CN118271446A - Rankl的抗体、抗原结合片段及其用途 - Google Patents
Rankl的抗体、抗原结合片段及其用途Info
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Abstract
本发明涉及RANKL抗体、抗原结合片段及其用途。具体提供靶向RANKL的抗体或其抗原结合片段,或与所述抗体或其抗原结合片段具有至少85%序列相同性并保留其RANKL结合活性的变体,所述抗体或其抗原结合片段能够特异性结合RANKL蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及生物学和医学领域,更具体地,本发明涉及一种特异性结合核因子κ B受体活化因子配体(Receptor Activator of Nuclear Factor-κ B Ligand,RANKL)的单克隆抗体、抗原结合片段以及包含所述单克隆抗体、抗原结合片段的药物、药物组合及其用途。
背景技术
核因子κB受体活化因子配体(RANKL),又称为肿瘤坏死因子配体超家族成员11(TNFSF11),在骨骼重塑,免疫调节以及乳腺发育等过程中发挥着重要作用。RANKL是Ⅱ型膜蛋白,主要表达在活化的T细胞、骨髓基质细胞以及成骨细胞上。游离形式的RANKL可通过蛋白酶酶解膜受体或mRNA替代剪切产生。与其它的TNFSF成员一样,无论是表达在细胞膜上或是游离在细胞外,RANKL均形成功能性三聚体。在骨骼重塑方面,RANKL是调控破骨细胞分化、融合、活化的关键性细胞因子,通过与表达于破骨细胞表面的RANK结合,使得受体三聚化,活化下游信号传导。在破骨细胞分化的各个阶段发挥重要作用,最终促进破骨细胞生成。RANKL的另一个天然配体是骨保护素(Osteoprotegerin, OPG),该蛋白主要由骨髓基质细胞以及成骨细胞分泌,作为诱饵受体阻断RANKL/RANK的结合。阻断RANKL与RANK的结合可有效抑制破骨细胞的生成,治疗骨质疏松。地舒单抗(Denosumab, 商品名 Prolia 或Xgeva)作为一款人源的特异性结合RANKL的单克隆抗体药物已于2010年获美国FDA批上市用于治疗绝经后妇女的骨质疏松症。该药物可显著降低患者的骨折风险,但治疗过程中可能出现低钙血症、免疫系统抑制等不良反应。在肿瘤治疗方面,靶向RANKL的抗体还可被用于治疗RANK阳性肿瘤以及阻止肿瘤转移引起的溶骨型病变。已有临床研究显示地舒单抗在前列腺癌患者以及肺癌患者的治疗中可显著提高总生存率。因此开发新型的具有更好效用和安全性的抗RANKL抗体药物具有重要意义和价值。
发明内容
本发明第一方面提供一种靶向RANKL的抗体或其抗原结合片段,或与所述抗体或其抗原结合片段具有至少85%序列相同性并保留其RANKL结合活性的变体。
在一个或多个实施方案中,所述抗体阻断RANKL与RANK的结合。
在一个或多个实施方案中,所述抗体的重链可变区VH包含(1)SEQ ID NO:1或SEQID NO:9所示的序列,或(2)与(1)具有至少85%序列相同性的序列。
在一个或多个实施方案中,所述抗体的轻链可变区VL包含(1)SEQ ID NO:5或SEQID NO:10所示的序列,或(2)与(1)具有至少85%序列相同性的序列。
在一个或多个实施方案中,所述抗体包含:SEQ ID NO:1所示的重链可变区的3个HCDR,和/或SEQ ID NO:5所示的轻链可变区的3个LCDR。
在一个或多个实施方案中,所述抗体的HCDR1包含SEQ ID NO:2或与其具有至少85%序列相同性的序列。
在一个或多个实施方案中,所述抗体的HCDR2包含SEQ ID NO:3或与其具有至少85%序列相同性的序列。
在一个或多个实施方案中,所述抗体的HCDR3包含SEQ ID NO:4或与其具有至少85%序列相同性的序列。
在一个或多个实施方案中,所述抗体的LCDR1包含SEQ ID NO:6或与其具有至少85%序列相同性的序列。
在一个或多个实施方案中,所述抗体的LCDR2包含SEQ ID NO:7或与其具有至少85%序列相同性的序列。
在一个或多个实施方案中,所述抗体的LCDR3包含SEQ ID NO:8或与其具有至少85%序列相同性的序列。
在一个或多个实施方案中,所述抗体包含:SEQ ID NO:2所示的HCDR1、SEQ ID NO:3所示的HCDR2、SEQ ID NO:4所示的HCDR3,和/或所述抗体包含:SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2、SEQ ID NO:8所示的LCDR3。
在一个或多个实施方案中,所述抗体的重链可变区包含鼠源或人源重链FR区。
在一个或多个实施方案中,所述抗体的轻链可变区包含鼠源或人源轻链FR区。
在一个或多个实施方案中,所述抗体的重链可变区的FR1、FR2、FR3和FR4各自分别独立选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:9中任一所示的重链可变区的FR1、FR2、FR3和FR4,和/或,所述抗体的轻链可变区的FR1、FR2、FR3和FR4各自分别独立选自SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:10中任一所示的轻链可变区的FR1、FR2、FR3和FR4。
在一个或多个实施方案中,所述抗体包含:
SEQ ID NO:1所示的VH和SEQ ID NO:5所示的VL,
SEQ ID NO:1所示的VH和SEQ ID NO:10所示的VL,
SEQ ID NO:9所示的VH和SEQ ID NO:5所示的VL,或
SEQ ID NO:9所示的VH和SEQ ID NO:10所示的VL。
在一个或多个实施方案中,所述抗体还包含重链恒定区和/或轻链恒定区。
在一个或多个实施方案中,所述抗体的重链包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区或与其具有至少85%序列相同性的序列。或,所述抗体的轻链包含人源κ链、λ链的轻链恒定区或与其具有至少85%序列相同性的序列。
在一个或多个实施方案中,所述抗体的重链包含人源IgG1的重链恒定区或与其具有至少85%序列相同性的序列,轻链包含人源κ链的轻链恒定区或与其具有至少85%序列相同性的序列。
在一个或多个实施方案中,所述抗体是单克隆抗体。
在一个或多个实施方案中,所述抗体是嵌合抗体或完全人抗体。
本发明还提供一种融合蛋白或抗体偶联物,其包含本文所述抗体或其抗原结合片段。优选地,所述抗体偶联物是抗体药物偶联物(ADC)。
本发明还提供多核苷酸,选自:
(1)本文任一实施方案所述抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、或抗体偶联物的编码序列;
(2)(1)的互补序列。
本发明还提供一种核酸构建物,其包含本文任一实施方案所述的多核苷酸。
在一个或多个实施方案中,所述核酸构建物是载体,例如整合载体、克隆载体或表达载体。
本发明还提供含本文任一实施方案所述抗体或其抗原结合片段的噬菌体或包含该噬菌体的文库。
在一个或多个实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段展示于所述噬菌体表面。
本发明还提供一种宿主细胞,其:
(1)表达和/或分泌本文任一实施方案所述抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、或抗体偶联物;
(2)包含本文所述的多核苷酸;和/或
(3)包含本文所述的核酸构建物。
在一个或多个实施方案中,所述宿主细胞选自原核细胞或真核细胞。
