WO2010104052A1 - 抗緑膿菌作用を有するヒト化ＰｃｒＶ抗体 - Google Patents

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antibody
seq
pcrv
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acid sequence
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佳則 山野
義人 沼田
剛章 佐藤
敏永 辻
敬子 川本
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塩野義製薬株式会社
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    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
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    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present invention relates to a humanized monoclonal antibody that recognizes PcrV or a part thereof. Specifically, the present invention relates to an antibody having a higher neutralizing activity (hereinafter also referred to as cytotoxicity inhibiting activity) than conventional anti-PcrV antibodies or a part thereof, and a pharmaceutical composition containing them.
  • cytotoxicity inhibiting activity an antibody having a higher neutralizing activity (hereinafter also referred to as cytotoxicity inhibiting activity) than conventional anti-PcrV antibodies or a part thereof, and a pharmaceutical composition containing them.
  • Pseudomonas aeruginosa is an obligately aerobic gram-negative bacilli that exists widely in nature. Although it is usually low in pathogenicity, it is a pathogenic bacterium that causes opportunistic infections that frequently occur in patients with various basic diseases such as cancer and diabetes, and in patients receiving immunosuppressive drugs. Often causes serious consequences, such as tract infections and sepsis. Pseudomonas aeruginosa infection is currently considered one of the most difficult to treat in the clinical setting. This is because Pseudomonas aeruginosa is not only less sensitive to existing antibiotics but also has a strong tendency to easily acquire resistance to various antibiotics and become intractable. Thus, for Pseudomonas aeruginosa, there is a limit in the response of developing new antibiotics one after another, and a treatment method that does not depend on antibiotics is eagerly desired.
  • PcrV is a component protein of the type III exotoxin secretion system consisting of 294 residues (NCBI Accession No. AAC45935, SEQ ID NO: 1), and the operon sequence encoded is disclosed (Patent Document 1, Non-Patent Document 1). ).
  • Non-Patent Document 2 Since control over PcrV may lead to therapeutic measures in Pseudomonas aeruginosa infection (Non-Patent Document 2), polyclonal antibodies (Non-Patent Documents 3 and 4) and monoclonal antibodies (Non-Patent Documents 3 and 4) having neutralizing activity Document 2, Non-Patent Documents 5 and 6) have been reported.
  • humanization is difficult with polyclonal antibodies, and antigenicity is difficult to improve, making it difficult to use as a pharmaceutical composition.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide an effective means for treating infections, particularly infections caused by Pseudomonas aeruginosa.
  • the present invention (1) A humanized monoclonal antibody against PcrV or a part thereof having at least one property selected from the following (A) to (D): (A) inhibits 50% or more of the cytotoxic activity against white blood cells of Pseudomonas aeruginosa at a concentration of 1 nM to 200 nM in vitro; (B) Inhibits 50% or more of the cytotoxic activity of Pseudomonas aeruginosa against myeloma cells at a concentration of 1 to 50 nM in vitro.
  • the dissociation constant (Kd) with PcrV is 2 ⁇ 10 ⁇ 9 (M) or less, and (D) has an epitope from position 136 to position 233 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a pharmaceutical composition comprising the antibody or a part thereof according to any one of (1) to (5) as an active ingredient, (7) a polynucleotide encoding the heavy chain variable region or the light chain variable region of the antibody according to any of (3) to (5) above, (8) an expression vector comprising the polynucleotide according to (7) above, (9) A method for treating Pseudomonas aeruginosa infection, comprising administering an effective amount of the antibody according to any one of (1) to (5) above or a part thereof to a patient in need of treatment, (10) Use of the antibody according to any one of (1) to (5) above or a part thereof for producing a therapeutic agent for Pseudomonas aeruginosa infection, and (11) Treatment of P
  • the humanized monoclonal antibody of the present invention or a part thereof has a very excellent neutralizing activity against PcrV, it is useful as an agent for preventing or treating infection caused by Pseudomonas aeruginosa.
  • FIG. 1 shows a displacement curve of biotin-labeled PcrV with unlabeled PcrV in PcrV antibodies (1F3, 2A4, 6F5, 7A7 and Mab166).
  • FIG. 2 shows the affinity of PcrV antibodies (1F3, 2A4, 6F5, 7A7 and Mab166) by surface plasmon resonance analysis.
  • FIG. 3 shows the results of a sandwich assay between PcrV antibodies (1F3, 2A4, 6F5, 7A7, Mab166) and Mab166.
  • FIG. 4 shows the inhibitory effect of PcrV antibodies (1F3, 2A4, 6F5, 7A7 and Mab166) on the cytotoxic activity of Pseudomonas aeruginosa SR24 strain on U937 cells.
  • FIG. 5 shows the inhibitory effect of PcrV antibodies (1F3, 2A4, 6F5, 7A7 and Mab166) on the cytotoxic activity of Pseudomonas aeruginosa SR24 strain on myeloma cells P3U1.
  • FIG. 6 shows a substitution curve of biotin-labeled PcrV with unlabeled full-length PcrV and deletion mutation PcrV in PcrV antibodies (1F3, 2A4, 9D12, 12H9 and Mab166).
  • FIG. 7 shows the reactivity of PcrV antibodies (1F3, 2A4, 9D12, 12H9 and Mab166) with full length PcrV and deletion mutant PcrV in Western blot.
  • FIG. 6 shows a substitution curve of biotin-labeled PcrV with unlabeled full-length PcrV and deletion mutation PcrV in PcrV antibodies (1F3, 2A4, 9D12, 12H9 and Mab166).
  • FIG. 8 shows the correlation between the antibody and full-length PcrV by suppressing the cytotoxicity inhibiting activity.
  • FIG. 9 shows the correlation between the antibody and the deletion mutant PcrV by suppressing the cytotoxicity inhibiting activity.
  • 1 shows the amino acid sequence of the variable region of the 1F3 antibody.
  • the underlined portion indicates the CDR region.
  • the amino acid sequence of the variable region of 2A4 antibody is shown.
  • the underlined portion indicates the CDR region.
  • the amino acid sequence alignment of the heavy chain variable region and the light chain variable region of mouse antibody Mae 1F3
  • template humanized antibody Tempolate
  • mutant humanized antibody Backmutation
  • humanized antibody Humanized 1F3
  • Mouse / human chimeric antibody heavy chain (H chimera), mouse / human chimeric antibody light chain (L chimera), template humanized antibody heavy chain (HT), template humanized antibody light chain (LT), mutant humanized antibody heavy chain ( HB) shows the affinity between the PcrV antigen and an antibody obtained by combining the mutant humanized antibody light chain (LB).
  • Each antibody light chain (LT) is combined to show the affinity between the antibody and the PcrV antigen.
  • the amino acid sequence of the variable region of the heavy chain of a humanized antibody is shown.
  • the underlined portion indicates the CDR region.
  • the amino acid sequence of the variable region of the light chain of a humanized antibody is shown.
  • the underlined portion indicates the CDR region.
  • a mouse / human chimeric antibody heavy chain (H chimera), a mouse / human chimeric antibody light chain (L chimera), a humanized antibody heavy chain (h1F3 H), a humanized antibody light chain (h1F3 L), and a combined antibody and a PcrV antigen The affinity of is shown.
  • the inhibitory effects of humanized pcrV antibody, mouse pcrV antibody and Mab166 on the cytotoxic activity of Pseudomonas aeruginosa SR24 strain on U937 cells are shown.
  • the inhibitory effects of humanized antibody, mouse antibody and Mab166 on the cytotoxic activity of Pseudomonas aeruginosa SR24 strain on myeloma cells are shown.
  • the “monoclonal antibody” targeted by the present invention is a monoclonal antibody that specifically binds to the aforementioned PcrV. More specifically, (1) inhibits 50% or more of the cytotoxic activity against white blood cells of Pseudomonas aeruginosa at a concentration of 1 nM to 200 nM in vitro.
  • a dissociation constant (Kd) with PcrV of 2 ⁇ 10 ⁇ 9 ( M) is (4) having an epitope at positions 136 to 233 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, which is a monoclonal antibody against PcrV having at least one property selected from
  • the monoclonal antibody of the present invention has a strong cytotoxic inhibitory activity.
  • the inhibitory activity of Pseudomonas aeruginosa has a 50% or higher inhibition at a concentration in the range of 1 to 200 nM, preferably 2 to 100 nM, more preferably 5 to 25 nM (medium Sum) activity.
  • the inhibitory activity of inhibiting the cytotoxic activity of Pseudomonas aeruginosa by 50% or more at a concentration within the range of 1 to 50 nM, preferably 2 to 30 nM, more preferably 4 to 20 nM. have. These values are from Dara W. This greatly exceeds the activity value of Mab166 reported in Frank et al. (J. Infect. Disease, 2002, 186, 64).
  • the monoclonal antibody of the present invention is characterized by having the epitope in the region from position 136 to position 233 in the full-length amino acid sequence of PcrV (SEQ ID NO: 1).
  • the present inventors have found that an antibody recognizing this region has a stronger activity (cytotoxic inhibition activity) than an antibody recognizing other regions.
  • An antibody that recognizes this region is useful for the treatment of infectious diseases because it has a strong cytotoxic inhibitory activity.
  • Identification of the recognition epitope of the monoclonal antibody can be performed as follows. First, various partial structures of molecules recognized by monoclonal antibodies are prepared. In preparing the partial structure, a method for preparing various partial peptides of the molecule using a known oligopeptide synthesis technique, or a DNA sequence encoding the target partial peptide using a gene recombination technique as a suitable expression plasmid. There are methods for integration and production inside and outside the host such as Escherichia coli, but for the above purpose, it is common to use both in combination.
  • the corresponding oligopeptides of the corresponding portion or variants of the peptides are synthesized in various ways using oligopeptide synthesis techniques well known to those skilled in the art, and the preventive or therapeutic agent of the present invention is contained as an active ingredient.
  • the epitopes are limited by examining the binding properties of the monoclonal antibodies to those peptides, or by examining the competitive inhibitory activity of the peptides on the binding of the monoclonal antibody to the antigen.
  • commercially available kits for example, SPOTs kit (Genosis Biotechnologies), a series of multipin peptide synthesis kits using the multipin synthesis method, etc.
  • SPOTs kit Geneosis Biotechnologies
  • Cytotoxicity inhibitory activity can be measured by the following procedure. First, a monoclonal antibody to be measured for cytotoxicity inhibitory activity is diluted to a suitable concentration by diluting with a 2-fold dilution series. Next, cells affected by the toxin of Pseudomonas aeruginosa (hereinafter referred to as target cells) are diluted with a cell culture medium or the like to prepare an appropriate number. Specifically, it is prepared in the range of 3 ⁇ 10 6 to 5 ⁇ 10 6 Cells / ml when using myeloma cells, and 1 ⁇ 10 6 to 3 ⁇ 10 6 Cells / ml when using white blood cells. It is desirable.
  • Pseudomonas aeruginosa is also prepared so as to be 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 8 cfu / ml using a culture medium or the like. Then, in the presence of the monoclonal antibody described above, Pseudomonas aeruginosa and target cells are cultured under appropriate culture conditions in the same test tube and well (for example, in vitro conditions such as wells on a microplate).
  • the culture conditions at this time may be general culture conditions that are favorable for growing cells and bacteria.
  • the optimal conditions for the culture time are appropriately changed depending on the type of target cell. For example, about 1 to 3 hours are preferable when using myeloma cells, and about 1 to 3 hours when using white blood cells.
  • a concentration that inhibits 50% of the control group (effective concentration) is calculated.
  • concentration concentration that inhibits 50% of the control group (effective concentration) is calculated.
  • Various methods have been established for determining whether a target cell is alive or not. After adding a color reagent, measurement of absorbance at an appropriate wavelength (for example, 400 to 500 nm) is useful (Reference: Nature). Medicine, 1999, vol. 5, pp. 392-395).
  • the monoclonal antibody of the present invention has a high affinity for PcrV.
  • the dissociation constant (Kd) used as an index representing the affinity of the monoclonal antibody for the antigen can be analyzed according to various methods. For example, using the Scatchard method using antigens labeled with various labeling agents, BiacoreX (manufactured by Amersham Pharmacia) or a similar kit, which is a commercially available measurement kit, the instruction manual and the experimental operation method attached to the kit Can be easily analyzed.
  • the dissociation constant (Kd value) obtained using these methods is expressed in units of M (mol).
  • the tested monoclonal antibody shows that the smaller the dissociation constant, the stronger the affinity.
  • the dissociation constant (Kd) with PcrV is 2 ⁇ 10 ⁇ 9 (M) or less, preferably 1.5 ⁇ 10 ⁇ 9 (M) or less, more preferably 1.2 ⁇ 10 ⁇ 9 (M) or less.
  • the immunoglobulin heavy chain variable region (V H ) includes CDR1, CDR2 and CDR3 which are complementarity determining regions.
  • CDR1 has the amino acid sequence SFTSYWMH (sequence CDR2 has the amino acid sequence INPSNGRTNYNEKFNT (SEQ ID NO: 16)
  • CDR3 has the amino acid sequence YGNYVVYYTMDY (SEQ ID NO: 17) and is a complementarity determining region in the immunoglobulin light chain variable region (V L ).
  • CDR1 has the amino acid sequence SASSVSYME (SEQ ID NO: 18)
  • CDR2 has the amino acid sequence TTSKLAS (SEQ ID NO: 19)
  • CDR3 has the amino acid sequence HQWRNYPFT (SEQ ID NO: 2).
  • the sequence of the CDR region is within a range in which the desired biological activity of the present invention (for example, affinity, cytotoxicity-inhibiting activity, etc.) is retained, one or more of the three CDRs can be used.
  • a variant having three CDRs consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the CDR is also included in the present invention.
  • a humanized monoclonal antibody having the characteristics described above can be mentioned.
  • a humanized monoclonal antibody is obtained by transplanting a complementarity determining region (CDR) of a mammal other than a human, for example, a mouse antibody, into a CDR of a human antibody. Therefore, the framework region is derived from human.
  • CDR complementarity determining region
  • a suitable framework area for use is Kabat E.I. A.
  • the FR amino acid of the variable region of the antibody may be substituted so that the CDR of the reshaped humanized antibody forms an appropriate antigen-binding site (Sato, K. et al., Cancer Res. 1993, 53, 851). In this case, the above steps may be performed again.
  • a general method for producing a humanized monoclonal antibody is also known (see, for example, WO95 / 14041 and WO96 / 02576). Specifically, first, a DNA sequence encoding a variable region designed to link the CDR of a mouse antibody and the framework region (FR) of a human antibody has a portion that overlaps the terminal portion. It is synthesized by PCR method from several prepared oligonucleotides (see WO98 / 13388). The obtained DNA is ligated with DNA encoding the constant region of a human antibody and then incorporated into an expression vector. Alternatively, DNA encoding the variable region of the antibody may be incorporated into an expression vector containing DNA of the constant region of the antibody.
  • the antibody gene is incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region, for example, an enhancer / promoter.
  • host cells can be transformed with this expression vector to express the antibody. Examples of host cells include vertebrate cells such as COS cells and CHO cells, prokaryotic cells, and yeast.
  • the expression of the antibody gene may be carried out by co-transforming the host by separately incorporating the heavy chain (H chain) or light chain (L chain) of the antibody into an expression vector, or DNA encoding the H chain and L chain. May be incorporated into a single expression vector to transform the host (see WO94 / 11523).
  • the desired transformant obtained above can be cultured according to a method well known to those skilled in the art, and by this culture, a humanized monoclonal antibody of PcrV is produced in or outside the transformant cells.
  • a humanized monoclonal antibody of PcrV is produced in or outside the transformant cells.
  • various commonly used media can be appropriately selected according to the host cells employed. For example, in the case of the COS cells, RPMI-1640 medium, Dulbecco's modified Eagle minimum essential medium (DMEM), etc. What added serum components, such as fetal bovine serum (FBS), to a culture medium as needed can be used.
