KR20220019755A - PcrV에 결합하는 항-PcrV 항체, 항-PcrV 항체를 포함하는 조성물, 및 이의 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 개시는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) PcrV에 결합하는 항체 및 항체의 항원 결합 단편, 및 이를 사용하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에 따르면, 본 개시는 PcrV에 결합하는 항체 및 항체의 항원 결합 단편을 포함한다. 항-PcrV 항체 및 항원 결합 단편은 녹농균 감염증의 예방 및 치료에 유용하다.

Description

PcrV에 결합하는 항-PcrV 항체, 항-PcrV 항체를 포함하는 조성물, 및 이의 사용 방법

기술 분야

본 발명은 PcrV에 특이적으로 결합하는 항체, 이중 특이적 항체, 및 이들의 항원 결합 단편뿐만 아니라 녹농균(P. aeruginosa) 감염증을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 부분적으로 제공한다.

서열 목록

서열 목록의 공식 사본은, 2020년 6월 10일자로 생성되고 "10494WO01_SEQ_LIST_ST25.txt"의 파일명을 가진 약 76 KB 크기의 ASCII 형식의 서열 목록으로서, EFS-Web을 통해 전자 방식으로 명세서와 함께 동시에 제출된다. 본 ASCII 형식의 문헌에 포함된 서열 목록은 본 명세서의 일부이며 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.

녹농균(Pseudomonas 또는 P. aeruginosa)은 다양한 환경에 존재하는 그람 음성 간균이다. 단순한 영양 섭취만을 필요로 하는 녹농균은 증류수에서 성장할 수 있고, 아세테이트 배지 및 황산암모늄 배지에서 잘 성장할 수 있다. 녹농균은 높게는 42℃의 온도에서 성장할 수 있고, 고농도의 염, 약한 소독제, 및 많은 항생제에 내성을 갖는다.

기회주의적 병원균인 세균(bacteria)은 건강 문제를 일으키는 주범이며, 대개는 약물에 내성을 가지고 지역사회 획득 및 병원내 감염을 유발한다. 이러한 세균 감염증은 심각하고 생명을 위협할 수 있으며, 폐렴은 가장 우려되는 증상 중 하나이다. 세균은 건강한 사람과 동물에서 질환을 유발하는 경우는 거의 없지만, 위중한 개체나 면역이 손상된 개체에게는 심각한 문제이다. 예를 들어, 녹농균 감염증은 낭성 섬유증(CF)을 앓고 있는 개체에게는 큰 문제가 되며, 세균으로 인한 재발성 및 만성 호흡기 감염증에 기인하는 진행성 폐 손상을 초래한다. 발병 위험이 있는 기타 대상체에는 인공호흡기를 이용하는 환자, 결핵 환자, 호중구감소성 암 환자, 및 화상 피해자가 포함된다.

세균 3형 분비 체계(T3SS)은 그람 음성균의 중요한 독성 인자이다. T3SS는 완전한 세균 세포벽을 넘나드는 복잡한 다중 단백질 구조이다. 단 2개의 단백질, 즉 단일 배럴 동종중합체 형성 단백질(single barrel homopolymeric forming protein) 및 니들 팁 단백질(needle tip protein)만이 항체에 접근할 수 있다. 녹농균의 V-팁 단백질(PcrV)은 많은 그람 음성균 T3SS에 공통적인 V-팁 단백질의 예이다. PcrV는 T3SS 단백질의 단부에 위치하여, 니들의 팁 상에 오량체 고리형 구조를 형성한다.

T3SS의 중공 니들형 분자 구조는 독소(ExoS, ExoT, ExoU, 및 ExoY)를 진핵 세포 내로 전위시켜 세포 사멸 및 용해를 유발함으로써 작동한다. 그러나, 전위 기공 자체는, 막 투과성의 기공 매개성 증가를 통해 직접적으로, 또는 광범위한 세포 방어 반응의 활성화를 통해 간접적으로, 감염된 세포의 사멸을 야기하기에 충분하다. T3SS 독성 메커니즘은 백혈구와 상피 세포를 살해하고 염증을 유발함으로써 녹농균이 인간 면역 방어를 회피할 수 있게 한다.

녹농균 감염증을 치료하거나 예방하는 개선된 항생제에 대한 충족되지 않은 상당한 의학적 요구가 남아 있다.

녹농균(P.aeruginosa)의 V-팁 단백질(PcrV)에 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 이러한 항체는 녹농균에서 박테리아 3형 분비 체계(T3SS)의 활성을 억제하거나 중화시키는 데 유용하다. 일부 구현예에서, 항체는 박테리아로부터 숙주 세포로 독소가 전위되는 것을 차단하고/하거나 숙주 세포의 사멸을 예방하는 데 유용하다. 일부 구현예에서, 항체는 숙주 세포에서 기공 매개 막 투과성을 차단함으로써 작용한다.

특정 구현예에서, 항체는 대상체에서 녹농균 감염증의 적어도 하나의 증상을 예방, 치료, 또는 개선하는데 유용하다. 특정 구현예에서, 항체는 녹농균 감염증을 앓고 있거나 이에 걸릴 위험이 있는 환자에게 예방적으로 또는 치료적으로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시의 적어도 하나의 항체를 함유하는 조성물은 녹농균 감염증을 가진 환자에게 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시의 적어도 하나의 항체를 함유하는 조성물은 녹농균 감염증에 걸릴 위험이 있는 환자, 예를 들어, 낭성 섬유증 환자, 당뇨병 환자, 인공 호흡기를 이용하는 환자, 수술 중인 환자, 결핵 환자, HIV 환자, 면역 체계가 손상된 환자, 호중구 감소증 환자, 유치 카테터가 삽입된 환자, 신체적 외상을 겪은 환자, 화상 환자, 중환자실에서 자리보전 중인 환자, 암 환자, 만성 폐쇄성 폐질환 환자, 장기 요양 의료 시설에 의탁 중인 환자, 정맥 주사용 약물 사용자에게 투여될 수 있다.

본원에서 제공된 항체는 전장 항체(예를 들어, IgG1 또는 IgG4 항체)이거나 항원 결합 부분(예를 들어, Fab, F(ab')₂, 또는 scFv 단편)만을 포함할 수 있고, 기능에 영향을 미치도록, 예를 들어 숙주에서 지속성을 증가시키도록 또는 잔류 효과기 기능을 제거하도록 변형될 수 있다(Reddy 등의 문헌[2000, J. Immunol. 164:1925-1933] 참조). 특정 구현예에서, 항체는 이중특이적(bispecific)일 수 있다.

일부 양태에서, 본 개시는 PcrV에 특이적으로 결합하는 단리된 재조합 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 이러한 항체는 종종 T3SS의 기능적 길항제이다. 즉, 이러한 항체는 PcrV에 결합하여 T3SS를 억제한다.

일 구현예에서, 본 개시는 PcrV에 특이적으로 결합하는 단리된 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 항체는 다음의 특징 중 하나 이상을 갖는다:

(a) 서열번호 2, 18, 34, 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역(HCVR) 중 어느 하나에 함유된 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3); 및 서열번호 10, 26, 42, 및 58로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역(LCVR) 중 어느 하나에 함유된 3개의 경쇄 CDR(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)를 포함함;

(b) 완전한 인간 단클론 항체임;

(c) 25℃에서 표면 플라스몬 공명 검정으로 측정했을 때, 10^-8 미만의 해리 상수(K_D)로 전장 PcrV에 결합함;

(d) 37℃에서 표면 플라스몬 공명 검정으로 측정했을 때, 10^-8 미만의 해리 상수(K_D)로 전장 PcrV에 결합함;

(e) 세포독성 검정에서, 약 10^-11 M 내지 약 10^-8 M 범위의 IC₅₀으로 녹농균 균주 6077의 중화를 나타냄;

(f) 세포독성 검정에서, 약 10^-9 M 내지 약 10^-7 M 범위의 IC₅₀으로 녹농균 균주 ATCC 700888의 중화를 나타냄;

(g) 용혈 검정에서, 약 10^-10 M 내지 약 10^-6 M 범위의 IC₅₀으로 녹농균 균주 6077의 중화를 나타냄;

(h) 용혈 검정에서, 약 10^-10 M 내지 약 10^-7 M 범위의 IC₅₀으로 녹농균 균주 ATCC 700888의 중화를 나타냄;

(i) 급성 폐렴 모델에서, 5 mg/kg으로 예방적으로 치료한 마우스에서의 녹농균 균주 6206 또는 균주 6077로 인한 사망률을 미치료 마우스에 비해 감소시킴;

(j) 급성 폐렴 모델에서, 1.0, 0.2, 또는 0.04 mg/kg으로 예방적으로 치료한 마우스에서의 녹농균 균주 6206 또는 균주 6077로 인한 사망률을 미치료 마우스에 비해 감소시킴;

(k) 급성 폐렴 모델에서, 0.1 mg/kg 또는 0.2 mg/kg으로 예방적으로 치료한 마우스에서의 녹농균 균주 6206으로 인한 폐 세균 부담을 미치료 마우스에 비해 감소시킴;

(l) 급성 폐렴 모델에서, 25 mg/kg으로 예방적으로 치료한 마우스에서의 녹농균 균주 PA01로 인한 폐 세균 부담을 미치료 마우스에 비해 감소시킴;

(m) 표 1의 HCVR 및 LCVR 아미노산 서열 중 어느 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR) 아미노산 서열을 포함하는 기준 항체와 교차 경쟁함.

일부 양태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음 특성 중 하나 이상을 추가로 갖는다:

(n) 약 10^-8 M 미만의 EC₅₀으로 전장 PcrV(서열번호 77)에 결합함;

(o) 약 10^-8 M 미만의 EC₅₀으로 PcrV 136-233(서열번호 81)에 결합함;

(p) (i) 서열번호 78의 약 150 위치 내지 약 170 위치 범위의 아미노산 잔기 및 (ii) 서열번호 78의 약 155 위치 내지 약 170 위치 범위의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열과 상호작용하고/하거나;

(q) 서열번호 85 및 서열번호 86으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열과 상호작용함.

본원에 제공된 예시적인 항-PcrV 항체는 본원의 표 1, 2, 및 3에 열거되어 있다. 표 1은 예시적인 항-PcrV 항체의 중쇄 가변 영역(HCVR), 경쇄 가변 영역(LCVR), 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3), 및 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)의 아미노산 서열 식별자를 제시한다. 표 2는 예시적인 항-PcrV 항체의 HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3의 핵산 서열 식별자를 제시한다. 표 3은 몇몇 예시적인 항체의 중쇄 및 경쇄 핵산 및 아미노산 서열을 제공한다.

표 1에 열거된 HCVR 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 HCVR을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 2, 18, 34, 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HCVR을 포함한다.

표 1에 열거된 LCVR 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 LCVR을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 또한 제공된다. 일부 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 10, 26, 42, 및 58로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LCVR을 포함한다.

표 1에 열거된 LCVR 아미노산 서열 중 어느 하나 및 이와 쌍을 이룬 표 1에 열거된 HCVR 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 HCVR과 LCVR 아미노산 서열 쌍(HCVR/LCVR)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 특정 구현예에 따르면, 본 개시는 표 1에 열거된 예시적인 항-PcrV 항체 중 어느 하나에 함유된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

일 구현예에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 2/10, 18/26, 34/42, 및 50/58로 이루어진 군으로부터 선택된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함한다.

일 구현예에서, 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은:

(a) 서열번호 4, 20, 36, 및 52로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1 도메인;

(b) 서열번호 6, 22, 38, 및 54로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HCDR2 도메인;

(c) 서열번호 8, 24, 40, 및 56으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HCDR3 도메인;

(d) 서열번호 12, 28, 44, 및 60으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1 도메인;

(e) 서열번호 14, 30, 46, 및 62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LCDR2 도메인; 및

(f) 서열번호 16, 32, 48, 및 64로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LCDR3 도메인을 포함한다.

특정 구현예에서, HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍은 서열번호 2/10 (H1H29329P), 18/26 (H1H29332P), 34/42 (H1H29336P), 및 50/58 (H1H29339P)를 포함한다.

표 1에 열거된 HCDR1 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR1(HCDR1)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 또한 본원에 제공된다.

또한, 표 1에 열거된 HCDR2 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는, 중쇄 CDR2(HCDR2)를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다.

또한, 표 1에 열거된 HCDR3 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는, 중쇄 CDR3(HCDR3)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다.

또한, 표 1에 열거된 LCDR1 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는, 경쇄 CDR1(LCDR1)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다.

또한, 표 1에 열거된 LCDR2 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는, 경쇄 CDR2(LCDR2)를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다.

또한, 표 1에 열거된 LCDR3 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는, 경쇄 CDR3(LCDR3)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다.

또한, 표 1에 열거된 LCDR3 아미노산 서열 중 어느 하나 및 이와 쌍을 이룬 표 1에 열거된 HCDR3 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 HCDR3 및 LCDR3 아미노산 서열 쌍(HCDR3/LCDR3)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 특정 구현예에 따르면, 본 개시는 표 1에 열거된 예시적인 항-PcrV 항체 중 어느 하나에 함유된 HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 특정 구현예에서, HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍은 서열번호 2/10 (H1H29329P), 18/26 (H1H29332P), 34/42 (H1H29336P), 및 50/58 (H1H29339P)을 포함한다.

또한, 표 1에 열거된 예시적인 항-PcrV 항체 중 어느 하나에 함유된 6개의 CDR 세트(즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 특정 구현예에서, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트는 서열번호 4-6-8-12-14-16 (예: H1H29329P), 20-22-24-28-30-32 (예: H1H29332P); 36-38-40-44-46-48 (예: H1H29336P); 및 52-54-56-60-62-64 (예: H1H29339P)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

관련 구현예에서, 표 1에 열거된 예시적인 항-PcrV 항체 중 어느 하나에 의해 정의된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍 내에 함유된 6개의 CDR 세트(즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 예를 들어, 본 개시는 서열번호 2/10(예: H1H29329P), 18/26 (예: H1H29332P), 34/42 (예: H1H29336P), 및 50/58 (예: H1H29339P)로 이루어진 군으로부터 선택된 HCVR/LCVR 서열 쌍 내에 함유된 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. HCVR 및 LCVR 아미노산 서열 내의 CDR을 확인하기 위한 방법 및 기술은 당업계에 잘 알려져 있고, 본원에 개시된 특정 HCVR 및/또는 LCVR 아미노산 서열 내의 CDR을 확인하는 데 사용될 수 있다. CDR의 경계를 식별하는 데 사용될 수 있는 예시적인 규정은, 예를 들어, Kabat 정의, Chothia 정의, 및 AbM 정의를 포함한다. 일반적인 조건에서, Kabat 정의는 서열 변동성에 기초하고, Chothia 정의는 구조적 루프 영역의 위치에 기초하며, AbM 정의는 Kabat 및 Chothia 접근법을 절충한 것이다. 예를 들어, Kabat의 문헌["Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]; Al-Lazikani 등의 문헌[J. Mol. Biol. 273:927-948(1997)]; 및 Martin 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272(1989)]을 참조한다. 공공 데이터베이스도 항체 내에서 CDR 서열을 확인하는 데 이용할 수 있다.

또한, 표 3에 제공된 중쇄 아미노산 서열 중 어느 하나 및/또는 표 3에 제공된 경쇄 아미노산 서열 중 어느 하나를 갖는 항체가 본원에 제공된다.

표 3에 열거된 HC 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 HC를 포함하는 항체가 본원에 제공된다.

또한, 표 3에 열거된 LC 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 LC를 포함하는 항체가 본원에 제공된다.

표 3에 열거된 HC 아미노산 서열 중 어느 하나 및 이와 쌍을 이룬 표 3에 열거된 LC 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 HC와 LC 아미노산 서열 쌍(HC/LC)을 포함하는 항체가 본원에 제공된다. 특정 구현예에 따르면, 본 개시는 표 3에 열거된 예시적인 항-PcrV 항체 중 어느 하나에 함유된 HC/LC 아미노산 서열 쌍을 포함하는 항체를 제공한다.

일 구현예에서, 이의 단리된 항체는 서열번호 65/66, 67/68, 69/70, 및 71/72로 이루어진 군으로부터 선택된 HC/LC 아미노산 서열 쌍을 포함한다.

본 개시는 변형된 글리코실화 패턴을 갖는 항-PcrV 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 항체 의존적 세포 독성(ADCC) 기능을 증가시키기 위해 바람직하지 않은 글리코실화 부위를 제거하는 변형이 유용하거나, 올리고당 사슬에 존재하는 푸코오스 모이어티가 결여된 항체가 유용할 수 있다(Shield 외, JBC 277:26733(2002) 참조). 다른 응용예에서, 보체 의존적 세포독성(CDC)을 변형시키기 위해 갈락토실화 변형이 이루어질 수 있다.

또한, 녹농균 PcrV에 특이적으로 결합하기 위해 기준 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 경쟁하고 HCVR의 CDR 및 LCVR의 CDR을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공하며, 여기서 HCVR 및 LCVR은 각각 표 1에 열거된 HCVR 및 LCVR 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다. 일부 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 PcrV 136-233(서열번호 81)에 결합하기 위해 기준 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 경쟁한다.

추가로, 기준 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 동일한 녹농균 PcrV 에피토프에 결합하고 HCVR의 CDR 및 LCVR의 CDR을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공하며, 여기서 HCVR 및 LCVR은 각각 표 1에 열거된 HCVR 및 LCVR 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다. 일부 양태에서, 에피토프는 PcrV 136-233(서열번호 81)의 잔기 또는 PcrV 150-170(서열번호 86)의 잔기 또는 PcrV 155-170(서열번호 85)의 잔기를 포함한다.

또한 추가로, 세균으로부터 숙주 세포로 녹농균 PcrV에 의한 독소의 전위를 차단하는 단리된 항체 및 이의 항원 결합 단편이 제공된다. 또한 추가로, 숙주 세포 막 투과성의 T3SS 기공 매개성 증가를 차단하는 단리된 항체 및 이의 항원 결합 단편이 제공된다.

특정 구현예에서, 본 개시의 항체 또는 항원 결합 단편은 PcrV 단백질의 제1 에피토프에 대한 제1 결합 특이성 및 PcrV 단백질의 제2 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편이며, 여기서 제1 및 제2 에피토프는 구별되고 중첩되지 않는다. 특정 구현예에서, 이중특이적이란 PcrV 단백질의 에피토프에 결합하는 제1 아암 및 상이한 녹농균 항원에 결합하는 제2 아암을 포함하는 것일 수 있다.

또 다른 양태에서, 항-PcrV 항체 또는 이의 일부분을 암호화하는 핵산 분자가 본원에 제공된다. 예를 들어, 본 개시는 표 1에 열거된 HCVR 아미노산 서열 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 HCVR 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.

또한, 표 1에 열거된 LCVR 아미노산 서열 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 분자가 본원에 제공되며; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 LCVR 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.

또한, 표 1에 열거된 HCDR1 아미노산 서열 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 분자가 본원에 제공되며; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 HCDR1 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.

또한, 표 1에 열거된 HCDR2 아미노산 서열 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 분자가 본원에 제공되며; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 HCDR2 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.

또한, 표 1에 열거된 HCDR3 아미노산 서열 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 분자가 본원에 제공되며; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 HCDR3 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.

또한, 표 1에 열거된 LCDR1 아미노산 서열 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 분자가 본원에 제공되며; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 LCDR1 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.

또한, 표 1에 열거된 LCDR2 아미노산 서열 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 분자가 본원에 제공되며; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 LCDR2 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.

또한, 표 1에 열거된 LCDR3 아미노산 서열 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 분자가 본원에 제공되며; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 LCDR3 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.

또한, HCVR을 암호화하는 핵산 분자가 본원에 제공되며, 여기서 HCVR은 3개의 CDR 세트(즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3)를 포함하고, HCDR1-HCDR2-HCDR3 아미노산 서열 세트는 표 1에 열거된 예시적인 항-PcrV 항체 중 어느 하나에 의해 정의된 바와 같다.

또한, LCVR을 암호화하는 핵산 분자가 본원에 제공되며, 여기서 LCVR은 3개의 CDR 세트(즉, LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하고, LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트는 표 1에 열거된 예시적인 항-PcrV 항체 중 어느 하나에 의해 정의된 바와 같다.

또한, HCVR 및 LCVR 둘 다를 암호화하는 핵산 분자가 본원에 제공되며, 여기서 HCVR은 표 1에 열거된 HCVR 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, LCVR은 표 1에 열거된 LCVR 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 HCVR 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열, 및 표 2에 열거된 LCVR 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다. 본 개시의 이러한 양태에 따른 특정 구현예에서, 핵산 분자는 HCVR 및 LCVR을 암호화하며, 여기서 HCVR 및 LCVR 둘 다는 표 1에 열거된 동일한 항-PcrV 항체로부터 유래된다.

또한, 표 1에 열거된 중쇄 아미노산 서열 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 분자가 본원에 제공된다. 또한, 본 개시는 표 1에 열거된 경쇄 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.

관련 양태에서, 항-PcrV 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터가 본원에 제공된다. 예를 들어, 본 개시는 전술한 핵산 분자 중 어느 하나, 즉 표 1에 제시된 바와 같은 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 서열 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함한다. 본 개시의 범주에는, 이러한 벡터가 도입된 숙주 세포뿐만 아니라, 항체 또는 항체 단편의 생산을 가능하게 하는 조건 하에서 숙주 세포를 배양하고 그렇게 생산된 항체 및 항체 단편을 회수함으로써 항체 또는 이의 일부분을 생산하는 방법도 포함된다.

또 다른 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 PcrV에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 하나 이상의 단리된 항체는 표 1에 열거된 HCVR 및 LCVR 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍 내에 CDR을 포함할 수 있다. 하나 이상의 단리된 항체는 표 1에 열거된 HCVR 및 LCVR 서열을 포함하는 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍은 서열번호 2/10, 18/26, 34/42, 및 50/58로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍은 서열번호 34/42 및 50/58로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 관련 양태에서, 항-PcrV 항체 및 하나 이상의 추가 치료제의 조합인 조성물이 본원에 제공된다.

일 구현예에서, 추가 치료제는 항-PcrV 항체와 유리하게 조합되는 임의의 제제이다. 항-PcrV 항체와 유리하게 조합될 수 있는 예시적인 제제는, 녹농균에 결합하고/하거나 녹농균 활성을 억제하는 다른 제제(다른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 등을 포함함) 및/또는 PcrV 또는 다른 녹농균 항원에 직접 결합하지는 않지만 숙주 세포의 감염성을 포함하여 세균 활성을 억제하는 제제를 제한없이 포함한다. 일부 양태에서, 제2 치료제는 녹농균과 공동 감염을 야기할 수 있는 상이한 유기체, 예를 들어, 황색 포도상구균(S. aureus)과 같은 유기체와 관련된 감염증을 치료하기 위한 치료제일 수 있다. 일부 양태에서, 추가 치료제는 항생제, 항염증제, 녹농균에 대한 상이한 항체, 및 공동 감염증 치료에 유용한 치료제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 추가 치료제는 황색 포도상구균 공동 감염증을 치료하는 데 유용하다.

관련 양태에서, 녹농균을 중화시키는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 세포내 녹농균을 함유하는 세포를 하나 이상의 항-PcrV 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물에 노출시키는 단계를 포함하며, 여기서 노출시키는 단계는 세포 사멸로부터의 보호를 강화시킨다. 특정 구현예에서, 노출시키는 단계는 시험관 내 또는 생체 내 단계일 수 있다. 특정 구현예에서, 보호 강화는 항체가 단독으로 사용되거나, 항체가 녹농균에 대한 하나 이상의 추가 치료제 또는 항체와 병용으로 사용될 때 관찰된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 추가 치료제는 항생제, 항염증제, 녹농균에 대한 상이한 항체, 및 공동 감염증 치료에 유용한 치료제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 추가 치료제는 황색 포도상구균 감염증과 같은 공동 감염증을 치료하는 데 유용한 치료제이다. 일부 양태에서, 하나 이상의 추가 치료제는 상이한 항-녹농균 항체이다.

일부 구현예에서, 녹농균 감염증에 걸릴 위험을 감소시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본원에 제공된 하나 이상의 항-PcrV 항체, 또는 하나 이상의 항-PcrV 항체를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 녹농균 감염증에 대한 위험이 더 큰 환자는 낭성 섬유증 환자, 당뇨병 환자, 인공 호흡기를 이용하는 환자, 수술 중인 환자, 결핵 환자, HIV 환자, 면역 체계가 손상된 환자, 호중구 감소증 환자, 유치 카테터가 삽입된 환자, 신체적 외상을 겪은 환자, 화상 환자, 중환자실에서 자리보전 중인 환자, 암환자, 만성 폐쇄성 폐질환 환자, 장기 요양 의료 시설에 의탁 중인 환자, 또는 정맥 주사용 약물 사용자일 수 있다.

특정 구현예에서, 대상체에서 세균 부하를 감소시키는 방법이 본원에 제공된다. 특정 구현예에서, 세균 부하를 감소시키는 것은 대상체의 폐에서 명백하다. 일부 양태에서, 상기 방법은 PcrV에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 녹농균이 숙주 세포 내로 독소를 전달하는 것을 차단한다. 일부 양태에서, 본원에 제공된 항-PcrV 항체를 사용한 치료는 녹농균 세균 부하를 감소시킨다. 일부 양태에서, 본원에 제공된 항-PcrV 항체를 사용한 치료는 녹농균 세균 부하 및 황색 포도상구균 세균 부하를 감소시킨다.

일부 구현예에서, 녹농균 감염증을 앓고 있는 대상체 또는 녹농균 감염증에 걸릴 위험이 있는 대상체의 생존률 또는 생존 가능성을 증가시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본원에 제공된 적어도 하나의 항-PcrV 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 적어도 하나의 항-PcrV 항체를 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 녹농균 감염증을 앓고 있는 대상체 또는 녹농균 감염증에 걸릴 위험이 있는 대상체의 생존률 또는 생존 가능성을 증가시키는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 대상체는 낭성 피부증을 앓는다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본원에 제공된 적어도 하나의 항-PcrV 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 적어도 하나의 항-PcrV 항체를 포함하는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 대상체는 투여 시점에 폐렴 증상을 갖지 않는다.

일부 구현예에서, 대상체에서 녹농균 감염증의 적어도 하나의 증상의 중증도, 지속 기간, 또는 발생 빈도를 개선하거나 감소시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본원에 제공된 하나 이상의 항-PcrV 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 적어도 하나의 항-PcrV 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 증상은 발열, 오한, 두통, 피로, 관절통, 강직, 근육통, 설사, 및 구토; 귀의 통증, 가려움증, 및 진물(liquid discharge); 고름이 들어찬 뾰루지를 포함하는, 피부 발진; 눈의 통증 및 발적; 폐렴, 기침, 및 울혈(congestion); 녹농의 연조직 방출, 및 달콤한 과일향; 및 요로 감염증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 양태에서, 대상체는 녹농균 감염증에 기인하는 폐렴, 균혈증, 골 감염증, 관절 감염증, 피부 감염증, 화상 감염증, 상처 감염증, 또는 이들의 임의의 조합을 갖는다.

일부 양태에서, 본원에 제공된 하나 이상의 항-PcrV 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 적어도 하나의 항-PcrV 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물은 녹농균의 침습성 감염증을 치료하거나 예방하기 위해 이를 필요로 하는 대상체에게 예방적으로 또는 치료적으로 투여된다.

