CN112662661B - 一种基因组dna室温保存卡及其制作方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基因组DNA室温保存卡及其制作方法与应用，属于生物技术领域。所述的基因组DNA室温保存卡，包括具有液体吸收性能的介质和细胞保存液体预混剂。本发明的基因组DNA室温保存卡，能在室温下长期确保基因组DNA结构的完整性和理化性质的稳定性、避免基因组信息的丢失或变化；还可延长基因组样本在室温下的储存时间及实现远距离运输。本发明所涉及基因组DNA长期常温保存及提取方法可为体细胞的突变监测，疾病预防和疾病治疗提供有力保障。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及生物基因样本常温保存技术，具体涉及一种基因组DNA室温保存卡及其制作方法与应用。
背景技术
基因组DNA(genomic DNA)是指组成生物基因组的所有DNA，人体基因组DNA蕴藏人体全部的遗传信息，是遗传和物种延续的物质基础，它使后代出现与亲代相似的性状。保存人体基因组DNA样本也即保存人体的全部遗传信息。近年来，随着基因组测序技术的高速发展以及国家一系列利好政策的推动，科学家已能对基因组DNA的遗传信息和生命密码进行全面的分析和解读。越来越多的研究证明，多种疾病特别是肿瘤，都是由于体细胞基因突变改变了细胞的性能，进而又改变了该组织和器官的性能，导致出现疾病症状。因此，在婴儿期以较低的成本将基因样本保存起来，待将来需要是将基因样本取出进行检测以对体细胞的突变进行监测，对预防疾病发生和疾病治疗具有重要意义。
目前，已有许多基因保存公司开展个人基因样本的保存服务，现有技术大多将分离获得的基因组DNA样本贮存在超低温条件下以长期维持其理化性质及生物学活性的稳定，其保存条件苛刻，成本较高，限制了其广泛应用。因此，开发能在常温下保存基因组DNA的技术，在降低基因保存的成本的同时确保基因组DNA结构的完整性和理化性质的稳定性、避免基因组信息的丢失或变化，对该领域的发展十分必要。
FTA(Flinders Technology Associates)卡是英国Whatman公司专利产品，为室温下采集、运输和储存检材提供了稳妥、安全、可靠的方法。有研究表明，FTA卡法可作为一种通用、快速、简便的DNA模板制备方法，FTA卡中含有特殊的化学物质，当检材吸附在卡上时，细胞膜和细胞器被裂解，蛋白质变性，释放出的核酸被捕获在FTA卡纤维上，从而免受核酸酶、氧化剂和紫外线损伤。FTA卡可以快速地使有机体(包括血液中的各种病原体)失活，并抑制细菌和其他微生物的生长，基因组DNA可在FTA卡上室温条件储存17年以上，而不会降低扩增效率。另外，美国公司研发的FTA基因保藏系统在常温保存基因方面也有很好的效果，可以长时间的保存基因样品，而无须考虑在远距离运输基因样品时环境温度等条件对基因样品的影响。
中国专利CN 101153263 B公开了一种血液DNA保存卡及其制作方法，其保护一种血液保存卡，包括具有吸附能力的纤维状物的介质，该介质内吸附有盐分，所述盐分包括细胞裂解剂、核酸酶抑制剂、使病原菌和病毒蛋白变性的物质和抗氧化抑制剂。然而，上述专利中保护的是从细胞内解离出的裸露DNA，离开细胞结构的保护，DNA稳定性将下降。因此，寻找一种能够保存基因组原位包封样本的保存卡具有重要意义。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种基因组DNA室温保存卡，旨在延长现有基因组DNA的保存时间并简化保存及提取的操作步骤。
本发明的第二个目的是在于提供上述基因组DNA室温保存卡的制作方法。
本发明的第三个目的是在于提供上述基因组DNA室温保存卡的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种基因组DNA室温保存卡，包括具有液体吸收性能的介质和细胞保存液体预混剂。
