TWI489995B - 具有抗綠膿桿菌作用之人化ＰｃｒＶ抗體 - Google Patents

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Takafumi Sato
Toshinaga Tsuji
Keiko Kawamoto
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Description

具有抗綠膿桿菌作用之人化PcrV抗體
本發明是關於辨識PcrV之人化單株抗體或其一部分。具體言之，本發明是關於比習知抗PcrV抗體之中和活性(以下也稱為『細胞傷害阻害活性』)高的抗體或其一部分，以及含有彼等之醫藥組成物。
綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa )是廣泛存在於自然界之專性好氧(obligate aerobe)的革蘭氏陰性桿菌。通常其病原性低，但為於有癌症或糖尿病等各種基礎疾病之患者，由於正接受具有免疫抑制作用之藥劑的投與的患者，經常引起伺機性感染的病原菌，多造成引起肺炎、尿路感染症、敗血症等嚴重疾病的結果。綠膿桿菌感染症在臨床上已被認為是現在最難治療的感染症之一。其原因是綠膿桿菌對既存的抗生素感受性本來就低，且對各種抗生素容易獲得抗藥性，因此難治癒化的傾向強烈。就因如此對綠膿桿菌繼續開發新抗生素有極限，因此寄望不靠抗生素的治療法。
綠膿桿菌的高細胞傷害性，可經由第III型外毒素分泌系統經由注入毒素於真核細胞內來發揮。PcrV是由294個殘基(NCBI登錄號AAC45935、序列編號：1)構成之第III型外毒素分泌系統的構成蛋白質，編碼操縱子(operon)的序列已經公開(專利文獻1、非專利文獻1)。對PcrV的控制，由於在綠膿桿菌感染症之治療手段可能有密切關連(非專利文獻2)，故已有報告對PcrV具有中和活性的多株抗體(非專利文獻3、4)或單株抗體(專利文獻2、非專利文獻5、6)。但多株抗體有人化的困難性，且難以改善抗原性，因此使用作為醫藥品組成物是困難的。再者，到目前為止已發表之單株抗體的中和活性低，無法滿足臨床上的要求。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]美國專利6551795
[專利文獻2]特表2005-500250
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Yahr,T.L.等人、J. Bacteriol. 1997年、第179卷、第7165頁
[非專利文獻2]T‧Sawa等人、Nature Medicine、1999年、第5卷、第392頁
[非專利文獻3]Shime N等人、J.Immunol.2001年、第167卷、第5880頁
[非專利文獻4]Imamura Y等人、Eur.Respir.J. 2007年、第29卷、第965頁
[非專利文獻5]Karine Faure等人、J.Immune.Based.Therapies and Vaccines、2003年、第1卷
[非專利文獻6]Dara W.Frank等人、J.Infect.Disease、2002年、第186卷、第64頁
本發明欲解決之課題是提供對感染症，特別是因綠膿桿菌之感染症的治療有效的手段。
本案發明者們，精心硏究關於抗PcrV之單株抗體的製作，結果成功製作出認為比向來已知之抗PcrV單株抗體對疾病的治療效果更高的新穎人化單株抗體而完成本發明。
換言之，本發明是關於：
(1)抗PcrV之人化單株抗體或其一部分，具有選自以下(A)~(D)至少1個性質：
(A)活體外(in vitro)在1nM至200nM的濃度，阻害綠膿桿菌對白血球細胞的細胞傷害活性50%以上、
(B)活體外(in vitro)在1nM至50nM的濃度，阻害綠膿桿菌對骨髓瘤細胞之細胞傷害活性50%以上、
(C)與PcrV的解離常數(Kd)為2×10-9 (M)以下、以及
(D)於序列編號1所示之胺基酸序列位置136至位置233具有抗原決定基(epitope)；
(2)一種人化單株抗體或其一部分，具有以受理編號FERM ABP-11805寄存之融合瘤所產生之單株抗體的全部互補決定區域(CDR)的胺基酸序列；
(3)抗PcrV之人化單株抗體或其一部分，具有1)互補決定區域含有下記胺基酸序列之重鏈可變區域：SFTSYWMH(序列編號15)、INPSNGRTNYNEKFNT(序列編號16)、YGNYVVYYTMDY(序列編號17)、以及2)互補決定區域含有下記胺基酸序列之輕鏈可變區域：SASTSVSYME(序列編號18)、TTSKLAS(序列編號19)、HQWRNYPFT(序列編號20)；
(4)抗PcrV之人化單株抗體或其一部分，具有下述1)及2)且有選自以下(A)~(D)至少1個性質：
1)互補決定區域含有下記胺基酸序列之重鏈可變區域：SFTSYWMH(序列編號15)、INPSNGRTNYNEKFNT(序列編號16)、YGNYVVYYTMDY(序列編號17)、或這3個CDR之1個以上的CDR中1或數個胺基酸經刪除、取代或添加之胺基酸序列所構成之3個CDR、以及
2)互補決定區域含有下記胺基酸序列之輕鏈可變區域：SASTSVSYME(序列編號18)、TTSKLAS(序列編號19)、HQWRNYPFT(序列編號20)、或這3個CDR之1個以上的CDR中1或數個胺基酸經刪除、取代或添加之胺基酸序列所構成之3個CDR；
(A)活體外(in vitro)在1nM至200nM的濃度，阻害綠膿桿菌對白血球細胞的細胞傷害活性50%以上、
(B)活體外(in vitro)在1nM至50nM的濃度，阻害綠膿桿菌對骨髓瘤細胞之細胞傷害活性50%以上、
(C)與PcrV的解離常數(Kd)為2×10-9 (M)以下、以及
(D)於序列編號1所示之胺基酸序列位置136至位置233具有抗原決定基(epitope)；
(5)抗PcrV之人化單株抗體或其一部分，具有1)具有序列編號27之胺基酸序列之重鏈可變區域，以及2)具有序列編號28之胺基酸序列之輕鏈可變區域；
(6)一種醫藥組成物，含有上記(1)~(5)之任一所記載之抗體或其一部分作為有效成分；
(7)一種多核苷酸，編碼上記(3)~(5)所記載之抗體的重鏈可變區域或輕鏈可變區域；
(8)一種表現載體，含有上記(7)所記載之多核苷酸；
(9)一種綠膿桿菌感染症之治療法，包括對有治療必要的患者投與有效量之上記(1)~(5)之任一所記載之抗體或其一部分；
(10)一種上記(1)~(5)之任一所記載之抗體或其一部分用於製造綠膿桿菌感染症之治療藥的使用；以及
(11)一種醫藥組成物，含有用於治療綠膿桿菌感染症之上記(1)~(5)之任一所記載之抗體或其一部分。
本發明之人化單株抗體或其一部分，對PcrV的中和活性非常優異，因此有用於作為基於綠膿桿菌之感染症的預防‧治療劑。
 [實施發明之態樣]
作為本發明對象之「單株抗體」是指專一地結合前述PcrV之單株抗體。更具體言之，是一種抗PcrV之單株抗體，具有選自(1)活體外(in vitro)在1nM至200nM的濃度，阻害綠膿桿菌對白血球細胞的細胞傷害活性50%以上；(2)活體外(in vitro)在1nM至50nM的濃度，阻害綠膿桿菌對骨髓瘤細胞的細胞傷害活性50%以上；以及(3)與PcrV的解離常數(Kd)為2×10-9 (M)以下之至少1個性質；(4)於序列編號1所示之胺基酸序列位置136至位置233具有抗原決定基。