在一个或多个实施方案中,所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
本发明还提供一种产生抗体或其抗原结合片段的方法,包括:在适合产生抗体或其抗原结合片段的条件下培养本文所述的宿主细胞,和任选的从培养物中纯化所述抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供一种药物组合物,包含本文所述抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、抗体偶联物、多核苷酸、核酸构建物、噬菌体或宿主细胞,和药学上可接受的辅料。
在一个或多个实施方案中,所述辅料是运载体、稀释剂或赋形剂。
在一个或多个实施方案中,所述药物组合物用于预防和/或治疗RANKL相关疾病。所述疾病收益于抑制破骨细胞生成。
在一个或多个实施方案中,所述RANKL相关疾病包括骨质疏松症。
在一个或多个实施方案中,所述骨质疏松症包括原发性骨质疏松症和继发性骨质疏松症。
本发明还提供本文任一实施方案所述抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、抗体偶联物、多核苷酸、核酸构建物或宿主细胞在制备用于预防或治疗疾病的药物中的用途。所述疾病收益于抑制破骨细胞生成。
在一个或多个实施方案中,所述疾病是骨质疏松症。
本发明还提供一种治疗或预防疾病的方法,所述方法包括给予需要的患者治疗有效量的本发明任一实施方案所述的抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、抗体偶联物或药物组合物。所述疾病收益于抑制破骨细胞生成。
在一个或多个实施方案中,所述疾病是骨质疏松症。
本发明还提供一种检测RANKL的试剂盒,用于评估药物治疗效果,所述的试剂盒包含本文任一实施方案所述抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、抗体偶联物、多核苷酸、核酸构建物、噬菌体或宿主细胞。
在一个或多个实施方案中,所述试剂盒还包括用于检测RANKL与抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、或抗体偶联物的结合的试剂。例如通过酶联免疫反应法检测所述结合的试剂。
在一个或多个实施方案中,所述检测结合的试剂是能与抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、或抗体偶联物连接的可检测标记物,例如生物素。所述的可检测标记物被连接于所述抗体或其抗原结合片段或分离地存在于试剂盒中。
本发明还提供一种检测样品中RANKL存在情况的非诊断性方法,所述方法包括:以本文任一实施方案所述抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、或抗体偶联物与样品孵育,和检测RANKL与抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、或抗体偶联物的结合,从而确定样品中RANKL存在情况。所述检测是酶联免疫反应法检测。
本发明还提供本文任一实施方案所述抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、或抗体偶联物在制备用于检测样品中RANKL、评估药物治疗效果或诊断癌症的试剂盒中的用途。
附图说明
图1,抗RANKL抗体与RANKL结合的特异性检测。
图2,抗RANKL抗体阻断RANKL/RANK的结合。
图3,抗RANKL抗体阻断RANKL/RANK诱导的NF-κB信号传导。
具体实施方式
本发明利用重组表达的蛋白抗原RANKL进行小鼠免疫,然后利用噬菌体展示技术筛选抗体基因库并进行人源化改造,从而获得了一系列抗RANKL特异性抗体。然后通过BLI、亲和力等方法鉴定出高亲合力、高特异性、高功能活性的抗体。所述抗体或其抗原结合片段具有良好的安全性和靶向性,能够特异性结合RANKL蛋白。
本文中,“抗RANKL抗体”是特异性结合RANKL的蛋白质,包括但不仅限于,抗体、抗体的抗原结合片段、纳米抗体、微型抗体、亲和体、受体的靶结合区、细胞粘附分子、配体、酶、细胞因子、和趋化因子。
本文中,术语“抗体”包括单克隆抗体(包括全长抗体,其具有免疫球蛋白Fc区),具有多表位特异性的抗体组合物,多特异性抗体(例如,双特异性抗体),双抗体和单链分子,以及抗体片段,尤其是抗原结合片段,例如,Fab,F(ab’)2和Fv)。本文中,术语“免疫球蛋白”(Ig)和“抗体”可互换地使用。
基本的4链抗体单元是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个基本的异四聚体单元及称作J链的另外多肽组成,包含10个抗原结合位点;而IgA抗体包含2-5个基本的4链单元,其可与J链组合聚合形成多价装配物。在IgG的情况中,4链单元通常约150,000道尔顿。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连,而两条重链通过一个或多个二硫键彼此相连,二硫键的数目取决于重链的同种型。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在N-末端具有可变结构域(VH),接着是三个(对于每种α和γ链,CH1、CH2和CH3)和四个(对于μ和ε同种型,CH1、CH2、CH3和CH4)恒定结构域(CH)以及位于CH1结构域与CH2结构域之间的绞链区(Hinge)。每条轻链在N-末端具有可变结构域(VL),接着是其另一端的恒定结构域(CL)。VL与VH排列在一起,而CL与重链的第一恒定结构域(CH1)排列在一起。特定的氨基酸残基被认为在轻链和重链可变结构域之间形成界面。成对的VH和VL一起形成一个抗原结合位点。关于不同类别抗体的结构和性质,参见如Basic and Clinical Immunology,第八版,Daniel P. Sties,Abba I. Terr 和Tristram G. Parsolw编辑,Appleton&Lange,Norwalk,CT,1994,第71页和第6章。来自任何脊椎动物物种的轻链,根据其恒定结构域氨基酸序列,可归入两种称作κ和λ的截然不同型中的一种。根据其重链恒定结构域(CH)氨基酸序列,免疫球蛋白可归入不同的类或同种型。有五类免疫球蛋白:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,分别具有称作α、δ、ε、γ和μ的重链。根据CH序列和功能的相对较小差异,γ和α类可进一步分为亚类,例如人表达下列亚类:IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合,但展现出多种效应子功能,如在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性中抗体的参与。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变结构域可分别称为“VH”和“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分(相对于相同类型的其它抗体)并含有抗原结合位点。
