PT2248826E - Anticorpo dirigido contra pcrv - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Anticorpo dirigido contra PcrV"

Campo técnico 0 presente invento refere-se a um anticorpo monoclonal que reconhece PcrV, ou uma sua parte. Mais especificamente, o presente invento refere-se a um anticorpo possuindo actividade de neutralização mais elevada (aqui depois também referida como actividade de inibição de citotoxicidade) do que anticorpos anti-PcrV convencionais, ou uma sua parte, e a uma composição farmacêutica contendo o mesmo.

Especialidade anterior A Pseudomonas aeruginosa é um bacilo gram-negativo obrigatoriamente aeróbio amplamente existente no mundo natural. Ainda que a sua patogenicidade seja usualmente baixa, é um patogénio que causa infecções oportunistas de ocorrência frequente em pacientes padecendo de várias doenças pré-existentes tais como cancro e diabetes, e em pacientes a quem foram administrados fármacos possuindo acção inibidora do sistema imunitário, e pode frequentemente causar pneumonia, infecção do tracto urinário, sepsia e outras condições conduzindo a resultados graves. Nas áreas clínicas, a infecção por Pseudomonas aeruginosa é considerada como uma das infecções mais difíceis de tratar porque não apenas a Pseudomonas aeruginosa possui uma sensibilidade inerentemente baixa aos antibióticos existentes, mas também tem uma tendência elevada para facilmente adquirir resistência a vários antibióticos e tornar-se difícil de curar. Assim, para Pseudomonas aeruginosa, a medida de desenvolver novos antibióticos uns a seguir aos outros está limitada, e é fortemente desejado um método terapêutico que não se baseie em antibióticos. A elevada toxicidade de Pseudomonas aeruginosa é exercida por injecção de toxina numa célula eucariótica através de um sistema de secreção de exotoxina do tipo III. A PcrV é uma proteína de 294 resíduos (N.° de Acesso NCBI AAC45935, SEQ NO: 1) que constitui o sistema de secreção de 2 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ exotoxina do tipo III, e uma sequência de operão codificando a mesma está disponível ao público (Documento de patente 1, Documento não patente 1). Uma vez que o controlo de PcrV pode possivelmente conduzir a um meio terapêutico na infecção por Pseudomonas aeruginosa (Documento não patente 2), são relatados anticorpos policlonais (Documentos não patente 3, 4) e anticorpos monoclonais (Documento de patente 2, Documentos não patente 5, 6) contra PcrV possuindo actividade de neutralização. No entanto, os anticorpos policlonais são difíceis de humanizar e de utilizar como composições farmacêuticas por causa da dificuldade em melhorar a antigenicidade. Também os anticorpos monoclonais até agora reportados possuem actividade de neutralização baixa e não conseguem satisfazer requisitos em áreas clínicas.

Documento de patente 1: Patente dos E.U.A. N.° 6 551 795 Documento de patente 2: Tradução Japonesa da Publicação PCT N.° 2005-500250

Documento não patente 1: Yahr, T.L. et al., J. Bacteriol., 1997, vol. 179, p. 7165

Documento não patente 2: T. Sawa et al., Nature Medicine, 1999, vol. 5, p. 392

Documento não patente 3: Shime N et al., J. Immunol. 2001, vol. 167, p. 5880

Documento não patente 4: Imamura Y et al • f Eur. Respir. J., 2007, Vol. 29, p. 965 Documento não patente 5: Karine Faure et al., J. Immune. Based. Therapies and Vaccines, 2003, Vol. 1 Documento não patente 6: Dara W. Frank et al., J. Infect.

Disease, 2002, Vol. 186, p. 64 Revelação do invento

Problema a ser solucionado pelo invento É um objectivo do presente invento proporcionar uma medida que seja eficaz na terapia de uma infecção, em particular, infecção com Pseudomonas aeruginosa. 3 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ

Meios para solucionar o problema

Como resultado de esforços diligentes na preparação de um anticorpo monoclonal contra PcrV, os presentes inventores foram bem-sucedidos na preparação de um novo anticorpo monoclonal que se considera ter um efeito terapêutico mais elevado sobre a doença, em comparação com um anticorpo monoclonal anti-PcrV conhecido convencionalmente, e levaram a cabo o presente invento.

Para ser mais específico, o presente invento refere-se à matéria sujeito das reivindicações 1-9. São também revelados (1) um anticorpo monoclonal contra PcrV ou uma sua parte, possuindo pelo menos uma característica seleccionada entre: (A) inibição de 50% ou mais da citotoxicidade de Pseudomonas aeruginosa para células de leucócitos numa concentração de 1 nM a 200 nM in vitro; (B) inibição de 50% ou mais da citotoxicidade de Pseudomonas aeruginosa para células de mieloma numa concentração de 1 nM a 50 nM in vitro; e (C) possuindo uma constante de dissociação (Kd) com PcrV de 2 x 10-9 (M) ou menos; (2) um anticorpo monoclonal ou uma sua parte, possuindo uma sequência de aminoácidos onde a região determinante de complementaridade (CDR) é de um anticorpo monoclonal produzido quer pelo hibridoma depositado com o número de acesso de FERM BP-11085, quer pelo hibridoma depositado com o número de acesso de FERM BP-11086; (3) um anticorpo monoclonal ou uma sua parte, produzido quer pelo hibridoma depositado com o número de acesso de FERM BP-11085, quer pelo hibridoma depositado com o número de acesso de FERM BP-11086; (4) um anticorpo monoclonal contra PcrV ou uma sua parte, possuindo o seu epítopo nas posições 136 a 233 da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1; (5) um anticorpo monoclonal contra PcrV ou uma sua parte, possuindo 1) numa região determinante de complementaridade, 4 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ uma região variável de cadeia pesada incluindo a sequência de aminoácidos seguinte: SFTSYWMH (SEQ ID NO: 15) INPSNGRTNYNEKFNT (SEQ ID NO: 16) YGNYVVYYTMDY (SEQ ID NO: 17) e 2) numa região determinante de complementaridade, uma região variável de cadeia leve incluindo a sequência de aminoácidos seguinte: SASTSVSYME (SEQ ID NO: 18) TTSKLAS (SEQ ID NO: 19) HQWRNYPFT (SEQ ID NO: 20); (6) um anticorpo monoclonal contra PcrV ou uma sua parte, possuindo 1) numa região determinante de complementaridade, uma região variável de cadeia pesada incluindo a sequência de aminoácidos seguinte: SITSDYAWN (SEQ ID NO: 21) YITYNGDTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 22) SRNYYGAWFAY (SEQ ID NO: 23) e 2) numa região determinante de complementaridade, uma região variável de cadeia leve incluindo a sequência de aminoácidos seguinte: KASQYVGTTVA (SEQ ID NO: 24) RASTRHT (SEQ ID NO: 25) QQYCSSPLT (SEQ ID NO: 26); (7) um anticorpo monoclonal contra PcrV ou uma sua parte, possuindo 1) uma região variável de cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, e 2) uma região variável de cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12; (8) um anticorpo monoclonal contra PcrV ou uma sua parte, possuindo 1) uma região variável de cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13, e 2) uma região variável de cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:14; (9) uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou uma sua parte de acordo com qualquer um de (1) a (8), como um ingrediente activo, e (10) um hibridoma produzindo o anticorpo ou uma sua parte de acordo com qualquer um de (1) a (8).

Efeito do invento

Um anticorpo monoclonal ou uma sua parte do presente invento é útil como um agente terapêutico de infecção por 5 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ causa da sua actividade de neutralização muito excelente sobre PcrV.

Breve explanação dos desenhos [Fig. 1] A Fig. 1 mostra curvas nas quais PcrV marcada com biotina está substituída por PcrV não marcada em anticorpos de PcrV (1F3, 2A4, 6F5, 7A7 e Mabl66).

[Fig. 2] A Fig. 2 mostra afinidades de anticorpos de PcrV (1F3, 2A4, 6F5, 7A7 e Mabl66) determinadas por análise de ressonância de plasmão de superfície.

[Fig. 3] A Fig. 3 mostra resultados de ensaios de sanduíche entre anticorpos de PcrV (1F3, 2A4, 6F5, 7A7 e Mabl66) e Mabl66.

[Fig. 4] anticorpos de citotoxicidade células U937. A Fig. 4 mostra efeitos de inibição de PcrV (1F3, 2A4, 6F5, 7A7 e Mabl66) na de Pseudomonas aeruginosa estirpe SR24 para [Fig. 5] A Fig. 5 mostra efeitos de inibição de anticorpos de PcrV (1F3, 2A4, 6F5, 7A7 e Mabl66) na citotoxicidade de Pseudomonas aeruginosa estirpe SR24 para células de mieloma P3U1.

[Fig. 6] A Fig. 6 mostra curvas nas quais PcrV marcada com biotina está substituída por PcrV truncada e PcrV a todo o comprimento não marcada em anticorpos de PcrV (1F3, 2A4, 9D12, 12H9 e Mabl66).

[Fig. 7] A Fig. 7 mostra a reactividade de PcrV a todo o comprimento e de PcrV truncada em anticorpos de PcrV (1F3, 2A4, 9D12, 12H9 e Mabl66) em Western blotting.

[Fig. 8] A Fig. 8 mostra a correlação entre anticorpo e PcrV a todo o comprimento por supressão da actividade de inibição da citotoxicidade. 6 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ [Fig. 9] A Fig. 9 mostra a correlação entre anticorpo e PcrV truncada por supressão da actividade de inibição da citotoxicidade.

[Fig. 10] A Fig. 10 mostra a sequência de aminoácidos de uma região variável de anticorpo 1F3. O sublinhado indica uma região CDR.

[Fig. 11] Fig. 11 mostra a sequência de aminoácidos de uma região variável de anticorpo 2A4. O sublinhado indica uma região CDR.