本發明之單株抗體的特徵之一，可舉出具有強的細胞傷害阻害活性。例如，使用白血球細胞時，在1~200nM之範圍內的濃度(較佳為2~100nM，更佳為5~25nM)具有阻害50%以上綠膿桿菌有的細胞傷害活性之阻害(中和)活性。此外，使用骨髓瘤細胞時，在1~50nM之範圍內的濃度(較佳為2~30nM，更佳為4~20nM)具有阻害50%以上綠膿桿菌有的細胞傷害活性之阻害活性。這些值大大地超過Dara W.Frank等人(J.Infect.Disease、2002年、第186卷、第64頁)所報告之Mab166的活性值。
此外，本發明之單株抗體之特徵為在PcrV的全長胺基酸序列(序列編號1)位置136至位置233之區域，有其抗原決定基。本發明者們發現，辨識該區域的抗體比辨識其他區域的抗體具有更強的活性(細胞傷害阻害活性)。辨識該區域的抗體，由於具有強的細胞傷害阻害活性，因此有用於作為感染症之治療用途。
單株抗體之辨識抗原決定基的鑑定可如下進行。首先，製作單株抗體辨識分子的各種部分構造。製作部分構造時，雖有使用公知的寡胜肽合成技術作成該分子的各部分胜肽之方法、使用基因重組技術將編碼目的部分胜肽之DNA序列置入適當表現質體中並在大腸菌等宿主內外生產之方法等，但為達上述目的通常組合兩者使用。例如，使用該業者周知的基因重組技術，製作從抗原蛋白質的C末端或N末端以適當長度依順序變短之一系列多胜肽後，檢討對於此等之單株抗體的反應性，決定大略的辨識部位。
之後進一步細化，使用該業者周知的寡胜肽合成技術，合成各種其對應部分的寡胜肽或該胜肽的突變體等，調查本發明之預防或治療劑之有效成分所含單株抗體之此等胜肽的結合性，或調查對於該單株抗體與抗原之結合的胜肽的競合阻害活性來限定抗原決定基。為得到多種寡胜肽的簡便方法，亦可利用市售套組(例如SPOTs套組(Genosys Biotechnologies製)、使用多重細管(Multipin)合成法之一系列的多重細管‧胜肽合成套組(Chiron製)等)。
細胞傷害阻害活性可經由以下順序測定。首先，經由一系列2倍稀釋將細胞傷害阻害活性之測定對象單株抗體稀釋調製為適當濃度。接著，使用細胞培養用之培養基等稀釋因綠膿桿菌之毒素等而受到影響的細胞(以下稱為標靶細胞)，調製成適當數量。具體言之，使用骨髓瘤細胞時最好調製在3×106 ~5×106 細胞/ml的範圍，使用白血球細胞時則為1×106 ~3×106 細胞/ml。同樣地，也以培養用之培養基等調製綠膿桿菌為1×107 ~1×108 cfu/ml。然後，在上述單株抗體存在下，於同一試管或井(例如微平板上的井等活體外(in vitro)條件)中以適度的培養條件培養綠膿桿菌以及標靶細胞。此時的培養條件可為使細胞及細菌生長發育良好的一般培養條件。此外，培養時間隨標靶細胞的種類適宜地變更為最適合條件，例如使用骨髓瘤細胞時為1~3小時左右，使用白血球細胞時為1~3小時左右為佳。未添加抗體之井作為對照組，對於對照組算出50%阻害的濃度(有效濃度)。標靶細胞的生死判定已建立各種手法，但添加呈色試藥後於適當波長(例如400~500nm)之吸光度的測定等是有用的(參考文獻：Nature Medicine、1999年、vol.5、第392~395頁)。
本發明之單株抗體的特徵之一，可舉出對PcrV具有高親和性。作為單株抗體對抗原親和性的表示指標所用之解離常數(Kd)，可依照各種方法解析。例如，使用經各種標識劑標識之抗原的Scatchard法，或使用市售測定套組BiacoreX(Amersham pharmacia製)或類似套組，依照該套組所附操作說明書及實驗操作方法可容易地解析。此外，結合活性的評價，亦可使用ELISA(酵素連結免疫吸附分析法)、EIA(酵素免疫測定法)、RIA(放射免疫測定法)或螢光抗體法等。使用這些方法所求得之解離常數(Kd值)以M(莫耳)單位表示。被試驗的單株抗體，解離常數小者表示具有強的親和性。本發明有關之單株抗體或其一部分與PcrV的解離常數(Kd)為2×10-9 (M)以下，較佳為1.5×10-9 (M)以下，更佳為1.2×10-9 (M)以下。
本發明之單株抗體的較佳態樣之一，可舉出免疫球蛋白重鏈可變區域(VH )含有互補決定區域CDR1、CDR2以及CDR3，此時CDR1具有胺基酸序列SFTSYWMH(序列編號15)、CDR2具有胺基酸序列INPSNGRTNYNEKFNT(序列編號16)、CDR3具有胺基酸序列YGNYVVYYTMDY(序列編號17)，免疫球蛋白輕鏈可變區域(VL )含有互補決定區域CDR1、CDR2以及CDR3，此時CDR1具有胺基酸序列SASTSVSYME(序列編號18)、CDR2具有胺基酸序列TTSKLAS(序列編號19)、CDR3具有胺基酸序列HQWRNYPFT(序列編號20)之抗體。
上記CDR區域之序列，若在維持本發明所欲之生物學活性(例如親和性或細胞傷害阻害活性等)的範圍內，具有由上記3個CDR之1個以上的CDR中1或數個胺基酸經刪除、取代或添加之胺基酸序列所構成之3個CDR之變異體也包含於本發明。
本發明之單株抗體的較佳態樣之一，可舉出具有上述特徵之單株抗體的人化單株抗體。人化單株抗體是將人以外的哺乳動物，例如將小鼠抗體的互補決定區域(CDR；complementarity determining region)移植到人抗體的CDR者。因此，骨架區域是來自人之物。適當的骨架區域之使用，可參照Kabat E.A.等人的文獻來選擇。作為此情形之FR，選擇CDR為形成良好抗原結合部位者。視需要，可取代抗體可變區域之FR的胺基酸，以使再構成之人化抗體的CDR形成適切抗原結合部位(Sato、K.等人,Cancer Res. 1993年、第53卷、第851頁)。此情形可再度進行上記之步驟。
人化單株抗體之一般的製造方法亦為已知(例如參照WO95/14041號公報、WO96/02576號公報)。具體言之，首先從末端部具有重疊的方式所製作之數個寡核苷酸，經由PCR法合成編碼經設計為小鼠抗體的CDR與人抗體的骨架區域(FR；framework region)連結之可變區域的DNA序列(參照WO98/13388號公報)。將所得DNA與編碼人抗體之恆定區域的DNA連結，然後組合到表現載體內。或亦可將編碼抗體的可變區域之DNA組合到含有抗體恆定區域之DNA的表現載體內。為製造本發明所使用之抗體，在控制抗體基因表現的區域，例如增強子/啟動子的控制下表現的方式組合到表現載體內。然後，經由該表現載體轉形宿主細胞，可使抗體表現。作為宿主細胞，可舉出例如COS細胞或CHO細胞等脊椎動物細胞、原核細胞、酵母菌等。
抗體基因的表現，將抗體的重鏈(H鏈)或輕鏈(L鏈)分別組合到表現載體，亦可以此同時使宿主轉形；或將編碼H鏈及L鏈的DNA組合到單一表現載體內，亦可以此使宿主轉形(參照WO94/11523)。
上記所得之所欲轉形體可依照當業者周知的方法培養，經由該培養使於轉形體細胞內或細胞外產生PcrV的人化單株抗體。可用於該培養之培養基，隨採用的宿主細胞可適宜選擇慣用的各種之物，例如為上記COS細胞之情形，可使用視需要添加胎牛血清(FBS)等血清成分於RPMI-1640培養基或杜氏經修飾鷹氏培養基(DMEM)等之培養基。該轉形體培養時的培養溫度，只要不會顯著使細胞內蛋白質合成能降低的溫度皆可，較佳為32~42℃，最佳為以37℃培養為宜。又視需要可在含有1~10%(v/v)之二氧化碳的空氣中培養。
含有上記轉形體之細胞內或細胞外所產生之本發明PcrV的人化單株抗體的分層(fraction)，經由利用該蛋白質的物理性質及化學性質等之各種公知的分離操作法可分離‧純化。作為該方法，具體而言可採用例如經由通常的蛋白質沈澱劑處理、超過濾、分子篩色層分析(凝膠過濾)、吸著性色層分析、離子交換色層分析、親和性色層分析、高效液相色層分析(HPLC)等各種色層分析、透析法、以及彼等之組合等。
