EA021101B1 - ГУМАНИЗИРОВАННОЕ АНТИТЕЛО К PcrV, ОБЛАДАЮЩЕЕ АКТИВНОСТЬЮ ПРОТИВ ПСЕВДОМОНАС - Google Patents

Abstract

Предложено гуманизированное моноклональное антитело против PcrV или часть указанного антитела и фармацевтическая композиция, которая их содержит в качестве активного ингредиента, в качестве эффективного средства лечения инфекции, в частности инфекции, вызываемой Pseudomonas aeruginosa. В частности, гуманизированное моноклональное антитело согласно настоящему изобретению обладает исключительной активностью ингибирования цитотоксичности в отношении клеток, являющихся мишенями для Pseudomonas aeruginosa. Также указанное гуманизированное моноклональное антитело согласно настоящему изобретению обладает высоким сродством к PcrV.

Description

Изобретение относится к гуманизированному моноклональному антителу, которое распознаёт РсгУ или части указанного антитела. Более конкретно, настоящее изобретение относится к антителу, обладающему более высокой нейтрализующей активностью (далее, также обозначается как активность ингибирования цитотоксичности), чем известные антитела против РсгУ или их части, и к фармацевтической композиции, содержащей указанное антитело или его часть.

Уровень техники

Ркеиботопак аегидепока представляет собой облигатно-аэробные грамотрицательные бациллы, широко распространенные в природе. Хотя обычно ее патогенность низка, она представляет собой патоген, который вызывает оппортунистические инфекции, часто возникающие у пациентов, страдающих разными первичными заболеваниями, такими как рак или диабет, и у пациентов, которым вводят лекарственные препараты, угнетающие иммунитет, и часто может вызывать пневмонию, инфекцию мочевыводящих путей, сепсис, или подобные состояния, приводящие к тяжелым последствиям. В клинической области инфекцию Ркеиботопак аегидепока рассматривают как одну из самых трудноизлечимых инфекций, поскольку Ркеиботопак аегидепока не только обладает исходно низкой чувствительностью к существующим антибиотикам, но также демонстрирует выраженную тенденцию к легкому приобретению устойчивости к разным антибиотикам, что делает её трудноизлечимой. Таким образом, поскольку возможности последовательной разработки новых антибиотиков против Ркеиботопак аегидеиока ограничены, существует ясная необходимость в способе лечения, который не был бы основан на антибиотиках. Ркеиботопак аегидеиока проявляет высокую цитотоксичность вследствие введения токсина в клетки эукариот при участии системы секреции экзотоксина III типа. РсгУ представляет собой белок, состоящий из 294 остатков (№ доступа ΝΟΒΙ №ААС45935, 8ЕЦ ГО №: 1), образующих систему секреции экзотоксина III типа, а последовательность оперона, кодирующая его, доступна для ознакомления (патентный документ 1, непатентный документ 1). Поскольку контроль РсгУ потенциально может привести к созданию терапевтических средств для борьбы с инфекцией, вызванной Ркеиботопак аегидепока (непатентный документ 2), есть сообщения о поликлональных антителах (непатентные документы 3, 4) и моноклональных антителах (патентный документ 2, непатентные документы 5, 6) против РсгУ, обладающих нейтрализующей активностью.

Однако поликлональные антитела трудно гуманизировать и применять в качестве фармацевтических композиций из-за трудностей с улучшением их антигенных свойств.

Также моноклональные антитела, о которых сообщалось до настоящего времени, обладают низкой нейтрализующей активностью и не могут удовлетворять требованиям, предъявляемым в клинических областях.

Патентный документ 1: патент США № 655179510.

Патентный документ 2: перевод на японский язык публикации РСТ № 2005-500250.

Непатентный документ 1: Уайт, Т.Ь. е! а1., I. Вас!егю1., 1997, уо1. 179, р. 7165.

Непатентный документ 2: Т. 5>а\\а е! а1., №!иге Мебюше, 1999, уо1. 5, р. 392.

Непатентный документ 3: §Пте N е! а1., I. Iттиηо1. 2001, уо1. 167, р. 5880 15.

Непатентный документ 4: Ипатша Υ е! а1., Еиг. Рекрй. I., 2007, уо1. 29, р. 965.

Непатентный документ 5: Каппе Раите е! а1., I. Iттипе. Вакеб. Тйегар1ек апб Уасстек, 2003, уо1. 1.

Непатентный документ 6: Нага А. Ргапк е! а1., I. Шес!. П1кеаке, 2002, уо1. 186, р. 64.

Краткое описание изобретения

Проблема, которую должно решить изобретение

Цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить средство, которое эффективно при лечении инфекции, в частности, инфекции, вызванной Ркеиботопак аегидепока.

Способы решения проблемы

В результате настойчивых попыток получить моноклональные антитела против РсгУ авторы настоящего изобретения достигли успеха в получении нового гуманизированного моноклонального антитела, которое, как предполагают, обладает более выраженным терапевтическим действием на заболевание, чем традиционно известные моноклональные антитела против РсгУ, и создали настоящее изобретение.

В частности, настоящее изобретение относится к:

(1) гуманизированному моноклональному антителу против РсгУ или части указанного антитела, которое обладает по меньшей мере одним свойством, выбранным из (Α)-(Ό):

(A) в концентрации от 1 до 200 нМ ингибирует 50% или более цитотоксичности, проявляемой Ркеиботопак аегидепока в отношении лейкоцитов ш уйго;

(B) в концентрации от 1 до 50 нМ ингибирует 50% или более цитотоксичности, проявляемой Ркеиботопак аегидепока в отношении клеток миеломы ш уйго;

(C) имеет константу диссоциации (КО) с РсгУ, равную 2х 10^-9 (М) или менее, и (Ό) направлено на эпитоп, содержащийся в положениях 136-233 в последовательности аминокислот, соответствующей 8ЕЦ ГО №: 1;

(2) гуманизированному моноклональному антителу или части указанного антитела, которое имеет

- 1 021101 последовательность аминокислот, в которой гипервариабельный участок (СОР) соответствует участку моноклонального антитела, продуцируемого гибридомой, депонированной с номером доступа РЕРМ АВР-11805;

(3) гуманизированному моноклональному антителу против РсгУ или части указанного антитела, которое имеет:

1) следующую последовательность аминокислот в гипервариабельном участке, вариабельной области тяжелой цепи: 8РТ8УЖМН (81 (С) ГО №: 15), ΙΝΡ8ΝΟΡΤΝΥΝΕΚΡΝΤ (81 (С) ГО №: 16), ΥΟΝΥ\ΥΥΤΜΌΥ (8ЕО ГО №: 17) и

2) следующую последовательность аминокислот в гипервариабельном участке, вариабельной области легкой цепи: 8А8Τ8У8УМЕ (8ЕО ГО №: 18), ТТ8КЬА8 (8ЕО ГО №: 19), НЦЖРЯУРРТ (8ЕО ГО №: 20);

(4) гуманизированному моноклональному антителу против РстУ или части указанного антитела, которое имеет:

1) следующую последовательность аминокислот в гипервариабельном участке, вариабельной области тяжелой цепи: 5РТ5¥\\'\111 (8ЕО ГО №: 15), ГОРБ^РТЯУЫЕКРЭТ (8ЕО ГО №: 16), ΥΟΝΥ\ΥУТМЭУ (8ЕЦ ГО №: 17) или по меньшей мере в одном СОР из набора из трех СОР, вариабельной области тяжелой цепи, присутствует замена, вставка или делеция одной или нескольких аминокислот и

2) следующую последовательность аминокислот в гипервариабельном участке, вариабельной области легкой цепи: 8А8Τ8У8УМЕ (8ЕО ГО №: 18), ТТ8КЬА8 (81 У) ГО №: 19), Н^ЖΡNУРРΤ (81 У) ГО №: 20) или по меньшей мере в одном СОР из набора из трех СОР, вариабельной области легкой цепи присутствует замена, вставка или делеция одной или нескольких аминокислот и обладает по меньшей мере одним свойством, выбранным из (Α)-(Ό):

(A) в концентрации от 1 нМ до 200 нМ ингибирует 50% или более цитотоксичности, проявляемой Ркеиботопак аетидеиока в отношении лейкоцитов ίη νίΐτο;

(B) в концентрации от 1 нМ до 50 нМ ингибирует 50% или более цитотоксичности, проявляемой Ркеиботопак аетидепока в отношении клеток миеломы ίη νίΐτο;

(C) имеет константу диссоциации (КО) с РсгУ, равную 2х 10^-9 (М) или менее, и (Ώ) направлено на эпитоп, содержащийся в положениях 136-233 в последовательности аминокислот, соответствующей 8ЕЦ ГО №: 1;

(5) гуманизированному моноклональному антителу против РсгУ или части указанного антитела, которое имеет

1) вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью аминокислот 8ЕЦ ГО №: 27, и

2) вариабельную область легкой цепи с последовательностью аминокислот 8ЕЦ ГО №: 28;

(6) фармацевтической композиции, которая содержит указанное антитело или часть указанного антитела по любому из (1)-(5), в качестве активного ингредиента;

(7) полинуклеотиду, кодирующему вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи антитела по любому из (1)-(5).

(8) вектору экспрессии, содержащему полинуклеотид в соответствии с (7);

(9) способу лечения инфекционного заболевания, вызываемого Ркеиботопак аетидепока, включающему введение эффективного количества моноклонального антитела или части указанного антитела в соответствии с любым из (1)-(5);

(10) применению моноклонального антитела или части указанного антитела согласно любому из пп. (1)-(5) при производстве лекарственного препарата для лечения инфекционных заболеваний, вызываемых Ркеиботопак аетидепока, и (11) фармацевтической композиции, содержащей антитело согласно любому из (1)-(5), для лечения инфекционных заболеваний, вызываемых Ркеиботопак аетидепока.

Результат настоящего изобретения

Гуманизированное моноклональное антитело или часть указанного антитела в соответствии с настоящим изобретением можно применять в качестве агента для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний, вызываемых Ркеиботопак аетидепока, благодаря его исключительно высокой нейтрализующей активности в отношении РсгУ.

Краткое описание рисунков

На фиг. 1 представлены кривые, на которых меченный биотином РсгУ заменяют немеченным РсгУ в антителах к РсгУ (1Р3, 2А4, 6Р5, 7А7 и МаЫ66).

На фиг. 2 предсгавлено сродство антител против РсгУ (1Р3, 2А4, 6Р5, 7А7 и МаЫ66), определенное способом поверхностного плазменного резонанса.

На фиг. 3 представлены результаты сэндвич-анализа для антител против РсгУ (1Р3, 2А4, 6Р5, 7А7 и МаЫ66) и МаЫ66.

На фиг. 4 показано ингибирующее действие антител против РсгУ (1Р3, 2А4, 6Р5, 7А7 и МаЫ66) на цитотоксичность, проявляемую штаммом 8Р24 Ркеиботопак аетидшока в отношении клеток И937.

На фиг. 5 показано ингибирующее действие антител против РсгУ (1Р3, 2А4, 6Р5, 7А7 и МаЫ66) на цитотоксичность, проявляемую штаммом 8Р24 Ркеиботопак аетидшока в отношении клеток миеломы

- 2 021101

Ρ3υι.

На фиг. 6 представлены кривые, на которых меченный биотином РсгУ, заменяют немеченным полноразмерным РсгУ и процессированным РсгУ в антителах к РсгУ (1Р3, 2А4, 9Ό12,12Η9 и МаЫ66).

На фиг. 7 показана реакционная способность в отношении полноразмерного РсгУ и процессированного РсгУ в антителах к РсгУ (1Р3, 2А4, 9Ό12, 12Н9 и МаЫ66) при вестерн-блоттинге.

На фиг. 8 показана корреляция между антителом и полноразмерным РсгУ в отношении подавления активности ингибирования цитотоксичности.

На фиг. 9 показана корреляция между антителом и процессированным РсгУ в отношении подавления активности ингибирования цитотоксичности.

На фиг. 10 показана последовательность аминокислот вариабельной области антитела 1Р3. Подчеркивание указывает участок СГОР.

На фиг. 11 показана последовательность аминокислот вариабельной области антитела 2А4. Подчеркивание указывает участок СГОР.

На фиг. 12 показана ориентация последовательности аминокислот вариабельных областей тяжелой и легкой цепи антитела мыши (1Р3 мышь), эталонного гуманизированного антитела (эталон), мутантного гуманизированного антитела (обратная мутация) и гуманизированного антитела (1Р3 гуманизированное).

На фиг. 13 показано сродство между антигеном РсгУ и каждой из комбинаций тяжелой цепи химерного антитела мыши-человека (Н-химера), его легкой цепи (Ь-химера), тяжелой цепи эталонного гуманизированного антитела (НТ), его легкой цепи (НТ), тяжелой цепи мутантного гуманизированного антитела (НВ) и его легкой цепи (ТВ). На фиг. 14 показано сродство антитела, включая каждую из комбинаций тяжелой цепи химерного антитела мыши-человека (Н-химера), легкой цепи химерного антитела мыши-человека (Ь-химера), мутантных вариантов тяжелой цепи мутантного гуманизированного антитела (148М, А67У, Ь69М, У71Р, А78У, У93А и Ь94Р) и легкой цепи эталонного гуманизированного антитела (ТТ) к антигену РсгУ.

На фиг. 15 показана последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела. Подчеркивание показывает участок СОР. На фиг. 16 показана последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела. Подчеркивание показывает участок СОР. На фиг. 17 показано сродство между антигеном РсгУ и каждой из комбинаций тяжелой цепи химерного антитела мыши-человека (Н-химера), его легкой цепи (Ь-химера), тяжелой цепи гуманизированного антитела (ЫР3 Н) и его легкой цепи (Н1Е3 Ь).

На фиг. 18 показано ингибирующее действие антител против РсгУ (гуманизированное антитело к РсгУ, антитело мыши к РсгУ и МаЫ66) на цитотоксичность, проявляемую штаммом Ркеийотоиак аегидК иока 8Р24 в отношении клеток υ937.