术语“可变的”指可变结构域中的某些区段在抗体序列中差异广泛的情况。可变结构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而,变异性并非均匀分布于可变结构域跨越的全部氨基酸。相反,其集中在三个称为高变区(HVR)的区段(在轻链和重链可变结构域中均有),即分别为重链可变区的HCDR1、HCDR2、HCDR3以及轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3。可变结构域中更为高度保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区(FR1、FR2、FR3和FR4),它们大多采取β-折叠构象,通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠结构一部分的三个HVR连接。每条链中的HVR通过FR区非常接近的保持在一起,并与另一条链的HVR一起促成抗体的抗原结合位点的形成。通常,轻链可变区的结构为FR1-LCDR1-FR2-LCDR2-FR3-LCDR3-FR4,重链可变区的结构为FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4。对于嵌合抗体,FR区可以是非人源(例如鼠源)的。抗体CDR可以通过多种编码系统来确定,如CCG、Kabat、AbM、Chothia、IMGT、综合考虑Kabat/Chothia等。这些编码系统为本领域内已知,具体可参见,例如,http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html#kabatnum。例如,所述抗原结合蛋白的氨基酸序列编号可以按照IMGT编号方案。
人种系抗体可变区框架(FR)序列可以从ImMunoGeneTics (IMGT)的网站http://imgt .cines .fr得到。人源抗体的共同序列可以从网站https://plueckthun.bioc.uzh.ch/antibody/Modelling/HuCAL/index.html得到(J.Mol.Biol.296, 57-86 (2000))。为避免免疫原性下降的同时,引起的抗体活性下降,可对人源化抗体或人抗体可变区进行反向突变(回复突变),以保持活性。本发明中,抗体包括经人源化的变体。
“Fc区”(可结晶片段区域)或“Fc结构域”或“Fc”是指抗体重链的C-末端区域,其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合,包括与位于免疫系统的各种细胞(例如,效应细胞)上的Fc受体的结合,或者与经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。在IgG,IgA和IgD抗体同种型中,Fc区由来自抗体两条重链的CH2结构域和CH3结构域的两个相同的蛋白片段构成;IgM和IgE的Fc区在每个多肽链中包含三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。如本文所使用的,Fc区可以是天然序列Fc或变体Fc。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分,优选完整抗体的抗原结合区和/或可变区。抗体片段优选为抗体的抗原结合片段。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段;双抗体;线性抗体;单链抗体分子;scFv-Fc片段;由抗体片段形成的多特异性抗体;以及通过化学修饰或通过掺入脂质体中应能够增加半衰期的任何片段。用木瓜蛋白酶消化抗体产生称作“Fab”片段的两个相同的抗原结合片段,和一个残余“Fc”片段,其名称反映了它易于结晶的能力。Fab片段由完整轻链及重链可变结构域(VH)和一条重链第一恒定结构域(CH1)组成。每个Fab片段在抗原结合方面是单价的,即其具有单个抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体产生一个较大F(ab’)2片段,它粗略相当于两个通过二硫键相连的Fab片段,具有不同抗原结合活性且仍能够交联抗原。Fab’片段因在CH1结构域的羧基末端增加了一些另外的残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与Fab片段有所不同。F(ab’)2抗体片段最初是作为成对Fab’片段生成的,在Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。Fc片段包含通过二硫键保持在一起的两条重链的羧基末端部分。抗体的效应子功能是由Fc区中的序列决定的,该区还是由在某些类型细胞上发现的Fc受体(FcR)所识别的区。本申请中,所述抗体的Fc片段是人IgG1重链及轻链的恒定区基因片段CH1-Hinge-CH2-CH3和CL,如SEQ ID NO:11-12序列所示。
“Fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中突出了六个高变环(重链和轻链各3个环),贡献出抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异性。然而,即使是单个可变结构域(或只包含对抗原特异的三个HVR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力,尽管亲合力低于完整结合位点。“单链Fv”也可缩写为“sFv”或“scFv”,是包含抗体VH和VL结构域的连接成一条多肽链的抗体片段。优选的是,sFv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头,使得sFv形成期望的抗原结合结构,接头例如(GGGS)3。
本文中,术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体,即除了可能以少量存在的可能的天然出现的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外,构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体针对单个抗原位点是高度特异性的。与多克隆抗体制剂(其典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体)相比,每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除它们的特异性外,单克隆抗体的优势在于它们通过杂交瘤培养合成,未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征,不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如,将根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成,包括例如杂交瘤法、噬菌体展示法、重组DNA法、及用于从具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物生成人或人样抗体的技术、单细胞测序法。
单克隆抗体在本文中也包括“嵌合”抗体,其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,以及此类抗体的片段,只要它们展现出期望的生物学活性。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。因此,“人源化抗体”通常指可变结构域构架区与在人抗体中发现的序列交换的非人抗体。通常在人源化抗体中,整个抗体(除CDR以外)由人来源的多核苷酸编码或与这种抗体相同(除CDR以外)。CDR(其中一些或全部由源自非人生物体的核酸编码)被移植到人抗体可变区的β-折叠骨架中以产生抗体,其特异性由被移植的CDR来决定。这类抗体的产生方法本领域周知,例如使用人源化改造平台hu-mab或BioPhi对已有抗体进行人源化改造,并使用具有基因工程免疫系统的小鼠产生抗体。本发明中,抗体包括各所述抗体的经人源化的变体。