일 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체란 활성 녹농균 감염증을 가진 대상체 또는 녹농균 감염증에 걸릴 위험이 있는 대상체이다. 일부 양태에서, 대상체는 면역손상된 개체, 입원한 개체, 주요 질환을 앓고 있는 개체, 수술 중인 개체, 침습적 시술 중인 개체, 외상 환자, 정맥 주사용 약물 사용자, 중증 화상을 입은 개체, 호흡기를 사용하는 개체, 카테터가 삽입된 개체, 화학요법으로 치료 중인 개체, 당뇨병을 앓고 있는 개체, 낭성 섬유증을 앓고 있는 개체, HIV에 걸린 개체, 결핵에 걸린 개체, 또는 면역 체계를 손상시킬 수 있는 임의의 다른 병태에 걸린 개체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 대상체는 녹농균 감염증을 갖는다. 일부 양태에서, 대상체는 녹농균 감염증과 황색 포도상구균 감염증을 갖는다. 일부 양태에서, 대상체는 녹농균 감염증 및 하나 이상의 다른 그람 음성 또는 그람 양성 공동 감염증을 갖는다. 일부 양태에서, 대상체는 녹농균 감염증에 기인하는 폐렴, 균혈증, 골 감염증, 관절 감염증, 피부 감염증, 화상 감염증, 상처 감염증, 또는 이들의 임의의 조합을 갖는다. 일부 양태에서, 녹농균은 항생제에 내성이 있거나 부분적으로 내성이 있다.

일 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 적어도 하나의 항-PcrV 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 적어도 하나의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물이 하나 이상의 추가 치료제와 병용으로 이를 필요로 하는 대상체게에 투여될 수 있다. 하나 이상의 추가 치료제는 항생제, 항염증제(예를 들어, 코르티코스테로이드 및 비-스테로이드성 항염증제), 녹농균에 대한 상이한 항체, 황색 포도상구균 감염증과 같은 공동 감염증을 치료하는 데 유용한 치료제, 및 녹농균 감염증의 적어도 하나의 증상을 완화시키는 데 유용하거나 환자에게서 세균 부하를 감소시키는 데 유용한 것으로 당업계에 알려진 임의의 다른 약물 또는 치료제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 하나 이상의 추가 치료제는 하나 이상의 항-PcrV 항체를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 관련이 있는 임의의 가능한 이상 사례(들)가 발생할 수 밖에 없는 경우, 제2 치료제는 이러한 이상 사례(들)에 길항하거나 이를 감소시키는 데 도움이 되는 제제일 수 있다.

일 구현예에서, 약학적 조성물은 피하, 정맥 내, 피 내, 근육 내, 비강 내, 또는 경구 투여될 수 있다.

특정 구현예에서, 하나 이상의 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 녹농균 감염증에 걸렸거나, 걸릴 위험이 있거나, 걸리기 쉬운 대상체에게 예방적으로 또는 치료적으로 투여될 수 있다. 위험이 있는 대상체는 면역손상된 개체, 입원한 개체, 주요 질환을 앓고 있는 개체, 수술 또는 다른 침습적 시술 중인 개체, 외상 환자, 정맥 주사용 약물 사용자, 중증 화상을 입은 개체, 호흡기를 사용하는 개체, 카테터가 삽입된 개체, 화학요법으로 치료 중인 개체, 결핵을 앓고 있는 개체, 당뇨병을 앓고 있는 개체, 낭성 섬유증을 앓고 있는 개체, HIV에 걸린 개체, 또는 면역 체계를 손상시킬 수 있는 임의의 다른 병태에 걸린 개체를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다.

또한, 본 개시는 녹농균 감염증을 앓고 있거나, 이에 걸릴 위험이 있는 대상체의 치료에 사용하거나, 녹농균 감염증과 관련된 질환 또는 장애의 치료를 위한 의약의 제조에 사용하기 위한, 본원에 제공된 바와 같은 항-PcrV 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.

본원에 기술된 바와 같은 항-PcrV 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예: 서열번호 2/10, 18/26, 34/42, 및 50/58로 이루어진 군으로부터 선택된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 갖는 항체)을 포함하는 주사 장치(예: 피하 주사침 및 주사기, 자가 주사기 또는 미리 채워진 주사기) 또는 용기(예: 바이알)가 본원에 제공된다.

추가로, 대상체(예: 인간)에게 조성물을 투여하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 예를 들어, 주사 장치를 사용한 주사에 의해 조성물의 성분을 대상체의 신체 내로, 예를 들어, 비경구적으로 도입하는 단계를 포함한다. 본 개시의 일 구현예에서, 대상체는 녹농균 감염증을 앓고 있거나 녹농균 감염증에 걸릴 위험이 있다.

추가로, 항-PcrV 항체(예: HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 갖는 항체를 포함하는 조성물은 서열번호 2/10, 18/26, 34/42, 및 50/58로 이루어진 군으로부터 선택됨) 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 제조하는 방법이 제공된다.

또한, 본원에 개시된 조성물을 포함하는 장치 또는 용기를 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 조합의 성분을 용기 또는 장치 내로 도입하는 단계를 포함한다.

다른 구현예는 다음의 상세한 설명을 검토함으로써 명백해질 것이다.

본 발명의 방법을 설명하기 전에, 방법과 실험 조건이 다양할 수 있으므로, 본 발명은 기술된 특정 방법 및 실험 조건에 제한되지 않는 것으로 이해해야 한다. 또한 본 발명의 범위는 첨부된 청구항에 의해서만 한정되므로 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 기술하기 위한 목적이며, 한정하는 것으로 의도되지 않음을 이해해야 한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 당해 기술분야의 통상의 기술을 가진 자에 의해 널리 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 발명에 기재된 방법 및 재료와 유사 또는 동등한 어떠한 방법 및 재료도 본 발명의 실시 또는 검사에 사용될 수 있으나, 바람직한 방법 및 재료를 지금부터 설명한다.

정의

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 4개의 폴리펩티드 사슬, 이황화 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L) (즉, "완전한 항체(full antibody) 분자")를 포함하는 면역글로불린 분자뿐만 아니라, 이의 다량체(예, IgM) 또는 이의 항원 결합 단편을 지칭하도록 의도된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역("HCVR" 또는 "V_H") 및 중쇄 불변 영역(도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3을 포함함)을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역("LCVR" 또는 "V_L") 및 경쇄 불변 영역(C_L)을 포함한다. V_H와 V_L 영역은, 프레임워크 영역(FR)으로 지칭되는 더 보존적인 영역이 중간에 끼어 있는 상보성 결정 영역(CDR)으로 명명된 초가변 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각각의 V_H 및 V_L은 아미노 말단에서 카르복시 말단의 방향으로 다음 순서로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 본 개시의 특정 구현예에서, 항체(또는 이의 항원 결합 단편)의 FR은 인간 생식선 서열과 동일하거나, 자연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다. 아미노산 공통 서열은 둘 이상의 CDR의 병렬 분석에 기초하여 정의될 수 있다.

하나 이상의 CDR 잔기의 치환 또는 하나 이상의 CDR의 생략도 가능하다. 결합을 위해 1개 또는 2개의 CDR이 분배될 수 있는 항체가 과학 문헌에 기술되어 왔다. Padlan 등은 항체와 이들의 항원 간의 접촉 영역을 공개된 결정 구조에 기초하여 분석하였고, CDR 잔기의 약 1/5 내지 1/3만이 항원과 실제로 접촉한다고 결론지었다(문헌[1995 FASEB J. 9:133-139] 참조). Padlan은 또한 항원과 접촉하는 아미노산이 없는 1개 또는 2개의 CDR을 가진 많은 항체를 발견하였다(Vajdos 등의 문헌[2002 J Mol Biol 320:415-428]도 참조함).

항원과 접촉하지 않는 CDR 잔기는 분자 모델링에 의해/의하거나 경험적으로 Chotia CDR의 외부에 위치하는 Kabat CDR의 영역으로부터 이전 연구(예를 들어, CDRH2에서의 잔기 H60-H65는 종종 필요하지 않음)에 기초하여 식별될 수 있다. CDR 또는 이의 잔기(들)가 생략되는 경우, 또 다른 인간 항체 서열에서 상응하는 위치를 차지하는 아미노산 또는 이러한 서열의 공통 서열로 치환된다. 치환을 위한 CDR 내의 위치 및 치환할 아미노산도 경험적으로 선택될 수 있다. 경험적 치환은 보존적 또는 비보존적 치환일 수 있다.

본원에 개시된 완전한 인간 항-PcrV 단클론 항체는 상응하는 생식선 서열과 비교해 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 프레임워크에 포함할 수 있고/있거나 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 CDR 영역을 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이는 본원에 개시된 아미노산 서열을, 예를 들어, 공개된 항체 서열 데이터베이스로부터 이용할 수 있는 생식선 서열과 비교함으로써 쉽게 확인할 수 있다. 본 개시는 본원에 개시된 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 유래된 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함하되, 하나 이상의 프레임워크 영역 및/또는 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산은 항체가 유래된 생식선 서열의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이되거나, 또 다른 인간 생식선 서열의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이되거나, 상응하는 생식선 잔기(들)의 보존적 아미노산 치환으로 돌연변이될 수 있다(이러한 서열 변화는 본원에서 "생식선 돌연변이"로서 통칭한다). 당업자는, 본원에 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열에서 출발하여, 하나 이상의 개별 생식선 돌연변이 또는 이들의 조합을 포함하는 다수의 항체 및 항원 결합 단편을 쉽게 생산할 수 있다. 특정 실시예에서, V _H 및/또는 V _L 도메인 내의 프레임워크 및/또는 CDR 잔기의 전부는, 항체가 유래된 원래의 생식선 서열에서 발견되는 잔기로 다시 돌연변이 된다. 다른 구현예에서, 특정한 잔기만이, 예를 들어, FR1의 처음 8개의 아미노산 또는 FR4의 마지막 8개의 아미노산 내에서 발견되는 돌연변이된 잔기, 또는 CDR1, CDR2 또는 CDR3에서 발견되는 돌연변이된 잔기만이 원래의 생식선 서열로 다시 돌연변이 된다. 다른 실시예에서, 프레임워크 및/또는 CDR 잔기(들) 중 하나 이상은 상이한 생식선 서열(즉, 항체가 유래된 원래 생식선 서열과 상이한 생식선 서열)의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이 된다. 또한, 본원에 개시된 항체는 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내의 2개 이상의 생식선 돌연변이의 임의의 조합을 함유할 수 있는데, 예를 들어, 특정 개별 잔기는 특정 생식선 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이 되는 반면, 원래의 생식선 서열과 상이한 특정한 다른 잔기는 유지되거나, 상이한 생식선 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이 된다. 일단 획득되면, 하나 이상의 생식선 돌연변이를 포함하는 항체 및 항원 결합 단편은, 개선된 결합 특이성, 증가된 결합 친화도, 개선되거나 강화된 길항성 또는 작용성 생물학적 특성(경우에 따라), 감소된 면역원성 등과 같은 하나 이상의 원하는 특성에 대해 쉽게 시험될 수 있다. 이러한 일반적인 방식으로 수득된 항체 및 항원 결합 단편은 본 개시에 포함된다.

또한, 하나 이상의 보존적 치환을 갖는 본원에 개시된 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열 중 어느 하나의 변이체를 포함하는 완전한 인간 항-PcrV 단클론 항체가 본원에서 고려된다. 예를 들어, 본 개시는 본원에 개시된 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열에 비해, 예를 들어, 10개 이하, 8개 이하, 6개 이하, 4개 이하 등의 보존적 아미노산 치환을 갖는 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열을 갖는 항-PcrV 항체를 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하도록 의도된다. 본 개시의 인간 mAb는 인간 생식선 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기(예컨대, 시험관 내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이 유발에 의하거나 생체 내 체세포성 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를, 예를 들어 CDR에, 구체적으로는 CDR3에 포함할 수 있다. 그러나, 본 설명에 사용된 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종(예: 마우스)의 생식선으로부터 유도된 CDR 서열이 인간 FR 서열 상에 이식된 항체를 포함하도록 의도되지는 않는다. 전술한 용어는 비인간 포유동물 또는 비인간 포유동물의 세포에서 재조합적으로 생성되는 항체를 포함한다. 전술한 용어는 인간 대상체로부터 단리되었거나 인간 대상체에서 생성된 항체를 포함하도록 의도되지 않는다.

본원에서 사용되는, 용어 "재조합"은 예를 들어, 스플라이싱 및 이식유전자 발현을 포함하는 재조합 DNA 기술로서 당업계에 알려진 기술 또는 방법에 의해 생성, 발현, 단리, 또는 수득된 본 개시의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 지칭한다. 상기 용어는 비-인간 포유동물(예를 들어, 유전자이식 마우스와 같은 유전자이식 비-인간 포유동물 포함) 또는 세포(예, CHO 세포) 발현 시스템에서 발현되거나, 재조합 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체를 지칭한다.

용어 "특이적으로 결합하는" 또는 "~에 특이적으로 결합하는" 등은 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 생리학적 조건 하에서 비교적 안정한 항원과 복합체를 형성하는 것을 의미한다. 특이적 결합은 적어도 약 1x10^-7 M 이하의 평형 해리 상수를 특징으로 할 수 있다(예를 들어, K_D가 작을수록 결합이 더 밀접함). 2개의 분자가 특이적으로 상호 간에 결합하는지 여부를 결정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어, 평형 투석(equilibrium dialysis), 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance) 등을 포함한다. 본원에 기술된 바와 같이, 항체는 PcrV에 특이적으로 결합하는 표면 플라스몬 공명(예: BIACORETM??)에 의해 식별되어 왔다. 또한, 녹농균 PcrV 및 하나 이상의 추가 녹농균 항원에 결합하는 다중 특이적 항체, 또는 녹농균 PcrV의 2개의 상이한 영역에 결합하는 이중특이적 항체는 그럼에도 불구하고 본원에서 사용되는 바와 같이 "특이적으로 결합하는" 항체로 간주된다.

용어 "고친화도" 항체는 표면 플라스몬 공명(예: BIACORE??) 또는 용액-친화도 ELISA에 의해 측정했을 때, 적어도 10^-7 M; 바람직하게는 10^-8 M; 더욱 바람직하게는 10^-9 M, 더욱 더 바람직하게는 10^-10 M, 더욱 더 바람직하게는 10^-11 M, 더욱 더 바람직하게는 10^-12 M의 K_D로서 표현되는, PcrV에 대한 결합 친화도를 갖는 이들 mAb를 지칭한다.

용어 "슬로우 오프 속도(slow off rate)", "Koff" 또는 "kd"는, 표면 플라스몬 공명(예: BIACORE??)에 의해 결정했을 때, 항체가 1 x 10^-3 s^-1 이하, 바람직하게는 1 x 10^-4 s^-1 이하의 속도 상수로 PcrV로부터 해리되는 것을 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 항체의 "항원 결합 부분", 항체의 "항원 결합 단편" 등은 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 자연적인, 또는 효소에 의해 수득할 수 있는, 또는 합성, 또는 유전자 조작된 폴리펩티드 또는 당단백질을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 항체의 "항원 결합 단편" 또는 "항체 단편"은 PcrV에 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다.

특정 구현예에서, 본 개시의 항체 또는 항체 단편은 리간드와 같은 모이어티 또는 치료 모이어티("면역접합체"), 예컨대 항생제, 제2 항-녹농균 항체, 또는 녹농균 감염증을 치료하는 데 유용한 임의의 다른 치료 모이어티에 접합될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체(Ab)가 실질적으로 없는 항체를 지칭하도록 의도된다(예를 들어, 녹농균 PcrV에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 단편으로서, PcrV 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 Ab가 실질적으로 없는 항체 또는 이의 단편).

본원에서 사용되는 바와 같이, "차단 항체(blocking antibody)" 또는 "중화 항체(neutralizing antibody)"(또는 "녹농균 활성을 중화시키는 항체" 또는 "길항제 항체")는 PcrV에 대한 결합으로 인해 녹농균의 적어도 하나의 생물학적 활성의 억제하는 항체를 지칭하도록 의도된다. 예를 들어, 본 개시의 항체는 녹농균 세균이 세균성 독소를 숙주 세포 내로 전위시키는 것을 방지하거나 차단할 수 있다. 또한, "중화 항체"는 숙주에서 감염증을 개시하고/하거나 영속시키는 병원균의 능력을 중화시킬 수 있는 것, 즉, 방지, 억제, 감소, 방해 또는 간섭할 수 있는 것이다. 용어 "중화 항체" 및 "중화시키는 항체" 또는 "중화시키는 항체들"은 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 이러한 항체는 예방제 또는 치료제로서 단독으로 사용되거나 다른 항균제와 조합하여 적절한 제형으로 사용되거나, 활성 백신접종과 결합하여 사용되거나, 진단 도구로서 사용될 수 있다.

"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 세포-매개 면역 방어의 메커니즘으로서, 이에 의해 면역계의 효과기 세포가 표적 세포를 활발하게 용해시키고, 그 막-표면 항원은 특이적 항체, 예컨대 본원에 기술된 항체에 의해 결합되었다. 이와 같이, 이는, 예를 들어, 세균 특이적 항체가 감염 확산을 제한하도록 작용할 수 있는, 하나의 메커니즘이다. 고전적 ADCC는 자연 킬러 세포(NK 세포), 대식세포, 호중구 및 특정 경우에 호산구에 의해 매개된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "표면 플라스몬 공명"은, 예를 들어, BIACORE?? 시스템(스웨덴 웁살라 및 뉴저지주 피츠카타웨이 소재의 Pharmacia Biosensor AB)을 사용해 바이오센서 매트릭스 내의 단백질 농도 변경을 검출함으로써 생체 분자의 상호 작용을 실시간으로 분석할 수 있게 하는 광학 현상을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "K_D"는 특정 항체-항원 상호 작용의 평형 해리 상수를 지칭하도록 의도된다.

용어 "에피토프"는 파라토프로서 알려진 항체 분자의 가변 영역에서 특이적 항원 결합 부위와 상호 작용하는 항원 결정자를 지칭한다. 단일 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 따라서, 상이한 항체는 항원 상의 상이한 영역에 결합할 수 있고 상이한 생물학적 효능을 가질 수 있다. 용어 "에피토프"는 또한 B 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 상의 부위를 지칭한다. 이는 또한 항체에 의해 결합되는 항원의 영역을 지칭한다. 에피토프는 구조적 또는 기능적으로 정의될 수도 있다. 기능적 에피토프는 일반적으로 구조적 에피토프의 서브 세트이며, 상호 작용의 친화도에 직접 기여하는 잔기들을 갖는다. 에피토프는 (비선형 아미노산으로 이루어진) 입체 구조일 수도 있다. 특정 실시예에서, 에피토프는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 기 또는 설포닐 기와 같은, 분자들의 화학적으로 활성 표면군인 결정기를 포함할 수 있으며, 소정의 실시예들에서, 특이적인 3차원 구조적 특성, 및/또는 특이적인 전하 특성을 가질 수도 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "교차-경쟁"은, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 항원에 결합하여 또 다른 항원 또는 이의 항원 결합 단편의 결합을 억제하거나 차단하는 것을 의미한다. 상기 용어는 두 항체 간의 양방향 경쟁, 즉, 제1 항체가 결합하여 제2 항체의 결합을 차단하는 것 및 그 반대의 경우도 포함한다. 특정 실시예에서, 제1 항체 및 제2 항체는 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 대안적으로, 한 항체의 결합이, 예를 들어, 입체 장애(steric hindrance)를 통해 제2 항체의 결합을 억제하거나 차단하도록, 제1 및 제2 항체는 상이하지만 중첩하는 에피토프에 결합할 수 있다. 항체 간의 교차 경쟁은 당업계에 알려진 방법, 예를 들어, 실시간 비표지 바이오-층 간섭계 검정에 의해 측정될 수 있다. 시험 항체가 본원에 기술된 기준 항-PcrV 항체와 교차 경쟁하는지 여부를 결정하기 위해, 기준 항체를 포화 조건 하에 PcrV 단백질에 결합시킨다. 다음으로, PcrV 단백질에 결합하는 시험 항체의 능력을 평가한다. 기준 항-PcrV 항체와 포화 결합시킨 후에 시험 항체가 PcrV 단백질에 결합할 수 있다면, 시험 항체가 기준 항-PcrV 항체와 다른 에피토프에 결합하는 것으로 결론을 내릴 수 있다. 반면, 기준 항-PcrV 항체와 포화 결합시킨 후에 시험 항체가 PcrV 단백질에 결합할 수 없다면, 시험 항체가 기준 항-PcrV 항체가 결합된 에피토프와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.

일반적으로, 본원에 제공된 항체 또는 항원 결합 단편으로서, 임의의 방식으로 변형되는 항체 또는 항원 결합 단편은 PcrV에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하며, 예를 들어, 결합 활성을 몰 기준으로 표현할 때, (부모 항체와 비교해) 이의 PcrV 결합 활성의 적어도 10%를 보유한다. 일부 양태에서, 본 개시의 항체 또는 항원 결합 단편은 부모 항체 대비 적어도 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% 또는 그 이상의 PcrV 결합 친화도를 보유한다. 또한, 본 개시의 항체 또는 항원 결합 단편은 그의 생물학적 활성을 실질적으로 변경시키지 않는 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환(항체의 "보존적 변이체" 또는 "기능 보존 변이체"로서 지칭됨)을 포함할 수 있는 것으로 의도된다.

폴리뉴클레오티드의 "변이체"는, BLAST 알고리즘으로 비교를 수행했을 때, 본원에 제시된 기준 뉴클레오티드 서열(예: 서열번호 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 또는 57)과 적어도 약 70 내지 99.9%(예: 적어도 약 70, 72, 74, 75, 76, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 또는 99.9%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭하며, 여기서 알고리즘의 파라미터는 각각의 기준 서열의 전체 길이에 걸쳐 각각의 서열 간에 가장 큰 일치(예: 예상 임계값: 10; 단어 크기: 28; 쿼리 범위에서 최대 일치: 0; 일치/불일치 점수: 1~2; 갭 비용: 선형)를 제공하도록 선택된다.

핵산 또는 이의 단편을 지칭할 때의 용어 "실질적 동일성" 또는 "실질적으로 동일한"은, 적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실로 또 다른 핵산(또는 이의 상보성 가닥)과 최적으로 정렬되는 경우, 후속한 바와 같은 FASTA, BLAST 또는 GAP와 같은 임의의 잘 알려진 서열 동일성 알고리즘에 의해 측정했을 때, 뉴클레오티드 염기의 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%에서 뉴클레오티드 서열 동일성이 있음을 나타낸다. 기준 핵산 분자에 대한 실질적 동일성을 갖는 핵산 분자는, 특정 경우, 기준 핵산 분자에 의해 암호화된 폴리펩티드와 동일하거나 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화할 수 있다.

면역글로불린 사슬(예: H1H29329P V_H, V_L, HC, 또는 LC, H1H29332P V_H, V_L, HC, 또는 LC, H1H29336P V_H, V_L, HC, 또는 LC, 또는 H1H29339P V_H, V_L, HC, 또는 LC)과 같은 폴리펩티드의 "변이체"는, BLAST 알고리즘으로 비교를 수행했을 때, 본원에 제시된 기준 아미노산 서열(예: 서열번호 2, 10, 65, 66, 18, 26, 67, 68, 34, 42, 69, 70, 50, 58, 71, 또는 72)과 적어도 약 70~99.9%(예를 들어, 70, 72, 74, 75, 76, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9%) 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭하며; 여기서, 알고리즘의 파라미터는 각각의 기준 서열의 전장에 걸쳐 각각의 서열 간에 가장 큰 일치(예: 예상 임계값: 10; 단어 크기: 3; 쿼리 범위에서 최대 일치: 0; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 비용: 존재 11, 연장 1; 조건부 구성 점수 매트릭스 조정)를 제공하도록 선택된다.

폴리펩티드에 적용되는 바와 같이, 용어 "실질적인 유사성" 또는 "실질적으로 유사한"은, 예를 들어, 디폴트 갭 가중치를 사용하는 GAP 또는 BESTFIT 프로그램에 의해 최적으로 정렬되었을 때, 2개의 펩티드 서열이 적어도 90% 서열 동일성, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 공유함을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환만큼 상이하다. "보존적으로 변형된 변이체" 또는 "보존적 치환"은 폴리펩티드 내에 아미노산의 하나 이상의 치환이 존재하고, 다른 아미노산은 유사한 특성(예: 전하, 측쇄 크기, 소수성/친수성, 골격 형태 및 강성 등)을 갖는 변이체를 지칭한다. 이러한 변화는 항체 또는 단편의 생물학적 활성을 상당히 파괴하지 않고도 빈번하게 이루어질 수 있다. 본 기술분야의 당업자는 일반적으로, 폴리펩티드의 비필수 영역에서의 단일 아미노산 치환이 생물학적 활성을 실질적으로 변경시키지 않는다는 것을 인식한다(예를 들어, Watson 등의 문헌[(1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Ed.)] 참조). 또한, 구조적으로 또는 기능적으로 유사한 아미노산의 치환이 생물학적 활성을 상당히 파괴할 가능성은 적다.

2개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환만큼 서로 상이한 경우, 유사성의 백분율 또는 정도는 상향으로 조정되어 치환의 보존적 성질을 보정할 수 있다. 이러한 조정을 만드는 수단은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, Pearson의 문헌[(1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331] 참조. 유사한 화학적 성질을 갖는 측쇄를 갖는 아미노산의 군의 예는 다음을 포함한다: 1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신; 2) 지방족-히드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; 3) 아미드 함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; 4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판; 5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌, 및 히스티딘; 6) 산성 측쇄: 아스파르트산염 및 글루탐산염; 및 7) 황 함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌. 바람직한 보존적 아미노산 치환기는: 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루탐산염-아스파르트산염, 및 아스파라긴-글루타민이다. 대안적으로, 보존적 치환은 Gonnet 등의 문헌에 개시된 PAM250 로그 우도 매트릭스에서 양의 값을 갖는 임의의 변화이다(예: Gonnet 등의 문헌[(1992) Science 256: 1443 45 참조). "적당한 보존적" 치환은 PAM250 로그 우도 매트릭스에서 음의 값을 갖는 임의의 변화이다.

폴리펩티드에 대한 서열 유사성은 일반적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용해 측정된다. 단백질 분석 소프트웨어는 보존적 아미노산 치환을 포함하는 다양한 치환, 결실 및 기타 변형에 배정된 유사성 측정치를 사용하여 유사한 서열들을 대조한다. 예를 들어, GCG 소프트웨어는, 상이한 종의 유기체 유래의 상동성 폴리펩티드와 같은 밀접하게 연관된 폴리펩티드 간의 서열 상동성이나 서열 동일성, 또는 야생형 단백질과 이의 뮤테인 사이의 서열 상동성이나 서열 동일성을 결정하기 위한 디폴트 파라미터와 함께 사용될 수 있는 GAP 및 BESTFIT과 같은 프로그램을 포함한다. 예를 들어, GCG 버전 6.1 참조. 폴리펩티드 서열은 FASTA를 디폴트 파라미터 또는 권장 파라미터와 함께 사용해 비교할 수도 있다(GCG 버전 6.1의 프로그램). FASTA(예, FASTA2 및 FASTA3)는 쿼리 및 검색 서열 사이의 가장 중첩된 영역의 정렬 및 서열 동일성 백분율을 제공한다 (전술한, Pearson의 문헌[(2000)] 참조). 본원에 제공된 서열을 상이한 유기체의 다수의 서열이 포함된 데이터베이스와 비교할 때 바람직한 또 다른 알고리즘은 디폴트 파라미터를 사용하는 컴퓨터 프로그램인 BLAST, 특히 BLASTP 또는 TBLASTN이다. 예를 들어, Altschul 등의 문헌[(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410] 및 문헌[(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402] 참조.

항-PcrV 항원 결합 단백질, 예를 들어 본 개시의 항체 및 이의 항원 결합 단편은, 일 구현예에서, 서열번호 2, 18, 34, 또는 50에 제시된 아미노산과 적어도 70%(예: 80%, 85%, 90%, 95%, 99%)의 아미노산 서열 동일성을 갖는 중쇄 면역글로불린 가변 영역; 및/또는 서열 번호 10, 26, 42, 또는 58에 제시된 아미노산과 적어도 70%(예: 80%, 85%, 90%, 95%, 99%)의 아미노산 서열 동일성을 갖는 경쇄 면역글로불린 가변 영역을 포함한다.

