WO2009088032A1 - ＰｃｒＶに対する抗体 - Google Patents

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WO2009088032A1
WO2009088032A1 PCT/JP2009/050118 JP2009050118W WO2009088032A1 WO 2009088032 A1 WO2009088032 A1 WO 2009088032A1 JP 2009050118 W JP2009050118 W JP 2009050118W WO 2009088032 A1 WO2009088032 A1 WO 2009088032A1
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pcrv
monoclonal antibody
antibody
amino acid
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PCT/JP2009/050118
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Yoshito Numata
Yoshinori Yamano
Takafumi Sato
Toshinaga Tsuji
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Shionogi & Co., Ltd.
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    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C07K16/1214—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present invention relates to a monoclonal antibody that recognizes PcrV or a part thereof. Specifically, the present invention relates to an antibody having a higher neutralizing activity (hereinafter also referred to as cytotoxicity inhibiting activity) than conventional anti-PcrV antibodies or a part thereof, and a pharmaceutical composition containing them.
  • cytotoxicity inhibiting activity an antibody having a higher neutralizing activity (hereinafter also referred to as cytotoxicity inhibiting activity) than conventional anti-PcrV antibodies or a part thereof, and a pharmaceutical composition containing them.
  • Pseudomonas aeruginosa is an obligately aerobic gram-negative bacilli that exists widely in nature. Although it is usually low in pathogenicity, it is a pathogenic bacterium that causes opportunistic infections that frequently occur in patients with various basic diseases such as cancer and diabetes, and in patients receiving immunosuppressive drugs. Often causes serious consequences, such as tract infections and sepsis. Pseudomonas aeruginosa infection is currently considered one of the most difficult to treat in the clinical setting. This is because Pseudomonas aeruginosa is not only less sensitive to existing antibiotics but also has a strong tendency to easily acquire resistance to various antibiotics and become intractable. Thus, for Pseudomonas aeruginosa, there is a limit in the response of developing new antibiotics one after another, and a treatment method that does not depend on antibiotics is eagerly desired.
  • PcrV is a constituent protein of the type III exotoxin secretion system consisting of 294 residues (NCBI Accession No. AAC45935, SEQ ID NO: 1), and the operon sequence encoded is disclosed (Patent Document 1, Non-Patent Document 1). ).
  • Non-Patent Document 2 Since control over PcrV may lead to therapeutic measures in Pseudomonas aeruginosa infection (Non-Patent Document 2), polyclonal antibodies (Non-Patent Documents 3 and 4) and monoclonal antibodies (Non-Patent Documents 3 and 4) having neutralizing activity Document 2, Non-Patent Documents 5 and 6) have been reported.
  • humanization is difficult with polyclonal antibodies, and antigenicity is difficult to improve, making it difficult to use as a pharmaceutical composition.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide an effective means for treating infections, particularly infections caused by Pseudomonas aeruginosa.
  • the present invention (1) (A) inhibits 50% or more of the cytotoxic activity against Pseudomonas aeruginosa white blood cells at a concentration of 1 nM to 200 nM in vitro; (B) inhibits more than 50% of the cytotoxic activity of Pseudomonas aeruginosa on myeloma cells at a concentration of 1 nM to 50 nM in vitro; and (C) The dissociation constant (Kd) with PcrV is 2 ⁇ 10 ⁇ 9 (M) or less.
  • the monoclonal antibody of the present invention or a part thereof has a very excellent neutralizing activity against PcrV, it is useful as a therapeutic agent for infectious diseases.
  • FIG. 1 shows a displacement curve of biotin-labeled PcrV with unlabeled PcrV in PcrV antibodies (1F3, 2A4, 6F5, 7A7 and Mab166).
  • FIG. 2 shows the affinity of PcrV antibodies (1F3, 2A4, 6F5, 7A7 and Mab166) by surface plasmon resonance analysis.
  • FIG. 3 shows the results of a sandwich assay between PcrV antibodies (1F3, 2A4, 6F5, 7A7, Mab166) and Mab166.
  • FIG. 4 shows the inhibitory effect of PcrV antibodies (1F3, 2A4, 6F5, 7A7 and Mab166) on the cytotoxic activity of Pseudomonas aeruginosa SR24 strain on U937 cells.
  • FIG. 5 shows the inhibitory effect of PcrV antibodies (1F3, 2A4, 6F5, 7A7 and Mab166) on the cytotoxic activity of Pseudomonas aeruginosa SR24 strain on myeloma cells P3U1.
  • FIG. 6 shows a replacement curve of biotin-labeled PcrV with unlabeled full-length PcrV and deletion mutation PcrV in PcrV antibodies (1F3, 2A4, 9D12, 12H9 and m166).
  • FIG. 7 shows the reactivity of full length PcrV and deletion mutant PcrV in PcrV antibodies (1F3, 2A4, 9D12, 12H9 and m166) in Western blot.
  • FIG. 6 shows a replacement curve of biotin-labeled PcrV with unlabeled full-length PcrV and deletion mutation PcrV in PcrV antibodies (1F3, 2A4, 9D12, 12H9 and m166).
  • FIG. 8 shows the correlation between the antibody and full-length PcrV by suppressing the cytotoxicity inhibiting activity.
  • FIG. 9 shows the correlation between the antibody and the deletion mutant PcrV by suppressing the cytotoxicity inhibiting activity.
  • 1 shows the amino acid sequence of the variable region of the 1F3 antibody. The underlined portion indicates the CDR region. The amino acid sequence of the variable region of 2A4 antibody is shown. The underlined portion indicates the CDR region.
  • the “monoclonal antibody” targeted by the present invention is a monoclonal antibody that specifically binds to the aforementioned PcrV. More specifically, (1) inhibits 50% or more of the cytotoxic activity against Pseudomonas aeruginosa white blood cells at a concentration of 1 nM to 200 nM in vitro. (2) inhibits more than 50% of the cytotoxic activity of Pseudomonas aeruginosa on myeloma cells at a concentration of 1 nM to 50 nM in vitro; and (3) The dissociation constant (Kd) with PcrV is 2 ⁇ 10 ⁇ 9 (M) or less.
  • a monoclonal antibody against PcrV having at least one property selected from:
  • the monoclonal antibody of the present invention has a strong cytotoxic inhibitory activity.
  • the inhibitory activity of Pseudomonas aeruginosa has a 50% or higher inhibition at a concentration in the range of 1 to 200 nM, preferably 2 to 100 nM, more preferably 5 to 25 nM (medium Sum) activity.
  • the inhibitory activity of inhibiting the cytotoxic activity of Pseudomonas aeruginosa by 50% or more at a concentration within the range of 1 to 50 nM, preferably 2 to 30 nM, more preferably 4 to 20 nM. have. These values are from Dara W. This greatly exceeds the activity value of Mab166 reported in Frank et al. (J. Infect. Disease, 2002, 186, 64).
  • the monoclonal antibody of the present invention is characterized by having the epitope in the region from position 136 to position 233 in the full-length amino acid sequence of PcrV (SEQ ID NO: 1).
  • the present inventors have found that an antibody recognizing this region has a stronger activity (cytotoxic inhibition activity) than an antibody recognizing other regions.
  • Identification of the recognition epitope of the monoclonal antibody can be performed as follows. First, various partial structures of molecules recognized by monoclonal antibodies are prepared. In preparing the partial structure, a method for preparing various partial peptides of the molecule using a known oligopeptide synthesis technique, or a DNA sequence encoding the target partial peptide using a gene recombination technique as a suitable expression plasmid. There are methods for integration and production inside and outside the host such as Escherichia coli, but for the above purpose, it is common to use both in combination.
  • the corresponding oligopeptides of the corresponding portion or variants of the peptides are synthesized in various ways using oligopeptide synthesis techniques well known to those skilled in the art, and the preventive or therapeutic agent of the present invention is contained as an active ingredient.
  • the epitopes are limited by examining the binding properties of the monoclonal antibodies to those peptides, or by examining the competitive inhibitory activity of the peptides on the binding of the monoclonal antibody to the antigen.
  • commercially available kits for example, SPOTs kit (Genosis Biotechnology), a series of multi-pin peptide synthesis kits using multi-pin synthesis method, etc.can also be used.
  • Cytotoxicity inhibitory activity can be measured by the following procedure. First, a monoclonal antibody which is a measurement target of cytotoxicity inhibitory activity is diluted with a 2-fold dilution series and adjusted to an appropriate concentration. Next, cells affected by the toxin of Pseudomonas aeruginosa (hereinafter referred to as target cells) are diluted with a cell culture medium or the like and adjusted to an appropriate number. Specifically, when using myeloma cells, adjust in the range of 3 ⁇ 10 6 to 5 ⁇ 10 6 Cells / ml, and when using white blood cells, adjust in the range of 1 ⁇ 10 6 to 3 ⁇ 10 6 Cells / ml. It is desirable.
  • Pseudomonas aeruginosa is adjusted to 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 8 cfu / ml with a culture medium or the like. Then, in the presence of the monoclonal antibody described above, Pseudomonas aeruginosa and target cells are cultured under appropriate culture conditions in the same test tube and well (for example, in vitro conditions such as wells on a microplate).
  • the culture conditions at this time may be general culture conditions that are favorable for growing cells and bacteria.
  • the optimal conditions for the culture time are appropriately changed depending on the type of target cell. For example, about 1 to 3 hours are preferable when using myeloma cells, and about 1 to 3 hours when using white blood cells.
  • a concentration that inhibits 50% of the control group (effective concentration) is calculated.
  • concentration concentration that inhibits 50% of the control group (effective concentration) is calculated.
  • Various methods have been established for determining whether a target cell is alive or not. After adding a color reagent, measurement of absorbance at an appropriate wavelength (for example, 400 to 500 nm) is useful (Reference: Nature). Medicine, 1999, vol. 5, pp. 392-395).
  • the dissociation constant (Kd) used as an index representing the affinity of the monoclonal antibody for the antigen can be analyzed according to various methods. For example, using the Scatchard method using antigens labeled with various labeling agents, BiacoreX (manufactured by Amersham Pharmacia) or a similar kit, which is a commercially available measurement kit, the instruction manual and the experimental operation method attached to the kit Can be easily analyzed.
  • the dissociation constant (Kd value) obtained using these methods is expressed in units of M (mol). The tested monoclonal antibody shows that the smaller the dissociation constant, the stronger the affinity.
  • the dissociation constant (Kd) with PcrV is 2 ⁇ 10 ⁇ 9 (M) or less, preferably 1.5 ⁇ 10 ⁇ 9 (M) or less, more preferably 1.2 ⁇ 10 ⁇ 9 (M) or less.
  • variable regions of the heavy and light chains are derived from humans, for example, variants of SEQ ID NOs: 11 to 14 (for example, substitution or insertion of one or several amino acids, addition or addition) Including, but not limited to, those containing deletions).
  • the constant region domains are also preferably suitable human constant region domains, such as Kabat E. A. Et al. , US Department of Health and Human Services, Public Health Service, and National Institute of Health.
  • amino acid sequence of the variable region to the antibody amino acid sequence database ([Sequence (of Proteins of Immunological Interest] US Dept.Health and Human Services, 1983) created by Kabat et al. Can be found.
  • the CDR region sequence may be modified by at least one addition / insertion, substitution or deletion as long as the desired biological activity (for example, binding activity or neutralization activity) of the present invention is maintained. It is included in the present invention. Examples thereof include sequences having a homology with each CDR region of 90 to 100%. Preferable examples include sequences having a homology of 95 to 100%. More preferred is a sequence having a homology of 98 to 100%.
  • the framework region can be related to any kind of framework region, but is preferably of human origin.
  • a suitable framework area is Kabat E.I. A. These documents can be selected by referring to them.
  • a preferred heavy chain framework is a human heavy chain framework, such as the anti-PcrV antibody framework shown in FIG. 10 or FIG. It can be determined from the sequence shown in FIG. 10 or FIG. 11 with reference to the above document. In the same manner, the anti-PcrV light chain framework can also be determined from the sequence shown in FIG.
  • CDR1 comprises the amino acid sequence SFTSYWMH (SEQ ID NO: 15).
  • CDR2 has the amino acid sequence INPSNGRTNYNEKFNT (SEQ ID NO: 16),
  • CDR3 has the amino acid sequence YGNYVVYYTMDY (SEQ ID NO: 17), an immunoglobulin heavy chain variable region (V H ) or fragment thereof and (ii) a human heavy chain And an antibody containing a constant part thereof or a fragment thereof.
  • CDR1 has the amino acid sequence SASSVSYME (SEQ ID NO: 18), CDR2 has the amino acid sequence TTSKLAS (SEQ ID NO: 19), and CDR3 has the amino acid sequence HQWRNYPFT (SEQ ID NO: 20). It preferably contains the chain variable region (V L ) and (ii) the constant part of a human light chain or a fragment thereof.
  • CDR1, CDR2 and CDR3, which are complementarity determining regions are included in the sequence, in which case CDR1 has the amino acid sequence SITSDYAWN (SEQ ID NO: 21).
  • An immunoglobulin heavy chain variable region (V H ) or fragment thereof, and (ii) human, having the amino acid sequence YTYNGDTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 22) and CDR3 having the amino acid sequence SRNYYGAWFAY (SEQ ID NO: 23) Mention may be made of antibodies comprising the constant part of the heavy chain or fragments thereof.
  • CDR1 has the amino acid sequence KASQYVGGTTVA (SEQ ID NO: 24)
  • CDR2 has the amino acid sequence RASTRHT (SEQ ID NO: 25)
  • CDR3 has the amino acid sequence QQYCSSPLT (SEQ ID NO: 26). It preferably contains the chain variable region (V L ) and (ii) the constant part of a human light chain or a fragment thereof.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be prepared by an existing general production method using PcrV (natural, recombinant, synthetic, etc.) as an immunogen.
  • mammals preferably mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, cats, dogs, pigs, goats, sheep, donkeys, horses, with PcrV as an immunogen and optionally with Freund's adjuvant.
