JP2022536469A - ＰｃｒＶに結合する抗ＰｃｒＶ抗体、抗ＰｃｒＶ抗体を含む組成物、およびその使用方法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、緑膿菌ＰｃｒＶに結合する抗体および抗体抗原結合断片、ならびにそれらの使用方法を提供する。特定の実施形態によると、本開示は、ＰｃｒＶに結合する抗体および抗体の抗原結合断片を含む。抗ＰｃｒＶ抗体および抗原結合断片は、緑膿菌感染の予防および治療に有用である。一部の態様では、本開示は、ＰｃｒＶに特異的に結合する単離された組み換えモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。当該抗体は多くの場合、Ｔ３ＳＳの機能的アンタゴニスト、すなわちＰｃｒＶに結合し、Ｔ３ＳＳを阻害する抗体である。

Description

本発明は、部分的にはＰｃｒＶに特異的に結合する抗体、二特異性抗体およびそれらの抗原結合断片を提供するものであり、ならびに緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）感染の治療に関する組成物および方法を提供するものである。
配列表
配列表の正式な写しは、ファイル名が「１０４９４ＷＯ０１＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、作成日が２０２０年６月１０日であり、サイズが約７６ＫＢのＡＳＣＩＩフォーマットの配列表として、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に本明細書と同時に提出される。このＡＳＣＩＩフォーマット書面に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は、様々な環境中に存在するグラム陰性桿菌である。必要とするのはシンプルな栄養素のみであるため、蒸留水中でも緑膿菌は増殖することができ、酢酸培地や硫酸アンモニウム培地でも良好に増殖することができる。４２℃もの高温でも増殖することができ、高濃度の塩、弱殺菌剤および多くの抗生物質に耐性である。
日和見病原体である細菌は、多くの場合は薬剤抵抗性であり、市中感染および院内感染を引き起こす、健康上の大きな懸念である。そのような細菌感染は重篤で生命を脅かすことがあり、肺炎は最も懸念される症状の一つである。健康な人や動物で細菌が疾患を引き起こすことは稀だが、重篤な病気の固体や、免疫不全の固体には大きな問題となる。例えば、緑膿菌感染は、嚢胞性線維症（ＣＦ）を有する固体において大きな問題であり、細菌による再発性および慢性の気道感染から、進行性の肺損傷が生じる。リスクのある他の患者としては、人工呼吸器を使用している患者、結核患者、好中球減少性の癌患者、および熱傷患者が挙げられる。
細菌３型分泌系（Ｔ３ＳＳ：ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｔｙｐｅ ３ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）は、グラム陰性細菌の重要な毒性因子である。Ｔ３ＳＳは、細菌細胞壁全体で交差する複雑な多重タンパク質構造である。たった二つのタンパク質：シングルバレルホモポリマー形成タンパク質（ｓｉｎｇｌｅ ｂａｒｒｅｌ ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｆｏｒｍｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）と針先タンパク質（ｎｅｅｄｌｅ ｔｉｐ ｐｒｏｔｅｉｎ）のみが、抗体にアクセス可能である。緑膿菌のＶ－ｔｉｐタンパク質（ＰｃｒＶ）は、多くのグラム陰性細菌のＴ３ＳＳに共通するＶ－ｔｉｐタンパク質の一例である。ＰｃｒＶは、Ｔ３ＳＳタンパク質の末端に位置し、針先に五量体の環型構造を形成する。
Ｔ３ＳＳの中空針様の分子構造は、毒素（ＥｘｏＳ、ＥｘｏＴ、ＥｘｏＵ、およびＥｘｏＹ）を真核細胞に転移させることによって作用し、細胞死や細胞溶解を生じさせる。しかしながら、膜透過性の孔介在性の増加を介して直接的に、または広範な細胞防御応答の活性化を介して間接的にのいずれかにより、転位孔それ自体で感染細胞の死をもたらすのに充分である。白血球と上皮細胞を殺傷し、炎症を誘発することによって、Ｔ３ＳＳの毒性機序は、緑膿菌がヒト免疫防御を回避することを可能にする。
緑膿菌感染を治療または予防する抗生物質の改善に対し、医療上の重大なアンメットニーズがいまだ存在する。
本明細書において、緑膿菌のＶ－ｔｉｐタンパク質（ＰｃｒＶ）に結合する抗体およびその抗原結合断片が提供される。当該抗体は、緑膿菌において、細菌３型分泌系（Ｔ３ＳＳ）の活性の阻害または中和に有用である。一部の実施形態では、当該抗体は、細菌から宿主細胞への毒素の転移の遮断、および／または宿主細胞の死の予防に有用である。一部の実施形態では、当該抗体は、宿主細胞において孔介在性の膜透過を遮断することにより機能する。
特定の実施形態では、当該抗体は、対象において、緑膿菌感染の少なくとも一つの症状の予防、治療または改善に有用である。特定の実施形態では、当該抗体は、緑膿菌感染を有する患者、または緑膿菌感染に罹るリスクがある患者に、予防的または治療的に投与されてもよい。特定の実施形態では、本開示の少なくとも一つの抗体を含有する組成物は、緑膿菌感染を有する患者に投与されてもよい。特定の実施形態では、本開示の少なくとも一つの抗体を含有する組成物は、例えば嚢胞性線維症の患者、糖尿病の患者、人工呼吸器を装着した患者、外科手術を受けている患者、結核の患者、ＨＩＶの患者、免疫不全の患者、好中球減少症の患者、留置カテーテルのある患者、身体外傷後の患者、火傷のある患者、集中治療室の患者、寝たきりの患者、悪性腫瘍の患者、慢性閉塞性肺疾患の患者、長期間医療施設にいる患者、または静脈内薬剤のユーザーの患者など、緑膿菌感染に罹るリスクのある患者に投与されてもよい。
本明細書において提供される抗体は、完全長（例えば、ＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ４抗体）であってもよく、または抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはｓｃＦｖ断片）のみを含んでもよく、および例えば、宿主における残存性を高めるため、または残存するエフェクター機能を排除するためなど、機能性に影響を与えるように改変されてもよい（Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１９２５－１９３３）。特定の実施形態では、抗体は二特異性であってもよい。
一部の態様では、本開示は、ＰｃｒＶに特異的に結合する単離された組み換えモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。当該抗体は多くの場合、Ｔ３ＳＳの機能的アンタゴニスト、すなわちＰｃｒＶに結合し、Ｔ３ＳＳを阻害する抗体である。
一つの実施形態では、本開示は、ＰｃｒＶに特異的に結合する、単離された組換え抗体またはその抗原結合断片を提供し、この場合において当該抗体は、以下の特徴のうちの一つ以上を有する：
（ａ）配列番号２、１８、３４および５０からなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列のいずれか一つの内に含有される三つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）、ならびに配列番号１０、２６、４２および５８からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列のいずれか一つの内に含有される三つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含有する、
（ｂ）完全ヒトモノクローナル抗体である、
（ｃ）２５℃での表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定されたとき、１０－８Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）で、全長ＰｃｒＶに結合する、
（ｄ）３７℃での表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定されたとき、１０－８Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）で、全長ＰｃｒＶに結合する、
（ｅ）細胞毒性アッセイにおいて、約１０－１１Ｍ～約１０－８Ｍの範囲のＩＣ５０で、緑膿菌６０７７株の中和を示す、
（ｆ）細胞毒性アッセイにおいて、約１０－９Ｍ～約１０－７Ｍの範囲のＩＣ５０で、緑膿菌ＡＴＣＣ ７００８８８株の中和を示す、
（ｇ）溶血アッセイにおいて、約１０－１０Ｍ～約１０－６Ｍの範囲のＩＣ５０で、緑膿菌６０７７株の中和を示す、
（ｈ）溶血アッセイにおいて、約１０－１０Ｍ～約１０－７Ｍの範囲のＩＣ５０で、緑膿菌ＡＴＣＣ ７００８８８株の中和を示す、
（ｉ）急性肺炎モデルにおいて、未治療マウスと比較し、５ｍｇ／ｋｇで予防的に治療されたマウスにおいて、緑膿菌６２０６株または６０７７株による死亡率が減少する、
（ｊ）急性肺炎モデルにおいて、未治療マウスと比較し、１．０、０．２または０．０４ｍｇ／ｋｇで予防的に治療されたマウスにおいて、緑膿菌６２０６株または６０７７株による死亡率が減少する、
（ｋ）急性肺炎モデルにおいて、未治療マウスと比較し、０．１ｍｇ／ｋｇまたは０．２ｍｇ／ｋｇで予防的に治療されたマウスにおいて、緑膿菌６２０６株の肺細菌量が減少する、
（ｌ）急性肺炎モデルにおいて、未治療マウスと比較し、２５ｍｇ／ｋｇで予防的に治療されたマウスにおいて、緑膿菌ＰＡ０１株の肺細菌量が減少する、および／または
（ｍ）参照抗体と交差競合し、当該参照抗体は、表１のＨＣＶＲアミノ酸配列およびＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかからなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）アミノ酸配列および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列を含む。
一部の態様では、単離された抗体またはその抗原結合断片はさらに、以下の特徴のうちの一つ以上を有する：
（ｎ）約１０－８Ｍ未満のＥＣ５０で、全長ＰｃｒＶ（配列番号７７）に結合する、
（ｏ）約１０－８Ｍ未満のＥＣ５０で、ＰｃｒＶの１３６－２３３（配列番号８１）に結合する、
（ｐ）（ｉ）配列番号７８の約１５０位～約１７０位の範囲のアミノ酸残基、および（ｉｉ）配列番号７８の約１５５位～約１７０位の範囲のアミノ酸残基からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列と相互作用する；および／または
（ｑ）配列番号８５および配列番号８６からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列と相互作用する。
本明細書に提供される抗ＰｃｒＶ抗体の例示を、本明細書の表１、２、および３に列挙する。表１には、例示的な抗ＰｃｒＶ抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）、および軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列識別子が記載されている。表２には、例示的な抗ＰｃｒＶ抗体のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２ ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３の核酸配列識別子が記載されている。表３は、いくつかの例示的な抗体の重鎖および軽鎖の核酸配列ならびにアミノ酸配列を提示する。
本明細書において、表１に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、実質的に類似した配列を含むＨＣＶＲを含む、抗体またはその抗原結合断片が提供される。一部の態様において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２、１８、３４および５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。
さらに、表１に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、実質的に類似した配列を含むＬＣＶＲを含む、抗体またはその抗原結合断片が提供される。一部の態様において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１０、２６、４２および５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。
本明細書において、表１に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかとペア形成される、表１に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかを含むＨＣＶＲとＬＣＶＲとのアミノ酸配列ペア（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む、抗体またはその抗原結合断片が提供される。ある特定の実施形態によると、本開示は、表１に列挙される例示的な抗ＰｃｒＶ抗体のいずれかの中に含有されるＨＣＤＲ／ＬＣＤＲアミノ酸配列ペアを含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
一つの実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、および５０／５８からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む。
一つの実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、以下を含む：
（ａ）配列番号４、２０、３６および５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン、
（ｂ）配列番号６、２２、３８および５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン、
（ｃ）配列番号８、２４、４０および５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン、
（ｄ）配列番号１２、２８、４４および６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン、
（ｅ）配列番号１４、３０、４６および６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン、および
（ｆ）配列番号１６、３２、４８および６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメイン。
ある実施形態では、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアは、配列番号２／１０（Ｈ１Ｈ２９３２９Ｐ）、１８／２６（Ｈ１Ｈ２９３３２Ｐ）、３４／４２（Ｈ１Ｈ２９３３６Ｐ）、および５０／５８（Ｈ１Ｈ２９３３９Ｐ）からなる群から選択される。
さらに本明細書において、表１に列挙されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらの実質的に類似の配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）を含む、抗体またはその抗原結合断片が提供される。
さらに本明細書において、表１に列挙されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらの実質的に類似の配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を含む、抗体またはその抗原結合断片が提供される。
さらに本明細書において、表１に列挙されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらの実質的に類似の配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、抗体またはその抗原結合断片が提供される。
さらに本明細書において、表１に列挙されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらの実質的に類似の配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）を含む、抗体またはその抗原結合断片が提供される。
さらに本明細書において、表１に列挙されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらの実質的に類似の配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）を含む、抗体またはその抗原結合断片が提供される。
さらに本明細書において、表１に列挙されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それらの実質的に類似の配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、抗体またはその抗原結合断片が提供される。
さらに本明細書において、表１に列挙されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかとペア形成される、表１に列挙されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかを含むＨＣＤＲ３とＬＣＤＲ３とのアミノ酸配列ペア（ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３）を含む、抗体またはその抗原結合断片が提供される。ある特定の実施形態によると、本開示は、表１に列挙される例示的な抗ＰｃｒＶ抗体のいずれかの中に含有されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列ペアを含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。ある実施形態では、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列ペアは、配列番号２／１０（Ｈ１Ｈ２９３２９Ｐ）、１８／２６（Ｈ１Ｈ２９３３２Ｐ）、３４／４２（Ｈ１Ｈ２９３３６Ｐ）、および５０／５８（Ｈ１Ｈ２９３３９Ｐ）からなる群から選択される。
さらに本明細書において、表１に列挙される例示的な抗ＰｃｒＶ抗体のいずれかの中に含有される六個のＣＤＲ（すなわちＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）のセットを含む、抗体またはその抗原結合断片が提供される。ある実施形態では、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号４－６－８－１２－１４－１６（例えば、Ｈ１Ｈ２９３２９Ｐ）、２０－２２－２４－２８－３０－３２（例えば、Ｈ１Ｈ２９３３２Ｐ）、３６－３８－４０－４４－４６－４８（例えば、Ｈ１Ｈ２９３３６Ｐ）、および５２－５４－５６－６０－６２－６４（例えば、Ｈ１Ｈ２９３３９Ｐ）からなる群から選択される。
関連の実施形態では、本明細書において、表１に列挙される例示的な抗ＰｃｒＶ抗体のいずれかにより定義されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアの中に含有される六個のＣＤＲ（すなわち、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）のセットを含む、抗体またはその抗原結合断片が提供される。例えば、本開示は、配列番号２／１０（例えば、Ｈ１Ｈ２９３２９Ｐ）、１８／２６（例えば、Ｈ１Ｈ２９３３２Ｐ）、３４／４２（例えば、Ｈ１Ｈ２９３３６Ｐ）、および５０／５８（例えば、Ｈ１Ｈ２９３３９Ｐ）からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアの中に含有される、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットを含む、抗体またはその抗原結合断片を含む。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するための方法および技法は当該技術分野で既知であり、本明細書に開示の特定のＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するために使用することができる。ＣＤＲの境界を同定するために使用することができる例示的な慣習としては、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、およびＡｂＭ定義が挙げられる。一般的な条件では、Ｋａｂａｔ定義は配列変動性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は構造ループ領域の位置に基づき、ＡｂＭ定義はＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａ手法との間の折衷物である。例えば、Ｋａｂａｔ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８（１９９７）、およびＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：９２６８－９２７２（１９８９）を参照されたい。パブリックデータベースもまた、抗体内のＣＤＲ配列を同定するために利用可能である。
さらに本明細書において、表３に提示される重鎖アミノ酸配列のいずれか一つ、および／または表３に提示される軽鎖アミノ酸配列のいずれか一つを有する抗体が提供される。
本明細書において、表３に列挙されるＨＣアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＨＣ、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、その実質的に類似した配列を含むＨＣを含む、抗体が提供される。
さらに、表３に列挙されるＬＣアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＬＣ、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、その実質的に類似した配列を含むＬＣを含む、抗体も提供される。
本明細書において、表３に列挙されるＬＣアミノ酸配列のいずれかとペア形成される、表３に列挙されるＨＣアミノ酸配列のいずれかを含む、ＨＣとＬＣとのアミノ酸配列ペア（ＨＣ／ＬＣ）を含む、抗体が提供される。ある実施形態によると、本開示は、表３に列挙される例示的な抗ＰｃｒＶ抗体のいずれかの中に含有されるＨＣ／ＬＣアミノ酸配列ペアを含む抗体を提供する。
一つの実施形態では、単離された抗体は、配列番号６５／６６、６７／６８、６９／７０および７１／７２からなる群から選択されるＨＣ／ＬＣアミノ酸配列ペアを含む。
本開示は、修飾グリコシル化パターンを有する抗ＰｃｒＶ抗体を含む。いくつかの実施形態では、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を増大させるために、望ましくないグリコシル化部位を除去する修飾、または抗体がオリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠損していることが有用であり得る（Ｓｈｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＪＢＣ ２７７：２６７３３を参照されたい）。他の応用において、ガラクトシル化の修飾は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を修飾するために行うことができる。
さらに本明細書において、ＨＣＶＲのＣＤＲおよびＬＣＶＲのＣＤＲを含む抗体またはその抗原結合断片と、緑膿菌ＰｃｒＶへの特異的結合に関して競合する抗体およびその抗原結合断片も提供され、この場合において当該ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲはそれぞれ、表１に列挙されるＨＣＶＲ配列およびＬＣＶＲ配列から選択されるアミノ酸配列を有する。一部の態様では、抗体またはその抗原結合断片は、参照抗体またはその抗原結合断片と、ＰｃｒＶ １３６－２３３（配列番号８１）への結合に関して競合する。
さらに、ＨＣＶＲのＣＤＲおよびＬＣＶＲのＣＤＲを含む参照抗体またはその抗原結合断片と同じ緑膿菌ＰｃｒＶエピトープに結合する抗体およびその抗原結合断片が提供され、この場合において当該ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲはそれぞれ、表１に列挙されるＨＣＶＲ配列およびＬＣＶＲ配列から選択されるアミノ酸配列を有する。一部の態様では、エピトープは、ＰｃｒＶ １３６－２３３（配列番号８１）の残基、またはＰｃｒＶ １５０－１７０（配列番号８６）の残基、またはＰｃｒＶ １５５－１７０（配列番号８５）の残基を含む。
さらに、細菌から宿主細胞への毒素の緑膿菌ＰｃｒＶ転移を遮断する単離抗体およびその抗原結合断片が提供される。さらに、宿主細胞の膜透過性における、Ｔ３ＳＳ孔介在性の上昇を妨害する抗体またはその抗原結合断片が提供される。
ある実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、ＰｃｒＶタンパク質中の第一のエピトープに対する第一の結合特異性と、ＰｃｒＶタンパク質中の第二のエピトープに対する第二の結合特異性とを備える二特異性であり、この場合において当該第一および第二のエピトープは、別個であり、非重複である。ある実施形態では、当該二特異性は、ＰｃｒＶタンパク質のエピトープに結合する第一のアームと、異なる緑膿菌抗原に結合する第二のアームを含み得る。
別の態様では、本明細書において、抗ＰｃｒＶ抗体またはその一部分をコードする核酸分子が提供される。例えば、本開示は、表１に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されるＨＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む。
表１に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子が本明細書に提供され、ある特定の実施形態では、この核酸分子は、表２に列挙されるＬＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それと実質的に類似した配列を含む。
また本明細書において、表１に列挙されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されるＨＣＤＲ１核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む。
また本明細書において、表１に列挙されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されるＨＣＤＲ２核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む。
また本明細書において、表１に列挙されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されるＨＣＤＲ３核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む。
また本明細書において、表１に列挙されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されるＬＣＤＲ１核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む。
また本明細書において、表１に列挙されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されるＬＣＤＲ２核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む。
また本明細書において、表１に列挙されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されるＬＣＤＲ３核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む。
また、ＨＣＶＲをコードする核酸分子も提供され、この場合において当該ＨＣＶＲは、三つのＣＤＲ（すなわち、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３）のセットを含み、当該ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３アミノ酸配列のセットは、表１に列挙される例示的な抗ＰｃｒＶ抗体のいずれかにより定義されるとおりである。
また本明細書において、ＬＣＶＲをコードする核酸分子も提供され、この場合において当該ＬＣＶＲは、三つのＣＤＲ（すなわち、ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）のセットを含み、当該ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列のセットは、表１に列挙される例示的な抗ＰｃｒＶ抗体のいずれかにより定義されるとおりである。