На фиг. 19 показано ингибирующее действие антител против РсгУ (гуманизированное антитело к РсгУ, антитело мыши к РсгУ и МаЫ66) на цитотоксичность, проявляемую штаммом Ркеийотоиак аегидК иока 8Р24 в отношении клеток миеломы.

Способ осуществления изобретения

Моноклональное антитело, которое является предметом настоящего изобретения, представляет собой моноклональное антитело, которое специфически связывается с упоминаемым выше белком РсгУ. Более конкретно, указанное моноклональное антитело против РсгУ, которое обладает по крайней мере одним из свойств, выбранным из группы, включающей: (1) в концентрации от 1 нМ до 200 нМ ингибирование 50% или более цитотоксичности, проявляемой Ркеийотоиак аегидепока в отношении лейкоцитов ίη уПго: (2) в концентрации от 1 нМ до 50 нМ ингибирование 50% или более цитотоксичности, проявляемой Ркеийотоиак аегидепока в отношении клеток миеломы ίη уПго: (3) константу диссоциации (ΚΌ) с РсгУ, равную 2х10^-9 (М) или менее; и (4) направленность на эпитоп, расположенный в положениях 136233 в последовательности аминокислот, 8ЕО ГО №:1;

Одно из свойств моноклонального антитела согласно настоящему изобретению - это высокая активность в отношении ингибирования цитотоксичности. Например, когда применяют лейкоциты, указанное моноклональное антитело имеет такую активность ингибирования (нейтрализации), которая приводит к ингибированию 50% или более цитотоксичности, вызываемой Ркеийотоиак аегидшока, при концентрации антитела в диапазоне от 1 до 200 нм, предпочтительно от 2 до 100 нм и еще более предпочтительно - от 5 до 25 нм. Когда применяют клетки миеломы, указанное моноклональное антитело имеет такую активность ингибирования (нейтрализации), которая приводит к ингибированию 50% или более цитотоксичности Ркеийотоиак аегидшока, при концентрации антитела в диапазоне от 1 до 50 нм, предпочтительно от 2 до 30 нм и еще более предпочтительно - от 4 до 20 нм. Данные значения намного превышают значения активности, которые приводятся для МаЫ66 в данных XV. Ргаик е1 а1. (1. НзГесС Ойеаке. 2002, уо1. 186, р. 64). Еще одно свойство моноклонального антитела согласно настоящему изобретению это его направленность на эпитоп, расположенный в участке с положениями с 136 по 223 в полноразмерной последовательности аминокислот РсгУ (8ЕО №: 1). Авторы настоящего изобретения показали, что антитело, которое распознает данный участок, обладает более высокой активностью (активностью ингибирования цитотоксичности), чем антитело, которое распознает другой участок. Антитело, которое распознает данный участок, можно применять при лечении инфекционных заболеваний, поскольку оно об- 3 021101 ладает высокой активностью ингибирования цитотоксичности.

Эпитоп, распознаваемый моноклональным антителом можно идентифицировать следующим образом. Сперва, получают несколько разных частичных структур молекулы, которую должно распознавать указанное моноклональное антитело. Для получения частичных структур известны способ получения разных частичных белков для молекулы с известным способом синтеза олигопептидов, способ получения их в клетке хозяина, такой как Е. сой, или вне ее, путем встраивания в пригодную экспрессионную плазмиду последовательности ДНК, кодирующей целевой частичный пептид, при помощи способа рекомбинации генов или подобного известного способа, однако для вышеупомянутой цели обычно применяют сочетание указанных способов. Например, после приготовления серий полипептидов, которые получают путем укорочения белка антигена с С-конца или Ν-конца на определенную длину при помощи способа рекомбинации генов, хорошо известного специалистам в этой области техники, оценивают реактивность моноклонального антитела в отношении данных полипептидов и приблизительно определяют сайт распознавания.

После этого, разные полипептиды соответствующей части, мутанты пептидов или подобные молекулы синтезируют более точно посредством способа синтеза олигопептидов, хорошо известного специалистам в этой области техники, и проводят определение эпитопа путем оценки способности к связыванию моноклонального антитела, которое включает агент для профилактики или лечения согласно настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, с указанными пептидами, или путем оценки конкурентной ингибирующей активности указанных пептидов в отношении связывания моноклонального антитела с антигеном. В качестве подходящего способа получения разных олигопептидов можно также применять коммерческий набор (например, набор 8РОТз (поставляемый компанией Оепозуз Вю1есйпо1офс5. 1пс.), или серии наборов для многоканального/пептидного синтеза со способом многоканального синтеза (поставляется компанией СЫгоп Согрогайоп).

Активность ингибирования цитотоксичности можно измерить следующим образом. Сперва, моноклональное антитело, для которого измеряют активность ингибирования цитотоксичности, разводят в соответствующих концентрациях путем серии 2-кратных разведений. Затем клетки, которые подвергают действию токсина Рзеиботопаз аегидшоза или подобного (в дальнейшем именуются как клеткимишени), разводят, например, при помощи питательной среды для культур клеток, чтобы получить требуемое количество. В частности, предпочтительно получить концентрацию 3х10⁶-5х10⁶ клеток/мл, когда применяют клетки миеломы, и получить концентрацию 1х10⁶-3х10⁶ клеток/мл, когда применяют лейкоциты. Аналогично, клетки Рзеиботопаз аегидтоза также получают в концентрации 1х10⁷-5х10⁸ КОЕ/мл, например, при помощи питательной среды. В присутствии моноклонального антитела клетки Рзеиботопаз аегидшоза культивируют в той же пробирке или лунке (например, условия ш уйго, такие как лунка на микропланшете) при подходящих условиях культивирования. На этом этапе условия культивирования могут соответствовать обычно применяемым условиям, которые считают приемлемыми для роста клеток и бактерий. Что касается периода культивирования, оптимальные условия изменяют должным образом в зависимости от типа клеток-мишеней и, например, в случае применения клеток миеломы предпочтительный период культивирования составляет приблизительно 1-3 ч, в случае применения лейкоцитов также 1-3 ч. Концентрацию, при которой наблюдается 50% ингибирования по сравнению с контрольной группой (эффективная концентрация), рассчитывают относительно лунки, в которую не добавляли антитела (контрольная группа). Для решения вопроса о том, живы или мертвы клетки-мишени, хотя и были разработаны разные процедуры, применяют, например, измерение поглощения на определенной длине волны (например, 400-500 нм) после добавления красителя (для справки см. №Щ.1ге МеФсте 1999, уо1.5, р. 392-395).

Одним из свойств моноклонального антитела согласно настоящему изобретению является высокое сродство к РсгУ. Константу диссоциации, которую применяют в качестве показателя сродства антитела для моноклонального антитела, можно измерить разными способами. Например, можно с легкостью провести анализ по способу Скатчарда с применением антигена, меченного разными веществами для мечения, или посредством применения коммерческого набора для измерения В1асоге X (поставляемый компанией Атегзйат Рйагтааа) или аналогичного набора в соответствии с инструкциями по применению и протоколом экспериментов, прилагаемыми к набору. Оценку активности связывания можно проводить в соответствии с способом ЕЬРЗА (твердофазный иммуноферментный анализ), ИФА (иммуноферментный анализ), РИА (радиоиммунный анализ) или анализа флуоресценции антител. Константу диссоциации (значение КО), определяемую при помощи такого способа, выражают в единицах М (моль). Чем ниже константа диссоциации тестируемого моноклонального антитела, тем более высоким сродством обладает тестируемое антитело. Что касается моноклонального антитела согласно настоящему изобретению или части указанного антитела, константа диссоциации (КО) с РсгУ составляет 2х10^-9 (М) или меньше, а более предпочтительно 1,2 х10^-9 (М) или меньше.

Моноклональное антитело, соответствующее настоящему изобретению, предпочтительно должно содержать вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, включая гипервариабельный участок СОК.1, который содержит следующую последовательность аминокислот δΕΤδΥνΜΗ (8ЕО ГО №: 15);

- 4 021101 ί'ΌΚ2. который содержит следующую последовательность аминокислот ΙΝΡδΝΟΚΤΝΥΝΕΚΡΝΤ (8ЕЦ ΙΌ №: 16); СЭР3. который содержит следующую последовательность аминокислот ΥΟΝΥνΥΥΤΜΌΥ (8ЕЦ ΙΌ №: 17) и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, включая гипервариабельный участок СПРЕ который содержит следующую последовательность аминокислот δΑδΤδνδΥΜΕ (8ЕЦ ΙΌ №: 18): ί'ΌΕ2. который содержит следующую последовательность аминокислот ΤΤδΚΕΑδ (δΕΟ ΙΌ №: 19); СЭКЗ. который содержит следующую последовательность аминокислот ΗΟνΡΝΥΡΕΤ (δΕΟ ΙΌ №: 20).

Что касается последовательности участка СОК, настоящее изобретение включает также модифицированный участок с добавлением, вставкой, заменой или делецией одной или нескольких аминокислот по меньшей мере в одном СОК из трех вышеперечисленных СОК, при условии, что биологическая активность (например, сродство, ингибирование цитотоксичности или подобное), требующаяся в соответствии с настоящем изобретением, будет сохранена.

В качестве предпочтительного аспекта настоящего изобретения можно назвать гуманизированную версию моноклонального антитела, обладающего требуемыми свойствами. Гуманизированное моноклональное антитело получают посредством трансплантации гипервариабельного участка (СОК) антитела млекопитающего, отличного от человека, например, мыши, на СОК антитела человека. Следовательно, каркасный участок (РК) получают из антитела человека. Подходящий каркасный участок (ΤΚ) можно выбрать в соответствии с документами КаЬа! Е.А. с1 а1. РК можно выбирать таким образом, чтобы СОК мог образовать соответствующий антиген-связывающий сайт. При необходимости аминокислоту в РК вариабельной области можно заменить таким образом, чтобы СОК преобразованного гуманизированного антитела мог образовать соответствующий аниген-связывающий сайт (δηΙο.Κ. с1 а1., Сапсег Ке8. 1993, νοί. 53. р. 851). В указанном случае описываемые выше этапы можно повторить.

Также известен общий способ получения гуманизированного моноклонального антитела (например, νθ 95/14041 и νθ 96/0257 и др.). В частности, последовательность ДНК, кодирующую вариабельную область, созданную для соединения СОК антитела мыши с РК антитела человека, синтезируют посредством ПЦР (полимеразно-цепной реакции) из нескольких олигонуклеотидов, созданных так, чтобы они содержали перекрывающиеся участки на своих концах (см. νθ 98/13388). Полученную ДНК соединяют с ДНК, кодирующей константную область антитела человека, и образующуюся в результате ДНК встраивают в вектор экспрессии. В качестве альтернативы, ДНК, кодирующую вариабельную область антитела, можно вводить в вектор экспрессии, содержащий ДНК, кодирующую константную область антитела. Чтобы получить антитело, соответствующее настоящему изобретению, ген антитела можно ввести в вектор экспрессии, для экспрессии под контролем регуляторной области, например, энхансера/промотора. Затем, клетки хозяина трансформируют с применением указанного вектора экспрессии, и они, таким образом, могут вырабатывать антитело. В качестве клеток хозяина можно перечислить клетки позвоночных, такие как клетки СΟδ или СНО, клетки прокариот или дрожжей.

Для экспрессии гена антитела тяжелую цепь (Н-цепь) или легкую цепь (Ь-цепь) антитела можно по раздельности встраивать в векторы экспрессии, и клетку хозяина можно трансформировать указанными векторами экспрессии, или ДНК, кодирующую Н-цепь и Ь-цепь, можно встраивать в одиночный вектор экспрессии для трансформации клетки хозяина полученным в результате вектором экспрессии (см. νθ 94/11523).

Подходящие трансформанты, полученные посредством способов, описанных ранее, можно культивировать посредством способов, известных специалистам. Посредством указанного культивирования гуманизированное моноклональное антитело против Ρ^ν получают в трансформантах или за пределами клеток. Среду для культивирования можно должным образом выбрать из традиционных сред в зависимости от клеток хозяина. Для описываемых выше клеток СΟδ существуют такие среды как ΡΡΜΙ-1640, модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (ΌΜΕΜ), и при необходимости можно добавлять ингредиенты сыворотки, такие как фетальная бычья сыворотка (ΡΒδ). Температуру для культивирования трансформантов не ограничивают, при условии, что не происходит серьезного снижения способности к выработке белка в клетке. Предпочтительной является температура 32-42°С. Более предпочтительна температура 37°С. При необходимости культивирование можно проводить в атмосфере, содержащей диоксид углерода 1-10% (о/о).

Фракции, содержащие гуманизированное антитело против Ρ^ν согласно настоящему изобретению, полученные в трансформантах или вне клеток при помощи способов, описанных ранее, можно очищать при помощи известных способов разделения. Указанные способы основаны на физических свойствах или химических свойствах целевого белка. В частности, можно применять, например, обработку веществом, осаждающим белки, хроматографию, такую как ультрафильтрация, размерно-эксклюзионная хроматография, хроматография с абсорбционной фильтрацией, ионообменная хроматография, аффинная хроматография или высокоэффективная жидкостная хроматография, диализ и их сочетания.

В соответствии с ранее описанными способами желательное гуманизированное моноклональное антитело против Ρ^ν можно с легкостью получить с высоким выходом и высокой степенью чистоты. Последовательности аминокислот вариабельной области оптимизированных антител приведены под номерами δΕΟ ΙΌ: № 27 на фиг. 15 и δΕΟ ΙΌ: 28 на фиг. 16. Указанные антитела были сконструированы путем прививки к антителу человека полных аминокислотных последовательностей СОК и частичных

- 5 021101 последовательностей РК, которые определены для гуманизации моноклонального антитела 1Р3.