Melhor modo para realizar o invento O "anticorpo monoclonal" que é um objecto da presente revelação é um anticorpo monoclonal que se liga especificamente à PcrV acima mencionada. Mais concretamente, é um anticorpo monoclonal contra PcrV possuindo pelo menos uma caracteristica seleccionada entre (1) inibição de 50% ou mais de citotoxicidade para células de leucócitos por Pseudomonas aeruginosa numa concentração de 1 nM a 200 nM in vitro; (2) inibição de 50% ou mais de citotoxicidade para células de mieloma por Pseudomonas aeruginosa numa concentração de 1 nM a 50 nM in vitro; e (3) possuindo uma constante de dissociação (Kd) com PcrV de 2 χ 10~9 (M) ou menos.

Uma caracteristica do anticorpo monoclonal da presente revelação é ter uma forte actividade de inibição de citotoxicidade. Por exemplo, quando se utilizam células de leucócitos, o anticorpo monoclonal tem uma actividade de inibição (neutralização) tal que inibe 50% ou mais da citotoxicidade de Pseudomonas aeruginosa, num intervalo de concentração de 1 a 200 nM, preferivelmente de 2 a 100 nM, e mais preferivelmente de 5 a 25 nM. Quando se utilizam células de mieloma, o anticorpo monoclonal tem uma actividade de inibição (neutralização) tal que inibe 50% ou mais da citotoxicidade de Pseudomonas aeruginosa, num intervalo de concentração de 1 a 50 nM, preferivelmente de 2 a 30 nM, e mais preferivelmente de 4 a 20 nM. Estes valores excedem grandemente as actividades numéricas para Mbl66 reportado em 7 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ

Dara W. Frank et al. (J. Infect. Disease, 2002, Vol. 186, p. 64) .

Outra característica do anticorpo monoclonal da presente revelação é ter o seu epítopo numa região desde as posições 136 a 233 na sequência de aminoácidos a todo o comprimento de PcrV (SEQ NO: 1). Os presentes inventores constataram que um anticorpo que reconhece esta região tem uma actividade mais forte (actividade de inibição de citotoxicidade) do que um anticorpo que reconhece outra região.

Um epitopo de reconhecimento de anticorpo monoclonal pode ser identificado do seguinte modo. Em primeiro lugar, preparam-se várias estruturas parciais de uma molécula a ser reconhecida pelo anticorpo monoclonal. Para preparação de estruturas parciais, são conhecidos um método de preparação de vários péptidos parciais da molécula com uma técnica conhecida de sintese de oligopéptidos, um método de produção dos mesmos dentro ou fora de um hospedeiro tal como E. coli incorporando, num plasmideo de expressão adequado, uma sequência de ADN codificando um péptido parcial objectivo com uma técnica de recombinação génica, e outros, no entanto, é geral utilizar uma combinação destes métodos para o objectivo acima mencionado. Por exemplo, após a preparação de uma série de polipéptidos encurtados num comprimento apropriado a partir do terminal C ou do terminal N da proteína antigénica, utilizando uma técnica de recombinação génica bem conhecida de um perito na especialidade, examina-se a reactividade de anticorpo monoclonal com estes polipéptidos e determina-se grosseiramente um local de reconhecimento.

Depois, sintetizam-se mais finamente vários oligopéptidos da parte correspondente, mutantes do péptido ou outros utilizando uma técnica de síntese de oligopéptidos bem conhecida de um perito na especialidade, e efectua-se a determinação de epítopo examinando a capacidade de ligação de um anticorpo monoclonal contendo um agente profiláctico ou terapêutico da presente revelação como um ingrediente activo, a estes péptidos, ou examinando a actividade de inibição competitiva destes péptidos à ligação entre o anticorpo monoclonal e antigénio. Como método conveniente para obtenção de uma variedade de oligopéptidos, podem-se também utilizar 8 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ um kit disponível comercialmente (por exemplo, kit SPOTs (disponível na Genosys Biotechnologies, Inc.) ou uma série de kits de síntese peptídica multipino com um método de síntese (disponível na Chiron Corporation). A actividade de inibição da citotoxicidade pode ser medida do seguinte modo. Em primeiro lugar, um anticorpo monoclonal para o qual se pretende medir a actividade de inibição da citotoxicidade é diluído nas concentrações apropriadas em séries de diluições de 1 para 2. A seguir, células que são influenciadas por toxina de Pseudomonas aeruginosa ou outras (aqui depois referidas como células alvo) são diluídas, por exemplo, utilizando um meio de cultura para cultura de células, para conseguir um número apropriado. Concretamente, prefere-se ajustar a 3 χ 106 a 5 χ 106 células/ml quando se utilizam células de mieloma e ajustar a 1 χ 106 a 3 χ 106 células/ml quando se utilizam células de leucócitos. Do mesmo modo, células de Pseudomonas aeruginosa são também ajustadas a 1 χ 107 a 5 χ 108 cfu/mL utilizando, por exemplo, um meio de cultura. Na presença do anticorpo monoclonal, células Pseudomonas aeruginosa e células alvo são cultivadas no mesmo tubo de ensaio ou poço (por exemplo, condição in vitro tal como um poço numa placa de microtitulação) em condições de cultura apropriadas. As condições de cultura neste momento podem ser condições de cultura habitualmente utilizadas consideradas como adequadas para o crescimento de células ou bactérias. No que se refere ao tempo de cultura, a condição óptima é apropriadamente modificada dependendo do tipo de células alvo e, por exemplo, preferem-se de cerca de 1 a 3 horas no caso de se utilizarem células de mieloma e cerca de 1 a 3 horas no caso de se utilizarem células de leucócitos. Tomando um poço não adicionado com um anticorpo como um grupo de controlo, calcula-se uma concentração para a qual se observa 50% de inibição em comparação com o grupo de controlo (concentração eficaz) . No que se refere à decisão de vida e morte de células alvo, embora tenham sido estabelecidos vários procedimentos, por exemplo, é útil a medição da absorvância a um comprimento de onda apropriado (por exemplo, 400 a 500 nm) após adição de um reagente corante (ver Nature Medicine 1999, vol. 5, p. 392-395, para referência). 9 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ

Uma característica do anticorpo monoclonal da presente revelação é ter elevada afinidade por PcrV. A constante de dissociação (Kd), que é utilizada como um indice de afinidade do anticorpo monoclonal por anticorpo, pode ser analisada de vários modos. Por exemplo, a análise pode ser conduzida prontamente de acordo com o método de Scatchard utilizando um antigénio marcado com vários agentes de marcação, ou um método utilizando um kit de medição Biacore X disponível comercialmente (disponível na Amersham Pharmacia), ou um kit similar, de acordo com o manual de instruções e o protocolo de experimentação associados ao kit. A constante de dissociação (valor de Kd) determinada utilizando um tal método é representada em unidades de M (molar). Quanto menor a constante de dissociação do anticorpo monoclonal testado, mais forte a afinidade do anticorpo monoclonal testado. Em relação ao anticorpo monoclonal da presente revelação ou uma sua parte, a constante de dissociação (Kd) de PcrV é 2 χ ΗΓ9 (M) ou menos, preferivelmente 1,5 χ 1CT9 (M) ou menos, e mais preferivelmente 1,2 χ 1CT9 (M) ou menos.

No anticorpo monoclonal da presente revelação preferivelmente, as regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve são derivadas de humano, e podem ter uma sequência de um anticorpo modificado das SEQ ID NOs. 11 a 14 (por exemplo, incluindo sem limitação aquelas possuindo substituição, inserção, adição ou deleção de um ou vários aminoácidos). 0 domínio de região constante inclui preferivelmente um domínio de região constante de humano apropriado (por exemplo, aqueles descritos em Kabat E. A. et al., US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institute of Health). Uma região CDR será encontrada através de verificação de homologia aplicando a sequência de aminoácidos da região variável à base de dados de sequências de aminoácidos de anticorpo preparada por Kabat et al. ("Sequence of Proteins of Immunological Interest" US Dept. Health and Human Services, 1983). No que se refere à região da sequência de CDR, um corpo modificado com pelo menos uma adição, inserção, substituição ou deleção pode ser abrangido na presente revelação desde que seja mantida uma bioactividade (por exemplo, actividade de ligação ou actividade de neutralização) requerida na presente revelação. 10 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ São mencionadas sequências possuindo uma homologia de 90 a 100% com cada região de CDR. Preferivelmente, são mencionadas sequências possuindo uma homologia de 95 a 100%. Mais preferivelmente, são mencionadas sequências possuindo uma homologia de 98 a 100%. A região de estrutura (framework) pode estar relacionada com qualquer tipo de região de estrutura, e é preferivelmente derivada de humano. Regiões de estrutura apropriadas podem ser seleccionadas por referência ao documento de Kabat E.A. et al. Uma estrutura de cadeia pesada preferível é uma estrutura de cadeia pesada de humano e, por exemplo, uma estrutura de anticorpo anti-PcrV que se mostra na Fig. 10 ou Fig. 11. Esta pode ser determinada a partir da sequência apresentada na Fig. 10 ou na Fig. 11 por referência ao documento acima. De um modo similar, uma estrutura de cadeia leve anti-PcrV pode ser determinada a partir da sequência apresentada na Fig. 10 ou na Fig. 11 por referência ao documento acima.

No anticorpo monoclonal do presente invento, como definido nas reivindicações, como um modo mais preferido, pode ser incluído um anticorpo contendo pelo menos a) (i) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) ou um seu fragmento contendo na sua sequência CDRl, CDR2 e CDR3 que são regiões determinantes de complementaridade onde CDRl possui uma sequência de aminoácidos SFTSYWMH (SEQ ID NO: 15), CDR2 possui uma sequência de aminoácidos INPSNGRTNYNEKFNT (SEQ ID NO: 16) e CDR3 possui uma sequência de aminoácidos YGNYVVYYTMDY (SEQ ID NO: 17), e (ii) uma parte constante de cadeia pesada de humano ou um seu fragmento.