また本明細書において、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲの両方をコードする核酸分子も提供され、この場合において当該ＨＣＶＲは、表１に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含み、当該ＬＣＶＲは、表１に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されるＨＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列と、表２に列挙されるＬＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列とを含む。本開示の当該態様による特定の実施形態では、核酸分子は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲをコードし、この場合において当該ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは両方とも、表１に列挙される同じＰｃｒＶ抗体から誘導される。
また本明細書において、表１に列挙される重鎖アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子が提供される。また本開示は、表１に列挙される軽鎖アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供する。
関連する態様において、本明細書において、抗ＰｃｒＶ抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現することのできる組換え発現ベクターが提供される。例えば、本開示は、上述の核酸分子、すなわち、表１に記載されるＨＣＶＲ配列、ＬＣＶＲ配列、および／またはＣＤＲ配列のいずれかをコードする核酸分子のいずれかを含む、組換え発現ベクターを含む。このようなベクターが導入された宿主細胞、ならびに抗体または抗体断片の産生を可能にする条件下で宿主細胞を培養することにより抗体またはその部分を産生する方法、およびそのように産生された抗体および抗体断片を回収する方法も、本開示の範囲内に含まれる。
別の態様では、本明細書に開示されるＰｃｒＶに特異的に結合する一つ以上の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容可能な担体または希釈剤とを含む医薬組成物が本明細書において提供される。当該一つ以上の単離された抗体は、表１に列挙されるＨＣＶＲ配列およびＬＣＶＲ配列からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペア内のＣＤＲを含み得る。当該一つ以上の単離された抗体は、表１に列挙されるＨＣＶＲ配列およびＬＣＶＲ配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含み得る。一つの実施形態では、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアは、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２および５０／５８からなる群から選択される。一つの実施形態では、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアは、配列番号３４／４２および５０／５８からなる群から選択される。
別の関連する態様では、本明細書において、抗ＰｃｒＶ抗体と、一つ以上の追加の治療剤の組み合わせである組成物が提供される。
一つの実施形態では、当該追加の治療剤は、抗ＰｃｒＶ抗体と有益に組み合わされる任意の剤である。抗ＰｃｒＶ抗体と有益に組み合わされ得る例示的な剤としては、緑膿菌に結合し、および／もしくは緑膿菌の活性を阻害する他の剤（他の抗体またはそれらの抗原結合断片など）、ならびに／またはＰｃｒＶもしくは他の緑膿菌抗原に直接結合しないにもかかわらず、宿主細胞の感染性を含む細菌活性を阻害する剤が挙げられるが、これらに限定しない。一部の態様では、第二の治療剤は、緑膿菌と同時感染する可能性のある異なる生物体、例えば黄色ブドウ球菌などの生物体と関連した感染を治療するための治療剤であり得る。一部の態様では、追加の治療剤は、抗生物質、抗炎症薬、緑膿菌に対する異なる抗体、および同時感染の治療に有用な治療剤からなる群から選択される。一部の態様では、追加の治療剤は、黄色ブドウ球菌の同時感染の治療に有用である。
関連の態様では、緑膿菌を中和する方法が本明細書において提供され、当該方法は、細胞内緑膿菌を含む細胞を、一つ以上の抗ＰｃｒＶ抗体またはその抗原結合断片を含む組成物に暴露することを含み、この場合において当該暴露によって、細胞死からの防御が強化される。特定の実施形態では、当該曝露は、インビトロまたはインビボであってもよい。特定の実施形態では、抗体が、単独で使用されるとき、または抗体が、緑膿菌に対する一つ以上の追加の治療剤もしくは抗体と併用されて使用されるときに、防御の強化が観察される。一部の態様では、当該一つ以上の追加の治療剤は、抗生物質、抗炎症薬、緑膿菌に対する異なる抗体、および同時感染の治療に有用な治療剤からなる群から選択される。一部の態様では、当該一つ以上の追加の治療剤は、例えば黄色ブドウ球菌の同時感染の治療に有用な治療剤である。一部の態様では、当該一つ以上の追加の治療剤は、異なる抗緑膿菌抗体である。
一部の実施形態では、本明細書において、緑膿菌に感染するリスクを低下させる方法が提供される。一部の態様では、当該方法は、本明細書に提供される一つ以上の抗ＰｃｒＶ抗体、または一つ以上の抗ＰｃｒＶ抗体を含む医薬組成物を投与することを含む。緑膿菌感染のリスクが高い患者は、嚢胞性線維症の患者、糖尿病の患者、人工呼吸器を装着した患者、外科手術を受けている患者、結核の患者、ＨＩＶの患者、免疫不全の患者、好中球減少症の患者、留置カテーテルのある患者、身体外傷後の患者、火傷のある患者、集中治療室の患者、寝たきりの患者、悪性腫瘍の患者、慢性閉塞性肺疾患の患者、長期間医療施設にいる患者、または静注薬物ユーザーの患者であり得る。
特定の実施形態では、本明細書において、対象の細菌量を減少させる方法が提供される。特定の実施形態では、細菌量の減少は、対象の肺において明白である。一部の態様では、当該方法は、ＰｃｒＶに結合する一つ以上の抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を、対象に投与することを含む。一部の態様では、抗体またはその抗原結合断片は、宿主細胞への毒素の緑膿菌送達を遮断する。一部の態様では、本明細書に提供される抗ＰｃｒＶ抗体を用いた治療は、緑膿菌の細菌量を減少させる。一部の態様では、本明細書に提供される抗ＰｃｒＶ抗体を用いた治療は、緑膿菌の細菌量と、黄色ブドウ球菌の細菌量を減少させる。
一部の実施形態では、本明細書において、緑膿菌感染に罹患している対象、もしくは緑膿菌感染のリスクがある対象の生存率、または生存の可能性を高める方法が提供される。一部の態様では、当該方法は、本明細書に提供される少なくとも一つの抗ＰｃｒＶ抗体またはその抗原結合断片、または少なくとも一つの抗ＰｃｒＶ抗体を含む医薬組成物を、その必要のある対象に投与することを含む。
一部の実施形態では、本明細書において、緑膿菌感染に罹患している対象、もしくは緑膿菌感染のリスクがある対象の生存率、または生存の可能性を高める方法が提供され、この場合において当該対象は、嚢胞性線維症に罹患している。一部の態様では、当該方法は、本明細書に提供される少なくとも一つの抗ＰｃｒＶ抗体またはその抗原結合断片、または少なくとも一つの抗ＰｃｒＶ抗体を含む医薬組成物を、対象に投与することを含む。一部の態様では、対象は、投与時に肺炎の症状が無い。
一部の実施形態では、本明細書において、対象の緑膿菌感染の少なくとも一つの症状の重症度、期間、もしくは発生頻度を改善または減少させる方法が提供される。一部の態様では、当該方法は、本明細書に提供される一つ以上の抗ＰｃｒＶ抗体もしくは抗原結合断片、または少なくとも一つの抗ＰｃｒＶ抗体もしくはその抗原結合断片を含む医薬組成物を、その必要のある対象に投与することを含む。一部の態様では、少なくとも一つの症状は、発熱、悪寒、頭痛、疲労、関節痛、硬直、筋肉痛、下痢、および嘔吐；耳の痛み、痒み、および耳だれ；皮膚上の膿が詰まった吹き出物を含む発疹；眼の痛みおよび発赤；肺炎、咳およびうっ血；軟部組織からの緑色の膿の排出および甘い果実臭；ならびに尿路感染症からなる群から選択される。
一部の態様では、対象は、緑膿菌感染を原因とする肺炎、菌血症、骨感染、関節感染、皮膚感染、熱傷感染、創傷感染またはそれらの任意の組み合わせを有する。
一部の態様では、本明細書に提供される一つ以上の抗ＰｃｒＶ抗体もしくはその抗原結合断片、または少なくとも一つの抗ＰｃｒＶ抗体もしくはその抗原結合断片を含む医薬組成物は、緑膿菌の浸潤性の感染の発症を治療または予防するために、その必要のある対象に、予防的または治療的に投与される。
一つの実施形態では、その必要のある対象は、活性な緑膿菌感染を有する対象、または緑膿菌に感染するリスクのある対象である。一部の態様では、対象は、免疫不全の個体、入院している個体、重い病気に罹患する個体、外科手術を受けている個体、侵襲的処置を受けている個体、外傷患者、静脈内薬剤のユーザー、重度の熱傷を有する個体、呼吸装置を使用している個体、カテーテルのある個体、化学療法を受けている個体、糖尿病を有する個体、嚢胞性線維症を有する個体、ＨＩＶを有する個体、結核を有する個体、または免疫系を損なう可能性のある任意の他の医学的状態を有する個体からなる群から選択される。一部の態様では、対象は、緑膿菌感染を有する。一部の態様では、対象は、緑膿菌感染と黄色ブドウ球菌感染を有する。一部の態様では、対象は、緑膿菌感染と、一つ以上の他のグラム陰性またはグラム陽性の同時感染を有する。一部の態様では、対象は、緑膿菌感染を原因とする肺炎、菌血症、骨感染、関節感染、皮膚感染、熱傷感染、創傷感染またはそれらの任意の組み合わせを有する。一部の態様では、緑膿菌は、抗生物質に耐性であるか、または部分的に耐性である。
一つの実施形態では、その必要のある対象は、本明細書に提供される少なくとも一つの抗ＰｃｒＶ抗体もしくはその抗原結合断片、または少なくとも一つの抗体もしくはその抗原結合断片を含む医薬組成物を、一つ以上の追加の治療剤と組み合わされて投与されてもよい。一つ以上の追加の治療剤は、抗生物質、抗炎症薬（例えば、コルチコステロイド、および非ステロイド性抗炎症薬）、緑膿菌に対する異なる抗体、例えば黄色ブドウ球菌などの同時感染の治療に有用な治療剤、および緑膿菌感染の少なくとも一つの症状の改善に有用である、もしくは患者の細菌量を減少させるのに有用である当分野に公知の任意の他の薬剤または治療法からなる群から選択されてもよい。一つの実施形態では、一つ以上の追加の治療剤は、一つ以上の抗ＰｃｒＶ抗体を含む。特定の実施形態では、第二の治療剤は、本開示の抗体またはその抗原結合断片に関連する任意の可能性のある副作用が生じた場合に、当該副作用に対抗する、または低下させるのを補助する剤であってもよい。
一つの実施形態では、医薬組成物は、皮下投与、静脈内投与、皮内投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、または経口投与されてもよい。
特定の実施形態では、一つ以上の抗体またはその抗原結合断片は、緑膿菌感染を有する、または緑膿菌感染を有するリスクがある、または緑膿菌感染を発症させやすい傾向がある対象に、予防的または治療的に投与されてもよい。リスクのある対象としては限定されないが、免疫不全の個体、入院している個体、重い病気に罹患する個体、外科手術または別の侵襲的処置を受けている個体、外傷患者、静脈内薬剤のユーザー、重度の熱傷を有する個体、呼吸装置を使用している個体、カテーテルのある個体、化学療法を受けている個体、結核を有する個体、糖尿病を有する個体、嚢胞性線維症を有する個体、ＨＩＶを有する個体、または免疫系を損なう可能性のある任意の他の医学的状態を有する個体が挙げられる。
また本開示は、緑膿菌感染を有する対象、または緑膿菌に感染するリスクのある対象の治療における使用のための、または緑膿菌感染に関連する疾患もしくは障害の治療のための医薬品の製造における使用のための、本明細書に提供される抗ＰｃｒＶ抗体またはその抗原結合断片も含む。
本明細書に提供される抗ＰｃｒＶ抗体またはその抗原結合断片（例えば、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２および５０／５８からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを有する抗体）を含む、注射用デバイス（例えば、皮下注射針とシリンジ、オートインジェクターまたはプレ充填シリンジ）または容器（例えば、バイアル）が本明細書において提供される。
さらに、対象（例えば、ヒト）に組成物を投与するための方法が提供され、当該方法は、例えば注射用デバイスを使用した注射など非経口的に、対象の身体内に組成物の構成要素を導入する工程を含む。本開示のある実施形態では、対象は、緑膿菌感染に罹患しているか、または緑膿菌に感染するリスクがある。
さらに、抗ＰｃｒＶ抗体および薬学的に許容可能な担体を含む組成物（例えば、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２および５０／５８からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを有する抗体を含む組成物）を作製するための方法が本明細書において提供される。
また、本明細書に開示される組成物を含むデバイスまたは容器を作製する方法も提供され、当該方法は、当該デバイスまたは容器に、組成物の構成要素を導入することを含む。
他の実施形態は、後に続く発明を実施するための形態の検討から明らかになるであろう。
本方法について記述する前に、本発明が本明細書に記述された特定の方法および実験条件に限定されず、それはこのような方法および条件が変化する場合があるからであることが理解されるべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって制限されるので、本明細書に使用される用語は、特定の実施形態のみを記述する目的で使用されており、制限することを意図しないことも理解されるべきである。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記述したものと類似または同等な任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をこれから記述する。
用語の定義
本明細書で使用する「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互接続された四つのポリペプチド鎖、二つの重（Ｈ）鎖および二つの軽（Ｌ）鎖からなる免疫グロブリン分子（すなわち、「完全抗体分子」）、ならびにこれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）またはこれらの抗原結合断片を指すことが意図される。各重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」または「ＶＨ」）および重鎖定常領域（ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインからなる）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲまたは「ＶＬ」）および軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域へとさらに細分化することができる。各ＶＨおよびＶＬは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された三つのＣＤＲと四つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。本開示のある実施形態では、抗体（またはその抗原結合断片）のＦＲは、ヒト生殖細胞系列の配列と同一であってもよく、または天然であってもよく、もしくは人工的に修飾されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、二つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。
一つ以上のＣＤＲ残基の置換または一つ以上のＣＤＲの省略も可能である。抗体は、一つまたは二つのＣＤＲが結合のために省かれることができると科学文献に記載されている。Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５ ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３－１３９）は、公開されている結晶構造に基づいて、抗体とこれらの抗原との間の接触領域を分析し、ＣＤＲ残基の約１／５～１／３のみが実際に抗原と接触すると結論付けた。Ｐａｄｌａｎは、一つまたは二つのＣＤＲが抗原と接触しているアミノ酸を有しない多くの抗体も発見した（Ｖａｊｄｏｓ ｅｔ ａｌ．２００２ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３２０：４１５－４２８も参照されたい）。
抗原と接触していないＣＤＲ残基は、先行研究に基づいて、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲの外側にあるＫａｂａｔのＣＤＲの領域から、分子モデリングによって、かつ／または経験的に同定することができる（例えば、ＣＤＲＨ２中の残基Ｈ６０～Ｈ６５はしばしば必要ではない）。ＣＤＲまたはその残基（複数可）が省略される場合、このＣＤＲまたはその残基は、通常、別のヒト抗体配列またはこのような配列のコンセンサスにおける対応する位置を占有するアミノ酸と置換される。ＣＤＲ内の置換のための位置および置換すべきアミノ酸も経験的に選択することができる。経験的な置換は、保存的置換または非保存的置換であり得る。
本明細書に開示される完全ヒト抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体は、対応する生殖系列配列と比較して、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域に一つ以上のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を含み得る。そのような変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば公開抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって容易に確認され得る。本開示は、本明細書に開示される例示的アミノ酸配列のいずれかに由来する抗体および抗原結合断片を含み、この場合において一つ以上のフレームワーク領域および／またはＣＤＲ領域内の一つ以上のアミノ酸は、当該抗体が由来する生殖細胞系列の配列の対応する残基への、または別のヒト生殖細胞系列の配列の対応する残基への、または対応する生殖細胞系列の残基の保存的アミノ酸置換への、変異を受けている（そのような配列変化を本明細書において集合的に「生殖細胞系列変異」と呼称する）。当業者であれば、本明細書に開示される重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列から開始して、一つ以上の個々の生殖系列変異またはそれらの組み合わせを含む、多くの抗体および抗原結合断片を容易に産生することができる。ある特定の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基の全てが、抗体が由来する元の生殖系列配列に見られる残基に再び変異する。他の実施形態では、ある特定の残基のみ、例えば、ＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内、もしくはＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内に見られる変異残基のみ、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３内に見られる変異残基のみが、元の生殖系列配列に再び変異する。他の実施形態では、フレームワークおよび／またはＣＤＲ残基（複数可）のうちの一つ以上は、異なる生殖系列配列（すなわち、抗体が元々由来する生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基（複数可）に変異する。さらに、本明細書に開示の抗体は、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内に二つ以上の生殖系列変異の任意の組み合わせを含有してもよく、例えば、ある特定の個々の残基が、特定の生殖系列配列の対応する残基に変異する一方で、元の生殖系列配列とは異なる、ある特定の他の残基が維持されるか、または異なる生殖系列配列の対応する残基に変異する。いったん得られれば、一つ以上の生殖系列変異を含有する抗体および抗原結合断片は、結合特異性の改善、結合アフィニティの増大、アンタゴニストまたはアゴニストの生物学的特性の改善または強化（場合により得る）、免疫原性の低減などの一つ以上の所望の特性について容易に試験することができる。この一般的な様式で得られた抗体および抗原結合断片は、本開示に包含される。
また本明細書において、一つ以上の保存的置換を有する本明細書に開示されるＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかのバリアントを含む完全ヒト抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体も予期される。例えば、本開示は、本明細書に開示されるＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば１０個以下、８個以下、６個以下、または４個以下などの保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＰｃｒＶ抗体を含む。
「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図する。本開示のヒトｍＡｂは、例えばＣＤＲにおいて、特にＣＤＲ３において、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでの無作為な、もしくは部位特異的な突然変異誘導により、またはインビボでの体細胞変異により導入される変異）を含んでもよい。しかしながら、用語「ヒト抗体」とは、本明細書にて使用される場合、別の哺乳類種（例えば、マウス）の生殖系列由来のＣＤＲ配列がヒトＦＲ配列上に移植されているｍＡｂを含むようには意図されていない。この用語は、非ヒト哺乳類において、または非ヒト哺乳類の細胞において組換え産生された抗体を含む。この用語は、ヒト対象から単離された、またはヒト対象において生成された抗体を含むよう意図されるものではない。
「組換え」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、ＤＮＡスプライシングおよびトランスジェニック発現を含む、組換えＤＮＡ技術として当分野で公知の技術または方法により作製、発現、単離、または取得される、本開示の抗体またはその抗原結合断片を指す。この用語は、非ヒト哺乳類（例えば、トランスジェニックマウスなどのトランスジェニック非ヒト哺乳類を含む）または細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）発現系で発現されるか、または組換え型コンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体を指す。
「～を特異的に結合する」という用語もしくは「～へ特異的に結合する」という用語、またはこれらに類するものは、抗体またはその抗原結合断片が、生理学的条件下で比較的安定である抗原と複合体を形成することを意味する。特異的結合は、少なくとも約１×１０－７Ｍ以下の平衡解離定数を特徴とすることができる（例えば、より小さいＫＤはより緊密な結合を示す）。二つの分子が特異的に結合するかどうかを判定するための方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などを含む。本明細書で記載される場合、ＰｃｒＶに特異的に結合する抗体は、表面プラズモン共鳴、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（商標）により特定された。さらに緑膿菌ＰｃｒＶおよび一つ以上の追加の緑膿菌抗原に結合する多特異性抗体、または緑膿菌ＰｃｒＶの二つの異なる領域に結合する二特異性抗体はそれでも、本明細書において使用される場合、「特異的に結合する」抗体とみなされる。
「高アフィニティ」抗体という用語は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）、または溶液アフィニティＥＬＩＳＡにより測定されたときに、少なくとも１０－７Ｍ、好ましくは１０－８Ｍ、より好ましくは１０－９Ｍ、さらにより好ましくは１０－１０Ｍ、さらにより好ましくは１０－１１Ｍ、さらにより好ましくは１０－１２ＭのＫＤとして表される、ＰｃｒＶに対する結合アフィニティを有するｍＡｂを指す。
「スローオフレート」、「Ｋｏｆｆ」または「ｋｄ」という用語は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）により決定されたときに、１ｘ１０－３ｓ－１以下、好ましくは１ｘ１０－４ｓ－１以下の速度定数で、ＰｃｒＶから解離する抗体を意味する。
本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」などという用語は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に存在する、酵素的に得ることができる、合成の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。本明細書で使用する場合、抗体の「抗原結合断片」、または「抗体断片」という用語は、ＰｃｒＶに結合する能力を保持する抗体の一つ以上の断片を指す。
特定の実施形態では、本開示の抗体または抗体断片は、リガンド部分、または例えば抗生物質、第二の抗緑膿菌抗体または緑膿菌感染の治療に有用な任意の他の治療部分などの部分に結合されてもよい（免疫結合体）。
本明細書で使用する場合、「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体（Ａｂ）を実質的に含まない抗体を指すことが意図される（例えば、緑膿菌ＰｃｒＶに特異的に結合する単離された抗体またはその断片は、ＰｃｒＶ以外の抗原を特異的に結合するＡｂを実質的に含まない。
本明細書で使用される場合、「遮断抗体」または「中和抗体」（または「緑膿菌活性を中和する抗体」または「アンタゴニスト抗体」）は、ＰｃｒＶへのその結合が、緑膿菌の少なくとも一つの生物学的活性の阻害をもたらす抗体を指すことが意図される。例えば、本開示の抗体は、宿主細胞への細菌毒素の転移から、緑膿菌を阻害または遮断し得る。さらに、「中和抗体」は、病原体が宿主における感染を開始および／または永続させる能力を中和、すなわち、防止、阻害、低減、妨害または干渉することができるものである。「中和抗体」および「中和する抗体」という用語は、本明細書では互換的に使用される。これらの抗体は、単独でまたは他の抗細菌剤と組合わせて、適切な処方の際に、または積極的なワクチン接種と関連して、予防剤または治療剤として、または診断ツールとして使用することができる。
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」は、免疫系のエフェクター細胞が標的細胞を積極的に溶解する細胞媒介性免疫防御の機序であり、その膜表面抗原は、本明細書に記載のものなどの特異的抗体によって結合されている。したがって、これが、例えば細菌特異的抗体が、感染の広がりを制限するように作用することができる一つの機序である。古典的ＡＤＣＣは、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージ、好中球、および特定の場合では好酸球によって媒介される。
「表面プラズモン共鳴」という用語は、本明細書で使用する場合、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（商標）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ，スウェーデン国ウプサラ市およびニュージャージー州ピスカタウェイ郡区）を使用して、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出によってリアルタイムでの生体分子相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。
「ＫＤ」という用語は、本明細書で使用される場合、特定の抗体－抗原相互作用の平衡解離定数を指すよう意図される。
「エピトープ」という用語は、パラトープとして既知の抗体分子の可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は、二つより多くのエピトープを有してもよい。したがって、異なる抗体は、抗原上の異なる領域に結合してもよく、異なる生物学的効果を有してもよい。「エピトープ」という用語は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位も指す。この用語は、抗体が結合する抗原の領域も指す。エピトープは、構造上または機能上として定義されてもよい。機能的エピトープは、概して、構造エピトープのサブセットであり、相互作用のアフィニティに直接関与する残基を有する。エピトープは、立体配座的でもあり得、すなわち、非線形アミノ酸から構成され得る。ある特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基のような分子の化学的に活性のある表面基である決定基を含んでもよく、ある特定の実施形態では、特異的三次元構造特徴、および／または特定の比電荷特徴を有してもよい。