經由上記方法可容易地製造高產率、高純度之所欲PcrV的人化單株抗體。如此進行之為將小鼠單株抗體(1F3)人化所決定之CDR序列全體及FR序列的一部分胺基酸殘基，經由移植到人抗體之最佳化抗體的可變區域的胺基酸序列示於第15圖(序列編號27)以及第16圖(序列編號28)。
該人化抗體(h1F3)與經由融合瘤所產生之小鼠抗體(m1F3)比較，具有同等的強細胞傷害阻害活性。抗體的人化中，通常要原樣維持來源抗體活性之人化的進行有困難，但在本發明中，成功取得與來源小鼠抗體具有同等活性的人化抗體。由於人化抗體在人體內的抗原性降低，有用於以治療目的等投與人之情形。
在本發明之人化單株抗體中使用人抗體的恆定區域。作為較佳之人抗體的恆定區域，可使用舉出之Cγ例如Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4作為重鏈，Cκ、Cλ作為輕鏈。此外，為改善抗體或其生產的安定性，可修飾人抗體的C區域。人化時可用的人抗體，雖可為IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等任何同型物的人抗體，在本發明中較佳使用IgG，更佳為IgG1或IgG4。
本發明之人化單株抗體可為與聚乙二醇(PEG)、放射性物質、毒素等各種分子結合之共軛抗體。如此之共軛抗體可於所得抗體經由施以化學修飾得到。又，抗體的修飾方法在該區域中已確立。本發明中，人化單株抗體也包含共軛抗體。
又本發明之人化單株抗體，於其N末端或C末端亦可融合其他蛋白質(Clinical Cancer Research,2004,10,1274-1281)。融合之蛋白質可為當業者適宜地選擇。
再者，本發明的人化單株抗體亦可為細胞障害阻害活性增強之抗體。作為細胞障害活性增強之抗體，可舉出例如刪除鹿角藻糖(fucose)之抗體、於糖鏈附加二等分(bisecting)N-乙醯葡萄醣胺(GlcNAc)之抗體、經由取代Fc區域之胺基酸以變化與Fcy受體之結合活性的抗體等。這些活性增強的抗體，可以當業者公知的方法製作。
本發明中所謂「單株抗體的一部分」，前述本發明之單株抗體的一部分意指具有與該單株抗體同樣地PcrV專一結合性的區域(以下也僅稱此為「抗體片段」)。
具體而言，可舉出對前述人PcrV具有專一結合性之Fab(fragment of antigen binding)、F(ab')2 、Fab'、單股抗體(single chain Fv；以下以scFv表示)、二硫化安定化抗體(disulfide stabilized Fv；以下以dsFv表示)、二聚體V區域片段(以下以Diabody表示)、含有CDR之胜肽等(Expert Opinion on Therapeutic Patents、第6卷、第5號、第441~456頁、1996年)。
Fab是以IgG的樞紐區域交聯2股H鏈的2個二硫鍵(S-S鍵)上部之胜肽部分經木瓜酵素分解所得，有H鏈的N末端側約一半部分與L鏈全體構成之分子量約5萬之具有抗原結合活性的抗體片段。本發明所使用之Fab，可由上記本發明之單株抗體經木瓜酵素處理得之。或可將編碼上記本發明單株抗體之Fab的DNA插入細胞用表現載體，經由導入該載體於細胞內使表現來製造Fab。
F(ab')2 是將IgG的樞紐區域2個S-S鍵下部分經胃蛋白酶分解所得，2個Fab’區域以樞紐部分結合所構成之分子量約10萬具有抗原結合活性的抗體片段。本發明所使用之F(ab')2 可由上記本發明之單株抗體經胃蛋白酶處理得之。或可將編碼該單株抗體之F(ab')2 的DNA插入細胞用表現載體，經由導入該載體於大腸菌、酵母菌、或動物細胞內使表現來製造F(ab')2 。
Fab'是上記F(ab')2 樞紐間之S-S鍵已切斷之分子量約5萬具有抗原結合活性之抗體片段。本發明所使用之Fab'可由上記本發明單株抗體的F(ab')2 經還原劑二硫蘇糖醇(dithiothreitol)處理得之。或可將編碼該單株抗體之Fab'的DNA插入細胞用表現載體，經由導入該載體於大腸菌、酵母菌、或動物細胞內使表現來製造Fab'。
scFv是使用適當的胜肽連接子(以下以P表示)連結一股VH和一股VL之VH-P-VL或VL-P-VH多胜肽，具有抗原活性之抗體片段。包含於本發明所使用之scFv的VH及VL，亦可為上記本發明之單株抗體者。本發明所使用之scFv，可從產生本發明單株抗體之融合瘤取得編碼VH及VL的cDNA，構築scFv表現載體，導入大腸菌、酵母菌、或動物細胞內使表現來製造。
dsFv是指將VH及VL中各別1胺基酸殘基取代為半胱胺酸殘基之多胜肽經由S-S鍵結合者。取代為半胱胺酸殘基之胺基酸殘基可依照Reiter等人所示方法(Protein Engineering、7、697(1994))，根據抗體的立體構造預測來選擇。包含於本發明所使用之dsFv的VH或VL，亦可為本發明之單株抗體者。本發明所使用之dsFv，可從產生本發明單株抗體之融合瘤取得編碼VH及VL的cDNA，插入到適當表現載體以構築dsFv表現載體，將該表現載體導入大腸菌、酵母菌、或動物細胞內使表現來製造。
Diabody是抗原結合專一性相同或不同之scFv形成二聚體之抗體片段，具有對相同抗原之2價抗原結合活性或對不同抗原之2種類專一的抗原結合活性之抗體片段。例如對本發明單株抗體專一地反應之2價Diabody，可經由取得編碼本發明單株抗體之VH及VL的cDNA，構築編碼具有3~10殘基的胜肽連接子之scFV的DNA，將該DNA插入到細胞用表現載體，將該表現載體導入大腸菌、酵母菌、或動物細胞內使表現Diabody來製造。
含有CDR之胜肽以含有VH或VL的CDR至少1區域以上所構成。複數的CDR可直接或經由適當的胜肽連接子來結合。含有本發明所使用之CDR的胜肽，可經由取得編碼本發明單株抗體之VH及VL的cDNA後，構築編碼CDR的DNA，將該DNA插入到動物細胞用表現載體，將該載體導入大腸菌、酵母菌、或動物細胞內使表現來製造。此外，含有CDR之胜肽，可經由Fmoc法(茀基甲氧羰基法)、tBoc法(第三丁氧基羰基法)等化學合成法來製造。
本發明之單株抗體或其一部分只要可適宜地使用於本發明，亦可為其修飾物。作為修飾物可使用與聚乙二醇(PEG)等各種分子結合之抗體。製作於抗體之修飾，可為導入化學鍵之修飾，亦可為製作於抗體的胺基酸序列之修飾。本發明之單株抗體或其一部分也包括此等之抗體修飾物。為得如此的抗體修飾物，可經由於所得抗體施以修飾得之。這些方法已建立於該領域中。
在其他觀點中，本發明提供編碼本發明人化單株抗體(h1F3)之重鏈可變區域或輕鏈可變區域的多核苷酸。較佳為本發明之多核苷酸具有序列編號29及30之任一所記載的鹼基序列。此外，與該多核苷酸在嚴格條件下雜化且與本發明抗體具有同等活性之抗體，編碼它的多核苷酸也在本發明之範圍內。
本發明之多核苷酸，只要可編碼本發明之抗體，則無特別限定，由複數的去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)等核苷酸構成之聚合體。可含有天然以外的鹼基。本發明之多核苷酸可使用於經由基因工程的手法來製造抗體。此外，為篩選具有與本發明抗體同等機能的抗體，亦可使用作為探針。亦即，使用編碼本發明抗體之多核苷酸、或其一部分作為探針，經由雜化、基因增幅技術(例如PCR)等之技術，在嚴格條件下與該多核苷酸雜化且可得到編碼與本發明抗體具有同等活性之抗體的DNA。此等DNA也包含於本發明之多核苷酸內。
