CN116024203A - 一种水凝胶固定化复合生物酶的制备方法及其产品和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水凝胶固定化复合生物酶的制备方法及其产品和应用。由于细菌细胞壁的保护作用，传统工艺对抗性基因的去除效率低。本发明利用聚丙烯酰胺水凝胶联合固定漆酶、水解酶及核酸酶，使得酶有效包覆在载体内部，避免了游离酶易流失及活性易降低的问题，且重复利用性好，不产生二次污染；通过固定化漆酶降低磺胺嘧啶浓度，通过水解酶水解细菌细胞壁，释放胞内ARG，再利用核酸酶对释放的胞内ARG进行降解，达到快速消除水中ARG的目的。所述方法对ARG及磺胺嘧啶具有很高的去除效率，且处理简单、高效、安全，适用于含抗生素及ARG污染的养殖废水的修复处理，解决了水溶性酶环境稳定性差和回收利用困难问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种水凝胶固定化复合生物酶的制备方法及其产品和应用，特别涉及聚丙烯酰胺水凝胶固定化复合生物酶在降解养殖废水中抗生素以及降低抗性基因的方法，属于生物环保领域。
背景技术
畜禽养殖过程中，由于抗生素的过量使用且由于其在动物体内不能被完全代谢，使得抗生素在动物粪便中富集。残留在动物粪便中的抗生素通过对微生物施加选择性压力，加速抗生素抗性基因(ARGs)的传播及富集。富集的抗生素和ARGs进入水环境中，最终危害人类健康。因此，如何在修复养殖废水中抗生素污染的同时阻断ARGs的传播成为发展健康养殖最迫切的需求。微生物的胞内ARG是ARG最稳定的存在形式，具有稳定且难以去除的问题。到目前为止，包括过滤、物理吸附、化学氧化、微生物降解、酶降解等途径已经广泛用于抗生素及ARG污染修复。酶降解技术由于反应温和无二次污染受到越来越多的关注。漆酶通过其对底物的电子提取及电子的传递强化对抗生素的去除，且具有修复效率高、无二次污染的优势；水解酶包括蛋白酶、淀粉酶及溶菌酶可以有效加速大分子物质的水解，同时具有加速细菌细胞水解的作用；溶菌酶是一种能专门作用于革兰氏阳性菌细胞壁中N乙酰胞壁酸的水解酶；核酸酶可以水解并分解DNA。但是，游离酶极易流失，导致其活性降低，无法重复利用，造成二次污染。同时，如何同时发挥上述酶对抗生素抗性的协同去除作用尚无研究。为此，需要通过游离酶固定化技术改善游离酶操作稳定性和可重复利用性，同时需要复合多种生物酶强化对抗生素抗性的去除，从而有效削减水产养殖塘废水中抗生素抗性。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供了一种重复利用性好、不产生二次污染的水凝胶固定化复合生物酶的制备方法及其产品和应用，以强化对ARG的去除。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供了一种水凝胶固定化复合生物酶的制备方法，包括以下步骤：将漆酶、核酸酶及水解酶加入到无酶水中混匀，使用固定化剂制备水凝胶固定化复合酶，制备完成后将水凝胶固定化复合酶置于超纯水中浸泡，经洗涤液清洗后将制备的水凝胶复合固定化酶置于冷冻干燥机中，干燥结束后将其磨碎成小颗粒即得到水凝胶固定化复合酶材料。
其中，所述水解酶、漆酶及核酸酶的浓度分别为0.5-1.5g/L，0.2-0.5g/L及200-500U/L；所述水解酶包括溶菌酶、α-淀粉酶及蛋白酶，三种生物酶质量比为1：1：1。
其中，所述核酸酶包括但不限于DNase I，其他核酸酶也可以用于本发明。
其中，所述固定化剂包括丙烯酰胺、N,N′-亚甲基双丙烯酰胺和K2S2O8。