所述的介质优选包括但不限于滤纸、硝酸纤维素膜、尼龙膜、玻璃纤维素膜和硅胶膜中的至少一种。
所述的具有液体吸收性能的介质优选为经过氨基化试剂处理的介质，即氨基化的具有液体吸收性能的介质。
所述的介质经过氨基化试剂处理的方法优选为：将介质与氨基化试剂按照10～50μL氨基化试剂/cm2介质的比例混合，于密封条件下共孵育30min，然后取出氨基化的介质于0～80℃至完全干燥，即得具有液体吸收性能的介质。
为进一步提升保存效果，上述具有液体吸收性能的介质还可以经过核酸酶抑制剂、抗氧化抑制剂和/或其他能够使病原菌和病毒蛋白变性的试剂处理。
所述的细胞保存液体预混剂，包括如下按重量份计的各组分：0～200份抗凝血剂，0～200份细胞稳定剂，1～200份反应型细胞包封剂，0.1～200份pH调节剂，0.1～200份离子浓度调节剂和500～1000份无RNase纯化水。
当待保存细胞为血液时，抗凝血剂的加入能够有效防止血液凝固；当待保存细胞不是血液时，可以不加入抗凝血剂。
所述的抗凝血剂优选为0～150份；进一步优选为0～120份；更优选为0～50份。
所述的抗凝血剂优选为枸橼酸钠、柠檬酸钠、肝素钠、肝素锂、乙二胺四乙酸二钾、乙二胺四乙酸三钾和乙二胺四乙酸二钠中的至少一种。
所述的细胞稳定剂优选为1～200份；进一步优选为5～200份；更优选为120～180份。
所述的细胞稳定剂优选为甘油、羟乙基淀粉、羧甲基纤维素钠、二甲亚砜、蔗糖、聚乙烯醇、海藻糖和甜菜碱中的至少一种。
所述的反应型细胞包封剂优选为1～100份；进一步优选为1～50份；更优选为5～30份。
所述的反应型细胞包封剂优选为可形成纳米层的化合物；所述的纳米层优选为贵金属纳米层、硅纳米层、钛纳米层、有机纳米层和有机-无机杂化纳米层中的至少一种。
所述的反应型细胞包封剂优选为可形成贵金属纳米层的四氯合金酸(HAuCl4)、四氯合金酸钾(KAuCl4)、六氯合铂酸(H2PtCl6)、六氯合铂酸钾(K2PtCl6)、三氯氨铂酸钾(KPt(NH3)Cl3)、四氯铂酸钾(K2PtCl4)、六溴铂酸钾(K2PtBr6)；可形成硅纳米层的甲基三甲氧基硅烷、甲基二乙氧基硅烷、乙基三乙氧基硅烷、甲基三乙氧基硅烷、正硅酸四乙酯(TEOS)、正硅酸四甲酯(TMOS)、双(三甲基硅烷基)乙酰胺(BSA)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、3-巯丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)、三甲基氯硅烷(TMCS)、氯三乙氧基硅烷(TECS)、辛基三甲氧基硅烷、环己基甲基二甲氧基硅烷、三甲氧基甲硅烷、三乙氧基硅烷、苄基三乙氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、异丁基三乙氧基硅烷；可形成钛纳米层的四异丙基钛酸酯、钛酸甲酯、钛酸四乙酯、钛酸四丁酯、钛酸四丙酯；可形成其他无机纳米层的异丙醇铝、锆酸四丁酯和能够形成有机纳米层的多巴胺、鞣酸中的至少一种。进一步优选为四氯合金酸(HAuCl4)、四氯合金酸钾(KAuCl4)、六氯合铂酸(H2PtCl6)、甲基三乙氧基硅烷、正硅酸四乙酯(TEOS)、正硅酸四甲酯(TMOS)、乙烯基三甲氧基硅烷、异丁基三乙氧基硅烷、钛酸甲酯、钛酸四乙酯、钛酸四丁酯、钛酸四丙酯、异丙醇铝、锆酸四丁酯、多巴胺和鞣酸中的一种；更优选为四氯合金酸(HAuCl4)、六氯合铂酸(H2PtCl6)、甲基三乙氧基硅烷、正硅酸四乙酯(TEOS)、正硅酸四甲酯(TMOS)、钛酸四乙酯、钛酸四丁酯、钛酸四丙酯、异丙醇铝、锆酸四丁酯中的至少一种；最优选为钛酸四乙酯、六氯合铂酸(H2PtCl6)、正硅酸四乙酯(TEOS)和四氯合金酸(HAuCl4)中的至少一种。
所述的pH调节剂优选为0.1～100份；进一步优选为0.1～10份；更优选为0.1～0.5份。