本明細書で使用される場合、「交差競合」という用語は、抗原に結合し、別の抗体またはその抗原結合断片の結合を阻害または遮断する、抗体またはその抗原結合断片を意味する。この用語はまた、二つの抗体間の両方向の競合、すなわち、第一の抗体が結合し、かつ第二の抗体の結合を遮断し、またその逆も含む。ある特定の実施形態では、第一の抗体および第二の抗体は、同じエピトープに結合してもよい。あるいは、第一および第二の抗体は、異なるが重複するエピトープに結合することができ、その結果、一つの結合が、例えば、立体障害を介して、第二の抗体の結合を阻害または遮断する。抗体間の交差競合は、当技術分野で既知の方法、例えば、リアルタイム無標識バイオレイヤー干渉アッセイによって測定され得る。被験抗体が、本開示の参照抗ＰｃｒＶ抗体と交差競合するかを判定するために、当該参照抗体を、飽和条件下でＰｃｒＶタンパク質に結合させる。次に、ＰｃｒＶタンパク質に結合する被験抗体の能力が評価される。参照抗ＰｃｒＶ抗体との飽和結合後に被験抗体がＰｃｒＶタンパク質に結合することができる場合、当該被験抗体は参照抗ＰｃｒＶ抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。一方で、参照抗ＰｃｒＶ抗体との飽和結合後に被験抗体がＰｃｒＶタンパク質に結合できない場合、当該被験抗体は、参照抗ＰｃｒＶ抗体により結合されるエピトープと同じエピトープに結合する可能性がある。
典型的には、何等かの方法で改変された本明細書に提供される抗体または抗原結合断片は、ＰｃｒＶに特異的に結合する能力を保持している。例えば、活性がモルベースで表される場合、（親抗体と比較して）ＰｃｒＶの結合活性を少なくとも１０％保持している。一部の態様では、本開示の抗体または抗原結合断片は、親抗体のＰｃｒＶ結合アフィニティの少なくとも２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％以上を保持している。また、本開示の抗体または抗原結合断片は、その生物活性を実質的に変化させない保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換（抗体の「保存的バリアント」または「機能保存的バリアント」と呼称される）を含み得ることも意図される。
ポリヌクレオチドの「バリアント」とは、本明細書に記載される参照ヌクレオチド配列（例えば、配列番号１、９、１７、２５、３３、４１、４９または５７）に対し、比較がＢＬＡＳＴアルゴリズムにより行われ、当該アルゴリズムのパラメータが、各参照配列の全長にわたり各配列間で最も大きな合致を与えるよう選択される場合（例えば、予測閾値：１０、ワードサイズ：２８、クエリ範囲における最大合致：０、合致／非合致スコア：１、－２；ギャップコスト：線形）、少なくとも約７０～９９．９％（例えば、少なくとも約７０、７２、７４、７５、７６、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、または９９．９％）同一であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを指す。
「実質的な同一性」または「実質的に同一である」という用語は、核酸またはその断片を指す場合、別の核酸（またはその相補鎖）との適切なヌクレオチド挿入または欠失と最適に整列した場合、以下で説明するように、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＧＡＰなど、配列同一性の任意の周知のアルゴリズムによって測定したときに、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％においてヌクレオチド配列同一性があることを示す。参照核酸分子と実質的な同一性を有する核酸分子は、ある特定の場合では、参照核酸分子によってコードされるポリペプチドと同じまたは実質的に類似したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。
例えば免疫グロブリン鎖（例えば、Ｈ１Ｈ２９３２９ＰのＶＨ、ＶＬ、ＨＣもしくはＬＣ、Ｈ１Ｈ２９３３２ＰのＶＨ、ＶＬ、ＨＣもしくはＬＣ、Ｈ１Ｈ２９３３６ＰのＶＨ、ＶＬ、ＨＣもしくはＬＣ、またはＨ１Ｈ２９３３９ＰのＶＨ、ＶＬ、ＨＣもしくはＬＣ）などのポリペプチドの「バリアント」とは、本明細書に記載される参照アミノ酸配列（例えば、配列番号２、１０、６５、６６、１８、２６、６７、６８、３４、４２、６９、７０、５０、５８、７１または７２）に対して、比較がＢＬＡＳＴアルゴリズムにより行われ、当該アルゴリズムのパラメータが、各参照配列の全長にわたり各配列間で最も大きな合致を与えるよう選択される場合（例えば、予測閾値：１０、ワードサイズ：３、クエリ範囲における最大合致：０、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス、ギャップコスト：エグジステンス１１、伸長１、コンディショナル組成スコアマトリクス調整）、少なくとも約７０～９９．９％（例えば、７０、７２、７４、７５、７６、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．９％）同一または類似であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。
ポリペプチドへ適用される場合、「実質的な類似性」または「実質的に類似の」という用語は、二つのペプチド配列が、既定のギャップ重みを用いてプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列した場合、少なくとも９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％、９８％または９９％の配列同一性を共有する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換だけ異なる。「保存的改変バリアント」または「保存的置換」とは、ポリペプチド中のアミノ酸と、類似した特性（例えば電荷、側鎖の大きさ、疎水性／親水性、骨格構造および剛性など）を有する他のアミノ酸との置換が一つ以上存在するバリアントを指す。そのような変化はしばしば、当該抗体または断片の生物活性を大きく損なうことなく発生し得る。当業者は、概して、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換が、生物学的活性を実質的に変えないことを認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎら、（１９８７年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ、Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，２２４頁（第４編））を参照されたい。さらに、構造的または機能的に類似のアミノ酸の置換は、生物活性を著しく破壊する可能性が低い。
二つ以上のアミノ酸配列が保存的置換だけ互いに異なる場合、相同性の百分率または程度は、置換の保存的性質を補正するために上向きに調整してもよい。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。（例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３３１を参照のこと）。類似の化学的特性を備えた側鎖を有するアミノ酸の基の例としては、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、２）脂肪族－ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン、３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン、４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン、６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに７）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタミン酸－アスパラギン酸およびアスパラギン－グルタミンである。あるいは、保存的置換とは、Ｇｏｎｎｅｔら、（１９９２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３ ４５において開示されるＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて正の値を有する任意の変化である。「適度に保存的な」置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度行列において負以外の値を有する何らかの変化である。
ポリペプチドについての配列類似性は、典型的には、配列解析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む種々の置換、欠失および他の修飾へ割り当てられた類似性の測定値を使用して類似の配列と一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、異なる種の生物由来の相同ポリペプチドのような密接に関連するポリペプチド間の、または野生型タンパク質とその変異タンパク質の間の配列相同性または配列同一性を判定するための既定パラメータと共に使用することができるＧＡＰおよびＢＥＳＴＦＩＴなどのプログラムを含有する。例えば、ＧＣＧ第６．１版を参照されたい。ポリペプチド配列は、ＧＣＧ第６．１版におけるプログラムである、既定パラメータまたは推奨パラメータを備えたＦＡＳＴＡを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、問い合わせ配列と検索配列との間の最良重複の領域の整列および配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）上述）。本明細書に提供される配列を、異なる生物体からの多数の配列を含むデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、コンピュータープログラムのＢＬＡＳＴであり、特にデフォルトパラメータを使用したＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０および（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２を参照のこと。
抗ＰｃｒＶ抗原結合タンパク質、例えば、本開示の抗体およびその抗原結合断片は、一つの実施形態では、配列番号２、１８、３４または５０に記載されるアミノ酸に対し、少なくとも７０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％）のアミノ酸配列同一性を有する重鎖免疫グロブリン可変領域、および／または配列番号１０、２６、４２または５８に記載されるアミノ酸に対し、少なくとも７０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％）のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖免疫グロブリン可変領域を含む。
さらに、抗ＰｃｒＶ抗原結合タンパク質のバリアントは、例えば、ミスセンス変異（例えば、保存的置換）、ナンセンス変異、欠失、または挿入のような一つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の変異を除き、本明細書に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含んでもよい。例えば本開示は、配列番号２、１８、３４または５０に記載されるが、そのような変異を一つ以上有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖バリアント、および／または配列番号１０、２６、４２もしくは５８に記載されるが、そのような変異を一つ以上有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖バリアントを含む抗原結合タンパク質を含む。本開示のある実施形態では、抗ＰｃｒＶ抗原結合タンパク質のバリアントは、当該ＣＤＲのうちの一つ以上（例えば、１、または２、または３）が、そのような変異（例えば保存的置換）を一つ以上有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖バリアント、および／または当該ＣＤＲのうちの一つ以上（例えば、１、または２、または３）が、そのような変異（例えば保存的置換）を一つ以上有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖バリアントを含む。
本開示はさらに、例えば、配列番号４、６、８、１２、１４および／もしくは１６、または２０、２２、２４、２８、３０および／もしくは３２、または３６、３８、４０、４４、４６および／もしくは４８、または５２、５４、５６、６０、６２および／もしくは６４に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは９９．９％の配列同一性または配列類似性を有する、本明細書に記載される一つ以上のバリアントＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２および／またはＬＣＤＲ３のうちのいずれか一つ以上）を含む、抗ＰｃｒＶ抗原結合タンパク質、例えば抗体またはその抗原結合断片のバリアントを提供するものである。
また本開示の実施形態は、本明細書に具体的に記載される対応するＶＨ、ＶＬ、ＨＣまたはＬＣのアミノ酸配列に対し、７０％以上（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％）の全体的なアミノ酸配列の同一性または類似性を有するアミノ酸配列を含む、免疫グロブリンＶＨおよびＶＬまたはＨＣおよびＬＣを含む、抗原結合タンパク質、例えば抗ＰｃｒＶ抗体およびその抗原結合断片のバリアントも含み、ただしこの場合において当該免疫グロブリンのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２および／またはＬＣＤＲ３は、バリアントではなく、それぞれ、配列番号４、６、８、１２、１４および／もしくは１６、または２０、２２、２４、２８、３０および／もしくは３２、または３６、３８、４０、４４、４６および／もしくは４８、または５２、５４、５６、６０、６２および／もしくは６４に記載されるアミノ酸配列を含む。したがって、かかる実施形態では、バリアント抗原結合タンパク質内のＣＤＲは、それ自体はバリアントではない。
抗ＰｃｒＶ抗体およびその抗原結合断片の機能保存的バリアントも、本発明の一部である。抗ＰｃｒＶ抗体およびその抗原結合断片のバリアント（本明細書において検討される）はいずれも、「機能保存的バリアント」であり得る。そのような機能保存的バリアントは、一部の例では、保存的に改変されたバリアントとしても特徴付けられ得る。本明細書で使用される場合、「機能保存的バリアント」は、一つ以上のアミノ酸残基が、当該抗体または断片の一つ以上の機能的特性を著しく変えることなく変化している、抗ＰｃｒＶ抗体またはその抗原結合断片のバリアントを指す。本発明のある実施形態では、本開示の抗ＰｃｒＶ抗体またはその抗原結合断片の機能保存的バリアントは、バリアントアミノ酸配列を含み、以下の機能的特性のうちの一つ以上を示す：
・２５℃での表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定されたとき、１０－８Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）で、全長ＰｃｒＶに結合する、
・３７℃での表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定されたとき、１０－８Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）で、全長ＰｃｒＶに結合する、
・細胞毒性アッセイにおいて、約１０－１１Ｍ～約１０－８Ｍの範囲のＩＣ５０で、緑膿菌６０７７株の中和を示す、
・細胞毒性アッセイにおいて、約１０－９Ｍ～約１０－７Ｍの範囲のＩＣ５０で、緑膿菌ＡＴＣＣ ７００８８８株の中和を示す、
・溶血アッセイにおいて、約１０－１０Ｍ～約１０－６Ｍの範囲のＩＣ５０で、緑膿菌６０７７株の中和を示す、
・溶血アッセイにおいて、約１０－１０Ｍ～約１０－７Ｍの範囲のＩＣ５０で、緑膿菌ＡＴＣＣ ７００８８８株の中和を示す、
・急性肺炎モデルにおいて、未治療マウスと比較し、５ｍｇ／ｋｇで予防的に治療されたマウスにおいて、緑膿菌６２０６株または６０７７株による死亡率が減少する、
・急性肺炎モデルにおいて、未治療マウスと比較し、１．０、０．２または０．０４ｍｇ／ｋｇで予防的に治療されたマウスにおいて、緑膿菌６２０６株または６０７７株による死亡率が減少する、
・急性肺炎モデルにおいて、未治療マウスと比較し、０．１ｍｇ／ｋｇまたは０．２ｍｇ／ｋｇで予防的に治療されたマウスにおいて、緑膿菌６２０６株の肺細菌量が減少する、
・急性肺炎モデルにおいて、未治療マウスと比較し、２５ｍｇ／ｋｇで予防的に治療されたマウスにおいて、緑膿菌ＰＡ０１株の肺細菌量が減少する、および／または
・参照抗体と交差競合する、この場合において当該参照抗体は、表１のＨＣＶＲアミノ酸配列およびＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかからなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）アミノ酸配列および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列を含む、
・約１０－８Ｍ未満のＥＣ５０で、全長ＰｃｒＶ（配列番号７７）に結合する、
・約１０－８Ｍ未満のＥＣ５０で、ＰｃｒＶの１３６－２３３（配列番号８１）に結合する、
・配列番号７８のおよそ１５０位～およそ１７０位の範囲のアミノ酸残基と相互作用する、
・配列番号７８のおよそ１５５位～およそ１７０位の範囲のアミノ酸残基と相互作用する、
・配列番号８５および配列番号８６からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列と相互作用する。
「治療有効量」という句によって意味されるのは、所望の効果のために投与されて所望の効果を生じる量である。正確な量は、治療の目的によることになっており、既知の技術を使用して当業者によって確認できることになっている（例えば、Ｌｌｏｙｄ（１９９９）Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇを参照されたい）。
本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、緑膿菌感染症などの疾患または障害の改善、予防、および／または治療を必要とする動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。対象は、緑膿菌感染症を有し得るか、または緑膿菌感染症を発症する傾向がある。「緑膿菌感染症を発症する傾向がある」対象、または「緑膿菌感染症に罹るリスクが高い可能性がある」対象は、外科手術を受けている対象、重い病気を治療されている対象、外傷患者、静脈内薬剤のユーザー、重度の熱傷を有する対象、呼吸装置を使用している対象、カテーテルのある対象、化学療法を受けている対象、糖尿病を有する対象、嚢胞性線維症を有する対象、結核を有する対象、ＨＩＶを有する対象、および免疫不全を有する対象である。
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」または「治療」という用語は、例えば、肺炎、菌血症、腹膜炎、敗血症および／または膿瘍などの感染症と臨床的に診断された対象における、感染性因子の細菌量を消滅させる、または低下させることを目的とする、治療的処置を指す。この用語には、疾患の進行の阻害または感染の悪化の阻害が含まれる。この用語は、疾患の肯定的な予後も含み、すなわち、対象は感染していない可能性があるか、または本明細書に開示される抗体などの治療剤の投与に際し、細菌力価が低減しているか、またはない可能性がある。「治療」には、治療を受けない場合の予測生存期間と比較して、生存期間が延長することも意味する場合がある。治療を必要とするものには、既に感染しているもの、ならびに例えば、緑膿菌などの細菌感染に感受性のある熱傷患者または免疫不全患者など、緑膿菌に感染する傾向があるものが含まれる。治療剤は、治療的投与量で対象に投与されてもよい。
本明細書で使用される場合、「予防する」または「軽減する」という用語は、予防的手段または防止的手段を指し、その目的は、緑膿菌感染、または感染に関連する症状の予防または減速（減少）である。有益または望ましい臨床結果には、限定されないが、症状の軽減、感染の程度の減少、安定した（すなわち悪化しない）疾患状態、対象における例えば緑膿菌などの感染性因子の消滅または減少、疾患進行の遅延または減速、病態の改善または緩和、および寛解（部分寛解または完全寛解）が含まれ、検出可能であっても検出不可能であってもよい。
本明細書で使用される場合、「院内疾患」および「院内感染」という用語は、病院または他の医療施設を起源とする疾患または感染症を指す。院内感染は、例えば、抗生物質に耐性の緑膿菌など、緑膿菌により引き起こされる場合がある。特定の態様では、院内感染は、対象が病院または医療施設に入院する前には存在せず、または培養されない。および院内感染は、対象が病院または医療施設に入院した後に取得され、または罹患する。
概要
上述のように、細菌のＴ３ＳＳは、緑膿菌を含むグラム陰性細菌の重要な毒性因子である。ＰｃｒＶタンパク質は、Ｔ３ＳＳ装置の末端に位置し、針先に環型構造を形成する。針先タンパク質は、細菌の外表面上に存在する二つのタンパク質のうちの一つとして抗体にアクセス可能である。
したがって本明細書において、緑膿菌ＰｃｒＶに結合する抗体、二特異性抗原分子、およびその抗原結合断片が提供される。ＰｃｒＶを標的とする抗体は、感染細胞への細菌毒素の注入を防止し、炎症、細胞死、および細菌の播種の減少をもたらすことができる。ＰｃｒＶを標的とする抗体は、感染宿主細胞の孔介在性の膜透過を遮断することができる。これらの抗ＰｃｒＶ抗体、二特異性抗原結合分子、およびその抗原結合断片は、緑膿菌感染の治療および／または軽減、緑膿菌感染の症状の治療および／または軽減、ならびに緑膿菌感染の発生防止または症状進行の防止に有用である。一部の態様では、抗ＰｃｒＶ抗体は、緑膿菌が原因の肺炎の発生または進行を防止する。
本明細書において、緑膿菌が感染した患者の治療方法が提供される。本明細書において、緑膿菌感染の発生または症状進行を防止する方法が提供される。例えば、血液、皮膚、尿、膿もしくは他の体液サンプルからの陽性培養物、または緑膿菌感染を示唆するＸ線画像、または例えば限定されないが、皮膚もしくは骨の潰瘍などの緑膿菌感染を示唆する身体検査の所見、または異常なバイタルサインなどの緑膿菌の兆候を予防する方法が本明細書において提供される。一部の態様では、患者は、嚢胞性線維症を有し得る。一部の態様では、患者は、呼吸装置を使用し得る。一部の態様では、患者は、好中球減少性の癌患者である。一部の態様では、患者は、熱傷患者である。一部の態様では、患者は、結核に罹患する。
一部の実施形態では、患者は、抗生物質耐性の緑膿菌感染を有する。一部の実施形態では、患者は、例えば抗生物質耐性の黄色ブドウ球菌感染などの黄色ブドウ球菌感染の同時感染を有する。一部の実施形態では、黄色ブドウ球菌感染と緑膿菌感染の両方とも、抗生物質耐性である。一部の実施形態では、患者は、グラム陰性細菌またはグラム陽性細菌との同時感染を有する。
一般的方法
分子生物学における標準的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８２ ＆ １９８９ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，３．ｓｕｐ．ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｗｕ（１９９３）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｖｏｌ．２１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）に記載されている。標準的な方法はまた、Ａｕｓｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１－４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．でも見られ、これは、細菌細胞におけるクローニングおよびＤＮＡ突然変異誘発（１巻）、哺乳類細胞および酵母におけるクローニング（２巻）、糖コンジュゲートおよびタンパク質発現（３巻）、ならびにバイオインフォマティクス（４巻）について記載している。
免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、および結晶化を含むタンパク質精製のための方法が記載されている（Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。化学分析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の産生、タンパク質のグリコシル化が記載されている（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ，ｐｐ．１６．０．５－１６．２２．１７、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃｏ．（２００１）Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．；ｐｐ．４５－８９、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００１）ＢｉｏＤｉｒｅｃｔｏｒｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，ｐｐ．３８４－３９１を参照のこと）。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の産生、精製、および断片化が記載されている（Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、上記参照）。リガンド／受容体の相互作用を特徴付けるための標準的な技術が利用可能である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、およびヒト化抗体が調製され得る（例えば、Ｓｈｅｐｅｒｄ ａｎｄ Ｄｅａｎ（ｅｄｓ．）（２０００）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ（ｅｄｓ．）（２００１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．１３９－２４３、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：６２０５、Ｈｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１０２９、Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２７３７１－２７３７８、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８－１０６８４、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３、Ｆｏｏｔｅ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７－４９９、米国特許第６，３２９，５１１号を参照のこと）。