其中，每20mL酶溶液中所述固定化剂的投加量为1.065g丙烯酰胺、0.1g N,N′-亚甲基双丙烯酰胺和0.122g K2S2O8。
本发明还提供了所述的制备方法得到的水凝胶固定化复合生物酶。
本发明还提供了所述的水凝胶固定化复合生物酶在降解养殖废水中抗生素和去除污水中的抗生素抗性基因中的应用。
本发明还提供了所述的水凝胶固定化复合生物酶降解养殖废水中抗生素和去除污水中的抗生素抗性基因的方法，包括以下步骤：将水凝胶固定化复合生物酶加入到含有抗生素的养殖废水中，置于摇床中，避光反应。
其中，所述抗生素为磺胺嘧啶，所述抗生素抗性基因为sulI,sulII或sulIII，所述抗生素在废水中的浓度为200μg/L，所述水凝胶固定化复合生物酶与废水的质量体积比为5-20mg/L。
反应机理：本发明首先利用水解酶(蛋白酶、淀粉酶及溶菌酶)有效破坏细菌细胞壁，提高胞内ARG的释放速率，进而利用核酸酶快速降低释放的ARG，从而达到削减胞内ARG及游离ARG的目的。同时漆酶的存在可以有效降低抗生素浓度，从而降低抗生素选择性压力，有效降低ARG的富集效率。针对实际修复过程中，生物酶容易受外界环境影响，且不能重复利用的问题，本发明采用酶固定化技术，通过利用聚丙烯酰胺水凝胶固定化酶技术提高酶的稳定性，提高生物酶在实际应用中的稳定性和催化效率。通过联合固定化漆酶、核酸酶及水解酶，耦合几种酶各自的功能，从而达到经济有降低水产养殖废水中抗生素抗性的目的。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
1、本发明利用聚丙烯酰胺水凝胶联合固定漆酶、水解酶及核酸酶，使得酶有效包覆在载体内部，避免了游离酶易流失及活性易降低的问题，且重复利用性好，不产生二次污染；
2、本发明中漆酶对抗生素具有较高的催化降解能力，可以显著降低废水中抗生素对微生物的选择性压力；
3、水解酶(蛋白酶、α-淀粉酶及溶菌酶)具有破坏细菌细胞壁，具有好的水解溶胞效果，使得胞内的抗生素抗性基因释放到胞外，最终使得释放的胞内ARG在核酸酶的作用下被降解，为去除水产养殖废水中ARG提供了新思路；
4、本发明方法对ARG及磺胺嘧啶具有很高的去除效率，且整个过程中，处理简单、高效、安全，适用于含抗生素及ARG污染的养殖废水的修复处理；
5、本发明利用新兴的酶固定化技术解决水溶性酶环境稳定性差和回收利用困难问题，将几种生物酶通过物理或化学方法固定在载体上，形成不溶性酶衍生物，从而具有良好的可重复使用性能；
6、通过漆酶降低抗生素选择性压力，通过水解酶使细菌细胞壁破裂释放胞内ARG，从而可以快速将细菌的胞内ARG释放到胞外，通过核酸酶降解释放的ARG，降低了ARG的富集及水平转移的风险，综合发挥了几种酶的协同降解优势。
附图说明
图1为聚丙烯酰胺水凝胶固定化复合生物酶的制备流程图；
图2为聚丙烯酰胺水凝胶固定化复合生物酶的实物图；
图3为聚丙烯酰胺水凝胶固定化复合生物酶的接触角；
图4为培养24h后聚丙烯酰胺水凝胶固定化复合生物酶对养殖废水中磺胺类ARGs(sulI，sulII及sulIII)的去除效果图；所述水解酶、漆酶及DNase I各自的浓度分别为1.5g/L，0.5g/L及500U/L；
图5为培养24h后聚丙烯酰胺水凝胶固定化复合生物酶对磺胺类抗性基因及磺胺嘧啶的循环去除效果图；所述水解酶、漆酶及DNase I各自的浓度分别为1.5g/L，0.5g/L及500U/L。
图6为培养24h后聚丙烯酰胺水凝胶固定化复合生物酶对养殖废水中磺胺类ARGs(sulI,sulII及sulIII)及磺胺嘧啶的去除效果图；所述水解酶、漆酶及DNase I各自的浓度为1g/L，0.35g/L及350U/L；