По сравнению с антителом мыши (1Р3), полученным с применением клеток гибридомы, указанное гуманизированное антитело (Й1Р3) обладает эквивалентной активностью ингибирования цитотоксичности. Хотя гуманизация антитела с сохранением активности исходного антитела обычно затруднена, авторам настоящего изобретения удалось получить гуманизированное антитело, обладающее активностью, эквивалентной активности исходного антитела мыши. Гуманизированное антитело можно применять в лечебных целях за счёт более низкой антигенности такого антитела в организме человека.

Что касается гуманизированного антитела согласно настоящему изобретению - доступна константная область антитела человека. Что касается предпочтительной константной области антитела человека, для тяжелой цепи можно перечислить Су и можно применять Су1, Су2, Су3 и Су4, а для легкой цепи можно перечислить Ск и СХ. Дополнительно С-область антитела человека можно модифицировать в целях повышения стабильности антитела или его продуктивности. При гуманизации доступное антитело человека может принадлежать к любому изотипу, например, 1§С, 1дМ, 1дА, 1дЕ или 1§ϋ. Что касается настоящего изобретения, предпочтительно 1§С и еще более предпочтительно 1§С1 и 1дС4.

Гуманизированное моноклональное антитело согласно настоящему изобретению может быть конъюгированным антителом, которое получают путем конъюгации с какой-либо молекулой, такой как полиэтиленгликоль (ПЭГ), радиоактивное вещество или токсин. Указанные конъюгированные моноклональные антитела получают путем химической модификации антитела. Способы модификации антител известны в данной области техники. Гуманизированное моноклональное антитело согласно настоящему изобретению включает в себя указанные конъюгированные моноклональные антитела.

Гуманизированное моноклональное антитело согласно настоящему изобретению можно соединять с другими белками через сайт на Ν-конце или С-конце гуманизированного моноклонального антитела (СНшса1 Сапсег Кекеагсй, 2004, 10, 1274-1281). Специалисты в данной области техники могут выбрать подходящие белки для присоединения.

Гуманизированное моноклональное антитело согласно настоящему изобретению может быть таким антителом, у которого повышена активность ингибирования цитотоксичности. Указанные антитела включают, например, антитело с удаленной фукозой, антитело, конъюгированное с разветвляющим Νацетилглюкозамином через его углеводную цепь (С1сNАс), или антитело, у которого активность связывания с Рсу-рецептором изменена путем замены остатка аминокислоты в области Рс. Указанные антитела можно получить посредством способов, которые известны специалистам в данной области техники.

В отношении настоящего изобретения фраза часть моноклонального антитела относится к области, которая является частью упомянутого выше антитела согласно настоящему изобретению и обладает способностью к специфическому связыванию с РсгУ подобно указанному моноклональному антителу (в дальнейшем именуется просто фрагмент антитела).

В частности, можно перечислить РаЬ (фрагмент, связывающий антиген), Р(аЬ')2, РаЬ', одноценочечное антитело (одноцепочечный Ρν; далее именуемый 5сРу). стабилизированное дисульфидными связями антитело (стабилизированный дисульфидными связями Ρν, далее именуемый άδΡν), фрагмент димеризованной вариабельной области (далее именуемый диателом), содержащий белки СЭР, обладающий способностью к специфическому связыванию с РсгУ человека (Ехрей ορίηίοη оп Шегареийс раЮпК νοί. 6, Νο. 5, р. 441-456, 1996).

РаЬ представляет собой фрагмент антитела, обладающий молекулярной массой приблизительно 50000, со способностью связывать антиген, состоящий приблизительно из половины Н-цепи (со стороны Ν-конца) и целой Ь-цепи, полученных путем расщепления с участием фермента папаина части пептида выше двух дисульфидных связей (8-8 связь), сшивающих две Н-цепи в шарнирной области 1§С. РаЬ, применяемый в настоящем изобретении, можно получить путем обработки моноклонального антитела папаином согласно настоящему изобретению. В качестве альтернативы РаЬ можно получить путем встраивания ДНК, кодирующей РаЬ моноклонального антитела согласно настоящему изобретению, в вектор экспрессии для клетки и путем введения указанного вектора в клетку, чтобы вызвать экспрессию.

Р(аЬ')₂ представляет собой фрагмент антитела, обладающий молекулярной массой приблизительно 100000 со способностью связывать антиген, образованный путем связывания двух областей РаЬ' в шарнирной части. Указанные области РаЬ' получают путем расщепления с участием пепсина ниже двух 8-8 связей шарнирной области 1§С. Р(аЬ')₂, применяемый в настоящем изобретении, можно получить путем обработки пепсином моноклонального антитела согласно настоящему изобретению, В качестве альтернативы Р(аЬ')₂ можно получить путем встраивания ДНК, кодирующей Р(аЬ')₂ указанного моноклонального антитела, в вектор экспрессии для клетки и путем введения указанного вектора в клетку Ε^οΐί, дрожжей или животного, чтобы вызвать экспрессию.

РаЬ' представляет собой фрагмент антитела, обладающий молекулярной массой приблизительно 50000, со способностью связывать антиген, полученный путем разрыва 8-8-связи между шарнирными областями упоминаемого выше Р(аЬ')2. РаЬ', применяемый в настоящем изобретении, можно получить путем обработки Р(аЬ')2 моноклонального антитела согласно настоящему изобретению восстановителем, например, дитиотреитолом. В качестве альтернативы Р(аЬ') можно получить путем встраивания ДНК,

- 6 021101 кодирующей Р(аЬ') указанного моноклонального антитела, в вектор экспрессии для клетки и путем введения указанного вектора в клетку Е.соН, дрожжей или животного, чтобы вызвать экспрессию.

8сРу представляет собой пептид УН-Р-УЪ или УЪ-Р-УН, в котором одна цепь УН и одна цепь УЪ соединены посредством пептидного линкера (в дальнейшем именуемый Р), и является фрагментом антитела, обладающим антигенной активностью. УН и УЪ, содержащиеся в 8сРу, применяемом в настоящем изобретении, можно получить из моноклонального антитела согласно настоящему изобретению. 8сРу, применяемый в настоящем изобретении, можно получить посредством получения ДНК, кодирующей УН и УЪ, из гибридомы, вырабатывающей моноклональное антитело, соответствующее настоящему изобретению, конструирования вектора экспрессии 8сРу и индуцирования экспрессии путем введения указанного вектора экспрессии в клетку Е.соН. дрожжей или животного, чтобы вызвать экспрессию.

Термин άδΡν относится к молекуле, полученной путем связывания δ-δ связью полипептидов, в каждом из которых по одному остатку аминокислоты в УН в УЪ заменено на остаток цистеина. Аминокислоту, которую следует заменить остатком цистеина, можно выбрать на основании предсказания четвертичной структуры антитела при помощи способа, предложенного Кейет с1 а1. (Рго1с1п Епдшеегшд, 7, 697 (1994)). УН или УЪ, содержащиеся в άδΡν, применяемом в настоящем изобретении, можно получить из моноклонального антитела согласно настоящему изобретению. άδΡν, применяемый в настоящем изобретении, можно получить посредством получения кДНК, кодирующей УН или УЪ, из гибридомы, вырабатывающей моноклональное антитело согласно настоящему изобретению, конструирования вектора экспрессии άδΡν и индуцирования экспрессии путем введения указанного вектора экспрессии в клетку Е.соН, дрожжей или животного.

Диатело представляет собой фрагмент антитела, в котором образуется димер δсΡνδ, обладающий такой же или отличной специфичностью связывания антигена, и является фрагментом антитела, обладающим бивалентной активностью связывания антигена в отношении связывания одного и того же антигена или активностью а отношении связывания двух антигенов, специфичного для разных антигенов. Например, бивалентное диатело, которое реагирует с той же специфичностью, что и моноклональное антитело согласно настоящему изобретению, можно получить посредством получения кДНК, кодирующей УН или УЪ моноклонального антитела согласно настоящему изобретению конструирования ДНК, кодирующей δсΡν, содержащего пептидный линкер из 3-10 остатков, встраивания указанной ДНК в вектор экспрессии для клетки и индуцирования экспрессии диатела путем введения полученного вектора экспрессии в клетку Е.соН, дрожжей или животного.

Пептид, содержащий СЭР, включает по меньшей мере один участок СОК из УН или УЪ. Можно соединять несколько СОК напрямую или через подходящий пептидный линкер. Пептид, содержащий СОК, применяемый в настоящем изобретении, можно получить путем получения кДНК, кодирующей УН или УЪ моноклонального антитела согласно настоящему изобретению, конструирования ДНК, кодирующей СОК, встраивания указанной ДНК в вектор экспрессии для клетки животного и индуцирования экспрессии путем введения полученного вектора экспрессии в клетку Е.соН, дрожжей или животного. Пептид, содержащий СОК, также можно получить путем химического синтеза, например, по способу Ртос (способ с применением флуоренилметоксикарбонила) или по способу 1Вос (способ с применением ΐ-бутилоксикарбонила).

Моноклональное антитело согласно настоящему изобретению или часть указанного антитела можно модифицировать настолько, насколько это применимо в настоящем изобретении. В качестве модифицированного вещества можно применять антитела в форме, связанной с разными молекулами, включая полиэтиленгликоль (ПЭГ) или подобные. Модификации, производимые с антителом, могут включать модификацию путем введения химической связи или модификацию, производимую с последовательностью аминокислот антитела. Моноклональное антитело, согласно настоящему изобретению, или часть указанного антитела также включают указанные вещества, модифицированные с применением антитела. Для получения таких веществ, модифицированных с применением антитела, полученное антитело можно модифицировать. Такие методики уже разработаны в технике.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи или вариабельную область легкой цепи гуманизированного моноклонального антитела (Н1Р3) согласно настоящему изобретению. Предпочтительно, полинуклеотид согласно настоящему изобретению имеет последовательность оснований, соответствующую δερ ΙΌ: 29 или 30. Также настоящее изобретение включает полинуклеотид, который может гибридизоваться с указанным полинуклеотидом в строгих условиях и кодирует антитело, обладающее активностью, эквивалентной активности антитела согласно настоящему изобретению.

Полинуклеотид согласно настоящему изобретению представляет собой полимер, состоящий из нуклеотидов, таких как несколько дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК) или рибонуклеиновых кислот (РНК), который кодирует антитело согласно настоящему изобретению. Нуклеотиды могут включать основания, отличные от тех, которые образуются в природе. Полинуклеотид согласно настоящему изобретению также можно применять в качестве зонда при скрининге антител, обладающих активностью, эквивалентной активности антитела согласно настоящему изобретению. Так, посредством применения в качестве зонда полинуклеотида, кодирующего антитело согласно настоящему изобретению или часть ука- 7 021101 занного антитела, применяя методику, такую как гибридизация или способ амплификации генов, например, ПЦР, можно получить ДНК, которая гибридизуется с указанным полинуклеотидом в жестких условиях и кодирует антитело, обладающее активностью, эквивалентной активности антитела согласно настоящему изобретению. Такие ДНК также включены в понятие полинуклеотида согласно настоящему изобретению.

Методика гибридизации (8атЬгоок, I е! а1., Мо1еси1аг. С1отпд 2пб еб., 9.47-9.58, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬ. ргекк, 1989) хорошо известна специалистам в данной области техники. Условия гибридизации могут, например, представлять собой нежесткие условия. Термин нежесткие условия означает, что этап отмывки после гибридизации проводят с применением 0,1х88С (раствор цитрата и хлорида натрия), содержащего 0,1% 8Ό8 (додецилсульфат натрия) при 42°С, предпочтительно 0,1х88С, содержащего 0,1% 8Ό8 при 50°С. Более предпочтительные условия гибридизации - это очень жесткие. Термин очень жесткие условия означает, например, применение 0,5х88С, содержащего 0,1% 8Ό8 при 65°С. Предполагается, что при данных условиях с более высокой температурой можно эффективно получать полинуклеотид с более высоким сходством. Среди факторов, влияющих на жесткость гибридизации, можно перечислить несколько факторов, такие как температура или концентрация солей. Специалисты могут должным образом выбрать указанные факторы и достичь сходной жесткости.

Антитела, функционально эквивалентные антителу согласно настоящему изобретению обычно обладают высоким сходством по последовательности аминокислот. Указанные антитела кодируются полинуклеотидами, которые получают путем описанной выше гибридизации или методик амплификации генов. Антитела, которые функционально эквивалентны антителу согласно настоящему изобретению и обладают высоким сходством с ним по последовательности аминокислот, включены в настоящее изобретение. Высокая степень сходства означает сходство последовательности аминокислот по меньшей мере более чем на 50%, предпочтительно более чем на 75%, а еще более предпочтительно сходство более чем на 85% и более, чем на 95%. Для определения сходства полипептида можно применять алгоритм, описанный в указанном документе (АПЬиг, А. I. апб Ыртап, Ό. I. Ргос. №!1. Асаб. 8сг И8А (1983) 80,726730).

Моноклональное антитело согласно настоящему изобретению или часть указанного антитела можно применять в виде фармацевтической композиции. Следовательно, фармацевтическую композицию, содержащую моноклональное антитело согласно настоящему изобретению, и часть указанного антитела, можно вводить системно или местно пероральным или парентеральным путем. Для парентерального введения можно выбрать, например, внутривенные инъекции, такие как капельное введение, внутримышечные инъекции, внутрибрюшинные инъекции, подкожные инъекции, интраназальное введение, ингаляцию или подобные пути. Однако поскольку известно, что Ркеиботопак аегидшока обычно вызывает поражение клеток эпителия легких и макрофагов легочных альвеол, инфицируя дыхательные пути (Т. 8а^а е! а1, №!иге Мебюше, 1999, уо1. 5, р. 392), желательны интраназальный путь введения и ингаляции.

Фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению вводят в качестве лекарственного средства пациенту, страдающему фиброзным кистозом или инфекцией, вызванной Ркеиботопак аегидшока. Например, эффективную дозу выбирают в диапазоне от 0,01 до 100 мг на 1 кг массы тела на один прием. В качестве альтернативы можно выбрать дозу от 1 до 1000 мг, предпочтительно дозу от 5 до 50 мг для одного пациента. Однако доза фармацевтической композиции, содержащей моноклональное антитело согласно настоящему изобретению или часть указанного антитела, не ограничивается указанными дозами. Длительность введения можно выбрать должным образом в зависимости от возраста, симптомов или подобных характеристик пациента. Фармацевтическая композиция, соответствующая настоящему изобретению, также может включать фармацевтически приемлемую основу или вспомогательное вещество, также в зависимости от пути введения.

Примеры таких основ и вспомогательных веществ включают воду, фармацевтически приемлемый органический растворитель, коллаген, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, альгинат натрия, водорастворимый декстран, пектин, метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, казеин, диглицерид, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, вазелин, альбумин сыворотки человека (Н8А), маннитол, сорбитол, лактозу и поверхностно-активные вещества, разрешенные в качестве фармацевтических вспомогательных веществ. Вспомогательное вещество для применения выбирают должным образом или создают сочетания из перечисленных выше веществ в зависимости от лекарственной формы, но не ограничиваясь ими.

Способ получения моноклонального антитела мыши против РсгУ можно объяснить на следующих Справочных примерах.

Справочный пример 1. Для проведения сравнительного эксперимента МаЬ166 (Заявка на патент Японии № 2005-500250 или подобные) получали в виде рекомбинантного антитела.

Сначала выделяли мРНК из гибридомы, которая вырабатывает антитело, по классификации относящееся к подклассу ^О2а, и клонировали константные области Н-цепи и Ь-цепи методом ОТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскрипцией). Каждый фрагмент, амплифицированный посредством ПЦР, встраивали в сайт Ше1-№Н вектора рс^NА3.1 (+) (поставляемого компанией 'Тпуйгодеп Согрогайоп), и далее встраивали сайт множественного клонирования, для обеспечения возможности встраивания фрагмента

- 8 021101

ДНК вариабельной области.

Затем, после расщепления последовательности гена Н-цепи и Ь-цепи вариабельной области МаЫбб на четыре части, синтезировали их смысловую ДНК и антисмысловую ДНК, и отжигали их. После отжига фрагменты подвергали связыванию с ДНК-лигазой и проводили клонирование в область М1с1-В1р1 для Н-цепи и в область ЕсоКУ-В81А1 для Ь-цепи.

Векторы Н-цепи и Ь-цепи, обладающие идентифицированной последовательностью оснований, вводили в клетки НЕК 239Т при помощи Липофектамина 2000 (поставляемого компанией Ппуйтодеп Сотротайоп), и через 48 ч отбирали надосадочную жидкость культуры. Отобранный из надосадочной жидкости после культивирования клеток рекомбинантный МаЫбб очищали при помощи колонки с белком-0 (поставляемой компанией РЕКСЕ).

Справочный пример 2. Получение антигена.

Экстрагировали хромосомную ДНК стандартного штамма Ркеийотопак аетидшока РАО1, предоставленного Университетом Токаи, Япония, и ген, кодирующий белок РсгУ (5>ЕО ГО №: 2), амплифицировали посредством ПЦР, применяя в качестве матрицы указанную ДНК. Сайт распознавания фермента рестрикции §рЫ находился на праймере 5'-конца, а сайт распознавания фермента рестрикции ΗίπάΙΙΙ находился на праймере З'-конца, (5>ЕО ГО №: 3, 4), и при встраивании в вектор экспрессии был выбран такой дизайн, чтобы цистеин встраивался между гистидиновой меткой и стартовым кодоном для мечения биотином. Фрагмент, амплифицированный в ходе ПЦР, клонировали в вектор рАЕ30 (поставляемый компанией 0Е НеаЕНсаге) в сайтах §рЫ и ΗίηάΙΙΙ. После секвенирования указанный вектор вводили в клетки Е.соП 1М109 и получали рекомбинантные Е.соП. (РсгАМ109). РстУ-!М109 культивировали в 500 мл жидкой среды Лурия-Бертани с ампициллином при температуре 37°С, и когда ОЭб00 (оптическая плотность на длине волны 600 нм) достигала 0,5, добавляли 200 мкл 0,1 М изопропилтиогалактозида (ИПТГ). После культивирования в течение дополнительных 1,5 часов при 37°С клетки бактерий центрифугировали и добавляли 15 мл буфера А (25 мМ трис-НС1 (рН 8,0), 0,5 М ЫаС1, 2 мМ МдС1₂), содержащего 0,5% лизоцима (поставляемого компанией §1§ша). После инкубации в течение 30 минут при 0°С клетки подвергали действию ультразвука. После центрифугирования получали растворимую фракцию, пропускали ее через колонки Ηίδ-Βίηά (поставляемые компанией Ыоуадеп) и затем элюировали с буфером В (20 мМ фосфатный буфер (рН 7,4), 500 мМ ЫаС1), содержащим 200 мМ имидазола. Конечную элюированную фракцию подвергали диализу против 10 мМ фосфатного буфера (рН 7,4), с заменой указанного буфера.

Мечение антигена биотином

Белку РсгУ, экспрессированному и очищенному, как было описано выше, давали прореагировать в растворе меркаптоэтиламина с конечной концентрацией 10 мМ при 37°С в течение 150 мин в целях восстановления остатков цистеина. Биотин, активированный ПЭО-малеинимидом (поставляемый компанией РГЕКСЕ), добавляли в таком количестве, чтобы мольное соотношение к восстановленным §Н-группам было 20:1, и давали прореагировать в течение ночи при 4°С, а затем проводили диализ, чтобы удалить непрореагировавший биотин.

Иммунизация антигеном

Каждые 20 мкг антигена РсгУ с полным адьювантом Фрейнда вводили внутрибрюшинно семи самкам мышей Ва1Ь/с в возрасте 4 недель. Реиммунизацию проводили путем введения 20 мкг РсгУ с неполным адъювантом Фрейнда через 14 и 35 дней. Далее конечную иммунизацию проводили через 77 дней путем внутрибрюшинного введения 20 мкг РсгУ и введения в хвостовую вену 10 мкг РсгУ.

Получение гибридомы

Селезенку извлекали хирургическим путем через 3 дня после конечной иммунизации и отбирали клетки селезенки. Проводили слияние клетки селезенки и клетки лимфомы мыши (р3хб3-А§8.Ш, лаборатория исследования опухолей Токио) при помощи 50% полиэтиленгликоля 4000 и проводили их селекцию на питательной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин.

Селекция антител против РсгУ

Через 8 дней после слияния клеток проводили скрининг клеток, вырабатывающих специфические антитела. В каждую лунку в микропланшете на 9б лунок (поставляемом компанией Ыипс) добавляли 200 мкл трис-буфера (50 мМ трис-НС1, рН 7,5), содержащего 2 мкг антитела против Ι§0 мыши (поставляемого компанией 5>1иЬауащ). и осуществляли иммобилизацию в течение 1б ч при 4°С. Указанные лунки двукратно промывали 300 мкл промывочного раствора (физиологический раствор, содержащий 0,1% Т\\ееп 20), затем добавляли 300 мкл В1оскАсе (поставляемый компанией ЭаППрроп ЗипитоЮ РЬатта Со, Ый.) и оставляли на два часа при комнатной температуре. После двукратного промывания каждой лунки 300 мкл промывочного раствора 50 мкл надосадочной жидкости из культуры гибридомы разбавляли 150 мкл буфера С (50 мМ трис-буфера, рН 7,б, содержащего 0,9% хлорида натрия, 0,05% азида натрия, 0,5% бычьего сывороточного альбумина, 0,1% Т\\ееп 80 и 25 мкМ диэтилентриаминаΝ,Ν,Ν',Ν'',Ν''-пентауксусной кислоты) и добавляли в каждую лунку, давали прореагировать в течение ночи при 4°С. После трехкратного промывания 300 мкл промывочного раствора добавляли 200 мкл буфера С, содержащего 10 нг меченного европием стрептавидина (поставляемого компанией РЕККШ ЕЬМЕК), добавляли 25 нг меченного биотином РсгУ и давали прореагировать в течение 1 ч при комнат- 9 021101 ной температуре. После протекания реакции и трехкратного промывания 300 мкл промывочного раствора добавляли 200 мкл стимулирующего реагента (1,39 г/л фталата калия, 19,3 мг/л три-поктилфосфиноксида, 4,59 мг/л 2-нафтоилтрифторацетона, 1,0 г/л Тритона-X100, 6,0 г/л уксусной кислоты) и измеряли флуоресценцию с разрешением во времени.

На основании результатов скрининга были отобраны 20 клонов гибридомы, которые проявляли высокое сродство к рекомбинантному РсгУ, и в соответствии с примером 4 оценивали активность ингибирования цитотоксичности, вызываемой Ркеиботопак аегидшока. В результате активность ингибирования цитотоксичности обнаружили у 10 клонов, и указанные клоны затем двукратно клонировали при помощи способа серийных разведений, и таким образом проводили селекцию клеток гибридомы. Из полученных 10 клонов отобрали 4 клона, проявляющие высокую активность интибирования цитотоксичности, и их назвали 1Р3, 2А4, 6Р5 и 7А7 соответственно. Для указанных антител подкласс антитела определяли при помощи набора ЕЬРЗА для изотипирования моноклональных антител мыши (поставляемого компанией ВИ Вю8С1епее8), и было показано, что 1Р3 является 1д02а, 2А4 является 1д02Ъ, 6Р5 является 1д02а, и 7А7 является 1д02а.

Клетки гибридов, которые вырабатывают моноклональные антитела 1Р3 и 2А4, были архивированы в Национальном институте прогрессивной промышленной науки и технологии, Международном депозитарии запатентованных организмов (Центр №6, 1-1-1, Хигаши, Тсукубаши, ИБАРАДЖИ, ЯПОНИЯ) 15 января 2009 г., с номерами доступа РЕКМ АВР-11805 и РЕКМ АВР-11806, соответственно.

Справочный пример 3. Связывающая активность антитела.

Для измерения связывающей активности антител (1Р3, 2А4, 6Р5, 7А7) применяли конкурентный иммуноанализ. В каждую лунку микропланшета на 96 лунок (поставляемый компанией Иипс) добавляли 100 мкл трис-буфера (50 мМ трис-НС1, рН 7,5), содержащего 1,5 мкг антитела против 1д0 мыши (поставляемый компанией .Тасккоп 1ттипоге8еагсй), и осуществляли иммобилизацию в течение 16 ч при 4°С. Указанные лунки двукратно промывали 300 мкл промывочного раствора, затем добавляли 300 мкл В1оскАсе (поставляемый компанией Иашрроп §ит1то1о Рйагта Со, ЬЙ), включающего 10% сахарозу, и оставляли на два часа при комнатной температуре, чтобы достичь блокирования (планшет с твердой фазой с антитела против 1д0 мыши). После двукратного промывания каждой лунки 300 мкл промывочного раствора добавляли 2 нг/лунку каждого антитела и немеченого РсгУ в пяти концентрациях в сериях 10-кратного разведения, начиная с 500 нг/лунку. Затем добавляли 5 нг/лунку РсгУ, связанного с биотином, и давали смеси прореагировать в течение ночи. После четырехкратного промывания 300 мкл промывочной жидкости и добавления 100 мкл/лунку стимулирующего реагента (поставляемого компанией ^Уа11ак) и после перемешивания в течение 1 мин измеряли флуоресценцию с разрешением во времени. В результате 1Р3, 2А4, 6Р5 и 7А7 продемонстрировали более высокую активность связывания с РсгУ, чем МаЪ166 (фиг. 1).

Далее сродство 1Р3, 2А4, 6Р5, 7А7 и МаЪ166 к РсгУ определяли способом поверхностного плазменного резонанса. Антитело против иммуноглобулина мыши иммобилизировали на сенсорном чипе СМ5 при помощи набора для захвата антител мыши (поставляемого компанией В1АСОРЕ). Затем осуществляли захват каждого антитела к РсгУ. Рскомбинантный РсгУ загружали в инструмент В1Асоге Т100 с сенсорным чипом для определения сродства.

В результате каждый клон демонстрировал более высокое сродство, чем МаЪ166, что подтверждалось значением сродства 3,7х10^-10для 1Р3, 3,5х10^-10 для 2А4, 1,1х10^-10 для 6Р5 и 1,1х10^-9 для 7А7, в отличие от значения сродства для МаЪ166, равного 3,0х 10^-9 (фиг. 2).

Справочный пример 4. Иммунологический сэндвич-анализ с МаЪ166.

Чтобы показать, что 1Р3, 2А4, 6Р5 и 7А7 обладают эпитопами, отличными от эпитопа МаЪ166, сравнивали результаты сэндвич-анализа для каждого из указанных антител и МаЪ166.

Сначала МаЪ166 метили биотином. 100 мкг МаЪ166 и 7,853 мкг Х-гидроксисукцимид-ПЭО₄биотина (поставляемого компанией Р1ЕКСЕ) смешивали в 0,1М фосфатом буфере (рН 7,4) и давали прореагировать в течение 2 ч на льду. Затем для удаления непрореагировавшего биотина из реакционной смеси проводили гель-хроматографию (колонка Ο20008\ν (поставляемая компанией ТОЗОН)).