“人抗体”指这样的抗体,其具有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术产生。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成,包括噬菌体展示文库。
在一些实施方案中,本发明还提供与本发明的任何抗RANKL抗体结合的抗体或其抗原结合片段,即能够与本发明的任何抗体交叉竞争与RANKL的结合的纳米抗体、抗体或其抗原结合片段。
本文所述抗RANKL抗体可以是包含本文所述的抗RANKL抗体片段的单价或多价抗体、多特异性抗体。
在一个或多个实施方案中,本文所述抗体还包括重链恒定区和/或轻链恒定区,重链恒定区例如源自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM的重链恒定区或源自IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2的重链恒定区或其具有至少85%序列相同性的序列,轻链恒定区例如κ或λ链的轻链恒定区或与其具有至少85%序列相同性的序列。
本发明还包括所述抗体衍生物和类似物。“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的衍生物或类似物可以是(i)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽,或(ii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物,例如聚乙二醇)融合所形成的多肽,或(iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列,或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导,这些衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在不实质性影响抗体活性的前提下,本领域技术人员可以对本发明的序列改变一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸,以获得所述抗体或其功能性片段序列的变体。这些变体包括(但并不限于):一个或多个(通常为1-50个,较佳地1-30个,更佳地1-20个,最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代,以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内,较佳地为10个以内,更佳地为5个以内)氨基酸。在本领域中,用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时,通常不会改变蛋白质的功能。如在可变区的FR和/或CDR区中将具有类似性质的氨基酸进行取代。可进行保守性取代的氨基酸残基为本领域所周知。这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的。又比如,在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。
本文所述抗体的变异形式包括:同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
在一些实施方案中,本发明所述变体的序列可以与其来源序列有至少有95%、96%、97%、98%或99%的一致性。本发明所述的序列一致性可以使用序列分析软件测量。例如使用缺省参数的计算机程序BLAST,尤其是BLASTP或TBLASTN。本发明还包括那些具有带CDR的抗体重链可变区的分子,只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90%以上(较佳地95%以上,最佳地98%以上)的同源性。
可采用本领域常规的方法制备本发明的抗体,如本领域熟知的杂交瘤技术。可采用本领域常规的方法制备本发明的抗体,如本领域熟知的噬菌体展示技术。或者,本发明的抗体或其片段或抗体偶联物可在其他细胞系中表达。可用编码本发明抗体的序列转化合适的哺乳动物宿主细胞。转化可采用任何已知的方法进行,例如包括将多核苷酸包装在病毒(或病毒载体中)并用病毒(或载体)转导宿主细胞。所用的转化程序取决于将转化的宿主。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞中的方法为本领域所熟知,包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸囊封在脂质体中和将DNA直接微注射至核中等。可用作用于表达的宿主的哺乳动物细胞系为本领域所熟知,包括但不限于可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的多种永生化细胞系,包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如,HepG2)等。尤其优选的细胞系通过确定哪些细胞系具有高表达水平并产生具有基本RANKL结合特性的抗体来进行选择。
融合蛋白
本申请还提供了融合蛋白,其包含本申请所述的抗体或抗原结合片段作为表达目标、活性分子或靶向分子。本文中,“表达目标”指融合蛋白是需要制备的表达物,例如在抗体的两端添加便于蛋白表达或纯化等功能的标签(例如His6标签)所形成的融合蛋白。标签不影响目标蛋白的功能,并且可被容易地切除。本文中,“活性分子”指发挥融合蛋白最终功能(例如中和抗原)的分子。本文中,“靶向分子”指介导融合蛋白与靶标的靶向、识别、或结合的分子。
抗体偶联物
本申请还提供了抗体偶联物,其包含本申请所述的抗体或抗原结合片段。在本申请中,术语“抗体偶联物”通常指所述其他试剂(例如,化疗剂、放射性元素、细胞生长抑制剂和细胞毒性剂)与所述抗体或其抗原结合片段缀合(例如,通过连接分子共价相连)而形成的偶联物,该偶联物可以通过所述抗体或其抗原结合片段与靶细胞上的抗原特异性结合,将所述其他试剂递送至靶细胞(例如,肿瘤细胞)。本发明还提供本文所述抗体在制备免疫缀合物中的用途。
在某些实施方式中,可以将本申请所述的抗体或其抗原结合片段与另一试剂,如化学治疗剂、毒素、免疫治疗剂、成像探针、分光镜探针等的连接。该连接可以通过一个或多个共价键,或非共价相互作用,并且可以包括螯合作用。可以使用多种接头(所述接头可以为本领域所知)以形成抗体偶联物。此外,可以以融合蛋白质的形式提供抗体偶联物,其可以由编码抗体偶联物的多核苷酸表达。所述抗体偶联物还可以包含例如抗体-药物缀合物(ADC)。合适的药物可以包括细胞毒素、烷化剂、DNA小沟结合分子、DNA嵌入剂、DNA交联剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、核输出抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶I或II的抑制剂、热激蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗生素和抗有丝分裂剂。在ADC中,抗体和治疗剂可以通过接头交联,该接头可切割,例如肽类接头、二硫类接头或腙类接头。
多核苷酸
本发明还提供了多核苷酸,具有能编码本文所述抗RANKL抗体或其抗原结合片段、融合蛋白或抗体偶联物的序列,或它们的互补序列。本文提供编码重链可变区、轻链可变区、重链、轻链以及各CDR的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是正义链或反义链。