  • bovine including transgenic animals created to produce antibodies from other animals such as human antibody-producing transgenic mice
  • muscle Immunization is performed by injecting once or several times into the body, veins, food pads or abdominal cavity.
  • immunization is performed 1 to 4 times about every 1 to 21 days from the initial immunization, and antibody-producing cells can be obtained from the immunized mammal about 1 to 10 days after the final immunization.
  • the number of times of immunization and the time interval can be appropriately changed depending on the nature of the immunogen used.
  • PcrV used as an immunogen or hapten include the following.
  • A Cells that express PcrV on the cell surface or cell lines that are artificially established to express on the cell surface, or genetically modified cells that are created using genetic recombination technology to express PcrV on the cell surface ;
  • B A culture supernatant obtained by culturing a genetically modified cell prepared using a gene recombination technique so that PcrV or a part thereof is expressed as a protein, or PcrV purified from the culture supernatant Part; or (c) chemically synthesized PcrV or part thereof.
  • a hybridoma secreting a monoclonal antibody can be prepared according to the method of Kohler and Milstein et al. (Nature, 1975, vol. 256, p495 to 497) and a method analogous thereto. That is, antibody-producing cells contained in the spleen, lymph node, bone marrow, tonsil, etc., preferably from the spleen obtained from the immunized mammal as described above, and preferably mouse, rat, guinea pig, hamster, rabbit or human
  • a hybridoma can be prepared by cell fusion of a myeloma cell having no autoantibody-producing ability derived from a mammal such as a mouse, rat or human.
  • myeloma cells used for cell fusion cell lines generally obtained from mice, such as 8-azaguanine-resistant mice (derived from BALB / c) myeloma strain P3X63Ag8U. 1 (P3-U1) [Yelton, D. E. Et al. Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7 (1978)], P3 / NSI / 1-Ag4-1 (NS-1) [Kohler, G. Et al. European J. Immunology, 6, 511-519 (1976), Sp2 / O-Ag14 (SP-2) [Shulman, SM. Et al.
  • the screening of hybridoma clones producing monoclonal antibodies is carried out by cultivating the hybridomas in, for example, a microtiter plate, and determining the reactivity of the culture supernatant of the wells in which proliferation has been observed with the immunogen used in the above-described mouse immunization.
  • the measurement is performed by an immunoassay method such as RIA or ELISA, and a clone producing a monoclonal antibody exhibiting specific affinity for the immunogen or hapten is selected.
  • a non-competitive ELISA is used in which an immunogen is immobilized on a solid phase and the antibody in the culture supernatant bound thereto is detected with an anti-mouse second antibody labeled with an enzyme.
  • the monoclonal antibody is produced from the hybridoma by culturing the hybridoma in vitro or by culturing it in mouse, rat, guinea pig, hamster, rabbit or the like, preferably mouse or rat, more preferably mouse ascites, etc. It can be carried out by isolation from the supernatant or the ascites of mammals.
  • the basic medium examples include a low calcium medium such as Ham'F12 medium, MCDB153 medium or low calcium MEM medium, and a high calcium medium such as MCDB104 medium, MEM medium, D-MEM medium, RPMI1640 medium, ASF104 medium or RD medium.
  • the basic medium can contain, for example, serum, hormones, cytokines and / or various inorganic or organic substances depending on the purpose.
  • affinity ammonium chromatography such as saturated ammonium sulfate, ion exchange chromatography (DEAE or DE52, etc.), anti-immunoglobulin column or protein A column, etc. Can be performed.
  • an antibody gene is cloned from an antibody-producing cell such as a hybridoma, incorporated into an appropriate vector, introduced into a host, and a recombinant antibody produced using gene recombination technology.
  • an antibody-producing cell such as a hybridoma
  • an appropriate vector such as a hybridoma
  • a recombinant antibody produced using gene recombination technology.
  • variable region (V region) of an antibody is encoded from a hybridoma that produces the target antibody or an immune cell that produces the antibody, for example, a cell in which sensitized lymphocytes have been immortalized by an oncogene or the like.
  • Isolate mRNA For isolation of mRNA, total RNA is prepared by a known method such as guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, JM, et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), mRNA Purification Kit (manufactured by Pharmacia), etc. To prepare mRNA.
  • Antibody V region cDNA is synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase.
  • the synthesis of cDNA can be performed using AMV Reverse Transscriptase First-strand cDNA Synthesis Kit or the like.
  • 5'-Ampli FINDER RACEKit® manufactured by Clontech
  • 5'-RACE method using PCR Frohman, MA, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
  • the target DNA fragment is purified from the obtained PCR product and ligated with vector DNA.
  • a recombinant vector is prepared from this, introduced into Escherichia coli, etc., and colonies are selected to prepare a desired recombinant vector.
  • the base sequence of the target DNA is confirmed by a known method such as the deoxy method.
  • DNA encoding the V region of the target antibody is obtained, it is ligated with DNA encoding the desired antibody constant region (C region) and incorporated into an expression vector.
  • DNA encoding the V region of the antibody may be incorporated into an expression vector containing DNA of the antibody C region.
  • the antibody gene is incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region, for example, an enhancer / promoter.
  • host cells can be transformed with this expression vector to express the antibody.
  • the expression of the antibody gene may be carried out by co-transforming the host by separately incorporating the heavy chain (H chain) or light chain (L chain) of the antibody into an expression vector, or DNA encoding the H chain and L chain. May be incorporated into a single expression vector to transform the host (see WO94 / 11523).
  • the monoclonal antibodies of the present invention include genetically modified monoclonal antibodies artificially modified for the purpose of reducing the heteroantigenicity to humans, such as chimeric monoclonal antibodies, humanized monoclonal antibodies, and human monoclonal antibodies. included.
  • a chimeric monoclonal antibody consists of a V region derived from a non-human mammal antibody and a C region derived from a human antibody, and a humanized monoclonal antibody comprises a CDR derived from a non-human mammal antibody and FR and C regions derived from a human antibody. Since the antigenicity in the human body is reduced, it is useful as an antibody used in the present invention.
  • These modified monoclonal antibodies can be produced using known methods.
  • a chimeric monoclonal antibody is obtained by ligating the DNA encoding the antibody V region obtained as described above with DNA encoding the human antibody C region, incorporating it into an expression vector, introducing it into a host, and producing it (for example, WO95 / 14041). Using this known method, chimeric monoclonal antibodies useful in the present invention can be obtained.
  • a humanized monoclonal antibody is obtained by transplanting a complementarity determining region (CDR) of a mammal other than a human, for example, a mouse antibody, into a CDR of a human antibody, and a general gene recombination technique is also known.
  • CDR complementarity determining region
  • oligonucleotides were prepared so that the DNA sequence designed to link the CDR of mouse antibody and the framework region (FR; framework region) of human antibody had an overlapping portion at the end. It is synthesized from nucleotides by PCR. The obtained DNA is obtained by ligating with DNA encoding the human antibody C region, then incorporating it into an expression vector, introducing it into a host and producing it (for example, WO95 / 14041).
  • FR of a human antibody linked via CDR one in which CDR forms a favorable antigen binding site is selected. If necessary, the FR amino acids of the V region of the antibody may be substituted so that the CDRs of the reconstituted human antibody form an appropriate antigen-binding site (Sato, K. et al., Cancer Res. 53, 851).
  • the human antibody C region is used for the chimeric monoclonal antibody and the humanized monoclonal antibody.
  • Preferred human antibody C regions include C ⁇ , and for example, C ⁇ 1, C ⁇ 2, C ⁇ 3, C ⁇ 4 can be used.
  • the human antibody C region may be modified to improve the stability of the antibody or its production.
  • a human monoclonal antibody is composed of a V region and a C region derived from a human antibody, immunizes a human antibody-producing transgenic non-human mammal such as a human antibody-producing transgenic mouse (eg, WO94 / 25585) with an immunogen, and the monoclonal antibody Can be manufactured according to the existing general manufacturing method.
  • the “part of the monoclonal antibody” is a part of the monoclonal antibody of the present invention described above, and means a region specifically binding to PcrV as in the case of the monoclonal antibody (hereinafter referred to as this).
  • antibody fragments are also simply referred to as “antibody fragments”.
  • Fab fragment of antigen binding
  • F (ab ′) 2 single chain antibody
  • Fab ′ single chain Fv
  • scFv single chain Fv
  • Disulfide stabilized antibodies disulfide stabilized Fv; hereinafter referred to as dsFv
  • diabody dimerized V region fragments
  • peptides containing CDRs etc.
  • Fab is obtained by cleaving the upper peptide part of two disulfide bond (SS bond) ⁇ that crosses two H chains at the hinge region of IgG with the enzyme papain. It is an antibody fragment having an antigen-binding activity with a molecular weight of about 50,000, consisting of half and the entire L chain.
  • the Fab used in the present invention can be obtained by treating the above monoclonal antibody of the present invention with papain.
  • the Fab can also be produced by inserting a DNA encoding the Fab of the monoclonal antibody of the present invention into a cell expression vector and expressing the vector by introducing the vector into a cell.
  • F (ab ′) 2 is composed of two Fab ′ regions obtained by decomposing the lower part of the two SS bonds in the hinge region of IgG with the enzyme pepsin and having a molecular weight of about It is an antibody fragment having an antigen binding activity of 100,000.
  • F (ab ′) 2 used in the present invention can be obtained by treating the monoclonal antibody of the present invention with pepsin.
  • F (ab ′) can also be expressed by inserting DNA encoding F (ab ′) 2 of the monoclonal antibody into an expression vector for cells and introducing the vector into Escherichia coli, yeast, or animal cells. 2 can be manufactured.
  • Fab ′ is an antibody fragment having an antigen binding activity of about 50,000 molecular weight obtained by cleaving the SS bond between the hinges of F (ab ′) 2 .
  • Fab ′ used in the present invention can be obtained by treating F (ab ′) 2 of the monoclonal antibody of the present invention with a reducing agent dithiothreitol.
  • Fab ′ can also be produced by inserting a DNA encoding Fab ′ of the monoclonal antibody into an expression vector for cells and expressing the vector by introducing the vector into Escherichia coli, yeast, or animal cells.
  • scFv is a VH-P-VL or VL-P-VH polypeptide in which one VH and one VL are linked using an appropriate peptide linker (hereinafter referred to as P) ⁇ , and has antigenic activity. It is an antibody fragment having The VH and VL contained in the scFv used in the present invention may be those of the above monoclonal antibody of the present invention.
  • the scFv used in the present invention is expressed by obtaining cDNA encoding VH and VL from the hybridoma producing the monoclonal antibody of the present invention, constructing an scFv expression vector, and introducing it into Escherichia coli, yeast, or animal cells. Can be manufactured.
  • DsFv refers to a polypeptide in which one amino acid residue in each of VH and VL is replaced with a cysteine residue, which are linked via an SS bond.
  • the amino acid residue to be substituted with the cysteine residue can be selected based on the three-dimensional structure prediction of the antibody according to the method (Protein Engineering, 7, 697 (1994)) shown by Reiter et al.
  • VH or VL contained in dsFv used in the present invention may be that of the monoclonal antibody of the present invention.
  • dsFv used in the present invention
  • cDNAs encoding VH and VL are obtained from the hybridoma producing the monoclonal antibody of the present invention and inserted into an appropriate expression vector to construct a dsFv expression vector.
  • Yeast or animal cells can be introduced and expressed.
  • Diabody is an antibody fragment in which scFv having the same or different antigen binding specificity forms a dimer, and has bivalent antigen binding activity against the same antigen or two types of specific antigen binding activities against different antigens. It is an antibody fragment.
  • a divalent diabody that specifically reacts with the monoclonal antibody of the present invention obtains cDNA encoding the VH and VL of the monoclonal antibody of the present invention, and encodes scFv with a peptide linker of 3 to 10 residues. It can be produced by constructing DNA, inserting the DNA into an expression vector for cells, and introducing the expression vector into Escherichia coli, yeast, or animal cells to express diabody.
  • the peptide containing CDR is configured to contain at least one region of CDR of VH or VL. Multiple CDRs can be linked directly or via a suitable peptide linker.
  • the CDR-containing peptide used in the present invention is obtained by obtaining cDNA encoding the VH and VL of the monoclonal antibody of the present invention, constructing a DNA encoding the CDR, and inserting the DNA into an expression vector for animal cells.
  • the vector can be produced by introducing the vector into Escherichia coli, yeast, or animal cells.
  • a peptide containing CDR can also be produced by chemical synthesis methods such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
  • the monoclonal antibody of the present invention or a part thereof may be a modified product as long as it can be suitably used in the present invention.
  • the modified product an antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • the modification made to the antibody may be a modification by introducing a chemical bond, or may be a modification made to the amino acid sequence of the antibody.
  • These antibody modifications are also included in the monoclonal antibody of the present invention or a part thereof. In order to obtain such a modified antibody, it can be obtained by modifying the obtained antibody. These methods are already established in this field.
  • the monoclonal antibody of the present invention or a part thereof is useful as a pharmaceutical composition. Therefore, the pharmaceutical composition containing the monoclonal antibody of the present invention and a part thereof can be systemically or locally administered orally or parenterally.
  • parenteral administration for example, intravenous injection such as infusion, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, intranasal administration, inhalation, etc. can be selected. It is known to damage epithelial cells and alveolar macrophages (T. Sawa et al., Nature Medicine, 1999, Vol. 5, page 392). Intranasal administration and inhalation are desirable.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered for the treatment of cystic fibrosis and infection patients caused by Pseudomonas aeruginosa.
  • the effective dose is selected from the range of 0.01 mg to 100 mg per kg body weight at a time.
  • a dose of 1-1000 mg, preferably 5-50 mg per patient can be selected.
  • the pharmaceutical composition containing the monoclonal antibody of the present invention or a part thereof is not limited to these doses.
  • the administration period can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain both pharmaceutically acceptable carriers and additives depending on the route of administration.
  • Such carriers and additives include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, sodium alginate, water-soluble dextran, pectin, methyl cellulose, ethyl cellulose, casein, diglycerin, propylene glycol , Polyethylene glycol, petrolatum, human serum albumin (HSA), mannitol, sorbitol, lactose, surfactants acceptable as pharmaceutical additives, and the like.