雜化技術(Sambrook,J et al.,Molecular Cloning 2nd ed.,9.47-9.58,Cold Spring Harbor Lab. press,1989)為當業者已熟知的技術。作為雜化的條件，可舉出例如低嚴格條件。所謂低嚴格條件，在雜化後的洗淨為例如42℃、0.1×SSC、0.1%SDS的條件，較佳為50℃、0.1×SSC、0.1%SDS的條件。作為更佳的雜化條件，可舉出高嚴格條件。所謂高嚴格條件，例如65℃、5×SSC以及0.1%SDS的條件。這些條件中，提高溫度的程度可有效率得到具有高相同性之多核苷酸是可期待。然而，影響雜化的嚴格度因素，可考慮溫度或鹼濃度等複數因素，若為當業者適宜選擇因素可實現同樣的嚴格度。
經由這些雜化技術及基因增幅技術所得多核苷酸所編碼之與本發明抗體同等機能的抗體，通常與這些抗體之胺基酸序列具有高相同性。本發明之抗體也包括與本發明抗體有同等機能，且與該抗體的胺基酸序列具有高相同性的抗體。所謂高相同性是指在胺基酸階段，通常至少50%以上的同一性，較佳為75%以上的同一性，更佳為85%以上的同一性，又較佳為95%以上的同一性。對於決定多胜肽的相同性，可依照文獻(Wilbur,W. J. and Lipman,D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1983)80,726-730)記載之演算法。
本發明之單株抗體或其一部分有用於作為醫藥組成物。但含有本發明之單株抗體及其一部分之醫藥組成物，可經口的或非經口地全身或局部的投與。作為非經口的投與，可選擇例如點滴等之靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射、鼻腔內投與、吸入等，然而已知綠膿桿菌是經由氣道感染，特別是傷害波及肺上皮細胞或肺泡的噬細胞(T‧Sawa等人，Nature Medicine、1999年、第5卷、第392頁)，因此期待鼻腔內投與、吸入。
本發明之醫藥組成物經投與用以治療經由綠膿桿菌之囊胞性線維症或感染症患者。例如一次時每1kg體重的有效投與量為選自0.01mg至 100mg的範圍。或可選擇每一患者1~1000mg，較佳為5~50mg的投與量。然而，含有本發明之單株抗體或其一部分的醫藥組成物不限制於這些投與量。此外，投與期間可依據患者的年齡、症狀適宜地選擇。本發明之醫藥組成物可為同時含有視投與路徑之醫藥可接受的載劑及添加物者。
作為此等載劑及添加物之例，可舉出水、醫藥可接受的有機溶劑、膠原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、藻酸鈉、水溶性葡聚糖、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、酪蛋白、二甘油、聚丙二醇、聚乙二醇、凡士林、人血清白蛋白(HSA)、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、作為醫藥添加物可接受的界面活性劑等。所使用之添加物依照劑型從上記之中適宜地選擇或組合，但不限定於此等者。
以下經由參考例說明抗PcrV之小鼠單株抗體的製作法。
(參考例1) 重組Mab166的製作
為進行比較實驗，製作Mab166(特願2005-500250等)作為重組抗體。
首先，從產生次型IgG2a抗體的融合瘤萃取mRNA，以RT-PCR法選殖H鏈及L鏈的恆定區域。以PCR增幅的各片段以NheI、NotI位置插入pcDNA3.1(+)載體(Invitrogen製)中，進一步可以插入可變區域部分之DNA片段的方式倂入多選殖位置。
然後分別4分割Mab166可變區域部分之H鏈以及L鏈的基因序列後，合成此等之有意義DNA與反意義DNA，做黏合(annealing)反應。經由DNA連接酶(ligase)使黏合後的片段結合，H鏈在MfeI與Blp I區域進行選殖，L鏈在EcoRV與BsiW I區域進行選殖。
使用Lipofectamine2000(Invitrogen製)將已確認鹼基序列的H鏈及L鏈載體導入HEK239T細胞，48小時後回收其細胞上清液。以Protein-G(PIERCE製)管柱從回收之細胞上清液純化重組Mab166。
(參考例2) 抗原的調製
從東海大學分讓之綠膿桿菌株標準株PAO1萃取染色體DNA，以該DNA為模板經由PCR法增幅編碼PcrV蛋白質的基因(序列編號：2)。於5’側引子設置限制酶Sph I辨識部位、於3’側引子設置限制酶Hind III辨識部位(序列編號：3、4)，進一步表現載體插入時為標識生物素，設計為在組胺酸與開始密碼子之間插入半胱胺酸。增幅之PCR片段以Sph I及Hind III部位選殖到pQE30載體(GE Healthcare製)。確認鹼基序列後，導入大腸菌JM109本載體，得到重組大腸菌(PcrV-JM109)。將PcrV-JM109於500ml的LB/安比西林(Ampicillin)液體培養基中在37℃培養，OD600為0.5時添加0.1M的IPTG 200μl，誘導PcrV的表現。再者，在37℃培養1.5小時後，離心分離菌體，添加15 ml含有0.5%溶解酶(lysozyme)(Sigma製)之緩衝液A(25mM Tris-HCl(pH8.0)、0.5M NaCl、2mM MgCl2 )，在0℃放置30分鐘後，進行超音波處理。離心後得到可溶性分層(fraction)，通過His-結合管柱(Novagen製)後，以含有200mM咪唑的緩衝液B(20mM磷酸緩衝液(pH7.4)、500mM NaCl)溶出。最終的溶出分層(fraction)，對於10mM磷酸緩衝液(pH7.4)經由透析進行緩衝液置換。
抗原的生物素標識
如上記所表現‧純化之PcrV蛋白質於終濃度10mM巰基乙胺溶液中，在37℃反應150分鐘還原半胱胺酸殘基。於已還原之SH基添加莫耳比20倍量之經PEO-馬來醯亞胺活化的生物素(PIERCE製)，在4℃隔夜反應後進行透析除去過剩的生物素。
抗原的免疫
以純化之PcrV 20μg為抗原，與佛朗氏完全佐劑(Freund’s Complete Adjuvant)一起腹腔內投與於4週齡Balb/c雌小鼠7隻作為初次免疫。之後，14日後、35日後一起投與PcrV 20μg與佛朗氏不完全佐劑作為追加免疫。再77日後，以PcrV 20μg的腹腔投與及PcrV 10μg的尾靜脈投與作為最終免疫。
融合瘤之製作
最終免疫的3日後摘出脾臟，回收脾臟細胞。使用50%聚乙二醇4000使脾臓細胞與小鼠骨髓瘤細胞(p3×63-Ag8.U1，東京腫瘤研究所)融合，以含有次黃嘌呤、胺基喋呤、及胸腺核苷的培養基篩選。
PcrV抗體的選定
細胞融合8日後進行專一抗體產生細胞的篩選。用於篩選之免疫分析如下。於96井微量滴定平板(Nunc公司製)的各井添加含有2μg抗小鼠IgG抗體(Shibayagi製)的Tris緩衝液(50mM Tris-HCl、pH7.5)200μl，在4℃固定16小時。這些井以300μl洗淨液(含0.1% Tween20的生理食鹽水)洗淨2次後，添加300μl的Block-Ace(大日本製藥社製)，在室溫放置2小時進行阻斷(抗小鼠IgG抗體固相化平板)。以300μl洗淨液洗淨各井2次後，以150μl緩衝液C(含有0.9%氯化鈉、0.05%疊氮化鈉、0.5%牛血清白蛋白、0.01% Tween80、25μM二伸乙三胺-N,N,N’,N”,N”-五乙酸之50mMTris緩衝液、pH7.6)稀釋50μl融合瘤培養上清，添加於各井，在4℃反應終夜。以300μl洗淨液洗淨3次後，添加10ng經Eu-標識之鏈黴抗生物素蛋白(Streptavidin)(PERKIN ELMER製)及含25ng生物素標識化PcrV之200μl緩衝液，在室溫反應1小時。反應後，以300μl洗淨液進行洗淨3次，添加200μl增強試藥(1.39g/l酞酸鉀、19.3mg/l三正辛基氧化磷、4.59mg/l之2-萘甲醯基三氟丙酮、1.0g/l Triton-X100、6.0g/l乙酸)，測定其時差性螢光(time-resolved fluorescence)。