또한, 변이체 항-PcrV 항원 결합 단백질은, 예를 들어, 미스센스 돌연변이(예를 들어, 보존적 치환), 비-센스 돌연변이, 결실, 또는 삽입과 같은 하나 이상의(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의) 돌연변이를 제외한, 본원에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 개시는 서열번호 2, 18, 34, 또는 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하되 이러한 돌연변이 중 하나 이상을 갖는 면역글로불린 중쇄 변이체, 및/또는 서열번호 10, 26, 42, 또는 58에 제시된 아미노산 서열을 포함하되 이러한 돌연변이 중 하나 이상을 갖는 면역글로불린 경쇄 변이체를 포함하는 항원 결합 단백질을 포함한다. 본 개시의 일 구현예에서, 변이체 항-PcrV 항원 결합 단백질은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 면역글로불린 중쇄 변이체(여기서, 이러한 CDR 중 하나 이상(예: 1개 또는 2개 또는 3개)은 이러한 돌연변이(예: 보존적 치환) 중 하나 이상을 가짐) 및/또는 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 면역글로불린 경쇄 변이체(여기서, 이러한 CDR 중 하나 이상(예: 1개 또는 2개 또는 3개)은 이러한 돌연변이(예: 보존적 치환) 중 하나 이상을 가짐)를 포함한다.

본 개시는, 예를 들어 서열번호 4, 6, 8, 12, 14, 및/또는 16; 또는 20, 22, 24, 28, 30, 및/또는 32; 또는 36, 38, 40, 44, 46, 및/또는 48; 또는 52, 54, 56, 60, 62, 및/또는 64와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 99. 9%의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는, 본원에 제시된 하나 이상의 변이체 CDR(예: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및/또는 LCDR3 중 하나 이상)을 포함하는 변이체 항-PcrV 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 추가로 제공한다.

본 발명의 구현예는 또한, 면역글로불린 V_H 및 V_L, 또는, HC 및 LC를 포함하는 변이체 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항-PcrV 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함하는데, 여기서 V_H, V_L, HC, 또는 LC는 본원에 구체적으로 제시된 상응하는 V_H, V_L, HC, 또는 LC의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상(예: 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 99%)의 전체적인 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하지만, 이러한 면역글로불린의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및/또는 LCDR3은 변이체가 아니며 서열번호 4, 6, 8, 12, 14, 및/또는 16; 또는 20, 22, 24, 28, 30, 및/또는 32; 또는 36, 38, 40, 44, 46, 및/또는 48; 또는 52, 54, 56, 60, 62, 및/또는 64에 제시된 아미노산 서열을 각각 포함한다. 따라서, 이러한 구현예에서, 변이체 항원 결합 단백질 내의 CDR 자체는 변이체가 아니다.

항-PcrV 항체 및 이의 항원 결합 단편의 기능 보존적 변이체도 본 발명의 일부이다. (본원에서 논의된 바와 같은) 항-PcrV 항체 및 이의 항원 결합 단편의 변이체 중 어느 하나는 "기능 보존적 변이체"일 수 있다. 이러한 기능 보존적 변이체는, 일부 경우에, 보존적으로 변형된 변이체로서 특징을 가질 수도 있다. 본원에서 사용된 "기능 보존적 변이체"는 항체 또는 단편의 하나 이상의 기능적 특성을 유의하게 변화시키지 않고 하나 이상의 아미노산 잔기가 변경된 항-PcrV 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 변이체를 지칭한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 개시의 항-PcrV 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 기능 보존적 변이체는 변이체 아미노산 서열을 포함하고, 다음의 기능적 특성 중 하나 이상을 나타낸다:

· 25℃에서 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정했을 때, 10^-8 M 미만의 해리 상수(K_D)로 전장 PcrV에 결합함;

· 37℃에서 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정했을 때, 10^-8 M 미만의 해리 상수(K_D)로 전장 PcrV에 결합함;

· 세포독성 검정에서 약 10 ^{- 11} M 내지 약 10^-8 M 범위의 IC₅₀으로 녹농균 균주 6077의 중화를 나타냄;

· 세포독성 검정에서 약 10 ^{- 9} M 내지 약 10^-7 M 범위의 IC₅₀으로 녹농균 균주 ATCC 700888의 중화를 나타냄;

· 용혈 검정에서 약 10 ^{- 10} M 내지 약 10^-6 M 범위의 IC₅₀으로 녹농균 균주 6077의 중화를 나타냄;

· 용혈 검정에서 약 10 ^{- 10} M 내지 약 10^-7 M 범위의 IC₅₀으로 녹농균 균주 ATCC 700888의 중화를 나타냄;

· 급성 폐렴 모델에서, 미치료 마우스에 비해 5 mg/kg으로 예방적으로 치료한 마우스에서 녹농균 균주 6206 또는 균주 6077로 인한 사망률을 감소시킴;

· 급성 폐렴 모델에서, 미치료 마우스에 비해 1.0, 0.2, 또는 0.04 mg/kg으로 예방적으로 치료한 마우스에서 녹농균 균주 6206 또는 균주 6077로 인한 사망률을 감소시킴;

· 급성 폐렴 모델에서, 미치료 마우스에 비해 0.1 mg/kg 또는 0.2 mg/kg으로 예방적으로 치료한 마우스에서 녹농균 균주 6206의 폐 세균 부담을 감소시킴;

· 급성 폐렴 모델에서, 미치료 마우스에 비해 25 mg/kg으로 예방적으로 치료한 마우스에서 녹농균 균주 PA01의 폐 세균 부담을 감소시킴; 및/또는

· 기준 항체와 교차 경쟁함 (여기서, 기준 항체는 표 1의 HCVR 및 LCVR 아미노산 서열 중 어느 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR) 아미노산 서열을 포함함);

· 약 10^-8 M 미만의 EC₅₀으로 전장 PcrV(서열번호 77)에 결합함;

· 약 10^-8 M 미만의 EC₅₀으로 PcrV 136-233(서열번호 81)에 결합함;

· 서열번호 78의 약 150 위치 내지 약 170 위치 범위의 아미노산 잔기와 상호작용함;

· 서열번호 78의 약 155 위치 내지 약 170 위치 범위의 아미노산 잔기와 상호작용함; 및/또는

· 서열번호 85 및 서열번호 86으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열과 상호작용함.

"치료적 유효량"이라는 구절은 투여에 의해 원하는 효과를 생성하는 양을 의미한다. 정확한 양은 치료의 목적에 따라 달라질 것이고, 공지된 기술을 사용하여 당업자에 의해 확인될 수 있을 것이다(예를 들어, Lloyd의 문헌[(1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding] 참조).

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 녹농균 감염증과 같은 질환 또는 장애의 개선, 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 동물, 바람직하게는 포유동물, 더 바람직하게는 인간을 지칭한다. 대상체는 녹농균 감염증에 걸린 대상체일 수 있거나, 녹농균 감염증에 걸리기 쉽다. "녹농균 감염증에 걸리기 쉬운" 대상체, 또는 "녹농균 감염증에 걸릴 위험이 높을 수 있는" 대상체는, 수술 중인 대상체, 주요 질환에 대해 치료 중인 대상체, 외상 환자, 정맥 주사용 약물 사용자, 중증 화상을 입은 대상체, 호흡기를 사용하는 대상체, 카테터가 삽입된 대상체, 화학요법으로 치료 중인 대상체, 당뇨병을 앓고 있는 대상체, 낭성 섬유증을 앓고 있는 대상체, 결핵에 걸린 대상체, HIV에 걸린 대상체, 및 면역 체계가 손상된 대상체를 포함하는 대상체들이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료(treat, treating, 또는 treatment)"는 치료적 치료를 지칭하며, 그 목적은 폐렴, 균혈증, 복막염, 패혈증, 및/또는 농양과 같은 감염증으로 임상적으로 진단된 대상체에서 감염원의 세균 부담을 제거 또는 감소시키는 것이다. 상기 용어는 질환 진행 또는 감염증 악화를 억제하는 것을 포함한다. 상기 용어는 질환의 긍정적 예후를 또한 포함한다, 즉, 본원에 개시된 항체와 같은 치료제의 투여 시 대상체에게 감염증이 없어질 수 있거나, 세균 역가가 감소하거나 없어질 수 있다. "치료"는 또한, 치료를 받지 않는 경우의 예상 생존 기간과 비교하여 생존 기간을 연장시키는 것을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 대상체는, 이미 감염증에 걸린 대상체를 비롯하여, 예를 들어, 화상 환자 또는 세균 감염증(예: 녹농균 감염증)에 걸리기 쉬운 면역억제 환자 중 녹농균 감염증에 걸리기 쉬운 대상체도 포함한다. 치료제는 치료적 투여량으로 대상체에게 투여될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "예방" 또는 "완화"는 예방적(prophylactic 또는 preventative) 조치를 지칭하며, 그 목적은 녹농균 감염증, 또는 녹농균 감염증과 관련된 증상을 예방하거나 지연시키는(경감시키는) 것이다. 유익하거나 바람직한 임상 결과는, 증상 완화, 감염 정도의 감소, 질환의 안정화된 (즉, 악화되지 않은) 상태, 대상체에서 녹농균과 같은 감염원의 제거 또는 감소, 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 경감 또는 완화, 및 검출 가능 여부와 상관없는 (부분적 또는 전체적인) 관해를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.　

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "원내 질환" 및 "원내 감염증"은 병원 또는 다른 의료 시설에서 기원하는 질환 또는 감염증을 지칭한다. 원내 감염증은 녹농균, 예를 들어 항생제에 내성이 있는 녹농균에 의해 야기될 수 있다. 특정 양태에서, 원내 감염증은 대상체가 병원 또는 의료 시설에 입원하기 전에 존재하지 않거나 배양되지 않으며, 대상체가 병원 또는 의료 시설에 입원한 후에 얻게되거나 걸린다.　

일반적인 설명

전술한 바와 같이, 세균성 T3SS는 녹농균을 포함하는 그람 음성 세균의 중요한 독성 인자이다. T3SS 기관의 단부에 위치한 PcrV는, 니들의 팁 상에 고리형 구조를 형성한다. 니들 팁 단백질은 세균의 외부면에 존재하는 2개의 단백질 중 하나로서 항체에 접근할 수 있다.

이와 같이, 녹농균 PcrV에 결합하는 항체, 이중 특이적 항원 결합 분자, 및 이들의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. PcrV를 표적으로 하는 항체는 세균 독소가 감염된 세포 내로 주입되는 것을 방지하여, 염증, 세포 사멸, 및 세균 확산을 감소시킬 수 있다. PcrV를 표적으로 하는 항체는 감염된 숙주 세포에서 기공 매개 막 투과성을 차단할 수 있다. 이들 항-PcrV 항체, 이중 특이적 항원 결합 분자, 및 이들의 항원 결합 단편은 녹농균 감염증을 치료하고/하거나 완화하고, 녹농균 감염증의 증상을 치료하고/하거나 완화하고, 녹농균 감염증의 증상의 발생 또는 진행을 예방하는 데 유용하다. 일부 양태에서, 항-PcrV 항체는 녹농균으로 인한 폐렴의 발생 또는 진행을 방지한다.

녹농균 감염증 환자를 치료하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 녹농균 감염증의 증상의 발생 또는 진행을 예방하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 녹농균의 징후, 예컨대 혈액, 피부, 소변, 고름, 또는 다른 체액 샘플의 양성 배양물 또는 녹농균 감염증을 시사하는 방사선 영상, 또는 녹농균 감염증을 시사하는 신체 검사 소견, 예컨대 피부 또는 뼈 궤양, 또는 비정상적인 활력 징후를 예방하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 환자는 낭성 섬유증을 가질 수 있다. 일부 양태에서, 환자는 인공호흡기를 이용하는 환자일 수 있다. 일부 양태에서, 환자는 호중구감소성 암 환자이다. 일부 양태에서, 환자는 화상 피해자이다. 일부 양태에서, 환자는 결핵을 앓는다.

일부 구현예에서, 환자는 항생제-내성 녹농균 감염증을 갖는다. 일부 구현예에서, 환자는 황색 포도상구균 감염증, 예를 들어, 항생제-내성 황색 포도상구균 감염증과 같은 공동 감염증을 갖는다. 일부 구현예에서, 황색 포도상구균 및 녹농균 감염증 모두는 항생제 내성이다. 일부 구현예에서, 환자는 그람 음성균 또는 그람 양성균에 의한 공동 감염증을 갖는다.

일반적인 방법

분자 생물학의 표준 방법은 Sambrook, Fritsch 및 Maniatis의 문헌(1982 및 1989 2차 개정판, 2001 3차 개정판) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]; Sambrook 및 Russell의 전술한 문헌[(2001) Molecular Cloning, 3차 개정판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]; Wu의 문헌[(1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, Calif.]에 기술되어 있다. 표준 방법은 Ausbel 등의 문헌[(2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols. 1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, N.Y.]에도 등장하는데, 동 문헌은 세균 세포 및 DNA 돌연변이 유발에서의 클로닝(Vol. 1), 포유류 세포 및 효모에서의 클로닝(Vol. 2), 당접합체 및 단백질 발현(Vol. 3), 및 생물정보학(Vol. 4)을 기술한다.

면역침강, 크로마토그래피, 전기영동, 원심분리, 및 결정화를 포함하는 단백질 정제 방법이 설명된다(Coligan, 등의 문헌[(2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York]). 화학적 분석, 화학적 변형, 전사후 변형, 융합 단백질의 생산, 단백질의 당질화가 기술된다(예를 들어, Coligan 등의 문헌[(2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York]; Ausubel 등의 문헌[(2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp. 16.0.5-16.22.17]; Sigma-Aldrich, Co.의 간행물[(2001) Products for Life Science Research, St. Louis, Mo.; pp. 45-89]; Amersham Pharmacia Biotech의 간행물[(2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391]을 참조한다). 다클론 및 단클론 항체의 생산, 정제 및 단편화가 설명된다(Coligan 등의 문헌[(2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York]; Harlow 및 Lane의 문헌[(1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]; Harlow 및 Lane의 전술한 문헌). 리간드/수용체 상호 작용을 특성화하기 위한 표준 기술이 이용 가능하다(예를 들어, Coligan 등의 문헌[(2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New York] 참조).

단클론, 다클론, 및 인간화 항체를 제조할 수 있다(예를 들어, Sheperd 및 Dean(eds.)의 문헌[(2000) Monoclonal Antibodies, Oxford Univ. Press, New York, N.Y.]; Kontermann 및 Dubel(eds.)의 문헌[(2001) Antibody Engineering, Springer-Verlag, New York]; Harlow 및 Lane의 문헌[(1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., pp. 139-243]; Carpenter 등의 문헌[(2000) J. Immunol. 165:6205]; He 등의 문헌[(1998) J. Immunol. 160:1029]; Tang 등의 문헌[(1999) J. Biol. Chem. 274:27371-27378]; Baca 등의 문헌[(1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684]; Chothia 등의 문헌[(1989) Nature 342:877-883]; Foote 및 Winter의 문헌[(1992) J. Mol. Biol. 224:487-499]; 미국 특허 제6,329,511호 참조).

인간화에 대한 대안은 유전자 이식 마우스에서 파지 또는 인간 항체 라이브러리에 표시된 인간 항체 라이브러리를 사용하는 것이다(Vaughan 등의 문헌[(1996) Nature Biotechnol. 14:309-314; Barbas (1995) Nature Medicine 1:837-839]; Mendez 등의 문헌[(1997) Nature Genetics 15:146-156]; Hoogenboom 및 Chames의 문헌[(2000) Immunol. Today 21:371-377]; Barbas 등의 문헌[(2001) Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]; Kay 등의 문헌[(1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, Calif.]; de Bruin 등의 문헌[(1999) Nature Biotechnol. 17:397-399]). 단쇄 항체 및 디아바디가 기술된다(예, Malecki 등의 문헌[(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:213-218]; Conrath 등의 문헌[(2001) J. Biol. Chem. 276:7346-7350]; Desmyter 등의 문헌[(2001) J. Biol. Chem. 276:26285-26290]; Hudson 및 Kortt의 문헌[(1999) J. Immunol. Methods 231:177-189]; 및 미국 특허 제4,946,778호 참조). 이기능성 항체가 제공된다(예를 들어, Mack 등의 문헌[(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7021-7025]; Carter의 문헌[(2001) J. Immunol. Methods 248:7-15]; Volkel 등의 문헌[(2001) Protein Engineering 14:815-823]; Segal 등의 문헌[(2001) J. Immunol. Methods 248:1-6]; Brennan 등의 문헌[(1985) Science 229:81-83]; Raso 등의 문헌[(1997) J. Biol. Chem. 272:27623]; Morrison의 문헌[(1985) Science 229:1202-1207]; Traunecker 등의 문헌[(1991) EMBO J. 10:3655-3659]; 및 미국 특허 제5,932,448호, 제5,532,210호, 및 제6,129,914호 참조). 완전한 인간 항체는, VelociMouse와 같은 유전적으로 조작된 마우스에서도 개발될 수 있다. 예를 들어, DeChiara 등의 문헌[Producing fully ES cell-derived mice from eight-cell stage embryo injections, Methods Enzymol, 476:285-94 (2010)]; Dechiara 등의 문헌[VelociMouse: fully ES cell-derived F0-generation mice obtained from the injection of ES cells into eight-cell-stage embryos. Methods Mol Biol, 530:311-24 (2009)]; 미국 특허 제7576259호; 제7659442호; 또는 제7294754호, 및 US2008/0078000A1을 참조한다.

항원의 정제는 일반적으로 항체의 생성에 필요하지 않다. 동물은 관심 항원을 갖는 세포로 면역화될 수 있다. 그런 다음, 비장세포를 면역화된 동물로부터 단리할 수 있고, 비장세포는 골수종 세포주와 융합되어 하이브리도마를 생성할 수 있다(예, Meyaard 등의 문헌[(1997) Immunity 7:283-290]; Wright 등의 문헌[(2000) Immunity 13:233-242]; Preston 등의 전술한 문헌; Kaithamana 등의 문헌[(1999) J. Immunol. 163:5157-5164] 참조).

항체는, 예를 들어 작은 약물 분자, 효소, 리포좀, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 접합될 수 있다. 항체는 치료, 진단, 키트 또는 다른 목적에 유용하며, 예를 들어 염료, 방사성 동위원소, 효소 또는 금속, 예를 들어 콜로이드 금에 결합된 항체를 포함한다(예, Le Doussal 등의 문헌[(1991) J. Immunol. 146:169-175]; Gibellini 등의 문헌[(1998) J. Immunol. 160:3891-3898]; Hsing 및 Bishop의 문헌[(1999) J. Immunol. 162:2804-2811]; Everts 등의 문헌[(2002) J. Immunol. 168:883-889] 참조).

형광 활성화 세포 분류(FACS)를 포함하는 유세포 계측법이 이용 가능하다(예, Owens, 등의 문헌[(1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, N.J.]; Givan의 문헌[(2001) Flow Cytometry, 2.sup.nd ed.; Wiley-Liss, Hoboken, N.J.]; Shapiro의 문헌[(2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, N.J.] 참조). 예를 들어, 진단 시약으로서 사용하기 위해, 핵산 프라이머 및 프로브, 폴리펩티드, 및 항체를 포함하는 핵산을 변형시키기에 적합한 형광 시약이 이용 가능하다(Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg.; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, Mo.).

면역 체계의 표준 조직학 방법이 설명된다(예, Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, New York, N.Y.; Hiatt, 등의 문헌[(2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, and Wilkins, Phila, Pa.]; Louis 등의 문헌[(2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, New York, N.Y.] 참조).

예를 들어, 항원 단편, 리더 서열, 단백질 접힘, 기능성 도메인, 당질화 부위, 및 서열 정렬을 결정하기 위한 소프트웨어 패키지 및 데이터베이스가 이용 가능하다(예, GenBank, Vector NTI® Suite (Informax, Inc, Bethesda, Md.); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, Calif.); DeCypher® (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nev.); Menne 등의 문헌[(2000) Bioinformatics 16: 741-742]; Menne 등의 문헌[(2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742]; Wren 등의 문헌[(2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181]; von Heijne의 문헌[(1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21]; von Heijne의 문헌[(1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690] 참조).

항-PcrV 항체

감염성 질환의 예방 또는 치료를 위한 수동 면역 요법은 일반적으로 높은 역가의 중화 항체를 함유하는 회복기 인간 혈청(convalescent human sera)의 형태로 1세기 이상 사용되어 왔다(Good 등의 문헌[1991; Cancer 68: 1415-1421] 참조). 오늘날, 여러 가지 정제된 단클론 항체가 현재 항균제로서 사용하기 위한 전임상 및 임상 개발 단계에 있다(Marasco 등의 문헌[2007; Nature Biotechnology 25: 1421-1434] 참조). 녹농균 PcrV에 결합하는 특정 항체들이 기술되었다(예를 들어, Franηois 등의 문헌[2012; Crit. Care Med. 40: 2320-2326]; 및 WO2009088032 참조).

본 발명자들은 녹농균 PcrV에 특이적으로 결합하여 T3SS 독성 메커니즘을 조절하는 완전한 인간 항체 및 이의 항원 결합 단편을 본원에 기술하였다. 항-PcrV 항체는 높은 친화도로 PcrV에 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 PcrV에 결합하여 세포 사멸을 예방하거나 완화할 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 세균성 독소가 숙주 세포 내로 전위되는 것을 방지할 수 있고, 이와 같이 녹농균 감염증을 억제하거나 중화시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 숙주 세포에서 T3SS 기공 매개 막 투과성을 차단함으로써 작용할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 항체 의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)을 매개할 수 있고, 이와 같이 세균을 보유하는 세포를 파괴하는 데 도움을 줄 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 두 가지 방식 모두로 작용할 수 있는데, 예를 들어, 항체는 세균 감염성을 중화시킬 수 있고 ADCC를 매개할 수 있다. 일부 양태에서, 항체는 비슷한 상황에 있지만 치료받지 않은 대상체 또는 모집단에 비해 세균 부하(예: 폐 세균 부하)를 감소시킬 수 있다. 일부 양태에서, 항체는 비슷한 상황에 있지만 치료받지 않은 대상체 또는 모집단에 비해 생존률을 증가시키거나 사망률을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 녹농균 감염증을 앓고 있는 대상체를 치료하는 데 유용할 수 있다. 항체는, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 때, 대상체에서 녹농균에 의한 감염증을 감소시킬 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나, 세균 감염증을 치료하기 위한 당업계에 공지된 다른 치료 모이어티 또는 방법과 함께 보조 요법으로서 사용될 수 있다. 또한, 식별된 항체는 감염증으로부터 대상체(예: 포유동물)를 보호하기 위해 (감염 전에) 예방적으로 사용되거나, 이전에 확립된 감염증을 완화시키거나 감염증과 관련된 적어도 하나의 증상을 완화시키기 위해 (감염증이 확립된 후에) 치료적으로 사용될 수 있다.

녹농균 PcrV 단백질의 전장 아미노산 서열은 GenBank에 수탁번호 250397.1로 표시되어 있고, 서열번호 77로도 표시되어 있다. 절단된 PcrV 단백질(PcrV_136-257)은 서열번호 79로 표시되어 있다. 전장 PcrV에 대한 서열번호 78 및 절단된 PcrV에 대한 서열번호 80의 두 단백질 모두 6-히스티딘 태그로 표지될 수 있다.

특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 전장 PcrV와 같은 일차 면역원 또는 단백질의 절단된 버전으로 면역화시킨 마우스로부터 수득된다. 면역원은 PcrV 단백질의 임의의 면역원성 단편이거나 이의 활성 단편을 암호화하는 DNA일 수 있다. 펩티드는 태그 부착을 위해 특정 잔기의 추가 또는 치환을 포함하도록 변형되거나, KLH와 같은 담체 분자에 접합시키기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, 시스테인이 펩티드의 N 말단 또는 C 말단 단부 중 하나에 추가되거나, 예를 들어, 면역화를 위해 KLH에 접합하기 위한 펩티드를 제조하기 위해 링커 서열이 추가될 수 있다.

본원에 개시된 특정 항-PcrV 항체는, 시험관 내 또는 생체 내 검정에 의해 결정했을 때, 녹농균에 결합하여 그 활성을 중화시킬 수 있다. 녹농균에 결합하여 그 활성을 중화시키는 본 개시의 항체의 능력은 본원에 기술된 것과 같은 결합 분석, 또는 활성 분석을 포함하여, 당업자에게 공지된 임의의 표준 방법을 사용하여 측정할 수 있다.

결합 활성을 측정하기 위한 비제한적인 예시적 시험관 내 검정은 본원의 실시예 3에 예시되어 있다. 실시예 3에서, 전장 PcrV(6his 표지된, 서열번호 78) 또는 절단된 PcrV(6his 표지된, 서열번호 80)에 대한 항-PcrV 항체의 결합 친화도 및 해리 상수를 Biacore에 의해 결정하였다. 실시예 6 및 7에서, 중화 검정을 사용하여 녹농균의 상이한 2가지 균주를 중화시키는 항체의 능력을 결정하였다.

PcrV에 특이적인 항체는 추가의 표지 또는 모이어티를 함유하지 않거나, N-말단 또는 C-말단 표지 또는 모이어티를 함유할 수 있다. 일 구현예에서, 표지 또는 모이어티는 비오틴이다. 결합 검정에서, 표지의 위치(있는 경우)를 통해 펩티드가 결합되는 표면에 대한 펩티드의 상대적인 배향을 결정할 수 있다. 예를 들어, 표면이 아비딘으로 코팅된 경우, N-말단 비오틴을 함유하는 펩티드는 펩티드의 C-말단 부분이 표면에 대해 원위에 있도록 배향될 것이다. 일 구현예에서, 표지는 방사성핵종, 형광 염료, 또는 MRI-검출형 표지일 수 있다. 특정 구현예에서, 이러한 표지된 항체는 영상 분석을 포함하는 진단 분석에 사용될 수 있다.

항체의 항원 결합 단편

구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 2개의 면역글로불린 중쇄 및 2개의 면역글로불린 경쇄(즉, "전체 항체 분자")를 비롯하여 이들의 항원 결합 단편을 포함하는 항체 분자를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 항체의 "항원 결합 부분", 항체의 "항원 결합 단편" 등은 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 자연적인, 또는 효소에 의해 수득할 수 있는, 또는 합성, 또는 유전자 조작된 폴리펩티드 또는 당단백질을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 항체의 "항원 결합 단편" 또는 "항체 단편"은 녹농균 PcrV에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체 단편은 Fab 단편, F(ab')₂ 단편, Fv 단편, dAb 단편, CDR 함유 단편, 또는 단리된 CDR을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 용어 "항원 결합 단편"은 다중특이적 항원 결합 분자의 폴리펩티드 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 단편은 임의의 적합한 표준 기법, 예를 들어, 단백질 가수분해성 소화 또는 항체 가변 도메인 및 (임의로) 불변 도메인을 암호화하는 DNA의 조작 및 발현을 포함하는 재조합 유전자 조작 기법을 사용하여 전체 항체 분자로부터 유도될 수 있다. 이러한 DNA는 공지되어 있고/있거나, 예를 들어 상업적인 공급원, (예를 들어, 파지-항체 라이브러리 포함하는) DNA 라이브러리로부터 쉽게 이용할 수 있거나, 합성될 수 있다. 이러한 DNA는 서열화될 수 있고, 예를 들면 하나 또는 이상의 가변 및/또는 불변 도메인을 적당한 구성으로 배열하기 위해, 또는 코돈을 도입하고, 시스테인 잔기를 생성하며, 아미노산을 변형, 첨가 또는 결실시키기 위해서 등, 화학적으로 또는 분자 생물학 기법을 사용하여 조작될 수 있다.