Depois, b) prefere-se que contenha (i) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL) onde CDRl possui uma sequência de aminoácidos SASTSVSYME (SEQ ID NO: 18), CDR2 possui uma sequência de aminoácidos TTSKLAS (SEQ ID NO: 19) e CDR3 possui uma sequência de aminoácidos HQWRNYPFT (SEQ ID NO: 20), e (ii) uma parte constante de cadeia leve de humano ou um seu fragmento. É também revelado um anticorpo contendo pelo menos a)(i) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) 11 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ ou um seu fragmento contendo na sua sequência CDR1, CDR2 e CDR3 que são regiões determinantes de complementaridade onde CDR1 possui uma sequência de aminoácidos SITSDYAWN (SEQ ID NO: 21), CDR2 possui uma sequência de aminoácidos YITYNGDTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 22) e CDR3 possui uma sequência de aminoácidos SRNYYGAWFAY (SEQ ID NO: 23), e (ii) uma parte constante de cadeia pesada de humano ou um seu fragmento.

Depois, b) prefere-se que contenha (i) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL) onde CDR1 possui uma sequência de aminoácidos KASQYVGTTVA (SEQ ID NO: 24), CDR2 possui uma sequência de aminoácidos RASTRHT (SEQ ID NO: 25) e CDR3 possui uma sequência de aminoácidos QQYCSSPLT (SEQ ID NO: 26), e (ii) uma parte constante de cadeia leve de humano ou um seu fragmento. 0 anticorpo monoclonal da presente revelação pode ser preparado por um método de produção existente habitualmente utilizado, utilizando PcrV (corpo natural, corpo recombinante, corpos sintéticos) como imunogénio. Concretamente, primeiramente, um mamífero, preferivelmente, ratinho, rato, hamster, porquinho-da-índia, coelho, gato, cão, porco, cabra, ovelha, burro, cavalo ou bovino (incluindo animais transgénicos criados para produzir anticorpos derivados de um outro animal, tais como ratinhos transgénicos criados para produzir um anticorpo de humano), mais preferivelmente um ratinho, rato, hamster, porquinho-da-índia ou coelho, é imunizado com PcrV servindo como imunogénio, em conjunto com adjuvante de Freund conforme necessário, por uma ou várias rondas de injecção subcutânea, intramuscular, intravenosa, nas almofadas das patas ou intraperitoneal. Usualmente, a imunização é conduzida uma a quatro vezes a cada de cerca de 1 a 21 dias após imunização primária, e as células produtoras de anticorpo podem ser obtidas, a partir do mamífero imunizado, após cerca de 1 a 10 dias desde a imunização final. O número de vezes e o intervalo de tempo de imunização podem ser apropriadamente alterados dependendo das propriedades do imunogénio que está a ser utilizado.

Exemplos de PcrV utilizados como um imunogénio ou um hapteno são como se segue. 12 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ (A) Células expressando PcrV sobre a superfície celular, ou estirpes de células estabelecidas artificialmente para expressarem PcrV sobre a superfície celular, ou células de recombinação génica criadas utilizando uma técnica de recombinação génica para expressar PcrV sobre a superfície celular; (B) Sobrenadante de cultura obtido por cultura de células de recombinação génica criadas por uma técnica de recombinação génica para expressarem PcrV ou uma sua parte como proteína, ou PcrV ou uma sua parte purificada a partir do sobrenadante de cultura; ou (C) PcrV sintetizada guimicamente ou uma sua parte. 0 hibridoma gue segrega anticorpo monoclonal pode ser preparado de acordo com o método de Kohler e Milstein (Nature, 1975, vol. 256, p. 495-497) e com um método correspondente. Isto é, o hibridoma pode ser preparado por fusão celular entre uma célula produtora de anticorpo contida no baço, nódulo linfático, medula óssea, amígdala ou outras, preferivelmente no baço, obtida a partir de um mamífero imunizado como descrito acima, e uma célula de hibridoma desprovida da capacidade de produção de autoanticorpos derivada, preferivelmente, de um mamifero tal como ratinho, rato, porguinho-da-índia, hamster, coelho ou humano, mais preferivelmente de ratinho, rato ou humano.

Como célula de mieloma utilizada em fusão celular, em geral, podem-se utilizar linhas de células obtidas a partir de ratinho, por exemplo, a estirpe de mieloma de ratinho (derivada de BALB/c) resistente à 8-azaguanidina, P3X63Ag8U.l (P3-U1) [Yelton, D.E. et al., Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7 (1978)], P3/NSI/l-Ag4-l(NS-1) [Kohler, G. et al. European J. Immunology, 6, 511-519 (1976)], SP2/O-Ag14 (SP-2) [Shulman, M. et al. Nature, 276, 269-270 (1978)], P3X63Ag8, 653(653) [Kearney, J. F. et al. J. Immunology, 123, 1548-1550 (1979)], P3X63Ag8(X63) [Horibata, K. e Harris, A. W. Nature, 256, 495-497 (1975)], e outras. O hibridoma que produz anticorpo monoclonal é rastreado por cultura de um hibridoma, por exemplo, numa placa de 13 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ microtitulação, medindo a reactividade em relação a um imunogénio utilizado em imunização do ratinho, como descrito acima em sobrenadante de cultura no poço onde se observa proliferação, por um método de medição de imunidade tal como RIA ou ELISA, e selecção de um clone que produz um anticorpo monoclonal exibindo afinidade especifica pelo imunogénio ou hapteno. Depois, utiliza-se habitualmente um ELISA não competitivo onde um imunogénio é colocado em fase sólida e um anticorpo no sobrenadante de cultura, que se liga ao imunogénio em fase sólida, é detectado por um anticorpo secundário anti-ratinho marcado com enzima. A produção de anticorpo monoclonal a partir de hibridoma pode ser conseguida cultivando o hibridoma in vitro ou em ascites de ratinho, rato, porquinho-da-índia, hamster ou coelho, preferivelmente de ratinho ou rato, ou mais preferivelmente de ratinho, seguindo-se isolamento a partir do sobrenadante de cultura obtido ou a partir de ascites de mamífero. No caso de cultura in vitro, o hibridoma pode ser cultivado num meio nutriente conhecido ou em quaisquer culturas de nutrientes obtidas e preparadas a partir de um meio de base conhecido utilizado para proliferação, manutenção e armazenamento de hibridoma e para produção de anticorpo monoclonal em sobrenadante de cultura, dependendo de várias condições tais como as propriedades das espécies de células cultivadas, o objecto da investigação de teste e o método de cultura.

Como meio de base, por exemplo, podem-se mencionar meios de baixo teor em cálcio tais como meio F12 de Ham, meio MCDB153 ou meio de cultura MEM de baixo teor em cálcio, e meios de elevado teor em cálcio tais como meio MCDB104, meio MEM, meio D-MEM, meio RPMI1640, meio AF104 ou meio RD, e um tal meio de base pode conter, por exemplo, soro, hormona, citoquina e/ou várias substâncias inorgânicas ou orgânicas dependendo do objectivo. 0 isolamento e purificação do anticorpo monoclonal podem ser conseguidos submetendo o sobrenadante de cultura ou ascites como descrito acima a sulfato de amónio saturado, cromatografia de permuta iónica (e.g., DEAE ou DE52), cromatografia de coluna de afinidade, tal como uma coluna anti-imunoglobulina ou uma coluna de proteína A ou similar. 14 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ

Como anticorpo monoclonal da presente revelação pode-se utilizar um anticorpo recombinante que é produzido utilizando uma técnica de recombinação génica de um modo tal que um gene do anticorpo é clonado a partir de uma célula produtora de anticorpo, por exemplo, hibridoma, e incorporado num vector apropriado, e o vector é introduzido num hospedeiro (por exemplo, Cari et al. , THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, publicada em 1990).

Concretamente, a partir de um hibridoma que produz um anticorpo objectivo, ou a partir de uma célula imunitária que produz um anticorpo, por exemplo, a partir de uma célula obtida por imortalização de linfócitos sensibilizados ou outros por um gene de cancro ou outros, é isolado ARNm codificando uma região variável (região V) de anticorpo. No isolamento de ARNm, prepara-se ARN inteiro por um método conhecido, por exemplo, por ultracentrifugação de guanidina (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) ou outros, e o ARNm é preparado utilizando o kit de purificação de ARNm (disponível na Pharmacia) ou outros. A partir do ARNm obtido, sintetiza-se ADNc da região V de anticorpo utilizando uma transcriptase reversa. A síntese de ADNc pode ser conduzida utilizando o kit de síntese de ADNc de primeira cadeia de transcriptase reversa AMV ou outros. Adicionalmente, para a síntese e amplificação de ADNc, podem-se utilizar o 5'-Ampli FINDER RACEKit (disponível na Clonetech) e o método 5'-RACE utilizando PCR (Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1988, vol. 85, p. 8998). Um fragmento de ADN objectivo é purificado a partir do produto de PCR obtido, e ligado a um vector de ADN. É assim criado um vector recombinante e introduz-se em E. coli ou outros, selecciona-se uma colónia e prepara-se um vector recombinante desejado. A sequência de bases de ADN do ADN objectivo é verificada por um método conhecido, por exemplo, pelo método de desoxi.

Se é obtido ADN codificando a região V do anticorpo objectivo, o ADN é ligado a ADN codificando uma região constante (região C) do anticorpo desejado, e incorporado num vector de expressão. Alternativamente, ADN codificando a 15 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ região V de anticorpo pode ser incorporado num vector de expressão contendo ADN da região C de anticorpo. Para produção do anticorpo utilizado na presente revelação, o gene do anticorpo é incorporado num vector de expressão de um modo tal que é expresso sob o controlo de uma região de controlo de expressão, por exemplo, intensificador/promotor. A seguir, uma célula hospedeira pode ser transformada com este vector de expressão para expressão do anticorpo.