  • FBS fetal bovine serum
  • the culture temperature for culturing the transformant may be any temperature as long as it does not significantly reduce the protein synthesis ability in the cells, but it is preferably cultured at 32-42 ° C, most preferably at 37 ° C. It is preferable. If necessary, the cells can be cultured in air containing 1 to 10% (v / v) carbon dioxide gas.
  • the fraction containing the humanized monoclonal antibody of PcrV of the present invention produced inside or outside of the transformant as described above is obtained from various known separation procedures utilizing the physical and chemical properties of the protein. Can be separated and purified. Specific examples of such methods include treatment with conventional protein precipitants, ultrafiltration, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC ), Etc., dialysis methods, and combinations thereof.
  • variable region of the antibody optimized by grafting the entire CDR sequence determined to humanize the mouse monoclonal antibody (1F3) and a part of the FR sequence into a human antibody.
  • the amino acid sequence of is shown in FIG. 15 (SEQ ID NO: 27) and FIG. 16 (SEQ ID NO: 28).
  • This humanized antibody (h1F3) had the same strong cytotoxic inhibitory activity as compared with the mouse antibody (m1F3) produced by the hybridoma.
  • humanization of antibodies it is usually difficult to perform humanization while maintaining the activity of the derived antibody, but in the present invention, a humanized antibody having an activity equivalent to that of the derived mouse antibody. Successfully acquired. Since humanized antibodies have reduced antigenicity in the human body, they are useful when administered to humans for therapeutic purposes.
  • the constant region of a human antibody is used.
  • Preferred constant regions of human antibodies include C ⁇ as the heavy chain.
  • C ⁇ 1, C ⁇ 2, C ⁇ 3, and C ⁇ 4 can be used, and C ⁇ and C ⁇ can be used as the light chain.
  • the C region of a human antibody may be modified in order to improve the stability of the antibody or its production.
  • the human antibody used for humanization may be any isotype human antibody such as IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, but in the present invention, IgG is preferably used, and IgG1 or IgG4 is more preferable.
  • the humanized monoclonal antibody of the present invention may be a conjugated antibody conjugated with various molecules such as polyethylene glycol (PEG), radioactive substances, and toxins. Such a conjugated antibody can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. Antibody modification methods have already been established in this field. These conjugated antibodies are also included in the humanized monoclonal antibody in the present invention.
  • PEG polyethylene glycol
  • humanized monoclonal antibody of the present invention may be fused with another protein at its N-terminus or C-terminus (Clinical Cancer Research, 2004, 10, 1274-1281). Those skilled in the art can appropriately select the protein to be fused.
  • the humanized monoclonal antibody of the present invention may be an antibody with enhanced cytotoxic activity.
  • antibodies with enhanced cytotoxic activity include antibodies lacking fucose, antibodies with bisecting N-acetylglucosamine (GlcNAc) added to sugar chains, and substitution of amino acids in the Fc region to accept Fcy. Examples thereof include antibodies whose binding activity with the body has been changed. These antibodies with enhanced activity can be prepared by methods known to those skilled in the art.
  • the “part of the monoclonal antibody” is a part of the monoclonal antibody of the present invention described above, and means a region specifically binding to PcrV as in the case of the monoclonal antibody (hereinafter referred to as this).
  • antibody fragments are also simply referred to as “antibody fragments”.
  • Fab fragment of antigen binding
  • F (ab ′) 2 single chain antibody
  • Fab ′ single chain Fv
  • scFv single chain Fv
  • Disulfide stabilized antibodies disulfide stabilized Fv; hereinafter referred to as dsFv
  • diabody dimerized V region fragments
  • peptides containing CDRs etc.
  • Fab is obtained by cleaving the upper peptide part of two disulfide bond (SS bond) ⁇ that crosses two H chains at the hinge region of IgG with the enzyme papain. It is an antibody fragment having an antigen-binding activity with a molecular weight of about 50,000, consisting of half and the entire L chain.
  • the Fab used in the present invention can be obtained by treating the above monoclonal antibody of the present invention with papain.
  • the Fab can also be produced by inserting a DNA encoding the Fab of the monoclonal antibody of the present invention into a cell expression vector and expressing the vector by introducing the vector into a cell.
  • F (ab ′) 2 is composed of two Fab ′ regions obtained by decomposing the lower part of the two SS bonds in the hinge region of IgG with the enzyme pepsin and having a molecular weight of about It is an antibody fragment having an antigen binding activity of 100,000.
  • F (ab ′) 2 used in the present invention can be obtained by treating the monoclonal antibody of the present invention with pepsin.
  • F (ab ′) can also be expressed by inserting DNA encoding F (ab ′) 2 of the monoclonal antibody into an expression vector for cells and introducing the vector into Escherichia coli, yeast, or animal cells. 2 can be manufactured.
  • Fab ′ is an antibody fragment having an antigen binding activity of about 50,000 molecular weight obtained by cleaving the SS bond between the hinges of F (ab ′) 2 .
  • Fab ′ used in the present invention can be obtained by treating F (ab ′) 2 of the monoclonal antibody of the present invention with a reducing agent dithiothreitol.
  • Fab ′ can also be produced by inserting a DNA encoding Fab ′ of the monoclonal antibody into an expression vector for cells and expressing the vector by introducing the vector into Escherichia coli, yeast, or animal cells.
  • scFv is a VH-P-VL or VL-P-VH polypeptide in which one VH and one VL are linked using an appropriate peptide linker (hereinafter referred to as P) ⁇ , and has antigenic activity. It is an antibody fragment having The VH and VL contained in the scFv used in the present invention may be those of the above monoclonal antibody of the present invention.
  • the scFv used in the present invention is expressed by obtaining cDNA encoding VH and VL from the hybridoma producing the monoclonal antibody of the present invention, constructing an scFv expression vector, and introducing it into Escherichia coli, yeast, or animal cells. Can be manufactured.
  • DsFv refers to a polypeptide in which one amino acid residue in each of VH and VL is replaced with a cysteine residue, which are linked via an SS bond.
  • the amino acid residue to be substituted with the cysteine residue can be selected based on the three-dimensional structure prediction of the antibody according to the method (Protein Engineering, 7, 697 (1994)) shown by Reiter et al.
  • VH or VL contained in dsFv used in the present invention may be that of the monoclonal antibody of the present invention.
  • dsFv used in the present invention
  • cDNAs encoding VH and VL are obtained from the hybridoma producing the monoclonal antibody of the present invention and inserted into an appropriate expression vector to construct a dsFv expression vector.
  • Yeast or animal cells can be introduced and expressed.
  • Diabody is an antibody fragment in which scFv having the same or different antigen binding specificity forms a dimer, and has bivalent antigen binding activity against the same antigen or two types of specific antigen binding activities against different antigens. It is an antibody fragment.
  • a divalent diabody that specifically reacts with the monoclonal antibody of the present invention obtains cDNA encoding the VH and VL of the monoclonal antibody of the present invention, and encodes scFv with a peptide linker of 3 to 10 residues. It can be produced by constructing DNA, inserting the DNA into an expression vector for cells, and introducing the expression vector into Escherichia coli, yeast, or animal cells to express diabody.
  • the peptide containing CDR is configured to contain at least one region of CDR of VH or VL. Multiple CDRs can be linked directly or via a suitable peptide linker.
  • the CDR-containing peptide used in the present invention is obtained by obtaining cDNA encoding the VH and VL of the monoclonal antibody of the present invention, constructing a DNA encoding the CDR, and inserting the DNA into an expression vector for animal cells.
  • the vector can be produced by introducing the vector into Escherichia coli, yeast, or animal cells.
  • a peptide containing CDR can also be produced by chemical synthesis methods such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
  • the monoclonal antibody of the present invention or a part thereof may be a modified product as long as it can be suitably used in the present invention.
  • the modified product an antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • the modification made to the antibody may be a modification by introducing a chemical bond, or may be a modification made to the amino acid sequence of the antibody.
  • These antibody modifications are also included in the monoclonal antibody of the present invention or a part thereof. In order to obtain such a modified antibody, it can be obtained by modifying the obtained antibody. These methods are already established in this field.
  • the present invention provides a polynucleotide encoding the heavy chain variable region or light chain variable region of the humanized monoclonal antibody (h1F3) of the present invention.
  • the polynucleotide of the present invention has the base sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 29 and 30.
  • a polynucleotide encoding an antibody that hybridizes with the polynucleotide under stringent conditions and has an activity equivalent to that of the antibody of the present invention is also within the scope of the present invention.
  • the polynucleotide of the present invention is not particularly limited as long as it encodes the antibody of the present invention, and is a polymer composed of a plurality of nucleotides such as deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA). Non-natural bases may be included.
  • the polynucleotide of the present invention can be used for producing an antibody by genetic engineering techniques. Moreover, it can also be used as a probe for screening an antibody having a function equivalent to that of the antibody of the present invention.
  • a polynucleotide encoding the antibody of the present invention, or a part thereof, is used as a probe, and is hybridized with the polynucleotide under stringent conditions by a technique such as hybridization or gene amplification technique (eg, PCR), and DNA encoding an antibody having an activity equivalent to that of the antibody of the present invention can be obtained.
  • a technique such as hybridization or gene amplification technique (eg, PCR)
  • DNA encoding an antibody having an activity equivalent to that of the antibody of the present invention can be obtained.
  • DNA is also included in the polynucleotide of the present invention.
  • Hybridization techniques (Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) are techniques well known to those skilled in the art.
  • Examples of hybridization conditions include low stringency conditions. Low stringent conditions are, for example, conditions of 42 ° C., 0.1 ⁇ SSC and 0.1% SDS in washing after hybridization, and preferably conditions of 50 ° C., 0.1 ⁇ SSC and 0.1% SDS. More preferable hybridization conditions include highly stringent conditions. Highly stringent conditions are, for example, conditions of 65 ° C., 5 ⁇ SSC and 0.1% SDS.
  • Antibodies functionally equivalent to the antibodies of the present invention encoded by polynucleotides obtained by these hybridization techniques and gene amplification techniques usually have high homology in amino acid sequences with these antibodies.
  • the antibody of the present invention includes an antibody functionally equivalent to the antibody of the present invention and having high homology with the amino acid sequence of the antibody.
  • High homology generally refers to at least 50% identity, preferably 75% identity, more preferably 85% identity, more preferably 95% identity at the amino acid level. .
  • Polypeptide homology was determined using the algorithm described in the literature (Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730). Just do it.
  • the monoclonal antibody of the present invention or a part thereof is useful as a pharmaceutical composition. Therefore, the pharmaceutical composition containing the monoclonal antibody of the present invention and a part thereof can be systemically or locally administered orally or parenterally.
  • parenteral administration for example, intravenous injection such as infusion, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, intranasal administration, inhalation, etc. can be selected. It is known to damage epithelial cells and alveolar macrophages (T. Sawa et al., Nature Medicine, 1999, Vol. 5, page 392). Intranasal administration and inhalation are desirable.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered for the treatment of cystic fibrosis and infection patients caused by Pseudomonas aeruginosa.
  • the effective dose is selected from the range of 0.01 mg to 100 mg per kg body weight at a time.
  • a dose of 1-1000 mg, preferably 5-50 mg per patient can be selected.
  • the pharmaceutical composition containing the monoclonal antibody of the present invention or a part thereof is not limited to these doses.
  • the administration period can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain both pharmaceutically acceptable carriers and additives depending on the route of administration.
  • Such carriers and additives include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, sodium alginate, water-soluble dextran, pectin, methyl cellulose, ethyl cellulose, casein, diglycerin, propylene glycol , Polyethylene glycol, petrolatum, human serum albumin (HSA), mannitol, sorbitol, lactose, surfactants acceptable as pharmaceutical additives, and the like.
  • the additive to be used is selected appropriately or in combination from the above depending on the dosage form, but is not limited thereto.
  • a method for producing a mouse monoclonal antibody against PcrV will be described with reference examples.
  • Mab166 (Japanese Patent Application No. 2005-500250, etc.) was produced as a recombinant antibody.
  • mRNA was extracted from a hybridoma producing an antibody whose subclass is IgG2a, and the constant regions of the H chain and L chain were cloned by RT-PCR.
  • Each fragment amplified by PCR was inserted into a pcDNA3.1 (+) vector (manufactured by Invitrogen) at the NheI and NotI sites, and a multiple cloning site was incorporated so that the DNA fragment of the variable region could be inserted.
  • the H chain and L chain gene sequences of the Mab166 variable region were each divided into four, and then the sense DNA and antisense DNA were synthesized and annealed.
  • the annealed fragments were ligated by DNA ligase, and the H chain was cloned into the MfeI and Blp I regions, and the L chain was cloned into the EcoRV and BsiW I regions.
  • the H chain and L chain vectors whose base sequences were confirmed were introduced into HEK239T cells using Lipofectamine 2000 (manufactured by Invitrogen). After 48 hours, the cell supernatant was recovered. Recombinant Mab166 was purified from the collected cell supernatant using a Protein-G (PIERCE) column. (Reference Example 2)
  • the amplified PCR fragment was cloned into the pQE30 vector (GE Healthcare) at the Sph I and Hind III sites. After confirming the base sequence, this vector was introduced into E. coli JM109 to obtain recombinant E. coli (PcrV-JM109).
  • PcrV-JM109 was cultured in 500 ml of LB / Ampicillin liquid medium at 37 ° C., and when OD600 reached 0.5, 200 ⁇ l of 0.1M IPTG was added to induce PcrV expression. Further, after culturing at 37 ° C.
  • buffer A 25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5 M NaCl containing 0.5% lysozyme (manufactured by Sigma)
  • 15 ml of 2 mM MgCl 2 was added and allowed to stand at 0 ° C. for 30 minutes, followed by sonication.
  • a soluble fraction was obtained, passed through His-Bind Columns (manufactured by Novagen), and then eluted with buffer B (200 mM phosphate buffer (pH 7.4), 500 mM NaCl) containing 200 mM imidazole.
  • the final elution fraction was dialyzed against 10 mM phosphate buffer (pH 7.4) to perform buffer replacement.
  • Biotin labeling of antigen As described above, PcrV protein expressed and purified was reacted in a final concentration 10 mM mercaptoethylamine solution at 37 ° C for 150 minutes to reduce cysteine residues. To the reduced SH group, 20 times the molar amount of PEO-Maleimide activated biotin (manufactured by PIERCE) was added and reacted at 4 ° C. overnight, and then dialyzed to remove excess biotin.
  • Spleen cells and mouse myeloma cells were fused with 50% polyethylene glycol 4000 and selected in a medium containing hypoxanthine, aminopterin, and thymidine.
  • the immunoassay used for the screening is as follows. 200 ⁇ l of Tris buffer solution (50 mM Tris-HCl, pH 7.5) containing 2 ⁇ g of anti-mouse IgG antibody (manufactured by Shiba Goat) was added to each well of a 96-well microtiter plate (manufactured by NUNK) and fixed at 4 ° C. for 16 hours. did.
  • the plate was washed 3 times with 300 ⁇ l of washing solution, and the enhancement reagent (1.39 g / l potassium phthalate, 19.3 mg / l Tri-n-octylphosphine oxide, 4.59 mg / l 2-naphthoyltrifluoracetone, 1.0 g / l 200 ⁇ l of 1 Triton-X100, 6.0 g / l acetic acid) was added, and the time-resolved fluorescence was measured.
  • the enhancement reagent (1.39 g / l potassium phthalate, 19.3 mg / l Tri-n-octylphosphine oxide, 4.59 mg / l 2-naphthoyltrifluoracetone, 1.0 g / l 200 ⁇ l of 1 Triton-X100, 6.0 g / l acetic acid
  • 1F3 was IgG2a
  • 2A4 was IgG2b
  • 6F5 was IgG2a
  • 7A7 was IgG2a.