從篩選的結果選擇20個選殖株顯示與重組PcrV強親和性的融合瘤，依照參考例5確認經由綠膿桿菌之細胞傷害的阻害活性。其結果發現10個選殖株有細胞傷害阻害活性，這些選殖株經由限數稀釋法進行2次選殖，獲得產生辨識PcrV之單株抗體的融合瘤選殖株。所得10個選殖株，選擇細胞傷害阻害活性高的4個選殖株，分別命名為1F3、2A4、6F5、7A7。關於這些抗體，使用小鼠單株抗體亞型ELISA套組(BD Biosience製)決定抗體的次型結果為1F3是IgG2a、2A4是IgG2b、6F5是IgG2a、7A7是IgG2a。
產生單株抗體1F3及2A4之融合瘤於2009年1月15日寄存於獨立行政法人產業技術總合研究所專利生物寄存中心(日本茨城縣筑波市東1-1-1中央第6)，國際寄存之受理編號分別為FERM ABP-11805及FERM ABP-11806。
(參考例3)
抗體的結合活性
進行競合免疫分析以測定抗體(1F3、2A4、6F5、7A7)的結合活性。於96井微量滴定平板(Nunc製)的各井，添加含有1.5μg抗小鼠Fc抗體(Jackson ImmunoReseach製)的Tris緩衝液(50mM Tris-HCl、pH7.5)100μl，在4℃固定16小時。以300μl的洗淨液洗淨這些井2次後，添加含10%蔗糖之Block-Ace(大日本製藥社製)溶液300μl，放置在室溫2小時進行阻斷(抗小鼠IgG抗體固相化平板)。以300μl洗淨液洗淨各井2次後，添加2ng/井的各抗體以及從500ng/井以10倍一系列稀釋5階段之未標識的PcrV。之後，添加5ng/井 的生物素化PcrV使反應終夜。以300μl洗淨液洗淨4次，添加100μl/井的強化溶液後(Enhancement Solution)(Wallac製，攪拌1分鐘後，測定時差性螢光。結果顯示相較於Mab166，1F3、2A4、6F5、7A7與PcrV的結合活性強(第1圖)。
接著經由表面電漿共振(surface plasmon resonance)解析，算出1F3、2A4、6F5、7A7、Mab166對PcrV的親和性。使用小鼠抗體捕捉獲套組(BIACORE製)於CM5感應晶片上，將抗小鼠抗體固相化，繼續捕捉各PcrV抗體。於設置該固相感應晶片之BICORE T100載入重組PcrV，求出親和性。
其結果，相對於Mab166的親和性為3.0×10-9 ，1F3為3.7×10-10 ，2A4為3.5×10-10 ，6F5為1.1×10-10 ，7A7為1.1×10-9 ，任一選殖株皆比Mab166親和性高(第2圖)。
(參考例4)
可否與Mab166夾心式
為證明1F3、2A4、6F5、7A7與Mab166的抗原決定基不同，檢討該抗體及Mab166(以下也記載為m166)之夾心式測定法是否可行。
最初進行Mab166的生物素標識。100μg的Mab166與7.853μg的NHS-PEO4 Biotin(PIERCE製)在0.1M PBS(pH7.4)中混合，在冰中反應2小時。之後為從反應溶液除去未反應的生物素，進行凝膠色層分析(G2000SW管柱(TOSHO製))。
接著進行夾心式測定法。於96井微量滴定平板(Nunc公司製)添加含有各500μg PcrV抗體(1F3、2A4、6F5、7A7)之PBS(-)溶液100μl，在4℃固定16小時。以300μl洗淨液(含有0.01% Tween20之生理食鹽水)洗淨這些井1次後，添加300μl的Block-Ace(大日本製藥社製)，在室溫放置2小時進行阻斷。以300μl洗淨液洗淨各井2次後，添加含有50μg的PcrV與50ng生物素標識的Mab166之分析緩衝液100μl(Wallac製)，在4℃反應終夜。以洗淨液洗淨3次後，添加100μl含有50ng經Eu-標識之鏈黴抗生物素蛋白(Wallac製)之分析緩衝液，在室溫反應1小時。以洗淨液洗淨4次，添加100μl強化溶液後，經過1分鐘攪拌，測定其時差性螢光。
其結果為1F3、2A4、6F5、7A7與Mab166的夾心式測定法(Sandwich Assay)是可能的，顯然本抗體群與Mab166的抗原決定基不同(第3圖)。
(參考例5) 細胞傷害阻害活性試驗
關於1F3、2A4、6F5、7A7，進行細胞傷害阻害活性試驗。其方法如下。
首先，從32μg/ml以一系列2倍稀釋來稀釋1F3、2A4、6F5、7A7，於96井微平板的各井各分注10μl。接著使用細胞培養用培養基(含有碳酸氫鈉，不含L-麩胺酸及酚紅之RPMI1640(Sigma製))調製5×106 細胞/ml的骨髓瘤細胞P3U1(獲自ATCC)或1×106 細胞/ml的白血球細胞的一種U937(獲自ATCC)細胞，於該96井微平板各添加100μl。進一步使用細胞培養用培養基，將以陽離子經調整之米爾希頓肉汁(Cation-adjusted Mueller Hinton Broth)(Difco)培養一晚的綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa )SR24株調製為1×108 cfu/ml的菌液，以10μl/井添加，在37℃、5%CO2 存在下培養3小時。經過3小時後，各添加10μl的WST-8(Kishida Chemical Co.製)，使用骨髓瘤細胞P3U1之場合，在37℃、5%CO2 存在下培養3小時，U937細胞的場合培養1小時。培養終了後測定在450nm波長之吸光度。
其結果，使用白血球U937細胞之場合，其細胞傷害阻害活性(IC50)相對於Mab166為213nM以上，1F3為5.3nM，2A4為20.7nM，6F5為12.7nM，7A7為14.7nM；使用骨髓瘤細胞U3P1之場合，相對於Mab166為54nM，1F3為4.0nM，2A4為16nM，6F5為7.3nM，7A7為6.0nM。換言之，即使與已知其強活性之Mab166(Frank等人，The Journal of Infectious Diseases、2002年、第186卷、第66頁)比較，1F3、2A4、6F5、7A7對於任一細胞也具有強的細胞傷害阻害活性(第4圖及第5圖)。
(參考例6) 刪除突變PcrV的製作
以以下的方法製作刪除突變PcrV(136-233)。以PcrV抗原蛋白質表現質體pQE30-PcrV為模板，使用5’側引子GCTCGAGGATCCCAAGGCGCTGACCGC(序列編號5)、3’側引子GTTAAGCTTCTCGAAGGGGTACTC(序列編號6)進行PCR，以BamHI、HindIII限制酶處理增幅之片段，插入pET32b(Novagen製)。確認鹼基序列後，得到將本載體導入大腸菌BL21-DE3株之重組大腸菌(刪除突變PcrV-BL21)。以2ml的LB/安比西林液體培養基，在37℃前培養該表現株一天。在500ml的LB/安比西林液體培養基中，添加2mL前培養液，在37℃培養，OD600成為0.5時添加培養液，在冰上靜置30分鐘。以終濃度為0.75mM的方式添加IPTG，以震盪培養機15℃、160rpm培養一天誘導PcrV的表現。以4℃、x5000g、30分鐘離心培養液收集菌。除去上清液，於菌體添加10 ml含有0.1%溶解酶(Sigma製)之緩衝液X(25mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl、2mM MgCl2)並懸浮，在冰上靜置1小時後，一邊使冰冷下一邊超音波破碎處理。經由離心得到可能的分層(fraction)，通過填充Ni-NTA瓊脂糖(Qiagen)的管柱後，以緩衝液Y(25mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl、200mM Imidazole)溶出。最終的溶出分層(fraction)經由對10mM磷酸緩衝液(pH7.4)透析進行緩衝液置換。