所述的pH调节剂优选为盐酸、醋酸、磷酸、硫酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氨水和三羟甲基氨基甲烷(Tris)中的至少一种；更优选为盐酸、磷酸、醋酸、氨水中的至少一种。
所述的离子浓度调节剂优选为0.1～180份；更优选为10～180份。
所述的离子浓度调节剂优选为氯化钠、氯化钾、氯化铵、磷酸钠、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸一氢钾、磷酸二氢钾和醋酸钠中的至少一种；更优选为氯化钠、磷酸一氢钠-磷酸二氢钠、醋酸钠和氯化铵中的至少一种。
所述的基因组DNA室温保存卡的制作方法，包括如下步骤：
(1)将抗凝血剂、细胞稳定剂、反应型细胞包封剂、pH调节剂、离子浓度调节剂和无RNase纯化水混合均匀，即得细胞保存液体预混剂；
(2)将该细胞保存液体预混剂与待保存细胞样本混合并孵育，得到表面包有包封剂的液体基因组原位包封样本，然后将所得液体基因组原位包封样本滴加于具有液体吸收性能的介质上，待其干燥后可在室温长期保存，即得基因组DNA室温保存卡。
步骤(2)中所述的细胞保存液体预混剂与待保存细胞优选按104～109个细胞/mL细胞保存液体预混剂计算；进一步优选按105～108个细胞/mL细胞保存液体预混剂计算；更优选按106～107个细胞/mL细胞保存液体预混剂计算。
步骤(2)中所述的共孵育优选为温度-197～37℃，时间为1min～168h；进一步优选为温度4～37℃，时间为1min～2h；更进一步优选为温度4℃～25℃，时间为2min～1h。
步骤(2)中所述的干燥优选为10～80℃干燥；所述的干燥优选为自然和鼓风干燥中的至少一种；所述的干燥更优选为25～30℃自然干燥。
所述的室温优选为20～35℃；更优选为25～30℃。
一种从基因组DNA室温保存卡上获取DNA样本的方法，包括如下步骤：
从基因组DNA室温保存卡上剪下含有基因组原位包封样本的部分，将剪下的含有基因组原位包封样本的部分浸润于能够降解包封剂的试剂中，即可将基因组原位包封样本表面的包封剂降解掉，得到含基因组DNA的样本，然后使用基因组总DNA提取试剂盒提取样本中的基因组DNA。
所述的剪下的含有基因组原位包封样本的部分的大小为1～3cm2；更优选为2cm2。
所述的能够降解包封剂的试剂优选为氢氟酸-氟化胺缓冲溶液、硫酸和王水中的至少一种。
所述的氢氟酸-氟化胺缓冲溶液的pH优选为5.5；所述的氢氟酸-氟化胺缓冲溶液优选由49％HF水溶液与40％氟化胺水溶液按体积比1:6混合而成。
所述的硫酸优选为30％(v/v)硫酸水溶液。
所述的含有基因组原位包封样本的部分浸润于能够降解包封剂的试剂中的时间优选为1～20min；进一步优选为5～15min；更优选为8～12min。
所述的基因组总DNA提取试剂盒优选为血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒。
所述的基因组DNA室温保存卡在全血、体细胞基因组DNA的长期室温保存中应用。
本发明提供的技术方案具有如下有益效果：
(1)本发明的基因组DNA室温保存卡，能在室温下长期确保基因组DNA结构的完整性和理化性质的稳定性、避免基因组信息的丢失或变化；还可延长基因组样本在室温下的储存时间及实现远距离运输。本发明所涉及基因组DNA长期常温保存及提取方法可为体细胞的突变监测，疾病预防和疾病治疗提供有力保障。
(2)本发明的保存剂中各成分相互配合，协同作用，长期高效地保护基因组DNA结构的完整性和理化性质的稳定性，避免在保存、运输过程中，遗传信息的丢失或变化；不同于前期的技术，本发明在细胞层面保护基因组DNA，在需要提取基因组DNA时再破坏包封层，并使用商用试剂盒提取基因组DNA，可以大幅度缩减前期保存过程的步骤，利于该技术的推广。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合实施例进一步阐述本发明的内容，但本发明的内容并不仅仅局限于以下实施例。