Para expressão do gene de anticorpo, a cadeia pesada (cadeia H) ou a cadeia leve (cadeia L) de anticorpo podem ser incorporadas separadamente em vectores de expressão, ou um hospedeiro pode ser co-transformado com estes vectores de expressão, ou ADN codificando a cadeia H e a cadeia L pode ser incorporado num único vector de expressão para transformar um hospedeiro com o vector de expressão resultante (ver W094/11523). 0 anticorpo monoclonal do presente invento inclui anticorpos monoclonais do tipo recombinante que são modificados artificialmente para o propósito de diminuir a antigenicidade heteróloga contra humanos, por exemplo, anticorpo monoclonal quimérico, anticorpo monoclonal humanizado e anticorpo monoclonal de humano.

Um anticorpo monoclonal quimérico é composto de uma região V derivada de anticorpo de um outro mamífero que não um humano e de uma região C derivada de anticorpo de humano, e um anticorpo monoclonal humanizado é composto de uma CDR derivada de anticorpo de um outro mamífero que não um humano e de regiões FR e C derivadas de anticorpo de humano, e estes anticorpos monoclonais são úteis como um anticorpo utilizado no presente invento uma vez que a antigenicidade no corpo humano é reduzida. Estes anticorpos monoclonais modificados podem ser produzidos utilizando um método conhecido.

Um anticorpo monoclonal quimérico é obtido por ligação de ADN codificando a região V de anticorpo obtido como descrito acima com ADN codificando a região C de anticorpo de humano, incorporação do ADN resultante num vector de expressão, e introdução do vector de expressão num hospedeiro para produção (por exemplo, WO95/14041). Utilizando este 16 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ método conhecido, pode-se obter um anticorpo monoclonal quimérico útil no presente invento.

Um anticorpo monoclonal humanizado é obtido transplantando uma região determinante de complementaridade (CDR) de anticorpo de um outro mamífero que não um humano, por exemplo, de um ratinho, na CDR de anticorpo humano, e é também conhecida uma técnica de recombinação génica para este propósito (por exemplo, WO95/14041).

Concretamente, uma sequência de ADN desenhada de modo a que a CDR de anticorpo de ratinho e a região de estrutura (FR) de anticorpo de humano estejam ligadas é sintetizada pelo método de PCR a partir de vários oligonucleótidos preparados para terem partes sobrepostas nos seus terminais. 0 ADN obtido é ligado com ADN codificando a região C de anticorpo de humano e incorporado num vector de expressão, e o vector de expressão resultante é introduzido num hospedeiro para produção (por exemplo, WO95/14041).

Como FR de anticorpo de humano ligada via CDR, é seleccionada aquela em que a CDR forma um bom local de ligação de antigénio. Conforme necessário, aminoácidos de FR na região V de anticorpo podem estar substituídos tal que a CDR de anticorpo de humano reconstruída forma um local de ligação de antigénio apropriado (Sato, K. et al., Câncer Res. 1993, vol. 53, p. 851). Num anticorpo monoclonal quimérico e num anticorpo monoclonal humanizado, utiliza-se uma região C de anticorpo de humano. Como região C de anticorpo de humano preferida, pode-se mencionar Cy e podem-se utilizar, por exemplo, Cyl, Cy2, Cy3 e Cy4. Adicionalmente, para melhorar a estabilidade de anticorpo ou a sua produção, a região C de anticorpo de humano pode ser modificada.

Um anticorpo monoclonal de humano é composto de uma região V e de uma região C derivadas de anticorpo de humano, e pode ser produzido por imunização de um mamífero transgénico não humano produtor de anticorpo de humano, tal como um ratinho transgénico produtor de anticorpo de humano (por exemplo, W094/25585), com um imunogénio, de acordo com um método geral de produção existente de um anticorpo monoclonal. 17 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ

No presente invento, ο termo "parte de anticorpo monoclonal" significa uma região que é uma parte do anticorpo monoclonal acima mencionado do presente invento e que possui capacidade de ligação especifica a PcrV do mesmo modo que o anticorpo monoclonal (aqui depois também referida simplesmente como "fragmento de anticorpo").

Concretamente, podem-se mencionar Fab (fragmento de ligação de antigénio), F(ab')2f Fab', anticorpo de cadeia simples (Fv de cadeia simples; aqui depois designado por scFv), anticorpo estabilizado por dissulfureto (Fv estabilizado por dissulfureto; aqui depois designado por dsFv), fragmento da região V dimerizado (aqui depois designado por diacorpo), péptido contendo CDR, possuindo capacidade de ligação especifica à PcrV (Expert opinion on therapeutic patents, vol. 6, No. 5, p. 441-456, 1996). 0 Fab é um fragmento de anticorpo possuindo um peso molecular de cerca de 50 000 com actividade de ligação de antigénio, constituído de cerca de metade do lado N-terminal da cadeia H e da cadeia L inteira, obtido degradando com uma enzima papaína uma parte de péptido acima de duas ligações dissulfureto (ligação S-S) reticulando duas cadeias H na região de charneira de IgG. O Fab utilizado no presente invento pode ser obtido por tratamento do anticorpo monoclonal do presente invento com papaína. Alternativamente, o Fab pode ser produzido por inserção de ADN codificando Fab de anticorpo monoclonal do presente invento num vector de expressão para célula e introdução do vector numa célula para expressão. O F(ab')2 é um fragmento de anticorpo possuindo um peso molecular de cerca de 100 000 com actividade de ligação de antigénio, formado por ligação de duas regiões Fab' numa zona de charneira. Estas regiões Fab' são obtidas por degradação com pepsina abaixo de duas ligações S-S da região de charneira de IgG. O F(ab')2 utilizado no presente invento pode ser obtido por tratamento do anticorpo monoclonal do presente invento com pepsina. Alternativamente, o F(ab')2 pode ser produzido por inserção de ADN codificando F(ab')2 do anticorpo monoclonal num vector de expressão para célula e 18 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ introdução do vector numa célula de E. coli, levedura ou animal para expressão. 0 Fab' é um fragmento de anticorpo possuindo um peso molecular de cerca de 50 000 com actividade de ligação de antigénio, obtido por corte da ligação S-S entre charneiras do F(ab')2 acima mencionado. O Fab' utilizado no presente invento pode ser obtido por tratamento de F(ab')2 do anticorpo monoclonal do presente invento com um agente de redução, ditiotreitol. Alternativamente, o Fab' pode ser produzido por inserção de ADN codificando Fab' do anticorpo monoclonal num vector de expressão para célula e introdução do vector numa célula de E. coli, levedura ou animal para expressão. O scFv é um péptido VH-P-VL ou VL-P-VH no qual uma cadeia VH e uma cadeia VL estão ligadas utilizando um ligador peptídico apropriado (aqui depois designado por P) , e é um fragmento de anticorpo possuindo actividade de antigénio. A VH e a VL contidas no scFv utilizado no presente invento podem ser derivadas a partir do anticorpo monoclonal do presente invento. O scFv utilizado no presente invento pode ser produzido por obtenção de ADNc codificando VH e VL a partir de um hibridoma produzindo um anticorpo monoclonal do presente invento, construção de um vector de expressão scFv, e expressão por introdução do vector de expressão numa célula de E. coli, levedura ou animal. dsFv refere-se a um fragmento obtido por ligação de polipéptidos, nos quais um resíduo aminoácido de cada está substituído por um resíduo cisteína em VH e VL, através de uma ligação S-S. O aminoácido a ser substituído por um resíduo cisteína pode ser seleccionado com base numa previsão de estrutura terciária de anticorpo de acordo com o método indicado por Reiter et al. (Protein Engineering, 7, 697 (1994)). A VH ou a VL contidas em dsFv utilizadas no presente invento podem ser derivadas do anticorpo monoclonal do presente invento. O dsFv utilizado no presente invento pode ser produzido por obtenção de ADNc codificando VH e VL a partir de hibridoma produzindo um anticorpo monoclonal do presente invento, construção de um vector de expressão de dsFv por inserção deste num vector de expressão apropriado, e 19 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ expressão por introdução do vector de expressão numa célula de E. coli, levedura ou animal.

Um diacorpo é um fragmento de anticorpo onde se forma um dimero de scFvs possuindo a mesma ou diferente especificidade de ligação de antigénio, e é um fragmento de anticorpo possuindo actividade de ligação de antigénio bivalente pelo mesmo antigénio ou duas actividades de ligação de antigénio especificas para diferentes antigénios. Por exemplo, um diacorpo bivalente que reage especificamente com o anticorpo monoclonal do presente invento pode ser produzido por obtenção ADNc codificando VH e VL de um anticorpo monoclonal do presente invento, construção de ADN codificando scFv possuindo um ligador peptídico de 3 a 10 resíduos, inserção do ADN num vector de expressão para célula, e expressão do diacorpo por introdução do vector de expressão resultante numa célula de E. coli, levedura ou animal.

Um péptido contendo CDR inclui pelo menos uma região de CDR de VH ou VL. Várias CDRs podem ser combinadas directamente ou através de um ligador peptídico apropriado. Um péptido contendo CDR utilizado no presente invento pode ser produzido por obtenção de ADNc codificando VH e VL de um anticorpo monoclonal do presente invento, construção de ADN codificando CDR, inserção do ADN num vector de expressão para célula de animal, e expressão por introdução do vector de expressão resultante numa célula de E. coli, levedura ou animal. Um péptido contendo CDR pode também ser produzido por um método de síntese química tal como o método de Fmoc (método de fluorenilmetiloxicarbonilo) ou o método de tBoc (método de t-butiloxicarbonilo).

Um anticorpo monoclonal do presente invento ou uma sua parte pode ser modificado na medida em que seja adequadamente utilizado no presente invento. Como substância modificada, podem-se utilizar anticorpos ligados a várias moléculas incluindo polietilenoglicol (PEG) e outros. A modificação efectuada no anticorpo pode ser uma modificação por introdução de uma ligação química, ou pode ser uma modificação efectuada na sequência de aminoácidos do anticorpo. Um anticorpo monoclonal do presente invento ou uma sua parte abrange também estas substâncias de anticorpo 20 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ modificado. Para obtenção destas substâncias de anticorpo modificado, o anticorpo obtido pode ser modificado. Estas técnicas já foram estabelecidas na especialidade.