  • Hybridomas producing the monoclonal antibodies 1F3 and 2A4 were obtained from the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biology Depositary Center (1-1-1 Higashi 1-1-1, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture) on January 15, 2009, respectively. It has been deposited internationally with receipt numbers FERM ABP-11805 and FERM ABP-11806. (Reference Example 3)
  • Antibody binding activity A competitive immunoassay was performed to measure the binding activity of the antibodies (1F3, 2A4, 6F5, 7A7).
  • 100 ⁇ l of Tris buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5) containing 1.5 ⁇ g of anti-mouse Fc antibody (Jackson ImmunoResearch) was added to each well of a 96-well microtiter plate (Nunk) at 4 ° C. Fixed for 16 hours. These wells were washed twice with 300 ⁇ l of washing solution, and then 300 ⁇ l of a block ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) solution containing 10% sucrose was added and left at room temperature for 2 hours for blocking (anti-mouse IgG antibody). Solid phase plate).
  • the affinity of Mab166 is 3.0 ⁇ 10 ⁇ 9
  • 1F3 is 3.7 ⁇ 10 ⁇ 10
  • 2A4 is 3.5 ⁇ 10 ⁇ 10
  • 6F5 is 1.1 ⁇ 10 9.
  • ⁇ 10 7A7 was 1.1 ⁇ 10 ⁇ 9
  • both clones had higher affinity than Mab166 (FIG. 2) (Reference Example 4)
  • m166 Availability of sandwich with Mab166
  • the possibility of a sandwich assay between the antibody and Mab166 (hereinafter also referred to as m166) was examined.
  • the biotin labeling of Mab166 was performed. 100 ⁇ g of Mab166 and 7.853 ⁇ g of NHS-PEO4 Biotin (manufactured by PIERCE) were mixed in 0.1 M PBS (pH 7.4) and reacted in ice for 2 hours. Then, in order to remove unreacted biotin from the reaction solution, gel chromatography (G2000SW column (manufactured by TOSHO)) was performed.
  • G2000SW column manufactured by TOSHO
  • Cytotoxicity inhibitory activity test 1F3, 2A4, 6F5, and 7A7 were subjected to a cytotoxicity inhibitory activity test. The method is as follows. First, 1F3, 2A4, 6F5, and 7A7 were diluted from 32 ⁇ g / ml in a 2-fold dilution series, and 10 ⁇ l was dispensed into each well of a 96-well microplate.
  • the myeloma cell P3U1 (obtained from ATCC) was added to 5 ⁇ 10 6 Cells / ml or U937 (obtained from ATCC) cells, which were a type of white blood cell, to 1 ⁇ 10 6 Cells / ml, and the cell culture medium (sodium bicarbonate was added) And L-glutamine and phenol red-free RPMI 1640 (manufactured by Sigma)) and 100 ⁇ l of each was added to the 96-well microplate.
  • the cell culture medium sodium bicarbonate was added
  • L-glutamine and phenol red-free RPMI 1640 manufactured by Sigma
  • a Pseudomonas aeruginosa SR24 strain cultured overnight in Cation-adjusted Mueller Hinton Broth (Difco) was added to the cell culture medium to 1 ⁇ 10 8 cfu / ml at 10 ⁇ l / well, and added at 37 ° C. and 3 hours at 5% C0 2 presence.
  • WST-8 Koreana Chemical Co., Ltd.
  • each 10 [mu] l in the case of using myeloma cells P3U1, 37 ° C., 3 hours at 5% C0 2 presence, in the case of U937 cells incubated for one hour did.
  • the absorbance was measured at a wavelength of 450 nm.
  • the cytotoxic inhibitory activity (IC50) of Mab166 was 213 nM or higher, whereas 1F3 was 5.3 nM, 2A4 was 20.7 nM, 6F5 was 12.7 nM, 7A7 is 14.7 nM.
  • IC50 cytotoxic inhibitory activity
  • Mab166 is 54 nM, whereas 1F3 is 4.0 nM, 2A4 is 16 nM, 6F5 is 7.3 nM, and 7A7 is 6.0 nM. It was.
  • deletion mutation PcrV (136-233) was prepared by the following method. PCR was performed using the PcrV antigen protein expression plasmid pQE30-PcrV as a template and using the 5 ′ primer GCTCGAGGATCCCAAGGCCGCTGACCGC (SEQ ID NO: 5) and 3 ′ primer GTTAAGCTTCTCGAAGGGGTACTC (SEQ ID NO: 6), and the amplified fragment was BamHI and HindIII After restriction enzyme treatment, it was inserted into pET32b (manufactured by Novagen).
  • this vector was introduced into Escherichia coli BL21-DE3 strain to obtain recombinant Escherichia coli (deletion mutant PcrV-BL21).
  • This expression strain was pre-cultured in 2 ml of LB / Ampicillin liquid medium at 37 ° C. overnight. 2 mL of pre-culture solution was added to 500 ml of LB / Ampicillin liquid medium and cultured at 37 ° C. When OD600 reached 0.5, the culture solution was added and allowed to stand on ice for 30 minutes. IPTG was added to a final concentration of 0.75 mM, and the cells were cultured overnight at 15 ° C. and 160 rpm in a shaking incubator to induce the expression of PcrV.
  • the culture was collected by centrifugation at 4 ° C., x5000 g, 30 min. The supernatant was removed, and 10 ml of Buffer X (25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2) containing 0.1% lysozyme (manufactured by Sigma) was added to the cells and suspended. After leaving it to stand for 1 hour, it was subjected to ultrasonic crushing treatment while cooling with ice.
  • Buffer X 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2) containing 0.1% lysozyme (manufactured by Sigma) was added to the cells and suspended. After leaving it to stand for 1 hour, it was subjected to ultrasonic crushing treatment while cooling with ice.
  • the possible fraction was obtained by centrifugation, passed through a column packed with Ni-NTA agarose (Qiagen), and then eluted with Buffer Y (25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 200 mM Imidazole). The final elution fraction was dialyzed against 10 mM phosphate buffer (pH 7.4) to perform buffer replacement.
  • enhancement reagent (1.39 g / l potassium phthalate, 19.3 mg / l Tri-n-octylphosphine oxide, 4.59 mg / l 2-naphthoyltrifluoracetone, 1.0 g / l Triton- 200 ⁇ l of X100, 6.0 g / l acetic acid) was added, and the time-resolved fluorescence was measured (FIG. 6).
  • the PcrV antibodies 1F3, 2A4, 9D12, 12H9, and m166 from KaloBios used as a reference example showed reactivity with the full length of PcrV (1-294).
  • 1F3 and 2A4 showed reactivity against PcrV (136-233), but m166 and 9D12 and 12H9 without neutralizing activity showed no reactivity.
  • a PcrV antibody solution diluted to 1 ⁇ g / ml was added to the membrane, reacted at 4 ° C. overnight, and then washed with washing solution B (10 mM phosphate buffer (pH 7.4), 0.05% Tween 20).
  • washing solution B 10 mM phosphate buffer (pH 7.4), 0.05% Tween 20.
  • a solution of anti-mouse IgG antibody (manufactured by GE Healthcare) labeled as a secondary antibody was added to the membrane, reacted for 2 hours at room temperature, the membrane was washed with washing solution B, and then ECL plus Western Blot Detection System (manufactured by GE Healthcare). Color was developed and photographed with LAS-1000 (FUJIFILM) (FIG. 7).
  • PcrV neutralizing antibodies 1F3 and 2A4 reacted to both full-length PcrV and deletion mutant PcrV, while m166 and 6F5 and 7A7 with low neutralizing activity reacted only to full-length PcrV and to deletion mutant PcrV. Did not react.
  • the epitope region of the PcrV neutralizing antibodies 1F3 and 2A4 was the region of amino acid residues 136-233, and m166, 6F5, and 7A7 did not have only the amino acid residues 136-233 as the epitope region. (Reference Example 7)
  • the test concentration ranges of 1F3, 2A4, and m166 in this test were 1.56-6.25 nM, 6.25-25 nM, and 50-200 nM, respectively.
  • 10 ⁇ l of full length PcrV protein and deletion mutant PcrV protein were added to a 96-well plate at a molar concentration of 30, 10, 3, 1, 0.3 times for each test concentration range, and left at room temperature for 30 minutes.
  • myeloma cells U3P1 were prepared in 5 ⁇ 10 6 cells / ml using a cell culture medium (containing sodium bicarbonate, L-glutamine and phenol red-free RPMI 1640 (manufactured by Sigma)), and the 96 wells. 70 ⁇ l of each was added to the microplate.
  • the antibodies (1F3 and 2A4) having an epitope at amino acid residues 136-233 have stronger cytotoxic inhibitory activity than the antibody (m166) having no epitope in that region. That is, the strength of cytotoxicity-inhibiting activity differs depending on the region recognized by the PcrV antibody, and the strongest cytotoxicity-inhibiting activity can be said to be an antibody having reactivity with the PcrV protein only in the amino acid residue 136-233 region. It was. (Reference Example 8)
  • 1F3 was AGGGGCCCAGTGGATAGACCGATGGGCGCTGT (sequence number: 9)
  • 2A4 was AGGGGCCCAGTGGATAGACTGATGGGGGGTGT (sequence number: 10).
  • the amplified fragment was cloned using TOPO TA Cloning Kit (manufactured by Invitrogen), and the base sequence was analyzed using Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer (manufactured by Applied Biosystems).
  • the analysis results of 1F3 are shown in FIG. 10, and 2A4 is shown in FIG.
  • the complementarity determining region in the heavy chain variable region is SFTSYWMH (SEQ ID NO: 15) INPSNGRTNYNEKFNT (SEQ ID NO: 16) YGNYVVYYTMDY (SEQ ID NO: 17), and the complementarity determining region in the light chain variable region is SASSTSVSYME (SEQ ID NO: 18) TTSKLAS (SEQ ID NO: 19) HQWRNYPFT (SEQ ID NO: 20).
  • the complementarity determining region in the heavy chain variable region of 2A4 is SITSDYAWN (SEQ ID NO: 21) YITYNGDTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 22) SRNYYGAWFAY (SEQ ID NO: 23), and the complementarity determining region in the light chain variable region was KASQYVGGTTVA (SEQ ID NO: 24) RASTRHT (SEQ ID NO: 25) QQYCSSPLT (SEQ ID NO: 26).
  • mice monoclonal antibody 1F3 Humanization of mouse monoclonal antibody 1F3 prepared as described above was prepared by transplanting the CDR of mouse antibody into a human germline acceptor sequence.
  • IgBLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/
  • the J gene region was selected from IMGT (http://imgt.cines.fr/) for the homology with the mouse antibody DNA sequence.
  • IMGT gene name; IGHV1-46 * 01 is the human reproductive gene having the highest homology to the J gene region as the human gene acceptor sequence-derived antibody gene sequence having the highest homology to the mouse antibody heavy chain V gene region. Since IMGT gene name; IGHJ6 * 01 was obtained as a system acceptor sequence-derived antibody gene sequence, this was used as a human framework sequence for heavy chain transplantation. Similarly, IMGT gene name; IGKV1-9 * 01 is the human reproductive system having the highest homology to the J gene region as the human reproductive acceptor sequence-derived antibody gene sequence having the highest homology to the mouse antibody light chain V gene region. Since IMGT gene name; IGKJ2 * 02 was obtained as an acceptor sequence-derived antibody gene sequence, this was used as a human framework sequence for light chain transplantation.
  • the V gene region amino acid sequences of the mouse antibody heavy chain and light chain were searched by IgBLAST, and the most homologous heavy chain sequence was Gene name; J558.33, Gene name; IGKV4-80 * 01 was obtained as the light chain sequence with the highest homology.
  • the amino acid sequence of the D gene region of the mouse antibody heavy chain was searched with IgBLAST, and Gene name; IGHD2-1 * 01 was obtained as the most homologous heavy chain sequence.
  • the J gene region DNA sequences of mouse antibody heavy chain and light chain are searched by IMGT, and IMGT gene name; IGHJ4 * 01 is the most homologous heavy chain sequence, and IMGT gene is the most homologous light chain sequence.
  • H71 and H94 were identified as different canonical side chains (http://www.bioinf.org.uk/abs/chothia.html) between the mouse antibody and the template humanized antibody.
  • Vernier zone those located in Vernier zone (Foote et al., J. Mol. Biol., 224.487 (1992)) are H48, H67, H69, H71, H78, H93, H94, L46, L71.
  • the annealed fragments were joined by DNA ligase, inserted into pcDNA3.1 (+) vector (Invitrogen) at the NheI and NotI sites, and a multicloning site was incorporated so that the DNA fragment of the variable region could be inserted. .
  • the sense DNA and the antisense DNA were synthesized and subjected to an annealing reaction.
  • the annealed fragments were joined by DNA ligase, and the heavy chain was cloned into the MfeI and BlpI regions, and the light chain was cloned into the EcoRV and BsiWI regions to confirm the DNA base sequence.
  • a human / mouse chimeric 1F3 antibody was prepared as an indicator for antibody humanization.
  • a human IgG4Pro constant region sequence is designed as a heavy chain constant region sequence in the heavy chain variable region of the mouse antibody, an expression plasmid is constructed by the method described below, and a mouse / human chimeric antibody heavy chain expression plasmid (FIG. 13; H chimera) is constructed. ).
  • a DNA sequence in which a human Igkappa constant region sequence is joined to a light chain variable region of a mouse antibody as a light chain constant region sequence is designed, and an expression vector is constructed by the above-described method to obtain a mouse / human chimeric antibody light chain expression plasmid ( FIG. 13; L chimera).
  • the KD value of the affinity analysis of the mouse / human chimeric antibody was 2.6 ⁇ 10 ⁇ 10 M.
  • the KD value of the antibody of the template humanized antibody heavy chain and the template humanized antibody light chain is 2.2 ⁇ 10 ⁇ 7 M, and the KD value of the antibody of the template humanized antibody heavy chain and the variant humanized antibody light chain is It was 6.5 ⁇ 10 ⁇ 7 M, and it was confirmed that the affinity was greatly reduced.
  • the KD values of the mutant humanized antibody heavy chain antibody and the template humanized antibody light chain antibody are 3.3 ⁇ 10 ⁇ 10 M, and the mutant humanized antibody heavy chain and the mutant humanized antibody light chain antibody The KD value was 3.4 ⁇ 10 ⁇ 10 M, indicating that the affinity close to that of the mouse / human chimeric antibody was maintained. From these results, it was determined that the mutant humanized antibody heavy chain is important for maintaining affinity, and that the light chain is the same regardless of whether the template humanized antibody light chain or the mutant humanized antibody light chain is used. Therefore, the template humanized antibody light chain close to the human germline sequence was selected for the light chain.
  • the properties were evaluated by surface plasmon resonance analysis (FIG. 14).
  • the KD value of the humanized antibody obtained by converting Val of H93 to Ala is 1.0 ⁇ 10 ⁇ 9 M
  • the KD value of the humanized antibody obtained by converting Leu of H94 to Arg is 3.2 ⁇ 10 ⁇ 7 M
  • the affinity was reduced, no significant decrease in affinity was observed in the humanized antibody in which other mutations were returned to the human germline sequence.
  • H93 and H94 used mouse antibody-derived sequences, and H48, H67, H69, H71, and H78 confirmed humanized antibody sequences using human germline amino acid sequences (FIGS. 15 and 16). ).
  • An antibody having this sequence was prepared according to the method of (3) below, and the affinity was confirmed by surface plasmon resonance analysis. As a result, it was confirmed that the affinity was equivalent to that of the mouse antibody (FIG. 17).
  • m1F3 human antibody
  • h1F3 humanized antibody
  • m166 The cytotoxicity inhibition activity test of m1F3 (mouse antibody), h1F3 (humanized antibody) and m166 was performed.
  • the method is as follows. First, m1F3, h1F3, and m166 were diluted with 200-fold dilution series from 200 nM, 200 nM, and 800 nM, respectively, and 10 ⁇ l was dispensed into each well of a 96-well microplate. Next, 5 ⁇ 10 6 cells / ml of myeloma cell U3P1 or 1 ⁇ 10 6 of U937 cell was used using cell culture medium (containing sodium bicarbonate, L-glutamine and phenol red-free RPMI 1640 (manufactured by Sigma)).