항원 결합 단편의 비제한적 예는: (i) Fab 단편; (ii) F(ab')2 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v) 단쇄 Fv(scFv) 분자; (vi) dAb 단편; 및 (vii) 항체의 초가변 영역(예를 들어, CDR3 펩티드와 같은 단리된 상보성 결정 영역(CDR))을 모방하는 아미노산 잔기, 또는 제한된 FR3-CDR3-FR4 펩티드로 이루어진 최소 인지 단위를 포함한다. 다른 조작된 분자, 예를 들어, 도메인 특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인-결실 항체, 키메라 항체, CDR-이식 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 나노바디(예를 들어, 1가 나노바디, 2가 나노바디 등), 작은 모듈형 면역치료제(SMIP), 및 상어 가변 IgNAR 도메인 등 또한 본원에서 사용되는 "항원 결합 단편"이란 표현에 포함된다.

항체의 항원 결합 단편은 일반적으로 적어도 하나의 가변 도메인을 포함하게 된다. 이러한 가변 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조성을 가질 수 있고, 하나 이상의 프레임워크 서열에 인접하거나 이들과 프레임 내에 있는 적어도 하나의 CDR을 일반적으로 포함하게 된다. V_L 도메인과 결합된 V_H 도메인을 갖는 항원 결합 단편에서, V_H 및 V_L 도메인은 임의의 적절한 배열로 서로에 대해 위치할 수 있다. 예를 들어, 가변 영역은 이량체로서, V_H - V_H, V_H - V_L 또는 V_L - V_L 이량체를 포함할 수 있다. 대안적으로, 항체의 항원 결합 단편은 단량체 V_H 또는 V_L 도메인을 포함할 수 있다.

특정 구현예에서, 항체의 항원 결합 단편은 적어도 하나의 불변 도메인에 공유 결합된 적어도 하나의 가변 도메인을 포함할 수 있다. 본 개시의 항체의 항원 결합 단편 내에서 발견될 수 있는 가변 및 불변 도메인의 비제한적인 예시적 구성은 다음을 포함한다: (i) V_H -C_H1; (ii) V_H -C_H2; (iii) V_H -C_H3; (iv) V_H -C_H1-C_H2; (v) V_H -C_H1-C_H2-C_H3; (vi) V_H -C_H2-C_H3; (vii) V_H -C_L; (viii) V_L -C_H1; (ix) V_L -C_H2; (x) V_L -C_H3; (xi) V_L -C_H1-C_H2; (xii) V_L -C_H1-C_H2-C_H3; (xiii) V_L -C_H2-C_H3; 및 (xiv) V_L -C_L. 위에서 열거된 임의의 예시적인 구성을 포함하는 가변 및 불변 도메인의 임의의 구성에서, 이러한 가변 및 불변 도메인은 직접적으로 상호간에 연결되거나 또는 전체 또는 부분적인 힌지 또는 링커 영역에 의해 연결될 수 있다. 힌지 영역은 단일 폴리펩티드 분자의 인접한 가변 및/또는 불변 도메인 사이에 가요성 또는 반 가요성 연결을 초래하는 적어도 2개(예를 들어, 5, 10, 15, 20, 40, 60개 또는 그 이상)의 아미노산으로 구성될 수 있다. 또한, 본 개시의 항체의 항원 결합 단편은 위에서 열거된 가변 및 불변 도메인 구성 중 어느 하나의 동종-이량체 또는 이종-이량체(또는 다른 다량체)를 (예를 들어, 이황화 결합(들)에 의해) 서로 및/또는 하나 이상의 단량체 V_H 또는 V_L 도메인과 비공유 결합으로 포함할 수 있다.

완전 항체 분자와 마찬가지로, 항원 결합 단편은 단일특이적이거나 다중 특이적(예: 이중 특이적)일 수 있다. 항체의 다중특이적 항원 결합 단편은 일반적으로 적어도 2개의 상이한 가변 도메인을 포함하게 되며, 여기서 각각의 가변 도메인은 별도의 항원에 특이적으로 결합할 수 있거나 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 본원에 개시된 예시적인 이중 특이적 항체 포맷을 포함하여, 임의의 다중 특이적 항체 포맷은 당업계에서 이용할 수 있는 일상적인 기술을 사용하여 본 개시의 항체의 항원 결합 단편의 맥락에서 사용하기에 적합할 수 있다.

인간 항체의 제조

유전자 이식 마우스에서 인간 항체를 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 임의의 공지된 방법을 본 개시의 맥락에서 사용하여 녹농균 PcrV에 특이적으로 결합하는 인간 항체를 제조할 수 있다. 다음 중 어느 하나를 포함하는 면역원이 PcrV에 대한 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시의 항체는 전장 PcrV, 예를 들어, GenBank 수탁 번호 NP_250397.1(서열번호 77) 또는 절단된 PcrV 단백질, 예를 들어, PcrV_136-257(서열번호 79)로 면역화시킨 마우스로부터 수득된다. 대안적으로, PcrV 단백질 또는 이의 단편은 표준 생화학 기술을 사용하여 생산되고 변형되어 면역원으로서 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 면역원은 재조합 PcrV 단백질 또는 이의 단편이다. 특정 구현예에서, 면역원은 상업적으로 이용 가능한 PcrV 단백질일 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 부스터 주사(booster injection)가 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 부스터 주사는 하나 이상의 상업적으로 이용 가능한 PcrV 단백질을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 면역원은 대장균(E. coli)에서 발현되거나 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포와 같은 임의의 다른 진핵생물 세포 또는 포유동물 세포에서 발현되는 재조합 PcrV 단백질일 수 있다.

단클론 항체를 생성하기 위한 VELOCIMMUNE?? 기술(예를 들어, 미국 특허 제6,596,541호, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE® 참조) 또는 기타 알려진 방법을 사용해, 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는, PcrV에 대한 고 친화도 키메라 항체를 먼저 단리한다. VELOCIMMUNE® 기술은 내인성 마우스 불변 영역 유전자좌에 작동 가능하게 연결된 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 게놈을 갖는 유전자 이식 마우스를 생성하는 것을 포함하며, 이 마우스는 항원 자극에 반응하여 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 포함하는 항체를 생산한다. 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 암호화하는 DNA는 단리되어 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 암호화하는 DNA에 작동 가능하게 연결된다. 그런 다음, DNA는 완전한 인간 항체를 발현할 수 있는 세포에서 발현된다.

일반적으로, VELOCIMMUNE® 마우스에게 관심 항원을 접종하고, 림프 세포(예컨대 B 세포)는 항체를 발현하는 마우스로부터 회수된다. 림프 세포를 골수종 세포주와 융합하여 불멸성 하이브리도마 세포주를 제조할 수 있고, 이러한 하이브리도마 세포주를 스크리닝하고 선택하여 관심 항원에 대해 특이적인 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 식별한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 암호화하는 DNA를 단리하여, 중쇄 및 경쇄의 바람직한 이소형 불변 영역에 연결할 수 있다. 이러한 항체 단백질은 세포(예: CHO 세포)에서 생산될 수 있다. 대안적으로, 항원 특이적 키메라 항체 또는 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인을 암호화하는 DNA를 항원 특이적 림프구로부터 직접 단리할 수 있다.

처음에, 고 친화도 키메라 항체를 인간 가변 영역과 마우스 불변 영역을 갖도록 단리한다. 하기 실험 섹션에서와 같이, 항체의 특성을 분석하여 친화도, 선택도, 에피토프 등을 포함하는 바람직한 특성에 맞게 선택한다. 마우스 불변 영역을 원하는 인간 불변 영역과 교체하여 완전한 인간 항체, 예를 들어 야생형 또는 변형된 IgG1 또는 IgG4를 생성한다. 선택된 불변 영역은 특이적 용도에 따라 매우 다양할 수 있지만, 고친화도 항원 결합 특성 및 표적 특이성 특성은 가변 영역에 존재한다.

생물학적 동등물

본원에 개시된 항-PcrV 항체 및 항체 단편은 기술된 항체의 아미노산 서열과는 다르지만 PcrV에 결합하는 능력을 보유하는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 이러한 변이체 항체 및 항체 단편은 부모 서열과 비교했을 때 아미노산의 하나 이상의 추가, 결실 또는 치환을 포함하지만, 기술된 항체와 본질적으로 동등한 생물학적 활성을 나타낸다. 마찬가지로, 본 개시의 항체-암호화 DNA 서열은 개시된 서열과 비교했을 때, 뉴클레오티드의 하나 이상의 추가, 결실 또는 치환을 포함하지만 본원에 개시된 항체 또는 항체 단편과 본질적으로 생물학적으로 동등한 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 서열을 포함한다.

2개의 항원 결합 단백질 또는 항체가, 예를 들어, 유사한 실험 조건 하에 동일한 몰 투약량(1회 투약량 또는 다회 투약량)으로 투여되었을 때 흡수 속도 및 정도에 있어서 유의한 차이를 보이지 않는 약학적 등가물 또는 약학적 대안인 경우, 이들은 생물학적으로 동등한 것으로 간주된다. 일부 항체가 흡수 정도에 있어서는 동등하지만 흡수 속도가 다른 경우, 이들은 등가물 또는 약학적 대안으로서 간주될 것이고, 여전히 생물학적으로 동등한 것으로 간주될 수 있는데, 그 이유는, 흡수 속도에 있어서의 이러한 차이는 의도적이고 표지에 반영되어 있으며, 예를 들어, 만성적으로 사용될 때 효과적인 신체 약물 농도를 달성하는 데 반드시 필요하지 않으며, 특정한 연구 의약품에 대해 의학적으로 유의하지 않은 것으로 간주되기 때문이다.

일 실시예에서, 2개의 항원 결합 단백질이 안전성, 순도 또는 효능에 있어서 임상적으로 의미있는 차이가 없는 경우, 이들은 생물학적으로 동등하다.

일 실시예에서, 환자가 기준 생성물을 사용하는 치료와 생물학적 생성물을 사용하는 치료 사이에서 1회 이상 전환할 수 있고, 이러한 전환이 없는 연속 요법과 비교했을 때 면역원성에 있어서의 임상적으로 유의한 변화를 포함하여 예상되는 이상 반응의 위험 증가 또는 효과의 감소가 없는 경우, 2개의 항원 결합 단백질은 생물학적으로 동등하다.

일 실시예에서, 2개의 항원 결합 단백질 둘 다가 사용 조건(들)에 대한 공통의 메커니즘 또는 공통의 작용 메커니즘(들)에 의해 이러한 메커니즘이 알려진 정도까지 작용하는 경우, 이들은 생물학적으로 동등하다.

생물학적 동등성은 생체 내 방법 및/또는 시험관 내 방법에 의해 입증될 수 있다. 생물학적 동등성 척도에는, 예를 들어: (a) 항체의 농도 또는 이의 대사가 혈액, 혈장, 혈청, 또는 기타 생물학적 유체에서 시간의 함수로서 측정되는, 인간 또는 다른 포유동물의 생체 내 시험; (b) 인간의 생체 내 생체이용율 데이터와 연관되었거나 이를 합리적으로 예측할 수 있게 하는 시험관 내 시험; (c) 항체(또는 이의 표적)의 적절한 급성 약리학적 효과가 시간의 함수로서 측정되는, 인간 또는 다른 포유동물의 생체 내 시험; 및 (d) 항체의 안전성, 효능, 또는 생체이용률이나 생물학적 동등성을 확립하는 잘 조절된 임상 시험이 있다.

본원에 개시된 항체의 생물학적으로 동등한 변이체는, 예를 들어, 잔기 또는 서열의 다양한 치환을 만들거나 생물학적 활성에 필요하지 않은 말단 또는 내부 잔기 또는 서열을 결실함으로써 작제할 수 있다. 예를 들어, 생물학적 활성에 필수적인 시스테인 잔기를 결실시키거나 다른 아미노산과 치환하여, 변성 시에 불필요하거나 부정확한 분자내 이황화 브리지가 형성되는 것을 방지할 수 있다. 다른 맥락에서, 생물학적으로 등등한 항체는 항체의 당화 특성을 바꾸는 아미노산 변화를 포함하는 항체 변이체, 예를 들어, 당화를 제거하거나 없애는 돌연변이를 포함할 수 있다.

Fc 변이체를 포함하는 항-PcrV 항체

특정 구현예에 따르면, 예를 들어, 중성 pH에 비해 산성 pH에서 FcRn 수용체에 대한 항체 결합을 강화시키거나 감쇠시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-PcrV 항체가 제공된다. 예를 들어, 본 개시는 Fc 도메인의 C_H2 또는 C_H3 영역에서 돌연변이를 포함하는 항-PcrV 항체를 포함하되, 돌연변이(들)는 산성 환경에서(예를 들어, pH가 약 5.5 내지 6.0 범위인 엔도솜에서) FcRn에 대한 Fc 도메인의 친화도를 증가시킨다. 이러한 돌연변이는, 동물에게 투여되는 경우 항체의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. 이러한 Fc 변형의 비제한적인 예는, 예를 들어, 위치 250의 변형(예: E 또는 Q); 250 및 428에서의 변형(예: L 또는 F); 252에서의 변형(예: L/Y/F/W 또는 T), 254에서의 변형(예: S 또는 T), 및 256에서의 변형(예: S/R/Q/E/D 또는 T); 또는 위치 428 및/또는 433에서의 변형(예: H/L/R/S/P/Q 또는 K) 및/또는 434에서의 변형(예: A, W, H, F 또는 Y [N434A, N434W, N434H, N434F 또는 N434Y]); 또는 위치 250 및/또는 428에서의 변형; 또는 위치 307 또는 308에서의 변형(예: 308F, V308F), 및 434에서의 변형을 포함한다. 일 구현예에서, 변형은 428L(예: M428L) 및 434S(예: N434S) 변형; 428L, 259I(예: V259I), 및 308F(예: V308F) 변형; 433K(예: H433K) 및 434(예: 434Y) 변형; 252, 254, 및 256(예: 252Y, 254T, 및 256E) 변형; 250Q 및 428L 변형(예: T250Q 및 M428L); 및 307 및/또는 308 변형(예: 308F 또는 308P)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 변형은 265A(예: D265A) 및/또는 297A(예: N297A) 변형을 포함한다.

예를 들어, 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이의 하나 이상의 쌍 또는 군을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-PcrV 항체가 본원에 제공된다: 250Q 및 248L(예: T250Q 및 M248L); 252Y, 254T 및 256E(예: M252Y, S254T 및 T256E); 428L 및 434S(예: M428L 및 N434S); 257I 및 311I(예: P257I 및 Q311I); 257I 및 434H(예: P257I 및 N434H); 376V 및 434H(예: D376V 및 N434H); 307A, 380A 및 434A(예: T307A, E380A 및 N434A); 및 433K 및 434F(예: H433K 및 N434F). 전술한 Fc 도메인 돌연변이 및 본원에 개시된 항체 가변 도메인 내의 다른 돌연변이의 모든 가능한 조합은 본 개시의 범위 내에 있는 것으로 고려된다.

본 개시는 또한 키메라 중쇄 불변(C_H) 영역을 포함하는 항-PcrV 항체를 포함하며, 키메라 C_H 영역은 하나 이상의 면역글로불린 이소형의 C_H 영역 유래의 분절을 포함한다. 예를 들어, 본 개시의 항체는, 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 분자 유래의 C_H3 도메인의 일부 또는 전부와 조합된, 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 분자 유래의 C_H2 도메인의 일부 또는 전부를 포함하는 키메라 C_H 영역을 포함할 수 있다. 특정 구현예에 따르면, 본원에 제공된 항체는 키메라 힌지 영역을 갖는 키메라 C_H 영역을 포함한다. 예를 들어, 키메라 힌지는 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 힌지 영역 유래의 "하부 힌지" 서열(EU 넘버링에 따른 위치 228 내지 236에서의 아미노산 잔기)과 조합된, 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 힌지 영역 유래의 "상부 힌지" 아미노산 서열(EU 넘버링에 따른 위치 216 내지 227에서의 아미노산 잔기)을 포함할 수 있다. 특정 구현예에 따르면, 키메라 힌지 영역은 인간 IgG1 또는 인간 IgG4 상부 힌지 유래의 아미노산 잔기, 및 인간 IgG2 하부 힌지 유래의 아미노산 잔기를 포함한다. 본원에 기술된 바와 같은 키메라 C_H 영역을 포함하는 항체는, 특정 구현예에서, 항체의 치료 특성 또는 약동학적 특성에 나쁜 영향을 미치지 않으면서 변형된 Fc 효과기 기능을 나타낼 수 있다. (예를 들어, 2013년 2월 1일에 출원된 미국 특허 가출원 제61/759,578호 참조).

항체의 생물학적 특성

일반적으로, 본 개시의 항체는 PcrV에 결합함으로써 기능한다. 예를 들어, 본 개시는, 예를 들어 본원에 기술된 것과 같은 검정 포맷을 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 측정했을 때, (예를 들어, 25℃ 또는 37℃에서) 10^-7 M 미만의 K_D로 PcrV 또는 PcrV_136-257에 결합하는 항체 및 항체의 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어 본원에 기술된 것과 같은 검정 포맷을 사용해 표면 플라스몬 공명 또는 실질적으로 유사한 검정에 의해 측정했을 때, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 약 1 nM 미만, 약 500 pM 미만, 250 pM 미만, 또는 100 pM 미만의 K_D로 PcrV에 결합한다.

본 개시는, 예를 들어 본원에 기술된 것과 같은 검정 포맷을 사용해, 25℃에서 표면 플라스몬 공명 또는 실질적으로 유사한 검정에 의해 측정했을 때 약 10분을 초과하는 해리 반감기(t½)로 PcrV에 결합하고, 37℃에서 표면 플라스몬 공명 또는 실질적으로 유사한 검정에 의해 측정했을 때 약 1분을 초과하는 해리 반감기로 PcrV에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 또한 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시의 항체 또는 항원 결합 단편은, 본원에 기술된 것과 같은 검정 포맷(예: mAb-포획 포맷 또는 항원-포획 포맷)을 사용해 25℃ 또는 37℃에서 표면 플라스몬 공명 또는 실질적으로 유사한 검정에 의해 측정했을 때, 약 1분 초과, 약 10분 초과, 약 30분 초과, 약 60분 초과, 약 100분 초과, 약 200분 초과, 약 300분 초과, 약 400분 초과, 약 500분 초과, 약 600분 초과, 약 700분 초과, 약 800분 초과, 약 900분 초과, 또는 약 1000분 초과의 t½로 PcrV에 결합한다.

또한, 예를 들어, 실시예 6에 표시된 것과 같은 A549 세포에서 녹농균 PcrV 매개 독성을 중화시키는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 포함된다. 일부 구현예에서, 항체는 약 10 ^{- 11} M 내지 약 10^-7 M 범위의 IC₅₀으로 녹농균 균주 6077에 대한 중화 효능을 나타낸다. 일부 구현예에서, 항체는 약 10^-9 M 내지 약 10^-7 M 범위의 IC₅₀으로 녹농균 균주 ATCC 700888에 대한 중화 효능을 나타낸다. 본원에 제공된 항체는 실시예 7에 표시된 바와 같이 녹농균 PcrV-매개 RBC 용혈을 중화시킨다. 일부 구현예에서, 항체는 약 10^-10 M 내지 약 10^-7 M 범위의 IC₅₀으로 균주 6077에 대한 중화 효능을 나타낸다. 일부 구현예에서, 항체는 약 10^-10 M 내지 약 10^-8 M 범위의 IC₅₀으로 균주 ATCC 700888에 대한 중화 효능을 나타낸다. 또한, 본원에 제공된 항체는 실시예 4에 나타낸 바와 같이 PcrV에 결합하는 다른 항체와 교차 경쟁한다.

또한, 개체의 사망을 예방하거나 모집단 사망률을 감소시키는 항체가 본원에 포함된다. 일부 구현예에서, 항체는 예방적으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 치료적으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 실시예 8에 나타낸 바와 같이, 항체는, 5 mg/kg으로 투여될 때, 폐렴의 마우스 모델에서 100% 개선된 생존율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 실시예 9에 나타낸 바와 같이, 항체는 보다 낮은 투여량, 예를 들어, 1 mg/kg, 또는 0.2 mg/kg, 또는 심지어 0.04 mg/kg에서도 개선된 생존을 나타낸다.

또한, 대상체 또는 모집단에서 세균 부하, 예를 들어 폐 세균 부하를 감소시키는 항체가 본원에 포함된다. 일부 구현예에서, 항체는 예방적으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 치료적으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 실시예 10 및 실시예 11에 나타낸 바와 같이, 항체는, 0.1 또는 0.2 mg/kg, 또는 25 mg/kg으로 투여될 때, 폐렴의 마우스 모델에서 미치료 대상체보다 3 내지 4 로그만큼 더 많은 세균 부하 감소를 나타낸다.

일 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 다음 특성 중 하나 이상을 가질 수 있다: (a) 서열번호 2, 18, 34, 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역(HCVR) 서열 중 어느 하나 내에 함유된 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3); 및 서열번호 10, 26, 42, 및 58로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역(LCVR) 중 어느 하나 내에 함유된 3개의 경쇄 경쇄 CDR(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)을 포함함; (a) 서열번호 2, 18, 34, 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역(HCVR) 서열 중 어느 하나 내에 함유된 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3); 및 서열번호 10, 26, 42, 및 58로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역(LCVR) 중 어느 하나 내에 함유된 3개의 경쇄 경쇄 CDR(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)을 포함함; (b) 완전한 인간 단클론 항체임; (c) 25℃에서 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정했을 때, 10^-8 M 미만의 해리 상수(K_D)로 전장 PcrV에 결합함; (d) 37℃에서 표면 플라스몬 공명 검정에서 측정했을 때, 10^-8 M 미만의 해리 상수(K_D)로 전장 PcrV에 결합함; (e) 세포독성 검정에서, 약 10^-11 M 내지 약 10^-8 M 범위의 IC₅₀으로 녹농균 균주 6077의 중화를 나타냄; (f) 세포독성 검정에서, 약 10^-9 M 내지 약 10^-7 M 범위의 IC₅₀으로 녹농균 균주 ATCC 700888의 중화를 나타냄; (g) 용혈 검정에서, 약 10^-10 M 내지 약 10^-6 M 범위의 IC₅₀으로 녹농균 균주 6077의 중화를 나타냄; (h) 용혈 검정에서, 약 10^-10 M 내지 약 10^-7 M 범위의 IC₅₀으로 녹농균 균주 ATCC 700888의 중화를 나타냄; (i) 급성 폐렴 모델에서, 미치료 마우스에 비해 5 mg/kg으로 예방적으로 치료한 마우스에서 녹농균 균주 6206 또는 균주 6077로 인한 사망률을 감소시킴; (j) 급성 폐렴 모델에서, 미치료 마우스에 비해 1.0, 0.2, 또는 0.04 mg/kg으로 예방적으로 치료한 마우스에서 녹농균 균주 6206 또는 균주 6077로 인한 사망률을 감소시킴; (k) 급성 폐렴 모델에서, 미치료 마우스에 비해 0.1 mg/kg 또는 0.2 mg/kg으로 예방적으로 치료한 마우스에서 녹농균 균주 6206의 폐 세균 부담을 감소시킴; (l) 급성 폐렴 모델에서, 미치료 마우스에 비해 25 mg/kg으로 예방적으로 치료한 마우스에서 녹농균 균주 PA01의 폐 세균 부담을 감소시킴; 및/또는 (m) 표 1의 HCVR 및 LCVR 아미노산 서열 중 어느 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR) 아미노산 서열을 포함하는 기준 항체와 교차 경쟁함.

관련 구현예에서, 본원에 제공된 것과 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음 특성 중 하나 이상을 가질 수 있다: (n) 약 10^-8 M 미만의 EC₅₀으로 전장 PcrV(서열번호 77)에 결합함; (o) 약 10^-8 M 미만의 EC₅₀으로 PcrV 136-233(서열번호 81)에 결합함; (p) (i) 서열번호 78의 약 150 위치 내지 약 170 위치 범위의 아미노산 잔기 및 (ii) 서열번호 78의 약 155 위치 내지 약 170 위치 범위의 아미노산 잔기와 상호작용함; 및/또는 (q) 서열번호 85 및 서열번호 86으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열과 상호작용함.

본원에 제공된 항체는 전술한 생물학적 특징 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 가질 수 있다. 항체의 특정 특성은 아래에 요약되어 있다. 항체의 다른 생물학적 특징은 본원의 실제 실시예를 포함하여 본 개시를 검토함으로써 당업자에게 명백해질 것이다.

에피토프 맵핑 및 관련 기술

녹농균 PcrV 단백질 내에서 발견되는 하나 이상의 아미노산과 상호작용하는 항-PcrV 항체가 본원에 제공된다. 항체가 결합하는 에피토프는 PcrV 단백질 내에 위치된 3개 이상의 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의) 아미노산으로 이루어진 1개의 인접 서열로 이루어질 수 있다(예: 도메인 내의 선형 에피토프). 대안적으로, 에피토프는 PcrV 단백질 내에 위치된 복수의 비인접 아미노산(또는 아미노산 서열)으로 이루어질 수 있다(예: 입체 에피토프). 예시적으로, 본원에 제공된 항-PcrV 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 PcrV 136-233(서열번호 81)에 결합할 수 있고; 서열번호 78의 약 150 위치 내지 약 170 위치 범위의 아미노산 잔기와 상호작용할 수 있고; 서열번호 78의 약 155 위치 내지 약 170 위치 범위의 아미노산 잔기와 상호작용할 수 있고/있거나; 서열번호 85 및 서열번호 86으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열과 상호작용할 수 있다.

당업자에게 공지된 다양한 기술들이 항체가 폴리펩티드 또는 단백질 내의 "하나 이상의 아미노산과 상호작용하는지" 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 기술은 예를 들어, Harlow 및 Lane의 문헌[Antibodies, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY]에 기술된 것과 같은 일상적인 교차-차단 검정을 포함한다. 다른 방법은 알라닌 스캐닝 돌연변이 분석, 펩티드 블롯 분석(Reineke (2004) Methods Mol. Biol. 248: 443-63 참조), 펩티드 절단 분석, 결정학적 연구 및 NMR 분석을 포함한다. 또한, 에피토프 절제, 에피토프 추출 및 항원의 화학적 변형과 같은 방법이 사용될 수 있다(Tomer 2000, Prot. Sci. 9:487-496 참조). 항체가 상호 작용하는 폴리펩티드 내의 아미노산을 식별하는데 사용될 수 있는 또 다른 방법은 질량 분석법에 의해 검출되는 수소/중수소 교환이다. 일반적으로 말하자면, 수소/중수소 교환 방법은 관심 단백질을 중수소-표지하는 단계, 이어서 항체를 중수소-표지된 단백질에 결합시키는 단계를 포함한다. 이어서, 단백질/항체 복합체는 물로 전달되고, 항체 복합체에 의해 보호되는 아미노산 내의 교환 가능한 양성자는 계면(interface)의 일부가 아닌 아미노산 내의 교환 가능한 양성자보다 느린 속도로 중수소-대-수소 역교환를 거친다. 결과적으로, 단백질/항체 계면의 일부를 형성하는 아미노산은 중수소를 보유할 수 있고, 따라서 계면에 포함되지 않은 아미노산에 비해 상대적으로 더 높은 질량을 나타낸다. 항체 해리 후, 표적 단백질을 대상으로 프로테아제 절단 및 질량 분광 분석을 수행하여, 항체가 상호 작용하는 특정 아미노산에 상응하는 중수소-표지된 잔기를 밝혀낸다. 예를 들어, Ehring의 문헌[(1999) Analytical Biochemistry 267: 252-259; Engen 및 Smith (2001) Anal. Chem. 73: 256A-265A]을 참조한다.

용어 "에피토프"는 B 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 상의 부위를 지칭한다. B-세포 에피토프는 단백질의 3차 접힘에 의해 병치된 연속 아미노산 및 비인접 아미노산 둘 다로부터 형성될 수 있다. 연속하는 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 통상적으로 변성 용매에 노출시 유지되는 반면, 3차 접힘에 의해 형성된 에피토프는 통상적으로 변성 용매로 치료 시 손실된다. 에피토프는 특유의 공간적 형태에서 전형적으로 적어도 3개, 및 더 일반적으로, 적어도 5개 또는 8-10개 아미노산을 포함한다.