实施例中的试剂，若非特别说明，均可通过市购得到。
实施例1
一种基因组DNA室温保存卡，包括氨基化的具有液体吸收性能的定性滤纸和细胞保存液体预混剂；
上述氨基化的具有液体吸收性能的定性滤纸为经过氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)处理的定性滤纸，具体操作方法为：将定性滤纸与APTES混合，用量为10μL APTES/cm2定性滤纸，然后在密封条件共孵育30min，之后在25℃室温干燥1h至完全干燥，即得氨基化的具有液体吸收性能的定性滤纸。
所述的细胞保存液体预混剂，其配方为如下按重量份计的组分：120份细胞稳定剂蔗糖，10份反应型细胞包封剂TEOS，0.2份1mol/L HCl水溶液，10份离子浓度调节剂氯化钠和859.8份无RNase纯化水。
将该细胞保存液体预混剂与含有口腔上皮细胞的唾液样本按107个细胞/mL细胞保存液体预混剂混合，在25℃共孵育5min，得到表面包有包封剂的液体基因组原位包封样本；之后将所得液体基因组原位包封样本滴加于氨基化的具有液体吸收性能的定性滤纸上(按100微升液体基因组原位包封样本/1cm2定性滤纸的比例滴加在氨基化的具有液体吸收性能的定性滤纸上，待其在25℃室温自然干燥后，即得基因组DNA室温保存卡。经试验发现，所得基因组DNA室温保存卡中的基因组样本可置于25℃稳定保存10年(按高温高湿老化试验计算所得)。
一种从基因组DNA室温保存卡上获取DNA样本的方法，包括如下步骤：
从基因组DNA室温保存卡上剪下2cm2含有基因组原位包封样本的部分，将剪下的含有基因组原位包封样本的部分浸润于氢氟酸-氟化胺缓冲溶液(氢氟酸-氟化胺缓冲溶液由49％HF水溶液与40％氟化胺水溶液按体积比1:6混合而成)中在室温下共孵育10min，即可将基因组原位包封样本表面的包封剂降解掉，得到含基因组DNA的样本，然后使用基因组总DNA提取试剂盒(即血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，购于天根生化科技(北京)有限公司)提取样本中的基因组DNA。
实施例2
一种基因组DNA室温保存卡，包括氨基化的具有液体吸收性能的硝酸纤维素膜和细胞保存液体预混剂；
上述氨基化的具有液体吸收性能的硝酸纤维素膜为经过3-巯基-1-丙胺处理的硝酸纤维素膜，具体操作方法为：将硝酸纤维素膜与3-巯基-1-丙胺水溶液混合，用量为30μL3-巯基-1-丙胺/cm2硝酸纤维素膜，然后在密封条件共孵育30min，之后在25℃室温干燥1h至完全干燥，即得氨基化的具有液体吸收性能的硝酸纤维素膜。
所述的细胞保存液体预混剂，其配方为如下按重量份计的组分：120份抗凝血剂肝素钠，200份细胞稳定剂羟乙基淀粉，20份反应型细胞包封剂HAuCl4，0.50份pH调节剂磷酸，10份离子浓度调节剂磷酸一氢钠-磷酸二氢钠和649.5份无RNase纯化水。
将该细胞保存液体预混剂与BALB/C小鼠静脉血(5～6周，雌鼠小鼠购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司)按体积比100:20混合(约合有血细胞的静脉血样本按2×108个细胞/mL细胞保存液体预混剂)，在-80℃共孵育24h，得到表面包有包封剂的液体基因组原位包封样本；之后将所得液体基因组原位包封样本按100微升液体基因组原位包封样本/1cm2硝酸纤维素膜的比例滴加于氨基化的具有液体吸收性能的硝酸纤维素膜上，待其于80℃鼓风干燥后，即得基因组DNA室温保存卡。
一种从基因组DNA室温保存卡上获取DNA样本的方法，包括如下步骤：