Um anticorpo monoclonal do presente invento e uma sua parte é útil como uma composição farmacêutica. Por conseguinte, uma composição farmacêutica contendo um anticorpo monoclonal do presente invento e uma sua parte pode ser administrada sistemicamente ou topicamente por uma via oral ou parentérica. Para administração parentérica, por exemplo, podem-se seleccionar injecção intravenosa tal como perfusão por gotejamento, injecção intramuscular, injecção intraperitoneal, injecção subcutânea, administração intranasal e outras. No entanto, uma vez que é conhecido que a Pseudomonas aeruginosa infligirá danos particularmente em células epiteliais do pulmão e macrófagos dos alvéolos pulmonares por infecção do tracto respiratório (T. Sawa et al., Nature Medicine, 1999, vol. 5, p. 392), a administração intranasal e por inalação são desejadas.

Uma composição farmacêutica do presente invento é administrada para terapia de um paciente padecendo de fibrose cistica ou infecção por Pseudomonas aeruginosa. Por exemplo, uma dose eficaz é seleccionada na gama de 0,01 mg a 100 mg por 1 kg de peso corporal de cada vez. Alternativamente, pode ser seleccionada uma dose de 1 a 1000 mg, preferivelmente uma dose de 5 a 50 mg por paciente. No entanto, uma dose da composição farmacêutica contendo o anticorpo monoclonal do presente invento ou uma sua parte não está limitada a estas doses. A duração da administração pode ser apropriadamente seleccionada dependendo da idade, sintomas e outros factores do paciente. A composição farmacêutica do presente invento pode também incluir um transportador ou aditivo farmaceuticamente aceitável dependendo da via de administração.

Exemplos destes transportadores e aditivos incluem água, solvente orgânico farmaceuticamente aceitável, colagénio, poli(álcool vinílico), polivinilpirrolidona, alginato de sódio, dextrano solúvel em água, pectina, metilcelulose, etilcelulose, caseína, diglicerina, propilenoglicol, polietilenoglicol, vaselina, albumina de soro de humano 21 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ (HSA), manitol, sorbitol, lactose, e tensioactivos permitidos como aditivo farmacêutico. Um aditivo para utilização é apropriadamente seleccionado ou combinado a partir dos anteriores dependendo da forma da dose, mas não está limitado a estes.

Exemplo de referência Preparação de Mabl66 recombinante

Para execução de uma experiência comparativa, preparou-se o Mabl66 (Pedido de Patente Japonesa N.° 2005-500250 ou outro) como um anticorpo recombinante.

Em primeiro lugar, ARNm é extraido a partir de hibridoma que produz um anticorpo classificado numa subclasse IgG2a, e regiões constantes de cadeia H e cadeia L foram clonados por um método de RT-PCR. Cada fragmento amplificado por PCR foi inserido num local Nhel-Notl do vector pcDNA3.1 (+) (disponível na Invitrogen Corporation) , e um local de clonagem múltipla foi incorporado adicionalmente para permitir a inserção de um fragmento de ADN da parte de região variável. A seguir, após separação da sequência génica de cadeia H e cadeia L da região variável de Mabl66 em quatro, sintetizaram-se o ADN em sentido e o ADN antissentido destas, e hibridizaram-se. A ligação dos fragmentos após hibridação foi efectuada por ADN ligase, e a clonagem foi efectuada na região Mfel-Blpl para a cadeia H e na região EcoRV-BsiWI para a cadeia L.

Os vectores de cadeia H e cadeia L possuindo sequências de bases identificadas foram introduzidas em células HEK 239T utilizando Lipofectamine 2000 (disponível na Invitrogen Corporation) e, após 48 horas, colheu-se um sobrenadante da cultura de células. A partir do sobrenadante celular colhido, purificou-se o Mabl66 recombinante através de uma coluna de Proteina-G (disponível na PIERCE). 0 presente invento será explicado em concreto através dos Exemplos não limitativos seguintes. Como técnica de 22 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ preparação de anticorpos, utilizaram-se os métodos descritos em Immunochemistry in Practice (Blackwell Scientific Publications) a não ser que especificado de outro modo. Como técnica de engenharia genética, utilizaram-se os métodos descritos em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.a Edição (Cold Spring Harbor Laboratory) a não ser que especificado de outro modo.

Exemplo 1

Preparação de antigénio

Extraiu-se ADN cromossómico de Pseudomonas aeruginosa da estirpe padrão PA01 fornecida pela Universidade Tokai, Japão, e amplificou-se o gene codificando a proteína PcrV (SEQ ID NO: 2) por PCR utilizando o ADN como matriz. Um local de reconhecimento da enzima de restrição Sphl foi proporcionado no iniciador do lado 5' e um local de reconhecimento da enzima de restrição HindIII foi proporcionado no iniciador do lado 3' (SEQ ID NOs: 3, 4), e num vector de expressão inseriu-se um desenho de modo a que uma cisterna esteja inserida entre o marcador de histidina e o codão de início para marcação com biotina. 0 fragmento de PCR amplificado foi clonado no vector pWE30 (disponível na GE Healthcare) em locais Sphl e HindIII. Após sequenciação, introduziu-se o vector em E. coli JM109 para obter E. coli recombinante (PcrV-JM109) . Cultivou-se o PcrV-JM109 em 500 mL de meio de cultura líquido de LB/ampicilina a 37°C, e quando a OD600 atingiu 0,5, adicionou-se IPTG até uma concentração final de 0,75 mM. Após cultura a 37°C durante 1,5 horas adicionais, centrifugaram-se as células bacterianas, e adicionaram-se 15 mL de tampão A (Tris-HCl 25 mM (pH 8,0), NaCl 0,5 M, MgCl2 2 mM) contendo 0,5% de lisozima (disponível na Sigma) . Após incubação a 0°C durante 30 minutos, sonicaram-se as células. Após centrifugação, obteve-se uma fracção solúvel, submeteu-se a colunas His-Bind (disponíveis na Novagen), e depois eluiu-se com tampão B (tampão fosfato 20 mM (pH 7,4), NaCl 500 mM) contendo imidazole 200 mM. A fracção de eluição final foi dialisada contra tampão fosfato 10 mM (pH 7,4) para substituir o tampão. 23 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ

Marcação do antigénio com biotina

Deixou-se reagir a proteína PcrV, expressa e purificada como descrito acima, numa solução de mercaptoetilamina numa concentração final de 10 mM a 37°C durante 150 minutos para reduzir os resíduos cisteína. Adicionou-se biotina activada com PEO-maleimida (disponível na PIERCE) numa quantidade de 20 vezes em relação aos grupos SH reduzidos, e deixou-se reagir de um dia para o outro a 4°C, e depois conduziu-se a diálise para remover a biotina não reagida.

Imunização com antigénio

Sete ratinhos Balb/c fêmeas com 4 semanas de idade foram imunizados intraperitonealmente cada um com 20 pg de antigénio PcrV purificado em adjuvante completo de Freund. A imunização de reforço foi realizada por administração de 20 pg de PcrV com adjuvante incompleto de Freund após 14 dias e 35 dias. Adicionalmente, a imunização final foi conduzida após 77 dias por administração intraperitoneal de 20 pg de PcrV e administração na veia caudal de 10 pg de PcrV.

Preparação de hibridoma

Extirpou-se o baço 3 dias após a imunização final, e colheram-se as células de baço. Fundiram-se uma célula de baço e uma célula de mieloma de ratinho (p3 χ 63-Ag8.Ul, Tokyo Mass Research Laboratory) utilizando 50% de polietilenoglicol 4000, e seleccionaram-se num meio de cultura contendo hipoxantina, aminopterina e timidina.

Selecção de anticorpo de PcrV

Decorridos 8 dias da fusão celular, rastrearam-se as células produtoras de anticorpo específico. O imunoensaio utilizado no rastreio foi como se segue. A cada poço de uma placa de microtitulação de 96 poços (disponível na Nunc) adicionaram-se 200 pL de tampão Tris (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5) contendo 2 pg de anticorpo IgG anti-ratinho (disponível na Shibayagi) e imobilizaram-se durante 16 horas a 4°C. Lavaram-se estes poços duas vezes com 300 pL de solução de lavagem (solução salina contendo 0,1% de Tween 20), e depois 24 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ adicionaram-se 300 pL de solução de bloqueio (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, 2% de BlockAce (disponível na Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.), 10% de sacarose) e deixaram-se duas horas à temperatura ambiente. Após lavagem de cada poço duas vezes com 300 pL de solução de lavagem, diluíram-se 50 pL de sobrenadante de cultura de hibridoma com 150 pl de tampão C (tampão Tris 50 mM, pH 7,6 contendo 0,9% de cloreto de sódio, 0,05% de azida de sódio, 0,5% de albumina de soro de bovino, 0,01% de Tween 80 e ácido dietilenotriamina-N,N, N',N" ,N"-penta-acético 25 pM) e adicionaram-se a cada cavidade, e deixaram-se reagir de um dia para o outro a 4°C. Após lavagem três vezes com 300 pl de solução de lavagem, adicionaram-se 200 pL de tampão C contendo 10 ng de estreptavidina marcada com Eu (disponível na PERKIN ELMER) e 25 ng de PcrV marcada com biotina, e deixou-se reagir durante 1 hora à temperatura ambiente. Após a reacção, lavou-se três vezes com 300 pL de solução de lavagem, e adicionaram-se 200 pL de reagente de intensificação (1,39 g/L de ftalato de potássio, 19,3 mg/L de óxido de tri-n-octilfosfina, 4,59 mg/L de 2-naftoiltrifluoroacetona, 1,0 g/L de Triton-X100, 6,0 g/L de ácido acético) e mediu-se a fluorescência desenvolvida em função do tempo. A partir do resultado do rastreio, seleccionaram-se 20 clones de hibridoma que exibiam forte afinidade por PcrV recombinante, e examinou-se a actividade de inibição da citotoxicidade por Pseudomonas aeruginosa de acordo com o Exemplo 4. Como resultado, observou-se actividade de inibição da citotoxicidade em 10 clones, e clonaram-se depois estes clones duas vezes pelo método da diluição limitante, e seleccionaram-se assim as células de hibridoma. A partir dos 10 clones obtidos, 4 clones exibiam elevada actividade de inibição da citotoxicidade, e foram denominados 1F3, 2A4, 6F5 e 7A7, respectivamente. Para estes anticorpos, determinaram-se as subclasses de anticorpo utilizando um kit ELISA de isotipagem de anticorpo monoclonal de ratinho (disponível na BD Biosciences) , e constatou-se que o 1F3 era IgG2a, ο 2A4 era IgG2b, o 6F5 era IgG2a e ο 7A7 era IgG2a.