图7为培养24h后聚丙烯酰胺水凝胶固定化复合生物酶对养殖废水中磺胺类ARGs(sulI,sulII及sulIII)及磺胺嘧啶的去除效果图；所述水解酶、漆酶及DNase I各自的浓度为0.5g/L，0.2g/L及200U/L。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。所用材料、试剂方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。
下述实施例中用到的实验仪器和药品如下：
紫外分光光度计(UV-754N；上海佑科仪器仪表有限公司)；
液相色谱质谱联用仪(Agilent 1200-6410B；安捷伦科技(中国)有限公司)；
冷冻干燥机(Scientz-18N；宁波新芝)。
实验所用水产养殖废水取自江苏某畜禽养殖场，磺胺嘧啶浓度为0.2mg/L：
表1实验试剂一览表
使用液相色谱质谱联用技术测定磺胺嘧啶浓度。抗性基因的测试委托上海启因生物有限公司进行测试。磺胺嘧啶的液质联用测定方法、目标基因的测试方法及引物公开于Chemical Engineering Journal.350,920-929中。
实施例1聚丙烯酰胺水凝胶复合固定化生物酶的制备
按照图1所示步骤制备聚丙烯酰胺水凝胶复合固定化生物酶。首先，向20mL无酶水中加入漆酶、水解酶(蛋白酶、淀粉酶及溶菌酶)及核酸酶三种生物酶，所述水解酶、漆酶及DNase I各自的浓度为1.5g/L，0.5g/L及500U/L。所述水解酶包括α-淀粉酶、蛋白酶及溶菌酶，三种生物酶质量比为1：1：1，漆酶购自南京都莱生物公司；水解酶及淀粉酶购自北京索莱宝科技有限公司；溶菌酶购自北京博奥拓达科技有限公司；核酸酶DNase I购自北京百奥莱博有限公司。其次，在上述溶液中加入1.065g聚丙烯酰胺，0.1g N,N′-亚甲基双丙烯酰胺和0.122g K2S2O8，得到20mL混合溶液，将所得的混合溶液在N2吹脱下充分搅拌20min，使其均质化。然后，置于37℃水浴锅中水浴加热30min至溶液完全凝胶化，反应生成复合固定化酶。最后，将复合固定化酶置于超纯水中浸泡24小时后，以除去吸附在固定化复合生物酶表面未反应的试剂(图2A)。再将其置于冷冻干燥机中进行-50℃条件下冷冻干燥24小时(图2B)。干燥后磨碎得到所需的聚丙烯酰胺水凝胶固定化复合生物酶粉末(图2C)。如图2D所示，冷冻干燥磨碎后的聚丙烯酰胺水凝胶固定化复合生物酶呈现粉末状。通过测量上清液浊度，其值小于1NTU，说明聚丙烯酰胺水凝胶固定化复合生物酶在溶液中具有良好的沉降性能。
实施例2验证聚丙烯酰胺水凝胶固定化复合生物酶对养殖废水中抗生素和抗性基因的抗性
为了验证实施例1聚丙烯酰胺水凝胶固定化复合生物酶的技术效果，将聚丙烯酰胺水凝胶固定化复合生物酶用于养殖废水水样中抗生素及ARG浓度进行测定，具体步骤如下：
S1、向含有50mL磺胺嘧啶浓度为200μg/L的养殖废水中投加聚丙烯酰胺水凝胶固定化复合生物酶，使得聚丙烯酰胺水凝胶固定化复合生物酶的终浓度为5mg/L，置于30℃、120rpm摇床中，在pH 6，温度为25℃时，避光反应24h，以此削减水中的抗生素及抗性基因，完成水处理；分别取0h、12h、24h反应后的水样进行后续实验；
S2、将步骤S1中结束的反应液静置后，去除上清液，继续向该体系中添加50mL上述养殖废水，开展下一批次的循环降解实验，验证制备的固定化材料的降解性能。本实施例中循环次数为3次，验证固定化复合生物酶对磺胺嘧啶的降解性能。经3次循环后，测量聚丙烯酰胺水凝胶固定化复合生物酶的接触角(图3)，湿润角大约为30度，说明聚丙烯酰胺水凝胶复合生物酶具有很好的亲水性，容易被水透过。
