CN112251489A - 一种血液rna保护剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种血液RNA保护剂及其制备方法，它涉及医学检验技术领域。一种血液RNA保护剂由以下组分组成：EDTA水、柠檬酸钠、硫酸铵、月桂酸、月桂酰肌氨酸钠、2，4‑癸二酸乙酯。按组分配比取上述原料根据一种血液RNA保护剂的制备方法进行制备即可得到一种血液RNA保护剂。本发明有益效果为：第一时间保护血液中的RNA,能更好地保证标本RNA的完整性。

Description

一种血液RNA保护剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种血液RNA保护剂及其制备方法。

背景技术

核糖核酸(RNA)存在于细胞及部分病毒、类病毒当中，并行使遗传信息载体的功能。其广泛参与各项重要的生命历程，对于生命活动的维系具有重要作用。根据RNA的功能可将RNA大致分为四类：1)mRNA：即信使RNA，主要功能是将DNA上的遗传信息精确无误地转录下来，以传递遗传信息；2)tRNA：具有特异识别、转运氨基酸功能；3)rRNA：核糖体的重要组成成分。4)microRNA：具有调控功能。由此可见，RNA在生物体内，对于生物体生命活性具有重要意义。

全血作为较易获取的人体标本，特别适用于实验室和临床检测。 RNA提取是进行诸如定量RT-PCR、微矩阵、RNA定位、cDNA文库的建立、基因表达和其他种类的下游应用研究的基础。但由于RNA自身结构为单链状态，极不稳定，同时广泛存在的RNaseA时刻发挥着降解 RNA的功能，其活性难以被抑制，使得从全血中提取RNA以及对RNA 的保存相对困难。

为了实现RNA功能探索及生理意义相关研究，通常需要对RNA进行分离纯化，并将纯化的RNA进行冷冻保存。RNA的易降解性使RNA 的保存面临严峻的挑战。目前，研究者通常采用添加RNA酶抑制剂的方法，人为添加RNA酶抑制剂到RNA溶液当中，以降低或抑制RNA 酶的催化活性，从而达到RNA保护的目的。

在RNA的实际应用中，RNA的保存依赖于不含有RNase的纯水或者加入EDTA等螯合剂的水溶液来溶解RNA并可在-80℃的超低温冰箱中保存一年，而对于样本量微少的RNA来说，在室温条件下冻存至-80℃过程中会造成不可逆的RNA断裂，同样在-80℃恢复至室温条件下再次的物理性损害会破坏微小RNA原本的生物活性。

市面上已有的RNA酶抑制物往往存在成本很高、运输存储困难、易变质、活性不稳定、反复冻融导致RNA损伤等问题。而血液中的 RNA含量较少，血液中RNA酶含量多，RNA在没有保护的状态下很容易降解消失，开发新型的、易储存运输、活性稳定的RNA保护剂对于RNA保护及相关领域具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种血液 RNA保护剂及其制备方法，该保护剂能够抑制RNA酶活性，保护血液中的RNA不被降解。本发明将采集的血液与RNA保护剂以10：1的比例缓慢充分混匀后，血液中RNA在常温可保存3天，4℃温度下稳定保存至少7天，-20℃至-80℃可长期保存，适用于各种血液RNA的保护和储存。解决现有技术存在的血液长期存放时RNA容易被降解且提取率低的问题，该保护剂RNA保护剂中加入了0.5-1.2ml/l的月桂酰肌氨酸钠，月桂酰肌氨酸钠为白色至淡黄色液体，有特殊气味。溶于水、乙醇或甘油等醇水溶液中。在通常条件下，对热、酸、碱都比较稳定。在室温条件下具有极高的稳定性。并且该浓度范围的月桂酰肌氨酸钠能够避免细菌等微生物的存活，具有明显的抑制细菌真菌等微生物的生长作用，这对于保护微小RNA来说是必要的，否则细菌真菌等微生物的代谢会产生RNase，不利于微小RNA的保存和反复使用，在这样的保护条件下，即使反复冻融RNA样本仍然具有很高的生物活性，避免了液态保存血液样本反复冻融造成的损伤。并且月桂酰肌氨酸钠的化学性质能够提高微小RNA结构稳定性并提高酶反应活性。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案是：一种血液RNA保护剂，由以下含量组分组成：EDTA水6-15mg/ml、柠檬酸钠 10-25mg/ml、硫酸铵500-750mg/ml、月桂酸6-10mg/ml、月桂酰肌氨酸钠0.5-1.2ml/l、2，4-癸二酸乙酯1-3ml/l。它的制备方法包含以下步骤：