从基因组DNA室温保存卡上剪下0.5cm2含有基因组原位包封样本的部分，将剪下的含有基因组原位包封样本的部分浸润于王水溶液(V硝酸：V盐酸＝1:3)中在室温下共孵育20min，即可将基因组原位包封样本表面的包封剂降解掉，得到含基因组DNA的样本，然后使用基因组总DNA提取试剂盒(即血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，购于天根生化科技(北京)有限公司)提取样本中的基因组DNA。
对比例1：未氨基化介质对照例
一种基因组DNA室温保存卡，包括具有液体吸收性能的定性滤纸和细胞保存液体预混剂；
所述具有液体吸收性能的定性滤纸直接使用，未经过氨基化试剂预先处理。
所述的细胞保存液体预混剂，其配方为如下按重量份计的组分：120份细胞稳定剂蔗糖，10份反应型细胞包封剂TEOS，0.2份1mol/L HCl水溶液，10份离子浓度调节剂氯化钠和859.8份无RNase纯化水。
将该细胞保存液体预混剂与含有口腔上皮细胞的唾液样本(来源于广东省广州市健康人群志愿者)按107个细胞/mL细胞保存液体预混剂混合，在25℃共孵育5min，得到表面包有包封剂的液体基因组原位包封样本；之后将所得液体基因组原位包封样本按100微升液体基因组原位包封样本/1cm2定性滤纸的比例滴加在定性滤纸上，待其在25℃室温自然干燥后，即得基因组DNA室温保存卡。
一种从基因组DNA室温保存卡上获取DNA样本的方法，包括如下步骤：
从基因组DNA室温保存卡上剪下2cm2含有基因组原位包封样本的部分，将剪下的含有基因组原位包封样本的部分浸润于氢氟酸-氟化胺缓冲溶液(氢氟酸-氟化胺缓冲溶液由49％HF水溶液与40％氟化胺水溶液按体积比1:6混合而成)中在室温下共孵育10min，即可将基因组原位包封样本表面的包封剂降解掉，得到含基因组DNA的样本，然后使用基因组总DNA提取试剂盒(即血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，购于天根生化科技(北京)有限公司)提取样本中的基因组DNA。
对比例2：无细胞稳定剂对照例
一种基因组DNA室温保存卡，包括氨基化的具有液体吸收性能的玻璃纤维素膜和细胞保存液体预混剂；
上述氨基化的具有液体吸收性能的玻璃纤维素膜为经过3-巯基-1-丙胺处理的玻璃纤维素膜，具体操作方法为：将玻璃纤维素膜与3-巯基-1-丙胺水溶液混合，用量为30μL3-巯基-1-丙胺/cm2玻璃纤维素膜，然后在密封条件共孵育30min，之后在25℃室温干燥1h至完全干燥，即得氨基化的具有液体吸收性能的玻璃纤维素膜。
所述的细胞保存液体预混剂，其配方为如下按重量份计的组分：120份抗凝血剂乙二胺四乙酸二钾，100份反应型细胞包封剂H2PtCl6，0.8份pH调节剂HCl，5份离子浓度调节剂氯化钠和749.2份无RNase纯化水。
将该细胞保存液体预混剂与精液(来源于广东省广州市健康人群志愿者，下同)按107个细胞/mL细胞保存液体预混剂混合，在4℃共孵育24h，得到表面包有包封剂的液体基因组原位包封样本；之后将所得液体基因组原位包封样本按100微升液体基因组原位包封样本/1cm2玻璃纤维素膜的比例滴加在氨基化的具有液体吸收性能的玻璃纤维素膜上，待其50℃烘箱干燥后，即得基因组DNA室温保存卡。经试验发现，所得基因组DNA室温保存卡中的基因组样本可置于25℃保存1个月。
一种从基因组DNA室温保存卡上获取DNA样本的方法，包括如下步骤：
从基因组DNA室温保存卡上剪下2cm2含有基因组原位包封样本的部分，将剪下的含有基因组原位包封样本的部分浸润于王水溶液(V硝酸:V盐酸＝1:3)中在室温下共孵育20min，即可将基因组原位包封样本表面的包封剂降解掉，得到含基因组DNA的样本，然后使用基因组总DNA提取试剂盒(即血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，购于天根生化科技(北京)有限公司)提取样本中的基因组DNA。