Иммунологический сэндвич-анализ проводили следующим образом. В каждую лунку микропланшета на 96 лунок (поставляемого компанией Иипс) добавляли 100 мкл раствора фосфатного буфера (-), в каждой аликвоте содержалось по 500 мкг антитела против РсгУ (1Р3, 2А4, 6Р5, 7А7) и осуществляли иммобилизацию в течение 16 ч при 4°С. Указанные лунки однократно промывали 300 мкл промывочного раствора (физиологический раствор, содержащий 0,01% Т\\ееп 20), затем добавляли 300 мкл В1оскАсе (поставляемый компанией Иа1шрроп ЗипитоЮ Рйагта Со. ЬЙ) и оставляли на два часа при комнатной температуре, чтобы достигнуть блокирования. После двукратного промывания каждой лунки 300 мкл промывочного раствора добавляли 100 мкл буфера для анализа (поставляемого компанией \Уа11а.к). содержащего 50 мкг РсгУ и 50 нг меченного биотином МаЪ166 и давали прореагировать в течение ночи при 4°С. После четырехкратного промывания промывочным раствором добавляли 100 мкл буфера для анализа, содержащего 50 нг меченного европием стрептавидина (поставляемого компанией ^Уа11ак) и давали прореагировать в течение 1 ч при комнатной температуре. После трехкратного промывания про- 10 021101 мывочным раствором и добавления 100 мкл стимулирующего реагента перемешивали в течение 1 мин и затем измеряли флуоресценцию с разрешением во времени.

В результате было показано, что иммунологический сэндвич-анализ возможен между 1Р3, 2А4, 6Р5, 7А7 и МаЫ66, и таким образом выявили, что указанные антитела обладают эпитопами, отличными от эпитопа МаЫ66 (фиг. 3).

Справочный пример 5. Измерение активности ингибирования цитотоксичности.

Активность ингибирования цитотоксичности измеряли для 1Р3, 2А4, 6Р5 и 7А7. Способ измерения был следующий.

Сначала 1Р3, 2А4, 6Р5, 7А7 разводили с получением серий двукратных разведений, начиная с 32 мкг/мл, и в каждую лунку микропланшета на 96 лунок наливали по 10 мкл. Далее клетки миеломы мыши Р3И1 (из Американской коллекции типовых культур) приводили к концентрации 5х10⁶ клеток/мл, или лейкоциты линии И937 (из Американской коллекции типовых культур) приводили к концентрации 1 х 10⁶ клеток/мл при помощи питательной среды для культивирования клеток (КРМ11640, содержащая гидрокарбонат натрия и не содержащая феноловый красный (поставляемая компанией Сигма)), и каждые 100 мкл суспензии клеток добавляли в микропланшет на 96 лунок. Далее штамм §К24 РзеиДотоиаз аегидшоза, культивированный в течение ночи в среде Мюллера-Хинтона, скорректированной по содержанию катионов (ОгГсо), приводили к концентрации 1 х 10⁸ КОЕ/мл при помощи питательной среды для культивирования клеток, добавляли в количестве 10 мкл/лунку и культивировали в течение 3 ч при 37°С в присутствии 5% СО₂. После перемешивания в течение 3 ч в каждую лунку добавляли 10 мкл νδΤ-8 (поставляемого компанией Кзз1ййа Сйетюа1 Со., НФ) и культивировали при 37°С в присутствии 5% СО₂ - в течение 3 ч в случае клеток миеломы Р3И1 и в течение 1 часа в случае клеток И937. После завершения культивирования измеряли поглощение на длине волны 450 нм.

В результате в случае применения лейкоцитов И937 активность ингибирования цитотоксичности (1С₅₀) составила 5,3 нМ для антитела 1Р3, 20,7 нМ для 2А4, 12,7 нМ для 6Р5 и 14,7 нМ для 7А7, а для антитела МаЫ66 - более 213 нМ; при применении клеток миеломы И3Р1 активность ингибирования цитотоксичности (1С₅₀) составила 4,0 нМ для антитела 1Р3, 16 нМ для 2А4, 7,3 нМ для 6Р5 и 6,0 нМ для 7А7, а для антитела МаЫ66 - 54 нМ. То есть 1Р3, 2А4, 6Р5 и 7А7 обладали более высокой активностью ингибирования цитотоксичности в отношении обоих типов клеток, чем МаЫ66, которое было описано ранее (Ргапк е1 а1., Тйе 1оигпа1 оГ 1пГесйоиз О1зеазез, 2002, уо1. 186, р. 66) (фиг. 4 и 5).

Справочный пример 6. Получение процессированного РсгУ.

Процессированный РсгУ (136-233) получали следующим образом. Фрагмент, амплифицированный посредством ПЦР с праймером 5'-конца ССТССАССАТСССААСССССТСАСССС (8ЕЦ ГО №: 5) и праймером З'-конца СТТААССТТСТССААССССТАСТС (8ЕЦ ГО №: 6) с применением в качестве матрицы рЦЕ30-РсгУ, который является плазмидой для экспрессии антигена РсгУ, обрабатывали ферментами рестрикции ВатН1 и НшйШ и встраивали в рЕТ32Ь (поставляемый компанией №уадеп). После секвенирования вектор вводили в клетку штамма Е. сой ВЬ21ГОЕ3 и получали рекомбинантную Е.сой (процессированный РсгУ-ВЬ21). Указанный экспрессирующий штамм культивировали в течение одного дня и ночи при 37°С в 2 мл жидкой среды Лурия-Бертани с ампициллином. 2 мл культуральной жидкости из прекультуры добавляли к 500 мл жидкой среды Лурия-Бертани с ампициллином и культивировали при 37°С, и когда ΟΌ600 достигала значения 0,5, культуральную жидкость оставляли еще на 30 мин на льду. Добавляли ИПТГ для получения конечной концентрации 0,75 мМ и культивировали в ротационном шейкере при скорости вращения 160 об/мин при 15°С в течение одного дня и ночи. Клетки бактерий отбирали посредством центрифугирования культуральной жидкости при 4°С, скорости вращения 5000д в течение 30 мин. Надосадочную жидкость удаляли, а к гранулам добавляли 10 мл буфера X (25 мМ ТрисНС1 (рН 7,5), 150 мМ №С1, 2 мМ МдС1₂), содержащего 0,1% лизоцима (поставляемого компанией Сигма) и суспендировали, оставляя еще на 1 час на льду, а затем обрабатывали ультразвуком при охлаждении на льду. Затем растворимую фракцию загружали в колонку, заполненную №-№ГА агарозой (Цшадеп), и элюировали с применением буфера Υ (25 мМ Трис-НС1 (рН 7,5), 150 мМ №С1, 200 мМ имидазола). Элюированную фракцию подвергали диализу с применением 10 мМ фосфатного буфера (рН 7,4).

Определение области эпитопа

В каждую лунку микропланшета на 96 лунок (поставляемого компанией №пс) добавляли 150 мкл трис-буфера (50 мМ трис-НС1, рН 7,5), содержащего 1,5 мкг Рс антитела против 1дС мыши (поставляемого компанией Ласкзоп 1ттипогезеагсй), и иммобилизировали в течение 16 ч при 4°С. Указанные лунки двукратно промывали 300 мкл промывочного раствора (физиологический раствор, содержащий 0,1% Т\\ееп 20), затем добавляли 300 мкл блокирующего раствора (500 мМ трис- НС1, рН 7,5,2% В1оскАсе (поставляемый компанией Оаийрроп ЗииитоЮ Рйагта Со, НФ'), 10% сахарозы) и оставляли на два часа при комнатной температуре, чтобы произошло блокирование каждой лунки (планшет с иммобилизованным антителом против 1дС мыши). После однократного промывания каждой лунки 300 мкл промывочной жидкости в каждую лунку добавляли 50 мкл раствора антител против РсгУ, разведенного до концентрации 80 нг/мл буфером С (50 мМ трис-буфера, содержащего 0,9% хлорида натрия, 0,05% азида натрия,

- 11 021101

0,5% бычьего сывороточного альбумина, 0,01% Т\\ееп 80 и 25 мкм диэтилентриамина-Ν,Ν,Ν',Ν'',Νпентауксусной кислоты, рН 7,6), затем добавляли 20 мкл раствора Еи-меченного стрептавидина (поставляемого компанией РЕРКШ ЕЬМЕР), разведенного до концентрации 200 нг/мл буфером С, 100 мкл процессированного белка РсгУ, разведенного до нужной концентрации буфером для анализа ИЕЬР1А, и давали прореагировать в течение ночи при 4°С. После трехкратного промывания 300 мкл промывочного раствора добавляли 200 мкл стимулирующего реагента (1,39 г/л фталата калия, 19,3 мг/л три-иоктилфосфиноксида, 4,59 мг/л 2-нафтоилтрифторацетона, 1,0 г/л Тритона-Х100, 6,0 г/л уксусной кислоты) и измеряли флуоресценцию с разрешением во времени (фиг. 6).

В результате антитела против РсгУ 1Р3, 2А4, 9Ό12, 12Н9 и т166, производимое компанией Ка1оВюк РЕагтасеиДса1к, 1пк., применяемое в качестве сравнительного образца, проявляли реакционную способность в отношении полноразмерного РсгУ (1-294). С другой стороны, хотя 1Р3 и 2А4 демонстрировали реакционную способность в отношении РсгУ (136-233), т166, а также 9Ό12 и 12Н9 не обладали нейтрализующей активностью и не демонстрировали реакционной способности.

Также проводили анализ связывания посредством вестерн-блоттинга. Очищенный рекомбинантный белок РсгУ наносили на δΌδ-РАОЕ (полиакриламидный гель с додецилсульфатом натрия) и затем переносили на мембрану из ПВДФ. Указанную мембрану блокировали при помощи В1оскАсе (поставляемый компанией Оаийрроп ЗипитоЮ РЕагта Со, Ый.) при комнатной температуре в течение 2 ч при встряхивании. Раствор антител против РсгУ, разведенный до концентрации 1 мкг/мл, добавляли на мембрану, давали прореагировать в течение ночи при 4°С и затем промывали промывочным буфером В (10 мМ фосфатного буфера (рН 7,4), 0,05% Т\\ееп 20). В качестве вторичного антитела на мембрану дополнительно наносили раствор меченного антитела против 1дО мыши (поставляемого компанией ОЕ НеаЕЕсаге), и ему давали прореагировать в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем мембрану промывали промывочным буфером В и считывали сигнал при помощи системы детекции для вестерн-блоттинга ЕСЬ Р1ик (поставляемой компанией ОЕ НеаЕЕсаге), визуализировали результаты при помощи прибора ЬАЗ-1000 (поставляемого компанией РиЛИЬМ) (фиг. 7). Хотя нейтрализующие РсгУ антитела 1Р3 и 2А4 реагировали и с полноразмерным, и с процессированным РсгУ, т166, а также 6Р5 и 7А7 реагировали только с полноразмерным РсгУ и не реагировали с процессированным РсгУ.

Данный факт демонстрирует, что область эпитопа для нейтрализации РсгУ антителами 1Р3 и 2А4 является областью, которая соответствует остаткам аминокислот 136-233, а антитела 6Р5 и 7А7 исключительно не обладают областью эпитопа, соответствующей остаткам аминокислот 136-233.

Справочный пример 7. Корреляция между специфичной областью белка РсгУ и интенсивностью цитотоксичности.

Тест на активность подавления цитотоксичности антителами 1Р3, 2А4 и т166 проводили следующим образом при помощи полноразмерного белка РсгУ (8ЕО ГО №: 1) и процессированного белка РсгУ (обладающего последовательностью аминокислот, соответствующей положениям 136-233 (8ЕО ГО №: 1).

Сначала 1Р3, 2А4 и т166 разводили путем последовательных двукратных разведений, начиная с концентрации 200 нМ, 200 нМ и 400 нМ, соответственно, и 10 мкл раствора каждого антитела добавляли в планшет на 96 лунок. В указанном тесте диапазон концентраций 1Р3, 2А4 и т166 приводили к 1,566,25 нМ, 6,25-25 нМ и 50-200 нМ соответственно. Для каждого тестируемого диапазона концентраций в планшет на 96 лунок добавляли по 10 мкл полноразмерного белка РсгУ и процессированного белка РсгУ в мольных отношениях 30, 10, 3, 1 и 0,3 и оставляли еще на 30 минут при комнатной температуре. Далее клетки миеломы Р3Ш приводили к концентрации 5х10⁶ клеток/мл посредством питательной среды (РРМ11640, содержащей гидрокарбонат натрия и не содержащей Ь-глутамин и феноловый красный (поставляемой компанией Сигма)) и добавляли их в объеме 70 мкл в каждую лунку микропланшета на 96 лунок. Затем жидкую культуру бактерий Ркеийотоиак аегидшока (штамм ЗР24), культивируемую в течение ночи в среде Мюллера-Хинтона (Эйсо), концентрацию клеток в которой приводили к 1х10⁸ КОЕ/мл при помощи питательной среды для клеток, добавляли в количестве 10 мкл/лунку и культивировали в течение 3 ч при 37°С в присутствии 5% СО₂. Спустя 3 ч в каждую лунку добавляли 10 мкл νδΤ-8 (поставляемого компанией Как1ййа СЕетюа1 Со., Ый.) и культивировали при 37°С в присутствии 5% СО₂ в течение 3 ч. После окончания культивирования измеряли поглощение на длине волны 450 нм.

В результате, когда белок РсгУ не добавляли, 1Р3 и 2А4 проявляли более высокую активность ингибирования цитотоксичности, чем т166. С другой стороны, когда добавляли полноразмерный белок РсгУ, эффекты ингибирования антител против РсгУ угнетались с зависимостью от дозы РсгУ (фиг. 8). Когда добавляли процессированный белок РсгУ, активность ингибирования антителами 1Р3 и 2А4 также угнеталась с зависимостью от дозы, а активность ингибирования антителом т166, которое не обладает указанным эпитопом, не изменялась (фиг. 9).

На основании данных результатов можно предположить, что антитела, распознающие эпитоп в положении 136-233 остатков аминокислот (1Р3 и 2А4), обладают более высокой активностью ингибирования цитотоксичности, чем антитела, не распознающие указанный эпитоп (т166). Иными словами, можно заключить, что активность ингибирования цитотоксичности зависит от области эпитопа, распознаваемой антителом против РсгУ, и антитело, которое реагирует только с областью 136-233 в белке РсгУ, обладает

- 12 021101 высокой нейтрализующей активностью.