  • cell culture medium containing sodium bicarbonate, L-glutamine and phenol red-free RPMI 1640 (manufactured by Sigma)
  • the humanized monoclonal antibody of the present invention or a part thereof not only has a high affinity for PcrV but also has a strong inhibitory activity against the cytotoxic activity against eukaryotic cells of Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa). Indicated. Therefore, the pharmaceutical composition containing the monoclonal antibody or a part thereof is useful as a therapeutic agent for infectious diseases involving Pseudomonas aeruginosa, which is currently difficult to treat in the medical field.

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Abstract

感染症、特に緑膿菌による感染症の治療に有効な手段として、ＰｃｒＶに対するヒト化モノクローナル抗体又はその一部、およびこれらを有効成分として含む医薬組成物を提供する。具体的には、本発明のヒト化モノクローナル抗体は、緑膿菌のターゲット細胞に対する細胞傷害性の阻害活性が優れている。また、本発明のヒト化モノクローナル抗体はＰｃｒＶに対して高い親和性を有する。

Description

抗緑膿菌作用を有するヒト化ＰｃｒＶ抗体
　本発明は、ＰｃｒＶを認識するヒト化モノクローナル抗体又はその一部に関する。具体的には、本発明は従来の抗ＰｃｒＶ抗体よりも中和活性（以下、細胞傷害阻害活性ともいう）の高い抗体又はその一部、およびこれらを含有する医薬組成物に関する。
緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は、自然界に広く存在する偏性好気性のグラム陰性桿菌である。その病原性は通常は低いが、癌や糖尿病等の各種基礎疾患を有する患者、免疫抑制作用を有する薬剤の投与を受けている患者に多く発生する日和見感染症を引き起こす病原菌であり、肺炎、尿路感染症、敗血症等を引き起こして重篤な結果をもたらすことも多い。緑膿菌感染症は臨床現場では、現在最も治療の困難な感染症の一つと考えられている。何故なら、緑膿菌は既存の抗生物質に対する感受性が元来低いばかりでなく、種々の抗生物質に対して容易に耐性を獲得して難治化する傾向が強いためである。このように、緑膿菌に対しては、次々に新たな抗生物質を開発するという対応では限界があり、抗生物質によらない治療法が切望されている。
　緑膿菌の高い細胞傷害性は、III型外毒素分泌システムを経由した真核細胞内への毒素注入により発揮される。ＰｃｒＶは、２９４残基（ＮＣＢＩ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＡＣ４５９３５、配列番号：１）からなるIII型外毒素分泌システムの構成蛋白であり、コードするオペロン配列は公開されている（特許文献１、非特許文献１）。ＰｃｒＶに対する制御は、緑膿菌感染症における治療手段に結びつく可能性がある（非特許文献２）ことから、中和活性を有するＰｃｒＶに対するポリクローナル抗体（非特許文献３、４）やモノクローナル抗体（特許文献２、非特許文献５、６）が報告されている。しかし、ポリクローナル抗体ではヒト化が困難であり、また抗原性の改善が難しく医薬品組成物としての使用は困難である。また、現在までに報告されているモノクローナル抗体は、その中和活性が低く、臨床現場における要求を満たすものではない。
米国特許６５５１７９５ 特表２００５－５００２５０
Ｙａｈｒ，Ｔ．Ｌ．ら、Ｊ. Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １９９７年、第１７９巻、７１６５ページ Ｔ・Ｓａｗａら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９９年、第５巻、３９２ページ Ｓｈｉｍｅ　Ｎら Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１年、第１６７巻、５８８０ページ Ｉｍａｍｕｒａ　Ｙら Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ． ２００７年、第２９巻、９６５ページ Ｋａｒｉｎｅ　Ｆａｕｒｅら Ｊ．Ｉｍｍｕｎｅ．Ｂａｓｅｄ．Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ　ａｎｄ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ、２００３年、第１巻 Ｄａｒａ　Ｗ．Ｆｒａｎｋら Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓｅ、２００２年、第１８６巻、６４ページ
　本発明が解決しようとする課題は、感染症、特に緑膿菌による感染症の治療に有効な手段を提供することである。
本発明者らは、ＰｃｒＶに対するモノクローナル抗体の作製に関して鋭意研究した結果、従来知られている抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体に比して、より疾患への治療効果が高いと考えられる新規なヒト化モノクローナル抗体を作製することに成功し本発明を完成した。
すなわち本発明は、
（１）以下の（Ａ）～（Ｄ）から選ばれる少なくとも１つの性質を有するＰｃｒＶに対するヒト化モノクローナル抗体またはその一部：
　（Ａ）インビトロにおいて１ｎＭから２００ｎＭの濃度で、緑膿菌の白血球細胞に対する細胞傷害活性の５０％以上を阻害する、　　
　（Ｂ）インビトロにおいて１ｎＭから５０ｎＭの濃度で、緑膿菌のミエローマ細胞に対する細胞傷害活性の５０％以上を阻害する　　　　　　　
　（Ｃ）ＰｃｒＶとの解離定数（Ｋｄ）が、２×１０－９（Ｍ）以下である、及び
　（Ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１３６位から２３３位に、エピトープを有する、　　
（２）受託番号ＦＥＲＭ　ＡＢＰ-１１８０５として寄託されたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体の全ての相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を有するヒト化モノクローナル抗体またはその一部、
（３）１）相補性決定領域に下記アミノ酸配列を含む重鎖可変領域；　　　　　　　ＳＦＴＳＹＷＭＨ（配列番号１５）、ＩＮＰＳＮＧＲＴＮＹＮＥＫＦＮＴ（配列番号１６）、ＹＧＮＹＶＶＹＹＴＭＤＹ（配列番号１７）、および　
２）相補性決定領域に下記アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；ＳＡＳＴＳＶＳＹＭＥ（配列番号１８）、ＴＴＳＫＬＡＳ（配列番号１９）、　 ＨＱＷＲＮＹＰＦＴ（配列番号２０）を有するＰｃｒＶに対するヒト化モノクローナル抗体またはその一部、
（４）１）相補性決定領域に下記アミノ酸配列を含む重鎖可変領域；　　　　　　　ＳＦＴＳＹＷＭＨ（配列番号１５）、ＩＮＰＳＮＧＲＴＮＹＮＥＫＦＮＴ（配列番号１６）、ＹＧＮＹＶＶＹＹＴＭＤＹ（配列番号１７）あるいは、これらの３つのＣＤＲのうちの１つ以上のＣＤＲにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲ、および　
２）相補性決定領域に下記アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；ＳＡＳＴＳＶＳＹＭＥ（配列番号１８）、ＴＴＳＫＬＡＳ（配列番号１９）、　 ＨＱＷＲＮＹＰＦＴ（配列番号２０）あるいは、これらの３つのＣＤＲのうちの１つ以上のＣＤＲにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲ
を有し、かつ以下の（Ａ）～（Ｄ）から選ばれる少なくとも１つの性質を有するＰｃｒＶに対するヒト化モノクローナル抗体またはその一部：
　（Ａ）インビトロにおいて１ｎＭから２００ｎＭの濃度で、緑膿菌の白血球細胞に対する細胞傷害活性の５０％以上を阻害する、　　
　（Ｂ）インビトロにおいて１ｎＭから５０ｎＭの濃度で、緑膿菌のミエローマ細胞に対する細胞傷害活性の５０％以上を阻害する、及び　　　　　　　
　（Ｃ）ＰｃｒＶとの解離定数（Ｋｄ）が、２×１０－９（Ｍ）以下
（Ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１３６位から２３３位に、エピトープを有する、
（５）１）配列番号２７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；および　　　　　　
２）配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；を有するＰｃｒＶに対するヒト化モノクローナル抗体またはその一部、
（６）上記（１）～（５）のいずれかに記載の抗体又はその一部を有効成分として含む医薬組成物、
（７）上記（３）～（５）に記載の抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、
（８）上記（７）に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
（９）上記（１）～（５）のいずれかに記載の抗体又はその一部の有効量を治療の必要な患者へ投与することを含む緑膿菌感染症の治療法、
（１０）緑膿菌感染症の治療薬を製造するための上記（１）～（５）のいずれかに記載の抗体又はその一部の使用、および
（１１）緑膿菌感染症の治療のための上記（１）～（５）のいずれかに記載の抗体又はその一部を含む医薬組成物、
に関する。
　本発明のヒト化モノクローナル抗体又はその一部は、ＰｃｒＶに対する中和活性が非常に優れているため、緑膿菌による感染症の予防・治療剤として有用である。
図１は、ＰｃｒＶ抗体（１Ｆ３、２Ａ４、６Ｆ５、７Ａ７及びＭａｂ１６６）におけるビオチン標識ＰｃｒＶの未標識ＰｃｒＶによる置換曲線を示す。 図２は、表面プラズモン共鳴解析によるＰｃｒＶ抗体（１Ｆ３、２Ａ４、６Ｆ５、７Ａ７及びＭａｂ１６６）の親和性を示す。 図３は、ＰｃｒＶ抗体（１Ｆ３、２Ａ４、６Ｆ５、７Ａ７、Ｍａｂ１６６）とＭａｂ１６６とのサンドイッチ・アッセイの結果を示す。 図４は、シュードモナス・アエルギノーザＳＲ２４株のＵ９３７細胞への細胞傷害活性に対するＰｃｒＶ抗体（１Ｆ３、２Ａ４、６Ｆ５、７Ａ７及びＭａｂ１６６）の阻害効果を示す。 図５は、シュードモナス・アエルギノーザＳＲ２４株のミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１への細胞傷害活性に対するＰｃｒＶ抗体（１Ｆ３、２Ａ４、６Ｆ５、７Ａ７及びＭａｂ１６６）の阻害効果を示す。 図６は、ＰｃｒＶ抗体（１Ｆ３、２Ａ４、９Ｄ１２、１２Ｈ９及びＭａｂ１６６）におけるビオチン標識ＰｃｒＶの未標識全長ＰｃｒＶおよび欠失変異ＰｃｒＶによる置換曲線を示す。 図７は、ウエスタンブロットでのＰｃｒＶ抗体（１Ｆ３、２Ａ４、９Ｄ１２、１２Ｈ９及びＭａｂ１６６）における全長ＰｃｒＶおよび欠失変異ＰｃｒＶとの反応性を示す。 図８は、抗体と全長ＰｃｒＶとの相関関係を細胞傷害阻害活性の抑制により示す。 図９は、抗体と欠損変異ＰｃｒＶとの相関関係を細胞傷害阻害活性の抑制により示す。 １Ｆ３抗体の可変領域のアミノ酸配列を示す。下線部はＣＤＲ領域を示す。 ２Ａ４抗体の可変領域のアミノ酸配列を示す。下線部はＣＤＲ領域を示す。 マウス抗体（Ｍｏｕｓｅ　１Ｆ３）、鋳型ヒト化抗体（Ｔｅｍｐｌａｔｅ），変異型ヒト化抗体（Ｂａｃｋｍｕｔａｔｉｏｎ）、ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ　１Ｆ３）の重鎖可変領域、および軽鎖可変領域のアミノ酸配列アライメントを示す。 マウス・ヒトキメラ抗体重鎖（Ｈ　ｃｈｉｍｅｒａ）、マウス・ヒトキメラ抗体軽鎖（Ｌ　ｃｈｉｍｅｒａ）、鋳型ヒト化抗体重鎖（ＨＴ）、鋳型ヒト化抗体軽鎖（ＬＴ）、変異型ヒト化抗体重鎖（ＨＢ）、変異型ヒト化抗体軽鎖（ＬＢ）のそれぞれを組み合わせた抗体とＰｃｒＶ抗原との親和性を示す。 マウス・ヒトキメラ抗体重鎖（Ｈ　ｃｈｉｍｅｒａ）、マウス・ヒトキメラ抗体軽鎖（Ｌ　ｃｈｉｍｅｒａ）、変異型ヒト化抗体重鎖変異体（Ｉ４８Ｍ、Ａ６７Ｖ、Ｌ６９Ｍ、Ｖ７１Ｒ、Ａ７８Ｖ、Ｖ９３Ａ、Ｌ９４Ｒ）、鋳型ヒト化抗体軽鎖（ＬＴ）のそれぞれを組み合わせ抗体とＰｃｒＶ抗原との親和性を示す。 ヒト化抗体の重鎖の可変領域のアミノ酸配列を示す。下線部はＣＤＲ領域を示す。 ヒト化抗体の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を示す。下線部はＣＤＲ領域を示す。 マウス・ヒトキメラ抗体重鎖（Ｈ　ｃｈｉｍｅｒａ）、マウス・ヒトキメラ抗体軽鎖（Ｌ　ｃｈｉｍｅｒａ）、ヒト化抗体重鎖（ｈ１Ｆ３　Ｈ）、ヒト化抗体軽鎖（ｈ１Ｆ３　Ｌ）のそれぞれを組み合わせ抗体とＰｃｒＶ抗原との親和性を示す。 シュードモナス・アエルギノーザＳＲ２４株のＵ９３７細胞への細胞傷害活性に対するヒト化ｐｃｒＶ抗体、マウスｐｃｒＶ抗体、Ｍａｂ１６６の阻害効果を示す。 シュードモナス・アエルギノーザＳＲ２４株のミエローマ細胞への細胞傷害活性に対するヒト化抗体、マウス抗体、Ｍａｂ１６６の阻害効果を示す。
本発明が対象とする「モノクローナル抗体」とは、前述するＰｃｒＶに特異的に結合するモノクローナル抗体である。より具体的には、（１）インビトロにおいて１ｎＭから２００ｎＭの濃度で、緑膿菌の白血球細胞に対する細胞傷害活性の５０％以上を阻害する、
　（２）インビトロにおいて１ｎＭから５０ｎＭの濃度で、緑膿菌のミエローマ細胞に対する細胞傷害活性の５０％以上を阻害する、および
　（３）ＰｃｒＶとの解離定数（Ｋｄ）が、２×１０－９（Ｍ）以下である、
から選ばれる少なくとも１つの性質を有するＰｃｒＶに対するモノクローナル抗体である、（４）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１３６位から２３３位に、エピトープを有する。
本発明のモノクローナル抗体は、強い細胞傷害阻害活性を有していることを一つの特徴として挙げられる。例えば、白血球細胞を用いた場合であれば緑膿菌の有する細胞傷害活性を１～２００ｎＭ、好ましくは２～１００ｎＭ、さらに好ましくは５～２５ｎＭの範囲内の濃度で５０％以上阻害する阻害（中和）活性を有している。また、ミエローマ細胞を用いた場合であれば、緑膿菌の有する細胞傷害活性を１～５０ｎＭ、好ましくは２～３０ｎＭ、さらに好ましくは４～２０ｎＭの範囲内の濃度で５０％以上阻害する阻害活性を有している。これらの値は、Ｄａｒａ　Ｗ．Ｆｒａｎｋら（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓｅ、２００２年、第１８６巻、６４ページ）に報告されているＭａｂ１６６の活性値を大きく超えている。
　また、本発明のモノクローナル抗体は、ＰｃｒＶの全長アミノ酸配列（配列番号１）における１３６位から２３３位の領域にそのエピトープを有することを特徴としている。この領域を認識する抗体は、その他の領域を認識する抗体よりも強い活性（細胞傷害阻害活性）を有することを本発明者らは見出した。この領域を認識する抗体は、強い細胞傷害阻害活性を有するので、感染症の治療用として有用である。
モノクローナル抗体の認識エピトープの同定は以下のようにして行うことができる。まず、モノクローナル抗体の認識する分子の様々な部分構造を作製する。部分構造の作製にあたっては、公知のオリゴペプチド合成技術を用いてその分子の様々な部分ペプチドを作成する方法、遺伝子組換え技術を用いて目的の部分ペプチドをコードするDNA配列を好適な発現プラスミドに組み込み、大腸菌等の宿主内外で生産する方法等があるが、上記目的のためには両者を組み合わせて用いるのが一般的である。例えば、抗原タンパク質のC末端又はN末端から適当な長さで順次短くした一連のポリペプチドを当業者に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製した後、それらに対するモノクローナル抗体の反応性を検討し、大まかな認識部位を決定する。
その後、さらに細かく、その対応部分のオリゴペプチド、又は該ペプチドの変異体等を、当業者に周知のオリゴペプチド合成技術を用いて種々合成し、本発明の予防又は治療剤が有効成分として含有するモノクローナル抗体のそれらペプチドに対する結合性を調べるか、又は該モノクローナル抗体と抗原との結合に対するペプチドの競合阻害活性を調べることによりエピトープを限定する。多種のオリゴペプチドを得るための簡便な方法として、市販のキット（例えば、ＳＰＯＴｓキット（ジェノシス・バイオテクノロジーズ社製）、マルチピン合成法を用いた一連のマルチピン・ペプチド合成キット（カイロン社製）等）を利用することもできる。