As células de hibridomas que produzem anticorpos monoclonais 1F3 e 2A4 foram depositadas no National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International 25 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ

Patent Organism Depositary (Centro N.°6, 1-1-1, Higashi,

Tsukuba-shi, IBARAGI, JAPÃO) em 18 de Outubro de 2007, com os números de acesso FERM BP-11085 e FERM BP-11086 respectivamente.

Exemplo 2

Actividade de ligação de anticorpo

Para medir a actividade de ligação de anticorpos (1F3, 2A4, 6F5, 7A7), realizou-se um imunoensaio competitivo. A cada poço de uma placa de microtitulação de 96 poços (disponível na Nunc) adicionaram-se 100 pL de tampão Tris (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5) contendo 1,5 pg de anticorpo Fc anti-ratinho (disponível na Jackson ImmunoReseach) e imobilizaram-se durante 16 horas a 4°C. Lavaram-se estes poços duas vezes com 300 pL de solução de lavagem, depois adicionaram-se 300 pL de solução de bloqueio e deixaram-se durante duas horas à temperatura ambiente para conseguir o bloqueio (placa de anticorpo IgG anti-ratinho em fase sólida) . Após lavagem duas vezes com 300 pL de solução de lavagem, adicionaram-se 2 ng/poço de cada anticorpo e PcrV não marcada em cinco concentrações de diluições em série de 1 para 10 a partir de 500 ng/poço. Depois, adicionaram-se 5 ng/poço de PcrV biotinilada e deixou-se reagir de um dia para o outro. Após lavagem quatro vezes com 300 pL de líquido de lavagem e adição de 100 pL/poço de reagente de intensificação (disponível na PerkinElmer), após agitação durante 1 minuto, mediu-se a fluorescência desenvolvida em função do tempo. Como resultado, 1F3, 2A4, 6F5 e 7A7 exibiram uma actividade de ligação mais forte contra PcrV do que Mabl66 (Fig. 1). A seguir, determinou-se a actividade de 1F3, 2A4, 6F5, 7A7 e Mabl66 com PcrV por análise de ressonância de plasmão de superfície. Anticorpo Fc IgG anti-ratinho foi imobilizado sobre um chip sensor CM5 utilizando um kit de captura de anticorpo de ratinho (disponível na BIACORE) num equipamento BIAcore T100. Sequencialmente, capturou-se cada um dos anticorpos de PcrV e carregou-se PcrV recombinante para determinar o valor de KD. 26 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ

Como resultado, cada clone mostrou uma afinidade mais elevada do que Mabl66 conforme evidenciado pela afinidade de 3,7 x IO-10 (M) para 1F3, pela afinidade de 3,5 χ 1CT10 (M) para 2A4, pela afinidade de 1,1 χ IO-10 (M) para 6F5 e pela afinidade de 1,1 χ 1CT9 (M) para 7A7, em contraste com a afinidade de 3,0 χ 10~9 (M) para Mabl66 (Fig. 2).

Exemplo 3

Imunoensaio de sanduíche com Mabl66

De modo a provar que 1F3, 2A4, 6F5 e 7A7 têm um epítopo diferente do epítopo de Mabl66, examinou-se um imunoensaio de sanduíche entre cada anticorpo e Mabl66.

Em primeiro lugar, marcou-se o Mabl66 com biotina. Misturaram-se 100 pg de Mabl66 e 7,853 pg de NHS-PE04 Biotina (disponível na PIERCE) em PBS 0,1 M (pH 7,4), e deixou-se reagir durante 2 horas em gelo. Depois, purificou-se o MAb biotinilado por cromatografia de exclusão de tamanhos (coluna G2000SW (disponível na TOSOH)) para remover a biotina não reagida da solução reaccional.

Um imunoensaio de sanduíche foi realizado como se segue. A cada poço de uma placa de microtitulação de 96 poços (disponível na Nunc) adicionaram-se 100 pL de solução PBS (-) contendo 500 ng de cada anticorpo de PcrV (1F3, 2A4, 6F5, 7A7) e imobilizou-se durante 16 horas a 4°C. Lavaram-se estes poços uma vez com 300 pL de uma solução de lavagem, e depois adicionaram-se 300 pL de solução de bloqueio e deixaram-se durante duas horas à temperatura ambiente para efectuar o bloqueio. Após lavagem de cada poço duas vezes com 300 pL de solução de lavagem, adicionaram-se 100 pL de tampão de ensaio (disponível na Wallac) contendo 50 ng de PcrV e 50 ng de

Mabl66 marcado com biotina e deixou-se reagir de um dia para o outro a 4°C. Após lavagem três vezes com solução de lavagem, adicionaram-se 100 pL de tampão de ensaio contendo 50 ng de estreptavidina marcada com Eu (disponível na

Wallac), e deixou-se reagir durante 1 hora à temperatura ambiente. Após lavagem três vezes com solução de lavagem e adição de 100 pL de reagente de intensificação, agitou-se 27 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ durante 1 minuto, e depois mediu-se a fluorescência desenvolvida em função do tempo.

Como resultado, foi possível o imunoensaio de sanduíche entre qualquer de 1F3, 2A4, 6F5 e 7A7 e Mabl66, pelo que foi revelado que os presentes anticorpos possuem epítopos diferentes do epítopo de Mabl66 (Fig. 3).

Exemplo 4

Medição da actividade de inibição da citotoxicidade de anticorpos de PcrV

Mediu-se a actividade de inibição da citotoxicidade de 1F3, 2A4, 6F5 e 7A7. 0 método é como se segue.

Em primeiro lugar, diluíram-se 1F3, 2A4, 6F5, 7A7 numa série de diluições de 1 para 2 a partir de 32 pg/mL, e dispensaram-se 10 pL em cada poço de uma placa de microtitulação de 96 poços. A seguir, ajustaram-se células de mieloma de ratinho P3U1 (da ATCC) a 5 χ 106 células/ml ou células de leucócitos de humano da linha U937 (da ATCC) a 1 χ 106 células/mL num meio de cultura de células (RPMI 1640 contendo hidrogenocarbonato de sódio, e não contendo L-glutamina e vermelho de fenol (disponível na Sigma)), e adicionaram-se 100 pL de cada suspensão de células à placa de microtitulação de 96 poços. A seguir, ajustou-se Pseudomonas aeruginosa estirpe SR24, cultivada de um dia para o outro em caldo Mueller Hinton de catiões ajustados (Difco), a 1 χ 108 cfu/mL num meio de cultura de células, e adicionada numa quantidade de 10 pL/poço, e cultivou-se durante 3 horas a 37°C na presença de 5% de CO2. Após agitação durante 3 horas, adicionaram-se a cada poço 10 pL de WST-8 (disponível na Kishida Chemical Co., Ltd.), e cultivaram-se a 37°C na presença de 5% de CO2 durante 3 horas para o caso das células de mieloma P3U1 ou durante 1 hora para o caso das células U937. Após a cultura estar completa, mediu-se a absorvância a 450 nm.

Como resultado, quando se utilizaram células de leucócitos U937, a actividade de inibição de citotoxicidade (IC50) foi 5,3 nM para 1F3, 20,7 nM para 2A4, 12,7 nM para 28 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ 6F5 e 14,7 ηΜ para 7Α7 em contraste com mais de 213 nM para Mabl66, e quando se utilizaram células de mieloma U3P1, a actividade de inibição de citotoxicidade (IC50) foi 4,0 nM para 1F3, 16 nM para 2A4, 7,3 nM para 6F5 e 6,0 nM para 7A7 em contraste com 54 nM para Mabl66. Isto é, 1F3, 2A4, 6F5 e 7A7 tinham actividade de inibição da citotoxicidade mais elevada para ambas as células do que Mabl66 que foi anteriormente descrito Frank et al., The Journal of Infectious Diseases, 2002, vol. 186, p. 66) (Fig. 4 e Fig. 5) .

Exemplo 5

Preparação de PcrV truncada

Preparou-se PcrV (136-233) truncada do seguinte modo.

Um fragmento amplificado por PCR com um iniciador do lado 5' GCTCGAGGATCCCAAGGCGCTGACCGC (SEQ ID NO: 5) e com um iniciador do lado 3' GTTAAGCTTCTCGAAGGGGTACTC (SEQ ID NO: 6), utilizando como matriz pQE30-PcrV como plasmideo de expressão de proteína antigénica PcrV, foi tratado com enzimas de restrição BamHI e HindIII e inserido em pET32b (disponível na Novagen). Após sequenciação, introduziu-se o vector em E. coli estirpe BL21-DE3 para obter E. coli recombinante (PcrV truncada-BL21). Esta estirpe de expressão foi pré-cultivada durante todo o dia e noite a 37°C e 2 mL de meio de cultura líquido de LB/ampicilina. Adicionaram-se 2 mL de líquido de pré-cultura a 500 mL de meio de cultura líquido de LB/ampicilina e cultivou-se a 37°C, e quando a OD600 atingiu 0,5, manteve-se o líquido de cultura em repouso durante 30 minutos em gelo. Adicionou-se IPTG até uma concentração final de 0,75 mM, e cultivou-se a 15°C de um dia para o outro. Colheram-se as células bacterianas por centrifugação a 4°C, x5000g durante 30 minutos. Removeu-se o sobrenadante para outro tubo, e adicionaram-se ao sedimento 10 mL de tampão X (Tris-HCl 25 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, MgCl2 2 mM) contendo 0,1% de lisozima (disponível na Sigma) e suspendeu-se, deixou-se em repouso em gelo durante 1 hora, e depois sonicou-se sob arrefecimento em gelo. Depois aplicou-se uma fracção solúvel a uma coluna Ni-NTA (Quiagen), e eluiu-se com tampão Y (Tris-HCl 25 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, imidazole 200 29 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ mM). A fracção eluída foi dialisada com tampao fosfato 10 mM (PH 7, 4) .