如本领域技术人员将了解,DNA通常是双链结构,具有相互互补的正义链和反义链。其中,正义链又称编码链或有义链,是指在DNA双链中具有遗传信息的链,不能进行转录,包含与编码功能蛋白质的mRNA相同的核苷酸序列,差异仅为DNA中的T在mRNA中为U。反义链又称模板链,是指在转录过程中被RNA聚合酶所使用的DNA链,充当转录的模板,RNA聚合酶沿着模板链移动,并将其转录成mRNA,再由mRNA翻译为多肽。
狭义上,“编码……的多核苷酸序列”或“……的编码序列”指存在于DNA的反义链上的能直接指导转录的序列,或存在于mRNA上的能直接指导翻译的序列。多核苷酸可以包含编码序列(或称编码区)和非编码序列(或称非编码区,例如内含子)。编码序列可以连续或不连续,不连续的编码序列片段之间可由非编码序列间隔。将编码序列片段顺序连接后获得的完整编码区即为多肽的编码序列。
如本领域技术人员将了解,由于遗传密码的简并性,可制得极大量的核酸,它们全部编码本发明的抗RANKL抗体。因此,在已鉴定特定氨基酸序列的情况下,本领域技术人员可通过以不改变编码蛋白质的氨基酸序列的方式简单地修饰一个或多个密码子的序列来制得任何数量的不同的核酸。所以,本发明还涉及与上述多核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少50%,较佳地至少70%,更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严谨条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中,“严谨条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱,如0.2×SSC,0.1%SDS,60℃;或(2)杂交时加有变性剂,如50%(v/v)甲酰胺,0.1%小牛血清/0.1%Ficoll,42℃等;或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上,更好是95%以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗RANKL抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外,还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起,形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。目前,已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段,或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外,还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
所以,本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的核酸构建物,例如表达载体和重组载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达蛋白质。载体通常含有用于质粒维系和用于克隆与表达外源性核苷酸序列的序列。所述序列(在某些实施方案中总称为“侧翼序列”)通常包括一个或多个以下核苷酸序列:启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完全内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码将要表达的抗RANKL抗体的核酸的多连接子区和可选标记元件。
宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌,链霉菌属;鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞;真菌细胞如酵母;果蝇S2或Sf9的昆虫细胞;CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时,能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获,用CaCl2法处理,所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要,转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物,可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法,常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养,表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞,培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后,用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子,将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
用途和药物组合物
发明人发现并表达纯化可以结合RANKL蛋白的抗体,通过蛋白水平亲和力检测验证了这些抗体对抗原的结合能力,并鉴定了抗RANKL抗体可以阻断RANKL/RANK诱导的NF-κB信号传导。
本文所述的抗RANKL抗体或抗体偶联物的所有方面都可用于制备用以预防或治疗本文所述各种病况和疾病的药物,所述病况和疾病尤其病况与表达RANKL的细胞相关的疾病或病况。所述抗体可以作为与靶标互作的靶向分子,也可以作为阻断NF-κB信号传导的活性分子。在一些实施方案中,所述病况和疾病是RANKL相关疾病。本文中,RANKL相关疾病包括骨质疏松症。
本文的药物组合物含有本文所述抗体、核酸或抗体偶联物,以及药学上可接受的辅料,包括但不限于稀释剂、载剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。辅料优选地在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒。这类辅料包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。在某些实施方案中,药物组合物可含有用于改善、维持或保留例如组合物的pH、渗透性、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸收或渗透的物质。这些物质为现有技术已知。可视预期的施用途径、递送方式和所需的剂量来确定最佳的药物组合物。
用于体内施用的药物组合物通常以无菌制剂的形式提供。通过经无菌过滤膜过滤来实现灭菌。在组合物冻干时,可在冻干和复水之前或之后使用此方法进行灭菌。可选择本发明的药物组合物用于肠胃外递送。用于肠胃外施用的组合物可以冻干形式或在溶液中储存。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。肠胃外组合物通常放在具有无菌进入孔的容器中,例如具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液带或小瓶。或者,可选择组合物用于吸入或通过消化道(诸如经口)递送。所述药学上可接受的组合物的制备在本领域的技术内。其它药物组合物将为本领域技术人员显而易见,包括在持续或控制释放递送配制物中包含抗体、核酸或抗体偶联物的配制物。用于配制多种其它持续或可控传递方式的技术(诸如脂质体载剂、生物易蚀微粒或多孔珠粒和积存注射)也为本领域技术人员所知。