細胞傷害阻害活性は以下の手順により測定することができる。まず細胞傷害阻害活性の測定対象であるモノクローナル抗体を、２倍希釈系列によって希釈し適当な濃度に調製を行う。次に、緑膿菌の毒素などにより影響を受ける細胞（以下、ターゲット細胞とする）を細胞培養用の培地などを用いて希釈を行い、適当な数となるように調製する。具体的には、ミエローマ細胞を用いる場合であれば３×１０６～５×１０６Ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、白血球細胞を用いるのであれば１×１０６～３×１０６Ｃｅｌｌｓ／ｍｌの範囲で調製することが望ましい。同様にして、緑膿菌についても培養用の培地などで１×１０７～１×１０８ｃｆｕ／ｍｌとなるように調製する。そして、上述したモノクローナル抗体の存在下において、緑膿菌およびターゲット細胞を、同一の試験管やウェル（例えば、マイクロプレート上のウェルなどのインビトロの条件）において適度な培養条件により培養する。このときの培養条件は細胞やバクテリアを生育させるのに良好とされる一般的な培養条件でよい。また、培養時間はターゲット細胞の種類により最適な条件は適宜変更するが、例えばミエローマ細胞を用いる場合であれば１～３時間程度、白血球細胞を用いる場合であれば１～３時間程度が好ましい。抗体を添加しないウェルを対照群として、対照群に対して５０％を阻害する濃度（有効濃度）を算出する。ターゲット細胞の生死の判定については種々の手法が確立されているが、呈色試薬を添加した後に、適当な波長（例えば、４００～５００ｎｍ）における吸光度の測定などが有用である（参考文献：Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９９年、ｖｏｌ．５、３９２～３９５ページ）。
　本発明のモノクローナル抗体は、ＰｃｒＶに対して高い親和性を有していることをひとつの特徴として挙げられる。モノクローナル抗体の抗原に対する親和性を表す指標として用いられる解離定数（Ｋｄ）は、種々の方法に従って解析することができる。例えば、各種標識剤で標識した抗原を用いたＳｃａｔｃｈａｒｄ法や、市販の測定キットであるＢｉａｃｏｒｅＸ（アマシャムファルマシア社製）または類似のキットを用いて、当該キットに添付された取扱い説明書及び実験操作方法に従って容易に解析することができる。また、結合活性の評価には、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法なども用いることができる。これらの方法を用いて求められる解離定数（Ｋｄ値）はＭ（モル）なる単位で表される。試験されたモノクローナル抗体は、解離定数が小さいほど強い親和性を有していることを示す。本発明にかかるモノクローナル抗体またはその一部については、ＰｃｒＶとの解離定数（Ｋｄ）は、２×１０－９（Ｍ）以下、好ましくは１．５×１０－９（Ｍ）以下、さらに好ましくは１．２×１０－９（Ｍ）以下である。
本発明のモノクローナル抗体において、好ましい態様の一つとして、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）に相補性決定領域である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、この場合、ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＳＦＴＳＹＷＭＨ（配列番号１５）を有し、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＩＮＰＳＮＧＲＴＮＹＮＥＫＦＮＴ（配列番号１６）を有し、ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＹＧＮＹＶＶＹＹＴＭＤＹ（配列番号１７）であり、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶL）に相補性決定領域である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含みこの場合、ＣＤＲ１はアミノ酸配列　ＳＡＳＴＳＶＳＹＭＥ（配列番号１８）を有し、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＴＴＳＫＬＡＳ（配列番号１９）を有し、ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＨＱＷＲＮＹＰＦＴ（配列番号２０）を有する抗体を挙げることができる。
上記のＣＤＲ領域の配列は、本発明の所望する生物学的活性（たとえば、親和性や細胞傷害阻害活性など）が保持される範囲内であれば、上記３つのＣＤＲのうちの１つ以上のＣＤＲにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲを有するような改変体も本発明に含まれる。
本発明のモノクローナル抗体の好ましい態様の一つとして、上述した特徴を有するモノクローナル抗体のヒト化モノクローナル抗体が挙げられる。ヒト化モノクローナル抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ; ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ) をヒト抗体のＣＤＲへ移植したものである。したがって、フレームワーク領域は、ヒト由来のものである。使用に適当なフレームワーク領域は、Ｋａｂａｔ　Ｅ．Ａ．らの文献を参照すれば選択できる。この場合のＦＲとしては、ＣＤＲが良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成したヒト化抗体のＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のＦＲのアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ、Ｋ．ら, Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ． １９９３年、第５３巻、８５１ページ)。この場合、再度上記の工程を行えばよい。
ヒト化モノクローナル抗体の一般的な製造方法も知られている（例えば、ＷＯ９５／１４０４１号公報、ＷＯ９６／０２５７６号公報参照）。具体的には、まずマウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ＦＲ ; ｆｒａｍｅｗｏｒｋ　ｒｅｇｉｏｎ)を連結するように設計した可変領域をコードするＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する（ＷＯ９８／１３３８８号公報参照）。得られたＤＮＡを、ヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込む。または、抗体の可変領域をコードするＤＮＡを、抗体の定常領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。本発明で使用される抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー／プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。宿主細胞としては例えば、ＣＯＳ細胞やＣＨＯ細胞などの脊椎動物細胞、原核細胞、酵母などが挙げられる。
抗体遺伝子の発現は、抗体の重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）を別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主を形質転換させてもよい（ＷＯ９４／１１５２３参照）。
上記で得られる所望の形質転換体は、当業者に周知の方法に従って培養することができ、該培養により、形質転換体細胞内または細胞外にＰｃｒＶのヒト化モノクローナル抗体が産生される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば上記ＣＯＳ細胞の場合、ＲＰＭＩ－１６４０培地やダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）などの培地に、必要に応じウシ胎児血清（ＦＢＳ）などの血清成分を添加したものを使用できる。該形質転換体の培養の際の培養温度は、細胞内のタンパク質合成能を著しく低下せしめない温度であればいずれでもよいが、好適には３２～４２℃、最も好適には３７℃で培養することが好ましい。また必要に応じて、１～１０％（ｖ／ｖ）の炭酸ガスを含む空気中で培養することができる。
上記により形質転換体の細胞内または細胞外に生産される本発明のＰｃｒＶのヒト化モノクローナル抗体を含む画分は、該タンパク質の物理的性質や化学的性質等を利用した各種公知の分離操作法により、分離・精製することができる。かかる方法としては、具体的には例えば通常のタンパク質沈澱剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種クロマトグラフィー、透析法、およびこれらの組み合わせ等を採用できる。
上記方法により、容易に高収率、高純度で所望のＰｃｒＶのヒト化モノクローナル抗体を製造できる。このようにして、マウスモノクローナル抗体（１Ｆ３）をヒト化するために決定されたＣＤＲ配列全体およびＦＲ配列の一部のアミノ酸残基を、ヒト抗体へ移植することによって最適化された抗体の可変領域のアミノ酸配列を図１５（配列番号２７）および図１６（配列番号２８）に示す。
このヒト化抗体（ｈ１Ｆ３）は、ハイブリドーマにより産生されるマウス抗体（ｍ１Ｆ３）と比較すると、同等の強い細胞傷害阻害活性を有していた。抗体のヒト化において、通常、由来となった抗体の活性を維持したままヒト化を行うことは困難であるが、本発明においては、由来となったマウス抗体と同等の活性を有するヒト化抗体の取得に成功した。ヒト化抗体はヒト体内における抗原性が低下しているため、治療目的などでヒトに投与する場合に有用である。
本発明のヒト化モノクローナル抗体には、ヒト抗体の定常領域が使用される。好ましいヒト抗体の定常領域としては、重鎖としてはＣγが挙げられ、例えば、Ｃγ１，Ｃγ２，Ｃγ３，Ｃγ４を、軽鎖としてはＣκ、Ｃλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体のＣ領域を修飾してもよい。ヒト化の際
に用いられるヒト抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤなどいかなるアイソタイプのヒト抗体でもよいが、本発明においてはＩｇＧを用いることが好ましく、さらにIgＧ１又はＩｇＧ４が好ましい。
本発明のヒト化モノクローナル抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、放射性物質、トキシン等の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよい。このようなコンジュゲート抗体は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明におけるヒト化モノクローナル抗体にはこれらのコンジュゲート抗体も包含される。
　また本発明のヒト化モノクローナル抗体は、そのＮ末端あるいはＣ末端に他のタンパク質を融合してもよい（Clinical Cancer Research, 2004, 10, 1274-1281）。融合するタンパク質は当業者が適宜選択することができる。
　さらに、本発明のヒト化モノクローナル抗体は細胞障害阻害活性が増強された抗体でもよい。細胞障害活性が増強された抗体としては、例えば、フコースが欠損した抗体、糖鎖にバイセクティング（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ)Ｎ－アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)が付加した抗体、Ｆｃ領域のアミノ酸を置換することによりＦｃｙ受容体との結合活性を変化させた抗体などを挙げることができる。これら活性が増強された抗体は当業者に公知の方法で作製することができる。
本発明において「モノクローナル抗体の一部」とは、前述する本発明のモノクローナル抗体の一部であって、当該モノクローナル抗体と同様にＰｃｒＶに特異的に結合性を有する領域を意味する（以下、これを単に「抗体断片」ともいう）。
具体的には、前述するヒトＰｃｒＶに対して特異的結合性を有するＦａｂ (ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｂｉｎｄｉｎｇ)、Ｆ(ａｂ')２、Ｆａｂ'、一本鎖抗体 （ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　Ｆｖ; 以下、ｓｃＦｖと表記する)、ジスルフィド安定化抗体(ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ　ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ　Ｆｖ; 以下、ｄｓＦｖと表記する)、２量化体Ｖ領域断片 (以下、Ｄｉａｂｏｄｙと表記する)、ＣＤＲを含むペプチド等を挙げることができる（エキスパート・オピニオン・オン・テラピューティック・パテンツ、第６巻、第５号、第４４１～４５６頁、１９９６年）。
　Ｆａｂは、ＩｇＧのヒンジ領域で２本のＨ鎖を架橋している２つのジスルフィド結合 (Ｓ－Ｓ結合) の上部のペプチド部分を酵素パパインで分解して得られる、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体で構成される、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明で使用されるＦａｂは、上記本発明のモノクローナル抗体をパパイン処理して得ることができる。または、上記本発明のモノクローナル抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを細胞用発現ベクターに挿入し、該ベクターを細胞へ導入することにより発現させることによってもＦａｂを製造することができる。
　Ｆ(ａｂ')２は、ＩｇＧのヒンジ領域の２個のＳ－Ｓ結合の下部を酵素ペプシンで分解して得られる、２つのＦａｂ’領域がヒンジ部分で結合して構成される、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明で使用されるＦ(ａｂ')２は、上記本発明のモノクローナル抗体をペプシン処理して得ることができる。または、当該モノクローナル抗体のＦ(ａｂ')２をコードするＤＮＡを細胞用発現ベクターに挿入し、該ベクターを大腸菌、酵母、あるいは動物細胞へ導入することにより発現させることによってもＦ(ａｂ')２を製造することができる。
　Ｆａｂ'は、上記Ｆ(ａｂ')２のヒンジ間のＳ－Ｓ結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明で使用されるＦａｂ'は、上記本発明のモノクローナル抗体のＦ(ａｂ')２を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、当該モノクローナル抗体のＦａｂ'をコードするＤＮＡを細胞用発現ベクターに挿入し、該ベクターを大腸菌、酵母、あるいは動物細胞へ導入することにより発現させることによってもＦａｂ'を製造することができる。
　ｓｃＦｖは、一本のＶＨと一本のＶＬとを適当なペプチドリンカー (以下、Ｐと表記する) を用いて連結した、ＶＨ－Ｐ－ＶＬないしはＶＬ－Ｐ－ＶＨポリペプチドであり、抗原活性を有する抗体断片である。本発明で使用されるｓｃＦｖに含まれるＶＨおよびＶＬは、上記本発明のモノクローナル抗体のものであればよい。本発明で使用されるｓｃＦｖは、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマよりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖ発現ベクターを構築し、大腸菌、酵母、あるいは動物細胞へ導入することにより発現させ製造することができる。
　ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドをＳ－Ｓ結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法 (Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、 ７、 ６９７ (１９９４)) に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明で使用されるｄｓＦｖに含まれるＶＨあるいはＶＬは、本発明のモノクローナル抗体のものであればよい。本発明で使用されるｄｓＦｖは、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマよりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、適当な発現ベクターに挿入してｄｓＦｖ発現ベクターを構築し、該発現ベクターを大腸菌、酵母、あるいは動物細胞へ導入し、発現させることにより製造することができる。
　Ｄｉａｂｏｄｙは、抗原結合特異性が同じ、または異なるｓｃＦｖが２量体を形成した抗体断片であり、同じ抗原に対する２価の抗原結合活性、または異なる抗原に対する２種類の特異的な抗原結合活性を有する抗体断片である。例えば、本発明のモノクローナル抗体に特異的に反応する２価のＤｉａｂｏｄｙは、本発明のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、３～１０残基のペプチドリンカーを有するｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを細胞用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを大腸菌、酵母、あるいは動物細胞へ導入することによりＤｉａｂｏｄｙを発現させることにより、製造することができる。
　ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。本発明で使用されるＣＤＲを含むペプチドは、本発明のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得した後、ＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを動物細胞用発現ベクターに挿入し、該ベクターを大腸菌、酵母、あるいは動物細胞へ導入することにより発現させることにより、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法 (フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、ｔＢｏｃ法 (ｔ－ブチルオキシカルボニル法) 等の化学合成法によって製造することもできる。