Determinação da região epitópica A cada poço de uma placa de microtitulação de 96 poços (disponível na Nunc) adicionaram-se 150 pL de tampão Tris (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5) contendo 1,5 pg de anticorpo Fc IgG anti-ratinho (disponível na Jackson ImmunoResearch) e imobilizaram-se durante 16 horas a 4°C. Lavaram-se estes poços duas vezes com 300 pL de uma solução de lavagem, e depois adicionaram-se 300 pL de solução de bloqueio e deixaram-se durante duas horas à temperatura ambiente para bloquear cada poço. Após lavagem de cada poço uma vez com 300 pL de líquido de lavagem, adicionaram-se a cada poço 50 pL de solução de anticorpo de PcrV diluído numa concentração de 80 ng/mL com tampão C (tampão Tris 50 mM contendo 0,9% de cloreto de sódio, 0,05% de azida de sódio, 0,5% de albumina de soro de bovino, 0,01% de Tween 80, e ácido dietilenotriamina-N,N,N',N",N"-penta-acético 25 pM, pH 7,6), seguindo-se 50 pL de solução de estreptavidina marcada com Eu (disponível na PERKIN ELMER) diluída numa concentração de 200 ng/mL com tampão C, 50 pL de proteína PcrV truncada diluída numa dada concentração com tampão de ensaio DELFIA e 50 pL de solução de PcrV biotinilada diluída numa concentração de 1,0 pg/mL com tampão C, e deixou-se reagir a 4°C de um dia para o outro. Após lavagem três vezes com 300 pL de solução de lavagem, adicionaram-se 200 pL de um reagente de intensificação (disponível na PERKIN ELMER), e mediu-se a fluorescência desenvolvida em função do tempo (Fig. 6) .

Como resultado, os anticorpos de PcrV 1F3, 2A4, 9D12, 12H9, e o Mabl66 recombinante, que é um exemplo modelo de anticorpo neutralizante de PcrV como anteriormente descrito, exibiram reactividade com PcrV a todo o comprimento (1-294). Por outro lado, enquanto 1F3 e 2A4 exibiram reactividade com PcrV (136-233), Mabl66, bem como 9D12 e 12H9 desprovidos de actividade de neutralização, não exibiram reactividade.

Foi também conduzida análise de ligação por Western blotting. Aplicou-se proteína PcrV recombinante purificada a SDS-PAGE, e depois transferiu-se para membrana de PVDF. 30 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ

Bloqueou-se a membrana transferida com PBS contendo 2% de Block Ace (disponível na Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) à temperatura ambiente durante 2 horas sob agitação. Adicionou-se à membrana solução de anticorpo de PcrV diluído a 1 pg/mL, deixou-se reagir de um dia para o outro a 4°C, e depois lavou-se com tampão de lavagem B (tampão fosfato 10 mM (pH 7,4), 0,05% de Tween 20). Como anticorpo secundário, adicionou-se à membrana solução de anticorpo IgG anti-ratinho marcado com HRP (disponível na GE Healthcare), e deixou-se reagir durante 2 horas à temperatura ambiente. Depois, lavou-se a membrana com tampão de lavagem B, e detectou-se o sinal utilizando o sistema de detecção ECL Plus Western Blot (disponível na GE Healthcare) (Fig. 7) . Enquanto os anticorpos neutralização de PcrV 1F3 e 2A4 reagiram tanto com a PcrV a todo o comprimento como com a PcrV truncada (136-233), o Mabl66 e também 9D12 e 12H9 reagiram apenas com PcrV a todo o comprimento, e não reagiram com PcrV truncada (136-233) .

Isto demonstrou que a região epitópica dos anticorpos de neutralização de PcrV 1F3 e 2A4 era uma região correspondendo aos resíduos aminoácido 136-233, e Mabl66, 9D12 e 12H9 não possuíam exclusivamente uma região epitópica correspondendo aos resíduos aminoácido 136-233.

Exemplo 6

Correlação entre a região específica de proteína PcrV e a força de citotoxicidade

Utilizando proteína PcrV a todo o comprimento (SEQ ID NO: 1) e proteína PcrV truncada (possuindo uma sequência de aminoácidos correspondendo às posições 136 a 233 na SEQ ID N0:I), foi conduzido um teste de supressão de actividade de inibição de citotoxicidade em 1F3, 2A4 e Mabl66 do seguinte modo.

Em primeiro lugar, ajustaram-se 1F3, 2A4 e Mabl66 a 1,56-6,25 nM, 6,25-25 nM e 50-200 nM, respectivamente, e adicionaram-se 10 pL destes anticorpos à placa de 96 poços. Para cada intervalo de concentrações de teste, adicionaram-se à placa de 96 poços 10 pL de cada uma de proteína PcrV a todo 31 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ ο comprimento ou proteína PcrV truncada em proporções molares de 30, 10, 3, 1 e 0,3 vezes, e mantiveram-se em repouso durante 30 minutos à temperatura ambiente. A seguir, prepararam-se células de mieloma P3U1 com 5 χ 106 células/mL em meio de cultura de células (RPMI 1640 contendo hidrogenocarbonato de sódio, e não contendo L-glutamina e vermelho de fenol (disponível na Sigma)), e adicionaram-se 70 pL de cada à placa de microtitulação de 96 poços. Depois, adicionou-se um líquido bacteriano de Pseudomonas aeruginosa estirpe SR24 cultivada de um dia para o outro em caldo de Mueller Hinton (Difco) ajustado para ter 1 χ 108 cfu/mL numa quantidade de 10 pL/poço, e cultivou-se durante 3 horas a 37°C na presença de 5% de C02. Após um lapso de 3 horas, adicionaram-se 10 pL de WST-8 (disponível na Kishida Chemical Co., Ltd.) a cada, e cultivaram-se a 37°C na presença de 5% de C02 durante 3 horas. Após a cultura estar completa, mediu-se a absorvância a um comprimento de onda de 450 nm.

Como resultado, 1F3 e 2A4 exibiram uma actividade de inibição da citotoxicidade mais elevada do que Mabl66. Quando se adicionou proteína PcrV a todo o comprimento, os efeitos de inibição de anticorpos anti-PcrV foram suprimidos de um modo dependente da dose de PcrV (Fig. 8). Quando se adicionou proteína PcrV truncada (136-233), as actividades de inibição de 1F3 e 2A4 foram também suprimidas de um modo dependente da dose. Por outro lado, a actividade de inibição de Mabl66 não se alterou por adição de PcrV truncada (136-233) (Fig. 9). A partir destes resultados, pode-se considerar que anticorpos reconhecendo um epítopo nos resíduos aminoácido 136-233 (1F3 e 2A4) têm actividade de inibição de citotoxicidade mais elevada do que anticorpos reconhecendo os epítopos diferentes (e.g. Mabl66). Por outras palavras, pode-se concluir que a actividade de inibição da citotoxicidade depende da região epitópica reconhecida pelo anticorpo de PcrV, e o anticorpo que reage com a região 136-233 da proteína PcrV possui uma actividade de neutralização forte. 32 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ

Exemplo 7

Análise da sequência de aminoácidos de anticorpo de PcrV (1F3 e 2A4) A partir das células de hibridoma estabelecidas, extraiu-se ARN utilizando o RNeasy Mini Kit (disponível na QIAGEN) . A partir de 1 pg de ARN extraido, amplificou-se um fragmento de ADN utilizando o sistema 5'RACE para amplificação rápida de extremidades de ADNc, Versão 2.0 (disponível na Invitrogen). Neste momento, os iniciadores utilizados para síntese de ADNc foram TAGAGTCACCGAGGAGCCAGTTGT (SEQ ID NO: 7) para 1F3 e TCCAGAGTTCCAAGTCACAGTCAC (SEQ ID NO: 8) para 2A4. Os iniciadores utilizados no método 5'RACE foram AGGGGCCAGTGGATAGACCGATGGGGCTGT (SEQ ID NO: 9) para 1F3 e AGGGGCCAGTGGATAGACTGATGGGGGTGT (SEQ ID NO: 10) para 2A4. Os fragmentos amplificados foram clonados utilizando o kit de clonagem TOPO TA (disponível na Invitrogen), e sequenciados pelo Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer (disponível na Applied Biosystems). Os resultados analíticos são apresentados na Fig. 10 para IF3 e na Fig. 11 para 2A4.

