CN116287101A - 一种生物样本基因组dna常温长期保存剂及其应用 - Google Patents

一种生物样本基因组dna常温长期保存剂及其应用 Download PDF

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CN116287101A CN202310298038.0A CN202310298038A CN116287101A CN 116287101 A CN116287101 A CN 116287101A CN 202310298038 A CN202310298038 A CN 202310298038A CN 116287101 A CN116287101 A CN 116287101A
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Abstract

一种生物样本基因组DNA常温长期保存剂及其应用。本发明的保存剂中各成分共同发挥作用，通过简单、低成本的方式，长期高效地保存生物样本不被腐蚀，同时可以保存生物样本基因组DNA结构的完整性和理化性质的稳定性，避免在采集、运输、保存过程中，遗传信息的丢失或变化；不同于前期的技术，本发明可以应用到不同尺度的的生物样本中，如细菌、细胞、组织、器官甚至是生物体，不受生物样本尺度大小限制，均可有效保护其基因组DNA，在需要提取基因组DNA时再除去包封层，并使用商用试剂盒提取基因组DNA，可以简化保存步骤，大幅度缩减前期保存过程的成本，利于该技术的推广。

Description

一种生物样本基因组DNA常温长期保存剂及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种生物样本基因组DNA常温长期保存剂及其应用。
背景技术
生物样本(如病毒、细菌、细胞、器官和生物体等)是生物学、遗传学和现代医学研究的重要原始实验材料，在过去的几十年中，对不同尺度的生物样本的研究重点已逐渐从形态特征分析转移到生物分子分析。脱氧核糖核酸(DNA)作为生物样本中重要的生物大分子之一，其携带有合成核糖核酸(RNA)和蛋白质所必需的遗传信息，也是未来信息储存的理想载体。DNA在活细胞中可以高效修复，但这种修复机制在生物体死亡后停止，生物样本在被采集和长期保存过程中，受到核酸酶、氧化损伤以及水解作用，DNA将不可避免的发生降解。生物样本中遗传信息的长期可靠保存，对癌症基因研究、法医取证、物种进化和新物种的识别具有重要意义。如何长期高质量、低成本的保存生物样本及其DNA是研究人员面临的一个重大挑战。
目前，最常用的生物样本保存方法主要为低温冷冻保存和防腐液保存(福尔马林、戊二醛等)。在超低温环境下，生物样本中的自由水变为不能被利用的固态水，细胞内的核酸酶及其他新陈代谢活动被抑制，其保存时间可达几个月甚至几十年。然而，低温冷冻保存成本较高，会消耗大量的电力能源，一旦出现电路或者设备故障，保存的生物样本将会遭受毁灭性的打击。此外，快速低温冷冻的设备较为庞大，不易搬动和运输，这极大的限制了生物样本的户外采集和快速保存。福尔马林作为最常用的防腐溶液，虽然具有成本低、抗腐蚀性强的优点，常被用于临床标本的固定和保存，但福尔马林溶液会使样本DNA与蛋白质产生交联，交联不仅会影响DNA的提取，也会使聚合酶链式反应(PCR)过程变得十分困难。因此，开发一种常温下生物样本及其基因组DNA长期可靠的保存方法，在高效的保存生物样本及其DNA的同时，简化操作步骤、降低保存成本是十分必要的。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种生物样本常温长期保存剂，旨在延长现有的生物样本及其基因组DNA的保存时间，实现简单一步封装，按需提取的目标。
本发明的另一目的在于，提供一种生物样本基因组DNA常温长期保存方法。