本発明のモノクローナル抗体又はその一部は、本発明に好適に使用され得るかぎり、その修飾物であってよい。修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ） 等の各種分子と結合した抗体を使用することができる。抗体になされる修飾とは、化学的結合を導入することによる修飾であってもよいし、抗体のアミノ酸配列になされる修飾であってもよい。本発明のモノクローナル抗体又はその一部にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野においてすでに確立されている。
別の観点においては、本発明は、本発明のヒト化モノクローナル抗体（ｈ１Ｆ３）の重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを提供する。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２９および３０のいずれかに記載の塩基配列を有する。また、該ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ本発明の抗体と同等の活性を有する抗体をコードするポリヌクレオチドも本発明の範囲内である。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明の抗体をコードする限り、特に限定されず、複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）等のヌクレオチドからなる重合体である。天然以外の塩基を含んでいてよい。本発明のポリヌクレオチドは、抗体を遺伝子工学的な手法により製造するために使用することができる。また本発明の抗体と同等な機能を有する抗体をスクリーニングするために、プローブとして用いることもできる。即ち本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド、またはその一部をプローブとして用い、ハイブリダイゼーション、遺伝子増幅技術（例えばＰＣＲ）等の技術により、該ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ本発明の抗体と同等の活性を有する抗体をコードするＤＮＡを得ることができる。このようなＤＮＡも本発明のポリヌクレオチドに含まれる。
ハイブリダイゼーション技術（Sambrook,J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989）は当業者によく知られた技術である。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば42℃、0.1×SSC、0.1％SDSの条件であり、好ましくは50℃、0.1×SSC 、0.1％SDSの条件で
ある。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば65℃、5×SSCおよび0.1％SDSの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するポリヌクレオチドが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
これらハイブリダイゼーション技術や遺伝子増幅技術により得られるポリヌクレオチドがコードする、本発明の抗体と機能的に同等な抗体は、通常、これら抗体とアミノ酸配列において高い相同性を有する。本発明の抗体には、本発明の抗体と機能的に同等であり、かつ該抗体のアミノ酸配列と高い相同性を有する抗体も含まれる。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも５０％以上の同一性、好ましくは７５％以上の同一性、さらに好ましくは８５％以上の同一性、さらに好ましくは95％以上の同一性を指す。ポリペプチドの相同性を決定するには、文献（Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730）に記載のアルゴリズムにしたがえばよい。
本発明のモノクローナル抗体又はその一部は、医薬組成物として有用である。したがって本発明のモノクローナル抗体およびその一部を含む医薬組成物は、経口的あるいは非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。非経口的投与としては、例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、鼻腔内投与、吸入などを選択することができるが、緑膿菌は気道感染によって特に肺上皮細胞や肺胞のマクロファージに傷害を及ぼすことが知られており（Ｔ・Ｓａｗａら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９９年、第５巻、３９２ページ）鼻腔内投与、吸入が望ましい。
本発明の医薬組成物は、緑膿菌による嚢胞性線維症や感染症患者の治療のために投与される。例えば、有効投与量は、一回につき体重１kgあたり０．０１mgから１００mgの範囲から選ばれる。あるいは、患者あたり１～１０００mg、好ましくは５～５０mgの投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明のモノクローナル抗体又はその一部を含む医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。また、投与期間は、患者の年齢、症状により適宜選択することができる。本発明の医薬組成物は、投与経路次第で医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。
このような担体および添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、カゼイン、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げられる。使用される添加物は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。

　以下に、参考例により、ＰｃｒＶに対するマウスモノクローナル抗体の作製法について説明する。
（参考例１）
リコンビナントＭａｂ１６６の作製
比較実験をするために、Ｍａｂ１６６（特願２００５－５００２５０など）をリコンビナント抗体として作製した。
まずサブクラスがＩｇＧ２ａである抗体を産生するハイブリドーマからｍＲＮＡを抽出し、Ｈ鎖およびＬ鎖の定常領域をＲＴ－ＰＣＲ法でクローニングした。ＰＣＲで増幅されたそれぞれの断片はｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（インビトロジェン社製）にＮｈｅＩ、ＮｏｔＩサイトで挿入し、さらに可変領域部分のＤＮＡ断片を挿入できるようにマルチクローニングサイトを組み込んだ。
次にＭａｂ１６６可変領域部のＨ鎖およびＬ鎖の遺伝子配列をそれぞれ４分割した後、それらのセンスＤＮＡとアンチセンスＤＮＡを合成し、アニーリング反応した。アニーリング後の断片をＤＮＡリガーゼによって結合させ、Ｈ鎖についてはＭｆｅＩとＢｌｐ　Ｉ領域に、Ｌ鎖についてはＥｃｏＲＶとＢｓｉＷ　Ｉ領域にクローニングを行った。
塩基配列が確認されたＨ鎖およびＬ鎖のベクターをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロジェン社製）を用いて、ＨＥＫ２３９Ｔ細胞へ導入し、４８時間後、その細胞上清を回収した。回収された細胞上清からＰｒｏｔｅｉｎ－Ｇ（ＰＩＥＲＣＥ社製）カラムでリコンビナントＭａｂ１６６を精製した。
（参考例２）
抗原の調製
　東海大より分与された緑膿菌株標準株ＰＡＯ１の染色体ＤＮＡを抽出し、そのＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により、ＰｃｒＶタンパク質をコードする遺伝子（配列番号：２）を増幅した。５’側プライマーに制限酵素Ｓｐｈ　Ｉ認識部位を、３’側プライマーに制限酵素Ｈｉｎｄ　III認識部位を設け（配列番号：３、４）、さらに発現ベクター挿入時に、ビオチン標識のためにヒスチジンタグと開始コドンの間にシステインが挿入されるように設計した。増幅されたＰＣＲ断片はＳｐｈ　ＩおよびＨｉｎｄ　III部位でｐＱＥ３０ベクター（ＧＥヘルスケア社製）へクローニングを行なった。塩基配列を確認後、大腸菌ＪＭ１０９へ本ベクターを導入し、組み換え大腸菌（ＰｃｒＶ－ＪＭ１０９）を得た。ＰｃｒＶ－ＪＭ１０９を５００ｍｌのＬＢ／Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ液体培地中に３７℃で培養し、ＯＤ６００が０．５になった時に０．１ＭのＩＰＴＧを２００μｌ加え、ＰｃｒＶの発現を誘導した。さらに、３７℃で１．５時間培養後、菌体を遠心分離し、０．５％のリゾチーム（シグマ社製）を含む緩衝液Ａ（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２）を１５ ｍｌ加え、０℃で３０分間放置後、超音波処理を行った。遠心後、可溶性画分を得、Ｈｉｓ－Ｂｉｎｄ　Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に通した後、２００ｍＭ　イミダゾールを含む緩衝液Ｂ(２０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ　ＮａＣｌ)で溶出した。最終的な溶出画分は１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に対して透析することにより緩衝液置換を行った。
抗原のビオチン標識
上記のように、発現・精製させたＰｃｒＶタンパク質を終濃度１０ｍＭ　メルカプトエチルアミン溶液中で３７℃、１５０分反応させてシステイン残基を還元した。還元されたＳＨ基にモル比で２０倍量のＰＥＯ－Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｂｉｏｔｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を添加し、４℃で終夜反応後、過剰なビオチンを除去するため、透析をおこなった。
抗原の免疫
　抗原として精製したＰｃｒＶ　２０μｇをフロイント完全アジュバントと共に４週齢Ｂａｌｂ／ｃ雌マウス７匹に腹腔内投与し、初回免疫とした。その後、１４日後、３５日後にＰｃｒＶ　２０μｇをフロイント不完全アジュバントと共に投与し、追加免疫とした。さらに７７日後にＰｃｒＶ　２０μｇの腹腔投与とＰｃｒＶ　１０μｇを尾静脈投与することで、最終免疫とした。
ハイブリドーマの作製
最終免疫の３日後に脾臓を摘出し、脾臓細胞を回収した。脾臓細胞とマウスミエローマ細胞（ｐ３×６３－Ａｇ８．Ｕ１、東京腫瘤研究所）を５０％のポリエチレングリコール４０００を用いて融合させ、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含む培地で選択した。
ＰｃｒＶ抗体の選定
　細胞融合８日後に特異抗体産生細胞のスクリーニングを行った。スクリーニングに用いたイムノアッセイは以下の通りである。９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）の各ウェルに２μｇの抗マウスＩｇＧ抗体（シバヤギ社製）を含むトリス緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を２００μｌ加えて４℃で１６時間固定した。これらのウェルを３００μｌの洗浄液（０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水）で２回洗浄した後、ブロックエース（大日本製薬社製）を３００μｌ加えて室温で２時間放置して、ブロッキングを行った（抗マウスＩｇＧ抗体固相化プレート）。各ウェルを３００μｌの洗浄液で２回洗浄した後、５０μｌのハイブリドーマ培養上清を１５０μｌの緩衝液Ｃ（０．９％　塩化ナトリウム、０．０５％　アジ化ナトリウム、０．５％　ウシ血清アルブミン、０．０１%　Ｔｗｅｅｎ８０、２５μＭ　Ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ‘’、Ｎ’ ’－ｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄを含む５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．６）で希釈して各ウェルに添加し、４℃で終夜反応させた。３００μｌの洗浄液で３回洗浄後、１０ｎｇのＥｕ－Ｌａｂｅｌｌｅｄ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＰＥＲＫＩＮ　ＥＬＭＥＲ社製）と２５ｎｇ　ビオチン標識化ＰｃｒＶを含む２００μｌの緩衝液Ｃを加え、室温１時間反応させた。反応後、３００μｌの洗浄液で３回洗浄を行い、増強試薬（１．３９ｇ／ｌ　フタル酸カリウム、１９．３ｍｇ／ｌ　Ｔｒｉ－ｎ－ｏｃｔｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ　ｏｘｉｄｅ、４．５９ｍｇ／ｌ　２－ｎａｐｈｔｈｏｙｌｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｏｎｅ、１．０ｇ／ｌ　Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、６．０ｇ／ｌ　酢酸）を２００μｌ添加し、その時間分解蛍光を測定した。
スクリーニングの結果から、リコンビナントＰｃｒＶと強い親和性を示したハイブリドーマを２０クローン選択し、実施例４に従い緑膿菌による細胞傷害の阻害活性を確認した。その結果、１０クローンで細胞傷害阻害活性が認められ、これらのクローンについて限外希釈法により２回クローニングをおこなうことで、ＰｃｒＶを認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローンを獲得した。獲得した１０クローンについて、細胞傷害阻害活性の高いクローンを４つ選択し、それぞれ、１Ｆ３、２Ａ４、６Ｆ５、７Ａ７と命名した。これらの抗体について、マウスモノクローナル抗体アイソタイピングＥＬＩＳＡキット（ＢＤバイオサイエンス社製）を用いて、抗体のサブクラスを決定した結果、１Ｆ３はＩｇＧ２ａ、２Ａ４はＩｇＧ２ｂ、６Ｆ５はＩｇＧ２ａ、７Ａ７はＩｇＧ２ａであった。
　モノクローナル抗体１Ｆ３および２Ａ４を産生するハイブリドーマは、独立行政法人　産業技術総合研究所内　特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１－１－１　中央第６）に、平成２１年１月１５日付けで、それぞれ受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ-１１８０５およびＦＥＲＭ ＡＢＰ-１１８０６として国際寄託されている。
（参考例３）
抗体の結合活性
抗体（１Ｆ３、２Ａ４、６Ｆ５、７Ａ７）の結合活性を測定するために、競合イムノアッセイを行った。９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）の各ウェルに１．５μｇの抗マウスＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｃｈ社製）を含むトリス緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を１００μｌ加えて４℃で１６時間固定した。これらのウェルを３００μｌの洗浄液で２回洗浄した後、１０％スクロースを含むブロックエース（大日本製薬社製）溶液を３００μｌ加えて室温で２時間放置して、ブロッキングを行った（抗マウスＩｇＧ抗体固相化プレート）。各ウェルを３００μｌの洗浄液で２回洗浄した後、２ｎｇ／ウェルの各抗体および未標識のＰｃｒＶを５００ｎｇ／ウェルから１０倍の希釈系列で５段階添加した。その後、５ｎｇ／ウェルのビオチン化ＰｃｒＶを添加し終夜反応させた。３００μｌの洗浄液で４回洗浄し、１００／ウェルのＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｗａｌｌａｃ社製）を添加後、１分間の攪拌後、時間分解蛍光を測定した。その結果、Ｍａｂ１６６と比較して、１Ｆ３、２Ａ４、６Ｆ５、７Ａ７はＰｃｒＶとの強い結合活性を示した（図１）。
次に表面プラズモン共鳴解析により、１Ｆ３、２Ａ４、６Ｆ５、７Ａ７、Ｍａｂ１６６のＰｃｒＶに対する親和性を算出した。ＣＭ５センサーチップ上にＭｏｕｓｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｃａｐｔｕｒｅ　Ｋｉｔ（ＢＩＡＣＯＲＥ社製）を用いて、抗マウス抗体を固相化し、続いて各ＰｃｒＶ抗体をキャプチャーした。当該固相センサーチップをセットしたＢＩＣＯＲＥ　Ｔ１００にリコンビナントＰｃｒＶをロードし、親和性を求めた。
その結果、Ｍａｂ１６６の親和性は、３．０×１０－９であるのに対して、１Ｆ３は３．７×１０－１０、２Ａ４は３．５×１０－１０、６Ｆ５は１．１×１０－１０、７Ａ７は１．１×１０－９　であり、いずれのクローンもＭａｂ１６６よりも親和性が高かった（図２）
（参考例４）
　Ｍａｂ１６６とのサンドイッチの可否
　１Ｆ３、２Ａ４、６Ｆ５、７Ａ７はＭａｂ１６６とエピトープが異なることを証明するため、当該抗体とＭａｂ１６６（以下、ｍ１６６とも記載する）とのサンドイッチ・アッセイの可否を検討した。