  • the additive to be used is selected appropriately or in combination from the above depending on the dosage form, but is not limited thereto. Reference example
  • Mab166 (Japanese Patent Application No. 2005-500250, etc.) was produced as a recombinant antibody.
  • mRNA was extracted from a hybridoma producing an antibody whose subclass is IgG2a, and the constant regions of the H chain and L chain were cloned by RT-PCR.
  • Each fragment amplified by PCR was inserted into a pcDNA3.1 (+) vector (manufactured by Invitrogen) at the NheI and NotI sites, and a multiple cloning site was incorporated so that the DNA fragment of the variable region could be inserted.
  • the H chain and L chain gene sequences of the Mab166 variable region were each divided into four, and then the sense DNA and antisense DNA were synthesized and annealed.
  • the annealed fragments were ligated by DNA ligase, and the H chain was cloned into the MfeI and Blp I regions, and the L chain was cloned into the EcoRV and BsiW I regions.
  • the H chain and L chain vectors whose base sequences were confirmed were introduced into HEK239T cells using Lipofectamine 2000 (manufactured by Invitrogen). After 48 hours, the cell supernatant was recovered.
  • Recombinant Mab166 was purified from the collected cell supernatant using a Protein-G (PIERCE) column.
  • PIERCE Protein-G
  • the amplified PCR fragment was cloned into the pQE30 vector (GE Healthcare) at the Sph I and Hind III sites. After confirming the base sequence, this vector was introduced into E. coli JM109 to obtain recombinant E. coli (PcrV-JM109).
  • PcrV-JM109 was cultured in 500 ml of LB / Ampicillin liquid medium at 37 ° C., and when OD600 reached 0.5, 200 ⁇ l of 0.1M IPTG was added to induce PcrV expression. Further, after culturing at 37 ° C.
  • buffer A 25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5 M NaCl containing 0.5% lysozyme (manufactured by Sigma)
  • 15 ml of 2 mM MgCl2 was added, and the mixture was allowed to stand at 0 ° C. for 30 minutes, and then sonicated.
  • a soluble fraction was obtained, passed through His-Bind Columns (manufactured by Novagen), and then eluted with buffer B (200 mM phosphate buffer (pH 7.4), 500 mM NaCl) containing 200 mM imidazole.
  • the final elution fraction was dialyzed against 10 mM phosphate buffer (pH 7.4) to perform buffer replacement.
  • Biotin labeling of antigen As described above, PcrV protein expressed and purified was reacted in a final concentration 10 mM mercaptoethylamine solution at 37 ° C for 150 minutes to reduce cysteine residues. To the reduced SH group, 20 times the molar amount of PEO-Maleimide activated biotin (manufactured by PIERCE) was added and reacted at 4 ° C. overnight, and then dialyzed to remove excess biotin.
  • Spleen cells and mouse myeloma cells were fused with 50% polyethylene glycol 4000 and selected in a medium containing hypoxanthine, aminopterin, and thymidine.
  • the immunoassay used for the screening is as follows. 200 ⁇ l of Tris buffer solution (50 mM Tris-HCl, pH 7.5) containing 2 ⁇ g of anti-mouse IgG antibody (manufactured by Shiba Goat) was added to each well of a 96-well microtiter plate (manufactured by NUNK) and fixed at 4 ° C. for 16 hours. did.
  • the plate was washed 3 times with 300 ⁇ l of washing solution, and the enhancement reagent (1.39 g / l potassium phthalate, 19.3 mg / l Tri-n-octylphosphine oxide, 4.59 mg / l 2-naphthoyltrifluoracetone, 1.0 g / l 200 ⁇ l of 1 Triton-X100, 6.0 g / l acetic acid) was added, and the time-resolved fluorescence was measured.
  • the enhancement reagent (1.39 g / l potassium phthalate, 19.3 mg / l Tri-n-octylphosphine oxide, 4.59 mg / l 2-naphthoyltrifluoracetone, 1.0 g / l 200 ⁇ l of 1 Triton-X100, 6.0 g / l acetic acid
  • 1F3 was IgG2a
  • 2A4 was IgG2b
  • 6F5 was IgG2a
  • 7A7 was IgG2a.
  • the hybridoma that produces monoclonal antibodies 1F3, 2A4, 6F5, and 7A7 was founded on October 18, 2007 in the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center (1-1-1 Higashi 1-1-1, Tsukuba, Ibaraki).
  • the deposit numbers are FERM P-21403, FERM P-21404, FERM P-21405, and FERM ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ P-21406, respectively.
  • Antibody binding activity A competitive immunoassay was performed to measure the binding activity of the antibodies (1F3, 2A4, 6F5, 7A7).
  • 100 ⁇ l of Tris buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5) containing 1.5 ⁇ g of anti-mouse Fc antibody (Jackson ImmunoResearch) was added to each well of a 96-well microtiter plate (Nunk) at 4 ° C. Fixed for 16 hours. These wells were washed twice with 300 ⁇ l of washing solution, and then 300 ⁇ l of a block ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) solution containing 10% sucrose was added and left at room temperature for 2 hours for blocking (anti-mouse IgG antibody). Solid phase plate).
  • the affinity of Mab166 is 3.0 ⁇ 10 ⁇ 9
  • 1F3 is 3.7 ⁇ 10 ⁇ 10
  • 2A4 is 3.5 ⁇ 10 ⁇ 10
  • 6F5 is 1.1 ⁇ 10 9.
  • ⁇ 10 7A7 was 1.1 ⁇ 10 ⁇ 9
  • both clones had higher affinity than Mab166 (FIG. 2)
  • Cytotoxicity inhibitory activity test 1F3, 2A4, 6F5, and 7A7 were subjected to a cytotoxicity inhibitory activity test. The method is as follows. First, 1F3, 2A4, 6F5, and 7A7 were diluted from 32 ⁇ g / ml in a 2-fold dilution series, and 10 ⁇ l was dispensed into each well of a 96-well microplate.
  • the myeloma cell P3U1 (obtained from ATCC) was added to 5 ⁇ 10 6 Cells / ml or U937 (obtained from ATCC) cells, which are a type of white blood cell, to 1 ⁇ 10 6 Cells / ml, and the medium for cell culture (sodium bicarbonate And L-glutamine and phenol red-free RPMI 1640 (manufactured by Sigma)) and 100 ⁇ l of each was added to the 96-well microplate.
  • the medium for cell culture sodium bicarbonate And L-glutamine and phenol red-free RPMI 1640 (manufactured by Sigma)
  • the cytotoxic inhibitory activity (IC50) of Mab166 was 213 nM or higher, whereas 1F3 was 5.3 nM, 2A4 was 20.7 nM, 6F5 was 12.7 nM, 7A7 is 14.7 nM.
  • IC50 cytotoxic inhibitory activity
  • Mab166 is 54 nM, whereas 1F3 is 4.0 nM, 2A4 is 16 nM, 6F5 is 7.3 nM, and 7A7 is 6.0 nM. It was.
  • 1F3, 2A4, 6F5, and 7A7 are compared with Mab166 (Frank et al., The Journal of Infectious Diseases, 2002, Vol. 186, page 66), which is known to have strong activity against any cell. Even so, it had strong cytotoxicity-inhibiting activity (FIGS. 4 and 5).
  • deletion mutation PcrV (136-233) was prepared by the following method. PCR was performed using the PcrV antigen protein expression plasmid pQE30-PcrV as a template and using the 5 ′ primer GCTCGAGGATCCCAAGGCCGCTGACCGC (SEQ ID NO: 5) and 3 ′ primer GTTAAGCTTCTCGAAGGGGTACTC (SEQ ID NO: 6), and the amplified fragment was BamHI and HindIII After restriction enzyme treatment, it was inserted into pET32b (manufactured by Novagen).
  • this vector was introduced into Escherichia coli BL21-DE3 strain to obtain recombinant Escherichia coli (deletion mutant PcrV-BL21).
  • This expression strain was pre-cultured in 2 ml of LB / Ampicillin liquid medium at 37 ° C. overnight. 2 mL of preculture was added to 500 ml of LB / Ampillin liquid medium and cultured at 37 ° C. When the OD600 reached 0.5, the culture was allowed to stand on ice for 30 minutes. IPTG was added to a final concentration of 0.75 mM, and the cells were cultured overnight at 15 ° C. and 160 rpm in a shaking incubator to induce the expression of PcrV.
  • the culture was collected by centrifugation at 4 ° C., x5000 g, 30 min. The supernatant was removed, and 10 ml of Buffer X (25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2) containing 0.1% lysozyme (manufactured by Sigma) was added to the cells and suspended. After leaving it to stand for 1 hour, it was subjected to ultrasonic crushing treatment while cooling with ice.
  • Buffer X 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2) containing 0.1% lysozyme (manufactured by Sigma) was added to the cells and suspended. After leaving it to stand for 1 hour, it was subjected to ultrasonic crushing treatment while cooling with ice.
  • the possibility fraction was obtained by centrifugation, passed through a column packed with Ni-NTA agarose (Quiagen), and then eluted with Buffer Y (25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 200 mM Imidazole). The final elution fraction was dialyzed against 10 mM phosphate buffer (pH 7.4) to perform buffer replacement.
  • enhancement reagent (1.39 g / l potassium phthalate, 19.3 mg / l Tri-n-octylphosphine oxide, 4.59 mg / l 2-naphthoyltrifluoracetone, 1.0 g / l Triton- 200 ⁇ l of X100, 6.0 g / l acetic acid) was added, and the time-resolved fluorescence was measured (FIG. 6).
  • the PcrV antibodies 1F3, 2A4, 9D12, 12H9, and m166 from KaloBios used as a reference example showed reactivity with the full length of PcrV (1-294).
  • 1F3 and 2A4 showed reactivity against PcrV (136-233), but m166 and 9D12 and 12H9 without neutralizing activity showed no reactivity.
  • a PcrV antibody solution diluted to 1 ⁇ g / ml was added to the membrane, reacted at 4 ° C. overnight, and then washed with washing solution B (10 mM phosphate buffer (pH 7.4), 0.05% Tween 20).
  • washing solution B 10 mM phosphate buffer (pH 7.4), 0.05% Tween 20.
  • a solution of anti-mouse IgG antibody (manufactured by GE Healthcare) labeled as a secondary antibody was added to the membrane, reacted for 2 hours at room temperature, the membrane was washed with washing solution B, and then ECL plus Western Blot Detection System (manufactured by GE Healthcare). Color was developed and photographed with LAS-1000 (FUJIFILM) (FIG. 7).
  • PcrV neutralizing antibodies 1F3 and 2A4 reacted to both full-length PcrV and deletion mutant PcrV, while m166 and 6F5 and 7A7 with low neutralizing activity reacted only to full-length PcrV and to deletion mutant PcrV. Did not react.
  • the epitope region of the PcrV neutralizing antibodies 1F3 and 2A4 was the region of amino acid residues 136-233, and m166, 6F5, and 7A7 did not have only the amino acid residues 136-233 as the epitope region.
  • the test concentration ranges of 1F3, 2A4, and m166 in this test were 1.56-6.25 nM, 6.25-25 nM, and 50-200 nM, respectively.
  • 10 ⁇ l of full length PcrV protein and deletion mutant PcrV protein were added to a 96-well plate at a molar concentration of 30, 10, 3, 1, 0.3 times for each test concentration range, and left at room temperature for 30 minutes.
  • myeloma cells U3P1 were prepared in 5 ⁇ 10 6 cells / ml using a cell culture medium (containing sodium bicarbonate, L-glutamine and phenol red-free RPMI 1640 (manufactured by Sigma)), and the 96 wells. 70 ⁇ l of each was added to the microplate.
  • the antibodies (1F3 and 2A4) having an epitope at amino acid residues 136-233 have stronger cytotoxic inhibitory activity than the antibody (m166) having no epitope in that region. That is, the strength of cytotoxicity-inhibiting activity differs depending on the region recognized by the PcrV antibody, and the strongest cytotoxicity-inhibiting activity can be said to be an antibody having reactivity with the PcrV protein only in the amino acid residue 136-233 region. It was.
  • 1F3 was AGGGGCCCAGTGGATAGACCGATGGGCGCTGT (sequence number: 9)
  • 2A4 was AGGGGCCCAGTGGATAGACTGATGGGGGGTGT (sequence number: 10).
  • the amplified fragment was cloned using TOPO TA Cloning Kit (manufactured by Invitrogen), and the base sequence was analyzed using Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer (manufactured by Applied Biosystems).
  • the analysis results of 1F3 are shown in FIG. 10, and 2A4 is shown in FIG.
  • the monoclonal antibody of the present invention or a part thereof not only has a high affinity for PcrV, but also showed a strong inhibitory activity against the cytotoxic activity against eukaryotic cells of Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa). . Therefore, the pharmaceutical composition containing the monoclonal antibody or a part thereof is useful as a therapeutic agent for infectious diseases involving Pseudomonas aeruginosa, which is currently difficult to treat in the medical field.