抗原決定基區域的決定
於96井微量滴定平板(Nunc公司製)的各井添加150μl含有1.5μg抗小鼠IgG Fc抗體(Jackson ImmunoResearch社製)之Tris緩衝液(50mM Tris-HCl、pH7.5)，在4℃固定16小時。以300μl洗淨液(含有0.1% Tween20的生理食鹽水)洗淨這些井2次後，添加300μl阻斷溶液(50mM Tris-HCl pH7.5、2%Block-Ace(大日本製藥社製)、10%蔗糖)，在室溫放置2小時以阻斷各井(抗小鼠IgG抗體固相化平板)。以300μl洗淨液洗淨各井1次後，以緩衝液C(含有0.9%氯化鈉、0.05%疊氯化鈉、0.5%牛血清白蛋白、0.01% Tween80、25μM二伸乙三胺-N,N,N’,N”,N”-五乙酸之50mMTris緩衝液，pH7.6)稀釋為80ng/ml的PcrV抗體溶液添加各50μl於各井，以緩衝液C稀釋為200ng/ml之經Eu-標識之鏈黴抗生物素蛋白(PERKIN ELMER製)溶液添加各50μl於各井，以DELFIA分析緩衝液稀釋為各濃度之刪除突變PcrV蛋白質添加各100μl於各井，在4℃反應終夜。以300μl洗淨液洗淨3次後，添加200μl的增強試藥(1.39g/l酞酸鉀、19.3mg/l三正辛基氧化磷、4.59mg/l 2-萘甲醯基三氟丙酮、1.0g/l Triton-X100、6.0g/l乙酸)，測定其時差性螢光(第6圖)。
其結果，PcrV抗體1F3、2A4、9D12、12H9、參考例所用之KaloBios的m166，相對PcrV全長(1-294)顯示反應性。另一方面，相對PcrV(136-233)，1F3、2A4顯示反應性，但m166及不具中和活性之9D12、12H9未顯示反應性。
又經由西方點墨法亦可進行結合解析。純化之重組PcrV蛋白質進行SDS-PAGE後，轉印錄於PVDF膜。經轉印之膜以Block-Ace(大日本製藥製)溶液在室溫一邊振盪2小時一邊阻斷。將稀釋為1μg/ml之PcrV抗體溶液添加於膜，在4℃反應終夜後，以洗淨液B(10mM磷酸緩衝液(pH7.4)、0.05% Tween20)洗淨。添加作為2次抗體之經標識抗小鼠IgG抗體(GE Healthcare製)溶液於膜，在室溫反應2小時後，以洗淨液B洗淨膜，以ECL加西方點墨法偵測系統(ECL plus Western Blot Detection SyStem)(GE Healthcare製)發色，以LAS-1000(FUJIFILM)攝影(第7圖)。PcrV中和抗體1F3、2A4對全長PcrV及刪除突變PcrV二者有反應，但m166及中和活性低的9D12、12H9僅對全長PcrV有反應，對刪除突變PcrV沒有反應。
由此PcrV中和抗體1F3、2A4的抗原決定基區域是胺基酸殘基136-233的區域，m166、9D12、12H9不是只有胺基酸殘基136-233作為抗原決定基區域。
(參考例7)
PcrV蛋白質的特定區域與細胞傷害活性強度的相關性
使用全長PcrV蛋白質(序列編號1)及刪除突變PcrV蛋白質(具有序列編號1之位置136-位置233的胺基酸序列)，進行1F3、2A4、m166之細胞傷害阻害活性的抑制試驗。其方法如下。
首先，以一系列2倍稀釋分別從200nM、200nM、400nM稀釋1F3、2A4、m166，各分注10μl於96井微平板。本試驗中1F3、2A4、m166的試驗濃度域分別為1.56-6.25nM、6.25-25nM、50-200nM。以30、10、3、1、0.3倍莫耳濃度添加10μl對各試驗濃度域之全長PcrV蛋白質及刪除突變PcrV蛋白質於96井平板，在室溫放置30分鐘。接著使用細胞培養用培養基(含有碳酸氫鈉，不含L-麩胺酸及酚紅之RPMI1640(Sigma製))調製5×106 細胞/ml的骨髓瘤細胞P3U1，於該96井微平板各添加70μl。進一步添加10μl之使用細胞培養用培養基將經米爾希頓肉汁(Mueller Hinton Broth)(Difco)培養一晚的綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa )SR24株調製為1×108 cfu/ml的菌液，在37℃、5%CO2 存在下培養3小時。經過3小時後，各添加10μl的WST-8(Kishida Chemical Co.製)，在37℃、5%CO2 存在下培養3小時。培養終了後測定在450nm波長之吸光度。
其結果，非添加PcrV蛋白質的場合，與m166比較1F3、2A4顯示強的細胞傷害阻害活性。另一方面，添加全長PcrV蛋白質之場合，任一抗體隨添加之全長PcrV蛋白質的濃度依存地抑制細胞傷害阻害活性(第8圖)。對此，添加刪除突變PcrV蛋白質的場合，於其胺基酸區域(136-233)有抗原決定基之1F3、2A4是隨添加之刪除突變蛋白質的濃度依存地抑制細胞傷害阻害活性，但沒有抗原決定基的m166未觀察到細胞傷害阻害活性的變化(第9圖)。
從以上可推知，於胺基酸殘基136-233有抗原決定基之抗體(1F3及2A4)，比其區域沒有抗原決定基之抗體(m166)有更強的細胞傷害阻害活性。換言之，經由辨識PcrV抗體的區域，細胞傷害阻害活性的強度不同，有最強之細胞傷害阻害活性者，可謂是只對PcrV蛋白質胺基酸殘基136-233區域有反應性的抗體。
(參考例8) 對人PcrV之小鼠單株抗體(1F3及2A4)之胺基酸序列的解析
使用RNeasy Mini套組(QIAGEN製)，從已建立之融合瘤細胞進行RNA的萃取。使用cDNA末端快速增幅用5’RACE系統2.0版(Invitrogen製)，從1μ萃取之RNA進行DNA片段的增幅。此時，為cDNA合成所使用之引子為1F3是TAGAGTCACCGAGGAGCCAGTTGT(序列編號：7)，2A4是TCCAGAGTTCCAAGTCACAGTCAC(序列編號：8)。此外，5’RACE法使用之引子為1F3是AGGGGCCAGTGGATAGACCGATGGGGCTGT(序列編號：9)，2A4是AGGGGCCAGTGGATAGACTGATGGGGGTGT(序列編號：10)。以TOPO TA選殖套組(Invitrogen製)選殖增幅之片段，以Applied Biosystems 3130基因分析儀(Applied Biosystems製)解析鹼基序列。1F3的解析結果示於第10圖，2A4示於第11圖。可變區域的胺基酸序列是應用Kabat等人作成之抗體的胺基酸序列資料庫([Sequence of Proteins of Immunological Interest」US Dept. Health and Human Services,1983)，調查相同性的結果為1F3之重鏈可變區域中互補決定區域是SFTSYWMH(序列編號15)INPSNGRTNYNEKFNT(序列編號16)YGNYVVYYTMDY(序列編號17)，輕鏈可變區域中互補決定區域是SASTSVSYME(序列編號18)TTSKLAS(序列編號19)HQWRNYPFT(序列編號20)。同樣地調查結果為2A4之重鏈可變區域中互補決定區域為SITSDYAWN(序列編號21)YITYNGDTSYNPSLKS(序列編號22)SRNYYGAWFAY(序列編號23)，輕鏈可變區域中互補決定區域為KASQYVGTTVA(序列編號24)RASTRHT(序列編號25)QQYCSSPLT(序列編號26)。