Справочный пример 8. Анализ последовательности аминокислот в моноклональном антителе мыши против РсгУ человека (1Е3 и 2А4).

Из клеток стандартной гибридомы экстрагировали РНК при помощи набора РБсаху Μίηί (поставляемого компанией риЬАОЕЫ). Из 1 мкг экстрагированной РНК амплифицировали фрагмент ДНК при помощи Системы для быстрой амплификации концов кДНК 5'КАСЕ, версия 2.0 (поставляемой компанией ’Тпуйтодеп). На этом этапе для синтеза кДНК применяли следующие праймеры:

ТАСАСТСАСССАССАСССАСТТСТ (8ЕО ГО №: 7) для 1Е3 и ТССАСАСТТССААСТСАСАСТСАС (8ЕО ГО №: 8) для 2А4. При реализации способа 5КАСЕ применяли праймеры АССССССАСТССАТАСАС ССАТСССССТСТ (8ЕО ГО №: 9) для 1Е3 и АССССССАСТССАТАСАСТСАТСССССТСТ (8ЕО ГО №: 10) для 2А4. Амплифицированные фрагменты клонировали при помощи набора для клонирования ТОРО ТА (поставляемого компанией 1пу|1годеп) и секвенировали при помощи генетического анализатора АррНеб Βίο8у81еш8 3130 (поставляемого компанией АррНеб Вю5У51ет5). Результаты анализа для 1Е3 показаны на фиг. 10, а для 2А4 - на фиг. 11. В результате поиска гомологии последовательностей аминокислот вариабельной области с применением базы данных последовательностей аминокислот в антителах Последовательности белков, представляющих интерес для иммунологии (Министерство здравоохранения и социального обеспечения США, 1983 г.) полученной от КаЬаЕ было выяснено, что гипервариабельным участком вариабельной области тяжелой цепи антитела 1Е3 являются 8ЕТ8У\УМН (8ЕО ГО №:15), 1\Р8\С.НТ\У\ЕКЕ\Т (8ЕО ГО №:16) и ¥С.\¥\\'¥¥Т\ГО¥ (8ЕО ГО №:17); гипервариабельным участком вариабельной области легкой цени указанного антитела являются §А8Т8У8УМЕ (8ЕО ГО №:18), ТТ8КЬА8 (8ЕО ГО №:19) и НОХУРБУРЕТ (8ЕО ГО №:20). Результат поиска, проведенного аналогичным образом для 2А4, показал, что гипервариабельным участком вариабельной области тяжелой цепи антитела 2А4 являются 81Т81)¥Л\\'\ (8ЕО ГО №:21), ¥1Т¥\С.1)Т8¥\Р8ЕК8 (8ЕО ГО №:22) и 8ΚΝΥΥСА\ЕАУ (8ЕО ГО №:23), и что гипервариабельным участком вариабельной области легкой цепи указанного антитела являются КЛ8О¥УС.ТТ\% (8ЕО ГО №:24), КА8ТКНТ (8ЕО ГО №:25) и ОО¥С88РРТ (8ЕО ГО №:26).

Настоящее изобретение более конкретно объясняется при помощи следующих неограничивающих примеров. В качестве методики получения антител применяли способы, описанные в 1ттипосНет151гу ίη РгасНсе (В1аск\\е11 8аепНПс РиЬНсаНоп5), если не указано другое. В качестве методики генной инженерии применяли способы, описанные в С1ошп§: А ЬаЬога1огу Мапиа1, 2'¹ ЕбПюп (Со1б 8ртш§ НагЬог ЬаЬога1огу), если не указано другое.

Пример 1.

(1) Гуманизация моноклонального антитела мыши 1Е3.

Для гуманизации моноклонального антитела мыши (1Е3), полученного как описывалось выше, СОК из антитела мыши встраивали в акцепторную последовательность человека зародышевого типа.

В частности, для поиска акцепторной последовательности человека зародышевого типа, демонстрирующей максимальную гомологию с последовательностью аминокислот области \-гена как легкой, так и тяжелой цени антитела мыши, применяли программу 1§ВЬА8Т (НирРЛхлхлу.псЬгпЬп.доу/щЬкМ/). Для области 1-гена выбирали последовательности с высокой степенью гомологии с последовательностью ДНК антитела мыши из 1МСТ (Иммуногенетическая база данных) (ННрУ/1т§Есше5.й7).

В результате поиска получили название гена из 1МСТ: 1СНУ1-46*01 как последовательность гена антитела, которая получена из акцепторной последовательности человека зародышевого типа и демонстрирует самую высокую гомологию с областью У-гена тяжелой цепи антитела мыши, и название гена по 1МСТ: 1СШ6*01 как последовательность гена антитела, которая получена из акцепторной последовательности человека зародышевого типа и демонстрирует самую высокую гомологию с областью 1-гена тяжелой цепи антитела мыши; указанные последовательности применяли в качестве каркасных последовательностей человека для встраивания тяжелой цепи. Аналогично получили название гена из 1МСТ: 1СКУ1-9*01 как последовательность гена антитела, которая получена из акцепторной последовательности человека зародышевого типа и демонстрирует самую высокую гомологию с областью У-гена легкой цепи антитела мыши, и название гена по 1МСТ: 1СК12*02 как последовательность гена антитела, которая получена из акцепторной последовательности человека зародышевого типа и демонстрирует самую высокую гомологию с областью 1-гена; указанные последовательности применяли в качестве каркасных последовательностей человека для встраивания легкой цепи.

Далее СОКН1, СОКН2 и СОКН3 тяжелой цепи и СОКЬ1, СОКЬ2 и СОКЬ3 легкой цепи антитела мыши характеризовали посредством нумерации последовательности аминокислот в соответствии с системой нумерации Кэбата (\и, Т.Т. и КаЬаЕ Е.А., 1. Ехр. Меб. Аид1;132(2):211-50.(1970)). Указанные области СОК встраивали в каркасные последовательности антитела человека, которые затем конструировали в качестве эталонного гуманизированного антитела. Различие между эталонным гуманизированным антителом, сконструированным таким образом, и последовательностью аминокислот в антителе мыши подтверждали в положениях последовательности аминокислот Н5, Н7, Н11, Н12, Н20, Н38, Н40, Н48, Н66, Н67, Н69, Н71, Н75, Н78, Н81, Н83, Н87, Н93, Н94, Н108, Ь1, Ь3, Ь9, Ь10, Ь11, Ь15, Ь17, Ь18, Ь19, Ь21, Ь40, Ь42, Ь43, Ь46, Ь70, Ь71, Ь72, Ь78, Ь79, Ь80, Ь83, Ь85 и Ь100 в соответствии с системой нуме- 13 021101 рации Хотия (СйоШа, С апб Ьекк, А.М., 1. Мо1. Вю1., 196:901-917, СйоШа, С е! а1., №11иге. 342: 877-883. (1989).

Для идентификации сайтов соматической мутации в антителе мыши проводили поиск последовательности аминокислот в области У-гена как тяжелой, так и легкой цепи антитела мыши при помощи 1дВЬА8Т и в результате получили название гена 1558.33 и название гена 1СКУ4-80*01, как последовательности с наивысшей степенью гомологии в отношении тяжелой и легкой цепи, соответственно. Последовательность аминокислот области Ό-гена тяжелой цепи антитела мыши искали при помощи Ι§ВЬА8Т и получили название гена: ΙΟΗΌ2-1*01 как последовательность с наивысшей степенью гомологии в отношении тяжелой цепи. Последовательность ДНК области 1-гена и тяжелой, и легкой цепи антитела мыши искали при помощи 1МСТ и получили название гена в 1МСТ: ЮН14*01 и название гена в 1МСТ ЮК14*01 как последовательности с наивысшей степенью гомологии в отношении последовательностей тяжелой и легкой цепи соответственно. Указанные последовательности мыши зародышевого типа сравнивали с антителом мыши, и остатки с разными боковыми цепями определяли как сайты соматических мутаций, и было подтверждено, что среди них Н93, Н94, Ь9 и Ь46 обладали боковыми цепями, различающимися у антитела мыши и эталонного гуманизированного антитела.

Было подтверждено, что Н71 и Н94 обладают каноническими боковыми цепями (1Шр.//\у\у\у.Ьюи1Г. ог§.ик/аЬ8/сйо!На.Ь!т1), различающимися у антитела мыши и эталонного гуманизированного антитела. Среди боковых цепей, различающихся у антитела мыши и эталонного гуманизированного антитела, расположенных в зоне Верньера (Роо!е е! а1., 1. Мо1. ВюЬ, 224.487(1992)), были Н48, Н67, Н69, Н71, Н78, Н93, Н94, Ь46 и Ь71. Не было идентифицировано ни одного остатка, обусловливающего упаковку между цепями, различающегося у антитела мыши и эталонного гуманизированного антитела. Все перечисленные результаты вместе позволили нам сконструировать мутантное гуманизированное антитело, в котором все боковые цепи аминокислот в положениях Н48, Н67, Н69, Н71, Н78, Н93, Н94, Ь9, Ь46 и Ь71 эталонного гуманизированного антитела были замещены боковыми цепями из антитела мыши (обратная мутация). Были сконструированы последовательности ДНК, в которых последовательность константной области 1§С4Рго человека конъюгирована в качестве константной области тяжелой цепи, а последовательность константной области 1§карра человека конъюгирована в качестве константной области легкой цепи вариабельных областей эталонного гуманизированного антитела, сконструированного как было описано выше (фиг. 12; эталон), и мутантного гуманизированного антитела (фиг. 12; обратная мутация). Каждую из последовательностей ДНК применяли для конструирования плазмиды, экспрессирующей тяжелую цепь эталонного гуманизированного антитела (фиг. 13; НТ), плазмиды, экспрессируюшей легкую цепь эталонного гуманизированного антитела (фиг. 13; ЬТ), плазмиды, экспрессирующей тяжелую цепь мутантного гуманизированного антитела (фиг. 13; НВ), или плазмиды, экспрессирующей легкую цепь мутантного гуманизированного антитела (фиг. 13; ЬВ) в соответствии со способом, описанным выше.

(2) Получение вектора для экспрессии генов антитела.

Сначала серии в положении 228 замещали пролином, чтобы предотвратить расщепление 8-8-связи в шарнирной области (Ап§а1 е! а1., 1993, Мо1. 1ттипо1. 30(1): 105-108, 8сйиигтап е! а1., 2001, Мо1. 1ттипо1. 38:1-8), а ДНК константной области 1§С4 делили на четыре части, для которых синтезировали смысловые и антисмысловые ДНК и отжигали их. Подвергнутые отжигу фрагменты сшивали при помощи ДНК-лигазы и встраивали в вектор рсЭХЛ3.1(+) (’Т^йгодеп) в сайтах ШеГШи. Также вводили сайт множественного клонирования так, чтобы можно было встроить фрагмент ДНК вариабельной области.

Далее последовательности генов тяжелых и легких целей вариабельной области гуманизированного антитела против РсгУ соответственно делили на четыре части, затем синтезировали их смысловые и антисмысловые ДНК и отжигали их. Подвергнутые отжигу фрагменты сшивали при помощи ДНК-лигазы и сшитые тяжелые и легкие цепи клонировали в участки МГе1/В1р1 апб ЕсоРУ/В81\1 соответственно. Далее подтверждали последовательности нуклеотидов антител.

Химерное антитело мыши-человека 1Р3 получали в качестве положительного контроля для оценки гуманизации антител. Последовательность константной области 1дС4Рго человека конструировали на вариабельном участке тяжелой цепи антитела мыши в качестве последовательности константной области тяжелой цепи, а плазмиду экспрессии конструировали при помощи способа, описанного выше, чтобы получить плазмиду, экспрессирующую тяжелую цепь химерного антитела мыши/человека (фиг. 13; Нхимера).

Последовательность ДНК конъюгированной последовательности константной областе 1д-карра человека конструировали на вариабельном участке легкой цепи антитела мыши в качестве последовательности константной области легкой цепи, а вектор экспрессии конструировали при помощи способа, описанного выше, чтобы получить плазмиду, экспрессирующую легкую цепь химерного антитела мыши/человека (фиг. 13; Ь-химера). Плазмиды, экспрессирующие тяжелую и легкую цепь, подвергали совместной трансфекции в клетки млекопитающих в культуре, применяя одну из комбинаций плазмид, экспрессирующих тяжелые и легкие цепи химерного антитела мыши/человека: плазмиды, экспрессирующие тяжелые и легкие цепи эталонного гуманизированного антитела; плазмиды, экспрессирующие тяжелую цепь эталонного гуманизированного антитела и легкую цепь мутантного гуманизированного

- 14 021101 антитела; плазмиды, экспрессирующие тяжелую цепь мутантного гуманизированного антитела и легкую цепь эталонного гуманизированного антитела, и плазмиды, экспрессирующие тяжелую цепь мутантного гуманизированного антитела и легкую цепь мутантного гуманизированного антитела. Надосадочную жидкость от каждой культуры применяли для определения сродства к антигену - рекомбинантному Ρ^ν способом поверхностного плазмонного резонанса (ΒIΑсο^еТ-100,ЖЕ Хелскэа) (фиг. 13).