항원 구조-기반 항체 프로파일링(MAP)으로도 알려진 변형-지원 프로파일링(MAP)은, 화학적으로 또는 효소적으로 변형된 항원 표면에 대한 각 항체의 결합 프로파일의 유사성에 따라 동일한 항원에 대해 유도된 다수의 단클론 항체(mAb)를 분류하는 방법이다(US 2004/0101920 참조). 각각의 범주는 또 다른 범주로 표현되는 에피토프와 명백히 상이하거나 부분적으로 이와 중첩하는 고유 에피토프를 반영할 수 있다. 이러한 기술은 유전적으로 동일한 항체의 신속한 필터링을 가능하게 하여, 유전적으로 구별되는 항체 위주의 특성 분석이 이뤄질 수 있다. 하이브리도마 스크리닝에 적용될 때, MAP는 원하는 특성을 가진 mAb를 생성하는 희귀 하이브리도마 클론의 식별을 용이하게 할 수 있다. MAP는 항체를 상이한 에피토프에 결합하는 항체의 그룹으로 분류하는데 사용될 수 있다.

특정 구현예에서, 항-PcrV 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 PcrV 단백질로 예시된 영역 중 임의의 하나 이상의 내에 있는 에피토프(천연 형태이거나 재조합적으로 생산된 것)에 결합하거나 이의 단편에 결합한다.

본 개시는 동일한 에피토프 또는 에피토프의 일부분에 결합하는 항-PcrV 항체를 포함한다. 마찬가지로, 본 개시는 또한, PcrV 단백질 또는 이의 단편에 결합하기 위해 본원에 기술된 특정 예시적인 항체 중 어느 하나와 경쟁하는 항-PcrV 항체를 포함한다. 예를 들어, 본 개시은 PcrV에 결합하기 위해 표 1 및 표 2에 기술된 항체들로부터 수득된 하나 이상의 항체와 교차 경쟁하는 항-PcrV 항체를 포함한다.

당업자는 당업계에 알려진 일상적인 방법을 사용하여, 항체가 기준 항-PcrV 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지, 또는 결합을 위해 이와 경쟁하는지 여부를 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어, 시험 항체가 본 개시의 기준 항-PcrV 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위해, 기준 항체를 포화 조건 하에 PcrV 단백질 또는 펩티드에 결합시킨다. 다음으로, PcrV 단백질에 결합하는 시험 항체의 능력을 평가한다. 기준 항-PcrV 항체와의 포화 결합 후에 시험 항체가 PcrV에 결합할 수 있다면, 시험 항체가 기준 항-PcrV 항체와 다른 에피토프에 결합하는 것으로 결론을 내릴 수 있다. 반면, 기준 항-PcrV 항체와의 포화 결합 후에 시험 항체가 PcrV에 결합할 수 없다면, 시험 항체는 본원에 제공된 기준 항-PcrV 항체가 결합된 에피토프와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.

항체가 결합을 위해 기준 항-PcrV 항체와 경쟁하는지 여부를 결정하기 위해, 전술한 결합 방법론이 2가지 방향으로 수행된다: 제1 방향에서, 포화 조건 하에서 기준 항체를 PcrV 단백질에 결합시키고, 이어서 PcrV 단백질에 대한 시험 항체의 결합을 평가한다. 제2 방향에서, 포화 조건 하에서 시험 항체를 PcrV 단백질에 결합시키고, 이어서 PcrV 단백질에 대한 기준 항체의 결합을 평가한다. 만약, 2가지 방향 모두에서, 제1 (포화) 항체만이 PcrV 단백질에 결합할 수 있다면, 시험 항체 및 기준 항체가 PcrV에 결합하기 위해 경쟁하는 것으로 결론을 내린다. 당업자가 이해할 수 있듯이, 결합을 위해 기준 항체와 경쟁하는 항체는 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합할 필요는 없지만, 중첩 또는 인접한 에피토프에 결합함으로써 기준 항체의 결합을 입체적으로 차단할 수 있다.

2개의 항체 각각이 항원에 대한 타 항체의 결합을 경쟁적으로 억제(차단)하는 경우, 이들은 동일한 에피토프 또는 중첩되는 에피토프에 결합한다. 즉, 경쟁적 결합 검정에서 측정했을 때, 1배, 5배, 10배, 20배 또는 100배 과량의 일 항체가 타 항체의 결합을 적어도 50%만큼, 바람직하게는 75%, 90% 또는 심지어 99%만큼 억제한다(예를 들어, Junghans 등의 Cancer Res. 1990 50:1495-1502 참조). 대안적으로, 일 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 항원 내의 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이가 타 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우, 2개의 항체는 동일한 에피토프를 갖는다. 일 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 일부 아미노산 돌연변이가 타 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우, 2개의 항체는 중첩하는 에피토프를 갖는다.

그런 다음, 추가의 일상적인 실험(예: 펩티드 돌연변이 및 결합 분석)을 수행하여, 시험 항체의 관찰된 결합 결여가 실제로 기준 항체와 동일한 에피토프에 대한 결합으로 인한 것인지, 또는 입체적 차단(또는 다른 현상)이 관찰된 결합 결여의 원인인지 여부를 확인할 수 있다. 이러한 정렬 실험은 ELISA, RIA, 표면 플라스몬 공명, 유세포 계측법 또는 당업계에서 이용할 수 있는 임의의 다른 정량적 또는 정성적 항체 결합 분석법을 사용하여 수행될 수 있다.

면역접합체

본 개시는 녹농균 감염증을 치료하기 위한 항생제와 같은 치료 모이어티("면역접합체")에 접합된 인간 항-PcrV 단클론 항체를 제공한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역접합체(immunoconjugate)"는 방사성 제제, 사이토카인, 인터페론, 표적 또는 리포터 모이어티, 효소, 펩티드 또는 단백질 또는 치료제에 화학적으로 또는 생물학적으로 결합된 항체를 지칭한다. 항체는 그이 표적에 결합할 수 있도록 분자를 따라 임의의 위치에서 방사성 제제, 사이토카인, 인터페론, 표적 또는 리포터 모이어티, 효소, 펩티드 또는 치료제에 결합될 수 있다. 면역접합체의 예는 항체 약물 접합체 및 항체-독소 융합 단백질을 포함한다. 일 구현예에서, 제제는 녹농균에 대해 두 번째로 상이한 항체일 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 감염된 세포에 특이적인 제제에 접합될 수 있다. 항-PcrV 항체에 접합될 수 있는 치료 모이어티의 유형은 치료 대상 병태 및 달성해야 할 원하는 치료 효과를 고려하게 된다. 면역접합체를 형성하기 위한 적절한 제제의 예는 당업계에 공지되어 있다; 예를 들어, WO 05/103081 참조.

다중특이적 항체

본원에 제공된 항체는 단일 특이적, 이중 특이적, 또는 다중 특이적일 수 있다. 다중특이적 항체는 하나의 표적 폴리펩티드의 상이한 에피토프에 특이적이거나 둘 이상의 표적 폴리펩티드에 특이적인 항원 결합 도메인을 함유할 수 있다. 예를 들어, Tutt 등의 문헌[1991, J. Immunol. 147:60-69]; Kufer 등의 문헌[2004, Trends Biotechnol. 22:238-244] 참조.

본원에 제공된 다중 특이적 항원 결합 분자 중 어느 하나 또는 이의 변이체는 당업자가 알 수 있듯이, 표준 분자 생물학적 기술(예컨대 재조합 DNA 및 단백질 발현 기술)을 이용해 작제될 수 있다.

일부 구현예에서, 녹농균 특이적 항체는 이중 특이적 포맷("이중 특이성")으로 생성되며, 여기서 녹농균 PcrV의 구별되는 도메인에 결합하는 가변 영역들은 함께 연결되어 단일 결합 분자 내에 이중 항원 특이성을 부여한다. 적절하게 설계된 이중 특이성은 특이성과 결합 친화성 둘 다를 증가시킴으로써 전체적인 T3SS 억제 효능을 강화시킬 수 있다. 개별 도메인에 대한 특이성을 갖거나, 하나의 도메인 내의 상이한 영역에 결합할 수 있는 가변 영역은, 각각의 영역을 동시에 별개 에피토프에 결합시키거나 하나의 도메인 내의 상이한 영역에 결합시키는 구조 골격 상에서 쌍을 이룬다. 이중 특이성에 대한 일 예에서, 하나의 도메인에 대해 특이성을 갖는 결합제에서 유래된 중쇄 가변 영역 (V_H)은 제2 도메인에 대해 특이성을 갖는 일련의 결합제에서 유래된 경쇄 가변 영역(V_L)과 재조합되어 원래 V_H에 대한 원래 특이성을 파괴하지 않고도 해당 V_H와 쌍을 이룰 수 있는 비-접합 V_L 파트너를 식별한다. 이러한 방식으로, 단일 V_L 세그먼트(예를 들어, V_L1)는 2개의 상이한 V_H 도메인(예를 들어, V_H1 및 V_H2)와 조합되어 2개의 결합 "아암"(V_H1- V_L1 및 V_H2- V_L1)을 포함하는 이중특이성을 생성할 수 있다. 단일 V_L 세그먼트를 사용하면 시스템의 복잡성이 감소하므로, 이중특이성을 생성하는 데 사용된 클로닝, 발현 및 정제 과정이 단순화되고 그 효율이 증가한다(예를 들어, USSN13/022759 및 US2010/0331527 참조).

대안적으로, 둘 이상의 도메인 및 제2 표적(예를 들어, 두 번째 상이한 항-녹농균 항체를 포함하되 이에 한정되지 않음)에 결합하는 항체는 본원에 설명된 기술, 또는 당업자에게 공지된 다른 기술을 사용하여 이중 특이적 포맷으로 제조될 수 있다. 구별되는 영역에 결합하는 항체 가변 영역은, 예를 들어, 녹농균 상의 관련 부위에 결합하는 가변 영역과 함께 연결되어 단일 결합 분자 내에 이중-항원 특이성을 부여할 수 있다. 이러한 속성의 적절히 설계된 이중특이성은 이중으로 기능한다. 녹농균 항원에 대한 특이성을 갖는 가변 영역은 PcrV에 대한 특이성을 갖는 가변 영역과 조합되고, 각각의 가변 영역을 별도의 항원에 결합시키는 구조 골격 상에서 쌍을 이룬다.

본 개시의 맥락에서 사용될 수 있는 예시적인 이중특이적 항체 포맷은 제1 면역글로불린(Ig) C_H3 도메인 및 제2 Ig C_H3 도메인을 사용하는 것을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 Ig C_H3 도메인은 적어도 하나의 아미노산만큼 서로 상이하며, 적어도 하나의 아미노산 차이는 아미노산 차이가 없는 이중특이적 항체와 비교했을 때 단백질 A에 대한 이중특이적 항체의 결합을 감소시킨다. 일 구현예에서, 제1 Ig C_H3 도메인은 단백질 A에 결합하고, 제2 Ig C_H3 도메인은 H95R 변형(IMGT 엑손 넘버링에 의함; EU 넘버링에 의하면 H435R임)과 같이 단백질 A 결합을 감소시키거나 제거하는 돌연변이를 함유한다. 제2 C_H3은 Y96F 변형(IMGT 넘버링에 의함; EU 넘버링은 Y436F)을 추가로 포함할 수 있다. 제2 C_H3에서 발견할 수 있는 추가의 변형은 다음을 포함한다: IgG1 항체의 경우 D16E, L18M, N44S, K52N, V57M 및 V82I(IMGT에 의함; EU에 의하면 D356E, L358M, N384S, K392N, V397M 및 V422I); IgG2 항체의 경우 N44S, K52N 및 V82I(IMGT에 의함; EU에 의하면 N384S, K392N 및 V422I); 및 IgG4 항체의 경우 Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q 및 V82I(IMGT에 의함; EU에 의하면 Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q 및 V422I). 전술한 이중 특이적 항체 포맷에 대한 변형은 본 개시의 범위에 포함되는 것으로 고려된다.

본 개시의 맥락에서 사용될 수 있는 기타 예시적인 이중 특이적 포맷으로는, 예를 들어, scFv-기반의 이중 특이적 포맷 또는 디아바디 이중 특이적 포맷, IgG-scFv 융합, 이중 가변 도메인(DVD)-Ig, 콰드로마, 놉-인투-홀(knobs-into-holes), 공통 경쇄(예를 들어, 놉-인투-홀을 가지는 공통 경쇄 등), CrossMab, CrossFab, (SEED)바디, 류신 지퍼, 듀오바디, IgG1/IgG2, 이중 작용 Fab (DAF)-IgG, 및 Mab² 이중 특이적 포맷을 제한없이 포함한다(전술한 포맷의 검토를 위해, 예를 들어, Klein 등의 문헌[2012, mAbs 4:6, 1-11], 및 동 문헌에 인용된 참고문헌을 참조한다). 이중특이적 항체는 펩티드/핵산 접합을 사용해 작제될 수도 있는데, 예를 들어, 여기서 직교 화학 반응성을 갖는 비천연 아미노산은 부위특이적 항체-올리고뉴클레오티드 접합체를 생성하는 데 사용되고, 이는 정의된 조성, 원자가 및 기하학적 구조를 갖는 다량체 복합체로 자기 조립된다. (예를 들어, Kazane 등의 문헌[J. Am. Chem. Soc. [Epub: Dec. 4, 2012]] 참조).

치료적 투여 및 제형

본 개시는 본원에 제공된 항-PcrV 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 치료 조성물을 제공한다. 본 개시에 따른 치료 조성물은 제형에 혼입되어 이송, 전달, 내성 등을 개선하는 적절한 담체, 부형제, 및 기타 제제와 함께 투여될 것이다. 다수의 적절한 제형은 모든 약사들에게 예전에 공지된 처방서(formulary)에서 확인할 수 있다: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. 이러한 제형은, 예를 들어, 분말, 고약(paste), 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 지질(양이온성 또는 음이온성) 함유 소포체(예: LIPOFECTIN??), DNA 접합체, 무수 흡수 연고제, 수중유 및 유중수 유화제, 카보왁스 유화제(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고형성 겔, 및 카보왁스를 함유하는 반고형성 혼합물을 포함한다. Powell 등의 문헌 ["Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311]도 참조함.

항체의 투여량은 투여 대상체의 연령 및 크기, 표적 질환, 상태, 투여 경로 등에 따라 달라질 수 있다. 성인 환자에서 질환 또는 장애를 치료하거나 이러한 질환을 예방하기 위해 본 개시의 항체가 사용되는 경우, 일반적으로는 항체를 약 0.01 내지 약 60 mg/kg(체중), 예를 들어, 약 0.04 mg/kg, 약 0.2 mg/kg, 약 2.0 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 15 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 25 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 0.04 mg/kg 내지 약 2.0 mg/kg, 약 5 mg/kg 내지 약 60 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 또는 약 20 mg/kg 내지 약 50 mg/kg(체중)의 단일 투여량으로 투여하는 것이 유리하다. 병태의 중증도에 따라, 치료의 빈도와 기간을 조정할 수 있다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 적어도 약 0.1 mg 내지 약 800 mg, 약 1 내지 약 500 mg, 약 5 내지 약 300 mg, 또는 약 10 내지 약 200 mg, 약 100 mg, 또는 약 50 mg의 초기 투여량으로서 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 초기 투여량에 이어서 항체 또는 항원 결합 단편의 제2 또는 복수의 후속 투여량이 초기 투여량과 거의 동일하거나 적은 양으로 투여되며, 여기서 후속 투여량은 적어도 6시간 내지 24시간, 적어도 1 내지 3일; 적어도 1주; 적어도 2주; 적어도 3주; 적어도 4주; 적어도 5주; 적어도 6주; 적어도 7주; 적어도 8주; 적어도 9주; 적어도 10주; 적어도 12주; 또는 적어도 14주만큼 간격을 둔다.

리포좀을 이용한 캡슐화, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 돌연변이체 바이러스를 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개 엔도시토시스와 같은 다양한 전달 시스템이 공지되어 있고, 이를 사용해 본원에 제공된 약학적 조성물을 투여할 수 있다.(예를 들어, Wu 등의 문헌[(1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432] 참조). 도입 방법은 피내, 경피, 근육 내, 복강 내, 정맥 내, 피하, 비강 내, 경막 외, 및 경구 경로를 포함하되 이들로 제한되지는 않는다. 조성물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들면 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점막피부의 내벽(예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 기타 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 투여이거나 국소 투여일 수 있다. 약학적 조성물은 소포체로, 특히 리포좀으로 전달될 수도 있다(예를 들어, Langer의 문헌[(1990) Science 249: 1527-1533] 참조).

본원에 제공된 항체를 전달하기 위해 나노입자를 사용하는 것도 고려된다. 항체-접합 나노입자는 치료 및 진단 응용 분야에 모두 사용될 수 있다. 항체-접합 나노 입자 및 이의 제조 및 사용 방법은 Arruebo, M., 등의 2009년 문헌["Antibody-conjugated nanoparticles for biomedical applications" in J. Nanomat. Volume 2009, Article ID 439389, 24 pages, doi: 10.1155/2009/439389]에 상세하게 기술되어 있다. 나노입자는 감염된 세포를 표적화하도록 개발되어 약학적 조성물에 포함된 항체에 접합될 수 있다. 약물 전달용 나노입자는, 예를 들어, US 8257740, 또는 US 8246995에도 기술되어 있다.

특정 상황에서는, 약학적 조성물이 방출 조절 시스템으로 전달될 수 있다. 일 구현예에서, 펌프가 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 중합체 물질이 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 방출 조절 시스템은 조성물의 표적에 근접하여 배치될 수 있으므로, 전신 투여량의 일부만을 필요로 한다.

주사식 제제는 정맥 내, 피하, 피 내, 두개 내, 복강 내 및 근육 내 주사, 적가 주입 등을 위한 투여 형태를 포함할 수 있다. 이들 주사식 제제는 공지의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 주사식 제제는, 예를 들어, 주사용으로 종래에 사용되는 멸균 수성 매질 또는 유성 매질에 전술한 항체 또는 이의 염을 용해하거나, 현탁하거나, 또는 유화시킴으로써 제조될 수 있다. 주사용 수성 매질로서는, 예를 들어, 생리 식염수, 알코올(예를 들어, 에탄올)과 같은 적절한 가용화제와 조합하여 사용할 수 있고 글루코오스 및 기타 보조제 등을 함유하는 등장성 용액, 다가알코올(예: 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜), 비이온성 계면활성제[예: 폴리소르베이트 80, HCO-50(수소 첨가 피마자유의 폴리옥시에틸렌 (50 몰) 부가물)] 등이 있다. 유성 매질로서는, 예를 들어, 벤질 벤조에이트, 벤질 알코올 등과 같은 가용화제와 조합하여 사용할 수 있는 참기름, 대두유 등이 사용된다. 이렇게 제조된 주사제는 바람직하게는 적절한 앰플에 채워진다.

약학적 조성물은 표준 바늘 및 주사기를 사용하여 피하 전달되거나 정맥내 전달될 수 있다. 또한, 피하 전달의 경우, 본 개시의 약학적 조성물을 전달하는 데 펜 전달 장치가 용이하게 적용된다. 이러한 펜 전달 장치는 재사용식이거나 일회용일 수 있다. 재사용식 펜 전달 장치에는 일반적으로 약학적 조성물이 담긴 교체식 카트리지가 사용된다. 일단 카트리지 내의 모든 약학적 조성물이 투여되어 카트리지가 비면, 빈 카트리지를 쉽게 폐기하고 약학적 조성물이 담긴 새로운 카트리지로 교체할 수 있다. 그러면, 펜 전달 장치를 재사용할 수 있다. 일회용 펜 전달 장치에는 교체식 카트리지가 없다. 오히려, 일회용 펜 전달 장치는 약학적 조성물이 장치 내의 저장조에 미리 담긴 상태로 제공된다. 일단 저장조의 약학적 조성물이 소진되면, 전체 장치가 폐기된다.

다수의 재사용식 펜 전달 장치 및 자가주입 전달 장치가 본 개시의 약학적 조성물을 피하 전달하는 데 적용된다. 몇 가지를 거명하자면, AUTOPEN??(Owen Mumford, Inc., 영국 우드스톡 소재), DISETRONIC?? 펜(Disetronic Medical Systems, 스위스 버그도르프 소재), HUMALOG MIX 75/25?? 펜, HUMALOG?? 펜, HUMALIN 70/30?? 펜(Eli Lilly and Co., 인디애나주 인디애나폴리스 소재), NOVOPEN?? I, II 및 III(Novo Nordisk, 덴마크 코펜하겐 소재), NOVOPEN JUNIOR??(Novo Nordisk, 덴마크 코펜하겐 소재), BD?? 펜(Becton Dickinson, 뉴저지주 프랭클린 레이크 소재), OPTIPEN??, OPTIPEN PRO??, OPTIPEN STARLET??, 및 OPTICLIK??(Sanofi-Aventis, 독일 프랑크푸르트 소재)이 포함되지만, 분명하게는 이들로 한정되지는 않는다. 본 개시의 약학적 조성물을 피하 전달하는 데 적용되는 일회용 펜 전달 장치의 몇 가지만 거명하자면, SOLOSTAR?? 펜(Sanofi-Aventis), FLEXPEN??(Novo Nordisk), 및 KWIKPEN??(Eli Lilly), SURECLICK?? Autoinjector(Amgen, 캘리포니아주 싸우전 오크스 소재), PENLET??(Haselmeier, 독일 슈투트가르트 소재), EPIPEN(Dey, L.P.) 및 HUMIRA?? 펜(Abbott Labs, 일리노이주 애벗 파크)이 포함되지만, 분명하게는 이들로 한정되지는 않는다.

유리하게는, 전술한 경구 또는 비경구적으로 사용하기 위한 약학적 조성물은 활성 성분의 투여량에 적절히 맞춰진 단위 투여량의 투약 형태로 제조된다. 이러한 투여량 형태는, 예를 들어, 정제, 알약, 캡슐, 주사제(앰플), 좌제 등을 포함한다. 함유된 항체의 양은 일반적으로 단위 투여량의 형태의 투여량 당 약 1 내지 약 500 mg이고; 특히 주사제 형태로는, 다른 투여량 형태에 대해 항체가 약 1 내지 약 100 mg 및 약 10 내지 약 250 mg으로 함유되는 것이 바람직하다.

항체의 치료적 용도

본원에 제공된 항체는 녹농균 감염증과 연관된 질환 또는 장애 또는 병태의 치료 및/또는 예방(예방적 치료)에 유용하고/하거나 이러한 질환, 장애 또는 병태와 관련된 적어도 하나의 증상을 완화시키는데 유용하다.

특정 구현예에서, 본원에 개시된 항체는 녹농균으로 인한 폐렴, 균혈증, 골 감염증, 관절 감염증, 피부 감염증, 화상 감염증, 상처 감염증, 요로 감염증, 또는 이들의 임의의 조합을 앓고 있는 대상체를 치료하는 데 유용하다. 일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 녹농균 감염증 환자에게 치료적 투여량으로 투여될 수 있다.

일부 구현예에서, 대상체에서 녹농균 감염증의 적어도 하나의 증상의 중증도, 지속 기간, 또는 발생 빈도를 개선하거나 감소시키는 방법이 본원에 제공된다. 예를 들어, 본원에 개시된 하나 이상의 항-PcrV 항체는 질환 또는 장애의 증상 또는 병태 중 하나 이상의 중증도를 완화시키거나 예방하거나 감소시키기 위해 투여될 수 있다. 항체는 발열, 오한, 두통, 피로, 관절통, 강직, 근육통, 구토, 통증, 가려움증, 귀의 진물, 피부 발진, 고름이 들어찬 뾰루지, 눈의 통증, 눈의 발적, 폐렴, 기침, 울혈, 녹농의 연조직 방출, 달콤한 과일향, 및 요로 감염증을 포함하되 이들로 한정되지는 않는 녹농균 감염증의 적어도 하나의 증상의 중증도를 완화시키거나 감소시키는 데 사용될 수 있다.

감염증 발생 위험이 이는 대상체, 예컨대, 수술 중인 대상체, 주요 질환에 대해 치료 중인 대상체, 중증 화상을 입은 대상체, 호흡기를 사용하는 대상체, 카테터가 삽입된 대상체, 화학요법으로 치료 중인 대상체, 당뇨병을 앓고 있는 대상체, 낭성 섬유증을 앓고 있는 대상체, 결핵에 걸린 대상체, HIV에 걸린 대상체, 또는 면역 체계가 손상된 대상체 등에게 본원에 개시된 하나 이상의 항-PcrV 항체를 투여하는 것도 본원에서 고려된다.

녹농균 감염증에 걸릴 위험이 있는 다른 대상체는, 예를 들어, 자가면역 질환으로 인해 면역체계가 손상된 사람, 또는 (예를 들어, 장기 이식 후) 면역억제 요법으로 치료 중인 사람들, 백혈구를 고갈시키거나 파괴하는 특정 형태의 빈혈증에 걸린 사람들, 방사선 또는 화학요법으로 치료 중인 사람들, 또는 염증성 장애에 걸린 사람들을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.

녹농균 감염증을 중화시키기 위해 하나 이상의 항-PcrV 항체를 투여하는 것도 본원에서 고려된다. 개체 또는 세포를 노출시키는 단계는 세포 사멸로부터 보호를 강화한다. 특정 구현예에서, 노출시키는 단계는 시험관 내 또는 생체 내 단계일 수 있다. 보호 강화는 항체가 단독으로 사용되거나, 항체가 녹농균에 대한 하나 이상의 추가 치료제 또는 항체와 병용으로 사용될 때 관찰될 수 있다.

대상체에서 세균 부하를 감소시키기 위해 하나 이상의 항-PcrV 항체를 투여하는 것도 본원에서 고려된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 항-PcrV 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 대상체의 폐에서 세균 부하를 감소시킨다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 녹농균이 숙주 세포 내로 독소를 전달하는 것을 차단할 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 제공된 항-PcrV 항체를 사용한 치료는 녹농균 세균 부하를 감소시킨다. 일부 양태에서, 본원에 제공된 항-PcrV 항체를 사용한 치료는 녹농균 및 공동 감염균, 예를 들어, 그람 음성균 또는 그람 양성균의 세균 부하를 감소시킨다. 일부 양태에서, 본원에 제공된 항-PcrV 항체를 사용한 치료는 녹농균 세균 부하 및 황색 포도상구균 세균 부하를 감소시킨다.

일부 구현예에서, 녹농균 감염증을 앓고 있는 대상체 또는 녹농균 감염증에 걸릴 위험이 있는 대상체의 생존률 또는 생존 가능성을 증가시키는 방법이 본원에 제공된다.

하나 이상의 항-PcrV 항체는 낭성 섬유증을 앓고 있는 대상체의 생존률 또는 생존 가능성을 증가시키기 위해 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 대상체는 투여 시점에 폐렴 증상을 갖지 않는다.

추가의 구현예에서, 본 항-PcrV 항체는 녹농균 감염증에 걸릴 위험이 있거나 이를 앓고 있는 환자를 치료하기 위한 약학적 조성물의 제조에 사용된다. 또 다른 구현예에서, 본 항체는 녹농균 감염증을 치료하거나 완화시키는 데 유용한 것으로 당업자에게 알려진 임의의 다른 제제 또는 임의의 다른 요법과 함께 보조 요법으로서 사용된다.

병용 요법

병용 요법은 본원에 개시된 것과 같은 항-PcrV 항체 및 이러한 항체 및 이의 생물학적 활성 단편과 유리하게 병용할 수 있는 임의의 추가 치료제를 포함할 수 있다. 항체는 녹농균 감염증을 치료하는 데 사용되는 하나 이상의 약물 또는 제제와 상승적으로 병용될 수 있다.

세균 감염증을 치료하기 위한 예시적인 제제는, 예를 들어, 항생제, 항염증제(예를 들어, 코르티코스테로이드 및 비-스테로이드성 항염증제), 녹농균에 대한 상이한 항체, 또는 녹농균 감염증의 증상을 치료하거나 환자에게서 세균 부하를 감소시키기 위한 임의의 다른 완화 요법(palliative therapy)을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제2 치료제는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 연관된 임의의 가능한 이상 사례(들)가 발생할 수 밖에 없는 경우, 이에 대항하거나 이를 감소시키는 데 도움이 되는 제제일 수 있다.