本发明的另一目的在于，提供上述生物样本常温长期保存剂的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种生物样本常温长期保存剂，包括如下按重量份计的组分：10～1000份的组织固定剂，10～1000份组织渗透剂，1～150份反应型生物样本包封剂，0.1～100份pH调节剂，0.1～100份离子浓度调节剂、10～500份水。
所述组织固定剂优选为100～1000份；更优选为500～950份。
所述组织渗透剂优选为100～1000份；更优选为500～950份。
所述反应型生物样本包封剂优选为1～100份；更优选为2～30份。
所述pH调节剂优选为0.1～50份；更优选为1～20份。
所述离子浓度调节剂优选为0.1～50份；更优选为1～20份。
所述组织固定剂为无水甲醇、无水乙醇、丙酮中的至少一种。
所述组织渗透剂为二甲基亚砜、甘油、月桂氮酮、异山梨醇二甲醚、N-正烷基苯并异噻酮唑酮、环己六醇中的至少一种。
所述的反应型生物样本包封剂为可形成硅纳米层的包封剂。
所述的反应型生物样本包封剂为甲基三甲氧基硅烷、甲基二乙氧基硅烷、乙基三乙氧基硅烷、甲基三乙氧基硅烷、正硅酸四乙酯(TEOS)、正硅酸四甲酯(TMOS)、双(三甲基硅烷基)乙酰胺(BSA)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、3-巯丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)、三甲基氯硅烷(TMCS)、氯三乙氧基硅烷(TECS)、辛基三甲氧基硅烷、环己基甲基二甲氧基硅烷、三甲氧基甲硅烷、三乙氧基硅烷、苄基三乙氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、异丁基三乙氧基硅烷，优选为，可形成纳米层的甲基三乙氧基硅烷、正硅酸四乙酯(TEOS)、正硅酸四甲酯(TMOS)、乙烯基三甲氧基硅烷、异丁基三乙氧基硅烷中的至少一种；更优选为，可形成无机纳米层的甲基三甲氧基硅烷、甲基三乙氧基硅烷、正硅酸四乙酯(TEOS)、正硅酸四甲酯(TMOS)中的至少一种。
所述pH调节剂为盐酸、醋酸、磷酸、硫酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、Tris中的至少一种。
所述的离子强度调节剂为氯化钠、氯化钾、氯化铵、磷酸钠、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、醋酸钠中的至少一种。
所述的水为纯水，优选为无RNase水。
一种生物样本基因组DNA常温长期保存方法，包括如下步骤：
将上述生物样本常温长期保存剂生物样本共同孵育，得到保存后的生物样本。
所述的保存剂与生物样本的体积比为1000～1：1，优选为100～2：1，更优选为50～10：1。
所述的孵育的条件为0℃～37℃共孵育5min～720h。
上述生物样本常温长期保存剂在保存生物样本中的应用。
上述生物样本基因组DNA常温长期保存方法在保存生物样本中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点：
本发明的生物样本及其DNA保存剂，能在室温下长期保护基因组DNA结构的完整性和理化性质的稳定性、避免基因组信息的丢失或变化；还可延长基因组样本在室温下的储存时间及远距离运输。本发明所涉及基因组DNA长期常温保存及提取方法可以为细菌、肿瘤组织和生物体等生物样本提供遗传信息高效可靠的保存。
本发明提供的技术方案具有如下效果：
本发明的保存剂中各成分共同发挥作用，通过简单、低成本的方式，长期高效地保存生物样本不被腐蚀，同时可以保存生物样本基因组DNA结构的完整性和理化性质的稳定性，避免在采集、运输、保存过程中，遗传信息的丢失或变化；不同于前期的技术，本发明可以应用到不同尺度的的生物样本中，如细菌、细胞、组织、器官甚至是生物体，不受生物样本尺度大小限制，均可有效保护其基因组DNA，在需要提取基因组DNA时再除去包封层，并使用商用试剂盒提取基因组DNA，可以简化保存步骤，大幅度缩减前期保存过程的成本，利于该技术的推广。
附图说明
图1是实施例1中保存后的细胞样本SEM照片图。