ヒト化の代替方法は、ファージ上に提示されるヒト抗体ライブラリ、またはトランスジェニックマウスにおけるヒト抗体ライブラリを使用することである（Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３０９－３１４、Ｂａｒｂａｓ（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １：８３７－８３９、Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６－１５６、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｃｈａｍｅｓ（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１：３７１－３７７、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．、ｄｅ Ｂｒｕｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：３９７－３９９）。単鎖抗体およびダイアボディが記載されている（例えば、Ｍａｌｅｃｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：２１３－２１８、Ｃｏｎｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：７３４６－７３５０、Ｄｅｓｍｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２６２８５－２６２９０、Ｈｕｄｓｏｎ ａｎｄ Ｋｏｒｔｔ（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１７７－１８９、および米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。二官能性抗体が提供されている（例えば、Ｍａｃｋ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：７０２１－７０２５、Ｃａｒｔｅｒ（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８：７－１５、Ｖｏｌｋｅｌ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １４：８１５－８２３、Ｓｅｇａｌ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８：１－６、Ｂｒｅｎｎａｎ，ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１－８３、Ｒａｓｏ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２７６２３、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２－１２０７、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５－３６５９、ならびに米国特許第５，９３２，４４８号、同第５，５３２，２１０号、および同第６，１２９，９１４号を参照のこと）。完全ヒト抗体は、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅなどの遺伝子操作されたマウスでも開発され得る。例えば、ＤｅＣｈｉａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｆｕｌｌｙ ＥＳ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｉｃｅ ｆｒｏｍ ｅｉｇｈｔ－ｃｅｌｌ ｓｔａｇｅ ｅｍｂｒｙｏ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，４７６：２８５－９４（２０１０）、Ｄｅｃｈｉａｒａ ｅｔ ａｌ．，ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ：ｆｕｌｌｙ ＥＳ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｆ０－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍｉｃｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｅｉｇｈｔ－ｃｅｌｌ－ｓｔａｇｅ ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，５３０：３１１－２４（２００９）、米国特許第７５７６２５９号、同第７６５９４４２号、または同第７２９４７５４号、およびＵＳ２００８／００７８０００Ａ１を参照のこと。
抗原の精製は、典型的には、抗体の生成に必要とされない。動物は、目的の抗原を有する細胞で免疫化され得る。次いで、脾臓細胞は、免疫化された動物から単離されてもよく、脾臓細胞は、骨髄腫細胞株と融合してハイブリドーマを産生することができる（例えば、Ｍｅｙａａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７：２８３－２９０、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：２３３－２４２、Ｐｒｅｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、上記参照、Ｋａｉｔｈａｍａｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：５１５７－５１６４を参照のこと）。
抗体は、例えば、小薬物分子、酵素、リポソーム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートされ得る。抗体は、治療、診断、キット、または他の目的に有用であり、例えば、染料、放射性同位体、酵素、または金属、例えば、金コロイドに結合した抗体を含む（例えば、Ｌｅ Ｄｏｕｓｓａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：１６９－１７５、Ｇｉｂｅｌｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３８９１－３８９８、Ｈｓｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｓｈｏｐ（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：２８０４－２８１１、Ｅｖｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：８８３－８８９を参照のこと）。
蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を含むフローサイトメトリーのための方法が利用可能である（例えば、Ｏｗｅｎｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．、Ｇｉｖａｎ（２００１）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２．ｓｕｐ．ｎｄ ｅｄ．、Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．、Ｓｈａｐｉｒｏ（２００３）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．を参照のこと）。例えば、診断試薬として使用するための、核酸プライマーおよびプローブを含む核酸、ポリペプチド、ならびに抗体の修飾に適した蛍光試薬が利用可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）。
免疫系の組織学の標準的な方法が記載されている（例えば、Ｍｕｌｌｅｒ－Ｈａｒｍｅｌｉｎｋ（ｅｄ．）（１９８６）Ｈｕｍａｎ Ｔｈｙｍｕｓ：Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．、Ｈｉａｔｔ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｏｌｏｒ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ，Ｐａ．、Ｌｏｕｉｓ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂａｓｉｃ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ：Ｔｅｘｔ ａｎｄ Ａｔｌａｓ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。
例えば、抗原断片、リーダー配列、タンパク質フォールディング、機能性ドメイン、グリコシル化部位、および配列アライメントを決定するためのソフトウェアパッケージおよびデータベースが利用可能である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ，Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（登録商標）Ｓｕｉｔｅ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＤｅＣｙｐｈｅｒ（登録商標）（ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ Ｃｏｒｐ．，Ｃｒｙｓｔａｌ Ｂａｙ，Ｎｅｖ．）、Ｍｅｎｎｅ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １６：７４１－７４２、Ｍｅｎｎｅ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｎｏｔｅ １６：７４１－７４２、Ｗｒｅｎ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｐｒｏｇｒａｍｓ Ｂｉｏｍｅｄ．６８：１７７－１８１、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９８３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３：１７－２１、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４６８３－４６９０を参照のこと）。
抗ＰｃｒＶ抗体
感染症の防止または治療のための受動的免疫療法は、通常は高力価の中和抗体を含有する回復期ヒト血清の形態で、一世紀以上にわたって使用されてきた（Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｃａｎｃｅｒ ６８：１４１５－１４２１）。今日、いくつかの精製されたモノクローナル抗体が、抗微生物薬として使用のために、現在、前臨床および臨床開発中である（Ｍａｒａｓｃｏ ｅｔ ａｌ ２００７；Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５：１４２１－１４３４）。緑膿菌ＰｃｒＶに結合する特定の抗体が報告されている（例えば、Ｆｒａｎｃｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．４０：２３２０－２３２６、およびＷＯ２００９０８８０３２を参照のこと）。
本発明者らは、本明細書において、緑膿菌ＰｃｒＶに特異的に結合し、Ｔ３ＳＳの病原性機構を調節する完全ヒト抗体およびその抗原結合断片を記載する。抗ＰｃｒＶ抗体は、高いアフィニティでＰｃｒＶに結合し得る。特定の実施形態では、抗体は、ＰｃｒＶに結合し、細胞死を防止または軽減し得る。特定の実施形態では、抗体は、宿主細胞内への細菌毒素の転移を防止し得、それにより、緑膿菌感染を阻害または中和し得る。一部の実施形態では、抗体は、宿主細胞において、Ｔ３ＳＳ孔介在性の膜透過を遮断することにより機能し得る。特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介在し得、それにより、細菌を担持する細胞の破壊を補助し得る。特定の実施形態では、抗体は、例えば、細菌の感染性を中和し得る、またはＡＤＣＣを介在し得るなど、両方の様式で作用し得る。一部の態様では、抗体は、類似した状況にあるが、未治療の対象または集団と比較して、例えば肺の細菌量などの細菌量を減少させることができる。一部の態様では、抗体は、類似した状況にあるが、未治療の対象または集団と比較して、生存率を上昇させ、または死亡率を減少させることができる。一部の実施形態では、抗体は、緑膿菌感染に罹患する対象の治療に有用であり得る。抗体は、その必要のある対象に投与されたとき、当該対象において、緑膿菌による感染を低下させ得る。これらは単独で、または細菌感染を治療するための当分野で公知の他の治療用部分またはモダリティと共に補助療法として使用し得る。さらに、特定された抗体は、感染から例えば哺乳動物などの対象を保護するために、（感染前に）予防的に使用されるか、または以前に確立された感染を改善するために、または感染と関連する少なくとも一つの症状を改善するために、（感染が確立された後に）治療的に使用することができる。
緑膿菌ＰｃｒＶタンパク質の全長アミノ酸配列は、アクセッション番号２５０３９７．１としてＧｅｎｅＢａｎｋに示されており、また配列番号７７にも示されている。短縮型ＰｃｒＶタンパク質（ＰｃｒＶ＿１３６－２５７）は、配列番号７９に示されている。両方のタンパク質は、６－ヒスチジンタグで標識することができる：全長ＰｃｒＶに対しては、配列番号７８、および短縮型ＰｃｒＶに対しては、配列番号８０。
特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体は、例えば全長ＰｃｒＶなどの一次免疫原で免疫化されたマウスから取得され、またはタンパク質の短縮型を用いて取得される。免疫原は、ＰｃｒＶタンパク質の任意の免疫原性の断片であってもよく、またはその活性断片をコードするＤＮＡであってもよい。ペプチドは、タグ付けまたはＫＬＨなどの担体分子へのコンジュゲートのために、特定の残基の付加または置換を含むように修飾されてもよい。例えば、ペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかにシステインを付加するか、またはリンカー配列を付加して、免疫のために、例えばＫＬＨとコンジュゲートするためにペプチドを調製してもよい。
本明細書に開示される特定の抗ＰｃｒＶ抗体は、インビトロアッセイまたはインビボアッセイによって判定される場合、緑膿菌に結合し、緑膿菌の活性を中和することができる。緑膿菌に結合し、緑膿菌の活性を中和する本開示抗体の能力は、本明細書に記載される、結合アッセイまたは活性アッセイを含む、当業者に公知の任意の標準的な方法を使用して測定されてもよい。
結合活性を測定するための非限定的で例示的なインビトロアッセイを、本明細書の実施例３に示す。実施例３において、全長ＰｃｒＶ（６ｈｉｓ標識、配列番号７８）または短縮型ＰｃｒＶ（６ｈｉｓ標識、配列番号８０）に対する抗ＰｃｒＶ抗体の結合アフィニティおよび解離定数を、Ｂｉａｃｏｒｅにより決定した。実施例６および７において、中和アッセイを使用して、二つの異なる緑膿菌株を中和する抗体の能力を判定した。
ＰｃｒＶに特異的な抗体は、追加標識または追加部分を含有しなくてもよく、またはＮ末端もしくはＣ末端の標識または部分を含有してもよい。一つの実施形態では、標識または部分はビオチンである。結合アッセイでは、標識（ある場合）の位置が、ペプチドが結合する表面に対するペプチドの配向を決定する場合がある。例えば、表面がアビジンで被覆される場合、Ｎ末端ビオチンを含有するペプチドは、ペプチドのＣ末端部分が表面から遠位になるように配向される。一つの実施形態では、標識は、放射性核種、蛍光色素またはＭＲＩ検出可能な標識であってもよい。ある特定の実施形態では、こうした標識抗体は、撮像アッセイを含む診断アッセイで使用され得る。
抗体の抗原結合断片
別段の具体的な記載がない限り、本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、二つの免疫グロブリン重鎖および二つの免疫グロブリン軽鎖を含む抗体分子（すなわち、「完全抗体分子」）ならびにその抗原結合断片を包含すると理解される。本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」などという用語は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に存在する、酵素的に得ることができる、合成の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。本明細書において使用する場合、抗体の「抗原結合断片」、または「抗体断片」という用語は、緑膿菌ＰｃｒＶに特異的に結合する能力を保持する抗体の一つ以上の断片を指す。抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、ＣＤＲを含有する断片、または単離されたＣＤＲを含みうる。特定の実施形態では、「抗原結合断片」という用語は、多特異性抗原結合分子のポリペプチド断片を指す。抗体の抗原結合断片は、例えば、抗体可変ドメインおよび（任意に）定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現を伴うタンパク質消化技術または組換え遺伝子操作技術などの任意の適切な標準的技術を用いて、完全抗体分子から得られうる。そのようなＤＮＡは既知であり、かつ／または例えば、市販の供給源、ＤＮＡライブラリ（例えば、ファージ抗体ライブラリを含む）から容易に入手可能であるか、もしくは合成され得る。ＤＮＡを配列決定し、化学的にまたは分子生物学技法を使用することによって操作して、例えば、一つ以上の可変ドメインおよび／もしくは定常ドメインを好適な構成に配置するか、またはコドンを導入する、システイン残基を作成する、アミノ酸を修飾、付加、もしくは欠失させるなどが可能である。
抗原結合断片の非限定例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）Ｆｄ断片、（ｉｖ）Ｆｖ断片、（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂ断片、および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））を模倣するアミノ酸残基、または拘束ＦＲ３‐ＣＤＲ３‐ＦＲ４ペプチドからなる最小認識単位が挙げられる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失した抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどの他の操作された分子もまた、本明細書で使用される場合、「抗原結合断片」という表現に包含される。
抗体の抗原結合断片は、典型的に、少なくとも一つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成のものであってもよく、概して、一つ以上のフレームワーク配列に隣接しているか、またはインフレームである、少なくとも一つのＣＤＲを含む。ＶＬドメインと結合したＶＨドメインを有する抗原結合断片において、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、任意の適当な配置で互いに対して配置され得る。例えば、可変領域は、二量体であってもよく、ＶＨ－ＶＨ、ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＬ二量体を含有してもよい。あるいは、抗体の抗原結合断片は、単量体のＶＨまたはＶＬドメインを含有してもよい。
ある特定の実施形態では、抗体の抗原結合断片は、少なくとも一つの定常ドメインに共有結合された少なくとも一つの可変ドメインを含有してもよい。本開示の抗体の抗原結合断片内に見られ得る可変ドメインおよび定常ドメインの非限定的な例示的な構成には、（ｉ）ＶＨ－ＣＨ１、（ｉｉ）ＶＨ－ＣＨ２、（ｉｉｉ）ＶＨ－ＣＨ３、（ｉｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２、（ｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｖｉ）ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｖｉｉ）ＶＨ－ＣＬ、（ｖｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１、（ｉｘ）ＶＬ－ＣＨ２、（ｘ）ＶＬ－ＣＨ３、（ｘｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２、（ｘｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｘｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ２－ＣＨ３、および（ｘｉｖ）ＶＬ－ＣＬが含まれる。上で列挙された例示的な構成のいずれかを含む、可変ドメインおよび定常ドメインのいずれの構成において、可変ドメインおよび定常ドメインは、互いに直接結合されてもよいか、または完全もしくは部分ヒンジまたはリンカー領域により結合されてもよい。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子において隣接する可変ドメインおよび／または定常ドメイン間に可動性または半可動性の結合をもたらす、少なくとも二つ（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０またはそれ以上）のアミノ酸からなってもよい。さらに、本開示の抗体の抗原結合断片は、互いとの、および／または一つ以上のモノマーＶＨもしくはＶＬドメインとの（例えば、ジスルフィド結合による）非共有会合で、上に列挙される可変ドメイン構成および定常ドメイン構成のいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含み得る。
完全抗体分子と同様に、抗原結合断片は一特異性または多特異性（例えば、二特異性）であってもよい。抗体の多特異性抗原結合断片は、典型的には、少なくとも二つの異なる可変ドメインを含み、各々の可変ドメインは、別個の抗原、または同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができる。本明細書に開示される二特異性抗体の形式の例をはじめとする、任意の多特異性抗体の形式を、当分野で利用可能な通常の技術を使用して、本開示抗体の抗原結合断片を背景とした使用に適合してもよい。
ヒト抗体の調製
トランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を生成するための方法は、当該技術分野で知られている。緑膿菌ＰｃｒＶに特異的に結合するヒト抗体を作製するために、本開示の状況下で任意のそうした公知の方法が使用され得る。以下のいずれか一つを含む免疫原を使用して、ＰｃｒＶに対する抗体を生成することができる。特定の実施形態では、本開示の抗体は、例えば、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿２５０３９７．１（配列番号７７）などの全長ＰｃｒＶ、または例えば、ＰｃｒＶ＿１３６－２５７（配列番号７９）などの短縮型ＰｃｒＶタンパク質で免疫化されたマウスから取得される。あるいは、ＰｃｒＶタンパク質またはその断片は、標準的な生化学技法を使用して産生され、および改変され、免疫原として使用され得る。一つの実施形態では、免疫原は、組換えＰｃｒＶタンパク質またはその断片である。特定の実施形態では、免疫原は、市販のＰｃｒＶタンパク質であってもよい。特定の実施形態では、一回以上のブースター注射が投与されてもよい。特定の実施形態では、ブースター注射は、一つ以上以上の市販のＰｃｒＶタンパク質を含んでもよい。特定の実施形態では、免疫原は、大腸菌で発現された組み換えＰｃｒＶタンパク質、または例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの任意の他の真核生物細胞または哺乳動物細胞で発現された組み換えＰｃｒＶタンパク質であってもよい。
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術（例えば、ＵＳ６，５９６，５４１、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）を参照）またはモノクローナル抗体を生成するための任意の他の公知の方法を使用して、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する、ＰｃｒＶに対する高アフィニティキメラ抗体が、最初に単離される。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術は、マウスが抗原刺激に応答してヒト可変領域およびマウス定常領域を含む抗体を産生するように、内在性マウス定常領域座に操作可能に結合されたヒト重鎖可変領域およびヒト軽鎖可変領域を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスを生成することを伴う。抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡが単離され、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域をコードするＤＮＡに作動可能に結合される。次に、完全ヒト抗体を発現することができる細胞においてＤＮＡが発現される。
概して、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスに対象の抗原を負荷し、抗体を発現するマウスからリンパ細胞（Ｂ細胞など）が回収される。リンパ細胞を骨髄腫細胞株と融合させて不死化ハイブリドーマ細胞株を調製し得、対象の抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定するためにそのようなハイブリドーマ細胞株が、スクリーニングおよび選択される。重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡが単離され、重鎖および軽鎖の望ましいアイソタイプ定常領域に結合されてもよい。そのような抗体タンパク質は、ＣＨＯ細胞のような細胞において産生されてもよい。あるいは、抗原特異的キメラ抗体または軽鎖および重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡは、抗原特異的リンパ球から直接単離されてもよい。
まず、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する高アフィニティキメラ抗体が、単離される。以下の実験セクションと同様に、抗体を、アフィニティ、選択性、エピトープなどを含む望ましい特徴について特徴付け、選択する。マウス定常領域は、所望のヒト定常領域で置換され、完全ヒト抗体、例えば、野生型もしくは改変されたＩｇＧ１またはＩｇＧ４が生成される。選択された定常領域は、特定の用途に応じ変動し得る一方、高アフィニティ抗原結合および標的特異性特徴は、可変領域に存在する。
生物学的等価物
本明細書に開示される抗ＰｃｒＶ抗体および抗体断片は、記載される抗体のアミノ酸配列とは異なるが、ＰｃｒＶに結合する能力は保持しているアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。このようなバリアント抗体および抗体断片は、親配列と比較してアミノ酸の一つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、記載された抗体の生物学的活性とは本質的に等価である生物学的活性を呈する。同様に、本開示の抗体をコードするＤＮＡ配列は、開示される配列と比較して一つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、本明細書に開示される抗体または抗体断片と本質的に生物学的に均等である抗体または抗体断片をコードする配列を包含する。
二つの抗原結合タンパク質または抗体が、薬学的な均等物または薬学的な代替物であり、類似した実験条件下で、単回投与または複数回投与のいずれかで同モル投与量で投与されたときに、その吸収の速度および範囲が有意な差を示さない場合、それら二つの抗原結合タンパク質または抗体は生物学的に均等とみなされる。いくつかの抗体で、吸収の範囲は同等であるが、吸収の速度は同等ではなく、しかし吸収速度における当該差異が意図的であり、ラベリングに反映されており、例えば慢性的使用での有効身体薬物濃度の獲得に必須ではなく、試験された特定の医薬品にとって医学的に重要ではないとみなされるために、それら抗体が生物学的に均等であるとみなされ得る場合、それら抗体は均等物、または薬学的代替物とみなされる。
一つの実施形態では、二つの抗原結合タンパク質は、その安全性、純度または有効性において臨床的に意義のある差異が無ければ、生物学的に均等である。
一つの実施形態では、患者における参照産物と生物学的産物の間の一回以上の交換が、当該交換が行われなかった場合の継続治療と比較して、免疫原性における臨床的に意義のある変化をはじめとする有害作用リスクの予測される上昇、または有効性の消失を伴わずに行われ得た場合、二つの抗原結合タンパク質は、生物学的に均等である。
一つの実施形態では、二つの抗原結合タンパク質は、使用条件に関して、当該機序で判明している程度まで共通の作用機序により両方ともが作用する場合、生物学的に均等である。
生物学的に均等であることは、インビボおよびインビトロの方法により実証され得る。生物学的に均等であることの測定方法としては例えば、（ａ）時間の関数として血液、血漿、血清または他の生物学的液体中で抗体またはその代謝物の濃度が測定される、ヒトまたは他の哺乳動物におけるインビボ検査、（ｂ）ヒトのインビボ生体利用効率データと相関し、このデータを合理的に予測するインビトロ検査、（ｃ）抗体（またはその標的）の適切な急性薬理学的作用が時間関数として計測される、ヒトまたは他の哺乳動物におけるインビボ検査、および（ｄ）抗体の安全性、有効性または生体利用効率もしくは生物学的均等性を立証する、適切に管理された臨床試験が挙げられる。
本発明に提供される抗体の生物学的に均等なバリアントは、例えば、残基もしくは配列の様々な置換を行うこと、または生物活性に必要とされない末端もしくは内部の残基または配列を欠失させることによって構築されてもよい。例えば、生物活性に必須ではないシステイン残基は、再生の際の不必要な、または不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するために欠失されてもよく、または他のアミノ酸で置換されてもよい。他の状況では、生物学的に均等の抗体には、抗体のグリコシル化特性を改変するアミノ酸変化、例えば、グリコシル化を消滅または除去する変異を含む、抗体バリアントを含んでもよい。
Ｆｃバリアントを含む抗ＰｃｒＶ抗体
