국)의 혼합물을 3주 간격으로 2차례 CD1(암컷, 8 주령) 마우스의 복강에 주사하였다. 2번째 면역 후 14일 후에 실시예 17에서 배양한 야생종 비브리오 패혈증균 8 × 106/㎖을 복강으로 투여하고 150분 후에 액와정맥 절개를 통하여 혈액을 얻은 후에 10배씩 인산완충용액에 희석하였다. 이렇게 희석한 샘플을 고체 HI 배지에 도말하여콜로니(colony)형성을 조사하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질 항원으로 백신네이션(또는 면역)된 마우스 9마리 중 1마리만이 1 ㎖ 혈액 중 40개의 비브리오 패혈증균을 가지고 있었다. 하지만, 대조군 재조합 GST 단백질로 백신네이션(또는 면역)된 모든 마우스의 혈액에서는 평균 1 × 105/㎖의 많은 수의 비리오 패혈증균이 관찰되었다.
이를 통해 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질 항원으로 백신네이션(또는 면역)된 마우스는 혈중 비브리오 패혈증균을 감소시킴으로써 백신효과를 보임을 의미하는 것이다.
실시예 21: RtxA1(3491-4701) 단백질에 대한 다중클론항체의 예방 및 치료효과
실시예 5에서 제조된 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질(서열 번호 6+6x-His tag) 20 ㎍을 실시예 7와 같이 Sigma adjuvant(Sigma, 미국)와 혼합한 다음 3주 간격으로 3차례 CD1(암컷, 8 주령) 마우스의 복강에 주사하였다. 3번째 면역 후 14일 후에 액와정맥절개을 통하여 혈액을 얻은 후 12,000 rpm에서 3분간 원심분리 하여 RtxA1(3491-4701) 단백질에 대한 다중클론항체를 포함한 혈청을 생성하였다.
재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질에 대한 다중클론항체의 예방효과를RtxA1(3491-4701) 단백질에 대한 다중클론항체를 포함한 혈청을 생성하였다.
재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질에 대한 다중클론항체의 예방효과를 확인하기 위해서, CD1(암컷, 8 주령) 마우스에 200 ㎕의 RtxA1(3491-4701) 단백질의 다중클론항체를 포함한 혈청을 복강으로 투여하고, 4시간 30분 후에 실시예 17에서 배양한 야생종 비브리오 패혈증균 2 × 106/㎖을 복강으로 투여하고, 치사 여부를 96시간 동안 관찰하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타난 바와 같이, 비브리오 패혈증균 감염 전 RtxA1(3491-4701) 단백질에 대한 다중클론항체를 포함한 혈청을 투여한 마우스는 100%의 생존율을 보였다. 하지만, 대조군 재조합 GST 단백질에 대한 다중클론항체를 포함한 혈청을 투여 받은 마우스는 10%의 매우 낮은 생존율을 보였다.
재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질에 대한 다중클론항체의 치료효과를 확인하기 위해서, CD1(암컷, 8 주령) 마우스에 실시예 17에서 배양한 야생종 비브리오 패혈증균 2 × 106/㎖을 복강으로 투여하고 1시간 후에 200 ㎕의 RtxA1(3491-4701) 단백질에 대한 다중클론항체를 포함한 혈청을 복강으로 투여하고, 치사여부를 96시간 동안 관찰하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타난 바와 같이, 비브리오 패혈증균 감염 후 RtxA1(3491-4701) 단백질에 대한 다중클론항체를 포함한 혈청을 투여한 마우스는 100%의 생존율을 보였다. 하지만, 대조군 재조합 GST 단백질에 대한 다중클론항체를 포함한 혈청을 투여 받은 마우스는 10%의 매우 낮은 생존율을 보였다.
이를 통해, 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질에 대한 다중클론항체가 비브리오 패혈증균 감염에 대한 예방 및 치료 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

실시예 22: 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질에 대한 단일클론항체의 비브리오 패혈증 감염에 대한 예방효과
재조합 RtxA1(3491-4701)단백질에 대한 단일클론항체의 예방효과를 확인하기 위해서, CD1(암컷, 8 주령) 마우스에 실시예 12에서 얻은 각각의 단일클론항체를 200ul/mouse(복수로 얻은 단일클론항체; 하기 표 1에서 "ASC"로 기재)나 1mg/mosue(정제된 단일클론항체; 하기 표 1에서 "PUR" 표시))을 복강으로 투여하고, 4시간 30분 후에 실시예 17에서 배양한 야생종 비브리오 패혈증균 1 ×106/㎖을 복강으로 투여하고, 치사 여부를 96시간 동안 관찰하였다. 그 결과를 표 1 및 도 13에 나타내었다.
단일클론
항체		 이소
타입		 결합부위 Protective activity
RtxA1 (3491-3980) RtxA1 (3491-4380) RtxA1 (3491-4701) % Surviving mice Antibody source
PBS( 대조군) - - - - 30
1RA IgG1 - + + 20 ASC
2RA IgG2a + + + 60 ASC
3RA IgG1 + + + 70 ASC
4RA IgG1 - - + 50 PUR
5RA IgG2a - + + 60 ASC
7RA IgG1 - + + 40 ASC
8RA IgG2b + + + 30 ASC
9RA IgG1 - + + 20 ASC
10RA IgG1 - - + 20 PUR
11RA IgG2a + + + 80 ASC
12RA IgG2a - + + 60 ASC
13RA IgG2a - + + 100 ASC
14RA IgG1 - + + 50 ASC
16RA IgG2a - - + 40 ASC
19RA IgG2a + + + 70 ASC
20RA IgG1 - + + 30 ASC
21RA IgG2a + + + 100 ASC/PUR
22RA IgG2b + + + 30 ASC
23RA IgG2a + + + 20 ASC
24RA IgG2a + + + 100 ASC/PUR
26RA IgG1 - + + 30 ASC
27RA IgG2a - - + 30 ASC
28RA IgG2a - + + 30 ASC
29RA IgG1 - + + 50 ASC
30RA IgG1 - - + 50 ASC
32RA IgG2b + + + 30 ASC
38RA IgG2a - + + 40 ASC
40RA IgG1 + + + 30 ASC
41RA IgG1 - - + 50 ASC
42RA IgG2a - - + 70 ASC
44RA IgG1 - + + 60 ASC
45RA IgG2a - - + 90 ASC
46RA IgG2a + + + 90 ASC
47RA IgG2a + + + 90 PUR
48RA IgG1 - - + 40 ASC
50RA IgG2a + + + 100 ASC
52RA IgG1 - - + 60 ASC