항-PcrV 항체와 유리하게 조합될 수 있는 예시적인 제제는, 녹농균에 결합하고/하거나 녹농균 활성을 억제하는 다른 제제(다른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 등을 포함함) 및/또는 PcrV 또는 다른 녹농균 항원에 직접 결합하지는 않지만 숙주 세포의 감염성을 포함하여 세균 활성을 억제하는 제제를 제한없이 포함한다. 일부 양태에서, 제2 치료제는 녹농균과 공동 감염을 야기할 수 있는 상이한 유기체, 예를 들어, 황색 포도상구균(S. aureus)과 같은 그람 양성 유기체 또는 그람 음성 유기체와 관련된 감염증을 치료하기 위한 치료제일 수 있다. 일부 양태에서, 추가 치료제는 공동 감염증을 치료하는 데 유용한 치료제이다. 일부 양태에서, 추가 치료제는 황색 포도상구균 공동 감염증을 치료하는 데 유용하다.

항-PcrV 항체와 병용하기 위한 예시적인 항생제는 다음을 포함한다: 페니실린 (피페라실린, 피페라실린/타조박탐, 메졸로실린, 티카르실린, 티카르실린/클라불라네이트), 세팔로스포린 (세프타지딤, 세포페라존, 세페핌), 카르바페넴 (이미페넴/실라스타틴; 메로페넴), 모노박탐 (아즈트레오남), 아미노글리코시드 (토브라마이신, 겐타마이신, 아미카신), 플루오로퀴놀론 (시프로플로가신, 레보플록사신), 및 기타 (폴리믹신 B, 콜르시틴). 일반적인 치료 요법은 다음을 포함한다: 균혈증의 경우: 페니실린 + 아미노글리코시드; 페니실린 + 시프로플록사신; 세팔로스포린, 아즈트레오남 또는 카르바페넴 + 아미노글리코시드 또는 시프로플록사신; CNS 감염증의 경우: 세프타지딤 (임의로 + 아미노글리코시드); 세페핌; 시프로플록사신; 아즈트레오남; 메로페넴; 골 감염증 또는 관절 감염증의 경우: 페니실린 + 아미노글리코시드 또는 시프로플록사신; 세팔로스포린; 아즈트레오남; 플루오로퀴놀론; 카르바페넴; 외이도염의 경우: 세팔로스포린; 카르바페넴; 시프로플록사신; 세팔로스포린 + 아미노글리코시드; (눈의) 각질염/각막 궤양의 경우: 토브라마이신(국소) (임의로 + 피페라실린 또는 티카르실린(국소)); 시프로플록사신 또는 오플록사신(국소); 및 요로 감염증의 경우: 시프로플록사신; 아미노글리코시드; 페니실린; 세팔로스포린; 카르바페넨. (예를 들어, Kasper, D. L(eds) 등의 문헌[Harrison's Principles of Internal Medicine, 16th Ed., McGraw-Hill, 2005] 참조).

일 구현예에서, 하나 이상의 추가 치료제는 하나 이상의 항-PcrV 항체를 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 치료제는 또 다른 상이한 항체, 예를 들어, 또 다른 녹농균 항체이며, 여기서 상이한 항체(들)는 PcrV에 결합하거나 결합하지 않을 수 있거나, PcrV 상의 동일한 에피토프 또는 중첩 에피토프에 결합하거나 결합하지 않을 수 있다. 특정 구현예에서, 제2 치료제는 상이한 녹농균 항원에 대한 항체이다. 특정 구현예에서, 제2 치료제는 상이한 감염균, 예를 들어, 황색 포도상구균에 대한 항체이다. 일부 구현예에서, 비경쟁 항체가 조합되어 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 조합을 포함하는 항체는 T3SS 메커니즘의 활성을 차단할 수 있고/있거나 세균의 일부 다른 활성을 억제할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "병용으로(in combination with)"는 추가의 치료적 활성 성분(들)이 본원에 제공된 항-PcrV 항체의 투여 전에, 동시에, 또는 후에 투여될 수 있음을 의미한다. 용어 "병용으로"는 항-PcrV 항체 및 제2 치료제의 순차적 또는 동시 투여를 또한 포함한다.

추가의 치료적 활성 성분(들)은 항-PcrV 항체의 투여 이전에 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 제1 성분이 제2 성분을 투여하기 1주일 전, 72시간 전, 60시간 전, 48시간 전, 36시간 전, 24시간 전, 12시간 전, 6시간 전, 5시간 전, 4시간 전, 3시간 전, 2시간 전, 1시간 전, 30분 전, 15분 전, 10분 전, 5분 전, 또는 1분 미만 전에 투여되는 경우, 제1 성분은 제2 성분 "이전에" 투여되는 것으로 간주될 수 있다. 다른 구현예에서, 추가의 치료적 활성 성분(들)은 항-PcrV 항체의 투여 이후에 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 제1 성분이 제2 성분을 투여하고 1분 후, 5분 후, 10분 후, 15분 후, 30분 후, 1시간 후, 2시간 후, 3시간 후, 4시간 후, 5시간 후, 6시간 후, 12시간 후, 24시간 후, 36시간 후, 48시간 후, 60시간 후, 72시간 후에 투여되는 경우, 제1 성분은 제2 성분 "이후에" 투여되는 것으로 간주될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 추가의 치료적 활성 성분(들)은 항-PcrV 항체의 투여와 동시에 대상체에게 투여될 수 있다. 본 개시의 목적을 위해, "동시" 투여는, 예를 들어, 항-PcrV 항체 및 추가의 치료적 활성 성분을 단일 투여 형태로 대상체에게 투여하는 것, 또는 별도의 투여 형태로 서로 약 30분 이내의 간격을 두고 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 별도의 투여 형태로 투여되는 경우, 각 투여 형태는 동일한 경로를 통해 투여될 수 있고(예를 들어, 항-PcrV 항체 및 추가의 치료적 활성 성분 모두 정맥 내 등으로 투여될 수 있음); 대안적으로, 각 투여 형태는 상이한 경로를 통해 투여될 수 있다(예를 들어, 항-PcrV 항체는 정맥 내 투여되고, 추가의 치료적 활성 성분은 경구 투여될 수 있음). 어떤 경우에도, 본 발명의 목적을 위해, 조성물을 단일 투여 형태로 투여하거나, 동일한 경로에 의해 별도의 투여 형태로 투여하거나, 상이한 경로에 의해 별도의 투여 형태로 투여하는 것은 모두 "동시 투여"로서 간주된다. 본 개시의 목적을 위해, 항-PcrV 항체를 추가의 치료적 활성 성분의 투여 "이전", "동시" 또는 "이후"(이들 용어는 위의 본원에 정의되어 있음)에 투여하는 것은 항-PcrV 항체를 추가의 치료적 활성 성분과 "병용" 투여하는 것으로 간주된다.

본 개시는, 본원에 기술된 항-PcrV 항체가 본 개시의 다른 곳에 기술된 것과 같은 추가의 치료적 활성 성분(들) 중 하나 이상과 공동으로 제형화되는 약학적 조성물을 포함한다.

투여 요법

특정 구현예에 따르면, 본원에 개시된 항-PcrV 항체(또는 항-PcrV 항체와 본원에서 언급된 추가의 치료적 활성제중 어느 하나의 조합을 포함하는 약학적 조성물)의 단일 투여량이 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 특정 구현예에 따르면, 항-PcrV 항체(또는 항-PcrV 항체와 본원에서 언급된 추가의 치료적 활성제 중 어느 하나의 조합을 포함하는 약학적 조성물)의 다회 투여량이 정의된 시간 과정에 걸쳐 대상체에게 투여될 수 있다. 본 개시의 이러한 양태에 따른 상기 방법은 본원에 기술된 항-PcrV 항체의 다회 투여량을 대상체에게 순차적으로 투여하는 단계를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "순차적 투여"는 항-PcrV 항체의 각 투여량이 상이한 시점에, 예를 들어, 소정의 간격(예: 시간, 일, 주, 또는 월)만큼 분리된 상이한 날에 대상체에게 투여됨을 의미한다. 본 개시는 항-PcrV 항체의 1회 초기 투여량에 이어서 항-PcrV 항체의 하나 이상의 2차 투여량을 환자에게 순차적으로 투여하고, 이어서 항-PcrV 항체의 1회 이상의 3차 투여량을 임의로 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.

용어 "초기 투여량", "2차 투여량" 및 "3차 투여량"은 본원에 개시된 항-PcrV 항체의 시간적 투여 순서를 지칭한다. 따라서, "초기 투여량"은 치료 처방의 시작 시 투여되는 투여량("베이스라인 투여량"으로도 지칭됨); "2차 투여량"은 초기 투여 후 투여되는 투여량이고; "3차 투여량"은 2차 투여 후 투여되는 투여량이다. 초기, 2차, 및 3차 투여량은 모두 동일한 양의 항-PcrV 항체를 함유할 수 있지만, 일반적으로 투여 빈도의 관점에서 서로 다를 수 있다. 그러나, 특정 구현예에서, 초기, 2차, 및/또는 3차 투여량에 함유된 항-PcrV 항체의 양은 치료 과정 동안 서로 다를 수 있다(예를 들어, 적절하게 상향 또는 하향 조절됨). 특정 구현예에서, 2가지 이상의(예: 2, 3, 4, 또는 5가지) 투여량이 치료 요법 시작 시 "로딩 투여량"으로서 투여되고, 이어서 후속 투여량(예: "유지 투여량")이 투여되며, 후속 투여량은 더 적은 빈도로 투여된다.

특정 예시적인 구현예에서, 각각의 2차 및/또는 3차 투여량은 직전 투여량의 1 내지 48시간 이후에 (예, 1, 1½, 2, 2½, 3, 3½, 4, 4½, 5, 5½, 6, 6½, 7, 7½, 8, 8½, 9, 9½, 10, 10½, 11, 11½, 12, 12½, 13, 13½, 14, 14½, 15, 15½, 16, 16½, 17, 17½, 18, 18½, 19, 19½, 20, 20½, 21, 21½, 22, 22½, 23, 23½, 24, 24½, 25, 25½, 26, 26½시간 또는 그 이상 후에) 투여된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "직전 투여량(the immediately preceding dose)"라는 문구는, 다회 투여의 순서에 있어서, 순서 상 바로 다음 투여량이 환자에게 투여되기 전에 투여되는 항-PcrV 항체의 투여량을 의미하고, 이들 사이에 개재되는 투여량이 없음을 의미한다.

상기 방법은 항-PcrV 항체의 임의의 수의 2차 및/또는 3차 투여량을 환자에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 1회의 2차 투여량만이 환자에게 투여된다. 다른 구현예에서, 2회 이상의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8회 또는 그 이상의) 2차 투여량이 환자에게 투여된다. 마찬가지로, 특정 구현예에서, 1회의 3차 투여량만이 환자에게 투여된다. 다른 구현예에서, 2회 이상의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8회 또는 그 이상의) 3차 투여량이 환자에게 투여된다.

특정 구현예에서, 2차 및/또는 3차 투여량이 환자에게 투여되는 빈도는 치료 요법의 과정에 걸쳐 달라질 수 있다. 투여 빈도는 임상 검사 후 개별 환자의 필요에 따라 의사가 치료 과정 동안 조정할 수도 있다.

약학적 조성물

표 1에 따른 하나 이상의 항-PcrV 항체를 포함하고, 예를 들어, 이의 하나 이상의 (예를 들어, 1, 2, 또는 3가지) 성분을 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제와 혼합된 형태로 포함하는 약학적 제형이 본원에 제공된다. 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1984)를 참조한다. 이러한 약학적 조성물을 제조하는 방법으로서, 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 성분(들)과 혼합하는 단계를 포함하는 상기 방법은 이러한 방법에 의해 생산되는 약학적 조성물과 마찬가지로 본 개시의 일부를 형성한다.

본 개시의 범위는 건조시킨 (예를 들어, 동결 건조시킨) 본 개시의 항-PcrV 항체 및 약학적 조성물을 포함하며, 여기서 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하되 실질적으로 물을 포함하지는 않는다. 일 구현예에서, 약학적 제형은 수성(물 포함)이다. 본 개시의 일 구현예에서, 약학적 제형은 멸균성이다.

치료제의 약학적 제형은, 허용 가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제와, 예를 들어 동결 건조 분말, 슬러리, 수용액 또는 현탁액의 형태로 혼합함으로써 제조될 수 있다(예를 들어, Hardman 등의 문헌[(2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.]; Gennaro의 문헌[(2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y.]; Avis (eds.) 등의 문헌[(1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY]; Lieberman (eds.) 등의 문헌[(1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY]; Lieberman (eds.) 등의 문헌[(1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY]; Weiner 및 Kotkoskie의 문헌[(2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.] 참조).

항-PcrV 항체를 포함하는 약학적 조성물의 투여 방식은 다양할 수 있다. 투여 경로는 경구, 직장, 경점막, 장, 비경구; 근육내, 피하, 피내, 골수내, 경막내, 직접 뇌실내, 정맥내, 복강내, 비강내, 안구내, 흡입, 취입, 국소, 피부, 경피, 또는 동맥내를 포함한다.

본 개시는 항-PcrV 항체를 포함하는 약학적 제형을 대상체(예: 인간)에게 투여하는 방법을 제공하였고, 상기 방법은 제형을 대상체의 신체 내에, 예를 들어 대상체의 정맥 내, 피하 조직 내, 또는 근육 조직 내에 도입하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 주사기 바늘로 대상체의 몸체를 천공하는 단계 및 대상체의 몸체에 제형을 주입하는 단계를 포함한다.

본원에 개시된 것과 같은 항-PcrV 항체 또는 이의 약학적 조성물(약학적으로 허용 가능한 담체를 포함함)을 포함하는 하나 이상의 용기(예를 들어, 캡이 구비된 플라스틱 또는 유리 바이알, 또는 크로마토그래피 컬럼, 중공 보어형 주사 바늘 또는 주사기 실린더)가 본원에 제공된다. 조성물을 포함하는 하나 이상의 용기를 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 조합의 성분을 하나 이상의 용기에, 예를 들어 공동 제형화된 성분의 조합을 포함하는 단일 용기에 도입하는 단계를 포함한다. 본 개시의 일 구현예에서, 용기(들)는 이어서 키트 내로 도입된다.

본원에 개시된 항-PcrV 항체 또는 이의 약학적 조성물을 포함하는 장치, 예를 들어 주사 장치, 및 이의 사용 방법이 또한 제공된다. 주사 장치는 비경구 경로, 예를 들어, 근육 내, 피하 또는 정맥내 경로를 통해 환자의 신체 내에 물질을 도입하는 장치이다. 예를 들어, 주사 장치는, 예를 들어, 주사할 유체(예를 들어, 항체 또는 이의 단편 또는 약학적 조성물을 포함함)를 담기 위한 실린더나 배럴; 유체의 주입을 위해 피부 및/또는 혈관에 찔러 넣기 위한 바늘; 및 주사 바늘 구멍을 통해 유체를 실린더 밖으로 밀어 내기 위한 플런저를 포함하는 주사기(예: 약학적 조성물로 미리 채워지거나 사용자 또는 의료인이 사용 시점에 채워질, 예컨대 자동 주사기)일 수 있다.

본원에 개시된 약학적 조성물은 또한, 무바늘 피하 주사 장치, 예컨대 미국 특허 제6620135호; 제6096002호; 제5399163호; 제5383851호; 제5312335호; 제5064413호; 제4941880호; 제4790824호; 제4596556호에 개시된 장치와 함께 투여될 수 있다. 약학적 조성물을 포함하는 이러한 무바늘 장치 및 이의 사용 방법 또한 본 개시의 일부이다.

항-PcrV 항체를 포함하는 하나 이상의 주사 장치(예: 사전 충전형 주사기 또는 자가주사기)를 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 조합의 성분을 이러한 장치 중 하나 이상, 예를 들어 항-PcrV 항체를 포함하는 단일 장치에 도입하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 주사 장치(들)는 이어서 키트 내로 도입된다.

항-PcrV 항체를 포함하는 키트가 또한 제공된다. 일 구현예에서, 키트는 용기 또는 주사 장치(예: 사전 충전형 주사기 또는 자가주사기)에 담긴 항체를 포함한다. 키트는, 키트 내의 약학적 조성물 및 투여 형태에 관한 정보를 포함하는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 일반적으로, 이러한 정보는 환자 및 의사가 동봉된 약학적 조성물을 효과적이고 안전하게 사용하는 것을 돕는다. 예를 들어, 본원에 제공된 항체에 관한 다음의 정보 중 어느 하나가 삽입물로 제공될 수 있다: 약동학, 약력학, 임상 연구, 효능 파라미터, 표시 및 용도, 금기, 경고, 주의, 부작용, 과투여량, 적절한 투여량 및 투여, 공급 방법, 적절한 보관 조건, 참고 사항, 제조업체/유통업체 정보 및 특허 정보.

항체의 진단적 사용

본원에 제공된 항-PcrV 항체는 샘플에서 녹농균을 검출 및/또는 측정하기 위해, 예를 들어, 진단 목적으로 사용될 수 있다. 일부 구현예는 본원에 제공된 하나 이상의 항체를 녹농균 감염증과 같은 질환 또는 장애를 검출하기 위한 검정에서 사용하는 것을 고려한다. 녹농균에 대한 예시적인 진단 검정은, 예를 들어, 환자로부터 수득한 샘플을 본 개시의 항-PcrV 항체와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 항-PcrV 항체는 검출 가능한 표지 또는 리포터 분자로 표지되거나, 환자 샘플로부터 녹농균을 선택적으로 단리하기 위한 포획 리간드로서 사용된다. 대안적으로, 표지되지 않은 항-PcrV 항체가 자체적으로 검출 가능하게 표지된 보조 항체와 병용으로 진단 용도에 사용될 수 있다. 검출 가능한 표지 또는 리포터 분자는 3H, 14C, 32P, 35S 또는 125I와 같은 방사성 동위원소; 플루오레세인 이소티오시아네이트 또는 로다민과 같은 형광 모이어티 또는 화학발광 모이어티; 또는 알칼라인 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 서양 고추냉이 퍼옥시다아제, 또는 루시페라아제와 같은 효소일 수 있다. 샘플에서 녹농균을 검출하거나 측정하는 데 사용할 수 있는 특정 예시적인 검정은 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), 방사성 면역분석(RIA) 및 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 포함한다.

본 개시에 따른 녹농균 진단 검정에 사용될 수 있는 샘플에는 환자로부터 얻을 수 있는 임의의 조직 또는 체액 샘플이 포함되며, 이러한 샘플은 정상적인 또는 병리학적 조건 하에서 검출 가능한 양의 녹농균 또는 이의 단편을 함유한다. 일반적으로, 건강한 환자(예: 녹농균과 관련된 질환에 걸리지 않은 환자)로부터 수득한 특정 샘플에서 녹농균의 수준을 측정하여 녹농균의 베이스라인 또는 표준 수준을 초기에 확립한다. 그런 다음, 녹농균의 베이스라인 수준을 녹농균과 관련된 병태 또는 이러한 병태와 관련된 증상을 갖는 것으로 의심되는 개체로부터 수득한 샘플에서 측정한 녹농균의 수준과 비교할 수 있다.

녹농균에 특이적인 항체는 추가의 표지 또는 모이어티를 함유하지 않거나, N-말단 또는 C-말단 표지 또는 모이어티를 함유할 수 있다. 일 구현예에서, 표지 또는 모이어티는 비오틴이다. 결합 검정에서, 표지의 위치(있는 경우)를 통해 펩티드가 결합되는 표면에 대한 펩티드의 상대적인 배향을 결정할 수 있다. 예를 들어, 표면이 아비딘으로 코팅된 경우, N-말단 비오틴을 함유하는 펩티드는 펩티드의 C-말단 부분이 표면에 대해 원위에 있도록 배향될 것이다.

실시예

다음 실시예들은 당업자에게 본원에 제공된 조성물을 제조하고 이를 사용하는 방법을 완전하게 개시하고 설명하기 위해 제시된 것으로서, 본 발명자들이 발명으로 간주하는 것의 범주를 제한하고자 하는 것이 아니다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위한 노력을 기울였으나 약간의 실험 오차와 편차에 대해서는 설명되어야 한다. 달리 표시되지 않는 한, 부(parts)는 중량 부(parts by weight)이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압이거나 거의 대기압이다.

실시예 1. 항-PcrV 항체의 생성

전장 PcrV 또는 절단된 버전의 PcrV(PcrV 136-257)를 암호화하는 DNA를 대장균 BL21(DE3)에서의 발현시키기 위해 표적 벡터 내로 클로닝하였다. 재조합 PcrV 또는 절단된 버전의 PcrV(PcrV 136-257)를, 형질변환시킨 대장균 세포 용해물의 상청액에서 정제하였다. PcrV에 대한 인간 항체를 전장 PcrV.6xHis(GenBank NP_250397.1; PAO1 균주; GenScript; 및 서열번호 77도 참조함) 또는 절단된 PcrV.6xHis 단백질(PcrV_136-257; GenScript, 및 서열번호 79도 참조함)을 사용해 생성하였다. 예를 들어, 미국 특허 제8,502,018호에 기술된 바와 같이, 면역 반응을 자극하기 위한 보조제와 함께 면역원을 VELOCIMMUNE® 마우스(즉, 인간 면역글로불린 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역을 암호화하는 DNA를 포함하는 조작된 마우스마우스)에게 직접 투여하였다. 항체 면역 반응은 PcrV-특이적 면역 검정으로 모니터링하였다. 미국 특허 번호 제7,582,298호(그 전체가 참조로서 본원에 구체적으로 통합됨)에 기술된 바와 같이, 원하는 면역 반응이 달성되었을 때, 항-PcrV 항체를 골수종 세포와 융합시키지 않고 항원 양성 B 세포로부터 직접 단리하였다. 이러한 방법을 사용하여, 여러 개의 완전한 인간 항-PcrV 항체(즉, 인간 가변 도메인 및 인간 불변 도메인을 갖는 항체)를 수득하였다.

전술한 방법에 따라 생성된 예시적인 항체를 다음과 같이 지정하였다: H1H29329P, H1H29332P, H1H29336P, 및 H1H29339P.

본 실시예의 방법에 따라 생성된 예시적인 항체의 생물학적 특성은 아래에 제시된 실시예에서 상세히 기술된다.

실시예 2. 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산 및 핵산 서열

표 1은 본 발명의 선택된 예시적 항-PcrV 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 CDR의 아미노산 서열 식별자를 제시한다. 상응하는 핵산 서열 식별자들은 표 2에 제시되어 있다. 표 3은 전장 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열에 대한 서열 식별자를 제공한다.

아미노산 서열 식별자
	서열번호
항체 명칭	HCVR	HCDR1	HCDR2	HCDR3	LCVR	LCDR1	LCDR2	LCDR3
H1H29329P	2	4	6	8	10	12	14	16
H1H29332P	18	20	22	24	26	28	30	32
H1H29336P	34	36	38	40	42	44	46	48
H1H29339P	50	52	54	56	58	60	62	64

핵산 서열 식별자
	서열번호
항체 명칭	HCVR	HCDR1	HCDR2	HCDR3	LCVR	LCDR1	LCDR2	LCDR3
H1H29329P	1	3	5	7	9	11	13	15
H1H29332P	17	19	21	23	25	27	29	31
H1H29336P	33	35	37	39	41	43	45	47
H1H29339P	49	51	53	55	57	59	61	63

전장 중쇄 및 경쇄 서열에 대한 서열 식별자
	서열번호
항체 명칭	전장 중쇄	전장 경쇄
	아미노산	아미노산
H1H29329P	65	66
H1H29332P	67	68
H1H29336P	69	70
H1H29339P	71	72

항체는 일반적으로 다음의 명명법에 따라 본원에서 지칭된다: 표 1, 2, 및 3에 표시된 바와 같이, Fc 접두어(예: "H4H")에 수치 식별자(예: "13290", "13291", "13295" 등)가 이어지고, "P" 접미어가 이어진다. 따라서, 이러한 명명법에 따라 항체는 본원에서, 예를 들어, "H1H29329P", "H1H29332P", "H1H29336P" 등으로 지칭될 수 있다. 본원에서 사용된 항체 명칭에 대한 접두어는 항체의 특정 Fc 영역 이소형을 나타낸다. 특히, "H1H" 항체는 인간 IgG1 Fc를 갖는다(모든 가변 영역은 항체 명칭이 'H'로 시작하는 것과 같이 완전한 인간이다). 당업자가 이해할 수 있듯이, 특정 Fc 이소형을 갖는 항체는 다른 Fc 이소형을 갖는 항체로 변환될 수 있지만(예를 들어, 마우스 IgG1 Fc를 갖는 항체는 인간 IgG4 등을 갖는 항체로 변환될 수 있지만), 어떤 경우에도, 표 1 내지 3에 나타낸 수치 식별자에 의해 표시되는 가변 도메인(CDR 포함)은 동일하게 유지될 것이고, 결합 특성은 Fc 도메인의 성질에 상관 없이 동일하거나 실질적으로 유사할 것으로 예상된다.

항체 비교자

제1 비교자 항체인 REGN3514(대조군 I, HC/LC 서열번호 73/74)는 WO 2013/070615에 보고된 서열을 갖는 항-PcrV 항체이다. 제2 비교자 항체인 REGN3977(대조군 III, HC/LC 서열번호 75/76)은 미국 특허 제7,494,653호에 보고된 서열을 갖는 항-PcrV 항체이다. 제3 비교자 항-PcrV 항체는 REGN7070(대조군 V, HC/LC 서열번호 83/84)이다. 이소형 대조군 항체인 REGN1932 및 REGN684(각각 대조군 II 및 IV)는 하기 실험에 사용된다.

실시예 3. 인간 단클론 항-PcrV 항체의 Biacore 결합 친화도 및 동역학 상수

정제된 항-PcrV 단클론 항체에 결합하는 상이한 PcrV 시약에 대한 평형 해리 상수(K_D)는, 실시간 표면 플라스몬 공명 기반의 Biacore T200 바이오센서를 사용해 결정하였다. 모든 결합 연구는 25℃ 및 37℃에서 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3.4 mM EDTA, 및 0.05% v/v Tween-20, pH 7.4(HBS-EP) 영동 완충액에서 수행하였다. 먼저, Biacore CM5 센서 칩 표면을 항-인간 Fcγ 특이적 다클론 항체(Jackson ImmunoResearch 카탈로그 # 109-005-098)와 아민 결합에 의해 유도체화하여 항-PcrV 단클론 항체를 포획하였다. HBS-EP 영동 완충액에서 제조한 상이한 농도의 전장 PcrV.6xhis (서열번호 78) 및 PcrV(aa136-257).6xhis (서열번호 80)(90nM ~ 3.33nM; 3배 연속 희석물)를 이용해 결합 연구를 수행하였다. 포획된 항-PcrV 단클론 항체 표면 위로 단백질을 50 μL/분의 유속으로 4분 동안 주입하면서, HBS-EP 영동 완충액 중에서 단클론 항체에 결합된 PcrV 시약의 해리를 10분 동안 모니터링하였다.

동역학 결합 속도 상수(k _a) 및 해리 속도 상수(k _d)는 Scrubber 2.0c 곡선 피팅 소프트웨어를 사용해 실시간 센서그램을 1:1 결합 모델에 피팅하여 결정하였다. 결합 해리 평형 상수(K _D) 및 해리 반감기(t½)를 동적 속도 상수로부터 다음과 같이 계산하였다:

25℃ 및 37℃에서 항-PcrV 단클론 항체에 결합하는 전장 PcrV.6xhis 및 PcrV(aaa136-257).6xhis에 대한 결합 동역학 파라미터는 표 4 내지 7에 나타나 있다.