药物组合物一经配制,就以溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体、晶体或以脱水或冻干粉末的形式储存在无菌小瓶中。所述配制物可储存成即用形式或在施用前复水的形式(例如,冻干)。本发明还提供用于产生单剂量施用单位的试剂盒。本发明的试剂盒可各自含有具有干燥蛋白的第一容器和具有含水配制物的第二容器。在本发明的某些实施方案中,提供含有单腔和多腔预填充注射器(例如,液体注射器和冻干注射器)的试剂盒。
本发明也提供通过施用本发明任一实施方案所述的抗体、核酸或抗体偶联物或其药物组合物来治疗患者(尤其是患者的RANKL相关疾病)的方法。本文中,术语“患者”、“受试者”、“个体”、“对象”在本文中可互换使用,包括任何生物体,优选动物,更优选哺乳动物(例如大鼠、小鼠、狗、猫、兔等),且最优选的是人。“治疗”指向受试者采用本文所述治疗方案以达到至少一种阳性治疗效果(比如,癌症细胞数目减少、肿瘤体积减小、癌细胞浸润至周边器官的速率降低或肿瘤转移或肿瘤生长的速率降低)。有效治疗患者的治疗方案可根据多种因素(比如患者的疾病状态、年龄、体重及疗法激发受试者的抗癌反应的能力)而变。
将采用的含有本发明抗体、核酸或抗体偶联物的药物组合物的治疗有效量将取决于例如治疗程度和目标。本领域技术人员将了解,用于治疗的适当剂量水平将部分取决于所递送的分子、适应症、施用途径和患者的大小(体重、体表或器官大小)和/或状况(年龄和一般健康状况)而变化。在某些实施方案中,临床医生可滴定剂量并改变施用途径来获得最佳的治疗效果。例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。
给药频率将取决于所用配制物中抗体、核酸或抗体偶联物的药物动力学参数。临床医生典型地施用组合物直到达到实现所需效果的剂量。组合物因此可作为单次剂量施用,或随时间以作为两次或多次剂量(可含有或不含有相同量的所需分子)施用,或通过植入装置或导管以连续输液的方式施用。
药物组合物的施用途径是根据已知方法,例如经口、通过静脉内、腹膜内、脑内(脑实质内)、脑室内、肌肉内、眼内、动脉内、门静脉或病灶内途径注射;通过持续释放系统或通过植入装置。
检测和试剂盒
本发明的抗体因其与RANKL的高亲合力可用于测定,例如结合测定来检测和/或定量在组织或细胞中表达的RANKL。抗体可用在进一步研究RANKL在疾病中的作用的研究中。检测RANKL的方法大致如下:获得细胞和/或组织样本;检测样本中RANKL的水平。
本发明的抗RANKL抗体可用于诊断目的,用来检测、诊断或监控与RANKL相关的疾病和/或病况。
通常用可检测的标记基团来标记抗体。合适的标记基团包括(但不限于)以下:放射性同位素或放射性核素(例如,3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光基团(例如,FITC、罗丹明、镧系元素磷光体)、酶促基团(例如,辣根过氧化物酶、β根半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基基团或由二级报导体识别的预定多肽表位(例如,亮氨酸拉链对序列、用于二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂。用于标记蛋白质的各种方法在本领域中已知且可用来进行本发明。
本发明的另一方面提供检测样品中RANKL存在情况的非诊断性方法,所述方法包括:以本文任一实施方案所述抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、或抗体偶联物与样品孵育,和检测RANKL与抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、或抗体偶联物的结合,从而确定样品中RANKL存在情况。所述检测是酶联免疫反应法检测。
本发明还提供了用于检测RANKL水平的检测试剂盒,用于评估药物治疗效果,该试剂盒包括抗RANKL抗体,用于溶解样本的裂解介质,检测所需的通用试剂和缓冲液,如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
除非另有定义,本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术,这些都在本领域的技术范围内。这些技术在文献中有充分解释,诸如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(Sambrook等,1989);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑,1984);Animal Cell Culture(R.I.Freshney编辑,1987);Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.);Current Protocols inMolecular Biology(F.M.Ausubel 等编辑,1987版及其定期更新版本);PCR:ThePolymerase Chain Reaction(Mullis等编辑,1994);A Practical Guide to MolecularCloning(Perbal Bernard V.,1988);Phage Display:A Laboratory Manual(Barbas等,2001)。
以下结合实施例进一步描述本公开,但这些实施例并非限制本公开的范围。本公开实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,如冷泉港的抗体技术实验手册,分子克隆手册;或按照原料或商品制造商所建议的实验条件。未注明具体来源的试剂,为市场购买的常规试剂。
实施例
实施例1. 抗人RANKL抗体的筛选
1) 小鼠免疫
选择6-8周龄Balb/c雌鼠(广东药康生物科技有限公司),将1 mg/mL重组表达的蛋白抗原RANKL(AcroBiosystems,RAL-H5240)与等体积的弗氏完全佐剂(Sigma,F5881-10ML)充分混合进行免疫。初次免疫每只小鼠皮下注射50 μg抗原。首次免疫后第14、28天进行加强免疫,加强免疫采用蛋白与弗氏不完全佐剂乳化制备的抗原悬液。每只小鼠腹腔或皮下注射25-50ug抗原。第35天采血检测抗体滴度,根据抗体滴度高低确定继续进行加强免疫或进行最后一次冲刺免疫。冲刺免疫采用50-100 µg纯蛋白溶液(蛋白溶解于磷酸盐缓冲液或生理盐水中)通过小鼠腹腔进行注射。免疫3天后将小鼠安乐死处理,采集小鼠血液,脾脏及淋巴结样本用于检测及噬菌体展示文库制备。
2) 单链抗体-噬菌体(scFv-phage)表面展示文库的构建
抽提免疫后小鼠脾细胞RNA,合成cDNA。合成cDNA后构建单链抗体(scFv)-噬菌体展示文库,通过噬菌体表面展示技术筛选目标抗体。具体来说,合成cDNA后,通过简并引物,如A Krebber等人,Journal of Immunological Methods 201 (1997) 35–55给出的引物组合,进行PCR扩增获得目标抗体的重链及轻链序列DNA并构建单链抗体-噬菌体展示的免疫文库。
3) 抗人RANKL单克隆抗体的筛选