以下呈現實施例具體說明本發明，但本發明不限制於下記實施例。又，作為抗體製作手法，無特別限定，使用Immunochemistry in Practice(Blackwell Scientific Publiations)記載之方法。此外，作為基因操作的手法，無特別限定，使用Molecular Cloning：A Laboratory Manual,2nd Edition(Cold Spring Harbor Laboratory)記載之方法。
[實施例1] (1)小鼠單株抗體1F3的人化
如上記製作之小鼠單株抗體1F3的人化，可將小鼠抗體的CDR移植於人生殖系接受器(acceptor)序列來製作。
具體而言，以IgBLAST(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)檢索小鼠抗體重鏈、輕鏈各別之V基因區域胺基酸序列中相同性最高的人生殖系接受器序列；至於J基因區域，從IMGT(http：//imgt.cines.fr/)選擇與小鼠抗體DNA序列相同性高的序列。
檢索的結果可得到IMGT基因名稱IGHV1-46*01作為來自小鼠抗體重鏈V基因區域最高相同性之人生殖系接受器序列之抗體基因序列，IMGT基因名稱IGHJ6*01 J作為來自基因區域最高相同性之人生殖系接受器序列之抗體基因序列，以此作為重鏈移植用人骨架序列。同樣地，可得到IMGT基因名稱IGKV1-9*01作為來自小鼠抗體輕鏈V基因區域最高相同性之人生殖系接受器序列之抗體基因序列，IMGT基因名稱IGKJ2*02J作為來自基因區域最高相同性之人生殖系接受器序列之抗體基因序列，以此作為輕鏈移植用人骨架序列。
然後依照Kabat編號(Wu、T.T. and Kabat,E.A.,J. Exp. Med. Augl;132(2)：211-50.(1970))之胺基酸序列編號記載，特定小鼠抗體重鏈CDRH1、CDRH2、CDRH3、以及輕鏈CDRL1、CDRL2、CDRL3，將這些CDR區域移植到人骨架序列，設計作為模板人化抗體。設計之模板人化抗體與小鼠抗體的胺基酸序列不同者，於Chothia編號(Chothia,C. and Lesk,A.M.,J. Mol. Biol.,196：901-917.,Chothia,C. et al.,Nature,342：877-883.(1989))之胺基酸序列編號已確認H5、H7、H11、H12、H20、H38、H40、H48、H66、H67、H69、H71、H75、H78、H81、H83、H87、H93、H94、H108、L1、L3、L9、L10、L11、L15、L17、L18、L19、L21、L40、L42、L43、L46、L70、L71、L72、L78、L79、L80、L83、L85、L100。
為鑑定小鼠抗體之體細胞突變部位，以IgBLAST檢索小鼠抗體重鏈、輕鏈各別的V基因區域胺基酸序列，可得到基因名稱J558.33作為最高相同性之重鏈序列，基因名稱IGKV4-80*01作為最高相同性之輕鏈序列。以IgBLAST檢索小鼠抗體重鏈的D基因區域胺基酸序列，可得到基因名稱IGHD2-1*01作為最高相同性之重鏈序列。以IMGT檢索小鼠抗體重鏈、輕鏈各別的J基因區域DNA序列，可得到IMGT基因名稱IGHJ4*01作為最高相同性之重鏈序列，IMGT基因名稱IGKJ4*01作為最高相同性之輕鏈序列。比較這些小鼠生殖系序列與小鼠抗體，以不同側鏈為體細胞突變部位，其中已確認H93、H94、L9、L46作為小鼠抗體與模板人化抗體的不同側鏈。
已確認H71、H94作為小鼠抗體與模板人化抗體之不同Canonical側鏈(http：//www.bioinf.org.uk/abs/chothia.html)。小鼠抗體與模板人化抗體不同的側鏈之中，位置在游標區(Vernier zone)(Foote et al.,J.Mol.Biol.,224.487(1992))有H48、H67、H69、H71、H78、H93、H94、L46、L71。小鼠抗體與模板人化抗體不同之鏈間填裝殘基(Interchain packing residue)未經確認。綜合這些結果，設計模板人化抗體的H48、H67、H69、H71、H78、H93、H94、L9、L46、L71之胺基酸側鏈全部導入小鼠抗體型突變(回覆突變(Backmutation))之突變型人化抗體。設計人IgG4Pro恆定區域序列作為設計之模板人化抗體可變區域(第12圖，模板)及突變型人化抗體可變區域(第12圖，回覆突變)的重鏈恆定區域序列，接合人Ig κ恆定區域序列之DNA序列作為輕鏈的恆定區域序列，經由下記所記載之方法各別構築模板人化抗體重鏈表現質體(第13圖，HT)、模板人化抗體輕鏈表現質體(第13圖，LT)、突變型人化抗體重鏈表現質體(第13圖，HB)、突變型人化抗體輕鏈表現質體(第13圖，LB)。
(2)抗體基因表現載體的製作
首先，為回避樞紐部分的S-S鍵裂開(Angal et al.,1993,Mol.Immunol.30(1)：105-108以及Schuurman et al.,2001,Mol.Immunol.,38：1-8.)，將第228的絲胺酸序列變換為脯胺酸，4分割IgG4之恆定區域的DNA後，合成此等之有意義DNA及反意義DNA，進行黏合(annealing)反應。經由DNA連接酶使黏合後的片段結合，以NheI、NotI位置插入pcDNA3.1(+)載體(Invitrogen製)中，進一步可以插入可變區域部分的DNA片段的方式倂入多選殖位置。
然後分別4分割人化PcrV抗體之可變區域部的基因序列重鏈及輕鏈後，合成此等之有意義DNA及反意義DNA，進行黏合(annealing)反應。經由DNA連接酶使黏合後的片段結合，關於重鏈，在MfeI及BlpI區域進行選殖；關於輕鏈，在EcoRV及BsiWI區域進行選殖，確認DNA鹼基序列。
作為抗體人化時的指標，製作人‧小鼠嵌合型1F3抗體。於小鼠抗體重鏈可變區域設計人IgG4Pro恆定區域序列作為重鏈的恆定區域序列，經由下記所記載之方法構築表現質體，作為小鼠‧人嵌合型抗體重鏈表現質體(第13圖，H嵌合型)。於小鼠抗體的輕鏈可變區域，設計接合人Ig κ恆定區域序列的DNA序列作為輕鏈的恆定區域序列，經由上記所記載之方法構築表現載體，作為小鼠‧人嵌合型抗體輕鏈表現質體(第13圖，L嵌合型)。以小鼠‧人嵌合型抗體重鏈表現質體與小鼠‧人嵌合型抗體輕鏈表現質體、模板人化抗體重鏈表現質體與模板人化抗體輕鏈表現質體、模板人化抗體重鏈表現質體與突變型人化抗體輕鏈表現質體、突變型人化抗體重鏈表現質體與模板人化抗體輕鏈表現質體、突變型人化抗體重鏈表現質體與突變型人化抗體輕鏈表現質體的組合轉染到哺乳類培養細胞中，使用該培養上清液，經由表面電漿共振(BIAcoreT-100，GE healthcare)測定與抗原：重組PcrV的親和性(第13圖)。
小鼠‧人嵌合型抗體的親和性解析之KD值為2.6 x 10-10 M。此外，模板人化抗體重鏈與模板人化抗體輕鏈之抗體的KD值為2.2 x 10-7 M，模板人化抗體重鏈與突變型人化抗體輕鏈之抗體的KD值為6.5 x 10-7 M，已確認大幅地降低親和性。另一方面，突變型人化抗體重鏈與模板人化抗體輕鏈之抗體的KD值為3.3 x 10-10 M，突變型人化抗體重鏈與突變型人化抗體輕鏈之抗體的KD值為3.4 x 10-10 M，顯示維持接近於小鼠‧人嵌合型抗體的親和性。從此結果判斷突變型人化抗體重鏈對於親和性的維持是重要的，使用模板人化抗體輕鏈與突變型人化抗體輕鏈之任一為輕鏈則無變化。因此，關於輕鏈，選擇接近來自人生殖系序列之模板人化抗體輕鏈。關於重鏈，製作將導入回覆突變之胺基酸側鏈H48、H67、H69、H71、H78、H93、H94之各個突變返回至來自人生殖系序列的人化抗體，經由表面電漿共振解析評價與抗原的親和性(第14圖)。其結果，H93的Val變換為Ala之人化抗體的KD值為1.0 x 10-9 M，H94的Leu變換為Arg之人化抗體的KD值為3.2 x 10-7 M，親和性降低了，但將其他突變返回至來自人生殖系序列之人化抗體中，未發現大的親和性降低。