25℃에서 전장 PcrV.6xhis에 대한 항-PcrV mAb의 결합 동역학
포획된 mAb	mAb 포획 레벨 (RU)	90nM Ag 결합 (RU)	k a (1/Ms)	k d (1/s)	KD (M)	t½ (분)
H1H29336P	283.9±2.2	102.1	4.90E+05	≤1.00E-05	2.04E-11	≥1155
H1H29339P	364.7±4.5	140.4	3.65E+05	≤1.00E-05	2.74E-11	≥1155
H1H29332P	504.4±2.8	151.9	2.37E+05	1.30E-05	5.48E-11	888.5
H1H29329P	438.4±2.3	81	1.84E+05	9.50E-04	5.16E-09	12.2
REGN3977 - 대조군 III	498.9±2.5	146.4	2.07E+05	4.95E-04	2.39E-09	23.4
REGN3514 - 대조군 I	618.6±4.9	169.4	2.67E+05	3.90E-05	1.46E-10	296.2
REGN1932 - 이소형 대조군 II	262.2±0.4	-5.9	NB	NB	NB	NB

37℃에서 전장 PcrV.6xhis에 대한 항-PcrV mAb의 결합 동역학
포획된 mAb	mAb 포획 레벨 (RU)	90nM Ag 결합 (RU)	k a (1/Ms)	k d (1/s)	KD (M)	t½ (분)
H1H29336P	272.5±1.4	80.7	8.60E+05	≤1.00E-05	1.16E-11	≥1155
H1H29339P	370.8±4.4	129.6	5.08E+05	≤1.00E-05	1.97E-11	≥1155
H1H29332P	533.4±2.1	163.2	2.93E+05	2.68E-05	9.20E-11	431.5
H1H29329P	430.7±1.8	59.6	5.54E+05	5.05E-03	9.12E-09	2.3
REGN3977 - 대조군 III	452.5±3.0	135.7	2.63E+05	9.17E-04	3.48E-09	12.6
REGN3514 - 대조군 I	517.6±2.9	141.2	4.31E+05	1.96E-04	4.53E-10	59.1
REGN1932 - 이소형 대조군 II	230.4±0.5	-22.5	NB	NB	NB	NB

25℃에서 PcrV (aa136-257).6xhis에 대한 항-PcrV mAb의 결합 동역학
포획된 mAb	mAb 포획 레벨 (RU)	90nM Ag 결합 (RU)	k a (1/Ms)	k d (1/s)	KD (M)	t½ (분)
H1H29336P	287.6±1.5	48.2	3.67E+05	1.48E-05	4.08E-11	783.1
H1H29339P	370.9±3.3	62.9	2.93E+05	2.76E-05	9.55E-11	418
H1H29332P	505.4±1.2	68.5	1.33E+05	3.83E-05	2.85E-10	302
H1H29329P	431.6±1.1	27.5	1.53E+05	2.30E-03	1.50E-08	5
REGN3977 - 대조군 III	497.7±2.6	66.6	2.23E+05	9.56E-04	4.28E-09	12.1
REGN3514 - 대조군 I	614.9±3.9	75.2	1.47E+05	1.22E-04	8.30E-10	94.7
REGN1932 - 이소형 대조군 II	262.4±0.3	0.4	NB	NB	NB	NB

37℃에서 PcrV (aa136-257).6xhis에 대한 항-PcrV mAb의 결합 동역학
포획된 mAb	mAb 포획 레벨 (RU)	90nM Ag 결합 (RU)	k a (1/Ms)	k d (1/s)	KD (M)	t½ (분)
H1H29336P	270.2±0.7	40.1	5.44E+05	4.36E-05	8.09E-11	264.7
H1H29339P	364.9±4.7	55.3	4.35E+05	8.15E-05	1.86E-10	141.8
H1H29332P	530.4±1.9	69.4	1.78E+05	1.06E-04	5.95E-10	109.2
H1H29329P	421.7±3.6	16.4	1.03E+05	1.10E-02	1.07E-07	1
REGN3977 대조군 III	445.8±2.6	54.7	2.16E+05	2.45E-03	1.14E-08	4.7
REGN3514 - 대조군 I	517.3±1.7	60.7	2.46E+05	5.96E-04	2.42E-09	19.4
REGN1932 - 이소형 대조군 II	229.0±1.5	-3	NB	NB	NB	NB

표 4에 나타낸 바와 같이, 25℃에서, 항-PcrV 단클론 항체는 20.4 pM 내지 5.16 nM 범위의 K_D 값으로 전장 PcrV.6xhis(서열번호 78)에 결합하였다. 표 5에 나타낸 바와 같이, 37℃에서, 항-PcrV 단클론 항체는 11.6 pM 내지 9.12 nM 범위의 K_D 값으로 전장 PcrV.6xhis(서열번호 78)에 결합하였다. 이소형 대조군 항체 REGN1932(대조군 II)는 결합을 나타내지 않았다.

표 6에 나타낸 바와 같이, 25℃에서, 항-PcrV 단클론 항체는 40.8 pM 내지 15.0 nM 범위의 K_D 값으로 전장 PcrV(aa136-257).6xhis(서열번호 80)에 결합하였다. 표 7에 나타낸 바와 같이, 37℃에서, 항-PcrV 단클론 항체는 80.9 pM 내지 107 nM 범위의 K_D 값으로 전장 PcrV(aa136-257).6xhis(서열번호 80)에 결합하였다. 이소형 대조군 항체 REGN1932(대조군 II)는 결합을 나타내지 않았다.

실시예 4: 항-PcvR 단클론 항체 간의 옥텟(Octet) 교차 경쟁

일 군의 항-PcrV 단클론 항체들 간의 결합 경쟁은 Octet^® HTX 바이오센서(ForteBio, A Division of Pall Life Sciences)를 이용한 실시간 비표지 바이오층 간섭 검정을 사용해 결정하였다. 전체 실험은 25℃에서, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% v/v 계면활성제 Tween-20, 및 1 mg/mL BSA, pH7.4 (HBS-EBT) 완충액 중에서, 플레이트를 1000rpm의 속도로 진탕시키면서 수행하였다. 항-Penta-his 항체로 코팅된 Octet 바이오센서 팁(ForteBio Inc, # 18-5122)을 C-말단 헥사히스티딘 태그(PcrV.6xhis; 서열번호 78)가 포함된 20 μg/mL의 전장 PcrV 용액이 담긴 웰에 90초 동안 침지시켜 약 0.62~0.74 nM의 PcrV.6xhis를 포획하였다. 이어서, 항원이 포획된 바이오센서 팁을 50 μg/mL의 mAb-1 용액이 담긴 웰에 5분 동안 침지하여 항-PcrV 단클론 항체(이하 mAb-1이라 함)로 포화시켰다. 이어서, 2개의 항체가 이들 각각의 에피토프에 결합하기 위해 경쟁하는지 여부를 평가하기 위해, 바이오센서 팁을 50 μg/mL의 제2 항-PcrV 단클론 항체(이하 mAb-2라 함) 용액이 담긴 웰에 3분 동안 침지하였다. 실험의 각 단계 사이에, HBS-ETB 완충액에서 바이오센서 팁을 세척하였다. 실시간 결합 반응을 실험의 전체 과정에 걸쳐 모니터링하고, 모든 단계가 끝난 후 결합 반응을 기록하였다. mAb-1과 미리 복합체화된 전장 PcrV.6xhis에 대한 mAb-2의 결합 반응을 비교하고, 상이한 항-PcrV 단클론 항체의 경쟁적/비경쟁적 거동을 표 8에 나타낸 바와 같이 결정하였다.

전장 PcrV.6xhis에 대한 결합을 위한 항-PcrV 항체들의 교차 경쟁
AHC 옥텟 바이오센서를 사용하여 포획된 제1 mAb-1	mAb-1과 경쟁하는 것으로 나타난 mAb-2
H1H29339P	H1H29329P
	H1H29332P
	H1H29336P
	REGN3514
H1H29329P	H1H29339P
	H1H29332P
	H1H29336P
	REGN3514
H1H29332P	H1H29339P
	H1H29329P
	H1H29336P
	REGN3514
H1H29336P	H1H29339P
	H1H29329P
	H1H29332P
	REGN3514
REGN3514 - 대조군 I	H1H29339P
	H1H29329P
	H1H29332P
	H1H29336P

실시예 5: 녹농균 PcrV 재조합 단백질에 대한 인간 단클론 항체 결합의 ELISA 검정

항-PcrV 단클론 항체(mAb)를 재조합 PcrV 단백질에 결합하는 이들의 능력에 대해 ELISA에 의해 평가하였다. Nunc MicroSorp?? 96-웰 플레이트를 웰 당 0.2 μg의 재조합 전장 녹농균 PcrV(GenScript)(서열번호 77) 또는 절단된 형태의 단백질(성숙 단백질의 아미노산 136 내지 233을 포함함; GenScript)(서열번호 81)로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날 아침에, 플레이트를 세척 완충액(Tween-20을 첨가한 이미다졸 완충 식염수)으로 3회 세척하고, 200 μl의 차단 완충액(PBS 중 3% BSA)으로 25℃에서 1.5시간 동안 차단하였다. 플레이트를 1회 세척하고, 항체 및 이소형 일치 대조군 항체(0.5% BSA/0.05% Tween-20/PBS에서 1:3으로 연속 희석시킨 33 nM 내지 0.1 pM 범위)의 적정액을 단백질이 담긴 웰에 첨가하고 25℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 웰을 3회 세척한 다음, 웰 당 100 ng/ml 항-인간 HRP 이차 항체와 함께 25℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 100 μl의 SuperSignal?? ELISA Pico 화학발광 기질을 각 웰에 첨가하고, 신호를 검출하였다(Victor X3 플레이트 판독기, Perkin Elmer). 발광 값을 10-점 반응 곡선(GraphPad Prism)에 대한 4-파라미터 로지스틱 방정식으로 분석하였다.

표 9에 나타낸 바와 같이, 모든 항-PcrV 항체는 녹농균 전장 PcrV에 대해 준-나노몰 수준의 EC₅₀ 결합을 나타냈고, 절단된 PcrV 단백질에 대해 준-나노몰 수준의 EC₅₀ 결합을 나타냈다. 항-PcrV 비교자 항체(대조군 I - REGN3514)의 준-나노몰 EC₅₀ 결합은 전장 PcrV 단백질 및 절단된 PcrV 단백질 모두에 대해 관찰된 반면, 이소형 대조군 mAb(대조군 IV - REGN684)는 어느 단백질에도 결합하지 않았다.

녹농균 PcrV 단백질에 대한 항-PcrV mAb의 결합
mAb	결합 (EC 50 ) [M]
	전장 PcrV	PcrV 136-233
H1H29329P	5.969E-10	7.438E-09
H1H29332P	2.119E-09	8.139E-10
H1H29336P	2.276E-09	1.027E-09
H1H29339P	1.961E-09	8.562E-10
대조군 I - REGN3514	6.957E-10	7.587E-09
대조군 IV - 이소형 대조군	비결합	비결합

실시예 6: PcrV 매개 세포독성을 중화시키는 녹농균 항-PcrV 단클론 항체의 능력

항-PcrV 단클론 항체를 인간 폐 상피 세포주인 A549 세포의 PcrV 매개 용해를 방지하는 능력에 대해 평가하였다. A549 세포를 Ham's F-12K(10% 열 불활성화 FBS 및 L-글루타민으로 보충됨) 중 대략 4.8x10⁵ 세포/ml의 밀도로 96-웰 플레이트(바닥이 투명하며, 검정색 조직 배양물로 처리함)에 시딩하고, 5% CO₂ 하에 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날, 세포로부터 배지를 제거하고 100 μl의 검정 배지(10% 열 불활성화 FBS가 보충되고, 페놀 레드가 없는 DMEM)로 대체하였다. 정제된 항체 또는 이소형 일치 대조군(33.3 pM 내지 1.33 μM 범위)의 적정액을 50 μl로 첨가하고, 세포를 5% CO₂ 하에 37℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다.

한편, 녹농균 균주 6077(Gerald Pier, Brigham and Women's Hospital, Harvard University) 및 ATCC 700888(ATCC)의 로그 상 배양물을 다음과 같이 제조하였다: 녹농균 배양물을 LB에서 밤새 성장시키고, 신선한 LB에서 1:50으로 희석하고, OD₆₀₀ = 약 1이 될 때까지 37℃에서 진탕하면서 성장시켰다. 배양물을 PBS로 1회 세척하고, 두 녹농균 균주 모두를 OD₆₀₀ = 0.03이 될 때까지 PBS에서 희석하였다. 세포와 항체가 담긴 웰에 50 μl의 세균을 첨가하고, 5% CO₂ 하에 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 사멸은 CytoTox-Glo?? 분석 키트(Promega)를 사용하여 결정하였다. 플레이트 판독기(Victor, Perkin Elmer)를 사용해 발광을 검출하고, 4-파라미터 로지스틱 방정식(GraphPad Prism)에 의해 발광 값을 분석하였다.

표 10에 나타낸 바와 같이, 항-PcrV mAb(H1H29329P, H1H29332P, H1H29336P, 및 H1H29339P)는 A549 세포 사멸을 예방하는 데 효능을 나타냈다. 4가지 단클론 항체 모두는 녹농균 균주 둘 다로부터 보호하였다. 대조군 항-PcrV mAb(대조군 I - REGN3514)도 세균 균주 둘 다에 대한 효능을 나타냈고, 이소형 대조군 mAb(대조군 II)는 효과가 없었다.

A549 세포독성 검정에서 녹농균 PcrV 매개 독성의 중화
mAb	A549 세포독성 검정 (IC50) [M]
	녹농균 균주 6077	녹농균 균주 ATCC 700888
H1H29329P	1.079E-08	5.428E-08
H1H29332P	6.474E-09	3.288E-08
H1H29336P	8.400E-10	6.372E-09
H1H29339P	3.329E-11	7.818E-09
대조군 I - REGN3514	8.070E-10	1.784E-08
대조군 II - 이소형 대조군	효능 없음	효능 없음

실시예 7: PcrV 매개 세포독성을 중화시키는 녹농균 항-PcrV 단클론 항체의 능력

항-PcrV 단클론 항체를 토끼 적혈구(rRBC; Colorado Serum Co.)의 PcrV 매개 용해를 방지하는 능력에 대해 평가하였다.

녹농군 균주 6077 및 균주 ATCC 700888의 밤새 배양물을 LB에서 성장시키고, 신선한 LB에서 1:50으로 희석하고, OD₆₀₀ = 약 1이 될 때까지 37℃에서 진탕하면서 성장시켰다. 배양물을 PBS로 1회 세척하고, 녹농균 균주 모두를 OD₆₀₀ = 0.15가 될 때까지 PBS에서 희석하였다. rRBC는, 50% rRBC 현탁액을 4℃에서 2000 xg의 속도로 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 PBS로 교체하고, rRBC와 PBS를 부드럽게 혼합하고, rRBC를 5%로 희석하여 제조하였다. 둥근 바닥 96 웰 플레이트에서, 10 μl의 녹농균 균주 6077 또는 ATCC 700888을 50 μl의 정제된 항체 또는 이소형 일치 대조군(33.3 pM 내지 1.33 μM 범위)의 적정액 또는 Triton X-100(용해 양성 대조군)과 혼합한 다음, 50 μl의 5% rRBC를 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 550 rpm으로 진탕하면서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간이 끝난 후, 플레이트를 25℃에서 200 xg의 속도로 1분 동안 원심분리하고, 75 μl의 상청액을 평평한 투명 바닥 플레이트로 옮기고, 플레이트 판독기(Victor X3, Perkin Elmer)를 사용해 흡광도(A₄₀₅)를 검출하고, 4-파라미터 로지스틱 방정식(GraphPad Prism)에 의해 흡광도 값을 분석하였다.

표 11에 나타낸 바와 같이, 4개의 항-PcrV mAb 모두는 rRBC 용혈을 예방하는 데 효능을 나타냈고, 녹농균 균주 둘 다에 대해 보호하였다. 대조군 항-PcrV mAb(대조군 I - REGN3514)도 세균 균주 둘 다에 대한 효능을 나타냈고, 이소형 대조군 mAb(대조군 IV - REGN684)는 효과가 없었다.

토끼 RBC 용혈 검정에서 녹농균 PcrV의 중화
mAb	토끼 RBC 용혈 검정 (IC50) [M]
	녹농균 균주 6077	녹농균 균주 ATCC 700888
H1H29329P	5.640E-08	2.389E-09
H1H29332P	1.525E-08	4.062E-09
H1H29336P	2.051E-10	8.097E-10
H1H29339P	2.302E-09	5.586E-09
대조군 I - REGN3514	2.441E-09	1.011E-09
대조군 IV - 이소형 대조군	효능 없음	효능 없음

실시예 8: 급성 폐렴의 생체 내 모델에서 항-PcrV 단클론 항체의 효능

토끼 적혈구(RBC) 용혈 검정(실시예 7) 또는 A549 세포독성 검정(실시예 6)에서 PcrV 매개 독성을 예방한 항-PcrV 단클론 항체(mAb)를 쥣과 급성 폐렴 모델에서 사망을 예방하는 능력에 대해 평가하였다. 암컷 BALB/c-ELITE 마우스(Charles River; 7~8주령; 군 당 n=5)에게 5 mg/kg의 정제된 항체 또는 이소형 일치 대조군의 단일 투여량을 피하 주사하였다. mAb의 주사 후 2일차에, 37℃에서 TSB에서 로그 상(OD₆₀₀ = 1)까지 성장시킨 다음 1회 세척하여 PBS에 재현탁한 20 μl의 녹농균 균주 6077(약 4.2x10⁵ CFU/마우스) 또는 균주 6206(약 1.2x10⁶ CFU/마우스)을 마우스에게 비강내 접종하였다. 감염 후 총 7일 동안 마우스를 생존에 대해 모니터링하였다.

표 12에 나타낸 바와 같이, 4개의 항-PcrV mAb, H1H29329P, H1H29332P, H1H29336P, 및 H1H29339P 모두는 녹농균 균주 둘 다에 대해 5 mg/kg을 예방적으로 투여했을 때, 급성 폐렴 모델에서 마우스의 사망을 예방하였다. 대조군 항-PcrV mAb(대조군 I - REGN3514)도 세균 균주 둘 다에 대한 효능을 나타냈다. 이소형 대조군 mAb(대조군 IV - REGN684)는 보호 효과가 없었다.

급성 폐렴 모델에서 항-PcrV mAb를 이용한 예방적 치료
mAb	생존율 (%, 감염 후 7일차)
	녹농균 균주 6077	녹농균 균주 6206
H1H29329P	100	100
H1H29332P	100	100
H1H29336P	100	100
H1H29339P	100	100
대조군 I - REGN3514	100	100
대조군 IV - REGN684	0	0

실시예 9: 녹농균 균주 6077 및 6206을 사용하는 급성 폐렴 모델에서 항-PcrV 단클론 항체의 생체 내 효능

5 mg/kg(H1H29329P, H1H29332PP, H1H29336PP, H1H29339P)을 예방적으로 투여했을 때 쥣과 급성 폐렴 모델에서 효능을 나타낸 항-PcrV 단클론 항체(mAb)를 더 낮은 투여량으로 시험하여 쥣과 급성 폐렴 모델에서 사망을 예방하는 능력을 평가하였다. 암컷 BALB/c-ELITE 마우스(Charles River; 7~8주령; 군 당 n=5~10)에게 1.0, 0.2, 또는 0.04 mg/kg의 정제된 항체 또는 이소형 일치 대조군의 단일 투여량을 피하 주사하였다. mAb의 주사 후 2일차에, 37℃에서 TSB에서 로그 상(OD600 = 1)까지 성장시킨 다음 1회 세척하여 PBS에 재현탁한 20 μl의 녹농균 균주 6077(약 4.5x10⁵ CFU/마우스) 또는 균주 6206(약 9x10⁵ CFU/마우스)을 마우스에게 비강내 접종하였다. 감염 후 총 7일 동안 마우스를 생존에 대해 모니터링하였다.

표 13에 나타낸 바와 같이, 항-PcrV mAb H1H29336P 및 H1H29339P는 녹농균 균주 6077에 대해 낮게는 0.04 mg/kg의 낮은 투여량으로, 녹농균 균주 6206에 대해 낮게는 0.2 mg/kg의 낮은 투여량으로 예방적으로 투여했을 때 마우스의 사망률을 감소시켰다. 대조적으로, 항-PcrV mAb H1H29329P 및 H1H29332P는 더 많은 세포독성 균주 6206을 사용하여 1.0 mg/kg 미만의 투여량으로 시험했을 때 사망을 예방할 수 없었다. 대조군 항-PcrV mAb(대조군 I - RENG3514)는 각각 0.2 mg/kg 및 1.0 mg/kg 미만의 투여량에서 녹농균 균주 6077 및 균주 6206에 대한 효능을 상실하였다. 이소형 대조군 mAb(대조군 IV - REGN684)는 보호 효과가 없었다.

급성 폐렴 마우스 모델에서 항-PcrV mAb를 이용한 예방적 치료
mAb	mAb 투여량(mg/kg)	생존율 (%, 감염 후 7일차)
		녹농균 균주 6077	녹농균 균주 6206
H1H29329P	1	100	80
	0.2	n.d.	0
	0.04	n.d.	n.d.
H1H29332P	1	100	80
	0.2	n.d.	0
	0.04	n.d.	n.d.
H1H29336P	1	100	80
	0.2	100	80
	0.04	70	0
H1H29339P	1	100	80
	0.2	100	90
	0.04	60	0
REGN3514 - 대조군 I	1	100	40
	0.2	80	0
	0.04	0	0
대조군 IV - 이소형 대조군	1	20	0
	0.2	0	0
	0.04	n.d.	n.d.
n.d.: 데이터 없음(실험 미실시)

실시예 10: 녹농균 균주 6206을 사용하는 급성 폐렴 모델에서 항-PcrV 단클론 항체를 이용한 예방적 치료의 생체 내 효능

본 실시예는 녹농균 균주 6206이 사용된 쥣과 급성 폐렴 모델에서, 예방적으로 투여된 항-PcrV 단클론 항체가 폐에서 세균 부담을 감소시키는 능력을 입증하였다.

실시예 9에 나타낸 바와 같이, H1H29339P 항-PcrV 항체는 예방적으로 투여했을 때, 쥣과 급성 폐렴 모델에서 사망을 방지하였다. 이 실험에서는, 동일한 급성 폐렴 모델을 사용해, 마우스의 폐에서 세균 부담을 감소시키는 항체의 능력을 낮은 투여량에서 시험하였다. 암컷 BALB/c-ELITE 마우스(Charles River; 7~8주령; 군 당 n=5)에게 0.1 또는 0.2 mg/kg의 정제된 항체 또는 0.2 mg/kg의 이소형 일치 대조군의 단일 투여량을 피하 주사하였다. mAb의 주사 후 2일차에, 37℃에서 TSB에서 로그 상(OD₆₀₀ = 1)까지 성장시킨 다음 1회 세척하여 PBS에 재현탁한 20 μl의 녹농균 균주 6206(약 1.2x10⁶ CFU/마우스)을 마우스에게 비강내 접종하였다. 감염 후 16~18시간차에 마우스를 희생시키고, 폐를 채취하고, 세균 계수를 위해 LB 한천 플레이트 상에서 폐 균질물을 도말하였다.

표 14에 나타낸 바와 같이, 항-PcrV mAb H1H29339P는 0.1 또는 0.2 mg/kg으로 투여했을 때 녹농균 6206으로 감염시킨 마우스의 폐에서 세균 부담을 대조군 항-PcrV mAb(대조군 V - REGN7070)보다 1 로그만큼 더 감소시켰고, 무항체 또는 이소형 대조군 mAb(대조군 IV)군보다 3~4 로그만큼 더 감소시켰다.

녹농균 균주 6206을 사용한 급성 폐렴 모델에서 0.1 또는 0.2 mg/kg의 항-PcrV mAb를 예방적으로 투여한 마우스의 폐에서의 세균 부담
mAb	mAb 투여량(mg/kg)	폐 내 녹농균 6206 (CFU/g 폐)
H1H29339P	0.1	3.23e6
	0.2	1.10e5
대조군 V -REGN7070	0.1	2.03e7
	0.2	2.22e6
대조군 IV - 이소형 대조군	0.2	1.21e9
mAb 없음	n.a.	1.33e9
n.a., 해당 없음

실시예 11: 녹농균 균주 PA01을 사용하는 급성 폐렴 모델에서 항-PcrV 단클론 항체를 이용한 예방적 치료의 생체 내 효능

본 실시예는, 더 최근에 단리한 녹농균 균주에 비해 가장 흔히 연구에 사용되는 균주이고, 세포독성이 덜한 녹농균 균주 PA01을 사용한 쥣과 급성 폐렴 모델에서, 예방적으로 투여한 항-PcrV 단클론 항체가 폐에서 세균 부담을 감소시키는 능력을 입증하였다.

실시예 8 내지 10에 나타낸 바와 같이, H1H29336P 항-PcrV 항체는 녹농균 세포독성 균주 6077 및 6206에 대해 예방적으로 투여했을 때 쥣과 급성 폐렴 모델에서 효능을 입증하였다. 여기서는, 항체를 비세포독성 균주인 PAO1에 대해 시험하였다. 암컷 BALB/c-ELITE 마우스(Charles River; 7~8주령; 군 당 n=10)에게 25 mg/kg의 정제된 항체 또는 이소형 일치 대조군의 단일 투여량을 피하 주사하였다. mAb의 주사 후 2일차에, 37℃에서 TSB에서 로그 상(OD₆₀₀ = 1)까지 성장시킨 다음 1회 세척하여 PBS에 재현탁한 20 μl의 녹농균 균주 PAO1(약 1x10⁸ CFU/마우스)을 마우스에게 비강내 접종하였다. 감염 후 16~18시간차에 마우스를 희생시키고, 폐를 채취하고, 세균 계수를 위해 LB 한천 플레이트 상에서 폐 균질물을 도말하였다.

표 15에 나타낸 바와 같이, 항-PcrV mAb H1H29336P는 비세포독성 녹농균 균주 PAO1로 감염시킨 마우스의 폐에서 세균 부담을 대조군 항-PcrV mAb(대조군 V - REGN7070)보다 약 2 로그만큼 더 감소시켰고, 무항체 또는 이소형 대조군 mAb(대조군 IV)군보다 4 로그만큼 더 감소시켰다.

녹농균 균주 PAO1을 사용한 급성 폐렴 모델에서 25 mg/kg의 항-PcrV mAb를 예방적으로 투여한 마우스의 폐에서의 세균 부담
mAb	mAb 투여량(mg/kg)	폐 내 녹농균 PAO1 (CFU/g 폐)
H1H29336P	25	5.11e7
대조군 V -REGN7070	25	1.24e9
대조군 IV - 이소형 대조군	25	9.34e11
mAb 없음	n.a.	2.34e11
n.a., 해당 없음

실시예 12: 항-PcrV 항체와 에피토프의 결합에 대한 HDX-MS

수소-중수소 교환 질량 분광분석(HDX-MS)을 수행하여 H1H29336P 및 H1H29339P 항체와 상호작용하는 녹농균 PcrV(서열번호 78)의 아미노산 잔기를 결정하였다. HDX-MS 방법의 일반적인 설명은, 예를 들어, Ehring의 문헌[(1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259]; 및 Engen 및 Smith의 문헌[(2001) Anal. Chem. 73:256A-265A]에 제공되어 있다.

HDX-MS 실험은 중수소 표지화 및 퀀칭을 위한 Leaptec HDX PAL 시스템, 샘플 분해 및 로딩을 위한 Waters Acquity M-Class (Auxiliary solvent manager), 분석물 구배를 위한 Waters Acquity M-Class (μBinary solvent manager), 및 펩티드 질량 측정을 위한 Thermo Q Exactive HF 질량 분광분석기로 이루어진 일체형 HDX-MS 플랫폼을 이용해 수행하였다.