特定の実施形態によると、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで、ＦｃＲｎ受容体への抗体結合を強化する、または減少させる一つ以上の変異を含むＦｃドメインを含む、抗ＰｃｒＶ抗体が提供される。例えば、本開示は、ＦｃドメインのＣＨ２領域またはＣＨ３領域に変異を含む抗ＰｃｒＶ抗体が含まれ、この場合において当該変異は、酸性環境において（例えば、ｐＨが約５．５～約６．０の範囲のエンドソームにおいて）ＦｃＲｎに対するＦｃドメインのアフィニティを増加させる。そのような変異によって、動物に投与されたときの抗体の血清半減期が延長され得る。このようなＦｃ改変の非限定的な例としては例えば、２５０位（例えば、ＥまたはＱ）、２５０位および４２８位（例えば、ＬまたはＦ）、２５２位（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）における改変、または４２８位および／もしくは４３３位（例えば、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）および／もしくは４３４位（例えば、Ａ、Ｗ、Ｈ、Ｆ、またはＹ［Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｗ、Ｎ４３４Ｈ、Ｎ４３４Ｆ、またはＮ４３４Ｙ］）における改変、あるいは２５０位および／もしくは４２８位における改変、あるいは３０７位もしくは３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、および４３４位における改変が含まれる。一つの実施形態では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変、４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変、４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４（例えば、４３４Ｙ）の改変、２５２、２５４、および２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）の改変、２５０Ｑおよび４２８Ｌの改変（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）、ならびに３０７および／または３０８の改変（例えば、３０８Ｆおよび／または３０８Ｐ）を含む。さらに別の実施形態では、改変は、２６５Ａ（例えば、Ｄ２６５Ａ）および／または２９７Ａ（例えば、Ｎ２９７Ａ）の改変を含む。
例えば本明細書において、以下からなる群から選択される変異の一つ以上のペアまたは群を含むＦｃドメインを含む、抗ＰｃｒＶ抗体が提供される：２５０Ｑおよび２４８Ｌ（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ２４８Ｌ）、２５２Ｙ、２５４Ｔおよび２５６Ｅ（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ）、４２８Ｌおよび４３４Ｓ（例えば、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ）、２５７Ｉおよび３１１Ｉ（例えば、Ｐ２５７ＩおよびＱ３１１Ｉ）、２５７Ｉおよび４３４Ｈ（例えば、Ｐ２５７ＩおよびＮ４３４Ｈ）、３７６Ｖおよび４３４Ｈ（例えば、Ｄ３７６ＶおよびＮ４３４Ｈ）、３０７Ａ、３８０Ａおよび４３４Ａ（例えば、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０ＡおよびＮ４３４Ａ）、ならびに４３３Ｋおよび４３４Ｆ（例えば、Ｈ４３３ＫおよびＮ４３４Ｆ）。前述のＦｃドメイン変異、および本明細書に開示される抗体可変ドメイン内の他の変異の全ての可能な組み合わせが、本開示の範囲内であることが企図される。
本開示は、キメラ重鎖定常（ＣＨ）領域を含む抗ＰｃｒＶ抗体を含み、この場合において当該キメラＣＨ領域は、複数の免疫グロブリンアイソタイプのＣＨ領域に由来するセグメントを含む。例えば、本開示の抗体は、ヒトＩｇＧ１分子、ヒトＩｇＧ２分子またはヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ３ドメインの一部または全部と組み合わせて、ヒトＩｇＧ１分子、ヒトＩｇＧ２分子またはヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ２ドメインの一部または全部を含むキメラＣＨ領域を含み得る。特定の実施形態によると、本発明に提供される抗体は、キメラヒンジ領域を有するキメラＣＨ領域を含む。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「下部ヒンジ」配列（ＥＵ番号付けによる位置２２８～２３６のアミノ酸残基）と組み合わされた、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「上部ヒンジ」アミノ酸配列（ＥＵ番号付けによる位置２１６～２２７のアミノ酸残基）を含んでもよい。特定の実施形態によると、キメラヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１上部ヒンジまたはヒトＩｇＧ４上部ヒンジに由来するアミノ酸残基およびヒトＩｇＧ２下部ヒンジに由来するアミノ酸残基を含む。本明細書において説明されるキメラＣＨ領域を含む抗体は、特定の実施形態では、抗体の治療特性または薬物動態学的特性に負に影響を与えることなく修飾Ｆｃエフェクター機能を呈する。（例えば、２０１３年２月１日に出願された米国仮特許出願６１／７５９，５７８を参照のこと）。
抗体の生物学的特徴
概して、本開示の抗体は、ＰｃｒＶに結合することによって機能する。例えば、本開示は、本明細書に記載されるアッセイフォーマットを使用し、表面プラズモン共鳴により測定された場合、１０－７未満のＫＤで、（例えば、２５℃または３７℃で）ＰｃｒＶまたはＰｃｒＶ＿１３６－２５７に結合する抗体および抗体の抗原結合断片を含む。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＰｃｒＶに、例えば、本明細書に記載のアッセイフォーマット、または実質的に類似したアッセイを使用して、表面プラズモン共鳴によって測定した場合、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約５００ｐＭ未満、２５０ｐＭ未満、または１００ｐＭ未満のＫＤで結合する。
本開示はさらに、例えば本明細書に規定されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似したアッセイを使用して、２５℃での表面プラズモン共鳴により測定された場合に、約１０分を超える解離半減期（ｔ１／２）で、または３７℃での表面プラズモン共鳴により測定された場合に、約１分を超える解離半減期（ｔ１／２）で、ＰｃｒＶに結合する抗体およびその抗原結合断片も含む。特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片は、例えば本明細書に規定されるアッセイフォーマット（例えば、ｍＡｂ捕捉フォーマットまたは抗原捕捉フォーマット）を使用して、または実質的に類似したアッセイを使用して、２５℃または３７℃での表面プラズモン共鳴により測定された場合に、約１分を超える、約１０分を超える、約３０分を超える、約６０分を超える、約１００分を超える、約２００分を超える、約３００分を超える、約４００分を超える、約５００分を超える、約６００分を超える、約７００分を超える、約８００分を超える、約９００分を超える、または約１０００分を超えるｔ１／２で、ＰｃｒＶに結合する。
また本明細書において、実施例６に示されるように、例えばＡ５４９細胞において、緑膿菌ＰｃｒＶ介在性の毒性を中和する抗体またはその抗原結合断片も含まれる。一部の実施形態では、抗体は、約１０－１１Ｍ～約１０－７Ｍの範囲のＩＣ５０で緑膿菌６０７７株に対する中和能力を示す。一部の実施形態では、抗体は、約１０－９Ｍ～約１０－７Ｍの範囲のＩＣ５０で緑膿菌ＡＴＣＣ７００８８８株に対する中和能力を示す。本明細書に提供される抗体はまた、実施例７に示されるように、緑膿菌ＰｃｒＶ介在性のＲＢＣ溶血を中和する。一部の実施形態では、抗体は、約１０－１０Ｍ～約１０－７Ｍの範囲のＩＣ５０で６０７７株に対する中和能力を示す。一部の実施形態では、抗体は、約１０－１０Ｍ～約１０－８Ｍの範囲のＩＣ５０でＡＴＣＣ７００８８８株に対する中和能力を示す。さらに本明細書に提供される抗体は、実施例４に示されるように、ＰｃｒＶに結合する他の抗体と交差競合する。
また本明細書において、個々の死亡を防止する、または集団の死亡率を低下させる抗体も含まれる。一部の実施形態では、抗体は、予防的に投与することができる。一部の実施形態では、抗体は、治療的に投与することができる。一部の実施形態では、抗体は、５ｍｇ／ｋｇで投与された場合、実施例８に示されるように、肺炎のマウスモデルにおいて、１００％の改善生存率を示す。一部の実施形態では、抗体は、実施例９に示されるように、例えば１ｍｇ／ｋｇ、または０．２ｍｇ／ｋｇ、またはさらには０．０４ｍｇ／ｋｇなどの低用量であっても、生存率の改善を示す。
また本明細書において、対象または集団における肺の細菌量などの細菌量を減少させる抗体も含まれる。一部の実施形態では、抗体は、予防的に投与することができる。一部の実施形態では、抗体は、治療的に投与することができる。一部の実施形態では、抗体は、０．１もしくは０．２ｍｇ／ｋｇ、または２５ｍｇ／ｋｇのいずれかで投与された場合、実施例１０および実施例１１に示されるように、肺炎のマウスモデルにおいて、未治療の対象よりも３～４ｌｏｇ多く細菌量を減少させる。
一つの実施形態では、本明細書に提供される抗体は、以下の特徴のうちの一つ以上を有し得る：（ａ）配列番号２、１８、３４および５０からなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列のうちのいずれか一つの内に含有される三つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）、ならびに配列番号１０、２６、４２および５８からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列のいずれか一つの内に含有される三つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）、を含む、（ａ）配列番号２、１８、３４および５０からなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列のうちのいずれか一つの内に含有される三つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）、ならびに配列番号１０、２６、４２および５８からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列のいずれか一つの内に含有される三つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）、を含む、（ｂ）完全ヒトモノクローナル抗体である、（ｃ）２５℃での表面プラズモン共鳴アッセイにより測定された場合に、１０－８未満の解離定数（ＫＤ）で全長ＰｃｒＶに結合する、（ｄ）３７℃での表面プラズモン共鳴アッセイにより測定された場合に、１０－８未満の解離定数（ＫＤ）で全長ＰｃｒＶに結合する、（ｅ）細胞毒性アッセイにおいて、約１０－１１Ｍ～約１０－８Ｍの範囲のＩＣ５０で緑膿菌６０７７株の中和を示す、（ｆ）細胞毒性アッセイにおいて、約１０－９Ｍ～約１０－７Ｍの範囲のＩＣ５０で緑膿菌ＡＴＣＣ７００８８８株の中和を示す、（ｇ）溶血アッセイにおいて、約１０－１０Ｍ～約１０－６Ｍの範囲のＩＣ５０で、緑膿菌６０７７株の中和を示す、（ｈ）溶血アッセイにおいて、約１０－１０Ｍ～約１０－７Ｍの範囲のＩＣ５０で、緑膿菌ＡＴＣＣ７００８８８株の中和を示す、（ｉ）急性肺炎モデルにおいて、未治療マウスと比較し、５ｍｇ／ｋｇで予防的に治療されたマウスにおいて、緑膿菌６２０６株または６０７７株による死亡率が減少する、（ｊ）急性肺炎モデルにおいて、未治療マウスと比較し、１．０、０．２または０．０４ｍｇ／ｋｇで予防的に治療されたマウスにおいて、緑膿菌６２０６株または６０７７株による死亡率が減少する、（ｋ）急性肺炎モデルにおいて、未治療マウスと比較し、０．１ｍｇ／ｋｇまたは０．２ｍｇ／ｋｇで予防的に治療されたマウスにおいて、緑膿菌６２０６株の肺細菌量が減少する、（ｌ）急性肺炎モデルにおいて、未治療マウスと比較し、２５ｍｇ／ｋｇで予防的に治療されたマウスにおいて、緑膿菌ＰＡ０１株の肺細菌量が減少する、および／または（ｍ）参照抗体と交差競合する、この場合において当該参照抗体は、表１のＨＣＶＲアミノ酸配列およびＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかからなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）アミノ酸配列および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列を含む。
関連の実施形態では、本明細書に提供される抗体またはその抗原結合断片は、以下の特徴のうちの一つ以上を有し得る：（ｎ）約１０－８Ｍ未満のＥＣ５０で、全長ＰｃｒＶ（配列番号７７）に結合する、（ｏ）約１０－８Ｍ未満のＥＣ５０で、ＰｃｒＶの１３６－２３３（配列番号８１）に結合する、（ｐ）（ｉ）配列番号７８のおよそ１５０位～およそ１７０位の範囲のアミノ酸残基および（ｉｉ）配列番号７８のおよそ１５５位～およそ１７０位の範囲のアミノ酸残基、からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列と相互作用する、および／または（ｑ）配列番号８５および配列番号８６からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列と相互作用する。
本明細書に提供される抗体は、前述の生物学的特徴、またはそれらの任意の組み合わせのうちの一つ以上を保有し得る。抗体の特性の一部を以下に要約する。抗体のその他の生物学的特徴は、本明細書の実施例を含む本開示の検討から当業者に明らかであろう。
エピトープマッピングおよび関連技術
本明細書において、緑膿菌ＰｃｒＶタンパク質の中に存在する一つ以上のアミノ酸と相互作用する抗ＰｃｒＶ抗体が提供される。抗体が結合するエピトープは、ＰｃｒＶタンパク質の中に位置する三つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上）のアミノ酸の単一の連続配列からなり得る（例えば、ドメイン内の直線状エピトープ）。あるいはエピトープは、ＰｃｒＶタンパク質の中に位置する複数の非連続アミノ酸（またはアミノ酸配列）からなり得る（例えば、立体構造エピトープ）。例示的には、本明細書に提供される抗ＰｃｒＶ抗体またはその抗原結合断片は、ＰｃｒＶ １３６－２３３（配列番号８１）に結合することができ、配列番号７８の約１５０位～約１７０位の範囲のアミノ酸残基と相互作用することができ、配列番号７８の約１５５位～約１７０位の範囲のアミノ酸残基と相互作用することができ、ならびに／または配列番号８５および配列番号８６からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列と相互作用することができる。
当業者にとって既知の様々な技法を使用して、抗体が、ポリペプチドまたはタンパク質内の「一つ以上のアミノ酸と相互作用する」かどうかを決定することができる。例示的な技法としては、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）に記載されたものなどの常套的な交差遮断アッセイが挙げられる。他の方法としては、アラニンスキャニング変異解析、ペプチドブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：４４３－６３）、ペプチド切断解析結晶学的研究およびＮＭＲ分析が挙げられる。さらに、抗原のエピトープ切り出し、エピトープ抽出および化学修飾のような方法を用いることができる（Ｔｏｍｅｒ（２０００年）Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．９：４８７～４９６）。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために使用することができる別の方法は、質量分析により検出される水素／重水素交換である。一般的な用語において、水素／重水素交換方法は、対象タンパク質を重水素で標識すること、続いて重水素で標識したタンパク質に抗体を結合させることを含む。次に、タンパク質／抗体複合体は、水に移され、抗体複合体によって保護されるアミノ酸内の交換可能なプロトンは、界面の一部ではないアミノ酸内の交換可能なプロトンよりも遅い速度で、重水素から水素への逆交換を受ける。結果として、タンパク質／抗体界面の一部を形成するアミノ酸は、重水素を保持し得るため、界面に含まれないアミノ酸と比較して、比較的高い質量を呈する。抗体の解離後、標的タンパク質はプロテアーゼ切断および質量分析解析を受け、それと抗体が相互作用する特異的なアミノ酸に対応する重水素標識残基を明らかにする。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７：２５２－２５９、Ｅｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ－２６５Ａを参照されたい。
「エピトープ」という用語は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位を指す。Ｂ細胞エピトープは、連続的なアミノ酸から形成されることができ、およびタンパク質の三次元フォールディングによって並置される非連続的なアミノ酸からも形成されることができる。連続的なアミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒へ暴露されても保持されるのに対して、三次元フォールディングにより形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒を用いた処理によって失われる。典型的にはエピトープは、固有の空間構造にある少なくとも３個、より一般的には少なくとも５個、または８～１０個のアミノ酸を含む。
抗原構造に基づく抗体プロファイリング（ＡＳＡＰ：Ａｎｔｉｇｅｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）としても公知の改変補助プロファイリング（ＭＡＰ：Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ－Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）は、化学的または酵素的に改変された抗原表面に対する各抗体の結合プロファイルの類似性に従って、同一抗原に指向される多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を分類する方法である（ＵＳ２００４／０１０１９２０を参照されたい）。各カテゴリーは、別のカテゴリーによって表されるエピトープと明瞭に異なるか、または部分的に重複する固有エピトープを反映し得る。本技術は、遺伝的に同一の抗体の迅速なフィルタリングを可能にし、その結果、特性評価は遺伝的に異なる抗体に焦点を当てることができる。ハイブリドーマスクリーニングに適用する場合、ＭＡＰは、所望の特性を有するｍＡｂを産生する希少なハイブリドーマクローンの識別を容易にしうる。ＭＡＰを使用して、抗体を、異なるエピトープに結合する抗体のグループに分類することができる。
特定の実施形態では、抗ＰｃｒＶ抗体またはその抗原結合断片は、天然形態または組換えによって産生された、ＰｃｒＶタンパク質中に例示される領域のうちのいずれか一つ以上の中のエピトープ、またはその断片に結合する。
本開示は、同じエピトープ、または当該エピトープの一部分に結合する、抗ＰｃｒＶ抗体を含む。同様に本開示はまた、本明細書に記載の特定の例示的な抗体のいずれかと、ＰｃｒＶタンパク質またはその断片への結合に関して競合する抗ＰｃｒＶ抗体も含む。例えば本開示は、表１および表２に記載される抗体から取得された一つ以上の抗体と、ＰｃｒＶへの結合に関して交差競合する抗ＰｃｒＶ抗体を含む。
当分野において公知の通常の方法を使用することによって、抗体が、参照抗ＰｃｒＶ抗体と同じエピトープに結合するか、または結合を競合するかを簡単に判定することができる。例えば、被験抗体が、本開示の参照抗ＰｃｒＶ抗体と同じエピトープに結合するかを判定するために、当該参照抗体を、飽和条件下でＰｃｒＶタンパク質またはペプチドに結合させる。次に、ＰｃｒＶタンパク質に結合する被験抗体の能力が評価される。参照抗ＰｃｒＶ抗体との飽和結合後に被験抗体がＰｃｒＶに結合することができる場合、当該被験抗体は参照抗ＰｃｒＶ抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。一方で、参照抗ＰｃｒＶ抗体との飽和結合後に被験抗体がＰｃｒＶタンパク質に結合できない場合、当該被験抗体は、本明細書に提供される参照抗ＰｃｒＶ抗体により結合されるエピトープと同じエピトープに結合する可能性がある。
抗体が、参照抗ＰｃｒＶ抗体と結合に関して競合するかを判定するために、以下の二つの方向性で上述の結合技法が実施される：第一の方向性では、参照抗体は、飽和条件下でＰｃｒＶタンパク質に結合され、その後、ＰｃｒＶタンパク質への被験抗体の結合が評価される。第二の方向性では、被験抗体が、飽和条件下でＰｃｒＶタンパク質に結合され、その後、ＰｃｒＶタンパク質への参照抗体の結合が評価される。両方の方向性で、第一の（飽和）抗体のみがＰｃｒＶタンパク質に結合することができた場合、被験抗体と参照抗体は、ＰｃｒＶへの結合に関して競合すると結論付けられる。当分野の当業者によって理解されるように、参照抗体への結合について競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同一のエピトープに結合しなくてよく、重複したエピトープまたは隣接するエピトープに結合することによって参照抗体の結合を立体的に妨害する場合もある。
二つの抗体は、それぞれが他方の抗原への結合を競合的に阻害（妨害）する場合、同じまたは重複したエピトープに結合する。すなわち、１、５、１０、２０、または１００倍の過剰な一方の抗体は、競合結合アッセイで測定する場合、他方の結合を、少なくとも５０％であるが好ましくは７５％、９０％またはさらに９９％阻害する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９０ ５０：１４９５－１５０２を参照されたい）。あるいは、一方の抗体の結合を低減または除去する抗原中の本質的に全てのアミノ酸変異が、他方の抗体の結合を低減または除去する場合、二つの抗体は同一エピトープを有する。一方の抗体の結合を低減または除去するいくつかのアミノ酸変異が、他方の抗体の結合を低減または除去する場合、二つの抗体は重複するエピトープを有する。
追加の日常的な実験（例えば、ペプチド変異および結合分析）を実施して、観察された試験抗体の結合の欠落が実際に、参照抗体と同じエピトープに結合することが原因であるのか、または立体遮断（または別の現象）が、観察された結合の欠落の原因であるのかを確認することができる。この種類の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、または当該技術分野で利用可能な任意の他の定量的または定性的抗体結合アッセイを使用して実施することができる。
免疫結合体
本開示は、例えば緑膿菌感染を治療するための抗生物質などの治療部分に結合されたヒト抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体（免疫結合体）を提供する。本明細書で使用される場合、「免疫結合体」という用語は、放射性薬剤、サイトカイン、インターフェロン、標的もしくはレポーター部分、酵素、ペプチドもしくはタンパク質、または治療剤と化学的または生物学的に連結する抗体を指す。抗体は、その標的に結合できる限り、当該分子に沿った任意の場所で、放射性薬剤、サイトカイン、インターフェロン、標的またはレポーター部分、酵素、ペプチドまたは治療剤に連結されてもよい。免疫結合体の例には、抗体薬物結合体および抗体－毒素融合タンパク質が含まれる。一つの実施形態では、剤は、緑膿菌に対する第二の異なる抗体であってもよい。特定の実施形態では、抗体は、感染細胞に特異的な剤と結合されてもよい。抗ＰｃｒＶ抗体に結合され得る治療部分のタイプは、治療される状態、および達成される望ましい治療効果を考慮する。免疫結合体を形成するための適切な剤の例は、当分野に公知である；例えば、ＷＯ０５／１０３０８１を参照のこと。
多特異性抗体
本明細書に提供される抗体は、一特異性、二特異性、または多特異性であってもよい。多特異性抗体は、一つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的であってもよく、または複数の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有してもよい。例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０－６９、Ｋｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８－２４４を参照されたい。
本明細書に提供される多特異性抗原結合分子またはそのバリアントはいずれも、当業者に公知であるように、標準的な分子生物学的手法（例えば、組み換えＤＮＡ法およびタンパク質発現技術）を使用して構築されてもよい。
一部の実施形態では、緑膿菌特異的抗体は、緑膿菌ＰｃｒＶの別個のドメインに結合する可変領域が連結されて、単一結合分子内に二重抗原特異性を与える、二特異性フォーマット（二特異性）で生成される。適切に設計された二特異性体は、特異性および結合アビディティの両方を増大させることにより、Ｔ３ＳＳ全体の阻害有効性を強化し得る。個別ドメインに対する特異性を有する可変領域、または一つのドメイン内の異なる領域に結合できる可変領域は、構造的スキャホールド上でペア形成され、それにより、各領域が別個のエピトープ、または一つのドメイン内の異なる領域に同時に結合することが可能となる。一例では、二特異性のために、一つのドメインに対する特異性を有する結合由来の重鎖可変領域（ＶＨ）を、第二のドメインに対する特異性を有する一連の結合由来の軽鎖可変領域（ＶＬ）で組換えて、元のＶＨとそのＶＨの元の特異性を妨げることなくペアリングさせることが可能な非同族ＶＬパートナーを特定する。このように、単一のＶＬセグメント（例えば、ＶＬ１）を、二つの異なるＶＨドメイン（例えば、ＶＨ１およびＶＨ２）と組み合わせて、二つの結合「アーム」（ＶＨ１－ＶＬ１およびＶＨ２－ＶＬ１）からなる二特異性体を生成することができる。単一のＶＬセグメントの使用は、二特異性体を生成するために使用されるクローニング、発現、および精製プロセスにおいて、系の複雑さを低減し、それによって単純化し、効率を向上させる（例えば、ＵＳＳＮ１３／０２２７５９およびＵＳ２０１０／０３３１５２７を参照されたい）。
あるいは限定されないが、例えば第二の異なる抗緑膿菌抗体などの、複数のドメインおよび第二の標的に結合する抗体は、本明細書に記載される方法、または当業者に公知の他の技法を使用して、二特異性のフォーマットで調製されてもよい。別個の領域に結合する抗体可変領域は、例えば、緑膿菌上の関連部位に結合する可変領域と連結して、単一結合分子内に二重抗原特異性を付与することができる。適切に設計された二特異性のこの性質は、二重の機能を果たす。一つの緑膿菌抗原に対する特異性を有する可変領域が、ＰｃｒＶに対する特異性を有する可変領域と組合わされて、構造的スキャホールド上でペア形成され、それにより各可変領域が別々の抗原に結合することが可能になる。
本開示の状況下で使用され得る例示的な二特異性抗体のフォーマットは、第一の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメインと第二のＩｇ ＣＨ３ドメインの使用を含み、この場合において当該第一および第二のＩｇ ＣＨ３ドメインは、少なくとも一つのアミノ酸によって互いに異なり、そしてこの場合において、少なくとも一つのアミノ酸の差異は、アミノ酸の差異を欠く二特異性抗体と比較して、二特異性抗体のプロテインＡへの結合を低下させる。一つの実施形態では、第一のＩｇ ＣＨ３ドメインはプロテインＡに結合し、第二のＩｇ ＣＨ３ドメインは、例えばＨ９５Ｒ（ＩＭＧＴエクソンナンバリングによる；ＥＵナンバリングではＨ４３５Ｒ）改変などのプロテインＡ結合を減少または消失させる変異を含有する。第二のＣＨ３はさらに、Ｙ９６Ｆ改変（ＩＭＧＴによる、ＥＵではＹ４３６Ｆ）を含んでもよい。第二のＣＨ３に見られ得るさらなる改変としては、以下が挙げられる：ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる、ＥＵではＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）、ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ、ＥＵではＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）、ならびにＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる、ＥＵではＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）。上述の二特異性抗体フォーマットの変形は、本開示の範囲内で意図されている。
本開示の状況下で使用され得る他の例示的な二特異性のフォーマットとしては限定されないが、例えば、ｓｃＦｖベースまたはダイアボディの二特異性フォーマット（ｄｉａｂｏｄｙ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒｍａｔ）、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合体、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）－Ｉｇ、クアドローマ（Ｑｕａｄｒｏｍａ）、ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）、共通軽鎖（例えば、ノブ・イントゥ・ホールを有する共通軽鎖など）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ボディ、ロイシンジッパー、デュオボディ（Ｄｕｏｂｏｄｙ）、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）－ＩｇＧ、およびＭａｂ２二特異性フォーマット（前述のフォーマットのレビューに関しては、例えばＫｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１２、ｍＡｂｓ ４：６、１～１１、および当該文献内に引用される参考文献を参照のこと）が挙げられる。二特異性抗体はさらに、ペプチド／核酸結合を使用して構築されてもよい。例えば直交的な化学反応性を有する非天然アミノ酸を使用して、部位特異的抗体－オリゴヌクレオチド結合体を作製し、次いでこれを規定の組成、結合価および構造を有する多量体性複合体へと自己アセンブリさせる。（例えば、Ｋａｚａｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．［Ｅｐｕｂ：Ｄｅｃ．４，２０１２］を参照されたい）。