对比例3：无反应型细胞包封剂对照例
一种基因组DNA室温保存卡，包括氨基化的具有液体吸收性能的定性滤纸和细胞保存液体预混剂；
上述氨基化的具有液体吸收性能的定性滤纸为经过APTES处理的定性滤纸，具体操作方法为：将定性滤纸与APTES水溶液混合，用量为10μL APTES/cm2定性滤纸，然后在密封条件共孵育30min，之后在25℃室温干燥1h至完全干燥，即得氨基化的具有液体吸收性能的定性滤纸。
所述的细胞保存液体预混剂，其配方为如下按重量份计的组分：200份细胞稳定剂聚乙烯醇，20份pH调节剂氨水，20份离子浓度调节剂氯化铵和760份无RNase纯化水。
将该细胞保存液体预混剂与精液按107个细胞/mL细胞保存液体预混剂混合，在4℃共孵育24h，得到表面包有包封剂的液体基因组原位包封样本；之后将所得液体基因组原位包封样本按100微升液体基因组原位包封样本/1cm2定性滤纸的比例滴加在氨基化的具有液体吸收性能的定性滤纸上，待其室温干燥1h后，即得基因组DNA室温保存卡，结果发现该卡无法稳定保存DNA样本。
一种从基因组DNA室温保存卡上获取DNA样本的方法，包括如下步骤：
从基因组DNA室温保存卡上剪下2cm2含有基因组原位包封样本的部分，将剪下的含有基因组原位包封样本使用基因组总DNA提取试剂盒(即血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，购于天根生化科技(北京)有限公司)提取样本中的基因组DNA。
对比例4：无pH调节剂及离子浓度调节剂对照例
一种基因组DNA室温保存卡，包括氨基化的具有液体吸收性能的定性滤纸和细胞保存液体预混剂；
上述氨基化的具有液体吸收性能的定性滤纸为经过APTES处理的定性滤纸，具体操作方法为：将定性滤纸与APTES水溶液混合，用量为10μL APTES/cm2定性滤纸，然后在密封条件共孵育30min，之后在25℃室温干燥1h至完全干燥，即得氨基化的具有液体吸收性能的定性滤纸。
所述的细胞保存液体预混剂，其配方为如下按重量份计的组分：100份抗凝血剂乙二胺四乙酸二钾，120份细胞稳定剂蔗糖，10份反应型细胞包封剂TEOS和770份无RNase纯化水。
将该细胞保存液体预混剂与全血(来源于广东省广州市健康人群志愿者)按107个细胞/mL细胞保存液体预混剂混合，在-80℃共孵育24h，得到表面包有包封剂的液体基因组原位包封样本；之后将所得液体基因组原位包封样本按100微升液体基因组原位包封样本/1cm2定性滤纸的比例滴加在氨基化的具有液体吸收性能的定性滤纸上，待其室温干燥后，即得基因组DNA室温保存卡。
一种从基因组DNA室温保存卡上获取DNA样本的方法，包括如下步骤：
从基因组DNA室温保存卡上剪下2cm2含有基因组原位包封样本的部分，将剪下的含有基因组原位包封样本的部分浸润于氢氟酸-氟化胺缓冲溶液(氢氟酸-氟化胺缓冲溶液由49％HF水溶液与40％氟化胺水溶液按体积比1:6混合而成)中在室温下共孵育10min，即可将基因组原位包封样本表面的包封剂降解掉，得到含基因组DNA的样本，然后使用基因组总DNA提取试剂盒(即血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，购于天根生化科技(北京)有限公司)提取样本中的基因组DNA。
对比例5：未脱除包封剂对照例
本对比例与实施例2基本相同，不同之处在于，本对比例未脱除包封剂；具体操作方法如下：
一种基因组DNA室温保存卡，包括氨基化的具有液体吸收性能的硝酸纤维素膜和细胞保存液体预混剂；
上述氨基化的具有液体吸收性能的硝酸纤维素膜为经过3-巯基-1-丙胺处理的硝酸纤维素膜，具体操作方法为：将硝酸纤维素膜与3-巯基-1-丙胺水溶液混合，用量为30μL3-巯基-1-丙胺/cm2硝酸纤维素膜，然后在密封条件共孵育30min，之后在25℃室温干燥1h至完全干燥，即得氨基化的具有液体吸收性能的硝酸纤维素膜。