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Abstract

感染症、特に緑膿菌による感染症の治療に有効な手段を提供する。 ＰｃｒＶに対するモノクローナル抗体又はその一部、およびこれらを有効成分として含む医薬組成物を提供する。具体的には、本発明のモノクローナル抗体は、緑膿菌のターゲット細胞に対する細胞傷害阻害活性の阻害活性が優れている。また、本発明のモノクローナル抗体はＰｃｒＶに対して高い親和性を有する。

Description

ＰｃｒＶに対する抗体
　本発明は、ＰｃｒＶを認識するモノクローナル抗体又はその一部に関する。具体的には、本発明は従来の抗ＰｃｒＶ抗体よりも中和活性（以下、細胞傷害阻害活性ともいう）の高い抗体又はその一部、およびこれらを含有する医薬組成物に関する。
緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は、自然界に広く存在する偏性好気性のグラム陰性桿菌である。その病原性は通常は低いが、癌や糖尿病等の各種基礎疾患を有する患者、免疫抑制作用を有する薬剤の投与を受けている患者に多く発生する日和見感染症を引き起こす病原菌であり、肺炎、尿路感染症、敗血症等を引き起こして重篤な結果をもたらすことも多い。緑膿菌感染症は臨床現場では、現在最も治療の困難な感染症の一つと考えられている。何故なら、緑膿菌は既存の抗生物質に対する感受性が元来低いばかりでなく、種々の抗生物質に対して容易に耐性を獲得して難治化する傾向が強いためである。このように、緑膿菌に対しては、次々に新たな抗生物質を開発するという対応では限界があり、抗生物質によらない治療法が切望されている。
　緑膿菌の高い細胞傷害性は、III型外毒素分泌システムを経由した真核細胞内への毒素注入により発揮される。ＰｃｒＶは、２９４残基（ＮＣＢＩ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＡＣ４５９３５、配列番号：１）からなるIII型外毒素分泌システムの構成蛋白であり、コードするオペロン配列は公開されている（特許文献１、非特許文献１）。ＰｃｒＶに対する制御は、緑膿菌感染症における治療手段に結びつく可能性がある（非特許文献２）ことから、中和活性を有するＰｃｒＶに対するポリクローナル抗体（非特許文献３、４）やモノクローナル抗体（特許文献２、非特許文献５、６）が報告されている。しかし、ポリクローナル抗体ではヒト化が困難であり、また抗原性の改善が難しく医薬品組成物としての使用は困難である。また、現在までに報告されているモノクローナル抗体は、その中和活性が低く、臨床現場における要求を満たすものではない。
米国特許６５５１７９５ 特表２００５－５００２５０ Ｙａｈｒ，Ｔ．Ｌ．ら、Ｊ. Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １９９７年、第１７９巻、７１６５ページ Ｔ・Ｓａｗａら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９９年、第５巻、３９２ページ Ｓｈｉｍｅ　Ｎら Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１年、第１６７巻、５８８０ページ Ｉｍａｍｕｒａ　Ｙら Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ． ２００７年、第２９巻、９６５ページ Ｋａｒｉｎｅ　Ｆａｕｒｅら Ｊ．Ｉｍｍｕｎｅ．Ｂａｓｅｄ．Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ　ａｎｄ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ、２００３年、第１巻 Ｄａｒａ　Ｗ．Ｆｒａｎｋら Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓｅ、２００２年、第１８６巻、６４ページ
　本発明が解決しようとする課題は、感染症、特に緑膿菌による感染症の治療に有効な手段を提供することである。
本発明者らは、ＰｃｒＶに対するモノクローナル抗体の作製に関して鋭意研究した結果、従来知られている抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体に比して、より疾患への治療効果が高いと考えられる新規なモノクローナル抗体を作製することに成功し本発明を完成した。
すなわち本発明は、
（１）（A）インビトロにおいて１ｎMから２００ｎMの濃度で、緑膿菌の白血球細胞に対する細胞傷害活性の５０％以上を阻害する、　　
（B）インビトロにおいて１ｎMから５０ｎMの濃度で、緑膿菌のミエローマ細胞に対する細胞傷害活性の５０％以上を阻害する、および　　　　　　　
（C）ＰｃｒＶとの解離定数（Ｋｄ）が、２×１０－９（Ｍ）以下である、
から選ばれる少なくとも１つの性質を有するＰｃｒＶに対するモノクローナル抗体またはその一部、　　
（２）　受託番号ＦＥＲＭ　P-２１４０３として寄託されたハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ　P-２１４０４として寄託されたハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ　P-２１４０５として寄託されたハイブリドーマまたは受託番号ＦＥＲＭ　P-２１４０６として寄託されたハイブリドーマのいずれかにより産生されるモノクローナル抗体の全ての相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体またはその一部、
（３）受託番号ＦＥＲＭ　P-２１４０３として寄託されたハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ　P-２１４０４として寄託されたハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ　P-２１４０５として寄託されたハイブリドーマまたは受託番号ＦＥＲＭ　P-２１４０６として寄託されたハイブリドーマのいずれかにより産生されるモノクローナル抗体またはその一部、
（４）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１３６位から２３３位に、そのエピトープを有する、ＰｃｒＶに対するモノクローナル抗体またはその一部、
（５）１）相補性決定領域に下記アミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
　　　　　　　ＳＦＴＳＹＷＭＨ（配列番号１５）ＩＮＰＳＮＧＲＴＮＹＮＥＫＦＮＴ（配列番号１６）ＹＧＮＹＶＶＹＹＴＭＤＹ（配列番号１７）および
　　　　　　２）相補性決定領域に下記アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
　　　　　　 ＳＡＳＴＳＶＳＹＭＥ（配列番号１８）ＴＴＳＫＬＡＳ（配列番号１９）
　ＨＱＷＲＮＹＰＦＴ（配列番号２０）
　　　　　　を有するＰｃｒＶに対するモノクローナル抗体またはその一部、
（６）１）相補性決定領域に下記アミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
　　　　　　ＳＩＴＳＤＹＡＷＮ（配列番号２１）ＹＩＴＹＮＧＤＴＳＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号２２）ＳＲＮＹＹＧＡＷＦＡＹ（配列番号２３）および
　　　２）相補性決定領域に下記アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
　　　　　　 ＫＡＳＱＹＶＧＴＴＶＡ（配列番号２４）ＲＡＳＴＲＨＴ（配列番号２５）　
ＱＱＹＣＳＳＰＬＴ（配列番号２６）
　　　　　　を有するＰｃｒＶに対するモノクローナル抗体またはその一部、
（７）１）配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；および
　　　２）配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；を有するＰｃｒＶに対するモノクローナル抗体またはその一部、
（８）１）配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；および
　　　２）配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；を有するＰｃｒＶに対するモノクローナル抗体またはその一部、および
（９）上記（１）～（８）のいずれかに記載の抗体又はその一部を有効成分として含む医薬組成物、および
（１０）上記（１）～（８）のいずれかに記載の抗体又はその一部を産生するハイブリドーマ、
に関する。
　本発明のモノクローナル抗体又はその一部は、ＰｃｒＶに対する中和活性が非常に優れているため、感染症の治療剤として有用である。
図１は、ＰｃｒＶ抗体（１Ｆ３、２Ａ４、６Ｆ５、７Ａ７及びＭａｂ１６６）におけるビオチン標識ＰｃｒＶの未標識ＰｃｒＶによる置換曲線を示す。 図２は、表面プラズモン共鳴解析によるＰｃｒＶ抗体（１Ｆ３、２Ａ４、６Ｆ５、７Ａ７及びＭａｂ１６６）の親和性を示す。 図３は、ＰｃｒＶ抗体（１Ｆ３、２Ａ４、６Ｆ５、７Ａ７、Ｍａｂ１６６）とＭａｂ１６６とのサンドイッチ・アッセイの結果を示す。 図４は、シュードモナス・アエルギノーザＳＲ２４株のＵ９３７細胞への細胞傷害活性に対するＰｃｒＶ抗体（１Ｆ３、２Ａ４、６Ｆ５、７Ａ７及びＭａｂ１６６）の阻害効果を示す。 図５は、シュードモナス・アエルギノーザＳＲ２４株のミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１への細胞傷害活性に対するＰｃｒＶ抗体（１Ｆ３、２Ａ４、６Ｆ５、７Ａ７及びＭａｂ１６６）の阻害効果を示す。 図６は、ＰｃｒＶ抗体（１Ｆ３、２Ａ４、９Ｄ１２、１２Ｈ９及びｍ１６６）におけるビオチン標識ＰｃｒＶの未標識全長ＰｃｒＶおよび欠失変異ＰｃｒＶによる置換曲線を示す。 図７は、ウエスタンブロットでのＰｃｒＶ抗体（１Ｆ３、２Ａ４、９Ｄ１２、１２Ｈ９及びｍ１６６）における全長ＰｃｒＶおよび欠失変異ＰｃｒＶとの反応性を示す。 図８は、抗体と全長ＰｃｒＶとの相関関係を細胞傷害阻害活性の抑制により示す。 図９は、抗体と欠損変異ＰｃｒＶとの相関関係を細胞傷害阻害活性の抑制により示す。 １Ｆ３抗体の可変領域のアミノ酸配列を示す。下線部はＣＤＲ領域を示す。 ２Ａ４抗体の可変領域のアミノ酸配列を示す。下線部はＣＤＲ領域を示す。
本発明が対象とする「モノクローナル抗体」とは、前述するＰｃｒＶに特異的に結合するモノクローナル抗体である。より具体的には、（１）インビトロにおいて１ｎMから２００ｎMの濃度で、緑膿菌の白血球細胞に対する細胞傷害活性の５０％以上を阻害する、
　（２）インビトロにおいて１ｎMから５０ｎMの濃度で、緑膿菌のミエローマ細胞に対する細胞傷害活性の５０％以上を阻害する、および　　　　　　　
　（３）ＰｃｒＶとの解離定数（Ｋｄ）が、２×１０－９（Ｍ）以下である、
から選ばれる少なくとも１つの性質を有するＰｃｒＶに対するモノクローナル抗体である。
本発明のモノクローナル抗体は、強い細胞傷害阻害活性を有していることを一つの特徴として挙げられる。例えば、白血球細胞を用いた場合であれば緑膿菌の有する細胞傷害活性を１～２００ｎＭ、好ましくは２～１００ｎＭ、さらに好ましくは５～２５ｎＭの範囲内の濃度で５０％以上阻害する阻害（中和）活性を有している。また、ミエローマ細胞を用いた場合であれば、緑膿菌の有する細胞傷害活性を１～５０ｎＭ、好ましくは２～３０ｎＭ、さらに好ましくは４～２０ｎＭの範囲内の濃度で５０％以上阻害する阻害活性を有している。これらの値は、Ｄａｒａ　Ｗ．Ｆｒａｎｋら（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓｅ、２００２年、第１８６巻、６４ページ）に報告されているＭａｂ１６６の活性値を大きく超えている。
　また、本発明のモノクローナル抗体は、ＰｃｒＶの全長アミノ酸配列（配列番号１）における１３６位から２３３位の領域にそのエピトープを有することを特徴としている。この領域を認識する抗体は、その他の領域を認識する抗体よりも強い活性（細胞傷害阻害活性）を有することを本発明者らは見出した。
モノクローナル抗体の認識エピトープの同定は以下のようにして行うことができる。まず、モノクローナル抗体の認識する分子の様々な部分構造を作製する。部分構造の作製にあたっては、公知のオリゴペプチド合成技術を用いてその分子の様々な部分ペプチドを作成する方法、遺伝子組換え技術を用いて目的の部分ペプチドをコードするDNA配列を好適な発現プラスミドに組み込み、大腸菌等の宿主内外で生産する方法等があるが、上記目的のためには両者を組み合わせて用いるのが一般的である。例えば、抗原タンパク質のC末端又はN末端から適当な長さで順次短くした一連のポリペプチドを当業者に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製した後、それらに対するモノクローナル抗体の反応性を検討し、大まかな認識部位を決定する。
その後、さらに細かく、その対応部分のオリゴペプチド、又は該ペプチドの変異体等を、当業者に周知のオリゴペプチド合成技術を用いて種々合成し、本発明の予防又は治療剤が有効成分として含有するモノクローナル抗体のそれらペプチドに対する結合性を調べるか、又は該モノクローナル抗体と抗原との結合に対するペプチドの競合阻害活性を調べることによりエピトープを限定する。多種のオリゴペプチドを得るための簡便な方法として、市販のキット（例えば、SPOTsキット（ジェノシス・バイオテクノロジーズ社製）、マルチピン合成法を用いた一連のマルチピン・ペプチド合成キット（カイロン社製）等）を利用することもできる。
細胞傷害阻害活性は以下の手順により測定することができる。まず細胞傷害阻害活性の測定対象であるモノクローナル抗体を、２倍希釈系列によって希釈し適当な濃度に調整を行う。
次に、緑膿菌の毒素などにより影響を受ける細胞（以下、ターゲット細胞とする）を細胞培養用の培地などを用いて希釈を行い、適当な数となるように調整する。具体的には、ミエローマ細胞を用いる場合であれば３×１０６～５×１０６Ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、白血球細胞を用いるのであれば１×１０６～３×１０６Ｃｅｌｌｓ／ｍｌの範囲で調整することが望ましい。同様にして、緑膿菌についても培養用の培地などで１×１０７～１×１０８ｃｆｕ／ｍｌとなるように調整する。そして、上述したモノクローナル抗体の存在下において、緑膿菌およびターゲット細胞を、同一の試験管やウェル（例えば、マイクロプレート上のウェルなどのインビトロの条件）において適度な培養条件により培養する。このときの培養条件は細胞やバクテリアを生育させるのに良好とされる一般的な培養条件でよい。また、培養時間はターゲット細胞の種類により最適な条件は適宜変更するが、例えばミエローマ細胞を用いる場合であれば１～３時間程度、白血球細胞を用いる場合であれば１～３時間程度が好ましい。抗体を添加しないウェルを対照群として、対照群に対して５０％を阻害する濃度（有効濃度）を算出する。ターゲット細胞の生死の判定については種々の手法が確立されているが、呈色試薬を添加した後に、適当な波長（例えば、４００～５００ｎｍ）における吸光度の測定などが有用である（参考文献：Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９９年、ｖｏｌ．５、３９２～３９５ページ）。
　本発明のモノクローナル抗体は、ＰｃｒＶに対して高い親和性を有していることをひとつの特徴として挙げられる。モノクローナル抗体の抗原に対する親和性を表す指標として用いられる解離定数（Ｋｄ）は、種々の方法に従って解析することができる。たとえば、各種標識剤で標識した抗原を用いたＳｃａｔｃｈａｒｄ法や、市販の測定キットであるＢｉａｃｏｒｅＸ（アマシャムファルマシア社製）または類似のキットを用いて、当該キットに添付された取扱い説明書及び実験操作方法に従って容易に解析することができる。これらの方法を用いて求められる解離定数（Ｋｄ値）はＭ（モル）なる単位で表される。試験されたモノクローナル抗体は、解離定数が小さいほど強い親和性を有していることを示す。本発明にかかるモノクローナル抗体またはその一部については、ＰｃｒＶとの解離定数（Ｋｄ）は、２×１０－９（Ｍ）以下、好ましくは１．５×１０－９（Ｍ）以下、さらに好ましくは１．２×１０－９（Ｍ）以下である。
　　本発明のモノクローナル抗体において、好ましくは、重鎖および軽鎖の可変領域はヒト由来であり、例えば、配列番号１１～１４の改変体（たとえば、１または数個のアミノ酸の置換・挿入、付加もしくは欠失を含むものが挙げられるがこれに限定されない。）の配列を有しうる。定常領域ドメインはまた、好ましくは、適当なヒト定常領域ドメイン、例えば、Ｋａｂａｔ　Ｅ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，ＵＳ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈに記載されているものが含まれる。可変領域のアミノ酸配列をＫａｂａｔらにより作成された抗体のアミノ酸配列のデータベース（［Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３）にあてはめて、相同性を調べることによりＣＤＲ領域を見いだすことが出来る。ＣＤＲ領域の配列は、本発明の所望する生物学的活性（たとえば、結合活性または中和活性）が保持される範囲内であれば、少なくとも１つの付加・挿入、置換または欠失による改変体も本発明に含まれる。各ＣＤＲ領域との相同性が９０～１００％の配列であるものが挙げられる。好ましくは、相同性が９５～１００％の配列であるものが挙げられる。さらに好ましくは、相同性が９８～１００％の配列であるものが挙げられる。
　フレームワーク領域は、任意の種類のフレームワーク領域に関連し得るが、好ましくはヒト由来のものである。適当なフレームワーク領域は、Ｋａｂａｔ　Ｅ．Ａ．らの文献を参照すれば選択できる。好ましい重鎖フレームワークは、ヒト重鎖フレームワークであり、例えば、図１０または図１１に示される抗ＰｃｒＶ抗体のフレームワークである。それは図１０または図１１に示す配列から、上記文献を参照して決定することができる。同様の方法で、抗ＰｃｒＶ軽鎖フレームワークについても、図１０または図１１に示す配列から、上記文献を参照して決定することができる。