治療的投与および製剤
本開示は、本明細書に提供される抗ＰｃｒＶ抗体またはその抗原結合断片を含む治療用組成物を提供する。本開示による治療用組成物は、移送、送達、忍容性などの改善をもたらすために製剤に組み込まれる、適切な担体、賦形剤、および他の剤と共に投与される。数多くの適切な製剤が、すべての薬剤師に既知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡにおいて見出され得る。これらの製剤としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、小胞を含有する脂質（カチオン性またはアニオン性）（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）など）、ＤＮＡ共役体、無水吸収ペースト、水中油および油中水乳剤、乳剤カルボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、ならびにカルボワックスを含有する半固体混合物が挙げられる。Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８－３１１も参照されたい。
抗体の用量は、投与されることになっている対象の年齢およびサイズ、標的疾患、容態、投与経路などによって変わり得る。本開示の抗体が、成人患者における疾患または障害の治療のために使用される場合、または当該疾患の予防に使用される場合、通常、約０．０１～約６０ｍｇ／体重ｋｇ、例えば約０．０４ｍｇ／体重ｋｇ、約０．２ｍｇ／体重ｋｇ、約２．０ｍｇ／体重ｋｇ、約５ｍｇ／体重ｋｇ、約１０ｍｇ／体重ｋｇ、約１５ｍｇ／体重ｋｇ、約２０ｍｇ／体重ｋｇ、約２５ｍｇ／体重ｋｇ、約３０ｍｇ／体重ｋｇ、約０．０４ ｍｇ／ｋｇ～約２．０ｍｇ／体重ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ～約６０ｍｇ／体重ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／体重ｋｇ、または約２０ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／体重ｋｇの単回投与量で、抗体を投与することが有益である。状態の重症度に応じて、治療の頻度および期間を調整できる。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、少なくとも約０．１ｍｇ～約８００ｍｇ、約１～約５００ｍｇ、約５～約３００ｍｇ、または約１０～約２００ｍｇ、～約１００ｍｇ、または～約５０ｍｇの初回用量として投与されうる。特定の実施形態では、初回投与量の後に、初回投与量とおよそ同量か、または初回投与量より少ない投与量であり得る量の抗体またはその抗原結合断片の第二の投与量または複数回のその後の投与量の投与が続いてもよく、この場合において、その後の投与量は、少なくとも６時間～２４時間、少なくとも１日～３日；少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間；少なくとも４週間；少なくとも５週間；少なくとも６週間；少なくとも７週間；少なくとも８週間；少なくとも９週間；少なくとも１０週間；少なくとも１２週間；または少なくとも１４週間の間をあける。
様々な送達系が公知であり、本明細書に提供される医薬組成物の投与に使用することができ、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルへの封入、変異ウイルスを発現することができる組換え細胞、受容体介在性エンドサイトーシスなどが挙げられる（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９－４４３２を参照のこと）。導入方法には、皮内経路、経皮経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路および経口経路が含まれるが、これらに限定されない。組成物は、任意の好都合な経路によって、例えば、注入もしくはボーラス注射によって、上皮もしくは粘膜皮膚内層（ｌｉｎｉｎｇｓ）（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を介した吸収によって投与することができ、かつ他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与することができる。投与は全身性または局所性であってもよい。医薬組成物は、ベシクル、特にリポソームで送達され得る（例えば、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３を参照されたい）。
本明細書に提供される抗体を送達するためのナノ粒子の使用も予期される。抗体とコンジュゲートしたナノ粒子は、治療用途および診断用途の両方で使用され得る。抗体とコンジュゲートしたナノ粒子、および調製方法および使用方法は、参照により本明細書に組み込まれる、Ａｒｒｕｅｂｏ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．２００９（“Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ” ｉｎ Ｊ．Ｎａｎｏｍａｔ．Ｖｏｌｕｍｅ ２００９，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４３９３８９，２４ ｐａｇｅｓ，ｄｏｉ：１０．１１５５／２００９／４３９３８９）に詳細に記載されている。感染細胞を標的にするために、ナノ粒子が開発され、医薬組成物中に含有される抗体にコンジュゲートされてもよい。薬物送達のためのナノ粒子はまた、例えば、ＵＳ８２５７７４０またはＵＳ８２４６９９５にも記載される。
ある特定の状況では、医薬組成物は、制御放出系で送達され得る。一実施形態では、ポンプを使用することができる。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる。さらに別の実施形態では、制御放出系を組成物の標的の近傍に配置することができ、したがって全身用量のほんの一部しか必要としない。
注入可能な調製物は、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、腹腔内および筋肉内注射、点滴などの投与形態を含み得る。これらの注射可能な調製物は、公知の方法によって調製されてもよい。例えば、注入可能な調製物は、例えば、注入に従来使用される無菌水性媒体または油性媒体に、上述される抗体またはその塩を溶解、懸濁、または乳化させることによって調製され得る。注射用水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコースを含有する等張液、および他の助剤などがあり、これらは、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加物）］などの適切な可溶化剤と併用され得る。油性媒体としては、例えば、ゴマ油、ダイズ油などが採用され、これらは安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と併用され得る。このようにして調製した注射液は、好ましくは、適切なアンプル中に充填される。
医薬組成物は、標準的な針とシリンジを用いて皮下送達されてもよく、または静脈内送達されてもよい。さらに皮下送達に関しては、ペン型送達デバイスが、本開示の医薬組成物の送達に容易に応用される。そのようなペン型送達デバイスは、再利用可能であるか、または使い捨てであり得る。再利用可能なペン型送達デバイスは、概して、医薬組成物を含有する交換可能なカートリッジを利用する。カートリッジ内部の医薬組成物のすべてが投与され、カートリッジが空になると、空のカートリッジは、容易に廃棄することができ、医薬組成物を含有する新しいカートリッジと交換され得る。次に、ペン型送達デバイスは再利用することができる。使い捨てペン型送達デバイスでは、交換可能なカートリッジはない。むしろ、使い捨てペン型送達デバイスは、医薬組成物がデバイス内部のリザーバ内に保持された事前に充填された状態で販売される。いったんリザーバの医薬組成物が空になると、デバイス全体が廃棄される。
多数の再利用可能なペン型および自動注入装置送達デバイスは、本開示の医薬組成物の皮下送達において用途を見出す。例としては、ほんの数例を挙げると、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ，ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｕｒｇｈｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ ＭＩＸ ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，ＤｅｎＭａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，ＤｅｎＭａｒｋ）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、およびＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられるが、決してこれらに限定されない。本開示の医薬組成物の皮下送達において用途を見出す使い捨てペン型送達デバイスの例としては、ほんの数例を挙げると、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、およびＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）Ａｕｔｏｉｎｊｅｃｔｏｒ（Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ，Ｌ．Ｐ．）およびＨＵＭＩＲＡ（商標）Ｐｅｎ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）が挙げられるが、決してこれらに限定されない。
有利に、上述の経口または非経口使用のための医薬組成物は、活性成分の用量を適合させるのに適した単位用量で剤形に調製される。単位用量におけるこのような剤形には、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル剤）、坐剤などが含まれる。含有される抗体の量は、一般的に単位用量で１剤形あたり約１～約５００ｍｇであり、特に注射の形態では、抗体は、約１～約１００ｍｇで含有されることが好ましく、およびその他の剤形に対しては約１０～約２５０ｍｇで含有されることが好ましい。
抗体の治療用途
本明細書に提供される抗体は、緑膿菌感染に関連する疾患もしくは障害もしくは状態の治療および／または抑制（例えば、予防的治療）、ならびに／または当該疾患、障害または状態に関連する少なくとも一つの症状の改善に有用である。
特定の態様では、本明細書に開示される抗体は、緑膿菌を原因とする肺炎、菌血症、骨感染、関節感染、皮膚感染、熱傷感染、創傷感染、尿路感染症、またはそれらの任意の組み合わせに罹患する対象の治療に有用である。一つの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、緑膿菌感染を有する患者に、治療用量で投与されてもよい。
一部の実施形態では、本明細書において、対象の緑膿菌感染の少なくとも一つの症状の重症度、期間、もしくは発生頻度を改善または減少させる方法が提供される。例えば、本明細書に開示される一つ以上の抗ＰｃｒＶ抗体を投与して、疾患もしくは障害の一つ以上の症状または状態の重症度を改善または抑制または減少させることができる。抗体を使用して、限定されないが、発熱、悪寒、頭痛、疲労、関節痛、硬直、筋肉痛、下痢、嘔吐、耳の痛み、痒みおよび耳だれ、発疹、皮膚上の膿が詰まった吹き出物、眼の痛み、眼の赤み、肺炎、咳、うっ血、軟部組織からの緑色の膿の排出、甘い果実臭、ならびに尿路感染症をはじめとする緑膿菌感染の少なくとも一つの症状の重症度を改善または低下させてもよい。
また、本明細書に開示される一つ以上の抗ＰｃｒＶ抗体を予防的に、例えば外科手術を受けている対象、重い病気を治療されている対象、重度の熱傷を有する対象、呼吸装置を使用している対象、カテーテルのある対象、化学療法を受けている対象、糖尿病の対象、嚢胞性線維症の対象、結核の対象、ＨＩＶの対象、または免疫不全の対象など、感染を発症するリスクのある対象に投与することが本明細書において予期される。
緑膿菌に感染するリスクのある他の対象としては例えば、自己免疫性疾患により免疫不全状態であるヒト、または免疫抑制療法を受けているヒト（例えば臓器移植後）、白血球を枯渇または破壊する特定の形態の貧血、放射線療法または化学療法を受けているヒト、または炎症性障害に罹患しているヒトが挙げられる。
また本明細書において、緑膿菌感染を中和するために一つ以上の抗ＰｃｒＶ抗体を投与することも予期される。個体または細胞を曝露することにより、細胞死からの防御が強化される。特定の実施形態では、当該曝露は、インビトロまたはインビボであってもよい。防御の強化は、抗体が単独で使用されるとき、または抗体が、緑膿菌に対する一つ以上の追加の治療剤もしくは抗体と併用されて使用されるときに、観察され得る。
また本明細書において、対象の細菌量を減少させるために一つ以上の抗ＰｃｒＶ抗体を投与することも予期される。一部の態様では、一つ以上の抗ＰｃｒＶ抗体またはその抗原結合断片が、対象の肺における細菌量を減少させる。抗体またはその抗原結合断片は、宿主細胞への毒素の緑膿菌送達を遮断し得る。一部の態様では、本明細書に提供される抗ＰｃｒＶ抗体を用いた治療は、緑膿菌の細菌量を減少させる。一部の態様では、本明細書に提供される抗ＰｃｒＶ抗体を用いた治療は、緑膿菌と、例えばグラム陰性細菌またはグラム陽性細菌などの同時感染細菌の細菌量を減少させる。一部の態様では、本明細書に提供される抗ＰｃｒＶ抗体を用いた治療は、緑膿菌の細菌量と、黄色ブドウ球菌の細菌量を減少させる。
一部の実施形態では、本明細書において、緑膿菌感染に罹患している対象、もしくは緑膿菌感染のリスクがある対象の生存率、または生存の可能性を高める方法が提供される。
嚢胞性線維症に罹患している対象の生存率を上昇させ、または生存の可能性を高めるために、一つ以上の抗ＰｃｒＶ抗体を投与することができる。一部の態様では、対象は、投与時に肺炎の症状が無い。
さらなる実施形態では、本発明の抗ＰｃｒＶ抗体は、緑膿菌感染のリスクがある患者、または緑膿菌感染に罹患している患者を治療するための医薬組成物の調製に使用される。別の実施形態では、本発明抗体は、緑膿菌感染の治療または改善に有用な、当業者に公知の任意の他の剤または任意の他の治療法と共に、補助療法として使用される。
併用療法
併用療法は、本明細書に開示される抗ＰｃｒＶ抗体と、当該抗体またはその生物学的に活性な断片と有益に組み合わされ得る任意の追加的治療剤とを含み得る。抗体は、緑膿菌感染を治療するために使用される一つ以上の薬物または剤と相乗的に組み合わされ得る。
細菌感染を治療するための剤の例としては、例えば、抗生物質、抗炎症薬（例えば、コルチコステロイド、および非ステロイド性抗炎症薬など）、緑膿菌に対する異なる抗体、または緑膿菌感染の症状を治療するための、もしくは患者中の細菌量を減少させるための任意の他の緩和療法が挙げられる。特定の実施形態では、第二の治療剤は、抗ＰｃｒＶ抗体またはその抗原結合断片に関連する任意の可能性のある副作用が生じた場合に、当該副作用に対抗する、または当該副作用を低下させるのを補助する剤であってもよい。
抗ＰｃｒＶ抗体と有益に組み合わされ得る例示的な剤としては、緑膿菌に結合し、および／もしくは緑膿菌の活性を阻害する他の剤（他の抗体またはそれらの抗原結合断片など）、ならびに／またはＰｃｒＶもしくは他の緑膿菌抗原に直接結合しないにもかかわらず、宿主細胞の感染性を含む細菌活性を阻害する剤が挙げられるが、これらに限定しない。一部の態様では、第二の治療剤は、緑膿菌と同時感染する可能性のある異なる生物体、例えば黄色ブドウ球菌などの生物体など、グラム陽性生物体やグラム陰性生物体などと関連した感染を治療するための治療剤であってもよい。一部の態様では、追加の治療剤は、同時感染の治療に有用な治療剤である。一部の態様では、追加の治療剤は、黄色ブドウ球菌の同時感染の治療に有用である。
抗ＰｃｒＶ抗体と組み合わされる抗生物質の例としては、ペニシリン（ピペラシリン、ピペラシリン／タゾバクタム、メズロシリン、チカルシリン、チカルシリン／クラブラン酸塩）、セファロスポリン（セフタジジム、セフォペラゾン、セフェピム）、カルバペネム（イミペネム／シラスタチン、メロペネム）、モノバクタム（アズトレオナム）、アミノグリコシド（トブラマイシン、ゲンタマイシン、アミカシン）、フルオロキノロン（シプロフロキサシン、レボフロキサシン）およびその他（ポリミキシンＢ、コリスチン）が挙げられる。一般的な治療レジメンには、以下が含まれる：菌血症に対しては、ペニシリンとアミノグリコシド；ペニシリンとシプロフロキサシン；セファロスポリン、アズトレオナムまたはカルバペネムと、アミノグリコシドまたはシプロフロキサシン；ＣＮＳ感染に対しては、セフタジジム、任意でアミノグリコシドを足す；セフェピム；シプロフロキサシン；アズトレオナム；メロペネム；骨感染または関節感染に対しては、ペニシリンとアミノグリコシドまたはシプロフロキサシン；セファロスポリン；アズトレオナム；フルオロキノロン；カルバペネム；外耳炎に対しては、セファロスポリン；カルバペネム；シプロフロキサシン；セファロスポリンとアミノグリコシド；角膜炎／角膜潰瘍（眼）に対しては、トブラマイシン（局所）、任意でピペラシリンまたはチカルシリンと併用（局所）；シプロフロキサシンまたはオフロキサシン（局所）；および尿路感染に対しては、シプロフロキサシン；アミノグリコシド；ペニシリン；セファロスポリン；カルバペネム。（例えば、Ｋａｓｐｅｒ，Ｄ．Ｌ，ｅｔ ａｌ，ｅｄｓ：Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１６ｔｈ Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，２００５を参照のこと）。
一つの実施形態では、一つ以上の追加の治療剤は、一つ以上の抗ＰｃｒＶ抗体を含む。特定の実施形態では、第二の治療剤は、別の異なる抗体、例えば、別の緑膿菌抗体であり、当該異なる抗体は、ＰｃｒＶに結合してもしなくてもよく、またはＰｃｒＶ上の同じエピトープに結合してもしなくてもよく、または重複エピトープに結合してもしなくてもよい。特定の実施形態では、第二の治療剤は、異なる緑膿菌抗原に対する抗体である。特定の実施形態では、第二の治療剤は、例えば黄色ブドウ球菌など、異なる感染性細菌に対する抗体である。一部の実施形態では、非競合抗体を組み合わせて、その必要のある対象に投与してもよい。当該組み合わせを含む抗体は、Ｔ３ＳＳ機構の活性を遮断してもよく、および／または細菌の何らかの他の活性を阻害してもよい。
本明細書で使用される場合、「と組み合わされる」という用語は、追加の治療活性構成要素が、本明細書に提供される少なくとも一つの抗ＰｃｒＶ抗体の投与の前、同時、または後に投与され得ることを意味する。「と組み合わされる」という用語はまた、抗ＰｃｒＶ抗体および第二の治療剤の逐次投与または同時投与も含む。
追加の治療活性構成要素は、抗ＰｃｒＶ抗体の投与前に対象に投与されてもよい。例えば、第一の成分が、第二の成分の投与の１週間前、７２時間前、６０時間前、４８時間前、３６時間前、２４時間前、１２時間前、６時間前、５時間前、４時間前、３時間前、２時間前、１時間前、３０分前、１５分前、１０分前、５分前、または１分未満前に投与される場合に、第一の成分は、第二の成分の「前に」投与されるとみなされ得る。他の実施形態では、追加の治療活性構成要素は、抗ＰｃｒＶ抗体の投与の後に対象に投与されてもよい。例えば、第一の成分が、第二の成分の投与の１分後、５分後、１０分後、１５分後、３０分後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、６０時間後、７２時間後に投与される場合に、第一の成分は、第二の成分の「後に」投与されるとみなされ得る。さらに他の実施形態では、追加の治療活性構成要素は、抗ＰｃｒＶ抗体の投与と同時に対象に投与されてもよい。本開示の目的に対し、「同時」投与とは、例えば、互いに約３０分以内に対象に投与される、単一剤形または個別の剤形で対象に抗ＰｃｒＶ抗体と追加の治療活性構成要素を投与することを含む。個別の剤形で投与する場合、各剤形は同じ経路を介して投与することができ（例えば、抗ＰｃｒＶ抗体と追加の治療活性構成要素の両方を静脈内に投与することができるなど）、別の方法として、各剤形は異なる経路を介して投与することができる（例えば、抗ＰｃｒＶ抗体は静脈内に投与されてもよく、追加の治療活性構成要素は経口投与されてもよい）。いずれの場合でも、成分を、単一の剤形を同じ経路で、個別の剤形を同じ経路で、または別個の剤形を異なる経路で投与することは全て、本開示の目的のための「同時投与」とみなされる。本開示の目的に関し、追加の治療活性構成要素の投与の「前に」、「同時に」または「後に」、抗ＰｃｒＶ抗体を投与することは、抗ＰｃｒＶ抗体を追加の治療活性構成要素「と組み合わせて」投与することとみなされる。
本開示は、本明細書に記載される抗ＰｃｒＶ抗体が、本明細書の別段に記載される追加の治療活性構成要素のうちの一つ以上と一緒に製剤化される医薬組成物を含む。
投与レジメン
特定の実施形態によると、本明細書に開示される抗ＰｃｒＶ抗体（または本明細書に言及される抗ＰｃｒＶ抗体と追加の治療活性剤のいずれかの組み合わせを含む医薬組成物）の単回投与量は、その必要のある対象に投与され得る。特定の実施形態によると、抗ＰｃｒＶ抗体（または本明細書に言及される抗ＰｃｒＶ抗体と追加の治療活性剤のいずれかの組み合わせを含む医薬組成物）の複数回投与量は、規定の時間経過にわたり対象に投与されてもよい。本開示の本態様による方法は、本明細書に記載される抗ＰｃｒＶ抗体の複数回投与量を対象に逐次的に投与することを含む。本明細書で使用される場合、「逐次的に投与すること」とは、抗ＰｃｒＶ抗体の各投与量が、例えば所定の間隔（例えば、時間、日、週または月）をあけた異なる日など、異なる時点で対象に投与されることを意味する。本開示は、抗ＰｃｒＶ抗体の一つの初回投与量、次いで抗ＰｃｒＶ抗体の一つ以上の第二の投与量、および任意で次いで抗ＰｃｒＶ抗体の一つ以上の第三の投与量を逐次的に患者に投与することを含む方法を含む。
「初回投与量」、「第二の投与量」、および「第三の投与量」という用語は、本明細書に開示される抗ＰｃｒＶ抗体の投与の時間的な順序を指す。したがって、「初回投与量」は、治療レジメンの開始時に投与される投与量であり（また「基準投与量」とも呼称される）、「第二の投与量」は、初回投与量の後に投与される投与量であり、「第三の投与量」は、第二の投与量の後に投与される投与量である。初回投与量、第二の投与量、および第三の投与量はすべて、同じ量の抗ＰｃｒＶ抗体を含有し得るが、概して投与頻度に関しては概して互いに異なり得る。しかしながら特定の実施形態では、初回投与量、第二の投与量、および／または第三の投与量に含有される抗ＰｃｒＶ抗体の量は、治療経過の間に（例えば適宜調整されて加減され）、互いに異なっている。ある実施形態では、二つ以上（例えば、２、３、４、または５）の投与量が、治療レジメンの開始時に負荷投与量」として投与され、その後に続く投与量は、より低い頻度ベースで投与される（例えば、「維持投与量」）。
特定の例示的な実施形態では、第二の投与量および／または第三の投与量の各々は、直前の投与量の１～４８時間後（例えば、１時間後、１時間半後、２時間後、２時間半後、３時間後、３時間半後、４時間後、４時間半後、５時間後、５時間半後、６時間後、６時間半後、７時間後、７時間半後、８時間後、８時間半後、９時間後、９時間半後、１０時間後、１０時間半後、１１時間後、１１時間半後、１２時間後、１２時間半後、１３時間後、１３時間半後、１４時間後、１４時間半後、１５時間後、１５時間半後、１６時間後、１６時間半後、１７時間後、１７時間半後、１８時間後、１８時間半後、１９時間後、１９時間半後、２０時間後、２０時間半後、２１時間後、２１時間半後、２２時間後、２２時間半後、２３時間後、２３時間半後、２４時間後、２４時間半後、２５時間後、２５時間半後、２６時間後、２６時間半後、またはそれ以上）に投与される。「直前の投与量」という文言は、本明細書において使用される場合、複数回の投与の順序を意味し、当該順序のまさに次の投与量の投与が、その間の投与を伴わずに患者に投与される抗ＰｃｒＶ抗体の投与を意味する。
当該方法は、抗ＰｃｒＶ抗体の任意の数の第二の投与量および／または第三の投与量を、患者に投与することを含みうる。例えばある実施形態では、一つの第二の投与量のみが患者に投与される。他の実施形態では、二つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８またはそれ以上）の第二の投与量が患者に投与される。同様にある実施形態では、一つの第三の投与量のみが患者に投与される。他の実施形態では、二つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８またはそれ以上）の第三の投与量が患者に投与される。
特定の実施形態では、第二および／または第三の投与量が患者に投与される頻度は、治療レジメンの経過中に変化し得る。投与頻度も、臨床検査後の個々の患者のニーズに応じて、医師により治療経過中に調整され得る。
医薬組成物
本明細書において、薬学的に許容可能な担体または賦形剤と混合される、一つ以上（例えば、１、２または３）のその構成要素を含む表１に記載される一つ以上の抗ＰｃｒＶ抗体を含む医薬製剤が提供される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９８４）を参照のこと。薬学的に許容可能な担体または賦形剤を構成要素と混合することを含む、かかる医薬製剤を作製するための方法は、かかる方法によって生成される医薬組成物と同様に、本開示の一部を形成する。
本開示の範囲は、乾燥された、例えば凍結乾燥された本開示の抗ＰｃｒＶ抗体を含み、および薬学的に許容可能な担体を含むが、実質的に水を含まないその医薬組成物を含む。一つの実施形態では、医薬製剤は、水溶液である（水を含む）。本開示のある実施形態では、医薬製剤は、滅菌されている。
治療薬の医薬製剤は、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液、または懸濁液の形態の許容される担体、賦形剤、または安定剤と混合することによって調製され得る（例えば、Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．、Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．、Ａｖｉｓ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ、Ｗｅｉｎｅｒ ａｎｄ Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。
抗ＰｃｒＶ抗体を含む医薬組成物の投与様式は変化し得る。投与経路は、経口、直腸、経粘膜、腸、非経口、筋肉内、皮下、皮内、髄内、くも膜下腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、眼内、吸入、吹送、局所、皮膚、経皮、または動脈内を含む。
本開示は、対象（例えば、ヒト）に、抗ＰｃｒＶ抗体を含む医薬製剤を投与するための方法を提供するものであり、当該方法は、当該対象の身体内、例えば対象の静脈内、皮下組織内または筋肉組織内に製剤を導入することを含む。例えば、方法は、対象の身体をシリンジの針で穿刺することと、対象の体内に製剤を注射することとを含む。
本明細書に開示される抗ＰｃｒＶ抗体を含む、または薬学的に許容可能な担体を含むその医薬組成物を含む、一つ以上の容器（例えば、キャップされているプラスチックバイアルもしくはガラスバイアル、またはクロマトグラフィーカラム、中空針またはシリンジ型シリンダー）が本明細書において提供される。組成物を含む一つ以上の容器を調製する方法が提供され、当該方法は、組み合わせの構成要素を一つ以上の容器、例えば、同時製剤化される構成要素の組み合わせを含む容器に導入することを含む。本開示のある実施形態では、容器は、次いでキットに導入される。
また、本明細書に開示される抗ＰｃｒＶ抗体またはその医薬組成物を含む例えば注射用デバイスなどのデバイス、およびその使用方法も提供される。注入用デバイスは、例えば筋肉内、皮下または静脈内などの非経口経路を介して患者の身体内に物質を導入するデバイスである。例えば、注射用デバイスは、シリンジ（例えば、自動注射器などの医薬組成物が事前充填されるか、または例えば、臨床医によって使用時に充填される）であってもよく、これは、例えば、注射されるべき流体（例えば、抗体もしくは断片またはその医薬組成物を含む）を保持するためのシリンダーまたはバレル、流体の注射のために皮膚および／または血管を穿刺するための針、ならびに流体をシリンダーから針穴を通して押し出すためのプランジャーを含む。
本明細書に開示される医薬組成物はまた、米国特許第６６２０１３５号、同第６０９６００２号、同第５３９９１６３号、同第５３８３８５１号、同第５３１２３３５号、同第５０６４４１３号、同第４９４１８８０号、同第４７９０８２４号、または同第４５９６５５６号に開示されるデバイスなどの針なし皮下注射用デバイスで投与されてもよい。医薬組成物を含む、かかる針なしデバイスおよびその使用方法も、本開示の一部である。
本明細書において、抗ＰｃｒＶ抗体を含む一つ以上の注射用デバイス（例えば、プレ充填シリンジまたはオートインジェクター）を調製する方法が提供され、当該方法は、組み合わせの構成要素を、そのようなデバイスのうちの一つ以上、例えば抗ＰｃｒＶ抗体を含む単一デバイスに導入することを含む。一つの実施形態では、注射用デバイスは、次いでキットに導入される。