Значение КО для химерного антитела мыши/человека, полученное при анализе сродства, составило 2,6х10^-10 М. Значение КО для антитела, включающего тяжелые и легкие цепи эталонного гуманизированного антитела, составило 2,2х10^-7 М; а значение для антитела, включающего тяжелую цепь эталонного гуманизированного антитела и легкую цепь мутантного гуманизированного антитела, составило 6,5х10^-7 М, что подтверждает, что сродство было значительно снижено. Напротив, значение КО для антитела, включающего тяжелую цепь мутантного гуманизированного антитела и легкую цепь эталонного гуманизированного антитела составило 3,3 х10^-10 М, а указанное значение для антитела, включающего тяжелую и легкую цепь мутантного гуманизированного антитела составило 3,4х10^-10 М, что указывает на то, что указанные антитела сохраняют сродство, близкое к сродству, характерному для химерного антитела мыши/человека. На основании данных результатов мы заключили, что тяжелая цепь мутантного гуманизированного антитела критична для сохранения сродства, а легкую цепь эталонного гуманизированного антитела или легкую цепь мутантного гуманизированного антитела можно применять, не изменяя сродства. Таким образом, для легкой цепи мы выбрали легкую цепь эталонного гуманизированного антитела, которая ближе к последовательности человека зародышевого типа. Для тяжелой цепи было получено гуманизированное антитело, в котором каждая из обратных мутаций в боковых цепях аминокислот в положениях Н48, Н67, Н69, Н71, Н78, Н93 и Н94 была обращена с получением последовательности человека зародышевого типа, соответственно, и сродство к антигену оценивали способом поверхностного плазмонного резонанса (фиг. 14). В результате гуманизированное антитело, в котором Вал в положении Н93 заменили на Ала, демонстрировало значение КО 1,0х10^-9 М, а гуманизированное антитело, в котором Лей в положении Н94 заменили на Арг, демонстрировало значение КО 3,2х10^-7 М. Хотя указанные антитела демонстрировали пониженное сродство, у других гуманизированных антител с обратными мутациями относительно последовательности человека зародышевого типа значимого снижения сродства не наблюдалось.

Указанные результаты позволили верифицировать последовательность гуманизированного антитела при помощи последовательности, полученных для антител мыши, для положений Н93 и Н94, и аминокислотной последовательности человека зародышевого типа для положений Н48, Н67, Н69, Н71 и Н78 (фиг. 15 и 16). Антитело, обладающее указанной последовательностью, получали при помощи способа, описанного ниже в (3), и его сродство подтверждали способом поверхностного плазмонного резонанса. В результате было подтверждено, что указанное антитело обладает таким же сродством, как и антитело мыши (фиг. 17).

(3) Получение рекомбинантного антитела.

Гены тяжелой и легкой цепи, полученные посредством способа, описанного выше, трансфецировали в клетки ΗΕΙ<293Ε при помощи Липофектамина 2000 (Ιηνίΐτο^η). Спустя 72 ч отбирали надосадочную жидкость у указанных клеток. Рекомбинантное антитело выделяли из отобранной надосадочной жидкости при помощи колонки с белком-0 (ΡIΕКСΕ).

Пример 2.

Тестирование активности ингибирования цитотоксичности проводили для т1Р3 (антитело мыши), Н1Р3 (гуманизированное антитело) и т166. Применяли следующий способ.

Сначала т1Р3, Н1Р3 и т166 разводили посредством последовательных двукратных разведений, начиная с концентрации 200, 200 и 800 нМ соответственно. Каждое разведение (10 мкл) добавляли в лунки микропланшета на 96 лунок. Далее клетки миеломы Р3И1 или клетки И937 приводили к плотности 5х 10⁶ клеток/мл или 1х10⁶ клеток/мл, соответственно, посредством питательной среды (ΡΡΜΠ640 (поставляемой компанией δίβΐηη Согрогайоп), содержащей гидрокарбонат натрия и не содержащей Ь-глутамин и феноловый красный) и добавляли их в объеме 70 мкл в каждую лунку микропланшета на 96 лунок. Затем жидкую культуру бактерий Ркеиботопак аегидшока (штамм δΡ24), культивируемую в течение ночи в среде Мюллера-Хинтона, скорректированной по содержанию катионов (Ойео), приводили к плотности 1 х 10⁸ КΟΕ/мл при помощи питательной среды для культивирования клеток, добавляли в количестве 10 мкл/лунку и культивировали в течение 3 ч при 37°С в атмосфере с 5% СО₂. Через 3 ч в каждую лунку добавляли 10 мкл νδΤ-8 (поставляемого компанией КЫнД) СНет1са1 Со., ЫД) и культивировали в течение 1 ч при 37°С в атмосфере с 5% СО₂. После окончания культивирования измеряли поглощение на длине волны 450 нм. Результаты показали, что активность ингибирования цитотоксичности (Ю₅₀) для т166 составила 98,4 нМ, а для т1Р3 и Н1Р3 составила 1,4 нМ и 1,5 нМ соответственно, когда применяли клетки И937 (фиг. 18), и для т166 составила 85,4 нМ, а для т1Р3 и Ь1Р3 составила 1,5 нМ и 1,3 нМ соответственно, когда применяли клетки миеломы (фиг. 19). Таким образом, активность ингибирования цитотоксичности т1Р3 и Н1Р3 была почти одинаковой и была выше, чем активность т166.

- 15 021101

Применимость в промышленности

Гуманизированное моноклональное антитело, соответствующее настоящему изобретению, или часть указанного антитела не только обладает высоким сродством к РсгУ, но также проявляет высокую активность в отношении ингибирования цитотоксичности, проявляемой Ркеиботоиак аегидшока в отношении клеток эукариот. Следовательно, фармацевтическую композицию, содержащую указанное моноклональное антитело или часть указанного антитела, можно применять в качестве лекарственного препарата при инфекции, вызываемой Ркеиботоиак аегидшока, которую в медицинской сфере в настоящее время считают трудноизлечимой.

5ециепсе_ьт зт1 лд_зиЬз1:тТиТе_165-29ЕА перечень последовательностей нуклеотидов и/или аминокислот (№ 201190163) <110> ШИОНОГИ и КО, ЛТД.

<120> ГУМАНИЗИРОВАННОЕ АНТИТЕЛО К РСКУ, ОБЛАДАЮЩЕЕ АКТИВНОСТЬЮ ПРОТИВ

ПСЕВДОМОНАС <130> ЮР00015ИО <160> 30 <170> Ратеппп версия 3.1 <210> 1 <211> 294 <212> ΡΒΤ <213> РзеиРотопаз аегидтпоза <400> 1

мет 1

б1и

уа1

Агд

АЗП 5

Теи

АЗЛ

А1а

А1а

Агд 10

б1и

Теи

Рйе

теи

АЗр 15

б!и

Ьеи

Теи

А! а

А1а

Бег

А1а

А1а

Рго

А1а

Бег

А1а

б1и

б1п

С1и

б1и

Теи

20

25

30

теи

д1а

теи

теи

Агд

Бег

б1и

Агд

Пе

Уа1

теи

А1а

Нт 5

А1а

б1у

б1п

35

40

45

Рго

Теи 50

5ег

б1и

А1а

б1п

Уа1 55

Теи

Туз

А! а

Теи

А1а 60

Тгр

Теи

ьеи

А1а

А1а

Азл

Рго

Бег

А1а

Рго

Рго

б1у

6ΐη

б1у

Теи

61 и

Уа1

ьеи

Агд

61 и

65

70

75

80

Уа1

Теи

б1п

А1а

Агд 85

Агд

61 η

Рго

б!у

А1а 90

61л

тгр

Азр

теи

Агд 95

61 и

рбе

теи

уа1

Бег

А1а

туг

Рйе

Бег

Теи

НТЗ

б! у

Агд

Теи

Азр

б1и

А5р

100

105

110

уа!

11 е

С1у

Уа1

туг

туз

Аэр

уа1

Теи

б!п

ТНг

61 η

Азр

б!у

туз

Агд

115

120

125

ьуз

д!а

теи

теи

Азр

б!и

Ьеи

Туз

а1 а

теи

тйг

А1а

б1и

Теи

Туз

Уа1

130

135

140

Туг

Бег

Уа1

Пе

б1п

5ег

с!л

11е

Азп

А1а

А1а

Теи

Бег

а! а

туз

6ΐη

145

150

155

160

61 у

Не

Агд

Пе

АЗР

А1а

б1у

б!у

Пе

АЗр

Теи

Уа1

Азр

Рго

ТНг

Теи

165

170

175

Туг

б!у

Туг

А1а

Уа1

б1у

Азр

Рго

Агд

Тгр

туз

Азр

Бег

Рго

б!и

Туг

180

185

190

раде 1

- 16 021101

А1а

ьеи

1_еи

5ег

Аз η

Ьеи

А5р

тКг

Рйе

5ег

61 у

Ьуз

Ьеи

Зег

Пе

ьуз

195

200

205

Азр

рКе 210

ьеи

зег

б!у

зег

РГО 215

1_У5

61 и

Зег

б!у

б1и 220

ьеи

ьуз

С1у

Ееи

5ег

Аьр

б!и

Туг

Рго

Рйе

61 и

ЬУ5

А5Р

А5П

Азп

Рго

Уа1

б!у

АЗП

РКе

225

230

235

240

А1а

тйг

ТЬг

Уа1

зег

А5р

Агд

зег

Агд

Рго

Ьеи

Аеп

А5р

Ьуз

Уа1

АЗП

245

250

255

С1и

Ьу5

тЬг

ТЬг 260

1_еи

1_еи

А5П

А5р

ТЬг 265

зег

Зег

Агд

туг

А5П 270

Зег

А1а

Уа1

б1и

А1а

|_еи

АЗП

Агд

рКе

Пе

6ΐη

Еуз

туг

Азр

зег

Уа1

|_еи

Агд

275

280

235

А5р Пе ьеи 5ег А1а Пе 290 <210> 2 <211> 885 <212> ДНК <213> РзеиОотопаБ аегидтпоаа <400> 2

аХддаадХса	дааассххаа	ХдссдсХсдс	дадсхдххсс	ХддасдадсХ	ссхддссдсд	60
тсддсддсдс	схдссадхдс	сдадсаддад	даасХдсхдд	сссхдХХдсд	садсдадсдд	120
ахсдхдсхдд	сссасдссдд	ссадссдсхд	адсдаддсдс	аадхдсхсаа	ддсдсхсдсс	180
тддххдсхсд	сддссаахсс	дхссдсдссх	ссддддсадд	дссхсдаддх	асхссдсдаа	240
дгсссдсадд	сасдхсддса	дсссддХдсд	садхдддахс	Хдсдсдадхх	ссхддхдХсд	300
дссХаХХХса	дссхдсасдд	дсдхсхсдас	даддахдхса	ХсддХдХсХа	сааддахдхс	360
сХдсадассс	аддасддсаа	дсдсааддсд	схдсхсдасд	адсхсааддс	дсхдассдсд	420
дадхсдаадд	ХсХасадсдХ	дахссадХсд	садахсаасд	ссдсдсхдхс	ддссаадсад	480
ддсахсадда	хсдасдсхдд	сддхахсдах	схддхсдасс	ссасдсхаха	хддсхахдсс	540
дгсддсдахс	ссаддхддаа	ддасадсссс	дадхахдсдс	хдехдадсаа	хсхддахасс	600
ххсадсддса	адсХдхсдаХ	сааддахххх	схсадсддсх	сдссдаадса	дадсддддад	660
сХсаадддсс	Хсадсдахда	дхассссххс	дадааддаса	асаасссддх	сддсааХХХс	720
дссассасдд	хдадсдассд	схсдсдхссд	схдаасдаса	аддхсаасда	даадассасс	780
схдсхсаасд	асассадсхс	ссдсхасаас	хсддсддхсд	аддсдсхсаа	ссдсххсахс	840
садааахасд	асадсдхссх	дсдсдасахх	схсадсдсда	хсхад		885

<210> 3 <211> 33

Раде 2

- 17 021101 <212> ДНК <213> праймер <400> 3 аххдсаСдса тддаадтхад ааасстсаат дсс 33 <210> 4 <211> 33 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <22О>

<223> праймер <400> 4 татттсдаад аТсТадсдсд астсттасад сдс 33 <210> 5 <211> 27 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 5 дсссдаддаХ сссааддсдс тдассдс 27 <210> 6 <211> 23 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <22О>

<223> праймер <400> 6 дгтаадсттс хсдаадддта ссс 23 <210> 7 <211> 24 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <22О>

<223> праймер <400> 7 тададтсасс даддадссад тгдх 24 <210> 8 <211> 24 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <22О>

<22 3> праймер <400> 8 сссададгес саадссасад ссас 24 <210? 9

Раде 3

- 18 021101 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 9 аддддссадг ддаТадассд аГддддстдт 30 <210> 10 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер <400> 10 аддддссадт ддаТадасТд аТдддддТдТ 30 <210> 11 <211> 121 <212> РКТ <213> искусственная последовательность <220>

<223> УН антитела 1РЗ <400> 11

б1п Уа1 с!п цеи 6ΐη

С1п Рго С1у А1а С1и 10

Ьеи Уа1

ьуь

Рго

б1у 15

А1а

1

5

5ег

Уа1

ЬУ5

1_еи

Бег

СУ5

ЬУ5

А1а

Бег

б1у

Туг

Бег

РИе

тЬг

Бег

Туг

20

25

30

Тгр

мег

ΗΪ 5

Тгр

Уа1

ЬУ5

6ΐη

Агд

Рго

б1у

с1п

б1у

1еи

61 и

Тгр

11е

35

40

45

61 у

б!и 50

Пе

А5П

Рго

Бег

А5П 55

б1у

Агд

Т1пг

А5П

Туг 60

А5П

61 и

иуэ

рпе

А5П

тЬг

1У5

А1а

тЬг

Ьеи

ТЬг

Уа1

Аэр

ТЬг

Бег

Бег

Бег

ТЬг

А1а

туг

65

70

75

80

МеТ

6ΐη

ьеи

Бег

Бег

цеи

ТНг

5ег

б1и

А5р

Бег

А1а

Уа!

туг

туг

СУ5

85

90

95

Уа1

ьеи

туг

О1у 100

А5П

Туг

уа!

Уа1

туг 105

туг

тЬг

мет

А5р

туг 110

тгр

с!у

б!п

б!у

тЬг

Бег

Уа1

тЬг

Уа!