從這些結果確定人化抗體序列，H93、H94是使用來自小鼠抗體的序列，至於H48、H67、H69、H71、H78是使用人生殖系胺基酸序列(第15圖，第16圖)。依照下記(3)之方法製作具有該序列的抗體，經由表面電漿共振解析確認親和性的結果，確認與小鼠抗體有同等的親和性(第17圖)。
(3)重組抗體的製作
使用Lipofectamine2000(Invitrogen製)將上記方法製作之重鏈基因與輕鏈基因導入HEK293F細胞內，72小時後，回收其細胞上清液。以Protein-G(PIERCE製)管柱從回收之細胞上清液純化重組抗體。
[實施例2]
進行m1F3(小鼠抗體)、h1F3(人化抗體)以及m166的細胞傷害阻害活性試驗。其方法如下。
首先，以一系列2倍稀釋分別從200nM、200nM、800nM稀釋m1F3、h1F3、m166，各分注10μl於96井微平板。接著使用細胞培養用培養基(含有碳酸氫鈉，不含L-麩胺酸及酚紅之RPMI1640(Sigma製))調製5×106 細胞/ml的骨髓瘤細胞P3U1或1×106 細胞/ml的U937細胞，於該96井微平板各添加70μl。進一步添加10μl/井之使用細胞培養用培養基將經米爾希頓肉汁(Difco)培養一晚的綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa )SR24株調製為1×108 cfu/ml的菌液，在37℃、5%CO2 存在下培養3小時。經過3小時後，各添加10μl的WST-8(Kishida Chemical Co.製)，在37℃、5%CO2 存在下培養1小時。培養終了後測定在450nm波長之吸光度。其結果，使用U937細胞之場合(第18圖)，其細胞傷害活性(IC50)相對於m166為98.4nM，m1F3是1.4nM、h1F3是1.5nM；使用骨髓瘤細胞之場合(第19圖)，相對於m166為85.4nM，1F3是1.5nM、h1F3是1.3nM。換言之，m1F3與h1F3的細胞傷害阻害活性同程度，顯示比m166更強的活性。
[產業上之可利用性]
本發明之人化單株抗體或其一部分，不僅對PcrV具有高親和性，也對於綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa )之真核細胞的細胞傷害活性顯示強的阻害活性。因此，含有該單株抗體或其一部分之醫藥組成物，有用於作為關於現在醫療現場難治療的綠膿桿菌之感染症的治療藥。
第1圖顯示PcrV抗體(1F3、2A4、6F5、7A7及Mab166)中生物素標識的PcrV經由未標識PcrV置換的曲線。
第2圖顯示經由表面電漿共振解析之PcrV抗體(1F3、2A4、6F5、7A7及Mab166)的親和性。
第3圖顯示PcrV抗體(1F3、2A4、6F5、7A7、Mab166)與Mab166之夾心式測定法的結果。
第4圖顯示PcrV抗體(1F3、2A4、6F5、7A7及Mab166)對於綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa )SR24株對U937細胞之細胞傷害活性的阻害效果。
第5圖顯示PcrV抗體(1F3、2A4、6F5、7A7及Mab166)對於綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa )SR24株對骨髓瘤細胞P3U1之細胞傷害活性的阻害效果。
第6圖顯示PcrV抗體(1F3、2A4、9D12、12H9及Mab166)中，生物素標識的PcrV經由未標識的全長PcrV以及刪除突變的PcrV置換的曲線。
第7圖顯示以西方點墨法之PcrV抗體(1F3、2A4、9D12、12H9及Mab166)與全長PcrV以及刪除突變PcrV的反應性。
第8圖是經由細胞傷害阻害活性的抑制顯示抗體與全長PcrV的相關關係。
第9圖是經由細胞傷害阻害活性的抑制顯示抗體與刪除突變PcrV的相關關係。
第10圖顯示1F3抗體之可變區域的胺基酸序列。劃底線部分表示CDR區域。
第11圖顯示2A4抗體之可變區域的胺基酸序列。劃底線部分表示CDR區域。
第12圖顯示小鼠抗體(Mouse 1F3)、模板人化抗體(Template)、突變型人化抗體(Backmutation)、人化抗體(Humanized 1F3)之重鏈可變區域及輕鏈可變區域的胺基酸序列。
第13圖顯示分別組合小鼠‧人嵌合型抗體重鏈(H chimera)、小鼠‧人嵌合型抗體輕鏈(L chimera)、模板人化抗體重鏈(HT)、模板人化抗體輕鏈(LT)、突變型人化抗體重鏈(HB)、突變型人化抗體輕鏈(LB)之抗體與PcrV抗原的親和性。
第14圖顯示分別組合小鼠‧人嵌合型抗體重鏈(H chimera)、小鼠‧人嵌合型抗體輕鏈(L chimera)、突變型人化抗體重鏈突變體(I48M、A67V、L69M、V71R、A78V、V93A、L94R)、模板人化抗體輕鏈(LT)之抗體與PcrV抗原的親和性。
第15圖顯示人化抗體之重鏈可變區域的胺基酸序列。劃底線部分表示CDR區域。
第16圖顯示人化抗體之輕鏈可變區域的胺基酸序列。劃底線部分表示CDR區域。
第17圖顯示分別組合小鼠‧人嵌合型抗體重鏈(H chimera)、小鼠‧人嵌合型抗體輕鏈(L chimera)、人化抗體重鏈(h1F3 H)、人化抗體輕鏈(h1F3 L)之抗體與PcrV抗原的親和性。
第18圖顯示人化pcrV抗體、小鼠pcrV抗體、Mab166對於綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa )SR24株對U937細胞之細胞傷害活性的阻害效果。
第19圖顯示人化抗體、小鼠抗體、Mab166對於綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa )SR24株對骨髓瘤細胞之細胞傷害活性的阻害效果。

Claims (5)

  1. 一種抗PcrV之人化單株抗體或其一部分，係與PcrV的解離常數(Kd)為2×10-9 (M)以下，而於序列編號1所示之胺基酸序列位置136至位置233具有抗原決定基(epitope)，且具有：1)互補決定區域含有下記胺基酸序列之重鏈可變區域：由SFTSYWMH(序列編號15)、INPSNGRTNYNEKFNT(序列編號16)、YGNYVVYYTMDY(序列編號17)所構成之3個CDR；以及2)互補決定區域含有下記胺基酸序列之輕鏈可變區域：由SASTSVSYME(序列編號18)、TTSKLAS(序列編號19)、HQWRNYPFT(序列編號20)所構成之3個CDR。
  2. 一種抗PcrV之人化單株抗體或其一部分，具有1)具有序列編號27之胺基酸序列之重鏈可變區域，以及2)具有序列編號28之胺基酸序列之輕鏈可變區域。
  3. 一種醫藥組成物，含有如申請專利範圍第1或2項之抗體或其一部分作為有效成分。
  4. 一種多核苷酸，編碼如申請專利範圍第1或2項之抗體的重鏈可變區域或輕鏈可變區域。
  5. 一種表現載體，含有如申請專利範圍第4項之多核苷酸。
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