图2是对比例2中保存后的细胞样本SEM照片图。
图3是实施例1中保存后样本的二维激光共聚焦显微镜照片图。
图4是实施例1中保存后样本的三维激光共聚焦显微镜照片图。
图5是对比例5中保存后的蚯蚓样本SEM照片图。
图6是实施例2中保存后的蚯蚓样本SEM照片图。
图7是Mirco CT扫描保存后的蚯蚓样本的照片图；左为对比例5，右为实施例2。
图8是70℃，70％湿度环境下1天的生物样本DNA凝胶电泳图；M1、M2：Mark 1、Mark2；S1、S2：实施例1、实施例2；C1～C6：对比例1～6。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下面实施方案中若未注明具体试验条件，则通常按照常规试验条件或按照试剂公司所建议的试验条件。所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均为从商业途径得到的试剂和材料。
为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合实施例进一步阐述本发明的内容，但本发明的内容并不仅仅局限于以下实施例。
本发明中的测试方法如下：
实验中使用的生物样本分别为小鼠成纤维上皮细胞(L929细胞)和蚯蚓。
扫描电镜观察：将细胞生物样本分散在水中，并滴加到干净的铝箔片上使用扫描电镜观察；蚯蚓生物样本置于导电胶上使用扫描电镜观察。
激光共聚焦显微镜观察：将细胞样本使用Hoechst33342、DiD、FITC分别标记细胞核、细胞膜和包封材料，并在激光共聚焦显微镜下观察。
Micro CT扫描成像观察：将蚯蚓生物样本置于Micro CT设备中扫描成像，观察其保存形态。
DNA浓度检测：通过使用动物组织基因组DNA试剂盒提取各个加速老化样本中的基因组DNA，取2μL待测样品加入NANODROP检测池，通过其260nm处的吸光度反推出基因组DNA的浓度。
DNA结构完整性检测：通过使用动物组织基因组DNA试剂盒提取各个加速老化样本中的基因组DNA，使用1％的琼脂糖凝胶电泳检测所提取的DNA的完整性。
qPCR检测：
1.PCR反应体系的设置：
L929细胞RT-PCR模板：X00686.1
上引物A：GGACACGGACAGGATTGACA
下引物B：CGGACATCTAAGGGCATCACAG
蚯蚓RT-PCR模板：AB558505.1
上引物A：CCGTAACTCTGATGACTCTGG
下引物B：CTGCCTTCCTTGGATGTG
上样量为2uL；
a.融解并混匀PCR反应所需的各种溶液。BeyoFast SYBR Green qPCR Mix(2X)完全融解并混匀后置于冰浴上或冰盒内。
b.参考下列配方在室温或冰浴上设置PCR反应体系(8连管)：
Reagent Volume for One PCR Reaction(20μL)；
BeyoFast SYBR Green qPCR Mix(2X)10μL；
Forward and Reverse Primer Mix(10μM each)2μL；
提取的基因组DNA体积：RNase-Free Water体积为1：100进行稀释，制成TemplateDNA；
Template DNA8μL；
2.PCR反应程序：
a.预变性：95℃，2min；
b.变性：95℃，15s；
c.退火/延伸：55℃，15-30s(退火温度由引物Tm值来确定)；
d.重复步骤b和步骤c，总共40个循环；
e.熔解曲线分析(可选)：95℃/15s，60℃/15s，95℃/15s；
f.使用荧光定量PCR仪提供的软件分析结果。
实施例1
一种生物样本常温长期保存剂及其保存细胞样本的效果验证
(1)保存剂的配制，其配方包括如下按重量份计的组分：800份组织固定剂无水乙醇，10份组织渗透剂二甲基亚砜，7.5份反应型细胞包封剂四甲氧基硅烷，0.2份pH调节剂盐酸，10份离子浓度调节剂氯化钠，170份无RNase纯化水。