　　本発明のモノクローナル抗体において、より好ましい形態として、少なくともａ）（ｉ）配列中に相補性決定領域である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、この場合、ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＳＦＴＳＹＷＭＨ（配列番号１５）を有し、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＩＮＰＳＮＧＲＴＮＹＮＥＫＦＮＴ（配列番号１６）を有し、ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＹＧＮＹＶＶＹＹＴＭＤＹ（配列番号１７）を有する、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）またはその断片および（ｉｉ）ヒト重鎖の定常部分またはその断片を含む抗体を挙げることができる。
そしてｂ）（ｉ）ＣＤＲ１はアミノ酸配列　ＳＡＳＴＳＶＳＹＭＥ（配列番号１８）を有し、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＴＴＳＫＬＡＳ（配列番号１９）を有し、ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＨＱＷＲＮＹＰＦＴ（配列番号２０）を有する、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶL）および（ｉｉ）ヒト軽鎖の定常部分またはその断片を含んでいることが望ましい。
　他に、本発明のより好ましい抗ＰｃｒＶ抗体として、少なくともａ）（ｉ）配列中に相補性決定領域である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、この場合、ＣＤＲ１はアミノ酸配列　ＳＩＴＳＤＹＡＷＮ（配列番号２１）を有し、ＣＤＲ２はアミノ酸配列）ＹＩＴＹＮＧＤＴＳＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号２２）　を有し、ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＳＲＮＹＹＧＡＷＦＡＹ（配列番号２３）を有する、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）またはその断片および（ｉｉ）ヒト重鎖の定常部分またはその断片を含む抗体を挙げることができる。
そしてｂ）（ｉ）ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＫＡＳＱＹＶＧＴＴＶＡ（配列番号２４）を有し、ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＲＡＳＴＲＨＴ（配列番号２５）を有し、ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＱＱＹＣＳＳＰＬＴ（配列番号２６）を有する、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶL）および（ｉｉ）ヒト軽鎖の定常部分またはその断片を含んでいることが望ましい。
本発明のモノクローナル抗体は、ＰｃｒＶ（天然体、組換体、合成物など）を免疫原として用い、既存の一般的な製造方法によって調製することができる。具体的には、まずＰｃｒＶを免疫原として、また必要に応じてフロイントアジュバントとともに、哺乳動物、好ましくは、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ウマあるいはウシ（ヒト抗体産生トランスジェニックマウスのような他の動物由来の抗体を産生するように作出されたトランスジェニック動物を含む）、より好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはウサギの皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に１乃至数回注射することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１～２１日毎に１～４回免疫を行って、最終免疫より約１～１０日後に免疫感作された哺乳動物から抗体産生細胞を取得することができる。免疫を施す回数及び時間的インターバルは、使用する免疫原の性質などにより、適宜変更することができる。
　なお、免疫原あるいはハプテンとして使用されるＰｃｒＶとしては、例えば下記のものを例示することができる。
（イ）ＰｃｒＶを細胞表面に発現する細胞もしくは細胞表面に発現するように人工的に樹立した細胞株、またはＰｃｒＶを細胞表面に発現するように遺伝子組換え技術を用いて作成した遺伝子組換え細胞；
（ロ）ＰｃｒＶまたはその一部をタンパク質として発現するように遺伝子組換え技術を用いて作成された遺伝子組換え細胞を培養して得た培養上清もしくは当該培養上清から精製されたＰｃｒＶまたはその一部；または
（ハ）化学的に合成されたＰｃｒＶまたはその一部。
　モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの調製は、ケーラー及びミルシュタインらの方法（Ｎａｔｕｒｅ、１９７５、ｖｏｌ．２５６、ｐ４９５～４９７）及びそれに準じた方法に従って行うことができる。即ち、前述の如く免疫感作された哺乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラットまたはヒト由来の自己抗体産生能のないミエローマ細胞を細胞融合させることによってハイブリドーマを調製することができる。
　細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えば８－アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）ミエローマ株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３－Ｕ１）［Ｙｅｌｔｏｎ， Ｄ．Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ８１， １－７（１９７８）］、Ｐ３／ＮＳＩ ／１－Ａｇ４－１（ＮＳ－１） ［Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ． ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ６， ５１１－５１９ （１９７６） ］、Ｓｐ２ ／Ｏ－Ａｇ１４ （ＳＰ－２） ［Ｓｈｕｌｍａｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ， ２７６， ２６９－２７０ （１９７８）］、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３ （６５３） ［Ｋｅａｒｎｅｙ， Ｊ． Ｆ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １２３， １５４８－１５５０ （１９７９）］、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８（Ｘ６３） ［Ｈｏｒｉｂａｔａ， Ｋ． ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ， Ａ． Ｗ． Ｎａｔｕｒｅ， ２５６， ４９５－４９７ （１９７５）］などを使用することができる。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の前述のマウス免疫感作で用いた免疫原に対する反応性を、ＲＩＡやＥＬＩＳＡ等の免疫測定法によって測定し、当該免疫原あるいはハプテンに対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって行う。そして、通常は免疫原を固相化しそこに結合する培養上清中の抗体を、酵素で標識した抗マウス第二抗体で検出するという、非競合法ＥＬＩＳＡを用いる。
　ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイブリドーマをインビトロで培養するか、またはマウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等、好ましくはマウスまたはラット、より好ましくはマウスの腹水中等で培養し、得られた培養上清、または哺乳動物の腹水から単離することにより行うことができる。インビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地あるいは既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
　基本培地としては、例えば、Ｈａｍ’Ｆ１２培地、ＭＣＤＢ１５３培地あるいは低カルシウムＭＥＭ培地等の低カルシウム培地及びＭＣＤＢ１０４培地、ＭＥＭ培地、Ｄ－ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＡＳＦ１０４培地あるいはＲＤ培地等の高カルシウム培地等が挙げられ、該基本培地は、目的に応じて、例えば血清、ホルモン、サイトカイン及び／または種々無機あるいは有機物質等を含有することができる。モノクローナル抗体の単離、精製は、上述の培養上清あるいは腹水を、飽和硫酸アンモニウム、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２等）、抗イムノグロブリンカラムあるいはプロテインＡカラム等のアフィニティカラムクロマトグラフィーに供すること等により行うことができる。
また本発明のモノクローナル抗体として、抗体遺伝子を抗体産生細胞、例えばハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｃａｒｌら、ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ、１９９０年発行）。
具体的には、目的とする抗体を産生するハイブリドーマや抗体を産生する免疫細胞、例えば感作リンパ球等を癌遺伝子等により不死化させた細胞から、抗体の可変領域（Ｖ領域）をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えばグアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、Ｊ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ(１９７９) １８、５２９４-５２９９)等により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ(ファルマシア製）等を使用してｍＲＮＡを調製する。
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　Ｆｉｒｓｔ－ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ等を用いて行うことができる。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには５’－Ａｍｐｌｉ　ＦＩＮＤＥＲ　ＲＡＣＥＫｉｔ (クローンテック製）およびＰＣＲを用いた５’－ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８８年、第８５巻、 ８９９８ページなど)を使用することができる。得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作成し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、デオキシ法により確認する。
目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。本発明で使用される抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー／プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
抗体遺伝子の発現は、抗体の重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）を別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主を形質転換させてもよい（ＷＯ９４／１１５２３参照）。
本発明のモノクローナル抗体には、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型モノクローナル抗体、例えば、キメラモノクローナル抗体、ヒト型化モノクローナル抗体や、ヒトモノクローナル抗体が含まれる。
キメラモノクローナル抗体はヒト以外の哺乳動物抗体由来のＶ領域とヒト抗体由来のＣ領域からなり、ヒト型化モノクローナル抗体はヒト以外の哺乳動物抗体由来のＣＤＲとヒト抗体由来のＦＲおよびＣ領域からなり、ヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明に使用される抗体として有用である。これらの改変モノクローナル抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
キメラモノクローナル抗体は、前記のようにして得た抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる（例えば、ＷＯ９５／１４０４１）。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラモノクローナル抗体を得ることができる。
ヒト型化モノクローナル抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ; ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ) をヒト抗体のＣＤＲへ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（例えば、ＷＯ９５／１４０４１）。
具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ＦＲ ; ｆｒａｍｅｗｏｒｋ　ｒｅｇｉｏｎ)を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡを、ヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（例えば、ＷＯ９５／１４０４１）。
ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、ＣＤＲが良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成したヒト抗体のＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成するように抗体のＶ領域のＦＲのアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ、Ｋ．ら, Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ． １９９３年、第５３巻、８５１ページ)。キメラモノクローナル抗体と、ヒト型化モノクローナル抗体には、ヒト抗体Ｃ領域が使用される。好ましいヒト抗体Ｃ領域としては、Ｃγが挙げられ、例えば、Ｃγ１，Ｃγ２，Ｃγ３，Ｃγ４を使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい。
ヒトモノクローナル抗体はヒト抗体由来のV領域およびＣ領域からなり、ヒト抗体産生トランスジェニックマウス（例えば、ＷＯ９４／２５５８５号）などのヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物に免疫原を免疫し、モノクローナル抗体の既存の一般的な製造方法に従って製造することができる。
　本発明において「モノクローナル抗体の一部」とは、前述する本発明のモノクローナル抗体の一部であって、当該モノクローナル抗体と同様にＰｃｒＶに特異的に結合性を有する領域を意味する（以下、これを単に「抗体断片」ともいう）。
具体的には、前述するヒトＰｃｒＶに対して特異的結合性を有するＦａｂ (ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｂｉｎｄｉｎｇ)、Ｆ(ａｂ')２、Ｆａｂ'、一本鎖抗体 （ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　Ｆｖ; 以下、ｓｃＦｖと表記する)、ジスルフィド安定化抗体(ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ　ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ　Ｆｖ; 以下、ｄｓＦｖと表記する)、２量化体Ｖ領域断片 (以下、Ｄｉａｂｏｄｙと表記する)、ＣＤＲを含むペプチド等を挙げることができる（エキスパート・オピニオン・オン・テラピューティック・パテンツ、第６巻、第５号、第４４１～４５６頁、１９９６年）。
　Ｆａｂは、ＩｇＧのヒンジ領域で２本のＨ鎖を架橋している２つのジスルフィド結合 (Ｓ－Ｓ結合) の上部のペプチド部分を酵素パパインで分解して得られる、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体で構成される、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明で使用されるＦａｂは、上記本発明のモノクローナル抗体をパパイン処理して得ることができる。または、上記本発明のモノクローナル抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを細胞用発現ベクターに挿入し、該ベクターを細胞へ導入することにより発現させることによってもＦａｂを製造することができる。
　Ｆ(ａｂ')２は、ＩｇＧのヒンジ領域の２個のＳ－Ｓ結合の下部を酵素ペプシンで分解して得られる、２つのＦａｂ'領域がヒンジ部分で結合して構成される、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明で使用されるＦ(ａｂ')２は、上記本発明のモノクローナル抗体をペプシン処理して得ることができる。または、当該モノクローナル抗体のＦ(ａｂ')２をコードするＤＮＡを細胞用発現ベクターに挿入し、該ベクターを大腸菌、酵母、あるいは動物細胞へ導入することにより発現させることによってもＦ(ａｂ')２を製造することができる。
