CN110643679A - 一种水环境dna采集保存卡及其制作方法 - Google Patents

一种水环境dna采集保存卡及其制作方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种水环境DNA采集保存卡及其制作方法，涉及生物技术领域，为解决目前常规的水环境DNA的研究中因为采集现场不具备DNA分离纯化条件，需要携带水样回到实验室中进行环境样本的处理与DNA的提取，储存和运输条件要求较高，成本增加，保存时间有限的问题。包括具有裂解细胞和DNA吸附能力的材料，所述吸附材料内吸附有盐分，所述盐分包括细胞裂解剂、核酸酶抑制剂、核酸稳定剂和抗氧化剂。其中，所述细胞裂解剂为Tris盐酸、NP40(乙基苯基聚乙二醇)、氯化钠、异硫氰酸胍和SDS(十二烷基磺酸钠)中的一种或几种的组合；所述核酸酶抑制剂为金属离子螯合剂，所述金属离子螯合剂为EDTA和EDTA钠盐中的一种。

Description

一种水环境DNA采集保存卡及其制作方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种水环境DNA采集保存卡及其制作方法。
背景技术
生态环境与生物多样性研究一直都是相关领域关注的重点。环境DNA通常是指从环境样本中获取的各物种DNA的总和,因其可以快速的进行环境生物物种的鉴定而备受关注。淡水生态系统是人们赖以生存的重要资源之一,近年来生态环境恶化、生物多样性减少使得淡水资源调查和水生生物物种监测成为当前生态学相关领域的研究热点。相对于传统的物种监测方法,环境DNA监测具有快速、简便、非侵入性等优点,但物种DNA会受到水环境中各种因素的影响而出现较大的波动。因此针对水环境中游离DNA进行系统的表征对于其在物种鉴定、多样性分析和环境保护方面的研究意义重大。而该相关研究的重要前提就是水环境样本的获取、保存、运输以及DNA的提取，稳定可靠而又方便的水环境DNA储存方案的研究显得尤为重要。
目前常规的水环境DNA的研究中，绝大多数的研究者因为采集现场不具备DNA分离纯化条件，需要携带水样回到实验室中进行环境样本的处理与DNA的提取；此外水环境DNA研究中取样量没有统一的标准，取样量大能够获取更多的代表性，但对后期储存和运输条件(储存时间与储存温度等)要求较高，成本增加，保存时间有限，随时间延长核酸酶对样品中DNA的降解也愈发严重，从而影响环境DNA的质量及其代表性，因此针对近年来水环境基因资源研究日益增加的迫切需求，特别是针对大规模现场采样与预处理，开发一种水环境DNA的保存方法至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水环境DNA采集保存卡及其制作方法，以解决上述背景技术中提出的目前常规的水环境DNA的研究中因为采集现场不具备DNA分离纯化条件，需要携带水样回到实验室中进行环境样本的处理与DNA的提取，储存和运输条件要求较高，成本增加，保存时间有限的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种水环境DNA采集保存卡，包括具有裂解细胞和DNA吸附能力的材料，所述吸附材料内吸附有盐分，所述盐分包括细胞裂解剂、核酸酶抑制剂、核酸稳定剂和抗氧化剂。
其中，所述细胞裂解剂为Tris盐酸、NP40(乙基苯基聚乙二醇)、氯化钠、异硫氰酸胍和SDS(十二烷基磺酸钠)中的一种或几种的组合；
所述核酸酶抑制剂为金属离子螯合剂，所述金属离子螯合剂为EDTA和EDTA钠盐中的一种；
所述核酸稳定剂为pH 8.0的Tris-HCl缓冲液，是将浓盐酸加入Tris碱和EDTA钠盐，调节pH至8.0制成；
所述抗氧化抑制剂是硫脲、TBHQ(叔丁基对苯二酚)、尿酸或尿酸盐中的一种；
所述盐分来自pH8.0的Tris-HCl缓冲液，所述pH 8.0的Tris-HCl缓冲液是将浓盐酸加入溶解有Tris碱、EDTA、SDS、NaCl，NP40；
优选的，所述异硫氰酸胍和硫脲的溶液中，调节pH到8.0制成。
优选的，所述保存卡的材质采用具有吸附DNA能力的材料为滤纸、硝酸纤维素膜、尼龙膜、玻璃纤维膜或硅胶膜中的一种；所述材料的规格是厚度为0.2—1mm的卡片。
优选的，所述水环境DNA采集保存卡的制作方法，采用如下步骤：
步骤1：配制pH值为8.0，浓度为0.01M-0.5M的Tris-HCl缓冲液A，该缓冲液中含有0.1M-0.5M的NaCl，0.01M-0.02M的EDTA，0.1％-2％的NP40，0.5％-5％的SDS(十二烷基磺酸钠)，1M-2M的异硫氰酸胍和15-50μM的硫脲；
步骤2：将吸附材料放入上述水溶液中震荡，使溶液完全吸收；取出卡片，自然干燥或80℃烘箱烘干即可，得采样后的保存卡。
优选的，所述水环境DNA采集保存卡获取DNA样本的方法，采用如下步骤：将所述采样后的保存卡用剪刀剪下任意部位，放入离心管中用无核酶的去离子水将卡片表面的盐分和水环境生物残留漂洗掉；再将DNA洗脱下来即可。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明与目前常规的水环境采样及DNA提取保存方法相比具有操作简单方便，成本低廉，便携易于运输，保存时间长的优点。
2.本发明采用的材料是具有吸附能力的卡片，样本采集非常方便，只需要将过滤的水样沉淀溶解到特定的缓冲液中，混匀后滴到卡片上，或者直接将卡片侵入溶解水样沉淀的缓冲液中即可，干燥后可长期保存。适合于各种场合下操作，也适合于大规模样本采集工作。由于体积小，重量轻，便于运输。