(2)将配置好的保存剂1mL和2×106个L929细胞混匀，在26℃共孵育3h得到保存后的样本，之后使用SEM和激光共聚焦显微镜观察样本形貌，结果如图1、3、4所示，保存后的生物样本可置于室温长期保存。
(3)保存后得到的样本置入0.1倍的BOE溶液(缓冲氧化物刻蚀液)浸泡5分钟，去除包封层，使用商用试剂盒(Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒、Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒)提取基因组DNA，检测样本内基因组DNA的浓度和DNA结构的完整性(检测方法可参考刘艳艳,董书光,耿加亮等.阿胶加工工艺过程中DNA降解规律研究[J].药学研究,2016,35(09):501-507.DOI:10.13506/j.cnki.jpr.2016.09.002.)，并使用qPCR法检测样本的循环次数CT值。
另外，将保存后的样本置于高温高湿环境(70℃，70％湿度)放置1，7，14天后，使用上述相同的步骤提取基因组DNA并检测基因组DNA的浓度并使用qPCR法检测样本的循环次数CT值，检验1天样本DNA结构的完整性，实验结果如表1～2和图8所示，实验结果证明，使用本发明的保存剂保存后的细胞样本中的DNA得到了良好的保护。
实施例2
一种生物样本常温长期保存剂及其保存大尺度生物样本的效果验证
(1)保存剂的配制，其配方包括如下按重量份计的组分：600份组织固定剂无水乙醇，200份组织渗透剂二甲基亚砜，7.5份反应型细胞包封剂四甲氧基硅烷，0.2份pH调节剂盐酸，10份离子浓度调节剂氯化钠，180份无RNase纯化水。
(2)将配置好的保存剂10mL和0.3g的蚯蚓样本在26℃共孵育360h，期间每48～96h更换一次溶液，孵育完成后得到保存后的样本，之后使用SEM和Micro CT观察样本形貌，结果如图6～7所示。
(3)参照实施例1步骤(3)的方法，测试包封样本在高温高湿环境中第1、7、14天的基因组DNA浓度和循环测试CT值，并检验1天样本DNA结构完整性，实验结果如表1～2和图8所示。
对比例1细胞生物样本无组织固定剂对比例
(1)保存剂的配制，其配方包括如下按重量份计的组分：10份组织渗透剂二甲基亚砜，7.5份反应型生物样本包封剂四甲氧基硅烷，0.2份pH调节剂盐酸，10份离子浓度调节剂氯化钠，970份无RNase纯化水。
(2)将配置好的保存剂1mL和2×106个L929细胞在26℃共孵育3h得到保存后的样本，之后使用SEM观察样本形貌，保存后的生物样本可置于室温长期保存。
(3)参照实施例1步骤(3)的方法，测试包封样本在高温高湿环境中第1、7、14天的基因组DNA浓度和循环测试CT值，并检验1天样本DNA结构完整性，实验结果如表1～2和图8所示。
本对比例与实施例1的不同之处：细胞生物样本未加入组织固定剂。
对比例2细胞生物样本无反应型生物样本包封剂对比例
一种生物样本及其DNA保存剂对应的细胞生物样本DNA长期常温保存及提取方法，包括如下步骤：
(1)保存剂的配制，其配方包括如下按重量份计的组分：800份组织固定剂无水乙醇，10份组织渗透剂二甲基亚砜，7.5份反应型生物样本包封剂四甲氧基硅烷，0.2份pH调节剂盐酸，10份离子浓度调节剂氯化钠，170份无RNase纯化水。
(2)将配置好的保存剂1mL和2×106个L929细胞在26℃共孵育3h得到保存后的样本，之后使用SEM观察样本形貌，结果如图2所示，保存后的生物样本可置于室温长期保存。
(3)参照实施例1步骤(3)的方法，测试包封样本在高温高湿环境中第1、7、14天的基因组DNA浓度和循环测试CT值，并检验1天样本DNA结构完整性，实验结果如表1～2和图8所示。
本对比例与实施例1的不同之处：细胞生物样本未加入反应型生物样本包封剂。
对比例3细胞生物样本未脱除包封层对比例
一种生物样本及其DNA保存剂对应的细胞生物样本DNA长期常温保存及提取方法，包括如下步骤：
(1)保存剂的配制，其配方包括如下按重量份计的组分：800份组织固定剂无水乙醇，10份组织渗透剂二甲基亚砜，7.5份反应型细胞包封剂四甲氧基硅烷，0.2份pH调节剂盐酸，10份离子浓度调节剂氯化钠，170份无RNase纯化水。