　Ｆａｂ'は、上記Ｆ(ａｂ')２のヒンジ間のＳ－Ｓ結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明で使用されるＦａｂ'は、上記本発明のモノクローナル抗体のＦ(ａｂ')２を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、当該モノクローナル抗体のＦａｂ'をコードするＤＮＡを細胞用発現ベクターに挿入し、該ベクターを大腸菌、酵母、あるいは動物細胞へ導入することにより発現させることによってもＦａｂ'を製造することができる。
　ｓｃＦｖは、一本のＶＨと一本のＶＬとを適当なペプチドリンカー (以下、Ｐと表記する) を用いて連結した、ＶＨ－Ｐ－ＶＬないしはＶＬ－Ｐ－ＶＨポリペプチドであり、抗原活性を有する抗体断片である。本発明で使用されるｓｃＦｖに含まれるＶＨおよびＶＬは、上記本発明のモノクローナル抗体のものであればよい。本発明で使用されるｓｃＦｖは、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマよりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖ発現ベクターを構築し、大腸菌、酵母、あるいは動物細胞へ導入することにより発現させ製造することができる。
　ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドをＳ－Ｓ結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法 (Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、 ７、 ６９７ (１９９４)) に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明で使用されるｄｓＦｖに含まれるＶＨあるいはＶＬは、本発明のモノクローナル抗体のものであればよい。本発明で使用されるｄｓＦｖは、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマよりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、適当な発現ベクターに挿入してｄｓＦｖ発現ベクターを構築し、該発現ベクターを大腸菌、酵母、あるいは動物細胞へ導入し、発現させることにより製造することができる。
　Ｄｉａｂｏｄｙは、抗原結合特異性が同じ、または異なるｓｃＦｖが２量体を形成した抗体断片であり、同じ抗原に対する２価の抗原結合活性、または異なる抗原に対する２種類の特異的な抗原結合活性を有する抗体断片である。例えば、本発明のモノクローナル抗体に特異的に反応する２価のＤｉａｂｏｄｙは、本発明のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、３～１０残基のペプチドリンカーを有するｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを細胞用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを大腸菌、酵母、あるいは動物細胞へ導入することによりＤｉａｂｏｄｙを発現させることにより、製造することができる。
　ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。本発明で使用されるＣＤＲを含むペプチドは、本発明のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得した後、ＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを動物細胞用発現ベクターに挿入し、該ベクターを大腸菌、酵母、あるいは動物細胞へ導入することにより発現させることにより、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法 (フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、ｔＢｏｃ法 (ｔ－ブチルオキシカルボニル法) 等の化学合成法によって製造することもできる。
本発明のモノクローナル抗体又はその一部は、本発明に好適に使用され得るかぎり、その修飾物であってよい。修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ） 等の各種分子と結合した抗体を使用することができる。抗体になされる修飾とは、化学的結合を導入することによる修飾であってもよいし、抗体のアミノ酸配列になされる修飾であってもよい。本発明のモノクローナル抗体又はその一部にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野においてすでに確立されている。
本発明のモノクローナル抗体又はその一部は、医薬組成物として有用である。したがって本発明のモノクローナル抗体およびその一部を含む医薬組成物は、経口的あるいは非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。非経口的投与としては、例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、鼻腔内投与、吸入などを選択することができるが、緑膿菌は気道感染によって特に肺上皮細胞や肺胞のマクロファージに傷害を及ぼすことが知られており（Ｔ・Ｓａｗａら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９９年、第５巻、３９２ページ）鼻腔内投与、吸入が望ましい。
本発明の医薬組成物は、緑膿菌による嚢胞性線維症や感染症患者の治療のために投与される。例えば、有効投与量は、一回につき体重１kgあたり０．０１mgから１００mgの範囲から選ばれる。あるいは、患者あたり１～１０００mg、好ましくは５～５０mgの投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明のモノクローナル抗体又はその一部を含む医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。また、投与期間は、患者の年齢、症状により適宜選択することができる。本発明の医薬組成物は、投与経路次第で医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。
このような担体および添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、カゼイン、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げられる。使用される添加物は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。
参考例
リコンビナントＭａｂ１６６の作製
比較実験をするために、Ｍａｂ１６６（特願２００５－５００２５０など）をリコンビナント抗体として作製した。
まずサブクラスがＩｇＧ２ａである抗体を産生するハイブリドーマからｍＲＮＡを抽出し、Ｈ鎖およびＬ鎖の定常領域をＲＴ－ＰＣＲ法でクローニングした。ＰＣＲで増幅されたそれぞれの断片はｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（インビトロジェン社製）にＮｈｅＩ、ＮｏｔＩサイトで挿入し、さらに可変領域部分のＤＮＡ断片を挿入できるようにマルチクローニングサイトを組み込んだ。
次にＭａｂ１６６可変領域部のＨ鎖およびＬ鎖の遺伝子配列をそれぞれ４分割した後、それらのセンスＤＮＡとアンチセンスＤＮＡを合成し、アニーリング反応した。アニーリング後の断片をＤＮＡリガーゼによって結合させ、Ｈ鎖についてはＭｆｅＩとＢｌｐ　Ｉ領域に、Ｌ鎖についてはＥｃｏＲＶとＢｓｉＷ　Ｉ領域にクローニングを行った。
塩基配列が確認されたＨ鎖およびＬ鎖のベクターをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロジェン社製）を用いて、ＨＥＫ２３９Ｔ細胞へ導入し、４８時間後、その細胞上清を回収した。回収された細胞上清からＰｒｏｔｅｉｎ－Ｇ（ＰＩＥＲＣＥ社製）カラムでリコンビナントＭａｂ１６６を精製した。
以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に制限されるものではない。なお、抗体作製手法として、特に断らない限り、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｉｎ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉａｔｉｏｎｓ）に記載されている方法を用いた。また、遺伝子操作的手法として、特に断らない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に記載されている方法を用いた。
抗原の調整
　東海大より分与された緑膿菌株標準株ＰＡO１の染色体ＤＮＡを抽出し、そのＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により、ＰｃｒＶタンパク質をコードする遺伝子（配列番号：２）を増幅した。５’側プライマーに制限酵素Ｓｐｈ　Ｉ認識部位を、３’側プライマーに制限酵素Ｈｉｎｄ　III認識部位を設け（配列番号：３、４）、さらに発現ベクター挿入時に、ビオチン標識のためにヒスチジンタグと開始コドンの間にシステインが挿入されるように設計した。増幅されたＰＣＲ断片はＳｐｈ　ＩおよびＨｉｎｄ　III部位でｐＱＥ３０ベクター（ＧＥヘルスケア社製）へクローニングを行なった。塩基配列を確認後、大腸菌ＪＭ１０９へ本ベクターを導入し、組み換え大腸菌（ＰｃｒＶ－ＪＭ１０９）を得た。ＰｃｒＶ－ＪＭ１０９を５００ｍｌのＬＢ／Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ液体培地中に３７℃で培養し、ＯＤ６００が０．５になった時に０．１ＭのＩＰＴＧを２００μｌ加え、ＰｃｒＶの発現を誘導した。さらに、３７℃で１．５時間培養後、菌体を遠心分離し、０．５％のリゾチーム（シグマ社製）を含む緩衝液Ａ（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２）を１５ ｍｌ加え、０℃で３０分間放置後、超音波処理を行った。遠心後、可溶性画分を得、Ｈｉｓ－Ｂｉｎｄ　Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に通した後、２００ｍＭ　イミダゾールを含む緩衝液Ｂ(２０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ　ＮａＣｌ)で溶出した。最終的な溶出画分は１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に対して透析することにより緩衝液置換を行った。
抗原のビオチン標識
上記のように、発現・精製させたＰｃｒＶタンパク質を終濃度１０ｍＭ　メルカプトエチルアミン溶液中で３７℃、１５０分反応させてシステイン残基を還元した。還元されたＳＨ基にモル比で２０倍量のＰＥＯ－Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｂｉｏｔｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を添加し、４℃で終夜反応後、過剰なビオチンを除去するため、透析をおこなった。
抗原の免疫
　抗原として精製したＰｃｒＶ　２０μｇをフロイント完全アジュバントと共に４週齢Ｂａｌｂ／ｃ雌マウス７匹に腹腔内投与し、初回免疫とした。その後、１４日後、３５日後にＰｃｒＶ　２０μｇをフロイント不完全アジュバントと共に投与し、追加免疫とした。さらに７７日後にＰｃｒＶ　２０μｇの腹腔投与とＰｃｒＶ　１０μｇを尾静脈投与することで、最終免疫とした。
ハイブリドーマの作製
最終免疫の３日後に脾臓を摘出し、脾臓細胞を回収した。脾臓細胞とマウスミエローマ細胞（ｐ３×６３－Ａｇ８．Ｕ１、東京腫瘤研究所）を５０％のポリエチレングリコール４０００を用いて融合させ、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含む培地で選択した。
ＰｃｒＶ抗体の選定
　細胞融合８日後に特異抗体産生細胞のスクリーニングを行った。スクリーニングに用いたイムノアッセイは以下の通りである。９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）の各ウェルに２μｇの抗マウスＩｇＧ抗体（シバヤギ社製）を含むトリス緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を２００μｌ加えて４℃で１６時間固定した。これらのウェルを３００μｌの洗浄液（０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水）で２回洗浄した後、ブロックエース（大日本製薬社製）を３００μｌ加えて室温で２時間放置して、ブロッキングを行った（抗マウスＩｇＧ抗体固相化プレート）。各ウェルを３００μｌの洗浄液で２回洗浄した後、５０μｌのハイブリドーマ培養上清を１５０μｌの緩衝液Ｃ（０．９％　塩化ナトリウム、０．０５％　アジ化ナトリウム、０．５％　ウシ血清アルブミン、０．０１%　Ｔｗｅｅｎ８０、２５μＭ　Ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ‘’、Ｎ’ ’－ｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄを含む５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．６）で希釈して各ウェルに添加し、４℃で終夜反応させた。３００μｌの洗浄液で３回洗浄後、１０ｎｇのＥｕ－Ｌａｂｅｌｌｅｄ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＰＥＲＫＩＮ　ＥＬＭＥＲ社製）と２５ｎｇ　ビオチン標識化ＰｃｒＶを含む２００μｌの緩衝液Ｃを加え、室温１時間反応させた。反応後、３００μｌの洗浄液で３回洗浄を行い、増強試薬（１．３９ｇ／ｌ　フタル酸カリウム、１９．３ｍｇ／ｌ　Ｔｒｉ－ｎ－ｏｃｔｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ　ｏｘｉｄｅ、４．５９ｍｇ／ｌ　２－ｎａｐｈｔｈｏｙｌｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｏｎｅ、１．０ｇ／ｌ　Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、６．０ｇ／ｌ　酢酸）を２００μｌ添加し、その時間分解蛍光を測定した。
スクリーニングの結果から、リコンビナントＰｃｒＶと強い親和性を示したハイブリドーマを２０クローン選択し、実施例４に従い緑膿菌による細胞傷害の阻害活性を確認した。その結果、１０クローンで細胞傷害阻害活性が認められ、これらのクローンについて限外希釈法により２回クローニングをおこなうことで、ＰｃｒＶを認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローンを獲得した。獲得した１０クローンについて、細胞傷害阻害活性の高いクローンを４つ選択し、それぞれ、１Ｆ３、２Ａ４、６Ｆ５、７Ａ７と命名した。これらの抗体について、マウスモノクローナル抗体アイソタイピングＥＬＩＳＡキット（ＢＤバイオサイエンス社製）を用いて、抗体のサブクラスを決定した結果、１Ｆ３はＩｇＧ２ａ、２Ａ４はＩｇＧ２ｂ、６Ｆ５はＩｇＧ２ａ、７Ａ７はＩｇＧ２ａであった。
　モノクローナル抗体１Ｆ３、２Ａ４、６Ｆ５、７Ａ７を産生するハイブリドーマは、独立行政法人　産業技術総合研究所内　特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１－１－１　中央第６）に、平成１９年１０月１８日付けで、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ Ｐ-２１４０３、ＦＥＲＭ Ｐ-２１４０４、ＦＥＲＭ Ｐ-２１４０５、ＦＥＲＭ Ｐ-２１４０６として寄託されている。
抗体の結合活性
抗体（１Ｆ３、２Ａ４、６Ｆ５、７Ａ７）の結合活性を測定するために、競合イムノアッセイを行った。９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）の各ウェルに１．５μｇの抗マウスＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｃｈ社製）を含むトリス緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を１００μｌ加えて４℃で１６時間固定した。これらのウェルを３００μｌの洗浄液で２回洗浄した後、１０％スクロースを含むブロックエース（大日本製薬社製）溶液を３００μｌ加えて室温で２時間放置して、ブロッキングを行った（抗マウスＩｇＧ抗体固相化プレート）。各ウェルを３００μｌの洗浄液で２回洗浄した後、２ｎｇ／ウェルの各抗体および未標識のＰｃｒＶを５００ｎｇ／ウェルから１０倍の希釈系列で５段階添加した。その後、５ｎｇ／ウェルのビオチン化ＰｃｒＶを添加し終夜反応させた。３００μｌの洗浄液で４回洗浄し、１００／ウェルのＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｗａｌｌａｃ社製）を添加後、１分間の攪拌後、時間分解蛍光を測定した。その結果、Ｍａｂ１６６と比較して、１Ｆ３、２Ａ４、６Ｆ５、７Ａ７はＰｃｒＶとの強い結合活性を示した（図１）。
次に表面プラズモン共鳴解析により、１Ｆ３、２Ａ４、６Ｆ５、７Ａ７、Ｍａｂ１６６のＰｃｒＶに対する親和性を算出した。ＣＭ５センサーチップ上にＭｏｕｓｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｃａｐｔｕｒｅ　Ｋｉｔ（ＢＩＡＣＯＲＥ社製）を用いて、抗マウス抗体を固相化し、続いて各ＰｃｒＶ抗体をキャプチャーした。当該固相センサーチップをセットしたＢＩＣＯＲＥ　Ｔ１００にリコンビナントＰｃｒＶをロードし、親和性を求めた。
その結果、Ｍａｂ１６６の親和性は、３．０×１０－９であるのに対して、１Ｆ３は３．７×１０－１０、２Ａ４は３．５×１０－１０、６Ｆ５は１．１×１０－１０、７Ａ７は１．１×１０－９　であり、いずれのクローンもＭａｂ１６６よりも親和性が高かった（図２）
　Ｍａｂ１６６とのサンドイッチの可否
　１Ｆ３、２Ａ４、６Ｆ５、７Ａ７はＭａｂ１６６とエピトープが異なることを証明するため、当該抗体とＭａｂ１６６とのサンドイッチ・アッセイの可否を検討した。