步骤一：将各组分按配方称取到容器中；

步骤二：向步骤一中加入500ml灭菌的超纯水，待所有组分溶解后全量转移到1L容量瓶中，多次清洗初次溶解的容器，洗涤液全量转移到容量瓶中，最后定容至1L；

步骤三：将步骤二得到的溶液通过PH调至物将PH值调至 7.2-8.0，得到血液RNA保护剂。

所述PH调至物为NaOH。

所述的血液RNA保护剂与外界采取的血液以1：10的比例缓慢充分均匀混合形成混合液。

所述混合液中的RNA在在常温可保存3天，4℃温度下稳定保存至少7天，-20℃至-80℃可长期保存，适用于各种血液RNA的保护和储存。

采用上述技术方案后，本发明有益效果为：第一时间保护血液中的RNA,能更好地保证标本RNA的完整性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明图1采用Qiagen、Ambion两种RNAlater保存液保存3天后的RNA的电泳结果；

图2是采用本发明血液RNA保护剂4℃保存1天的血液RNA的电泳结果；

图3是采用本发明血液RNA保护剂4℃保存3天的血液RNA的电泳结果；

图4是采用本发明血液RNA保护剂4℃保存7天的血液RNA的电泳结果。

具体实施方式

实施例1

随机抽取1个全血样本，平均分成2组，每组两个。其中1组置于Qiagen RNAlater保存液中，另1组置于Ambion RNAlater保护剂中，常温保存三天后对RNA进行提取，提取结果如表1。从表1中可以看出，采用Qiagen、Ambion两种RNAlater保存液保存3天后的RNA的260/230比值分别为0.42、0.51、0.34、0.46，均严重偏低。这说明提取出来的RNA中残留有大量盐分。RNA降解较为严重。 RNA提取浓度偏低，说明RNA降解较为严重，如图1所示。

表1：采用Qiagen、Ambion两种RNAlater保存液保存3天后RNA的提取浓度

图1采用Qiagen、Ambion两种RNAlater保存液保存3天后的RNA的电泳结果

实施例2对比试验

随机抽取4个全血样本，置于本发明所述血液RNA保护剂中。分别在4℃保存1天、3天、7天后对血液样本RNA进行提取。提取结果如表2-4。4℃保存1天、3天及4℃保存7天后的RNA电泳图如图 2-4。大量的实验数据表明，置于本发明所述的血液RNA保护剂中的血液提取RNA时，血液样品可在常温稳定保存至少3天，4℃温度下稳定保存至少7天。采用本发明提供的血液RNA保存管保存的血液，可以明显抑制RNA的降解，从而提高血液RNA保存的稳定性和提取率，同时简化预处理步骤，且适用于无离心机和低温环境下使用。

表2：采用本发明血液RNA保护剂4℃保存1天的血液RNA的提取浓度

表3：采用本发明血液RNA保护剂4℃保存3天的血液RNA的提取浓度

表4：采用本发明血液RNA保护剂4℃保存7天的血液RNA的提取浓度

以上所述，仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其它修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (5)

1.一种血液RNA保护剂，其特征在于它由以下含量组分组成：EDTA水6-15mg/ml、柠檬酸钠10-25mg/ml、硫酸铵500-750mg/ml、月桂酸6-10mg/ml、月桂酰肌氨酸钠0.5-1.2ml/l、2，4-癸二酸乙酯1-3ml/l。

2.一种血液RNA保护剂的制备方法，其特征在于它包含以下步骤：

步骤一：将各组分按配方称取到容器中；

步骤二：向步骤一中加入500ml灭菌的超纯水，待所有组分溶解后全量转移到1L容量瓶中，多次清洗初次溶解的容器，洗涤液全量转移到容量瓶中，最后定容至1L；

步骤三：将步骤二得到的溶液通过PH调至物将PH值调至7.2-8.0，得到血液RNA保护剂。

3.根据权利要求2所述的一种血液RNA保护剂，其特征在于：所述PH调至物为NaOH。

4.根据权利要求2所述的一种血液RNA保护剂，其特征在于：所述的血液RNA保护剂与外界采取的血液以1：10的比例缓慢充分均匀混合形成混合液。

5.根据权利要求书4所述的一种血液RNA保护剂，其特征在于：所述混合液中的RNA在在常温可保存3天，4℃温度下稳定保存至少7天，-20℃至-80℃可长期保存，适用于各种血液RNA的保护和储存。

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