(2)将配置好的保存剂1mL和2×106个L929细胞在26℃共孵育3h得到保存后的样本，之后使用SEM观察样本形貌，保存后的生物样本可置于室温长期保存。
(3)参照实施例1步骤(3)的方法，测试包封样本在高温高湿环境中第1、7、14天的基因组DNA浓度和循环测试CT值，并检验1天样本DNA结构完整性，实验结果如表1～2和图8所示。
本对比例与实施例1的不同之处：细胞生物样本未脱除生物样本包封层。
对比例4蚯蚓生物样本无组织固定剂对比例
一种生物样本及其DNA保存剂对应的大尺度生物样本(如蚯蚓)DNA长期常温保存及提取方法，包括如下步骤：
(1)保存剂的配制，其配方包括如下按重量份计的组分：200份组织渗透剂二甲基亚砜，7.5份反应型细胞包封剂四甲氧基硅烷，0.2份pH调节剂盐酸，10份离子浓度调节剂氯化钠，780份无RNase纯化水。
(2)将配置好的保存剂10mL和0.3g的蚯蚓样本在26℃共孵育360h，期间每48～96h更换一次溶液，孵育完成后得到保存后的样本，之后使用SEM观察样本形貌。
(3)参照实施例1步骤(3)的方法，测试包封样本在高温高湿环境中第1、7、14天的基因组DNA浓度和循环测试CT值，并检验1天样本DNA结构完整性，实验结果如表1～2和图8所示。
本对比例与实施例2的不同之处：蚯蚓生物样本未加入组织固定剂。
对比例5蚯蚓生物样本无反应型生物样本包封剂对比例
一种生物样本及其DNA保存剂对应的大尺度生物样本(如蚯蚓)DNA长期常温保存及提取方法，包括如下步骤：
(1)保存剂的配制，其配方包括如下按重量份计的组分：600份组织固定剂无水乙醇，200份组织渗透剂二甲基亚砜，0.2份pH调节剂盐酸，10份离子浓度调节剂氯化钠，180份无RNase纯化水。
(2)将配置好的保存剂10mL和0.3g的蚯蚓样本在26℃共孵育360h，期间每48～96h更换一次溶液，孵育完成后得到保存后的样本，之后使用SEM和Micro CT观察样本形貌，结果如图5和图7所示。
(3)参照实施例1步骤(3)的方法，测试包封样本在高温高湿环境中第1、7、14天的基因组DNA浓度和循环测试CT值，并检验1天样本DNA结构完整性，区别在于无需加入BOE溶液浸泡(保存剂中不含包封剂)，实验结果如表1～2和图8所示。
本对比例与实施例2的不同之处：蚯蚓生物样本未加入反应型生物样本包封剂。
对比例6未脱除包封层对比例
一种生物样本及其DNA保护剂对应的大尺度生物样本(如蚯蚓)DNA长期常温保存及提取方法，包括如下步骤：
(1)保存剂的配制，其配方包括如下按重量份计的组分：600份组织固定剂无水乙醇，200份组织渗透剂二甲基亚砜，7.5份反应型细胞包封剂四甲氧基硅烷，0.2份pH调节剂盐酸，10份离子浓度调节剂氯化钠，180份无RNase纯化水；
(2)将配置好的保存剂10mL和0.3g的蚯蚓样本在26℃共孵育360h，期间每48～96h更换一次溶液，孵育完成后得到保存后的样本，之后使用SEM观察样本形貌。
(3)参照对比例4步骤(3)的方法，测试包封样本在高温高湿环境中第1、7、14天的基因组DNA浓度和循环测试CT值，并检验1天样本DNA结构完整性，实验结果如表1～2和图8所示。
本对比例与实施例2的不同之处：蚯蚓生物样本未脱除生物样本包封层。
表1样品中的DNA浓度检测结果
Figure BDA0004143857470000091
*0天的数据为未经处理的生物样本检测结果
表2样品中的CT值检测结果
编号 0天CT值* 1天CT值 7天CT值 14天CT值
实施例1 18.26 19.54 21.78 22.7
实施例2 15.75 16.41 17.25 17.50
对比例1 18.26 23.01 27.14 31.40
对比例2 18.26 19.75 22.54 28.13
对比例3 18.26 23.93 26.13 30.96
对比例4 15.75 23.85 28.42 31.33
对比例5 15.75 22.65 28.13 31.62