상기 표 1 및 도 13에 나타난 바와 같이 13RA, 21RA, 24RA, 50RA는 비브리오 패혈증 감염에 대해서 100%의 예방효과를 보였고, 45RA, 46RA, 47RA는 90%의 예방효과를 보였다. 그러나, 대조군으로 인산완충용액을 투여한 마우스는 30%의 낮은 생존율을 보였다.
실시예 23: 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질에 대한 단일클론항체의 비브리오 패혈증 감염에 대한 치료효과
단일클론항체의 치료효과를 확인하기 위해서, CD1(암컷, 8 주령) 마우스에 실시예 17에서 배양한 야생종 비브리오 패혈증균 1 × 106/㎖을 복강으로 투여하고, 1시간이 후에 실시예 12에서 얻은 각각의 단일클론항체를 200 ㎕/mouse(복수로 얻은 단일클론항체)나 500 ㎍/mosue(정제된 단일클론항체)을 복강으로 투여하여 치사 여부를 96시간 동안 관찰하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다.
도 14에 나타난 바와 같이, 단일클론항체 24RA는 87%(P = 0.0001) 치료효과를 보였고, 47RA는 67%(P = 0.0207)의 통계적으로 큰 의미를 가지는 치료 효과를 보였다. 하지만, 대조군으로 인산완충용액을 투여한 마우스는 32%의 낮은 생존율을 보였다.
상기 표 1을 통해 알 수 있듯이, 재조합 RtxA1 단백질을 면역원으로 이용하여 융합된 하이브리도마 세포 37개에서 생산된 각각의 단일클론항체 중 이소타입에 따른 대량생산가능성, 단일클론항체들간의 경쟁적 결합, 단일클론항체의 비브리오 패혈증 감염에 대한 예방 및 치료효과, 비브리오패혈증 감염 후 마우스 생존율 등을 종합해 볼 때, 항원에 대한 항체의 결합부위, 이소타입 서브클래스는 및 치료효과가 각각 다른 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질에 대한 단일클론항체 중 24RA 및 47RA가 우수한 효과를 나타내었다. 특히, 단일클론항체 24RA는 비브리오 패혈증 감염에 대해서 아주 높은 치료효과를 보였다.
이를 통해 비브리오 패혈증균과 그에 관련된 감염에 의해서 유발되는 질병의 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있으며, 우수한 백신효과를 가짐으로써 비브리오 패혈증 예방제 및/또는 치료제로 사용될 수 있다.
따라서, 상기 24RA는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank)에 기탁번호 KCLRF-BP-00311로 기탁하고, 47RA는 기탁번호 KCLRF-BP-00309로 기탁하였다.
본 발명은 상술한 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 첫 번째 이용가능성은 비브리오 패혈증균에 대하여 고친화도의 특이적 결합능력으로 비브리오 패혈증균과 그에 관련된 감염에 의해서 유발되는 질병의 예방 및 치료 효과가 우수한 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 두번째 이용가능성은 본 발명의 단일클론항체를 포함하는 비브리오 패혈증 치료제, 비브리오 패혈증 예방제 및 비브리오 패혈증 진단 키트를 제공하는 것이다.

Claims (8)

  1. 비브리오 패혈증균 RtxA1 단백질에 대한 단일클론항체를 생산하는 것을 특징으로 하는 수탁번호 KCLRF-BP-00311인 하이브리도마 세포.
  2. 비브리오 패혈증균 RtxA1 단백질에 대한 단일클론항체를 생산하는 것을 특징으로 하는 수탁번호 KCLRF-BP-00309인 하이브리도마 세포.
  3. 수탁번호 KCLRF-BP-00311인 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 비브리오 패혈증균 RtxA1 단백질에 대한 단일클론항체 또는 이의 항원결합단편.
  4. 수탁번호 KCLRF-BP-00309인 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 비브리오 패혈증균 RtxA1 단백질에 대한 단일클론항체 또는 이의 항원결합단편.

  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 단일클론항체는 서열목록 4의 RtxA1 단백질의 3491 내지 3980번째 아미노산 서열 부위에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 항원결합단편.
  6. 제3항 또는 제4항의 단일클론항체 또는 이의 항원결합단편을 포함하는 비브리오 패혈증 치료제.
  7. 제3항 또는 제4항의 단일클론항체 또는 이의 항원결합단편을 포함하는 비브리오 패혈증 예방제.
  8. 제3항 또는 제4항의 단일클론항체 또는 이의 항원결합단편을 포함하는 비브리오 패혈증 진단 키트.
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