5ег

Бег

115

120

<210> 12 <211> 109 <212> РИТ раде 4 <213> искусственная последовательность <220>

<223> VI. антитела 1рЗ <400> 12

с1л Пе Уа1 1

Ьеи

тНг οίη 5

Бег Рго ТНг 11е МеТ Бег А1а Бег Ьеи

С1у

10

15

С1и 01 и

11 е

ТНг

1_еи

тНг

Су5

Бег

А1а

Бег

ТНг

Бег

Уа!

Бег

Туг

ме!

20

25

30

01 и Тгр

Йг

<31п

01 п

ьуз

Бег

С1у 40

ТНг

Бег

Рго

ьуз

Пе 45

|_еи

Пе

Туг

ТНг ТНг

Бег

1-У5

Беи

Д1а

Бег

С1у

Уа!

РГО

Бег

Агд

РНе

Бег

С1у

Бег

50

55

60

С1у Бег

01 у

ТНг

РНе

Туг

Бег

1_еи

ТНг

Пе

Бег

Бег

Уа1

01 и

А1а

01 и

65

70

75

80

А5р А1а

А1а

А5Р

туг

туг

суз

ΗΪ 5

О1п

тгр

Агд

Азп

Туг

Рго

РНе

ТНг

85

90

95

РНе о!у

Бег

С1у 100

ТНг

иуз

ьеи

О1и

Не 105

1_уз

Агд

А1а

Азр

<210>

13

<211>

120

<212>

РКТ

<213>

искусственная последовательность

<22О>

<223>

УН антитела 2А4

<400>

13

Айр Уа1

Οίη

1еи

Οίη

01 и

Бег

01 у

Рго

01 у

1_еи

Уа1

ьуз

РГО

Бег

01 Л

1

5

10

15

Бег 1_еи

Бег

Беи

ТНг

суз

ТНг

Уа!

ТНг

О1у

туг

Бег

Пе

ТНг

Бег

АЗр

20

25

30

Туг д1а

Тгр 35

АЗП

Тгр

11 е

Агд

С1 п 40

РНе

Рго

О1у

А5П

ЬУ5 45

ьеи

с1и

тгр

Ме1 С1у

Туг

Не

ТНг

Туг

Азл

С1у

Аэр

ТНг

Бег

Туг

АЗП

Рго

Бег

Ьеи

50

55

60

Ьу5 5ег

Агд

11е

Бег

х1е

д1а

дгд

АЗР

ТНг

Бег

ЬУ5

АЗП

οίη

РНе

РНе

65

70

75

80

ьеи Οίη

Беи

А5П

Бег

уа!

тНг

тНг

С1и

А5р

ТНг

А1а

ТНг

Туг

Бег

Суз

85

90

95

Раде 5

- 20 021101

А1а б1у 5ег Агд Азп Туг Туг С1у АТ а тгр РНе л!а Туг Тгр с1у С1п 100 105 110

С1у тЬг 1еи \/а1 Тйг Уа1 5ег А1а 115 120 <210> 14 <211> 110 <212> РКТ <213> искусственная последовательность <220>

<22 3> VI. антитела 2а4 <400> 14

Авр 11е νβΊ мет тЬг с1п 5ег Нтв 1_ув РНе мет 5ег т(гг 5ег 11е б!у 15 10 15

Авр Агд

Уа1

5ег 20

Пе

А5П Туг |_у5

А1а 25

Вег 61 η Туг Уа1

61 у 30

ТЙГ

ТЬг

Уа1

А1а

Тгр

Туг

6ΐη

б!п

Ьу5

Вег

С1у

Ηΐ в

Вег

Рго

ьув

Ьеи

ьеи

П е

35

40

45

Туг

й’

А1а

5ег

ТНг

Агд

НТ 5 55

ТЬг

б!у

Уа1

Рго

А5Р 60

Агд

РЬе

тЬг

с!у

вег

б1у

вег

С1у

тЬг

А5р

РЬе

ТЬг

ьеи

А5П

Пе

вег

Азп

Уа1

61 η

Вег

65

70

75

80

С1и

Авр

ьеи

Д1а

АВр

Туг

РЬе

Сув

С1п

6ΐη

Туг

сув

вег

Вег

Рго

Деи

85

90

95

ТИг

РЬе

б1у

д!а

с!у

ТЬг

Туг

|_еи

С1и

Уа1

ьув

Агд

А1а

Авр

100

105

110

<210> 15 <211> 8 <212> РКТ <213> искусственная последовательность <22О>

<223> СОК1 тяжелой цепи 1рЗ <400> 15 вег Рпе тйг вег туг Тгр МеТ Нт 5 1 5 <210> 16 <211> 16 <212> РКТ <213> искусственная последовательность <220>

<223> сок 2 тяжелой цепи 1рЗ раде б

- 21 021101 <400> 16

Ιΐβ Αδη рго 5ег Αδη οΐγ Ага тНг Αδη Туг Αδη Οΐιι цуз РНе А5П ТНг 15 10 15 <210> 17 <211> 12 <212> РКТ <213> искусственная последовательность <22О>

<223> СОКЗ тяжелой цепи 1рЗ <400> 17

Туг С1у Αδη Туг Уа1 Уа1 Туг туг тНг мет А5р туг

10 <210> 18 <211> 10 <212> РКТ <213> искусственная последовательность <220>

<223> СОК1 легкой цепи 1гЗ <400> 18

5ег А1а 5ег ТНг 5ег Уа1 5ег Туг мет с!и 15 10 <210> 19 <211> 7 <212> РКТ <213> искусственная последовательность <220>

<223> сов 2 легкой цепи 1гЗп <400> 19

ТНг тНг 5ег Ьу5 1.еи А1а 5ег

5 <210> 20 <211> 9 <212> РКТ <213> искусственная последовательность <22О>

<223> СОКЗ легкой цепи 1гЗ <400> 20

Ηι5 01 η Тгр Агд Азл Туг Рго РНе ТНг 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> РКТ <213> искусственная последовательность

Раде 7

- 22 021101 <220> _ <223> С0К1 тяжелой цепи 2д4 <400> 21

5ег 13е ТЬг Бег Авр Туг АЗа Тгр Азп 1 5 <210> 22 <211> 16 <212> РКТ <213> искусственная последовательность <220>

<223> сок 2 тяжелой цепи 2а4 <400> 22 туг 11е тКг туг азп сЗу Авр тКг Бег туг абп рго Бег 1_еи цу5 Бег 15 10 15 <210> 23 <211> 11 <212> РКТ <213> искусственная последовательность <22О>

<223> СОКЗ тяжелой цепи 2а4 <400> 23

Бег Агд Абп Туг Туг сЗу А1а Тгр РЬе А1а Туг 15 10 <210> 24 <211> 11 <212> РКТ <213> искусственная последовательность <22О>

<223> СОК1 легкой цепи 2А4 <400> 24 цуз дЗа Бег еЗп туг УаЗ сЗу тКг тКг уа! дЗа 15 10 <210> 25 <211> 7 <212> РКТ <213> искусственная последовательность <220>

<223> С0К2 легкой цепи 2А4 <400> 25

Агд АЗа Бег тНг Агд ΗΪ5 тЬг

5 <210> 26 <211> 9 <212> ркт

Раде 8

- 23 021101 <213> искусственная последовательность <22О>

<223> сокЗ легкой цепи 2а4 <400> 26 с!п с!п туг суз Бег Бег Рго сеи тЬг 1 5 <210> 27 <211> 115 <212> РКТ <213> искусственная последовательность <22О>

<223> ун гуманизированного антитела <400> 27

С1п 1

Уа! о! η

сеи

Уа1 5

С! η

Бег

01у а! а С1и Уа! 10

Суз Суз Рго

б!у 15

А1а

Бег

Уа!

Ьуз

уа!

Бег

Суз

суз

а! а

Бег

О!у

туг

Бег

РЬе

ТЬг

Бег

Туг

20

25

30

Тгр

Мет

Н15

тгр

Уа!

Агд

С1п

а! а

РГО

С1у

с! η

С! у

|_еи

с! и

тгр

мет

35

40

45

б!у

С1и

11е

АЗП

Рго

Бег

АЗП

с1у

Агд

ТЬг

АЗП

Туг

АЗП

о! и

Суз

РЬе

50

55

60

АЗЛ

ТЬг

Агд

Уа!

ТЬг

мет

ТЬг

Агд

АЗр

ТЬг

Бег

тЬг

Бег

ТЬг

Уа1

туг

65

70

75

80

мет

С1и

сеи

Бег

Бег

|_еи

Агд

Бег

о! и

Азр

ТЬг

А1а

уа!

туг

туг

суз

85

90

95

Уа!

!_еи

туг

С! у

АЗП

туг

уа!

Уа!

Туг

Туг

ТЬг

МеТ

Азр

Туг

Тгр

с! у

100

105

110

С1п е1у ТЬг 115 <210> 28 <211> 107 <212> ΡΚΤ <213> искусственная последовательность <220>

<223> VI. гуманизированного антитела <400> 28

Азр Пе б1п Геи тЬг с1л Бег рго Бег рЬе сеи Бег А1а Бег Уа! б!у 15 10 15

А5р Агд Уа1 тЬг 11е тЬг суз Бег А1а Бег тЬг Бег Уа1 Бег туг Мег Раде 9

- 24 021101

20

25

30

01 и тгр

Туг 35

С1п

С1п

ЬУ5

Рго

С1у 40

ЬУ5

А1а

Рго

Ьу5

ьеи 45

Ьеи

Пе

Туг

тКг тКг 50

5ег

суя

ьеи

А1а

5ег 55

с!у

Уа1

Рго

5ег

Агд 60

рКе

5ег

о!у

5ег

С1у £ег 65

б1у

тКг

с!и

РКе 70

ТКг

Ьеи

ТКг

Не

5ег 75

5ег

ьеи

01 п

Рго

О1и 80

Аэр РКе

д1а

ТКг

Туг 85

Туг

Су 5

НТ 5

01 п

Тгр 90

Агд

А5П

туг

Рго

рКе 95

тКг

РКе б!у

б!п

е1у 100

тКг

ЬУ5

ьеи

С1и

11е 105

ьуз

Агд

<210> <211> <212> <213>

29 363 ДНК искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК, кодирующая область νΗ <400> 29

саддсдсааг	сддгдсадгс	Еддадссдад	дтдааааадс	саддадсТЬс	сдТаааадТа	60
адсьдтаадд	сссссдддга	гадссссасс	ссссастдда	гдсассдддт	тадасаадса	120
ссаддссадд	дсхтддадьд	да!дддсдад	атсаа^ссаТ	сгаагддсад	аасааастас	180
аасдадаад!	ЬсааГасЬад	адхдассаЕд	асгададаса	саадЕассЬс	сассдгдТаТ	240
атддадстдт	ссадсстдад	аадсдадда!	ассдссдьдт	ассастдсдт	дстдтасддд	300
аастасдгдд	сдгагтасас	аагддастаг	Хдддддсадд	дсасаассдТ	аассдтдадс	360
Тса						363

<210> 30 <211> 324 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> ДНК, кодирующая область νι.

<400> 30

дататссадс	Тсасасадад	тссатссттс	стдадсдсса	дсдЬсддсда	ссдддТаасТ	60
аЫассТдсТ	сТдсТТсаас	садсдТдТсс	Тасагддадс	ддтаьсааса	даадсссддс	120
ааддстссса	аасТсстдаТ	сТасастаса	ТссааасТдд	ссадсддддт	дсссадссдд	180
Исадсддаа	дТдддадТдд	аасададЫс	асассдасса	ЫЬССЬСССЬ	дсадссадад	240
дагстсдста	сстастатсд	ссатсадтдд	адааанасс	ссисассгс	сддасадддс	300
асааадстдд	адатсаадсд	тдст				324

Раде 10

- 25 021101

Claims (5)

1) вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью аминокислот δΕΟ ΙΌ №: 27 и

1) гипервариабельные участки вариабельной области тяжелой цепи, содержащие следующие последовательности аминокислот: δΡΤδΥνΜΗ (δΕΟ ГО №: 15) в ΟΌΚ1, ΙΝΡδΝΟΚΤΝΥΝΕΚΕΝΤ (δΕΟ ΙΌ №: 16) в ΟΌΚ2 и ΥΟΝΥνΥΥΤΜΌΥ (δΕΟ ΙΌ №: 17) в ΟΌΚ3, и

1. Гуманизированное моноклональное антитело против РсгУ или сохраняющая способность к специфичному связыванию РстУ часть указанного антитела, которое имеет:

2) вариабельную область легкой цепи с последовательностью аминокислот δΕΟ ΙΌ №: 28.

2. Гуманизированное моноклональное антитело против РсгУ или часть указанного антитела, которое имеет:

2) гипервариабельные участки вариабельной области легкой цепи, содержащие следующие последовательности аминокислот: δΛδΤδΥδΥΜΕ (δΕΟ ΙΌ №: 18) в ΟΌΚ1, ΤΤδΚΣΑδ (δΕΟ ΙΌ №: 19) в ΟΌΚ2 и ΗΟ\νΚΝΥΡΡΤ (δΕΟ ΙΌ №: 20) в ΟΌΚ3; и имеет по меньшей мере одно свойство, выбранное из (А)-(В):

(A) способностью к ингибированию 50% или более цитотоксичности, проявляемой Ркеиботопак аегидепока в отношении лейкоцитов, при концентрации антитела от 1 до 200 нМ ίη νίίτο;

(Б) способностью к ингибированию 50% или более цитотоксичности, проявляемой Ркеиботопак аегидепока в отношении клеток миеломы, при концентрации антитела от 1 до 50 нМ ίη υΠιό; и (B) константой диссоциации (Кб) с РсгУ, равной 2х 10^-9 (М) или менее.

3. Фармацевтическая композиция для лечения и/или предотвращения инфекции Ркеиботопак аегидепока, содержащая эффективное количество антитела или части антитела по п. 1 или 2, в качестве активного ингредиента.

4. Полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи или вариабельную область легкой цепи антитела по п. 1 или 2.

5. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по п.4.