S3、采集步骤S1及步骤S2处理完的出水。采集过程如下：将反应器内的液体旋转均匀，采集体积为30mL，使用0.22μm滤膜进行抽滤截留水中的细菌，收集滤膜并提取滤膜上的细菌基因组DNA。过膜后的水样用来分析磺胺嘧啶的浓度。
S4、对滤膜上截留的细菌使用DNA提取试剂盒进行DNA的提取。使用分光光度计测定并计算A260/A280值，大小均在1.8附近，说明DNA质量合格。合格的DNA委托上海启因生物技术有限公司用荧光定量qPCR检测ARG在0h和24h时的丰度，通过公式(1)计算24h目标ARG的去除效率λ(％)。
λ(％)＝(Gene abundance(Copies/mL)0h-Gene abundance(Copies/mL)24h)/Gene
abundance(Copies/mL)0h(1)
其中，Gene abundance(Copies/mL)0h代表目标ARG在反应前的绝对拷贝数，Gene
abundance(Copies/mL)24h代表目标ARG在反应24h后的绝对拷贝数，
S5、使用液相色谱质谱联用仪测定过膜后的水样中剩余的磺胺嘧啶浓度Ct磺胺嘧啶(μg/L)，并计算抗生素的去除效率η(％)。
η(％)＝(200-Ct磺胺嘧啶)/200
实验结果：步骤S1中聚丙烯酰胺水凝胶固定化复合生物酶与养殖废水反应0、12、24小时后，所得ARGs(sulI，sulII及sulIII)及磺胺嘧啶的浓度如表2所示。
表2
根据表2所述浓度，分别计算聚丙烯酰胺水凝胶固定化复合生物酶对磺胺嘧啶及磺胺类ARGs(sulI，sulII及sulIII)的去除效率。图4结果表明，在12h时，磺胺嘧啶降解率达到70％以上，12-24小时内，磺胺嘧啶降解率达到92.86％，24小时后磺胺嘧啶的降解效果仍然维持在98％。反应24h过后，样本中sulI去除率达到60％，其中sulII及sulIII的去除效率最高，均接近80％。
步骤S2的处理结果可以从图5看出，经过连续三轮反应，固定化复合生物酶对磺胺类ARGs(sulI，sulII及sulIII)及磺胺嘧啶仍保持较高的去除效率，去除效率没有显著下降(p>0.05)。对sulI，sulII及sulIII的去除效率分别为65％，80％及79％，对磺胺嘧啶的去除效率达到98％。
实施例3验证不同复合生物酶组分浓度变化对水产养殖废水中抗生素和抗性基因的抗性
重复实施例1及实施例2的操作，仅改变投加水解酶、漆酶及DNase I各自的浓度，分别为1g/L，0.35g/L及350U/L。按照实施例1中的步骤制备聚丙烯酰胺水凝胶固定化复合生物酶。重复实施例2中的步骤测定样本中sulI、sulII、sulIII和磺胺嘧啶的去除效率，测得反应前后的ARGs(sulI，sulII及sulIII)及磺胺嘧啶的浓度如表3所示。
表3
| 0h(Copies/mL) | 12h(Copies/mL) | 24h(Copies/mL) | |
| sulI | <![CDATA[1×10<sup>8</sup>±1.5×10<sup>7</sup>]]> | - | <![CDATA[4.8×10<sup>7</sup>±7×10<sup>6</sup>]]> |
| sulII | <![CDATA[5×10<sup>7</sup>±1.5×10<sup>7</sup>]]> | - | <![CDATA[3×10<sup>7</sup>±2×10<sup>6</sup>]]> |
| sulIII | <![CDATA[5.7×10<sup>5</sup>±1.2×10<sup>5</sup>]]> | - | <![CDATA[2.5×10<sup>5</sup>±1.8×10<sup>4</sup>]]> |