对比例6 15.75 18.67 23.11 28.69
*0天的数据为未经处理的生物样本检测结果
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种生物样本基因组DNA常温长期保存剂及其应用，其特征在于包括如下按重量份计的组分：
10～1000份的组织固定剂，10～1000份组织渗透剂，1～150份反应型生物样本包封剂，0.1～100份pH调节剂，0.1～100份离子浓度调节剂、10～500份水。
2.根据权利要求1所述的保存剂，其特征在于：
所述组织固定剂为100～1000份；
所述组织渗透剂为100～1000份；
所述反应型生物样本包封剂为1～100份；
所述pH调节剂为0.1～50份；
所述离子浓度调节剂为0.1～50份。
3.根据权利要求1所述的保存剂，其特征在于：
所述组织固定剂为500～950份；
所述组织渗透剂为500～950份；
所述反应型生物样本包封剂为2～30份；
所述pH调节剂为1～20份；
所述离子浓度调节剂为1～20份。
4.根据权利要求1所述的保存剂，其特征在于：
所述组织固定剂为无水甲醇、无水乙醇、丙酮中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的保存剂，其特征在于：
所述组织渗透剂为二甲基亚砜、甘油、月桂氮酮、异山梨醇二甲醚、N-正烷基苯并异噻酮唑酮、环己六醇中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的保存剂，其特征在于：
所述的反应型生物样本包封剂为甲基三甲氧基硅烷、甲基二乙氧基硅烷、乙基三乙氧基硅烷、甲基三乙氧基硅烷、正硅酸四乙酯(TEOS)、正硅酸四甲酯(TMOS)、双(三甲基硅烷基)乙酰胺(BSA)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、3-巯丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)、三甲基氯硅烷(TMCS)、氯三乙氧基硅烷(TECS)、辛基三甲氧基硅烷、环己基甲基二甲氧基硅烷、三甲氧基甲硅烷、三乙氧基硅烷、苄基三乙氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、异丁基三乙氧基硅烷，优选为，可形成纳米层的甲基三乙氧基硅烷、正硅酸四乙酯(TEOS)、正硅酸四甲酯(TMOS)、乙烯基三甲氧基硅烷、异丁基三乙氧基硅烷中的至少一种；更优选为，可形成无机纳米层的甲基三甲氧基硅烷、甲基三乙氧基硅烷、正硅酸四乙酯(TEOS)、正硅酸四甲酯(TMOS)中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的保存剂，其特征在于：
所述pH调节剂为盐酸、醋酸、磷酸、硫酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、Tris中的至少一种；
所述的离子强度调节剂为氯化钠、氯化钾、氯化铵、磷酸钠、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、醋酸钠中的至少一种；
所述的水为纯水。
8.一种生物样本基因组DNA常温长期保存方法，其特征在于包括如下步骤：
将权利要求1～7任一所述的生物样本常温长期保存剂生物样本共同孵育，得到保存后的生物样本。
9.根据权利要求8所述的保存方法，其特征在于：
所述的保存剂与生物样本的体积比为1000～1：1；
所述的孵育的条件为0℃～37℃共孵育5min～720h。
10.权利要求1～7任一所述的生物样本常温长期保存剂在保存生物样本中的应用。
CN202310298038.0A 2023-03-24 2023-03-24 一种生物样本基因组dna常温长期保存剂及其应用 Pending CN116287101A (zh)

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