　最初に、Ｍａｂ１６６のビオチン標識を行った。１００μｇのＭａｂ１６６と７．８５３μｇのＮＨＳ－ＰＥＯ４　Ｂｉｏｔｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を０．１Ｍ　ＰＢＳ(ｐＨ７．４)中で混合し、氷中で２時間反応させた。その後、反応溶液から未反応のビオチンを除去するため、ゲルクロマトグラフィー（Ｇ２０００ＳＷカラム（ＴＯＳＨＯ社製））を行った。
　次にサンドイッチ・アッセイを行った。９６ウェルマイクロタイタープレート（ヌンク社製）に各５００μｇのＰｃｒＶ抗体（１Ｆ３、２Ａ４、６Ｆ５，７Ａ７）を含むＰＢＳ（－）溶液１００μｌを加えて、４℃で１６時間固定した。これらのウェルを３００μｌの洗浄液（０．０１％　Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水）で１回洗浄した後、ブロックエース（大日本製薬社製）を３００μｌ加えて室温で２時間放置して、ブロッキングを行った。各ウェルを３００μｌの洗浄液で２回洗浄した後、５０μｇのＰｃｒＶと５０ｎｇのビオチン標識Ｍａｂ１６６を含む１００μｌのＡｓｓａｙ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｗａｌｌａｃ社製）を添加し、４℃で終夜反応させた。洗浄液で３回洗浄後、５０ｎｇのＥｕ－Ｌａｂｅｌｌｅｄ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｗａｌｌａｃ社製）を含むＡｓｓａｙ　Ｂｕｆｆｅｒを１００μｌ添加し、室温で１時間反応させた。洗浄液で４回洗浄し、１００μｌのＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加後、１分間の撹拌を経て、その時間分解蛍光を測定した。
その結果、１Ｆ３、２Ａ４、６Ｆ５、７Ａ７はＭａｂ１６６とサンドイッチ・アッセイが可能であり、本抗体群はＭａｂ１６６とエピトープが異なることが明らかとなった（図３）。
細胞傷害阻害活性試験
１Ｆ３、２Ａ４、６Ｆ５、７Ａ７について、細胞傷害阻害活性試験を行った。その方法は以下の通りである。
まず１Ｆ３、２Ａ４、６Ｆ５、７Ａ７を、３２μｇ／ｍｌから２倍希釈系列で希釈し、９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに１０μｌずつ分注した。次にミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１(ＡＴＣＣから入手)を５×１０６Ｃｅｌｌｓ／ｍｌもしくは白血球細胞の一種であるＵ９３７（ＡＴＣＣから入手）細胞を１×１０６Ｃｅｌｌｓ／ｍｌに細胞培養用培地（炭酸水素ナトリウムを含み、Ｌ－グルタミン及びフェノール・レッド不含ＲＰＭＩ１６４０(Ｓｉｇｍａ社製)）を用いて調整し、当該９６ウェルマイクロプレートに各１００μｌ添加した。さらにＣａｔｉｏｎ－ａｄｊｕｓｔｅｄ　Ｍｕｅｌｌｅｒ　Ｈｉｎｔｏｎ　Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）で一晩培養したシュードモナス・アエルギノーザＳＲ２４株を細胞培養用培地を用いて１×１０８ｃｆｕ／ｍｌに調整した菌液を１０μｌ／ウェルで添加し、３７℃、５％Ｃ０２存在下で３時間培養した。３時間経過後、ＷＳＴ－８（キシダ化学社製）を各１０μｌ添加し、ミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１を用いた場合は、３７℃、５％Ｃ０２存在下で３時間、Ｕ９３７細胞の場合は１時間培養した。培養終了後、４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。
その結果、白血球Ｕ９３７細胞を用いた場合、その細胞傷害阻害活性（ＩＣ５０）は、Ｍａｂ１６６が２１３ｎＭ以上であるのに対して、１Ｆ３は５．３ｎＭ、２Ａ４は２０．７ｎＭ、６Ｆ５は１２．７ｎＭ、７Ａ７は１４．７ｎＭであり、ミエローマ細胞Ｕ３Ｐ１を用いた場合は、Ｍａｂ１６６が５４ｎＭであるのに対して、１Ｆ３は４．０ｎＭ、２Ａ４は１６ｎＭ、６Ｆ５は７．３ｎＭ、７Ａ７は６．０ｎＭであった。すなわち、１Ｆ３、２Ａ４、６Ｆ５、７Ａ７は、いずれの細胞に対しても、その強い活性が知られていたＭａｂ１６６（Ｆｒａｎｋら、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ、２００２年、第１８６巻、６６ページ）と比較しても強い細胞傷害阻害活性を有していた（図４および図５）。
欠失変異ＰｃｒＶの作製
　欠失変異ＰｃｒＶ（１３６－２３３）は以下の方法で作製した。
ＰｃｒＶ抗原タンパク発現プラスミドであるｐＱＥ３０―ＰｃｒＶを鋳型とし、５’側プライマーＧＣＴＣＧＡＧＧＡＴＣＣＣＡＡＧＧＣＧＣＴＧＡＣＣＧＣ（配列番号５）、３’側プライマーＧＴＴＡＡＧＣＴＴＣＴＣＧＡＡＧＧＧＧＴＡＣＴＣ（配列番号６）を用いてＰＣＲを行い、増幅したフラグメントをＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素処理し、ｐＥＴ３２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入した。塩基配列を確認後、本ベクターを大腸菌ＢＬ２１－ＤＥ３株に導入し組み換え大腸菌（欠失変異ＰｃｒＶ－ＢＬ２１）を得た。この発現株を２ｍｌのＬＢ／Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ液体培地で３７℃、一昼夜前培養した。５００ｍｌのＬＢ／Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ液体培地中に２ｍＬの前培養液を加えて３７℃で培養し、ＯＤ６００が０．５になった時に培養液を氷上で３０分間静置した。終濃度０．７５ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加え、震盪培養機で１５℃、１６０ｒｐｍ、一昼夜培養してＰｃｒＶの発現を誘導した。培養液を４℃、ｘ５０００ｇ、３０ｍｉｎで遠心して集菌した。上清を除き、菌体に０．１％のリゾチーム（シグマ社製）を含むＢｕｆｆｅｒ　Ｘ（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２）を１０ ｍｌ加えて懸濁し、氷上で１時間静置した後、氷冷しながら超音波破砕処理した。遠心により可能性画分を得、Ｎｉ－ＮＴＡアガロース（Ｑｕｉａｇｅｎ）を充填したカラムに通した後、Ｂｕｆｆｅｒ　Ｙ（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、２００ｍＭ　Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）で溶出した。最終的な溶出画分は１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に対して透析することにより緩衝液置換を行った。
エピトープ領域の決定
９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）の各ウェルに１．５μｇの抗マウスＩｇＧ　Ｆｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を含むトリス緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を１５０μｌ加えて４℃で１６時間固定した。これらのウェルを３００μｌの洗浄液（０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水）で２回洗浄した後、ブロッキング溶液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ７．５、２％ブロックエース（大日本製薬社製）、１０％スクロース）を３００μｌ加えて室温で２時間放置して、各ウェルをブロッキングした（抗マウスＩｇＧ抗体固相化プレート）。各ウェルを３００μｌの洗浄液で１回洗浄した後、緩衝液Ｃ（０．９％　塩化ナトリウム、０．０５％　アジ化ナトリウム、０．５％　ウシ血清アルブミン、０．０１%　Ｔｗｅｅｎ８０、２５μＭ　Ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’ ，Ｎ’ ’， Ｎ’ ’－ｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄを含む５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．６）で８０ｎｇ／ｍｌに希釈したＰｃｒＶ抗体溶液を５０μｌずつ各ウェルに添加し、Ｂｕｆｆｅｒ　Ｃで２００ｎｇ／ｍｌに希釈したＥｕ－Ｌａｂｅｌｌｅｄ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＰＥＲＫＩＮ　ＥＬＭＥＲ社製）溶液を各ウェルに５０μｌずつ、ＤＥＬＦＩＡ　Ａｓｓｓａｙ　Ｂｕｆｆｅｒで各濃度に希釈した欠損変異ＰｃｒＶタンパクを各ウェルに１００μｌずつ加え４℃で終夜反応させた。３００μｌの洗浄液で３回洗浄後、２００μｌの増強試薬（１．３９ｇ／ｌ　フタル酸カリウム、１９．３ｍｇ／ｌ　Ｔｒｉ－ｎ－ｏｃｔｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ　ｏｘｉｄｅ、4.59mg／ｌ　２－ｎａｐｈｔｈｏｙｌｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｏｎｅ、１．０ｇ／ｌ　Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、６．０ｇ／ｌ　酢酸）を２００μｌ添加し、その時間分解蛍光を測定した（図６）。
その結果、ＰｃｒＶ抗体１Ｆ３、２Ａ４、９Ｄ１２、１２Ｈ９、また参考例として用いたＫａｌｏＢｉｏｓ社のｍ１６６はＰｃｒＶ全長（１－２９４）に対して反応性を示した。他方でＰｃｒＶ（１３６－２３３）に対して、１Ｆ３、２Ａ４は反応性を示したが、ｍ１６６、及び中和活性を持たない９Ｄ１２、１２Ｈ９は反応性を示さなかった。
またウエスタンブロット法による結合解析も行なった。精製したリコンビナントＰｃｒＶタンパクをＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った後、ＰＶＤＦメンブレンに転写した。転写されたメンブレンはブロックエース（大日本製薬製）溶液で室温、２時間、振盪しながらブロッキングした。１μｇ／ｍｌに希釈したＰｃｒＶ抗体溶液をメンブレンに加え、４℃で終夜反応させた後、洗浄液Ｂ（１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した。２次抗体として標識した抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）溶液をメンブレンに加え、室温で２時間反応後、メンブレンを洗浄液Ｂで洗浄し、ＥＣＬ　ｐｌｕｓ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）で発色させ、ＬＡＳ－１０００（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）で撮影した（図７）。ＰｃｒＶ中和抗体１Ｆ３、２Ａ４は全長ＰｃｒＶおよび欠失変異ＰｃｒＶの双方に対して反応したが、ｍ１６６、及び中和活性の低い６Ｆ５、７Ａ７は全長ＰｃｒＶに対してのみ反応し、欠失変異ＰｃｒＶには反応しなかった。
このことからＰｃｒＶ中和抗体１Ｆ３、２Ａ４のエピトープ領域は、アミノ酸残基１３６－２３３の領域であり、ｍ１６６、６Ｆ５、７Ａ７はアミノ酸残基１３６－２３３だけをエピトープ領域とするものではなかった。
ＰｃｒＶタンパク質の特定領域と細胞傷害活性の強さの相関性
全長ＰｃｒＶタンパク質（配列番号１）および欠損変異ＰｃｒＶタンパク質（配列番号１における１３６位－２３３位のアミノ酸配列を有する）を用いて，１Ｆ３、２Ａ４、ｍ１６６における細胞傷害阻害活性の抑制試験を行なった。その方法は以下の通りである。
　まず１Ｆ３、２Ａ４、ｍ１６６をそれぞれ２００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭから２倍希釈系列で希釈し、９６ウェルマイクロプレートに１０μｌずつ分注した。本試験における１Ｆ３、２Ａ４、ｍ１６６の試験濃度域はそれぞれ１．５６－６．２５ｎＭ、６．２５－２５ｎＭ、５０－２００ｎＭとした．各試験濃度域に対して全長ＰｃｒＶタンパク質および欠損変異ＰｃｒＶタンパク質を３０、１０、３、１、０．３倍モル濃度で９６ウェルプレートに１０μｌ添加し、３０分室温で放置した．次にミエローマ細胞Ｕ３Ｐ１を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに細胞培養用培地（炭酸水素ナトリウムを含み、Ｌ－グルタミン及びフェノール・レッド不含ＲＰＭＩ１６４０(Ｓｉｇｍａ社製)）を用いて調製し、当該９６ウェルマイクロプレートに各７０μｌ添加した。さらにＭｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）で一晩培養した緑膿菌ＳＲ２４株を細胞培養用培地を用いて１×１０８ｃｆｕ／ｍｌに調製した菌液を１０μｌ添加し、３７℃、５％Ｃ０２存在下で３時間培養した。３時間経過後、ＷＳＴ－８（キシダ化学社製）を各１０μｌ添加し、３７℃、５％Ｃ０２存在下で３時間培養した。培養終了後、４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。
その結果、ＰｃｒＶタンパク質非添加の場合、１Ｆ３、２Ａ４はｍ１６６と比較して強い細胞傷害阻害活性を示した．一方、全長ＰｃｒＶタンパク質を添加した場合は、いずれの抗体も添加した全長ＰｃｒＶタンパク質の濃度依存的に細胞傷害阻害活性が抑制された（図８）。それに対し、欠損変異ＰｃｒＶタンパク質を添加した場合では、そのアミノ酸領域（１３６－２３３）にエピトープを有する１Ｆ３、２Ａ４は添加した欠損変異タンパク質の濃度依存的に細胞傷害阻害活性が抑制されるが、エピトープを有さないｍ１６６は細胞傷害阻害活性に変化は観察されなかった（図９）。
以上のことから、アミノ酸残基１３６－２３３にエピトープを有する抗体（１Ｆ３および２Ａ４）は、その領域にエピトープを有さない抗体（ｍ１６６）より強い細胞傷害阻害活性を有すると考えられた。すなわち、ＰｃｒＶ抗体の認識する領域によって、細胞傷害阻害活性の強さが異なり、もっとも強い細胞傷害阻害活性を有するのは、アミノ酸残基１３６－２３３領域だけでＰｃｒＶタンパク質に反応性を有する抗体といえた。
ＰｃｒＶ抗体（１Ｆ３および２Ａ４）のアミノ酸配列の解析
樹立されたハイブリドーマ細胞から、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、ＲＮＡの抽出を行った。抽出したＲＮＡを１μｇから、５’ＲＡＣＥ　Ｓｙａｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｒａｐｉｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　Ｅｎｄｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　２．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ＤＮＡ断片の増幅を行った。その際、ｃＤＮＡ合成のために使用したプライマーは、１Ｆ３がＴＡＧＡＧＴＣＡＣＣＧＡＧＧＡＧＣＣＡＧＴＴＧＴ(配列番号：７)であり、２Ａ４はＴＣＣＡＧＡＧＴＴＣＣＡＡＧＴＣＡＣＡＧＴＣＡＣ(配列番号：８)であった。また５’ＲＡＣＥ法に用いたプライマーは、１Ｆ３がＡＧＧＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＣＧＡＴＧＧＧＧＣＴＧＴ(配列番号：９)であり、２Ａ４がＡＧＧＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＴＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴ(配列番号：１０)であった。増幅された断片は、ＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）でクローニングされ、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３１３０　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で塩基配列を解析した。１Ｆ３の解析結果を、図１０に、２Ａ４については図１１に示した。
本発明のモノクローナル抗体又はその一部は、ＰｃｒＶに対して高い親和性を有しているだけでなく、緑膿菌（シュードモナス・エルギノーザ）の真核細胞に対する細胞傷害活性に強い阻害活性を示した。従って、該モノクローナル抗体又はその一部を含む医薬組成物は、現在医療現場において治療が難しいとされる緑膿菌が関与する感染症の治療薬として有用である。

Claims (10)

  1. 以下の（１）～（３）から選ばれる少なくとも１つの性質を有するＰｃｒＶに対するモノクローナル抗体またはその一部：
    　（１）インビトロにおいて１ｎMから２００ｎMの濃度で、緑膿菌の白血球細胞に対する細胞傷害活性の５０％以上を阻害する、　　
    　（２）インビトロにおいて１ｎMから５０ｎMの濃度で、緑膿菌のミエローマ細胞に対する細胞傷害活性の５０％以上を阻害する、及び　　　　　　　
    　（３）ＰｃｒＶとの解離定数（Ｋｄ）が、２×１０－９（Ｍ）以下である。　　
  2. 受託番号ＦＥＲＭ　P-２１４０３として寄託されたハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ　P-２１４０４として寄託されたハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ　P-２１４０５として寄託されたハイブリドーマまたは受託番号ＦＥＲＭ　P-２１４０６として寄託されたハイブリドーマのいずれかにより産生されるモノクローナル抗体の全ての相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体またはその一部。
  3. 受託番号ＦＥＲＭ　P-２１４０３として寄託されたハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ　P-２１４０４として寄託されたハイブリドーマ、受託番号ＦＥＲＭ　P-２１４０５として寄託されたハイブリドーマまたは受託番号ＦＥＲＭ　P-２１４０６として寄託されたハイブリドーマのいずれかにより産生されるモノクローナル抗体またはその一部。