표지화 용액을 pD 7.0의 D₂O(10 mM 인산 완충액, 140 mM NaCl, 및 3 mM KCl, 25℃에서 pH 7.4와 동등함) 중의 PBS 완충액으로서 제조하였다. 중수소 표지화를 위해, 10 μl의 PcrV (GenScript에서 구입, 57.3 μM) 또는 1:0.6의 몰비(항원 대 항체 복합체)로 H1H29336P와 미리 혼합한 PcrV, 및 10 μl의 PcrV (GenScript에서 구입, 31.7 μM) 또는 1:0.6의 몰비(항원 대 항체 복합체)로 미리 혼합한 PcrV를 90 μL의 D₂O 표지화 용액과 20℃에서 다양한 시점 동안 중복하여 인큐베이션 하였다(예를 들어, 비중수소화 대조군 = 0초; 중수소화 표지의 경우 5분 및 10분). 100 μL의 퀀칭 완충액(0.5 M TCEP-HCl, 8 M 우레아 및 1% 포름산)을 각 샘플에 첨가하고 20℃에서 5분 동안 인큐베이션함으로써 중수소화 반응을 퀀칭시켰다. 그런 다음, 퀀칭된 샘플을 온라인 펩신/프로테아제 XIII 분해를 위해 Waters HDX Manager에 주입하였다. 분해된 펩티드는 0%에서 90% B까지 22분 구배(이동상 A: 물 중 0.5% 포름산 및 4.5% 아세토니트릴, 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.5% 포름산)를 이용해 -9.5℃에서 C8 컬럼(1.0 mm x 50 mm, NovaBioassay)으로 분리하였다. 용리된 펩티드를 LC-MS/MS 또는 LC-MS 모드에서 Thermo Q Exactive HF 질량 분광분석법으로 분석하였다.

Byonic 검색 엔진(Protein Metrics)을 사용해 PcrV 서열 및 이의 반전 서열이 포함된 데이터베이스에서 중수소화되지 않은 PcrV 샘플의 LC-MS/MS 데이터를 검색하였다. 비특이적 효소 분해 및 인간 당질화를 공통 변수 변경 값으로서 사용해 검색 파라미터를 기본값으로 설정하였다. 그런 다음, 식별된 펩티드의 목록을 HDX 워크벤치 소프트웨어(버전 3.3)로 가져와서 모든 중수소화된 샘플로부터 LC-MS에 의해 검출된 각 펩티드의 중수소 흡수를 계산하였다. 주어진 펩티드에 대해, 각 시점에서의 중심 질량(강도 가중 평균 질량)을 사용하여 중수소 흡수(D) 및 중수소 흡수율(D(%))을 계산하였다.

PcrV로부터 유래된 총 127개의 펩티드를 PcrV 단독 샘플 및 H1H29336P과 PcrV의 복합체 샘플 모두로부터 식별하였는데, 이는 PcrV의 95% 서열 커버리지를 나타낸다. 5%를 초과하는 차등 D-흡수 값을 나타내는 임의의 펩티드는 유의하게 보호된 것으로서 정의하였다. PcrV 상의 아미노산 155-170(ALSAKQGIRIDAGGID - 서열번호 85)에 상응하는 펩티드는 H1H29336P에 의해 상당히 보호되었다(PcrV 잔기는 서열번호 78의 PcrV 아미노산 서열에 따라 넘버링함). 표 16 참조.

PcrV로부터 유래된 총 133개의 펩티드를 PcrV 단독 샘플 및 H1H29339P과 PcrV의 복합체 샘플 모두로부터 식별하였는데, 이는 PcrV의 98% 서열 커버리지를 나타낸다. 5%를 초과하는 차등 D-흡수 값을 나타내는 임의의 펩티드는 유의하게 보호된 것으로서 정의하였다. PcrV 상의 아미노산 150-170(SQINAALSAKQGIRIDAGGID - 서열번호 86)에 상응하는 펩티드는 H1H29339P에 의해 상당히 보호되었다(PcrV 잔기는 서열번호 78의 PcrV 아미노산 서열에 따라 넘버링함). 표 17 참조.

본 발명은 본원에 기술된 특정 실시예에 의해 그 범위가 제한되지 않는다. 실제로, 본원에 기술된 것들 외에, 본 발명의 다양한 변형은 전술된 설명 및 첨부된 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범주에 포함되는 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. KYRATSOUS, Christos COPPI, Alida <120> ANTI-PCRV ANTIBODIES THAT BIND PCRV, COMPOSITIONS COMPRISING ANTI-PCRV ANTIBODIES, AND METHODS OF USE THEREOF <130> 10494WO01 <140> TBD <141> 2020-06-10 <150> 62/860,146 <151> 2019-06-11 <160> 86 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 1 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgcgcag cctctggatt caccttcagt gatcatgaaa tgaattgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg gatttcatac attggtagtg gtgttgttac catgtactac 180 gcagactctg tgaggggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa aacactgtat 240 ttgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgttt attactgtgc gcgagatcga 300 gggtattact ttggttcgga ggcctttcac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 2 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His 20 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ctttggttcg gaggcctttc actac 45 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 8 Ala Arg Asp Arg Gly Tyr Tyr Phe Gly Ser Glu Ala Phe His Tyr 1 5 10 15 <210> 9 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 9 gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc gggccagtca gagtattagt aactggttgg cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctataag tcgtctagtt tagaaagtgg agtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctacagcct 240 gatgattttg caacttatta ctgccaacag tataagagtt attcgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa acga 324 <210> 10 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 10 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ser Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Ser Tyr Ser Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 11 cagagtatta gtaactgg 18 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 12 Gln Ser Ile Ser Asn Trp 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 13 aagtcgtct 9 <210> 14 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 14 Lys Ser Ser 1 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 15 caacagtata agagttattc gctcact 27 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 16 Gln Gln Tyr Lys Ser Tyr Ser Leu Thr 1 5 <210> 17 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 17 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtaaag cctctggatt cacctttagc acctttgcca tgaactgggt ccgtcaggct 120 ccagggaggg gcctggagtg ggtctcagct attggtgcta gtggttatag tacatactac 180 gtagactcca tgaagggccg cttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcagatga acagcctggg agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagaatat 300 agtgtctcgt caaactacta ctacggtatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 360 gtctcctca 369 <210> 18 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 18 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Phe 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Gly Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Met 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Gly Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Tyr Ser Val Ser Ser Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 19 ggattcacct ttagcacctt tgcc 24 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 20 Gly Phe Thr Phe Ser Thr Phe Ala 1 5 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 21 attggtgcta gtggttatag taca 24 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 22 Ile Gly Ala Ser Gly Tyr Ser Thr 1 5 <210> 23 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 23 gcgaaagaat atagtgtctc gtcaaactac tactacggta tggacgtc 48 <210> 24 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 24 Ala Lys Glu Tyr Ser Val Ser Ser Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 25 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 25 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 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cctactacta ctacggtatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 360 gtctcctca 369 <210> 34 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 34 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Arg Gly Ser Gly Tyr Ser Ser Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Arg Ser Val Thr Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 35 ggattcacct ttagcagcta cgcc 24 <210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 36 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> 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Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 75 <211> 453 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 75 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Leu Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Arg Ala Thr 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Pro Phe Glu Lys Asp Asn Asn Pro Val Gly Asn Phe 225 230 235 240 Ala Thr Thr Val Ser Asp Arg Ser Arg Pro Leu Asn Asp Lys Val Asn 245 250 255 Glu Lys Thr Thr Leu Leu Asn Asp Thr Ser Ser Arg Tyr Asn Ser Ala 260 265 270 Val Glu Ala Leu Asn Arg Phe Ile Gln Lys Tyr Asp Ser Val Leu Arg 275 280 285 Asp Ile Leu Ser Ala Ile 290 <210> 78 <211> 300 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 78 Met Glu Val Arg Asn Leu Asn Ala Ala Arg Glu Leu Phe Leu Asp Glu 1 5 10 15 Leu Leu Ala Ala Ser Ala Ala Pro Ala Ser Ala Glu Gln Glu Glu Leu 20 25 30 Leu Ala Leu Leu Arg Ser Glu Arg Ile Val Leu Ala His Ala Gly Gln 35 40 45 Pro Leu Ser Glu Ala Gln Val Leu Lys Ala Leu Ala Trp Leu Leu Ala 50 55 60 Ala Asn Pro Ser Ala Pro Pro Gly Gln Gly Leu Glu Val Leu Arg Glu 65 70 75 80 Val Leu Gln Ala Arg Arg Gln Pro Gly Ala Gln Trp Asp Leu Arg Glu 85 90 95 Phe Leu Val Ser Ala Tyr Phe Ser Leu His Gly Arg Leu Asp Glu Asp 100 105 110 Val Ile Gly Val Tyr Lys Asp Val Leu Gln Thr Gln Asp Gly Lys Arg 115 120 125 Lys Ala Leu Leu Asp Glu Leu Lys Ala Leu Thr Ala Glu Leu Lys Val 130 135 140 Tyr Ser Val Ile Gln Ser Gln Ile Asn Ala Ala Leu Ser Ala Lys Gln 145 150 155 160 Gly Ile Arg Ile Asp Ala Gly Gly Ile Asp Leu Val Asp Pro Thr Leu 165 170 175 Tyr Gly Tyr Ala Val Gly Asp Pro Arg Trp Lys Asp Ser Pro Glu Tyr 180 185 190 Ala Leu Leu Ser Asn Leu Asp Thr Phe Ser Gly Lys Leu Ser Ile Lys 195 200 205 Asp Phe Leu Ser Gly Ser Pro Lys Gln Ser Gly Glu Leu Lys Gly Leu 210 215 220 Ser Asp Glu Tyr Pro Phe Glu Lys Asp Asn Asn Pro Val Gly Asn Phe 225 230 235 240 Ala Thr Thr Val Ser Asp Arg Ser Arg Pro Leu Asn Asp Lys Val Asn 245 250 255 Glu Lys Thr Thr Leu Leu Asn Asp Thr Ser Ser Arg Tyr Asn Ser Ala 260 265 270 Val Glu Ala Leu Asn Arg Phe Ile Gln Lys Tyr Asp Ser Val Leu Arg 275 280 285 Asp Ile Leu Ser Ala Ile His His His His His His 290 295 300 <210> 79 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 79 Lys Ala Leu Thr Ala Glu Leu Lys Val Tyr Ser Val Ile Gln Ser Gln 1 5 10 15 Ile Asn Ala Ala Leu Ser Ala Lys Gln Gly Ile Arg Ile Asp Ala Gly 20 25 30 Gly Ile Asp Leu Val Asp Pro Thr Leu Tyr Gly Tyr Ala Val Gly Asp 35 40 45 Pro Arg Trp Lys Asp Ser Pro Glu Tyr Ala Leu Leu Ser Asn Leu Asp 50 55 60 Thr Phe Ser Gly Lys Leu Ser Ile Lys Asp Phe Leu Ser Gly Ser Pro 65 70 75 80 Lys Gln Ser Gly Glu Leu Lys Gly Leu Ser Asp Glu Tyr Pro Phe Glu 85 90 95 Lys Asp Asn Asn Pro Val Gly Asn Phe Ala Thr Thr Val Ser Asp Arg 100 105 110 Ser Arg Pro Leu Asn Asp Lys Val Asn Glu 115 120 <210> 80 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 80 Lys Ala Leu Thr Ala Glu Leu Lys Val Tyr Ser Val Ile Gln Ser Gln 1 5 10 15 Ile Asn Ala Ala Leu Ser Ala Lys Gln Gly Ile Arg Ile Asp Ala Gly 20 25 30 Gly Ile Asp Leu Val Asp Pro Thr Leu Tyr Gly Tyr Ala Val Gly Asp 35 40 45 Pro Arg Trp Lys Asp Ser Pro Glu Tyr Ala Leu Leu Ser Asn Leu Asp 50 55 60 Thr Phe Ser Gly Lys Leu Ser Ile Lys Asp Phe Leu Ser Gly Ser Pro 65 70 75 80 Lys Gln Ser Gly Glu Leu Lys Gly Leu Ser Asp Glu Tyr Pro Phe Glu 85 90 95 Lys Asp Asn Asn Pro Val Gly Asn Phe Ala Thr Thr Val Ser Asp Arg 100 105 110 Ser Arg Pro Leu Asn Asp Lys Val Asn Glu His His His His His His 115 120 125 <210> 81 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 81 Lys Ala Leu Thr Ala Glu Leu Lys Val Tyr Ser Val Ile Gln Ser Gln 1 5 10 15 Ile Asn Ala Ala Leu Ser Ala Lys Gln Gly Ile Arg Ile Asp Ala Gly 20 25 30 Gly Ile Asp Leu Val Asp Pro Thr Leu Tyr Gly Tyr Ala Val Gly Asp 35 40 45 Pro Arg Trp Lys Asp Ser Pro Glu Tyr Ala Leu Leu Ser Asn Leu Asp 50 55 60 Thr Phe Ser Gly Lys Leu Ser Ile Lys Asp Phe Leu Ser Gly Ser Pro 65 70 75 80 Lys Gln Ser Gly Glu Leu Lys Gly Leu Ser Asp Glu Tyr Pro Phe Glu 85 90 95 Lys Asp <210> 82 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 82 Lys Ala Leu Thr Ala Glu Leu Lys Val Tyr Ser Val Ile Gln Ser Gln 1 5 10 15 Ile Asn Ala Ala Leu Ser Ala Lys Gln Gly Ile Arg Ile Asp Ala Gly 20 25 30 Gly Ile Asp Leu Val Asp Pro Thr Leu Tyr Gly Tyr Ala Val Gly Asp 35 40 45 Pro Arg Trp Lys Asp Ser Pro Glu Tyr Ala Leu Leu Ser Asn Leu Asp 50 55 60 Thr Phe Ser Gly Lys Leu Ser Ile Lys Asp Phe Leu Ser Gly Ser Pro 65 70 75 80 Lys Gln Ser Gly Glu Leu Lys Gly Leu Ser Asp Glu Tyr Pro Phe Glu 85 90 95 Lys Asp His His His His His His 100 <210> 83 <211> 454 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 83 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Thr Met Ser Gly Ile Thr Ala Tyr Tyr Thr Asp Asp Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Glu Phe Leu Pro Gly Thr His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 130 135 140 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 195 200 205 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 210 215 220 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 225 230 235 240 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 245 250 255 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 260 265 270 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 275 280 285 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 290 295 300 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 305 310 315 320 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 325 330 335 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 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Asp Tyr Asn Tyr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 85 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 85 Ala Leu Ser Ala Lys Gln Gly Ile Arg Ile Asp Ala Gly Gly Ile Asp 1 5 10 15 <210> 86 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 86 Ser Gln Ile Asn Ala Ala Leu Ser Ala Lys Gln Gly Ile Arg Ile Asp 1 5 10 15 Ala Gly Gly Ile Asp 20

Claims (49)

1. 녹농균(P. aeruginosa) PcrV에 특이적으로 결합하는 단리된 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음 특성 중 하나 이상을 갖는, 단리된 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
   (a) 서열번호 34, 50, 2, 및 18로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역(HCVR) 중 어느 하나에 함유된 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3); 및 서열번호 42, 58, 10, 및 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역(LCVR) 중 어느 하나에 함유된 3개의 경쇄 CDR(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함함;
   (b) 완전한 인간 단클론 항체임;
   (c) 25℃에서 표면 플라스몬 공명 검정으로 측정했을 때, 10^-8 미만의 해리 상수(K_D)로 전장 PcrV에 결합함;
   (d) 37℃에서 표면 플라스몬 공명 검정으로 측정했을 때, 10^-8 미만의 해리 상수(K_D)로 전장 PcrV에 결합함;
   (e) 세포독성 검정에서, 약 10^-11 M 내지 약 10^-8 M 범위의 IC₅₀으로 녹농균 균주 6077의 중화를 나타냄;
   (f) 세포독성 검정에서, 약 10^-9 M 내지 약 10^-7 M 범위의 IC₅₀으로 녹농균 균주 ATCC 700888의 중화를 나타냄;
   (g) 용혈 검정에서, 약 10^-10 M 내지 약 10^-6 M 범위의 IC₅₀으로 녹농균 균주 6077의 중화를 나타냄;
   (h) 용혈 검정에서, 약 10^-10 M 내지 약 10^-7 M 범위의 IC₅₀으로 녹농균 균주 ATCC 700888의 중화를 나타냄;
   (i) 급성 폐렴 모델에서, 5 mg/kg으로 예방적으로 치료한 마우스에서의 녹농균 균주 6206 또는 균주 6077로 인한 사망률을 미치료 마우스에 비해 감소시킴;
   (j) 급성 폐렴 모델에서, 1.0, 0.2, 또는 0.04 mg/kg으로 예방적으로 치료한 마우스에서의 녹농균 균주 6206 또는 균주 6077로 인한 사망률을 미치료 마우스에 비해 감소시킴;
   (k) 급성 폐렴 모델에서, 0.1 mg/kg 또는 0.2 mg/kg으로 예방적으로 치료한 마우스에서의 녹농균 균주 6206으로 인한 폐 세균 부담을 미치료 마우스에 비해 감소시킴;
   (l) 급성 폐렴 모델에서, 25 mg/kg으로 예방적으로 치료한 마우스에서의 녹농균 균주 PA01로 인한 폐 세균 부담을 미치료 마우스에 비해 감소시킴;
   (m) 표 1의 HCVR 및 LCVR 아미노산 서열 중 어느 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR) 아미노산 서열을 포함하는 기준 항체와 교차 경쟁함.
2. 녹농균(P. aeruginosa) PcrV에 특이적으로 결합하는 단리된 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음 특성 중 하나 이상을 갖는, 단리된 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
   (a) 서열번호 34, 50, 2, 및 18로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역(HCVR) 중 어느 하나에 함유된 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3); 및 서열번호 42, 58, 10, 및 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역(LCVR) 중 어느 하나에 함유된 3개의 경쇄 CDR(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함함;
   (b) 약 10^-8 M 미만의 EC₅₀으로 전장 PcrV에 결합함;
   (c) 약 10^-8 M 미만의 EC₅₀으로 PcrV 136-233(서열번호 81)에 결합함;
   (d) (i) 서열번호 78의 약 150 위치 내지 약 170 위치 범위의 아미노산 잔기 및 (ii) 서열번호 78의 약 155 위치 내지 약 170 위치 범위의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열과 상호작용하고/하거나;
   (e) 서열번호 85 및 서열번호 86으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열과 상호작용함.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열번호 34, 50, 2, 및 18로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HCVR을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 42, 58, 10, 및 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LCVR을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   (a) 서열번호 36, 52, 4, 및 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1 도메인;
   (b) 서열번호 38, 54, 6, 및 22로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HCDR2 도메인;
   (c) 서열번호 40, 56, 8, 및 24로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HCDR3 도메인;
   (d) 서열번호 44, 60, 12, 및 28로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1 도메인;
   (e) 서열번호 46, 62, 14, 및 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LCDR2 도메인; 및
   (f) 서열번호 48, 64, 16, 및 32로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LCDR3 도메인을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 34/42, 50/58, 2/10, 및 18/26으로 이루어진 군으로부터 선택된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는, 단리된 항체 또는 항원 결합 단편.
7. 제6항에 있어서, 서열번호 34/42 및 50/58로 이루어진 군으로부터 선택된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는, 단리된 항체 또는 항원 결합 단편.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 36의 HCDR1 아미노산 서열; 서열번호 38의 HCDR2 아미노산 서열; 서열번호 40의 HCDR3 아미노산 서열; 서열번호 44의 LCDR1 아미노산 서열; 서열번호 46의 LCDR2 아미노산 서열; 및 서열번호 48의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 52의 HCDR1 아미노산 서열; 서열번호 54의 HCDR2 아미노산 서열; 서열번호 56의 HCDR3 아미노산 서열; 서열번호 60의 LCDR1 아미노산 서열; 서열번호 62의 LCDR2 아미노산 서열; 및 서열번호 64의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 4의 HCDR1 아미노산 서열; 서열번호 6의 HCDR2 아미노산 서열; 서열번호 8의 HCDR3 아미노산 서열; 서열번호 12의 LCDR1 아미노산 서열; 서열번호 14의 LCDR2 아미노산 서열; 및 서열번호 16의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 20의 HCDR1 아미노산 서열; 서열번호 22의 HCDR2 아미노산 서열; 서열번호 24의 HCDR3 아미노산 서열; 서열번호 28의 LCDR1 아미노산 서열; 서열번호 30의 LCDR2 아미노산 서열; 및 서열번호 32의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
12. PcrV에 결합하기 위해 기준 항체 또는 항원 결합 단편과 경쟁하는 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 기준 항체 또는 항원 결합 단편은 HCVR의 CDR 및 LCVR의 CDR을 포함하되, HCVR은 서열번호 34, 50, 2, 및 18로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, LCVR은 서열번호 42, 58, 10, 및 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는, 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
13. 제12항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 PcrV 136-233(서열번호 81)에 결합하기 위해 기준 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 경쟁하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
14. 기준 항체 또는 항원 결합 단편과 동일한 PcrV 상의 에피토프에 결합하는 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 기준 항체 또는 항원 결합 단편은 HCVR의 CDR 및 LCVR의 CDR을 포함하되, HCVR은 서열번호 34, 50, 2, 및 18로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, LCVR은 서열번호 42, 58, 10, 및 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
15. 녹농균을 중화시키는 방법으로서, 상기 방법은 녹농균으로 감염된 세포를 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물에 노출시키는 단계를 포함하되, 노출시키는 단계는 세포 사멸로부터의 보호를 강화시키는, 방법.
16. 제15항에 있어서, 녹농균은 시험관 내 또는 생체 내에서 중화되는, 방법.
17. 제15항에 있어서, 보호 강화는 항체가 단독으로 사용되거나, 항체가 녹농균에 대한 하나 이상의 추가 치료제 또는 항체와 병용으로 사용될 때 관찰되는, 방법.
18. 제17항에 있어서, 하나 이상의 추가 치료제는 항생제, 항염제, 녹농균에 대한 상이한 항체, 및 공동 감염 치료에 유용한 치료제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
19. 제18항에 있어서, 하나 이상의 추가 치료제는 공동 감염증 치료에 유용한 치료제이고, 공동 감염증은 황색 포도상구균 감염증인, 방법.
20. 제17항에 있어서, 하나 이상의 추가 치료제는 상이한 항-녹농균 항체인, 방법.
21. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
22. 제21항에 있어서, 하나 이상의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 34/42, 50/58, 2/10, 및 18/26으로 이루어진 군으로부터 선택된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍 내에 3개의 HCDR 및 3개의 LCDR을 포함하는, 약학적 조성물.
23. 제21항에 있어서, 하나 이상의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 34/42, 50/58, 2/10, 및 18/26으로 이루어진 군으로부터 선택된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는, 약학적 조성물.
24. 제23항에 있어서, 하나 이상의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 34/42 및 50/58로 이루어진 군으로부터 선택된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는, 약학적 조성물.
25. 제21항에 있어서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 36의 HCDR1 아미노산 서열; 서열번호 38의 HCDR2 아미노산 서열; 서열번호 40의 HCDR3 아미노산 서열; 서열번호 44의 LCDR1 아미노산 서열; 서열번호 46의 LCDR2 아미노산 서열; 및 서열번호 48의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는, 약학적 조성물.
26. 제21항에 있어서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 52의 HCDR1 아미노산 서열; 서열번호 54의 HCDR2 아미노산 서열; 서열번호 56의 HCDR3 아미노산 서열; 서열번호 60의 LCDR1 아미노산 서열; 서열번호 62의 LCDR2 아미노산 서열; 및 서열번호 64의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는, 약학적 조성물.
27. 제21항에 있어서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 4의 HCDR1 아미노산 서열; 서열번호 6의 HCDR2 아미노산 서열; 서열번호 8의 HCDR3 아미노산 서열; 서열번호 12의 LCDR1 아미노산 서열; 서열번호 14의 LCDR2 아미노산 서열; 및 서열번호 16의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는, 약학적 조성물.
28. 제21항에 있어서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 20의 HCDR1 아미노산 서열; 서열번호 22의 HCDR2 아미노산 서열; 서열번호 24의 HCDR3 아미노산 서열; 서열번호 28의 LCDR1 아미노산 서열; 서열번호 30의 LCDR2 아미노산 서열; 및 서열번호 32의 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는, 약학적 조성물.
29. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 제시된 것과 같은 항체의 HCVR 및/또는 LCVR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
30. 제29항의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
31. 제30항의 벡터를 발현하는 세포.
32. 녹농균 감염증에 걸릴 위험을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 녹농균 감염증에 대한 위험이 더 큰 대상체에게 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제21항 내지 제28항의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
33. 제32항에 있어서, 녹농균 감염증에 대한 위험이 더 큰 대상체는 수술 중인 대상체, 주요 질환에 대해 치료 중인 대상체, 외상 환자, 정맥 주사용 약물 사용자, 중증 화상을 입은 대상체, 호흡기를 사용하는 대상체, 카테터가 삽입된 대상체, 화학요법으로 치료 중인 대상체, 당뇨병을 앓고 있는 대상체, 낭성 섬유증을 앓고 있는 대상체, 결핵에 걸린 대상체, HIV에 걸린 대상체, 또는 면역 체계가 손상된 대상체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
34. 녹농균 감염증에 걸린 대상체에서 세균 부하를 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제21항 내지 제28항의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
35. 녹농균 감염증을 앓고 있는 대상체 또는 녹농균 감염증에 걸릴 위험이 있는 대상체의 생존률 또는 생존 가능성을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제21항 내지 제28항의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
36. 녹농균 감염증의 적어도 하나의 증상의 중중도, 지속 기간, 또는 발생 빈도를 감소시키거나 완화시키는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제21항 내지 제28항의 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
37. 제36항에 있어서, 적어도 하나의 증상은 발열, 오한, 두통, 피로, 관절통, 강직, 근육통, 설사, 구토, 귀의 통증, 가려움증, 및 진물, 발진, 고름이 들어찬 피부 뾰루지, 눈의 통증, 눈의 발적, 폐렴, 기침, 울혈, 녹농의 연조직 방출, 달콤한 과일향, 및 요로 감염증으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
38. 제36항에 있어서, 약학적 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 예방적으로 또는 치료적으로 투여되는, 방법.
39. 제36항에 있어서, 대상체는 수술 중인 대상체, 주요 질환에 대해 치료 중인 대상체, 외상 환자, 정맥 주사용 약물 사용자, 중증 화상을 입은 대상체, 호흡기를 사용하는 대상체, 카테터가 삽입된 대상체, 화학요법으로 치료 중인 대상체, 당뇨병을 앓고 있는 대상체, 낭성 섬유증을 앓고 있는 대상체, 결핵에 걸린 대상체, HIV에 걸린 대상체, 또는 면역 체계가 손상된 대상체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
40. 제36항에 있어서, 이를 필요로 하는 대상체는 녹농균 감염증을 갖는, 방법.
41. 제36항에 있어서, 대상체는 녹농균 감염증에 걸릴 위험이 있는, 방법.
42. 제40항에 있어서, 대상체는 황색 포도상구균 감염증을 갖는, 방법.
43. 제32항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물은 제2 치료제와 병용 투여되는, 방법.
44. 제43항에 있어서, 제2 치료제는 항생제, 항염증제(예: 코르티코스테로이드 및 비스테로이드성 항염증제), 및 녹농균에 대한 상이한 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
45. 제32항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물은 피하, 정맥 내, 피내, 근육 내, 비강 내, 또는 경구 투여되는, 방법.
46. 제40항에 있어서, 대상체는 폐렴, 균혈증, 골 감염증, 관절 감염증, 피부 감염증, 화상 감염증, 상처 감염증, 또는 이들의 임의의 조합을 갖는, 방법.　
47. 제40항에 있어서, 녹농균은 항생제에 내성이 있거나 부분적으로 내성이 있는, 방법.
48. 낭성 섬유증을 앓고 있는 대상체의 생존률 또는 생존 가능성을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
49. 제48항에 있어서, 대상체는 투여 시점에 폐렴 증상을 갖지 않는, 방법.