　最初に、Ｍａｂ１６６のビオチン標識を行った。１００μｇのＭａｂ１６６と７．８５３μｇのＮＨＳ－ＰＥＯ４　Ｂｉｏｔｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を０．１Ｍ　ＰＢＳ(ｐＨ７．４)中で混合し、氷中で２時間反応させた。その後、反応溶液から未反応のビオチンを除去するため、ゲルクロマトグラフィー（Ｇ２０００ＳＷカラム（ＴＯＳＨＯ社製））を行った。
　次にサンドイッチ・アッセイを行った。９６ウェルマイクロタイタープレート（ヌンク社製）に各５００μｇのＰｃｒＶ抗体（１Ｆ３、２Ａ４、６Ｆ５，７Ａ７）を含むＰＢＳ（－）溶液１００μｌを加えて、４℃で１６時間固定した。これらのウェルを３００μｌの洗浄液（０．０１％　Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水）で１回洗浄した後、ブロックエース（大日本製薬社製）を３００μｌ加えて室温で２時間放置して、ブロッキングを行った。各ウェルを３００μｌの洗浄液で２回洗浄した後、５０μｇのＰｃｒＶと５０ｎｇのビオチン標識Ｍａｂ１６６を含む１００μｌのＡｓｓａｙ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｗａｌｌａｃ社製）を添加し、４℃で終夜反応させた。洗浄液で３回洗浄後、５０ｎｇのＥｕ－Ｌａｂｅｌｌｅｄ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｗａｌｌａｃ社製）を含むＡｓｓａｙ　Ｂｕｆｆｅｒを１００μｌ添加し、室温で１時間反応させた。洗浄液で４回洗浄し、１００μｌのＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加後、１分間の撹拌を経て、その時間分解蛍光を測定した。
その結果、１Ｆ３、２Ａ４、６Ｆ５、７Ａ７はＭａｂ１６６とサンドイッチ・アッセイが可能であり、本抗体群はＭａｂ１６６とエピトープが異なることが明らかとなった（図３）。
（参考例５）
細胞傷害阻害活性試験
１Ｆ３、２Ａ４、６Ｆ５、７Ａ７について、細胞傷害阻害活性試験を行った。その方法は以下の通りである。
まず１Ｆ３、２Ａ４、６Ｆ５、７Ａ７を、３２μｇ／ｍｌから２倍希釈系列で希釈し、９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに１０μｌずつ分注した。次にミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１(ＡＴＣＣから入手)を５×１０６Ｃｅｌｌｓ／ｍｌもしくは白血球細胞の一種であるＵ９３７（ＡＴＣＣから入手）細胞を１×１０６Ｃｅｌｌｓ／ｍｌに細胞培養用培地（炭酸水素ナトリウムを含み、Ｌ－グルタミン及びフェノール・レッド不含ＲＰＭＩ１６４０(Ｓｉｇｍａ社製)）を用いて調製し、当該９６ウェルマイクロプレートに各１００μｌ添加した。さらにＣａｔｉｏｎ－ａｄｊｕｓｔｅｄ　Ｍｕｅｌｌｅｒ　Ｈｉｎｔｏｎ　Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）で一晩培養したシュードモナス・アエルギノーザＳＲ２４株を細胞培養用培地を用いて１×１０８ｃｆｕ／ｍｌに調製した菌液を１０μｌ／ウェルで添加し、３７℃、５％Ｃ０２存在下で３時間培養した。３時間経過後、ＷＳＴ－８（キシダ化学社製）を各１０μｌ添加し、ミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１を用いた場合は、３７℃、５％Ｃ０２存在下で３時間、Ｕ９３７細胞の場合は１時間培養した。培養終了後、４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。
その結果、白血球Ｕ９３７細胞を用いた場合、その細胞傷害阻害活性（ＩＣ５０）は、Ｍａｂ１６６が２１３ｎＭ以上であるのに対して、１Ｆ３は５．３ｎＭ、２Ａ４は２０．７ｎＭ、６Ｆ５は１２．７ｎＭ、７Ａ７は１４．７ｎＭであり、ミエローマ細胞Ｕ３Ｐ１を用いた場合は、Ｍａｂ１６６が５４ｎＭであるのに対して、１Ｆ３は４．０ｎＭ、２Ａ４は１６ｎＭ、６Ｆ５は７．３ｎＭ、７Ａ７は６．０ｎＭであった。すなわち、１Ｆ３、２Ａ４、６Ｆ５、７Ａ７は、いずれの細胞に対しても、その強い活性が知られていたＭａｂ１６６（Ｆｒａｎｋら、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ、２００２年、第１８６巻、６６ページ）と比較しても強い細胞傷害阻害活性を有していた（図４および図５）。
（参考例６）
欠失変異ＰｃｒＶの作製
　欠失変異ＰｃｒＶ（１３６－２３３）は以下の方法で作製した。
ＰｃｒＶ抗原タンパク発現プラスミドであるｐＱＥ３０―ＰｃｒＶを鋳型とし、５’側プライマーＧＣＴＣＧＡＧＧＡＴＣＣＣＡＡＧＧＣＧＣＴＧＡＣＣＧＣ（配列番号５）、３’側プライマーＧＴＴＡＡＧＣＴＴＣＴＣＧＡＡＧＧＧＧＴＡＣＴＣ（配列番号６）を用いてＰＣＲを行い、増幅したフラグメントをＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素処理し、ｐＥＴ３２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入した。塩基配列を確認後、本ベクターを大腸菌ＢＬ２１－ＤＥ３株に導入し組み換え大腸菌（欠失変異ＰｃｒＶ－ＢＬ２１）を得た。この発現株を２ｍｌのＬＢ／Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ液体培地で３７℃、一昼夜前培養した。５００ｍｌのＬＢ／Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ液体培地中に２ｍＬの前培養液を加えて３７℃で培養し、ＯＤ６００が０．５になった時に培養液を加えて氷上で３０分間静置した。終濃度０．７５ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加え、震盪培養機で１５℃、１６０ｒｐｍ、一昼夜培養してＰｃｒＶの発現を誘導した。培養液を４℃、ｘ５０００ｇ、３０ｍｉｎで遠心して集菌した。上清を除き、菌体に０．１％のリゾチーム（シグマ社製）を含むＢｕｆｆｅｒ　Ｘ（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２）を１０ ｍｌ加えて懸濁し、氷上で１時間静置した後、氷冷しながら超音波破砕処理した。遠心により可能性画分を得、Ｎｉ－ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を充填したカラムに通した後、Ｂｕｆｆｅｒ　Ｙ（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、２００ｍＭ　Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）で溶出した。最終的な溶出画分は１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に対して透析することにより緩衝液置換を行った。
エピトープ領域の決定
９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）の各ウェルに１．５μｇの抗マウスＩｇＧ　Ｆｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を含むトリス緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を１５０μｌ加えて４℃で１６時間固定した。これらのウェルを３００μｌの洗浄液（０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水）で２回洗浄した後、ブロッキング溶液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ７．５、２％ブロックエース（大日本製薬社製）、１０％スクロース）を３００μｌ加えて室温で２時間放置して、各ウェルをブロッキングした（抗マウスＩｇＧ抗体固相化プレート）。各ウェルを３００μｌの洗浄液で１回洗浄した後、緩衝液Ｃ（０．９％　塩化ナトリウム、０．０５％　アジ化ナトリウム、０．５％　ウシ血清アルブミン、０．０１%　Ｔｗｅｅｎ８０、２５μＭ　Ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’ ，Ｎ’ ’， Ｎ’ ’－ｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄを含む５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．６）で８０ｎｇ／ｍｌに希釈したＰｃｒＶ抗体溶液を５０μｌずつ各ウェルに添加し、Ｂｕｆｆｅｒ　Ｃで２００ｎｇ／ｍｌに希釈したＥｕ－Ｌａｂｅｌｌｅｄ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＰＥＲＫＩＮ　ＥＬＭＥＲ社製）溶液を各ウェルに５０μｌずつ、ＤＥＬＦＩＡ　Ａｓｓｓａｙ　Ｂｕｆｆｅｒで各濃度に希釈した欠損変異ＰｃｒＶタンパクを各ウェルに１００μｌずつ加え４℃で終夜反応させた。３００μｌの洗浄液で３回洗浄後、２００μｌの増強試薬（１．３９ｇ／ｌ　フタル酸カリウム、１９．３ｍｇ／ｌ　Ｔｒｉ－ｎ－ｏｃｔｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ　ｏｘｉｄｅ、4.59mg／ｌ　２－ｎａｐｈｔｈｏｙｌｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｏｎｅ、１．０ｇ／ｌ　Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、６．０ｇ／ｌ　酢酸）を２００μｌ添加し、その時間分解蛍光を測定した（図６）。
その結果、ＰｃｒＶ抗体１Ｆ３、２Ａ４、９Ｄ１２、１２Ｈ９、また参考例として用いたＫａｌｏＢｉｏｓ社のｍ１６６はＰｃｒＶ全長（１－２９４）に対して反応性を示した。他方でＰｃｒＶ（１３６－２３３）に対して、１Ｆ３、２Ａ４は反応性を示したが、ｍ１６６、及び中和活性を持たない９Ｄ１２、１２Ｈ９は反応性を示さなかった。
またウエスタンブロット法による結合解析も行なった。精製したリコンビナントＰｃｒＶタンパクをＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った後、ＰＶＤＦメンブレンに転写した。転写されたメンブレンはブロックエース（大日本製薬製）溶液で室温、２時間、振盪しながらブロッキングした。１μｇ／ｍｌに希釈したＰｃｒＶ抗体溶液をメンブレンに加え、４℃で終夜反応させた後、洗浄液Ｂ（１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した。２次抗体として標識した抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）溶液をメンブレンに加え、室温で２時間反応後、メンブレンを洗浄液Ｂで洗浄し、ＥＣＬ　ｐｌｕｓ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）で発色させ、ＬＡＳ－１０００（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）で撮影した（図７）。ＰｃｒＶ中和抗体１Ｆ３、２Ａ４は全長ＰｃｒＶおよび欠失変異ＰｃｒＶの双方に対して反応したが、ｍ１６６、及び中和活性の低い６Ｆ５、７Ａ７は全長ＰｃｒＶに対してのみ反応し、欠失変異ＰｃｒＶには反応しなかった。
このことからＰｃｒＶ中和抗体１Ｆ３、２Ａ４のエピトープ領域は、アミノ酸残基１３６－２３３の領域であり、ｍ１６６、６Ｆ５、７Ａ７はアミノ酸残基１３６－２３３だけをエピトープ領域とするものではなかった。
（参考例７）
ＰｃｒＶタンパク質の特定領域と細胞傷害活性の強さの相関性
全長ＰｃｒＶタンパク質（配列番号１）および欠損変異ＰｃｒＶタンパク質（配列番号１における１３６位－２３３位のアミノ酸配列を有する）を用いて，１Ｆ３、２Ａ４、ｍ１６６における細胞傷害阻害活性の抑制試験を行なった。その方法は以下の通りである。
　まず１Ｆ３、２Ａ４、ｍ１６６をそれぞれ２００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭから２倍希釈系列で希釈し、９６ウェルマイクロプレートに１０μｌずつ分注した。本試験における１Ｆ３、２Ａ４、ｍ１６６の試験濃度域はそれぞれ１．５６－６．２５ｎＭ、６．２５－２５ｎＭ、５０－２００ｎＭとした．各試験濃度域に対して全長ＰｃｒＶタンパク質および欠損変異ＰｃｒＶタンパク質を３０、１０、３、１、０．３倍モル濃度で９６ウェルプレートに１０μｌ添加し、３０分室温で放置した．次にミエローマ細胞Ｕ３Ｐ１を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに細胞培養用培地（炭酸水素ナトリウムを含み、Ｌ－グルタミン及びフェノール・レッド不含ＲＰＭＩ１６４０(Ｓｉｇｍａ社製)）を用いて調製し、当該９６ウェルマイクロプレートに各７０μｌ添加した。さらにＭｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）で一晩培養した緑膿菌ＳＲ２４株を細胞培養用培地を用いて１×１０８ｃｆｕ／ｍｌに調製した菌液を１０μｌ添加し、３７℃、５％Ｃ０２存在下で３時間培養した。３時間経過後、ＷＳＴ－８（キシダ化学社製）を各１０μｌ添加し、３７℃、５％Ｃ０２存在下で３時間培養した。培養終了後、４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。
その結果、ＰｃｒＶタンパク質非添加の場合、１Ｆ３、２Ａ４はｍ１６６と比較して強い細胞傷害阻害活性を示した．一方、全長ＰｃｒＶタンパク質を添加した場合は、いずれの抗体も添加した全長ＰｃｒＶタンパク質の濃度依存的に細胞傷害阻害活性が抑制された（図８）。それに対し、欠損変異ＰｃｒＶタンパク質を添加した場合では、そのアミノ酸領域（１３６－２３３）にエピトープを有する１Ｆ３、２Ａ４は添加した欠損変異タンパク質の濃度依存的に細胞傷害阻害活性が抑制されるが、エピトープを有さないｍ１６６は細胞傷害阻害活性に変化は観察されなかった（図９）。
以上のことから、アミノ酸残基１３６－２３３にエピトープを有する抗体（１Ｆ３および２Ａ４）は、その領域にエピトープを有さない抗体（ｍ１６６）より強い細胞傷害阻害活性を有すると考えられた。すなわち、ＰｃｒＶ抗体の認識する領域によって、細胞傷害阻害活性の強さが異なり、もっとも強い細胞傷害阻害活性を有するのは、アミノ酸残基１３６－２３３領域だけでＰｃｒＶタンパク質に反応性を有する抗体といえた。
（参考例８）
ヒトＰｃｒＶに対するマウスモノクローナル抗体（１Ｆ３および２Ａ４）のアミノ酸配列の解析
樹立されたハイブリドーマ細胞から、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、ＲＮＡの抽出を行った。抽出したＲＮＡを１μｇから、５’ＲＡＣＥ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｒａｐｉｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　Ｅｎｄｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　２．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ＤＮＡ断片の増幅を行った。その際、ｃＤＮＡ合成のために使用したプライマーは、１Ｆ３がＴＡＧＡＧＴＣＡＣＣＧＡＧＧＡＧＣＣＡＧＴＴＧＴ(配列番号：７)であり、２Ａ４はＴＣＣＡＧＡＧＴＴＣＣＡＡＧＴＣＡＣＡＧＴＣＡＣ(配列番号：８)であった。また５’ＲＡＣＥ法に用いたプライマーは、１Ｆ３がＡＧＧＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＣＧＡＴＧＧＧＧＣＴＧＴ(配列番号：９)であり、２Ａ４がＡＧＧＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＴＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴ(配列番号：１０)であった。増幅された断片は、ＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）でクローニングされ、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３１３０　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で塩基配列を解析した。１Ｆ３の解析結果を、図１０に、２Ａ４については図１１に示した。可変領域のアミノ酸配列をＫａｂａｔらにより作成された抗体のアミノ酸配列のデータベース（［Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３）にあてはめて、相同性を調べた結果、１Ｆ３の重鎖可変領域における相補性決定領域は、ＳＦＴＳＹＷＭＨ（配列番号１５）ＩＮＰＳＮＧＲＴＮＹＮＥＫＦＮＴ（配列番号１６）ＹＧＮＹＶＶＹＹＴＭＤＹ（配列番号１７）であり、軽鎖可変領域における相補性決定領域は、ＳＡＳＴＳＶＳＹＭＥ（配列番号１８）ＴＴＳＫＬＡＳ（配列番号１９）ＨＱＷＲＮＹＰＦＴ（配列番号２０）であった。同様にして調べた結果、２Ａ４の重鎖可変領域における相補性決定領域は、ＳＩＴＳＤＹＡＷＮ（配列番号２１）ＹＩＴＹＮＧＤＴＳＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号２２）ＳＲＮＹＹＧＡＷＦＡＹ（配列番号２３）であり、軽鎖可変領域における相補性決定領域は、ＫＡＳＱＹＶＧＴＴＶＡ（配列番号２４）ＲＡＳＴＲＨＴ（配列番号２５）ＱＱＹＣＳＳＰＬＴ（配列番号２６）であった。
　