所述的细胞保存液体预混剂，其配方为如下按重量份计的组分：200份细胞稳定剂羟乙基淀粉，20份反应型细胞包封剂HAuCl4，0.50份pH调节剂磷酸，10份离子浓度调节剂磷酸一氢钠-磷酸二氢钠和769.5份无RNase纯化水。
将该细胞保存液体预混剂与小鼠成纤维细胞细胞(L929细胞，购于上海研生实业有限公司)按107个细胞/mL细胞保存液体预混剂混合，在4℃共孵育2h，得到表面包有包封剂的液体基因组原位包封样本；之后将所得液体基因组原位包封样本按100微升液体基因组原位包封样本/1cm2硝酸纤维素膜的比例滴加于氨基化的具有液体吸收性能的硝酸纤维素膜上，待其干燥后，即得基因组DNA室温保存卡。
一种从基因组DNA室温保存卡上获取DNA样本的方法，包括如下步骤：
从基因组DNA室温保存卡上剪下2cm2含有基因组原位包封样本的部分，将剪下的含有基因组原位包封样本的部分浸润于超纯水溶液，得到含基因组DNA的样本，然后使用基因组总DNA提取试剂盒(即血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，购于天根生化科技(北京)有限公司)提取样本中的基因组DNA。
性能测试：
本发明中的测试方法如下：
DNA结构完整性检测：通过使用全血基因组DNA试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取各个加速老化样本中的基因组DNA，使用琼脂糖凝胶电泳检测所提取的DNA的完整性。
qPCR检测：
1.PCR反应体系的设置：
RT-PCR模板：β-act
上引物A：CCACACTGTGCCCATTTACG
下引物B：ACGGCCAGCAAGATCCAA
上样量为2uL；
a.融解并混匀PCR反应所需的各种溶液。BeyoFast SYBR Green qPCR Mix(2×)完全融解并混匀后置于冰浴上或冰盒内。
b.参考下列配方在室温或冰浴上设置PCR反应体系(8连管)：
每个PCR反应的试剂量(20μL)；
BeyoFast SYBR Green qPCR Mix(2X)(qPCR预混液)10μL；
正向引物和反向引物的混合物(3μM/管)2μL；
DNA模板2μL；
无RNA酶水6μL；
2.PCR反应程序：
a.预变性：95℃，2min；
b.变性：95℃，15s；
c.退火/延伸：60℃，15-30s(退火温度由引物Tm值来确定)；
d.重复步骤b和步骤c，总共40个循环；
e.熔解曲线分析(可选)：95℃/15s，60℃/15s，95℃/15s；
f.使用荧光定量PCR仪提供的软件分析结果。
样本内基因组DNA的浓度结果如下表1所示，CT值结果如下表2所示。
将实施例1-2和对比例1-5的基因组DNA室温保存卡置于高温高湿环境(70℃，70％湿度)放置0，7，14，21，28天后，分别按照各实施例和对比例记载的方法去除基因组原位包封样本表面的包封剂，得到含基因组DNA的样本，然后使用基因组总DNA提取试剂盒提取样本中的基因组DNA；检测样本内基因组DNA的浓度，DNA结构的完整性，及用qPCR检测循环次数CT值。
不同时间样本内基因组DNA的浓度结果如下表1所示，CT值结果如下表2所示。
表1：
注：“实”代表实施例，例如实1代表实施例1；“对”代表对比例，例如对1代表对比例1。
表2：
注：“实”代表实施例，例如实1代表实施例1；“对”代表对比例，例如对1代表对比例1。
从表1和表2可以看出：未氨基化介质的对比例1，基因组DNA出现部分降解，但仍具有较好DNA保护效果。无反应型细胞包封剂的对比例3，基因组DNA降解明显，几乎无DNA保护效果。而对比例5中不脱除包封剂则会显著影响DNA的提取效果。本发明实施例1和2的保存剂中各成分相互配合，即使在高温高湿环境中也能高效地保护基因组DNA结构的完整性和理化性质的稳定性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种基因组DNA室温保存卡，其特征在于，包括具有液体吸收性能的介质和细胞保存液体预混剂；