3.本发明的卡片中含有细胞裂解剂，在水环境样本沉淀与吸附材料接触后即可使其中的细胞破裂，释放出DNA，由于有核酸酶抑制剂和抗氧化剂，DNA能够避免被降解。随即DNA跟吸附结合，避免了跟外界物质的物理接触，得到进一步保护。这种卡片在室温保存就可以，避免了低温保存的高昂花费，并且保存时间更长。
4.本发明的卡片中保存的是DNA，只要用水将卡片介质上的盐离子和水环境生物残留物漂洗掉就得到纯净DNA，避免了提取过程，使得操作更为简便，便于批量操作，并且节约了DNA提取试剂的花费。
附图说明
图1为本发明的利用水环境DNA保存卡直接进行16srDNA扩增的凝胶电泳图谱。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1：水环境DNA采集保存卡的制作1
1)用300ml去离子水溶解3gTris碱、3.72gEDTANa2﹒H20、25gSDS、118g异硫氰酸胍、1.9mg硫脲、1％的NP40和4.383gNaCl，用浓盐酸调节pH至8.0，加去离子水定容到500ml；
2)剪裁一定大小的硝酸纤维素膜，厚度约0.3mm，放入一定体积的上述溶液中(按照50μL溶液/cm2吸附材料的比例)，置于密闭容器中防止外界DNA污染，100rpm震荡30分钟，直到溶液被吸收完全。
3)小心取出吸收了盐溶液的卡片，80℃烘烤1小时，充分干燥即可。
实施例2：水环境DNA采集保存卡的制作2
1)用300ml去离子水溶解3gTris碱、1.86gEDTANa2﹒H20、10gSDS、59g异硫氰酸胍、0.95mg硫脲、1％的NP40和2.191gNaCl，用浓盐酸调节pH至8.0，加去离子水定容到500ml；
2)剪裁一定大小的硝酸纤维素膜，厚度约0.3mm，放入一定体积的上述溶液中(按照50μL溶液/cm2吸附材料的比例)，置于密闭容器中防止外界DNA污染，100rpm震荡30分钟，直到溶液被吸收完全。
3)小心取出吸收了盐溶液的卡片，80℃烘烤1小时，充分干燥即可。
实施例3：利用DNA采集保存卡进行环境样本的采集
1)用300ml去离子水溶解3gTris碱、3.72gEDTANa2﹒H20、25gSDS、118g异硫氰酸胍、1.9mg硫脲、1％的NP40和4.383gNaCl，用浓盐酸调节pH至8.0，加去离子水定容到500ml；
2)取水样1L，用滤膜进行过滤，收集滤膜上的沉淀物月50-100mg，加入上述溶液50-100μL，上下剧烈颠倒，使之充分混匀，吸取50μL裂解液小心滴加到DNA采集样品卡上(约2.5cm×2.5cm大小的卡片)，并使其扩散均匀，布满整个卡片，晾干。或者将混匀好的裂解液倒入洁净的平皿中，将2.5cm×2.5cm大小的DNA保存卡侵入其中，时期充分均匀的吸附水环境样本DNA，晾干。
3)干燥后的水环境DNA采集保存卡装于密封袋或其它保存袋中，室温干燥环境保存。
实施例4：从水环境DNA保存卡上获取纯化的DNA
DNA保存在这种卡片上，能够在室温条件下保存至少1年以上，仍然可以用于PCR扩增检测、DNA杂交，测序及其它相关分子生物学研究。重新获取DNA方法如下：
1)用剪刀剪取适当大小的DNA保存卡片(此时采用实施例3中采集后的卡片)，置于1.5ml离心管中；
2)向管中加入100μL去离子水，上下颠倒混匀30s，吸弃水分，短时离心后吸弃水分残留；
3)所得卡片上带有纯净的DNA，可以直接用作PCR反应的模板、核酸杂交等相关的鉴定分析实验。
实验例5：用纯化后的环境DNA样品卡作为模板直接进行PCR扩增
本发明试剂：无核酶水，厂家：Ambion，货号：AM9932
BSA，厂家：NEB，货号：B9001
TaqDNA聚合酶：TaKaRa，货号：R045Q
本发明主要实验仪器：
Eppendorf高速冷冻离心机
凝胶成像系统，厂家：上海勤翔科学仪器有限公司
PCR仪，厂家型号：ThermoFisher，ABI9700
利用16sV3区引物，进行水环境微生物16SrDNAPCR扩增，引物序列16S-F:CCTACGGGNGGCWGCAG，16S-R:GACTACHVGGGTATCTAATCC，扩增目标片段大小318bp左右。
PCR反应体系如下:10μM16s-F和16s-R引物，各1μL，2×PCRMasterMix12.5μL,3-5mm的DNA保存卡(参照实施例4处理),0.1％(w/v)牛血清蛋白(Bovineserumalbumin，BSA)2.5μL，ddH2O补足25μL反应体系，PCR扩增反应的热循环参数为：94℃预变性2min，94℃变性30s，58℃退火lmin，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸8min，10℃保温forever。
取5μLPCR产物在2％琼脂糖凝胶进行电泳，结果见图1。成功在两个DNA保存卡样本上扩增出来了318bp的16sV3区片段，无非特异性扩增。Lane1，Lane2分别为两个样本的扩增结果，M为分子量标志DL1000(最亮的条带为400bp)，从图中可以看出，本发明所制备的水环境DNA采集保存卡能够直接用于16srDNA的扩增。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