抗ＰｃｒＶ抗体を含むキットも提供される。一つの実施形態では、キットは、容器または注射用デバイス（例えばプレ充填シリンジまたはオートインジェクター）中に抗体を含む。キットは、キット中の医薬組成物および剤形に関する情報を含む添付文書を含み得る。一般的に、かかる情報は、同封の医薬組成物を効果的かつ安全に使用することにおいて、患者および医師を助ける。例えば、本明細書に提供される抗体に関する以下の情報のいずれかが、添付文書に提供され得る：薬物動態、薬力学、臨床研究、有効性パラメータ、適応症および使用法、禁忌、警告、注意、副作用、過量投与、適切な投与量および投与、供給方法、適切な保管条件、参照、製造業者／販売業者情報、ならびに特許情報。
抗体の診断上の使用
本明細書に提供される抗ＰｃｒＶ抗体を使用して、例えば診断目的に対し、サンプル中の緑膿菌を検出および／または測定してもよい。一部の実施形態は、緑膿菌感染などの疾患または障害を検出するアッセイにおける、本明細書に提供される一つ以上の抗体の使用を予期する。緑膿菌に対する例示的な診断アッセイは、例えば、患者から取得されたサンプルを、本開示の抗ＰｃｒＶ抗体と接触させることを含み、この場合において当該抗ＰｃｒＶ抗体は、検出可能な標識またはレポーター分子で標識されるか、または患者サンプルから緑膿菌を選択的に単離するための捕捉リガンドとして使用される。あるいは標識されていない抗ＰｃｒＶ抗体が、それ自体が検出可能に標識されている２次抗体と組み合わされて、診断応用に使用され得る。検出可能な標識またはレポーター分子は、例えば３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、もしくは１２５Ｉなどの放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネートもしくはローダミンなどの蛍光部分もしくは化学発光部分、またはアルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼなどの酵素であり得る。サンプル中の緑膿菌を検出または測定するために使用され得る具体的な例示的アッセイとしては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞ソーティング法（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
本発明による緑膿菌診断アッセイにおいて使用され得るサンプルとしては、正常な状態または病的な状態で、検出可能な量の緑膿菌またはその断片のいずれかを含有する、患者から取得可能な任意の組織サンプルまたは液体サンプルが挙げられる。一般的に、健常な患者（例えば緑膿菌と関連した疾患に罹患していない患者）から取得された特定のサンプル中の緑膿菌レベルを測定して、最初に基準または標準的な緑膿菌レベルを確立する。次いで、緑膿菌の基準レベルを、緑膿菌が関連する状態を有すると推測される個体、またはそのような状態と関連する症状を有すると推測される個体から取得されたサンプルにおいて測定された緑膿菌のレベルと比較することができる。
緑膿菌に特異的な抗体は、追加標識または追加部分を含有しなくてもよく、またはＮ末端もしくはＣ末端の標識または部分を含有してもよい。一つの実施形態では、標識または部分はビオチンである。結合アッセイでは、標識（ある場合）の位置が、ペプチドが結合する表面に対するペプチドの配向を決定する場合がある。例えば、表面がアビジンで被覆される場合、Ｎ末端ビオチンを含有するペプチドは、ペプチドのＣ末端部分が表面から遠位になるように配向される。
以下の実施例は、当業者に、本明細書に提供される方法および組成物をどのように作製および使用するかに関する完全な開示と説明を提供するために提示されており、本発明者らが自身の発明であるとみなす範囲を限定することは意図されていない。使用した数字（例えば、量、温度など）に対する正確性を確保するための努力がなされているが、いくらかの実験誤差および偏差は考慮に入れるべきである。別途示さない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は大気圧でまたは大気圧付近での℃（摂氏）である。
実施例１．抗ＰｃｒＶ抗体の作製
全長ＰｃｒＶまたは短縮型ＰｃｒＶ（ＰｃｒＶ １３６－２５７）をコードするＤＮＡを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）での発現用の標的ベクターにクローニングした。組換えＰｃｒＶまたは短縮型ＰｃｒＶ（ＰｃｒＶ １３６－２５７）を、形質転換された大腸菌細胞からの溶解物の上清から精製した。ＰｃｒＶに対するヒト抗体は、全長ＰｃｒＶ．６ｘＨｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿２５０３９７．１も参照；ＰＡＯ１株；ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ；配列番号７７も参照）または短縮型ＰｃｒＶ．６ｘＨｉｓタンパク質（ＰｃｒＶ＿１３６－２５７も参照；ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、配列番号７９も参照）を使用して生成された。免疫原は、免疫応答を刺激するアジュバントとともに直接ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（すなわち、ヒト免疫グロブリンの重鎖およびカッパ軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを含む遺伝子操作マウス）に投与した。例えば、米国特許第８，５０２，０１８号に記載される。抗体の免疫応答は、ＰｃｒＶ特異的な免疫アッセイによりモニタリングされた。望ましい免疫応答が獲得されたときに、米国特許第７，５８２，２９８号に記載されるように、ミエローマ細胞と融合させることなく抗原陽性Ｂ細胞から直接抗ＰｃｒＶ抗体を単離した。当該文献は、その全体で参照により本明細書に具体的に組み込まれる。この方法を使用して、数種の完全ヒト抗ＰｃｒＶ抗体（すなわちヒト可変ドメインとヒト定常ドメインとを保有する抗体）を得た。
前述の方法に従って生成された例示的な抗体を、以下のように指定した：Ｈ１Ｈ２９３２９Ｐ、Ｈ１Ｈ２９３３２Ｐ、Ｈ１Ｈ２９３３６ＰおよびＨ１Ｈ２９３３９Ｐ。
本実施例の方法にしたがって作製された例示的な抗体の生物学的特性を、以下に記載される実施例において詳細に説明する。
実施例２．重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列
表１は、本発明の選択された例示的な抗ＰｃｒＶ抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域、およびＣＤＲのアミノ酸配列識別子を記載する。対応する核酸配列識別子を表２に記載する。表３は、全長重鎖および軽鎖のアミノ酸配列の配列識別子を提供する。
Figure 2022536469000001
Figure 2022536469000002
Figure 2022536469000003
抗体は典型的には、以下の命名法にしたがって本明細書において言及される：表１、２および３に示されるように、Ｆｃ接頭辞（例えば、「Ｈ４Ｈ」）、その後に数値識別子（例えば、「１３２９０」、「１３２９１」、「１３２９５」など）、その後に「Ｐ」接尾辞が続く。したがってこの命名法によると、抗体は本明細書において例えば「Ｈ１Ｈ２９３２９Ｐ」、「Ｈ１Ｈ２９３３２Ｐ」、「Ｈ１Ｈ２９３３６Ｐ」などと呼称される場合もある。本明細書で使用される抗体の名称に対する接頭辞は、抗体の特定のＦｃ領域のアイソタイプを示す。特に「Ｈ１Ｈ」抗体は、ヒトＩｇＧ１のＦｃを有する（抗体の名称において最初に「Ｈ」で示される場合、全ての可変領域が完全にヒトである）。当業者によって理解されるように、特定のＦｃアイソタイプを有する抗体は、異なるＦｃアイソタイプを有する抗体に変換することができる（例えば、マウスＩｇＧ１ Ｆｃを有する抗体は、ヒトＩｇＧ４を有する抗体に変換することができる、など）。しかしいずれの場合でも、可変ドメイン（ＣＤＲを含む）－これは、表１～３に示される数値識別子によって示されている－は変わらず同じであり、結合特性はＦｃドメインの性質に関わらず同一または実質的に類似していると予想される。
抗体コンパレータ
第一のコンパレータ抗体であるＲＥＧＮ３５１４（対照Ｉ、ＨＣ／ＬＣ配列番号７３／７４）は、ＷＯ２０１３／０７０６１５で報告された配列を有する抗ＰｃｒＶ抗体である。第二のコンパレータ抗体であるＲＥＧＮ３９７７（対照ＩＩＩ、ＨＣ／ＬＣ配列番号７５／７６）は、米国特許第７，４９４，６５３号で最初に報告された配列を有する抗ＰｃｒＶ抗体である。第三のコンパレータ抗ＰｃｒＶ抗体は、ＲＥＧＮ７０７０（対照Ｖ、ＨＣ／ＬＣ 配列番号８３／８４）である。アイソタイプ対照抗体のＲＥＧＮ１９３２およびＲＥＧＮ６８４（それぞれ対照ＩＩおよびＩＶ）を、以下の実験で使用する。
実施例３．ヒトモノクローナル抗ＰｃｒＶ抗体のＢｉａｃｏｒｅ結合アフィニティおよび速度定数
精製された抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体に結合する各種ＰｃｒＶ試薬についての平衡解離定数（ＫＤ）を、リアルタイム表面プラズモン共鳴を基にしたＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００バイオセンサーを使用して決定した。全ての結合試験を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３．４ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．０５％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４（ＨＢＳ－ＥＰ）の泳動用緩衝液中で、２５℃および３７℃において実施した。抗ヒトＦｃγ特異的ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、カタログ番号 ＃１０９－００５－０９８）を用いたアミンカップリングにより、Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ５センサーチップ表面を最初に誘導体化して、抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体を捕捉した。結合試験は、ＨＢＳ－ＥＰランニング緩衝液中で調製された全長ＰｃｒＶ．６ｘｈｉｓ（配列番号７８）およびＰｃｒＶ（ａａ１３６～２５７）．６ｘｈｉｓ（配列番号８０）（９０ｎＭ～３．３３ｎＭ；３倍連続希釈）の様々な濃度で実施された。タンパク質を、捕捉された抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体表面上に、５０μＬ／分の流速で４分間注入し、一方で、モノクローナル抗体に結合したＰｃｒＶ試薬の解離は、ＨＢＳ－ＥＰランニング緩衝液中で１０分間モニタリングされた。
Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２．０ｃ曲線適合ソフトウェアを使用して、リアルタイムセンサーグラムを１：１結合モデルに適合させることによって、結合速度定数（ｋａ）および解離速度（ｋｄ）定数を決定した。結合解離平衡定数（ＫＤ）および解離半減期（ｔ１／２）を、
Figure 2022536469000004
 として、動態速度定数から計算した。
２５℃および３７℃での、全長ＰｃｒＶ．６ｘｈｉｓおよびＰｃｒＶ（ａａ１３６～２５７）．６ｘｈｉｓの抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体への結合に関する結合動態パラメータを、表４～７に示す。
Figure 2022536469000005
Figure 2022536469000006
Figure 2022536469000007
Figure 2022536469000008
２５℃では、表４に示されるように、抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体は、２０．４ｐＭ～５．１６ｎＭの範囲のＫＤ値で、全長ＰｃｒＶ．６ｘｈｉｓ（配列番号７８）に結合した。３７℃では、表５に示されるように、抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体は、１１．６ｐＭ～９．１２ｎＭの範囲のＫＤ値で、全長ＰｃｒＶ．６ｘｈｉｓ（配列番号７８）に結合した。アイソタイプ対照抗体のＲＥＧＮ１９３２（対照ＩＩ）は、結合を示さなかった。
２５℃では、表６に示されるように、抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体は、４０．８ｐＭ～１５．０ｎＭの範囲のＫＤ値で、ＰｃｒＶ（ａａ１３６－２５７）．６ｘｈｉｓ（配列番号８０）に結合した。３７℃では、表７に示されるように、抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体は、８０．９ｐＭ～１０７ｎＭの範囲のＫＤ値で、ＰｃｒＶ（ａａ１３６－２５７）．６ｘｈｉｓ（配列番号８０）に結合した。アイソタイプ対照抗体のＲＥＧＮ１９３２（対照ＩＩ）は、結合を示さなかった。
実施例４：抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体間のＯｃｔｅｔ交差競合
抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体のパネル間の結合競合を、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＨＴＸバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ａ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でのリアルタイムの標識非含有バイオレイヤー干渉分光アッセイを使用して決定した。実験全体は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ｖ／ｖ 界面活性剤のＴｗｅｅｎ－２０、および１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、ｐＨ７．４（ＨＢＳ－ＥＢＴ）の緩衝液中、２５℃で、１０００ｒｐｍでプレートを振とうさせながら実施された。抗Ｐｅｎｔａ－ｈｉｓ抗体でコーティングされたＯｃｔｅｔバイオセンサーチップ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｉｎｃ、＃１８－５１２２）を、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグを有する全長ＰｃｒＶの２０μｇ／ｍＬ溶液（ＰｃｒＶ．６ｘｈｉｓ；配列番号７８）を含有するウェルに９０秒間浸漬し、約０．６２～０．７４ｎＭのＰｃｒＶ．６ｘｈｉｓを捕捉した。次に、抗原を捕獲したバイオセンサーチップを、５０μｇ／ｍＬのｍＡｂ－１溶液を含有するウェル内に５分間浸漬することによって、抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体（以降、ｍＡｂ－１と呼称される）で飽和させた。二つの抗体がそれぞれのエピトープへの結合について競合するかを評価するために、続いてバイオセンサーチップを、第二の抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体（以降、ｍＡｂ－２と呼称される）の５０μｇ／ｍＬの溶液を含有するウェルに３分間浸漬した。バイオセンサーチップは、実験の各工程の間に、ＨＢＳ－ＥＢＴ緩衝液で洗浄された。実験の全過程にわたり、リアルタイムの結合反応をモニタリングし、各工程の終了時の結合反応を記録した。ｍＡｂ－１と予め複合体化された全長ＰｃｒＶ．６ｘｈｉｓに対するｍＡｂ－２の結合反応を比較し、表８に示されるように、各種抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体の競合／非競合の挙動を判定した。
Figure 2022536469000009
実施例５：ＥＬＩＳＡによる、緑膿菌ＰｃｒＶ組み換えタンパク質に対するヒトモノクローナル抗体の結合
抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、組換えＰｃｒＶタンパク質に結合する能力についてＥＬＩＳＡにより評価した。Ｎｕｎｃ ＭｉｃｒｏＳｏｒｐ（商標）９６ウェルプレートを、１ウェル当たり０．２μｇの組換え全長緑膿菌ＰｃｒＶ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）（配列番号７７）または短縮型タンパク質（成熟タンパク質のアミノ酸１３６～２３３を含む；ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）（配列番号８１）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。翌朝、プレートを洗浄緩衝液（Ｔｗｅｅｎ－２０を含むイミダゾール緩衝生理食塩水）で３回洗浄し、２５℃で１．５時間、２００μｌのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中、３％のＢＳＡ）でブロッキングした。プレートを１回洗浄し、抗体およびアイソタイプ適合対照抗体（０．５％ ＢＳＡ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０／ＰＢＳ中、１：３の連続希釈で３３ｎＭ～０．１ｐＭの範囲）の用量設定を、タンパク質含有ウェルに加え、２５℃で１時間インキュベートした。ウェルを３回洗浄し、次いで、１ウェル当たり１００ｎｇ／ｍＬの抗ヒトＨＲＰ二次抗体と、２５℃で１時間インキュベートした。１００μＬのＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを各ウェルに加え、シグナルを検出した（Ｖｉｃｔｏｒ Ｘ３プレートリーダー、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）。発光値を、１０点反応曲線にわたる４パラメータロジスティック方程式（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）によって分析した。
表９に示されるように、すべての抗ＰｃｒＶ抗体は、緑膿菌全長ＰｃｒＶに対し、サブナノモルのＥＣ５０結合を示し、短縮型ＰｃｒＶタンパク質に対しても、サブナノモルのＥＣ５０結合を示した。全長ＰｃｒＶタンパク質および短縮型ＰｃｒＶタンパク質の両方に対し、抗ＰｃｒＶコンパレータ抗体（対照Ｉ－ＲＥＧＮ３５１４）のサブナノモルのＥＣ５０結合が観察された。アイソタイプ対照ｍＡｂ（対照ＩＶ－ＲＥＧＮ６８４）はいずれのタンパク質にも結合しなかった。
Figure 2022536469000010
実施例６．ＰｃｒＶ介在性細胞毒性を中和する、緑膿菌抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体の能力
抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体を、ヒト肺上皮細胞株であるＡ５４９細胞のＰｃｒＶ介在性溶解を防止する能力について評価した。Ａ５４９細胞を、Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ（１０％熱不活化ＦＢＳおよびＬ－グルタミンを補充）中、およそ４．８ｘ１０５細胞／ｍｌの密度で９６ウェルの透明で底が黒い組織培養処理プレート中に播種し、一晩、５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。翌日、培地を細胞から取り除き、１００μｌのアッセイ培地（フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ、１０％の熱不活化ＦＢＳを補充）と置き換えた。精製抗体またはアイソタイプ適合対照（３３．３ｐＭ～１．３３μＭの範囲）の用量設定を、５０μｌで添加し、細胞を、５％ ＣＯ２、３７℃で４５分間インキュベートした。
一方で、緑膿菌６０７７株（Ｇｅｒａｌｄ Ｐｉｅｒ、Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、ハーバード大学）およびＡＴＣＣ ７００８８８株（ＡＴＣＣ）の対数増殖相培養物を以下のように調製した：一晩、緑膿菌をＬＢ中で増殖させ、新鮮なＬＢで１：５０希釈し、振とうしながら、３７℃で、ＯＤ６００＝約１まで増殖させた。培養物をＰＢＳで１回洗浄し、両方の緑膿菌株について、ＰＢＳ中、ＯＤ６００＝０．０３まで希釈した。５０μｌ中の細菌を、細胞と抗体を含有するウェルに添加し、５％ ＣＯ２、３７℃で２時間インキュベートした。ＣｙｔｏＴｏｘ－Ｇｌｏ（商標）アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して、細胞死を判定した。プレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を使用して発光を検出し、発光値を４パラメータロジスティック方程式（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）により分析した。
表１０に示されるように、抗ＰｃｒＶ ｍＡｂ（Ｈ１Ｈ２９３２９Ｐ、Ｈ１Ｈ２９３３２Ｐ、Ｈ１Ｈ２９３３６ＰおよびＨ１Ｈ２９３３９Ｐ）は、Ａ５４９細胞の死の防止に有効性を示した。四つのモノクローナル抗体すべてが、両方の緑膿菌株に対して防御した。対照抗ＰｃｒＶ ｍＡｂ（対照Ｉ－ＲＥＧＮ３５１４）も、両方の細菌株に対して有効性を示したが、アイソタイプ対照ｍＡｂは、効果がなかった。
Figure 2022536469000011
実施例７：緑膿菌抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体の、ＰｃｒＶ介在性細胞毒性を中和する能力
抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体を、ウサギ赤血球（ｒＲＢＣ；Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｅｒｕｍ Ｃｏ．）のＰｃｒＶ介在性溶解を防止する能力について評価した。
緑膿菌６０７７株およびＡＴＣＣ ７００８８８株の一晩の培養物をＬＢ中で増殖させ、新鮮なＬＢ中で１：５０希釈し、振とうしながら３７℃でＯＤ６００＝約１まで増殖させた。培養物をＰＢＳで一回洗浄し、両方の緑膿菌株について、ＰＢＳ中でＯＤ６００＝０．１５まで希釈した。ｒＲＢＣは、４℃で１０分間、２０００ｘｇで５０％のｒＲＢＣ懸濁液を遠心分離して、上清をＰＢＳと置き換え、ｒＲＢＣとＰＢＳを穏やかに混合し、ｒＲＢＣを５％に希釈することによって調製された。９６ウェル丸底プレートにおいて、１０μｌの緑膿菌６０７７株またはＡＴＣＣ ７００８８８株を、５０μｌ中、精製抗体またはアイソタイプ適合対照（３３．３ｐＭ～１．３３μＭの範囲）の用量設定、またはＴｒｉｔｏｎＸ－１００（溶解陽性対照）と混合し、続いて５０μｌの５％ ｒＲＢＣを添加した。プレートを、５５０ｒｐｍで振とうしながら、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション期間の終了時に、プレートを、２５℃で１分間、２００ｘｇで遠心分離し、７５μｌの上清を平底で透明なプレートに移し、プレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ Ｘ３、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を使用して吸光度（Ａ４０５）を検出して、吸光度の値を４パラメータロジスティック方程式（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ社）により分析した。
表１１に示されるように、四つすべての抗ＰｃｒＶ ｍＡｂが、ｒＲＢＣの溶血防止に有効性を示し、両方の緑膿菌株に対して防御した。対照抗ＰｃｒＶ ｍＡｂ（対照Ｉ－ＲＥＧＮ３５１４）も、両方の細菌株に対して有効性を示したが、アイソタイプ対照ｍＡｂ（対照ＩＶ－ＲＥＧＮ６８４）は、効果がなかった。
Figure 2022536469000012
実施例８：急性肺炎のインビボモデルにおける抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体の有効性
ウサギ赤血球（ＲＢＣ）溶血アッセイ（実施例７）またはＡ５４９細胞毒性アッセイ（実施例６）のいずれかにおいて、ＰｃｒＶ介在性性毒性を防止した抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、マウス急性肺炎モデルにおける死亡を防止する能力について評価した。メスのＢＡＬＢ／ｃ－ＥＬＩＴＥマウス（チャールズリバー、７～８週齢、１群当たりｎ＝５）に、５ｍｇ／ｋｇの精製抗体またはアイソタイプ適合対照の単回投与を皮下注射した。ｍＡｂ注射の２日後、ＴＳＢ中、３７℃でＴＳＢ中、対数増殖相（ＯＤ６００＝１）まで増殖し、１回洗浄され、ＰＢＳ中に再懸濁された緑膿菌６０７７株（約４．２×１０５ＣＦＵ／マウス）または６２０６株（約１．２×１０６ＣＦＵ／マウス）のいずれか２０μｌを用いてマウスに鼻腔内チャレンジを行った。マウスは、感染後、合計で７日間、生存についてモニタリングされた。
表１２に示されるように、四つすべての抗ＰｃｒＶ ｍＡｂ、Ｈ１Ｈ２９３２９Ｐ、Ｈ１Ｈ２９３３２Ｐ、Ｈ１Ｈ２９３３６ＰおよびＨ１Ｈ２９３３９Ｐは、両方の緑膿菌株に対して、５ｍｇ／ｋｇで予防的に投与されたとき、急性肺炎モデルにおけるマウスの死を防止した。対照抗ＰｃｒＶ ｍＡｂ（対照Ｉ－ＲＥＧＮ３５１４）も、両方の細菌株に対して有効性を示した。アイソタイプ対照ｍＡｂ（対照ＩＶ－ＲＥＧＮ６８４）は、防御効果がなかった。
Figure 2022536469000013
実施例９：緑膿菌６０７７株および６２０６株を使用した、急性肺炎モデルにおける抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体のインビボ有効性
５ｍｇ／ｋｇ（Ｈ１Ｈ２９３２９Ｐ、Ｈ１Ｈ２９３３２ＰＰ、Ｈ１Ｈ２９３３６ＰＰ、Ｈ１Ｈ２９３３９Ｐ）で予防的に投与されたとき、マウス急性肺炎モデルにおいて有効性を示した抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、より低い用量で試験し、マウス急性肺炎モデルにおいて死亡を防止する能力を評価した。メスのＢＡＬＢ／ｃ－ＥＬＩＴＥマウス（チャールズリバー、７～８週齢、１群当たりｎ＝５～１０）に、１．０、０．２、または０．０４ｍｇ／ｋｇの精製抗体またはアイソタイプ適合対照のいずれかの単回投与を皮下注射した。ｍＡｂ注射の２日後、ＴＳＢ中、３７℃、ＴＳＢ中で対数増殖相（ＯＤ６００＝１）まで増殖し、１回洗浄され、ＰＢＳ中に再懸濁された緑膿菌６０７７株（約４．５×１０５ＣＦＵ／マウス）または６２０６株（約９×１０５ＣＦＵ／マウス）の２０μｌを用いてマウスに鼻腔内チャレンジを行った。マウスは、感染後、合計で７日間、生存についてモニタリングされた。
表１３に示されるように、抗ＰｃｒＶ ｍＡｂのＨ１Ｈ２９３３６ＰおよびＨ１Ｈ２９３３９Ｐは、緑膿菌６０７７株に対し、０．０４ｍｇ／ｋｇもの低用量で、および緑膿菌６２０６株に対しては０．２ｍｇ／ｋｇもの低用量で予防的に投与されたときに、マウスの死亡率を低下させた。対照的に、抗ＰｃｒＶ ｍＡｂのＨ１Ｈ２９３２９ＰおよびＨ１Ｈ２９３３２Ｐは、より細胞毒性の強い６２０６株を使用し、１．０ｍｇ／ｋｇ未満の用量で試験したとき、死亡を防ぐことができなかった。対照抗ＰｃｒＶ ｍＡｂ（対照Ｉ－ＲＥＮＧ３５１４）は、それぞれ０．２ｍｇ／ｋｇおよび１．０ｍｇ／ｋｇ未満の投与量では、緑膿菌６０７７株および６２０６株に対する有効性を失った。アイソタイプ対照ｍＡｂ（対照ＩＶ－ＲＥＧＮ６８４）は、防御効果がなかった。
Figure 2022536469000014
実施例１０：緑膿菌６２０６株を使用した急性肺炎モデルにおける、抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体を用いた予防的治療のインビボ有効性
本実施例は、緑膿菌６２０６株を使用したマウス急性肺炎モデルにおいて、予防的に投与された抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体が肺の細菌量を低下させる能力を示す。
Ｈ１Ｈ２９３３９Ｐの抗ＰｃｒＶ抗体は、実施例９に示されるように、予防的に投与されたとき、マウス急性肺炎モデルにおいて死亡を防止した。この実験では、同じ急性肺炎モデルを使用して、マウスの肺における細菌量を減少させる抗体の能力について低用量で試験した。メスのＢＡＬＢ／ｃ－ＥＬＩＴＥマウス（チャールズリバー、７～８週齢、１群当たりｎ＝５）に、０．１または０．２ｍｇ／ｋｇの精製抗体または０．２ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ適合対照のいずれかの単回投与を皮下注射した。抗体注射の２日後、ＴＳＢ中、３７℃で対数増殖相（ＯＤ６００＝１）まで増殖し、１回洗浄され、ＰＢＳ中に再懸濁された緑膿菌６２０６株（約１．２×１０６ＣＦＵ／マウス）の２０μｌを用いてマウスに鼻腔内チャレンジを行った。マウスは、感染から１６～１８時間後に安楽死させ、肺を採取し、肺ホモジネートをＬＢ寒天プレート上で播種し、細菌計数した。
表１４に示されるように、抗ＰｃｒＶ ｍＡｂのＨ１Ｈ２９３３９Ｐは、０．１または０．２ｍｇ／ｋｇのいずれかで投与されたときも、対照抗ＰｃｒＶ ｍＡｂ（対照Ｖ－ＲＥＧＮ７０７０）よりも１ｌｏｇ多く、および抗体無し、またはアイソタイプ対照ｍＡｂ（対照ＩＶ）群よりも３～４ｌｏｇ多く、緑膿菌６２０６に感染したマウスの肺中の細菌量を減少させた。
Figure 2022536469000015
実施例１１：緑膿菌ＰＡ０１株を使用した急性肺炎モデルにおける、抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体を用いた予防的治療のインビボ有効性