  4. 配列番号１で示されるアミノ酸配列の１３６位から２３３位に、そのエピトープを有する、ＰｃｒＶに対するモノクローナル抗体またはその一部。
  5. １）相補性決定領域に下記アミノ酸配列を含む重鎖可変領域；　　　　　　　ＳＦＴＳＹＷＭＨ（配列番号１５）ＩＮＰＳＮＧＲＴＮＹＮＥＫＦＮＴ（配列番号１６）ＹＧＮＹＶＶＹＹＴＭＤＹ（配列番号１７）および　２）相補性決定領域に下記アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；ＳＡＳＴＳＶＳＹＭＥ（配列番号１８）ＴＴＳＫＬＡＳ（配列番号１９）　 ＨＱＷＲＮＹＰＦＴ（配列番号２０）を有するＰｃｒＶに対するモノクローナル抗体またはその一部。
  6. １）相補性決定領域に下記アミノ酸配列を含む重鎖可変領域；　　　　　　　ＳＩＴＳＤＹＡＷＮ（配列番号２１）ＹＩＴＹＮＧＤＴＳＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号２２）ＳＲＮＹＹＧＡＷＦＡＹ（配列番号２３）および２）相補性決定領域に下記アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；ＫＡＳＱＹＶＧＴＴＶＡ（配列番号２４）ＲＡＳＴＲＨＴ（配列番号２５）ＱＱＹＣＳＳＰＬＴ（配列番号２６）を有するＰｃｒＶに対するモノクローナル抗体またはその一部。
  7. １）配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；および　　　　　　２）配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；を有するＰｃｒＶに対するモノクローナル抗体またはその一部。
  8. １）配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；および　　　　　　２）配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；を有するＰｃｒＶに対するモノクローナル抗体またはその一部。
  9. 請求項１～８のいずれかに記載の抗体又はその一部を有効成分として含む医薬組成物。
  10. 請求項１～８のいずれかに記載の抗体又はその一部を産生するハイブリドーマ。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010104052A1 (ja) * 2009-03-11 2010-09-16 塩野義製薬株式会社 抗緑膿菌作用を有するヒト化ＰｃｒＶ抗体
US8501179B2 (en) 2008-01-10 2013-08-06 Shionogi & Co., Ltd. Antibody against PcrV
JP2015509723A (ja) * 2012-03-02 2015-04-02 アブリンクス エン．ヴェー． シュードモナス・エルギノーサのＰｃｒＶに結合する単一可変ドメイン抗体
WO2020252029A1 (en) 2019-06-11 2020-12-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-pcrv antibodies that bind pcrv, compositions comprising anti-pcrv antibodies, and methods of use thereof

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3385280A1 (en) 2011-06-10 2018-10-10 MedImmune Limited Anti-pseudomonas psl binding molecules and uses thereof
RS60920B1 (sr) * 2011-11-07 2020-11-30 Medimmune Ltd Kombinovane terapije primenom anti-pseudomonas psl i pcrv vezujućih molekula
CN114072145A (zh) * 2020-06-01 2022-02-18 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 特异性识别假单胞菌pcrv的抗体及其用途

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994011523A2 (en) 1992-11-13 1994-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Fully impaired consensus kozac sequences for mammalian expression
WO1994025585A1 (en) 1993-04-26 1994-11-10 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1995014041A1 (fr) 1993-11-19 1995-05-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anticorps humain reconstitue contre des cellules medulloblastomateuses humaines
US6551795B1 (en) 1998-02-18 2003-04-22 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to pseudomonas aeruginosa for diagnostics and therapeutics
JP2005500250A (ja) 2001-01-26 2005-01-06 エムシーダブリユー リサーチ フオンデーシヨン インコーポレーテツド シュードモナスｖ抗原を用いる免疫化のための方法および組成物
WO2007114340A1 (ja) * 2006-03-30 2007-10-11 Meiji Seika Kaisha, Ltd. 緑膿菌の外膜タンパク質ｐａ０４２７
WO2009005040A1 (ja) * 2007-06-29 2009-01-08 Meiji Seika Kaisha Ltd. 緑膿菌の外膜タンパク質pa4710

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1049488B1 (en) 1998-11-25 2006-03-01 MCW Research Foundation, Inc. Method of and compositions for immunization with the pseudomonas aeruginosa v-antigen
US20030228324A1 (en) * 1999-05-06 2003-12-11 Malcolm Andrew J. Peptide compositions and methods of producing and using same
JP4782700B2 (ja) * 2004-01-20 2011-09-28 カロバイオス ファーマシューティカルズ インコーポレイティッド 最低限必須な結合決定基を用いた抗体特異性の移入
CN101002947B (zh) * 2007-01-16 2010-08-25 湖南农业大学 一种用于细菌病治疗的靶向药物及其制备方法
CA2706732A1 (en) 2007-11-30 2009-06-11 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to the pcrv antigen of pseudomonas aeruginosa
BRPI0906810A2 (pt) 2008-01-10 2019-10-01 Shionogi & Co anticorpo contra pcrv
PL2407537T6 (pl) 2009-03-11 2016-07-29 Shionogi & Co Humanizowane przeciwciało PcrV wykazujące aktywność przeciwko Pseudomonas

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994011523A2 (en) 1992-11-13 1994-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Fully impaired consensus kozac sequences for mammalian expression
WO1994025585A1 (en) 1993-04-26 1994-11-10 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1995014041A1 (fr) 1993-11-19 1995-05-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anticorps humain reconstitue contre des cellules medulloblastomateuses humaines
US6551795B1 (en) 1998-02-18 2003-04-22 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to pseudomonas aeruginosa for diagnostics and therapeutics
JP2005500250A (ja) 2001-01-26 2005-01-06 エムシーダブリユー リサーチ フオンデーシヨン インコーポレーテツド シュードモナスｖ抗原を用いる免疫化のための方法および組成物
WO2007114340A1 (ja) * 2006-03-30 2007-10-11 Meiji Seika Kaisha, Ltd. 緑膿菌の外膜タンパク質ｐａ０４２７
WO2009005040A1 (ja) * 2007-06-29 2009-01-08 Meiji Seika Kaisha Ltd. 緑膿菌の外膜タンパク質pa4710

Non-Patent Citations (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CARL ET AL., THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, 1990
CHIRGWIN, J. M. ET AL., BIOCHEMISTRY, vol. 18, 1979, pages 5294 - 5299
DARA W. FRANK ET AL., J. INFECT. DISEASE, vol. 186, 2002, pages 64
DATABASE NCBI 19 November 1997 (1997-11-19), YAHR T.L. ET AL.: "Pseudomonas aeruginosa PcrG (pcrG), PcrV (pcrV), PcrH (pcrH), PopB (popB) and PopD (popD) genes, complete cds.", retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi? 2459966:NCBI:664056 Database accession no. AF010149 *
EXPERT OPINION ON THERAPEUTIC PATENTS, vol. 6, no. 5, 1996, pages 441 - 456
FAURE K. ET AL.: "Effects of monoclonal anti-PcrV antibody on Pseudomonas aeruginosa-induced acute lung injury in a rat model.", J. IMMUNE BASED THER. VACCINES, vol. 1, no. 2, 2003, pages 1 - 9 *
FRANK ET AL., THE JOURNAL OF INFECTIOUS DISEASES, vol. 186, 2002, pages 66
FROHMAN, M. A. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 85, 1988, pages 8998
HORIBATA, K.; HARRIS, A. W., NATURE, vol. 256, 1975, pages 495 - 497
IMAMURA Y ET AL., EUR. RESPIR. J., vol. 29, 2007, pages 965
KARINE FAURE ET AL., J. IMMUNE. BASED. THERAPIES AND VACCINES, vol. 1, 2003
KEARNEY, J. F. ET AL., J. IMMUNOLOGY, vol. 123, 1979, pages 1548 - 1550
KOHLER, G ET AL., EUROPEAN J. IMMUNOLOGY, vol. 6, 1976, pages 511 - 519
NATURE MEDICINE, vol. 5, 1999, pages 392 - 395
NATURE, vol. 256, 1975, pages 495 - 497
SATO, K. ET AL., CANCER RES., vol. 53, 1993, pages 851
See also references of EP2248826A4 *
SHIME N ET AL., J. IMMUNOL., vol. 167, 2001, pages 5880
SHULMAN, M. ET AL., NATURE, vol. 276, 1978, pages 269 - 270
T. SAWA ET AL., NATURE MEDICINE, vol. 5, 1999, pages 392
YAHR T.L. ET AL.: "Identification of type III secreted products of the Pseudomonas aeruginosa exoenzyme S regulon.", J. BACTERIOL., vol. 179, 1997, pages 7165 - 7168 *
YAHR, T.L. ET AL., J. BACTERIOL., vol. 179, 1997, pages 7165
YELTON, D.E. ET AL., CURRENT TOPICS IN MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY, vol. 81, 1978, pages 1 - 7

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8501179B2 (en) 2008-01-10 2013-08-06 Shionogi & Co., Ltd. Antibody against PcrV
US9085611B2 (en) 2009-03-11 2015-07-21 Shionogi & Co., Ltd. Humanized PcrV antibody having anti-pseudomonal activity
EP2407537A4 (en) * 2009-03-11 2012-12-26 Shionogi & Co HUMANIZED ANTI-PCRV ANTIBODIES WITH ANTI-PSEUDOMONAS ACTIVITY
EP2407537A1 (en) * 2009-03-11 2012-01-18 Shionogi & Co., Ltd. Humanized pcrv antibody having anti-pseudomonal activity
EA021101B1 (ru) * 2009-03-11 2015-04-30 Шионоги Энд Ко., Лтд. ГУМАНИЗИРОВАННОЕ АНТИТЕЛО К PcrV, ОБЛАДАЮЩЕЕ АКТИВНОСТЬЮ ПРОТИВ ПСЕВДОМОНАС
WO2010104052A1 (ja) * 2009-03-11 2010-09-16 塩野義製薬株式会社 抗緑膿菌作用を有するヒト化ＰｃｒＶ抗体
JP2015509723A (ja) * 2012-03-02 2015-04-02 アブリンクス エン．ヴェー． シュードモナス・エルギノーサのＰｃｒＶに結合する単一可変ドメイン抗体
US10072098B2 (en) 2012-03-02 2018-09-11 Ablynx N.V. Pseudomonas aeruginosa PCRV binding single variable domain antibodies
JP2019013239A (ja) * 2012-03-02 2019-01-31 アブリンクス エン．ヴェー． シュードモナス・エルギノーサのＰｃｒＶに結合する単一可変ドメイン抗体
JP7007250B2 (ja) 2012-03-02 2022-02-10 アブリンクス エン．ヴェー． シュードモナス・エルギノーサのＰｃｒＶに結合する単一可変ドメイン抗体
US11312788B2 (en) 2012-03-02 2022-04-26 Ablynx N.V. Pseudomonas aeruginosa PcrV binding single variable domain antibodies
WO2020252029A1 (en) 2019-06-11 2020-12-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-pcrv antibodies that bind pcrv, compositions comprising anti-pcrv antibodies, and methods of use thereof
US11655286B2 (en) 2019-06-11 2023-05-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-PcrV antibodies that bind PcrV, compositions comprising anti-PcrV antibodies, and methods of use thereof

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