Claims (5)

1.一种水环境DNA采集保存卡，包括具有裂解细胞和DNA吸附能力的材料，其特征在于：所述吸附材料内吸附有盐分，所述盐分包括细胞裂解剂、核酸酶抑制剂、核酸稳定剂和抗氧化剂。
其中，所述细胞裂解剂为Tris盐酸、NP40(乙基苯基聚乙二醇)、氯化钠、异硫氰酸胍和SDS(十二烷基磺酸钠)中的一种或几种的组合；
所述核酸酶抑制剂为金属离子螯合剂，所述金属离子螯合剂为EDTA和EDTA钠盐中的一种；
所述核酸稳定剂为pH 8.0的Tris-HCl缓冲液，是将浓盐酸加入Tris碱和EDTA钠盐，调节pH至8.0制成；
所述抗氧化抑制剂是硫脲、TBHQ(叔丁基对苯二酚)、尿酸或尿酸盐中的一种；
所述盐分来自pH8.0的Tris-HCl缓冲液，所述pH 8.0的Tris-HCl缓冲液是将浓盐酸加入溶解有Tris碱、EDTA、SDS、NaCl，NP40；
2.根据权利要求1所述的一种水环境DNA采集保存卡，其特征在于：所述异硫氰酸胍和硫脲的溶液中，调节pH到8.0制成。
3.根据权利要求1所述的一种水环境DNA采集保存卡，其特征在于：所述保存卡的材质采用具有吸附DNA能力的材料为滤纸、硝酸纤维素膜、尼龙膜、玻璃纤维膜或硅胶膜中的一种；所述材料的规格是厚度为0.2—1mm的卡片。
4.根据权利要求书1所述的一种水环境DNA采集保存卡，其特征在于，所述水环境DNA采集保存卡的制作方法，采用如下步骤：
步骤1：配制pH值为8.0，浓度为0.01M-0.5M的Tris-HCl缓冲液A，该缓冲液中含有0.1M-0.5M的NaCl，0.01M-0.02M的EDTA，0.1％-2％的NP40，0.5％-5％的SDS(十二烷基磺酸钠)，1M-2M的异硫氰酸胍和15-50μM的硫脲；
步骤2：将吸附材料放入上述水溶液中震荡，使溶液完全吸收；取出卡片，自然干燥或80℃烘箱烘干即可，得采样后的保存卡。
5.根据权利要求4所述的一种水环境DNA采集保存卡，其特征在于，所述水环境DNA采集保存卡获取DNA样本的方法，采用如下步骤：将所述采样后的保存卡用剪刀剪下任意部位，放入离心管中用无核酶的去离子水将卡片表面的盐分和水环境生物残留漂洗掉；再将DNA洗脱下来即可。
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