所述的具有液体吸收性能的介质为经过氨丙基三乙氧基硅烷处理的定性滤纸或经过3-巯基-1-丙胺处理的硝酸纤维素膜；
所述的经过氨丙基三乙氧基硅烷处理的定性滤纸的制备方法为：将滤纸与氨丙基三乙氧基硅烷按照10～50µL氨丙基三乙氧基硅烷/cm2滤纸的比例混合，于密封条件下共孵育30min，然后取出并至于0～80℃至完全干燥，即得经过氨丙基三乙氧基硅烷处理的定性滤纸；
所述的经过3-巯基-1-丙胺处理的硝酸纤维素膜的制备方法为：将硝酸纤维素膜与3-巯基-1-丙胺按照10～50µL3-巯基-1-丙胺/cm2硝酸纤维素膜的比例混合，于密封条件下共孵育30 min，然后取出并至于0～80℃至完全干燥，即得经过3-巯基-1-丙胺处理的硝酸纤维素膜；
所述的细胞保存液体预混剂，包括如下按重量份计的各组分：0～120份抗凝血剂，120～200份细胞稳定剂，1～200份反应型细胞包封剂，0.1～10份pH调节剂，10～180份离子浓度调节剂和500～1000份无RNase纯化水
所述的抗凝血剂为枸橼酸钠、柠檬酸钠、肝素钠、肝素锂、乙二胺四乙酸二钾、乙二胺四乙酸三钾或乙二胺四乙酸二钠；
所述的细胞稳定剂为羟乙基淀粉或蔗糖；
所述的反应型细胞包封剂为可形成贵金属纳米层的四氯合金酸或正硅酸四乙酯。
2.根据权利要求1所述的基因组DNA室温保存卡，其特征在于，
所述的pH调节剂为盐酸、醋酸、磷酸、硫酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氨水或三羟甲基氨基甲烷；
所述的离子浓度调节剂为氯化钠、氯化钾、氯化铵、磷酸钠、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸一氢钾、磷酸二氢钾和醋酸钠中的至少一种。
3.权利要求1-2任一所述的基因组DNA室温保存卡的制作方法，包括如下步骤：
（1）将抗凝血剂、细胞稳定剂、反应型细胞包封剂、pH调节剂、离子浓度调节剂和无RNase纯化水混合均匀，即得细胞保存液体预混剂；
（2）将该细胞保存液体预混剂与待保存细胞样本混合并孵育，得到表面包有包封剂的液体基因组原位包封样本，然后将所得液体基因组原位包封样本滴加于具有液体吸收性能的介质上，待其干燥后可在室温长期保存，即得基因组DNA室温保存卡。
4.根据权利要求3所述的制作方法，其特征在于，
步骤（2）中所述的细胞保存液体预混剂与待保存细胞样品按104～109个细胞/mL细胞保存液体预混剂计算；
步骤（2）中所述的共孵育为温度-80～37℃，时间为1min～24h。
5.一种从基因组DNA室温保存卡上获取DNA样本的方法，其特征在于，包括如下步骤：
从权利要求3或4所述的制作方法制作得到的基因组DNA室温保存卡上剪下含有基因组原位包封样本的部分，将剪下的含有基因组原位包封样本的部分浸润于能够降解包封剂的试剂中，即可将基因组原位包封样本表面的包封剂降解掉，得到含基因组DNA的样本，然后使用基因组总DNA提取试剂盒提取样本中的基因组DNA；
当包封剂为正硅酸四乙酯时，所述的能够降解包封剂的试剂为氢氟酸-氟化胺缓冲溶液；
当包封剂为四氯合金酸时，所述的能够降解包封剂的试剂为王水。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，
所述的剪下的含有基因组原位包封样本的部分的大小为1～3 cm2。
7.权利要求1-2任一所述的基因组DNA室温保存卡在全血、体细胞基因组DNA的长期室温保存中应用。
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| GR01 | Patent grant | ||
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