Aplicabilidade Industrial O anticorpo monoclonal do presente invento ou uma sua parte não apenas possui afinidade elevada por PcrV, mas também exibiu uma forte actividade inibidora da citotoxicidade de Pseudomonas aeruginosa para a célula eucariótica. Por conseguinte, a composição farmacêutica contendo o anticorpo monoclonal ou uma sua parte é útil como um fármaco terapêutico para uma infecção relacionada com Pseudomonas aeruginosa que é correntemente considerada como sendo difícil de tratar no campo médico. 33 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> SHIONOGI&CO.,LTD. <120> Anticorpos para PcrV <13 0> 08P00114 <160> 26 <17 0> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 294 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 1

Met Glu val Arg Asn Leu Asn Ala Ala Arg Glu Leu Phe Leu Asp Glu 1 5 10 15 Leu Leu Ala Ala Ser Ala Ala Pro Ala Ser Ala Glu Gin Glu Glu Leu 20 25 30 Leu Ala Leu Leu Arg Ser Glu Arg Ile Val Leu Ala His Ala Gly Gin 35 40 45 Pro Leu Ser Glu Ala Gin Val Leu Lys Ala Leu Ala Trp Leu Leu Ala 50 55 60 Ala Asn Pro Ser Ala Pro Pro Gly Gin Gly Leu Glu Val Leu Arg Glu 65 70 75 80 Vai Leu Gin Ala Arg Arg Gin Pro Gly Ala Gin Trp Asp Leu Arg Glu 85 90 95 Phe Leu Val Ser Ala Tyr Phe Ser Leu His Gly Arg Leu Asp Glu Asp 100 105 110 Val Ile Gly Val Tyr Lys Asp val Leu Gin Thr Gin Asp Gly Lys Arg 115 120 125 Lys Ala Leu Leu Asp Glu Leu Lys Ala Leu Thr Ala Glu Leu Lys Val 130 135 140 Tyr Ser val Ile Gin Ser Gin Ile Asn Ala Ala Leu Ser Ala Lys Gin 145 150 155 160 Gly Ile Axg Ile Asp Ala Gly Gly Ile Asp Leu val Asp Pro Thr Leu 165 170 175 34 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ

Tyr Gly Xyr Ala Vai Gly Asp Pro Arg Trp Lys Asp Ser Pro Glu Tyr 180 185 190

Ala Leu Leu Ser Asn Leu Asp Thr Phe Ser Gly Lys Leu Ser Ile Lys 195 200 205

Asp Phe Leu Ser Gly Ser Pro Lys Gin Ser Gly Glu Leu Lys Gly Leu 210 215 220

Ser Asp Glu Xyr Pro Phe Glu Lys Asp Asn Asn Pro Vai Gly Asn Phe 225 230 235 240

Ala Xhr Ihr Vai Ser Asp Arg Ser Arg Pro Leu Asn Asp Lys Vai Asn 245 250 255

Glu Lys Thr Thr Leu Leu Asn Asp Thr Ser Ser Arg Tyr Asn Ser Ala 260 265 270

Vai Glu Ala Leu Asn Arg Phe Ile Gin Lys Tyr Asp Ser vai Leu Arg 275 280 285

Asp Ile Leu Ser Ala Ile 290 <210> 2

<211> 885 <212> ADN <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 2 atggaagtca gaaaccttaa tgccgctcgc gagctgttcc tggacgagct cctggccgcg 60 tcggcggcgc ctgccagtgc cgagcaggag gaactgctgg ccctgttgcg cagcgagcgg 120 atcgtgctgg cccacgccgg ccagccgctg agcgaggcgc aagtgctcaa ggcgctcgcc 180 tggttgctcg cggccaatcc gtccgcgcct ccggggcagg gcctcgaggt actccgcgaa 240 gtcctgcagg cacgtcggca gcccggtgcg cagtgggatc tgcgcgagtt cctggtgtcg 300 gcctatttca gcctgcacgg gcgtctcgac gaggatgtca tcggtgtcta caaggatgtc 360 ctgcagaccc aggacggcaa gcgcaaggcg ctgctcgacg agctcaaggc gctgaccgcg 420 gagttgaaçg tctacagcgt gatccagtcg cagatcaacg ccgcgctgtc ggccaagcag 480 ggcatcagga tcgacgctgg cggtatcgat ctggtcgacc ccacgctata tggctatgcc 540 gtcggcgatc ccaggtggaa ggacagcccc gagtatgcgc tgctgagcaa tctggatacc 600 ttcagcggca agctgtcgat caaggatttt ctcagcggct cgccgaagca gagcggggag 660 ctcaagggcc tcagcgatga gtaccccttc gagaaggaca acaacccggt cggcaatttc 720 gccaccacgg tgagcgaccg ctcgcgtccg ctgaacgaca aggtcaacga gaagaccacc 780 ctgctcaacg acaccagctc ccgctacaac tcggcggtcg aggcgctcaa ccgcttcatc 840 cagaaatacg acagcgtcct gcgcgacatt ctcagcgcga tctag 885 <210> 3 35 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ <211> 33 <212> ADN <213> Iniciador <400> 3 attgcatgca tggaagtcag aaaccttaat gcc 33 <210> 4 <211> 33 <212> ADN <213> <220> Artificial <223> Iniciador <400> 4 tatttcgaag atctagcgcg actcttacag cgc 33 <210> 5 <211> 27 <212> ADN <213> <220> Artificial <223> Iniciador <400> 5 gctcgaggat cccaaggcgc tgaccgc 27 <210> 6 <211> 23 <212> ADN <213> <220> Artificial <223> Iniciador <400> 6 gttaagcttc tcgaagggta ctc 23 <210> 7 <211> 24 <212> ADN <213> <220> Artificial <223> Iniciador <400> 7 tagagtcacc gaggagccag ttgt 24 <210> 8 36 36 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ <211> 24 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador <400> 8 tccagagttc caagtcacag tcac 24 <210> 9 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador <400> 9 aggggccagt ggatagaccg atggggctgt 30 <210> 10 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <40 0> 10 aggggccagt ggatagactg atgggggtgt 30 <210> 11 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH de anticorpo 1F3 <400> 11

Gin Vai Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Vai Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile 37 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ 35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60

Asn Thr Lys Ala Thr Leu Thr Vai Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Vai Leu Tyr Gly Asn Tyr Vai Vai Tyr Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Ser Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 12 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL de anticorpo 1F3 <400> 12

Gin Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Thr Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15

Glu Glu Ile Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Thr Ser Vai Ser Tyr Met 20 25 30

Glu Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Ile Leu Ile Tyr 35 40 45

Thr Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Vai Glu Ala Glu 65 70 75 80

Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Cys His Gin Trp Arg Asn Tyr Pro Phe Thr 85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp 100 <210> 13 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> 38 38 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ <223> VH de anticorpo 2Ά4 <400> 13

Asp Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Vai Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45

Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60

Lys Ser Arg Ile Ser Ile Ala Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Phe 65 70 75 80

Leu Gin Leu Asn Ser Vai Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Ser Cys 85 90 95

Ala Gly Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ala 115 120 <210> 14 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL de anticorpo 2A4 <400> 14

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Ile Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Ser Ile Asn Tyr Lys Ala Ser Gin Tyr Vai Gly Thr Thr 20 25 30

Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly His Ser Pro Lys Leu Leu Ile 39 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ 35 40 45

Tyr Arg Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile Ser Asa Vai Gin Ser 65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Cys Ser Ser Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Tyr Leu Glu Vai Lys Arg Ala Asp 100 105 110 <210> 15 <211> 8

<212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR1 de cadeia pesada de 1F3 <400> 15

Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Met His 1 5 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 de cadeia pesada de 1F3 <400> 16

Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Asn Thr 15 10 15 <210> 17 <211> 12

<212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 de cadeia pesada de 1F3 <400> 17

Tyr Gly Asn Tyr Vai Vai Tyr Tyr Thr Met Asp Tyr 15 10 40 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR1 de cadeia leve de 1F3 <400> 18

Ser Ala Ser Thr Ser Vai Ser Tyr Met Glu 1 5 10 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> <220> Artificial <223> CDR2 de cadeia leve de 1F3 <400> 19

Thr Thr Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> <220> Artificial <223> CDR3 de cadeia leve de 1F3 <400> 20

His Gin Trp Arg Asn Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> <220> Artificial <223> CDR1 de cadeia pesada de 2A4 <400> 21

Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala Trp Asn 1 5 <210> 22 41 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ <211> 16 <212> PRT <213> <220> Artificial <223> <400> CDR2 de cadeia pesada de 2A4 22

Tyr Ile Thr Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> <220> Artificial <223> <400> CDR3 de cadeia pesada de 2A4 23

Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr 15 10 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> <220> Artificial <223> CDR1 de cadeia leve de 2A4 <400> 24

Lys Ala Ser Gin Tyr Vai Gly Thr Thr Vai Ala 1 5 10 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> <220> Artificial <223> CDR2 de cadeia leve de 2A4 <400> 25

Arg Ala Ser Thr Arg His Thr 1 5 <210> 26 <211> 9 42 ΕΡ 2 248 826/ΡΤ

<212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 de cadeia leve de 2A4 <400> 26

Gin Gin Tyr Cys Ser Ser Pro Leu Thr 1 5

Lisboa, 2013-08-30

Claims (9)

1. ΕΡ 2 248 826/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo monoclonal, ou uma parte de um anticorpo monoclonal, contra PcrV possuindo 1) na região variável de cadeia pesada, regiões determinantes de complementaridade incluindo as sequências de aminoácidos seguintes: SETSYWMH (SEQ ID NO: 15) para CDR1 INPSNGRTNYNEKFNT (SEQ ID NO: 16) para CDR2 e YGNYVVYYTMDY (SEQ ID NO: 17) para CDR3 e 2) na região variável de cadeia leve, regiões determinantes de complementaridade incluindo as sequências de aminoácidos seguintes: SASTSVSYME (SEQ ID NO: 18) para CDR1, TTSKLAS (SEQ ID NO: 19) para CDR2 e HQWRNYPFT (SEQ ID NO: 20) para CDR3.
2. 2. Composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou a parte do anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, como um ingrediente activo.
3. 3. Anticorpo monoclonal ou a parte do anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, para utilização num método de tratamento médico.
4. 4. Anticorpo monoclonal ou a parte do anticorpo monoclonal para utilização num método de tratamento médico de acordo com a reivindicação 3, onde o tratamento médico é tratamento de uma infecção.
5. 5. Anticorpo monoclonal ou a parte do anticorpo monoclonal para utilização de acordo com a reivindicação 4, onde a infecção é uma infecção do tracto respiratório.
6. 6. Anticorpo monoclonal ou a parte do anticorpo monoclonal para utilização de acordo com a reivindicação 4 ou reivindicação 5, onde a infecção está associada a fibrose cística.
7. 7. Utilização do anticorpo monoclonal ou da parte do anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1 na preparação de um medicamento para tratamento de uma infecção. ΕΡ 2 248 826/ΡΤ 2/2
8. 8. Utilização de acordo com a reivindicação 7, onde a infecção é uma infecção do tracto respiratório.
9. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 7 ou reivindicação 8, onde a infecção está associada a fibrose cística. Lisboa, 2013-08-30