以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に制限されるものではない。なお、抗体作製手法として、特に断らない限り、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｉｎ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉａｔｉｏｎｓ）に記載されている方法を用いた。また、遺伝子操作的手法として、特に断らない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に記載されている方法を用いた。
（１）マウスモノクローナル抗体１Ｆ３のヒト化
　上記のように作製したマウスモノクローナル抗体１Ｆ３のヒト化については、マウス抗体のＣＤＲをヒト生殖系アクセプター配列に移植することで作製した。
　具体的には、マウス抗体重鎖、軽鎖それぞれのＶ遺伝子領域アミノ酸配列に最もホモロジーの高いヒト生殖系アクセプター配列をＩｇＢＬＡＳＴ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）で検索し、Ｊ遺伝子領域についてはマウス抗体ＤＮＡ配列とホモロジーの高い配列をＩＭＧＴ（ http://imgt.cines.fr/）から選択した。
検索の結果、マウス抗体重鎖Ｖ遺伝子領域に最も相同性の高いヒト生殖系アクセプター配列由来抗体遺伝子配列として、ＩＭＧＴ　ｇｅｎｅ　ｎａｍｅ；ＩＧＨＶ１－４６＊０１が、Ｊ遺伝子領域に最も相同性の高いヒト生殖系アクセプター配列由来抗体遺伝子配列としてＩＭＧＴ　ｇｅｎｅ　ｎａｍｅ；ＩＧＨＪ６＊０１が得られたため、これを重鎖移植用ヒトフレームワーク配列とした。同様に、マウス抗体軽鎖Ｖ遺伝子領域に最も相同性の高いヒト生殖系アクセプター配列由来抗体遺伝子配列として、ＩＭＧＴ　ｇｅｎｅ　ｎａｍｅ；ＩＧＫＶ１－９＊０１が、Ｊ遺伝子領域に最も相同性の高いヒト生殖系アクセプター配列由来抗体遺伝子配列として、ＩＭＧＴ　ｇｅｎｅ　ｎａｍｅ；ＩＧＫＪ２＊０２が得られたため、これを軽鎖移植用ヒトフレームワーク配列とした。
次に、Ｋａｂａｔ　Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ（Ｗｕ、　Ｔ．Ｔ．　ａｎｄ　Ｋａｂａｔ，　Ｅ．Ａ．，　Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．　Ａｕｇ１；１３２（２）：２１１－５０．（１９７０））に従ったアミノ酸配列番号表記により、マウス抗体重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、および軽鎖ＣＤＲＬ１，ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３を特定し、これらのＣＤＲ領域をヒトフレームワーク配列に移植し、鋳型のヒト化抗体として設計した。設計された鋳型ヒト化抗体とマウス抗体のアミノ酸配列の違いは、Ｃｈｏｔｈｉａ　Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ（Ｃｈｏｔｈｉａ，　Ｃ．　ａｎｄ　Ｌｅｓｋ，　Ａ．Ｍ．，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　１９６：９０１－９１７．，　Ｃｈｏｔｈｉａ，　Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７－８８３．（１９８９））におけるアミノ酸配列番号、Ｈ５，Ｈ７，Ｈ１１，Ｈ１２，Ｈ２０，Ｈ３８，Ｈ４０，Ｈ４８，Ｈ６６，Ｈ６７，Ｈ６９，Ｈ７１，Ｈ７５，Ｈ７８，Ｈ８１，Ｈ８３，Ｈ８７，Ｈ９３，Ｈ９４，Ｈ１０８，Ｌ１，Ｌ３，Ｌ９，Ｌ１０，Ｌ１１，Ｌ１５，Ｌ１７，Ｌ１８，Ｌ１９，Ｌ２１，Ｌ４０，Ｌ４２，Ｌ４３，Ｌ４６，Ｌ７０，Ｌ７１，Ｌ７２，Ｌ７８，Ｌ７９，Ｌ８０，Ｌ８３，Ｌ８５，Ｌ１００において確認された。
マウス抗体における体細胞変異部位を同定するため、マウス抗体重鎖、軽鎖それぞれのＶ遺伝子領域アミノ酸配列をＩｇＢＬＡＳＴにて検索し、最も相同性の高い重鎖配列としてＧｅｎｅ　ｎａｍｅ；Ｊ５５８．３３が、最も相同性の高い軽鎖配列としてＧｅｎｅ　ｎａｍｅ；ＩＧＫＶ４―８０*０１が得られた。マウス抗体重鎖のＤ遺伝子領域アミノ酸配列をＩｇＢＬＡＳＴにて検索し、最も相同性の高い重鎖配列としてＧｅｎｅ　ｎａｍｅ；ＩＧＨＤ２－１＊０１が得られた。マウス抗体重鎖、軽鎖それぞれのＪ遺伝子領域ＤＮＡ配列をＩＭＧＴにて検索し、最も相同性の高い重鎖配列としてＩＭＧＴ　ｇｅｎｅ　ｎａｍｅ；ＩＧＨＪ４＊０１が、最も相同性の高い軽鎖配列としてＩＭＧＴ　ｇｅｎｅ　ｎａｍｅ；ＩＧＫＪ４＊０１が得られた。これらのマウス生殖系配列とマウス抗体を比較して異なる側鎖を体細胞変異部位とし、このうちマウス抗体と鋳型ヒト化抗体とで異なる側鎖として、Ｈ９３，Ｈ９４，Ｌ９，Ｌ４６が確認された。
マウス抗体と鋳型ヒト化抗体とで異なるＣａｎｏｎｉｃａｌ側鎖（http://www.bioinf.org.uk/abs/chothia.html）として、Ｈ７１、Ｈ９４が確認された。マウス抗体と鋳型ヒト化抗体とで異なる側鎖のうち、Ｖｅｒｎｉｅｒ　ｚｏｎｅ（Ｆｏｏｔｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，　２２４．４８７（１９９２））に位置するのはＨ４８，Ｈ６７，Ｈ６９，Ｈ７１，Ｈ７８，Ｈ９３，Ｈ９４，Ｌ４６，Ｌ７１であった。マウス抗体と鋳型ヒト化抗体とで異なるＩｎｔｅｒｃｈａｉｎ　ｐａｃｋｉｎｇ　ｒｅｓｉｄｕｅは確認されなかった。これらの結果を総合し、鋳型ヒト化抗体のＨ４８，Ｈ６７，Ｈ６９，Ｈ７１，Ｈ７８，Ｈ９３，Ｈ９４，Ｌ９，Ｌ４６，Ｌ７１のアミノ酸側鎖をマウス抗体型の変異（Ｂａｃｋｍｕｔａｔｉｏｎ）を全て導入した変異型ヒト化抗体を設計した。設計した鋳型ヒト化抗体可変領域（図１２；Ｔｅｍｐｌａｔｅ）、および変異型ヒト化抗体可変領域（図１２；Ｂａｃｋｍｕｔａｔｉｏｎ）の重鎖の定常領域配列としてヒトＩｇＧ４Ｐｒｏ定常領域配列を、軽鎖の定常領域配列としてヒトＩｇｋａｐｐａ定常領域配列を接合したＤＮＡ配列を設計し、下記に記載の方法により、それぞれ鋳型ヒト化抗体重鎖発現プラスミド（図１３；ＨＴ）、鋳型ヒト化抗体軽鎖発現プラスミド（図１３；ＬＴ）、変異型ヒト化抗体重鎖発現プラスミド（図１３；ＨＢ）、変異型ヒト化抗体軽鎖発現プラスミド（図１３；ＬＢ）を構築した。
（２）抗体遺伝子発現ベクターの作製
まずヒンジ部分のＳ－Ｓ結合が開裂するのを回避するため(Ａｎｇａｌ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０（１）：１０５－１０８およびＳｃｈｕｕｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，２００１，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３８：１－８.)２２８番目のセリン配列をプロリンに変換し、IｇＧ４の定常領域のＤＮＡを４分割した後、それらのセンスＤＮＡとアンチセンスＤＮＡを合成し、アニーリング反応した。アニーリング後の断片をＤＮＡリガーゼによって結合させ、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（インビトロジェン社製）にＮｈｅＩ、ＮｏｔＩサイトで挿入し、さらに可変領域部分のＤＮＡ断片を挿入できるようにマルチクローニングサイトを組み込んだ。
次にヒト化ＰｃｒＶ抗体の可変領域部の遺伝子配列を重鎖および軽鎖をそれぞれ４分割した後、それらのセンスＤＮＡとアンチセンスＤＮＡを合成し、アニーリング反応した。アニーリング後の断片をＤＮＡリガーゼによって結合させ、重鎖についてはＭｆｅＩとＢｌｐＩ領域に、軽鎖についてはＥｃｏＲＶとＢｓｉＷＩ領域にクローニングを行い、ＤＮＡ塩基配列を確認した。
抗体ヒト化時の指標としてヒト・マウスキメラ１Ｆ３抗体を作製した。マウス抗体の重鎖可変領域に重鎖の定常領域配列としてヒトＩｇＧ４Ｐｒｏ定常領域配列を設計し、下記に記載の方法により発現プラスミドを構築し、マウス・ヒトキメラ抗体重鎖発現プラスミド（図１３；Ｈ　ｃｈｉｍｅｒａ）とした。マウス抗体の軽鎖可変領域に軽鎖の定常領域配列としてヒトＩｇｋａｐｐａ定常領域配列を接合したＤＮＡ配列を設計し、上記記載の方法により、発現ベクターを構築し、マウス・ヒトキメラ抗体軽鎖発現プラスミド（図１３；Ｌ　ｃｈｉｍｅｒａ）とした。哺乳類培養細胞にマウス・ヒトキメラ抗体重鎖発現プラスミドとマウス・ヒトキメラ抗体軽鎖発現プラスミド、鋳型ヒト化抗体重鎖発現プラスミドと鋳型ヒト化抗体軽鎖発現プラスミド、鋳型ヒト化抗体重鎖発現プラスミドと変異型ヒト化抗体軽鎖発現プラスミド、変異型ヒト化抗体重鎖発現プラスミドと鋳型ヒト化抗体軽鎖発現プラスミド、変異型ヒト化抗体重鎖発現プラスミドと変異型ヒト化抗体軽鎖発現プラスミドの組み合わせでトランスフェクションし、その培養上清を用いて、抗原であるリコンビナントＰｃｒＶとの親和性を表面プラズモン共鳴解析（ＢＩＡｃｏｒｅＴ－１００，ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により測定した（図１３）。
マウス・ヒトキメラ抗体の親和性解析のＫＤ値は２．６　ｘ　１０－１０　Ｍであった。また、鋳型ヒト化抗体重鎖と鋳型ヒト化抗体軽鎖の抗体のＫＤ値は２．２　ｘ　１０－７　Ｍ、鋳型ヒト化抗体重鎖と変異型ヒト化抗体軽鎖の抗体のＫＤ値は６．５　ｘ　１０－７　Ｍであり、大幅に親和性が低下していることが確認された。一方で、変異型ヒト化抗体重鎖と鋳型ヒト化抗体軽鎖の抗体のＫＤ値は３．３　ｘ　１０－１０　Ｍ、変異型ヒト化抗体重鎖と変異型ヒト化抗体軽鎖の抗体のＫＤ値は３．４　ｘ　１０－１０　Ｍであり、マウス・ヒトキメラ抗体に近い親和性を維持していることが示された。この結果から親和性の維持には変異型ヒト化抗体重鎖が重要であり、軽鎖は鋳型ヒト化抗体軽鎖と変異型ヒト化抗体軽鎖のどちらを用いても変わらないと判断した。そのため、軽鎖に関してはヒト生殖系由来の配列に近い鋳型ヒト化抗体軽鎖を選択した。重鎖に関してはＢａｃｋｍｕｔａｔｉｏｎを導入したアミノ酸側鎖であるＨ４８，Ｈ６７，Ｈ６９，Ｈ７１，Ｈ７８，Ｈ９３，Ｈ９４のそれぞれの変異をヒト生殖系由来配列に戻したヒト化抗体を作製し、抗原との親和性を表面プラズモン共鳴解析により評価した（図１４）。その結果、Ｈ９３のＶａｌをＡｌａに変換したヒト化抗体のＫＤ値は１．０　ｘ　１０－９　Ｍ、Ｈ９４のＬｅｕをＡｒｇに変換したヒト化抗体のＫＤ値は３．２　ｘ　１０－７　Ｍであり、親和性が低下していたが、他の変異をヒト生殖系由来配列に戻したヒト化抗体においては大きな親和性の低下は認められなかった。
これらの結果から、Ｈ９３、Ｈ９４はマウス抗体由来の配列を用い、Ｈ４８，Ｈ６７，Ｈ６９，Ｈ７１，Ｈ７８に関してはヒト生殖系アミノ酸配列を用いてヒト化抗体配列を確定させた（図１５、図１６）。この配列を有する抗体を、下記（３）の方法に従って作製し、表面プラズモン共鳴解析により親和性を確認した結果、マウス抗体と同等の親和性であることが確認された（図１７）。
（３）リコンビナント抗体の作製
上記の方法で作製された重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロジェン社製）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞へ導入し、７２時間後、その細胞上清を回収した。回収された細胞上清からＰｒｏｔｅｉｎ－Ｇ（ＰＩＥＲＣＥ社製）カラムでリコンビナント抗体を精製した。
ｍ１Ｆ３（マウス抗体）、ｈ１Ｆ３（ヒト化抗体）およびｍ１６６の細胞傷害阻害活性試験を行った。その方法は以下の通りである。
　まずｍ１Ｆ３、ｈ１Ｆ３、ｍ１６６をそれぞれ２００ｎＭ、２００ｎＭ、８００ｎＭから２倍希釈系列で希釈し、９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに１０μｌずつ分注した。次に細胞培養用培地（炭酸水素ナトリウムを含み、Ｌ－グルタミン及びフェノール・レッド不含ＲＰＭＩ１６４０(Ｓｉｇｍａ社製)）を用いてミエローマ細胞Ｕ３Ｐ１を５×１０６Ｃｅｌｌｓ／ｍｌもしくはＵ９３７細胞を１×１０６Ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製し、当該９６ウェルマイクロプレートに各７０μｌ添加した。さらにＣａｔｉｏｎ－ａｄｊｕｓｔｅｄ　Ｍｕｅｌｌｅｒ　Ｈｉｎｔｏｎ　Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）で一晩培養した緑膿菌ＳＲ２４株を細胞培養用培地において１×１０８ｃｆｕ／ｍｌに調製し、１０μｌ／ウェルで添加し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で３時間培養した。３時間経過後、ＷＳＴ－８（キシダ化学社製）を各１０μｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で１時間培養した。培養終了後、４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。その結果、Ｕ９３７細胞を用いた場合（図１８）、その細胞傷害活性（ＩＣ５０）は、ｍ１６６が９８．４ｎＭであるのに対して、ｍ１Ｆ３は１．４ｎＭ、ｈ１Ｆ３は１．５ｎＭであり、ミエローマ細胞を用いた場合（図１９）は、ｍ１６６が８５．４ｎＭであるのに対して、１Ｆ３は１．５ｎＭ、ｈ１Ｆ３は１．３ｎＭであった。すなわち、ｍ１Ｆ３とｈ１Ｆ３の細胞傷害阻害活性は同程度であり、ｍ１６６よりも強い活性を示した。
本発明のヒト化モノクローナル抗体又はその一部は、ＰｃｒＶに対して高い親和性を有しているだけでなく、緑膿菌（シュードモナス・エルギノーザ）の真核細胞に対する細胞傷害活性に強い阻害活性を示した。従って、該モノクローナル抗体又はその一部を含む医薬組成物は、現在医療現場において治療が難しいとされる緑膿菌が関与する感染症の治療薬として有用である。

Claims (8)

  1. 以下の（１）～（４）から選ばれる少なくとも１つの性質を有するＰｃｒＶに対するヒト化モノクローナル抗体またはその一部：
    　（１）インビトロにおいて１ｎＭから２００ｎＭの濃度で、緑膿菌の白血球細胞に対する細胞傷害活性の５０％以上を阻害する、
    　（２）インビトロにおいて１ｎＭから５０ｎＭの濃度で、緑膿菌のミエローマ細胞に対する細胞傷害活性の５０％以上を阻害する
    　（３）ＰｃｒＶとの解離定数（Ｋｄ）が、２×１０－９（Ｍ）以下である、及び
    　（４）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１３６位から２３３位に、エピトープを有する。　　
  2. 受託番号ＦＥＲＭ　ＡＢＰ-１１８０５として寄託されたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体の全ての相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を有するヒト化モノクローナル抗体またはその一部。
  3. １）相補性決定領域に下記アミノ酸配列を含む重鎖可変領域；　　　　　　　ＳＦＴＳＹＷＭＨ（配列番号１５）、ＩＮＰＳＮＧＲＴＮＹＮＥＫＦＮＴ（配列番号１６）、ＹＧＮＹＶＶＹＹＴＭＤＹ（配列番号１７）、および　
    ２）相補性決定領域に下記アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；ＳＡＳＴＳＶＳＹＭＥ（配列番号１８）、ＴＴＳＫＬＡＳ（配列番号１９）、　 ＨＱＷＲＮＹＰＦＴ（配列番号２０）を有するＰｃｒＶに対するヒト化モノクローナル抗体またはその一部。
  4. １）相補性決定領域に下記アミノ酸配列を含む重鎖可変領域；　　　　　　　ＳＦＴＳＹＷＭＨ（配列番号１５）、ＩＮＰＳＮＧＲＴＮＹＮＥＫＦＮＴ（配列番号１６）、ＹＧＮＹＶＶＹＹＴＭＤＹ（配列番号１７）あるいは、これらの３つのＣＤＲのうちの１つ以上のＣＤＲにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲ、および　
    ２）相補性決定領域に下記アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；ＳＡＳＴＳＶＳＹＭＥ（配列番号１８）、ＴＴＳＫＬＡＳ（配列番号１９）、　 ＨＱＷＲＮＹＰＦＴ（配列番号２０）あるいは、これらの３つのＣＤＲのうちの１つ以上のＣＤＲにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲを有し、かつ以下の（１）～（４）から選ばれる少なくとも１つの性質を有するＰｃｒＶに対するヒト化モノクローナル抗体またはその一部：
    　（１）インビトロにおいて１ｎＭから２００ｎＭの濃度で、緑膿菌の白血球細胞に対する細胞傷害活性の５０％以上を阻害する、　　
    　（２）インビトロにおいて１ｎＭから５０ｎＭの濃度で、緑膿菌のミエローマ細胞に対する細胞傷害活性の５０％以上を阻害する、及び
    　（３）ＰｃｒＶとの解離定数（Ｋｄ）が、２×１０－９（Ｍ）以下
    （４）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１３６位から２３３位に、エピトープを有する。
  5. １）配列番号２７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；および
    ２）配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；を有するＰｃｒＶに対するヒト化モノクローナル抗体またはその一部。
  6. 請求項１～５のいずれかに記載の抗体又はその一部を有効成分として含む医薬組成物。
  7. 請求項３～５に記載の抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド。
  8. 請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
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