本実施例は、緑膿菌ＰＡ０１株を使用したマウス急性肺炎モデルにおいて、予防的に投与された抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体が肺の細菌量を減少させる能力を示す。当該株は、研究用に最も普遍的に使用されている株であり、近年に単離された緑膿菌株と比較して細胞毒性が低い。
Ｈ１Ｈ２９３３６Ｐの抗ＰｃｒＶ抗体は、実施例８～１０に示されるように、緑膿菌細胞毒性株の６０７７および６２０６に対して、予防的に投与されたときに、マウス急性肺炎モデルにおいて有効性を示した。本実施例では、当該抗体を、非細胞毒性株のＰＡＯ１に対して試験した。メスのＢＡＬＢ／ｃ－ＥＬＩＴＥマウス（チャールズリバー、７～８週齢、１群当たりｎ＝１０）に、２５ｍｇ／ｋｇの精製抗体またはアイソタイプ適合対照の単回投与を皮下注射した。ｍＡｂ注射の２日後、ＴＳＢ中、３７℃で対数増殖相（ＯＤ６００＝１）まで増殖し、１回洗浄され、ＰＢＳ中に再懸濁された緑膿菌ＰＡＯ１株（約１×１０８ＣＦＵ／マウス）の２０μｌを用いてマウスに鼻腔内チャレンジを行った。マウスは、感染から１６～１８時間後に安楽死させ、肺を採取し、肺ホモジネートをＬＢ寒天プレート上で播種し、細菌計数した。
表１５に示されるように、抗ＰｃｒＶ ｍＡｂのＨ１Ｈ２９３３６Ｐは、緑膿菌の非細胞毒性株のＰＡＯ１が感染したマウスの肺中の細菌量を、対照抗ＰｃｒＶ ｍＡｂ（対照Ｖ－ＲＥＧＮ７０７０）よりも約２ｌｏｇ多く、および抗体なしまたはアイソタイプ対照ｍＡｂ（対照ＩＶ）群よりも４ｌｏｇ多く、減少させた。
Figure 2022536469000016
実施例１２ ＨＤＸ－ＭＳによる、抗ＰｃｒＶ抗体のエピトープ結合
水素－重水素交換質量分析法（ＨＤＸ－ＭＳ）を実施して、Ｈ１Ｈ２９３３６Ｐ抗体およびＨ１Ｈ２９３３９Ｐ抗体と相互作用する緑膿菌ＰｃｒＶ（配列番号７８）のアミノ酸残基を決定した。ＨＤＸ－ＭＳ法の概要説明は、例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（２）：２５２－２５９；およびＥｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ～２６５Ａに記載されている。
ＨＤＸ－ＭＳ実験は、統合型ＨＤＸ－ＭＳプラットフォーム上で実施された。当該プラットフォームは、重水素の標識およびクエンチ用のＬｅａｐｔｅｃ ＨＤＸ ＰＡＬシステム、サンプル消化とローディング用のＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｍ－Ｃｌａｓｓ（Ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｓｏｌｖｅｎｔ ｍａｎａｇｅｒ）、分析的勾配用のＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｍ－Ｃｌａｓｓ（μＢｉｎａｒｙ ｓｏｌｖｅｎｔ ｍａｎａｇｅｒ）、およびペプチド質量測定用のＴｈｅｒｍｏ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ 質量分析器からなる。
標識溶液を、ｐＤ７．０でＤ２Ｏ中のＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、および３ｍＭ ＫＣｌ、２５℃でｐＨ７．４と同等）として調製した。重水素標識については、１０μｌのＰｃｒＶ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社より、５７．３μＭ）、またはＨ１Ｈ２９３３６Ｐと１：０．６のモル比で予め混合されたＰｃｒＶ（抗体複合体に対する抗原）、および１０μｌのＰｃｒＶ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社より、３１．７μＭ）、またはＨ１Ｈ２９３３９Ｐと１：０．６のモル比で予め混合されたＰｃｒＶ（抗体複合体に対する抗原）を、様々な時点に対し、二重で、９０μＬのＤ２Ｏ標識溶液とともに２０℃でインキュベートした（例えば、非重水素化対照＝０秒、５分間と１０分間の重水素標識化など）。重水素反応は、１００μｌのクエンチ緩衝液（０．５Ｍ ＴＣＥＰ－ＨＣｌ、８Ｍ尿素、および１％ギ酸）を各サンプルに２０℃、５分間のインキュベーションで添加することにクエンチされた。次いでクエンチされたサンプルをＷａｔｅｒｓ ＨＤＸ Ｍａｎａｇｅｒに注入し、オンラインのペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ消化を行った。消化ペプチドは、－９．５℃、０％～９０％Ｂ（移動相Ａ：０．５％ギ酸および４．５％アセトニトリル水溶液、移動相Ｂ：０．５％ギ酸のアセトニトリル溶液）の２２分の勾配でＣ８カラム（１．０ｍｍ ｘ ５０ｍｍ、ＮｏｖａＢｉｏａｓｓａｙｓ社）により分離された。溶出されたペプチドは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳまたはＬＣ－ＭＳモードで、Ｔｈｅｒｍｏ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ質量分析器により分析された。
非重水素化ＰｃｒＶサンプルのＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータを、ＰｃｒＶ配列とそのリバース配列を含むデータベースに対して、Ｂｙｏｎｉｃ検索エンジン（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ社）を使用して検索した。検索パラメータは、共通可変改変として非特異的酵素消化とヒトグリコシル化を使用したデフォルトとして設定された。次いで特定されたペプチドのリストを、ＨＤＸ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈソフトウェア（バージョン３．３）にインポートして、すべての重水素化サンプルからＬＣ－ＭＳにより検出された各ペプチドの重水素取り込みを計算した。所与のペプチドに対し、各時点での質量中心（強度－重み付け平均質量）を使用して、重水素取り込み（Ｄ）と、重水素取り込みの割合（Ｄ％）を計算した。
Figure 2022536469000017
ＰｃｒＶ由来の合計で１２７個のペプチドが、ＰｃｒＶ単独、およびＨ１Ｈ２９３３６Ｐとの複合体サンプルでのＰｃｒＶの両方から同定され、ＰｃｒＶの９５％配列カバレッジを示した。５％を超える差分パーセントＤ－取り込み値を示したペプチドはすべて、有意に保護されたと定義した。ＰｃｒＶ上のアミノ酸１５５－１７０（ＡＬＳＡＫＱＧＩＲＩＤＡＧＧＩＤ－配列番号８５）に対応するペプチドは、Ｈ１Ｈ２９３３６Ｐにより有意に保護された（ＰｃｒＶ残基は、配列番号７８のＰｃｒＶアミノ酸配列に従い番号付けされている）。表１６を参照のこと。
ＰｃｒＶ由来の合計で１３３個のペプチドが、ＰｃｒＶ単独、およびＨ１Ｈ２９３３９Ｐとの複合体サンプルでのＰｃｒＶの両方から同定され、ＰｃｒＶの９８％配列カバレッジを示した。５％を超える差分パーセントＤ－取り込み値を示したペプチドはすべて、有意に保護されたと定義した。ＰｃｒＶ上のアミノ酸１５０－１７０（ＳＱＩＮＡＡＬＳＡＫＱＧＩＲＩＤＡＧＧＩＤ－配列番号８６）に対応するペプチドは、Ｈ１Ｈ２９３３９Ｐにより有意に保護された（ＰｃｒＶ残基は、配列番号７８のＰｃｒＶアミノ酸配列に従い番号付けされている）。表１７を参照のこと。
Figure 2022536469000018
Figure 2022536469000019
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態による範囲に限定されるものではない。実際に、本発明の種々の修飾は、本明細書に記載されるものに加えて、上記の記述および付随する図から、当業者に明らかとなるであろう。そのような変更は、添付される特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。

Claims (49)

  1. 緑膿菌ＰｃｒＶに特異的に結合する、単離された組換え抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体またはその抗原結合断片は、
    （ａ）配列番号３４、５０、２および１８からなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列のいずれか一つの内に含有される三つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）、ならびに配列番号４２、５８、１０および２６からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列のいずれか一つの内に含有される三つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含有する、
    （ｂ）完全ヒトモノクローナル抗体である、
    （ｃ）２５℃での表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定されたとき、１０－８Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）で、全長ＰｃｒＶに結合する、
    （ｄ）３７℃での表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定されたとき、１０－８Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）で、全長ＰｃｒＶに結合する、
    （ｅ）細胞毒性アッセイにおいて、約１０－１１Ｍ～約１０－８Ｍの範囲のＩＣ５０で、緑膿菌６０７７株の中和を示す、
    （ｆ）細胞毒性アッセイにおいて、約１０－９Ｍ～約１０－７Ｍの範囲のＩＣ５０で、緑膿菌ＡＴＣＣ ７００８８８株の中和を示す、
    （ｇ）溶血アッセイにおいて、約１０－１０Ｍ～約１０－６Ｍの範囲のＩＣ５０で、緑膿菌６０７７株の中和を示す、
    （ｈ）溶血アッセイにおいて、約１０－１０Ｍ～約１０－７Ｍの範囲のＩＣ５０で、緑膿菌ＡＴＣＣ ７００８８８株の中和を示す、
    （ｉ）急性肺炎モデルにおいて、未治療マウスと比較し、５ｍｇ／ｋｇで予防的に治療されたマウスにおいて、緑膿菌６２０６株または６０７７株による死亡率が減少する、
    （ｊ）急性肺炎モデルにおいて、未治療マウスと比較し、１．０、０．２または０．０４ｍｇ／ｋｇで予防的に治療されたマウスにおいて、緑膿菌６２０６株または６０７７株による死亡率が減少する、
    （ｋ）急性肺炎モデルにおいて、未治療マウスと比較し、０．１ｍｇ／ｋｇまたは０．２ｍｇ／ｋｇで予防的に治療されたマウスにおいて、緑膿菌６２０６株の肺細菌量が減少する、
    （ｌ）急性肺炎モデルにおいて、未治療マウスと比較し、２５ｍｇ／ｋｇで予防的に治療されたマウスにおいて、緑膿菌ＰＡ０１株の肺細菌量が減少する、および／または
    （ｍ）参照抗体と交差競合し、前記参照抗体は、表１のＨＣＶＲアミノ酸配列およびＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかからなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）アミノ酸配列および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列を含む、の特徴のうちの一つ以上を有する、抗体またはその抗原結合断片。
  2. 緑膿菌ＰｃｒＶに特異的に結合する、単離された組換え抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体またはその抗原結合断片は、
    （ａ）配列番号３４、５０、２および１８からなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列のいずれか一つの内に含有される三つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）、ならびに配列番号４２、５８、１０および２６からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列のいずれか一つの内に含有される三つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含有する、
    （ｂ）約１０－８Ｍ未満のＥＣ５０で、全長ＰｃｒＶに結合する、
    （ｃ）約１０－８Ｍ未満のＥＣ５０で、ＰｃｒＶの１３６－２３３（配列番号８１）に結合する、
    （ｄ）（ｉ）配列番号７８の約１５０位～約１７０位の範囲のアミノ酸残基、および（ｉｉ）配列番号７８の約１５５位～約１７０位の範囲のアミノ酸残基からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列と相互作用する；および／または
    （ｅ）配列番号８５および配列番号８６からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列と相互作用する、の特徴のうちの一つ以上を有する、抗体またはその抗原結合断片。
  3. 配列番号３４、５０、２および１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む、請求項１または２のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  4. 配列番号４２、５８、１０および２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  5. （ａ）配列番号３６、５２、４および２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン、
    （ｂ）配列番号３８、５４、６および２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン、
    （ｃ）配列番号４０、５６、８および２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン、
    （ｄ）配列番号４４、６０、１２および２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン、
    （ｅ）配列番号４６、６２、１４および３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン、および
    （ｆ）配列番号４８、６４、１６および３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメイン、を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  6. 配列番号３４／４２、５０／５８、２／１０および１８／２６からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離された抗体または抗原結合断片。
  7. 配列番号３４／４２および５０／５８からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含有する、請求項６に記載の単離された抗体または抗原結合断片。
  8. 配列番号３６のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号３８のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号４０のＨＣＤＲ３アミノ酸配列、配列番号４４のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号４６のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号４８のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  9. 配列番号５２のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号５４のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号５６のＨＣＤＲ３アミノ酸配列、配列番号６０のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６２のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号６４のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  10. 配列番号４のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号８のＨＣＤＲ３アミノ酸配列、配列番号１２のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１４のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１６のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  11. 配列番号２０のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号２２のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号２４のＨＣＤＲ３アミノ酸配列、配列番号２８のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号３０のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号３２のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  12. ＨＣＶＲのＣＤＲ、およびＬＣＶＲのＣＤＲを含む、参照抗体または抗原結合断片とＰｃｒＶへの結合について競合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＨＣＶＲは、配列番号３４、５０、２および１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、前記ＬＣＶＲは、配列番号４２、５８、１０および２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
  13. 前記抗体またはその抗原結合断片は、前記参照抗体またはその抗原結合断片と、ＰｃｒＶ １３６－２３３（配列番号８１）への結合に関して競合する、請求項１２に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  14. ＨＣＶＲのＣＤＲ、およびＬＣＶＲのＣＤＲを含む、参照抗体または抗原結合断片と同じＰｃｒＶ上のエピトープに結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＨＣＶＲは、配列番号３４、５０、２および１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有し、前記ＬＣＶＲは、配列番号４２、５８、１０および２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
  15. 緑膿菌を中和する方法であって、前記方法は、緑膿菌に感染した細胞を、請求項１～１４のいずれか一項に記載の一つ以上の抗ＰｃｒＶ抗体またはその抗原結合断片を含む組成物に暴露することを含み、前記暴露によって、細胞死からの防御が強化される、方法。
  16. 前記緑膿菌が、インビトロまたはインビボで中和される、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記防御の強化は、前記抗体が単独で使用されるとき、または前記抗体が、緑膿菌に対する一つ以上の追加の治療剤もしくは抗体と併用されて使用されるときに、観察される、請求項１５に記載の方法。
  18. 前記一つ以上の追加の治療剤は、抗生物質、抗炎症薬、緑膿菌に対する異なる抗体、および同時感染の治療に有用な治療剤からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記一つ以上の追加の治療剤が、同時感染の治療に有用な治療剤であり、前記同時感染が、黄色ブドウ球菌の感染である、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記一つ以上の追加の治療剤は、異なる抗緑膿菌抗体である、請求項１７に記載の方法。
  21. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の一つ以上の単離された抗体またはその抗原結合断片、および薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む、医薬組成物。
  22. 前記一つ以上の単離された抗体またはその抗原結合断片が、配列番号３４／４２、５０／５８、２／１０および１８／２６からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアの中に三個のＨＣＤＲと三個のＬＣＤＲを含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
  23. 前記一つ以上の単離された抗体またはその抗原結合断片が、配列番号３４／４２、５０／５８、２／１０および１８／２６からなる群から選択される前記ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
  24. 前記一つ以上の単離された抗体またはその抗原結合断片が、配列番号３４／４２および５０／５８からなる群から選択される前記ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む、請求項２３に記載の医薬組成物。
  25. 前記単離された抗体またはその抗原結合断片が、配列番号３６のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号３８のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号４０のＨＣＤＲ３アミノ酸配列、配列番号４４のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号４６のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号４８のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
  26. 前記単離された抗体またはその抗原結合断片が、配列番号５２のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号５４のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号５６のＨＣＤＲ３アミノ酸配列、配列番号６０のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６２のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号６４のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
  27. 前記単離された抗体またはその抗原結合断片が、配列番号４のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号８のＨＣＤＲ３アミノ酸配列、配列番号１２のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１４のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１６のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
  28. 前記単離された抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２０のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号２２のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号２４のＨＣＤＲ３アミノ酸配列、配列番号２８のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号３０のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号３２のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
  29. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体のＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
  30. 請求項２９に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター。
  31. 請求項３０に記載のベクターを発現する細胞。
  32. 緑膿菌が感染するリスクを低下させる方法であって、請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、または請求項２１～２８のいずれか一項に記載の医薬組成物を、緑膿菌が感染するリスクが高い対象に投与することを含む、方法。
  33. 前記緑膿菌が感染するリスクが高い対象は、外科手術を受けている対象、重い病気を治療されている対象、外傷患者、静脈内薬剤のユーザー、重度の熱傷を有する対象、呼吸装置を使用している対象、カテーテルのある対象、化学療法を受けている対象、糖尿病を有する対象、嚢胞性線維症を有する対象、結核を有する対象、ＨＩＶを有する対象、または免疫不全を有する対象からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
  34. 緑膿菌に感染している対象中の細菌量を減少させる方法であって、前記対象に請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、または請求項２１～２８に記載の医薬組成物を、前記対象に投与することを含む、方法。
  35. 緑膿菌感染に罹患している対象、もしくは緑膿菌感染のリスクがある対象の生存率または生存の可能性を高める方法であって、請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、または請求項２１～２８に記載の医薬組成物を、前記対象に投与することを含む、方法。
  36. 緑膿菌感染の少なくとも一つの症状の重症度、期間もしくは発生頻度を改善または低下させる方法であって、請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、または請求項２１～２８に記載の医薬組成物を、その必要のある対象に投与することを含む、方法。
  37. 前記少なくとも一つの症状が、発熱、悪寒、頭痛、疲労、関節痛、硬直、筋肉痛、下痢、嘔吐、耳の痛み、痒みおよび耳だれ、発疹、皮膚上の膿が詰まった吹き出物、眼の痛み、眼の赤み、肺炎、咳、うっ血、軟部組織からの緑色の膿の排出、甘い果実臭、ならびに尿路感染症からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記医薬組成物が、前記その必要のある対象に予防的または治療的に投与される、請求項３６に記載の方法。
  39. 前記対象は、外科手術を受けている対象、重い病気を治療されている対象、外傷患者、静脈内薬剤のユーザー、重度の熱傷を有する対象、呼吸装置を使用している対象、カテーテルのある対象、化学療法を受けている対象、糖尿病を有する対象、嚢胞性線維症を有する対象、結核を有する対象、ＨＩＶを有する対象、または免疫不全を有する対象からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
  40. 前記その必要のある対象が、緑膿菌感染を有する、請求項３６に記載の方法。
  41. 前記対象が、緑膿菌感染にかかるリスクがある、請求項３６に記載の方法。
  42. 前記対象が、黄色ブドウ球菌感染を有する、請求項４０に記載の方法。
  43. 前記抗体もしくはその抗原結合断片、または前記抗体もしくはその抗原結合断片を含む前記医薬組成物が、第二の治療剤と併用されて投与される、請求項３２～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記第二の治療剤が、抗生物質、抗炎症薬（例えば、コルチコステロイドおよび非ステロイド性抗炎症薬）ならびに緑膿菌に対する異なる抗体からなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記抗体もしくはその抗原結合断片、または前記抗体もしくはその抗原結合断片を含む前記医薬組成物が、皮下、静脈内、皮内、筋肉内、鼻腔内、または経口的に投与される、請求項３２～４２のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記対象は、肺炎、菌血症、骨感染、関節感染、皮膚感染、熱傷感染、創傷感染またはそれらの任意の組み合わせを有する、請求項４０に記載の方法。
  47. 前記緑膿菌は、抗生物質に耐性であるか、または部分的に耐性である、請求項４０に記載の方法。
  48. 嚢胞性線維症に罹患する対象の生存率または生存の可能性を高める方法であって、請求項１～１４のいずれか一項に記載の少なくとも一つの抗体もしくは抗原結合断片、または請求項２１～２８のいずれかに記載の医薬組成物を、その必要のある対象に投与することを含む、方法。
  49. 前記対象は、投与時に肺炎の症状を有さない、請求項４８に記載の方法。
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