首轮筛选将RANKL蛋白(AcroBiosystems,RAL-H5240)稀释于PBS中,在高吸附96孔板中每孔加入100 μL,5μg/mL的蛋白,4℃过夜。第2天,用含3%脱脂奶粉的PBS(PBSM)封闭96孔板(室温,2小时)后,用含0.1% Tween20的PBS(PBST)洗涤板子3次后,每孔加入1012用PBSM封闭1小时后的噬菌体,室温孵育1小时。孵育结束后,用PBST洗涤板子10次去除不结合抗原的噬菌体颗粒,并用胰酶洗脱可结合抗原的噬菌体。洗脱的噬菌体通过感染TG1进行扩增。第二、三轮筛选与第一轮筛选方法相似,区别在于,首先采用过量的RANK-mFc(AcroBiosystems,RAK-H5251)结合RANKL,孵育后去除多余的RANK-mFc,加入噬菌体颗粒,室温孵育1小时后,将不能与RANKL-RANK结合的噬菌体转移至包被RANKL的孔中,室温孵育1小时后,进行洗涤、洗脱及扩增。经过三轮筛选后挑取单克隆进行ELISA检测,与抗原RANKL有结合的克隆通过竞争性ELISA检测测定是否可以阻断RANKL与RANK的结合。具体操作如下:将单克隆scFv-噬菌体颗粒浓缩后进行梯度稀释,与150 pM的带有his标签的RANKL重组蛋白室温孵育1小时。孵育结束后加入包被有RANK-Fc蛋白的ELISA板,室温放置1小时后,洗涤3次。加入HRP标记的抗his标签抗体,室温放置1小时后,洗涤3次,加入显色底物进行显色。根据实验结果挑选出可以阻断RANKL/RANK结合的克隆。
实施例2. 抗RANKL抗体重链及轻链可变区序列
表1列出了本公开获得的抗RANKL抗体重链,轻链可变区和CDR区氨基酸序列所对应的序列编号。
表1. 鼠源抗RANKL抗体重链及轻链序列列表
实施例3. 抗RANKL抗体的表达纯化及特异性检测
设计引物并通过PCR扩增得到表1抗体的VH和VL基因片段,分别与人IgG1重链及轻链的恒定区基因片段CH1-Hinge-CH2-CH3(SEQ ID NO:11)和CL(SEQ ID NO:12)进行overlap PCR得到融合DNA序列,插入哺乳动物表达载体pCDNA3.4中,构建得到表达嵌合抗体的重、轻链质粒载体。经过测序验证序列正确后,采用去内毒素的质粒提取试剂盒提取质粒载体,-20℃条件下保存备用。将Expi293F稀释至密度约为4x106细胞/mL,将分别表达抗体轻、重链的质粒采用PEI40000 (polysciences)转染试剂共转染入Expi293F细胞。四天后收集细胞培养液上清,高速离心后收集细胞培养上清液,并用0.22μm的滤膜过滤去除残余的细胞碎片。过滤后的细胞培养上清液用Protein A柱进行纯化,用PBS缓冲液冲洗ProteinA柱去除杂蛋白,至A280示数降至基线稳定后,用pH3.2的0.1M乙酸-乙酸钠溶液洗脱目的蛋白,收集目标蛋白峰,用1M的Tris-HCl,pH8.0溶液中和。样品浓缩后,用凝胶层析柱ENrichTM SEC650(Bio-red)进一步纯化,去除聚集体,收集单体峰。收集后的样品经4-12%的SDS-PAGE梯度胶电泳检测后,分装后于-80℃条件下保存备用。
通过BLI检测纯化后的抗体与RANKL、TNFα、CD40L以及TRAIL的结合。研究发现RA02特异性结合RANKL而不结合其它同家族蛋白(图1)。
实施例4. 抗RANKL抗体可阻断RANKL与RANK的结合
通过BLI检测待测抗体RA02阻断RANKL/RANK结合的能力,如图2所示,在SA传感器上固定带有生物素标签的RANKL,平衡后将传感器浸没至含有100 nM待测抗体RA02以及对照抗体的缓冲液中直至饱和,之后再将传感其浸没在含有100 nM RANK的缓冲液中,可以发现当RANKL被待测抗体饱和后,RANK不能与RANKL结合,待测抗体具有阻断RANK/RANKL结合的能力。
实施例5. 抗RANKL抗体的人源化改造
根据序列的相似性、抑制RANKL与RANK结合的能力以及特异性,选择RA02进行人源化改造,根据IMGT命名规则界定重链及轻链CDR区的位置,将CDR区移植到与鼠源抗体框架区序列相似度最高的人抗体种系序列上得到相应的人源化序列如表2所示。
表2. 人源化抗RANKL抗体重链及轻链序列列表
通过BLI检测人源化改造前后,抗体与RANKL结合的亲和力。具体方法为:将生物素标记的RANKL三聚体蛋白固化到链霉亲和素传感器上。配置不同浓度的抗体分析物,依次让传感器浸没于含有不同浓度抗体的分析物中,通过Octet Analysis Studio软件按照1:1结合模式进行拟合,得到结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)。基于结合和解离速率常数的比值计算解离平衡常数(KD)。如表3所示,抗RANKL的抗体RA02在人源化改造后,亲和力有轻微下降,但仍然与抗原高亲和力结合。地舒单抗(自产)作为阳性对照蛋白。
表3. 抗RANKL抗体结合RANKL的亲和力检测
实施例6. 抗RANKL抗体阻断RANKL/RANK诱导的NF-κB信号传导
研究显示RANK信号传导通过结合下游蛋白,如TRAF6等使得MAPKs、NF-kB以及AP-1活化。其中活化的NF-kB诱导核因子NFATc1的表达,该因子是破骨细胞生成的关键。因此通过检测待测抗体对NF-kB信号通路的阻断能力可评估其抑制破骨细胞生成的能力。pGL4.32(promega,#E8491)质粒中含有5个拷贝的NF-κB应答元件,调控下游荧光素酶基因的表达。当NF-κB信号通路被激活后,荧光素酶基因表达产生荧光素酶,在存在相应荧光底物的情况下,荧光素酶分解底物产生荧光。通过记录荧光的强弱可评估NF-κB激活的程度。当抗体可阻断RANKL/RANK结合时,相应的荧光信号减弱。通过该检测评估抗体阻断RANKL/RNAK的效用强弱。不添加阻断抗体时得到的荧光信号强度设为100,对添加阻断抗体时的荧光信号进行均一化(N),%抑制率由1-N计算得到。
用N端带有flag标签编码RANK的质粒(义翘神州,#HG16078-NF)转染HEK293细胞,通过潮霉素筛选及细胞分选获得HEK293-RANK稳转细胞系。用pGL4.32质粒转染HEK293-RANK细胞,转染24小时后,消化细胞,计数后将细胞接种至96孔白板中,2x104细胞/孔,37℃孵育过夜。第2天,将0.2 nM的RANKL蛋白以及不同浓度的抗体在新鲜的培养基中进行混合,室温孵育30分钟后加入细胞中,将细胞放置于37℃培养箱培养4-6h,取出后加入荧光底物,室温孵育5分钟后检测荧光信号。如图3所示,在100 ng/mL的浓度下RA02、Hu-RA02以及地舒单抗可以完全阻断RANKL/RANK诱导的NF-κB信号传导。
本文部分序列:
SEQ ID NO:1-RA02-VH
EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTTSGFNIKATYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPAKDNTKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSDDTAVYYCARSPHYYVYFDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO:2-HCDR1
GFNIKATY
SEQ ID NO:3-HCDR2
IDPAKDNT
SEQ ID NO:4-HCDR3
ARSPHYYVYFDY
SEQ ID NO:5-RA02-VL
SIVMTQTQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNSYPLTFGAGTKLEMK
SEQ ID NO:6-LCDR1
QNVGTN
SEQ ID NO:7-LCDR2
SAS
SEQ ID NO:8-LCDR3
QQYNSYPLT