| 磺胺嘧啶 | 200 | 124±18.6 | 76±15.2 |
根据表3所述浓度，分别计算聚丙烯酰胺水凝胶固定化复合生物酶对磺胺嘧啶及磺胺类ARGs(sulI，sulII及sulIII)的去除效率。图6结果表明，24小时内，样本中sulI,sulII及sulIII的去除效率分别为52％，40％及56％，磺胺嘧啶的去除效率为62％。
实施例4验证不同复合生物酶组分浓度对水产养殖废水中抗生素和抗性基因的抗性
重复实施1及实施例2的操作，仅改变投加水解酶、漆酶及DNase I各自的浓度，分别为0.5g/L，0.2g/L及200U/L。按照实施例1中的步骤制备聚丙烯酰胺水凝胶固定化复合生物酶。重复实施例2中的步骤测定样本中sulI、sulII、sulIII和磺胺嘧啶的去除效率，，测得反应前后的ARGs(sulI，sulII及sulIII)及磺胺嘧啶的浓度如表4所示。
表4
根据表4所述浓度，分别计算聚丙烯酰胺水凝胶固定化复合生物酶对磺胺嘧啶及磺胺类ARGs(sulI，sulII及sulIII)的去除效率。图7结果表明，24小时内，样本中sulI，sulII及sulIII的去除效率分别为48％，44％及65％，磺胺嘧啶的去除效率55％。
Claims (9)
1.一种水凝胶固定化复合生物酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将漆酶、核酸酶及水解酶加入到无酶水中混匀，使用固定化剂制备水凝胶固定化复合酶，制备完成后将水凝胶固定化复合酶置于超纯水中浸泡，经洗涤液清洗后将制备的水凝胶复合固定化酶置于冷冻干燥机中，干燥结束后将其磨碎成小颗粒即得到水凝胶固定化复合酶材料。
2.根据权利要求1所述的水凝胶固定化复合生物酶的制备方法，其特征在于，所述水解酶、漆酶及核酸酶的浓度分别为0.5-1.5g/L，0.2-0.5g/L及200-500units/L；所述水解酶包括溶菌酶、α-淀粉酶及蛋白酶，三种生物酶质量比为1：1：1。
3.根据权利要求1所述的水凝胶固定化复合生物酶的制备方法，其特征在于，所述核酸酶包括DNase I。
4.根据权利要求1所述的水凝胶固定化复合生物酶的制备方法，其特征在于，所述固定化剂包括丙烯酰胺、N,N′-亚甲基双丙烯酰胺和K2S2O8。
5.根据权利要求4所述的水凝胶固定化复合生物酶的制备方法，其特征在于，每20mL酶溶液中所述固定化剂的投加量为1.065g丙烯酰胺、0.1g N,N′-亚甲基双丙烯酰胺和0.122gK2S2O8。
6.权利要求1～5任一项所述的制备方法得到的水凝胶固定化复合生物酶。
7.权利要求6所述的水凝胶固定化复合生物酶在降解水产养殖废水中抗生素和/或去除污水中的抗生素抗性基因中的应用。
8.一种权利要求6所述的水凝胶固定化复合生物酶降解水产养殖废水中抗生素和去除污水中的抗生素抗性基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：将水凝胶固定化复合生物酶加入到含有抗生素的养殖废水中，置于摇床中，避光反应。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述抗生素为磺胺嘧啶，所述抗生素抗性基因为sulI，sulII或sulIII，所述抗生素在废水中的浓度为200μg/L，所述水凝胶固定化复合生物酶与废水的质量体积比为5-20mg/L。
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