SEQ ID NO:9-Hu-RA02-VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGFNIKATYMHWVRQAPGQGLEWIGRIDPAKDNTNYAQKFQGRATITADTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSPHYYVYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:10-Hu-RA02-VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNVGTNLAWYQQKPGKAPKALIYSASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYNSYPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:11- CH1-Hinge-CH2-CH3
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:12-CL
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Claims (18)
1.一种靶向RANKL的抗体或其抗原结合片段,或与所述抗体或其抗原结合片段具有至少85%序列相同性并保留其RANKL结合活性的变体,
其中,
(A)所述抗体的重链可变区VH包含:(1)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:9所示的序列,或(2)与(1)具有至少85%序列相同性的序列;和/或,所述抗体的轻链可变区VL包含:(a)SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:10所示的序列,或(b)与(a)具有至少85%序列相同性的序列,或
(B)所述抗体包含:SEQ ID NO:1所示的重链可变区的3个HCDR,和/或,SEQ ID NO:5所示的轻链可变区的3个LCDR,或
(C)所述抗体的HCDR1包含SEQ ID NO:2或与其具有至少85%序列相同性的序列,所述抗体的HCDR2包含SEQ ID NO:3或与其具有至少85%序列相同性的序列,所述抗体的HCDR3包含SEQ ID NO:4或与其具有至少85%序列相同性的序列;和/或,所述抗体的LCDR1包含SEQ ID NO:6或与其具有至少85%序列相同性的序列,所述抗体的LCDR2包含SEQ ID NO:7或与其具有至少85%序列相同性的序列,所述抗体的LCDR3包含SEQ ID NO:8或与其具有至少85%序列相同性的序列;或
(D)所述抗体包含:SEQ ID NO:2所示的HCDR1、SEQ ID NO:3所示的HCDR2、SEQ ID NO:4所示的HCDR3,和/或,所述抗体包含:SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2、SEQ ID NO:8所示的LCDR3。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体的重链可变区包含鼠源或人源重链FR区,所述抗体的轻链可变区包含鼠源或人源轻链FR区。
3. 如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,所述抗体包含:SEQ ID NO:1所示的VH和SEQ ID NO:5所示的VL,或,SEQ ID NO:1所示的VH和SEQ ID NO:10所示的VL,或,SEQ IDNO:9所示的VH和SEQ ID NO:5所示的VL,或SEQ ID NO:9所示的VH和SEQ ID NO:10所示的VL。
4.如权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体还包含重链恒定区和/或轻链恒定区。
5. 如权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,
所述抗体的重链包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区或与其具有至少85%序列相同性的序列,和/或
所述抗体的轻链包含人源κ链、λ链的轻链恒定区或与其具有至少85%序列相同性的序列。
6.如权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体的重链包含人源IgG1的重链恒定区或与其具有至少85%序列相同性的序列,轻链包含人源κ链的轻链恒定区或与其具有至少85%序列相同性的序列。
7.如权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体是单克隆抗体。
8.如权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体是嵌合抗体或完全人抗体。
9.一种融合蛋白或抗体偶联物,其包含权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
10.一种多核苷酸,选自:
(1)权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求9所述的融合蛋白或抗体偶联物的编码序列;
(2)(1)的互补序列。
11.一种核酸构建物,其包含权利要求10所述的多核苷酸。
12.如权利要求11所述的核酸构建物,其特征在于,所述核酸构建物是载体。
13.一种宿主细胞,其:
(1)表达和/或分泌权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求9所述的融合蛋白或抗体偶联物;
(2)包含权利要求10所述的多核苷酸;和/或
(3)包含权利要求11或12所述的核酸构建物。
14.一种产生抗体或其抗原结合片段的方法,包括:在适合产生抗体或其抗原结合片段的条件下培养权利要求13所述的宿主细胞,和任选的从培养物中纯化所述抗体或其抗原结合片段。
15.一种药物组合物,包含权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求9所述的融合蛋白或抗体偶联物、权利要求10所述的多核苷酸、权利要求11或12所述的核酸构建物、权利要求13所述的宿主细胞,和药学上可接受的辅料。
16.权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求9所述的融合蛋白或抗体偶联物、权利要求10所述的多核苷酸、权利要求11或12所述的核酸构建物或权利要求13所述的宿主细胞在制备用于预防或治疗受益于抑制破骨细胞生成的疾病的药物中的用途。
17.如权利要求16所述的用途,其特征在于,所述疾病是骨质疏松症。
18.一种检测样品中RANKL存在情况的非诊断性方法,所述方法包括:以权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求9所述的融合蛋白或抗体偶联物与样品孵育,和检测RANKL与抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、或抗体偶联物的结合,从而确定样品中RANKL存在情况。
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN118271446A true CN118271446A (zh) | 2024-07-02 |
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PB01 | Publication |