CN116200455A - 一种rna核酸保存液及其保存与使用方法 - Google Patents

一种rna核酸保存液及其保存与使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于RNA保存技术领域，涉及一种RNA核酸保存液及其保存与使用方法。本发明提供了一种RNA核酸保存液，其包括：焦碳酸二乙酯、单甲氧基聚乙二醇‑二硫‑二维生素E琥珀酸酯和RNA酶抑制剂。本发明还提供了该RNA核酸保存液用于RNA保存的方法，其使得RNA样品以液态保存于低温条件下，可避免反复冰冻溶解对RNA样品造成的物理损害。本发明提供的保存液，使得RNA样本在反转录、PCR等反应体系中不但不影响酶反应效率，还对反应效率和长链RNA的处理均有正面影响，特别对微量RNA的保存、重复使用及运输具有重大应用价值。

Description

一种RNA核酸保存液及其保存与使用方法
技术领域
本发明属于RNA保存技术领域，涉及一种RNA核酸保存液及其保存与使用方法。
背景技术
核糖核酸(Ribonucleic acid,RNA)存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。由至少几十个核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的一类核酸，因含核糖而得名。每个RNA分子都由核苷酸单元长链组成，每个核苷酸单元含有一个含氮碱基、一个核糖和一个磷酸基。含RNA的生物样品一旦从体内采集分离，它的RNA会变得非常不稳定，极易被降解。且RNA是单链结构，在提取过程或保存过程中都极易发生降解。因此，RNA的提取和保存过程需要进行严格的处理，防止RNA发生特异或非特异的降解。
分子生物学实验例如Northern杂交、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等都需要使用高质量的、完整的RNA分子。因此，RNA保存过程中的质量和完整性会显著影响检测结果的准确性和可靠性。实验室中的常用方法为低温保存，即保存于-20℃至-80℃的低温冰箱中，最好是保存在液氮中，以抑制生物样本中RNase的活性。在生物样品中广泛存在并极度稳定的RNase对RNA的水解作用很强，因此将RNA纯化后直接低温保存效果并不理想。
RNA保护剂主要是通过抑制RNase活性来保护RNA分子。RNA保护剂常用的物质主要包括RNase抑制剂如RNasin，4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸钠(HEPES)等。但是，RNA水溶液中加入RNA保护剂，虽能抑制多种RNase，但这些单一抑制剂的使用效果并不理想，易于失活并容易影响后续分子试验中所用酶的活性。因此，一种能够有效防止RNA降解，不影响后续分子试验结果的RNA保存液，对RNA的分子生物学检测非常重要，也是目前RNA保存迫切需要解决的技术难题。
发明内容
本发明目的在于提供一种RNA核酸保存液，其使得RNA样品以液态保存于低温条件下，可避免反复冰冻溶解对RNA样品造成的物理损害，使得RNA样本在反转录、PCR等反应体系中不但不影响酶反应效率，还对反应效率和长链RNA的处理均有正面影响。
基于上述目的，本发明提供了一种RNA核酸保存液，其包括：焦碳酸二乙酯、单甲氧基聚乙二醇-二硫-二维生素E琥珀酸酯和RNA酶抑制剂。
进一步地，本发明提供的RNA核酸保存液中，以摩尔比计，所述焦碳酸二乙酯、单甲氧基聚乙二醇-二硫-二维生素E琥珀酸酯和RNA酶抑制剂的配比为1～6:30～80:500～1500。
优选地，本发明提供的RNA核酸保存液中，还包括铵盐和缓冲剂。所述铵盐为氯化铵，所述缓冲剂为三羟甲基氨基甲烷。本发明提供的铵盐和缓冲剂用于增进前述的RNA核酸保存液对RNA的保护作用，并使得前述的RNA核酸保存液在低温条件下保持液体状态。
进一步地，本发明提供的RNA核酸保存液中，所述RNA酶抑制剂选自甘氨酸或RNasin。
另一方面，本发明涉及上述RNA核酸保存液在RNA保存中的应用。
进一步地，本发明提供的应用中，所述RNA包括mRNA、miRNA、snRNA、scRNA、端粒酶RNA、反义RNA和核酶。
另一方面，本发明涉及一种RNA核酸保存液的保存方法，其包括：将纯化后的RNA样品溶解于上述的保存液，然后在0～25℃环境下直接保存或在低于-10℃环境下以液体形式保存。具体地，本发明提供的低于-10℃环境下以液体形式保存通过铵盐、缓冲剂和密闭后打入惰性气体加压0.1～1MPa实现。
进一步地，本发明提供的RNA核酸保存液的使用方法中，所述焦碳酸二乙酯的摩尔浓度为1～6mM，所述单甲氧基聚乙二醇-二硫-二维生素E琥珀酸酯的摩尔浓度为30～80mM，所述RNA酶抑制剂的摩尔浓度为500～1500mM，所述铵盐的摩尔浓度为10～1000mM，所述缓冲剂的摩尔浓度为10～1000mM。
另一方面，本发明还涉及RNA核酸保存液的保存后的使用，包括：将纯化后的RNA样品溶解于上述的保存液在低于-10℃环境下保存完毕后，将样品温度恢复至5℃，然后离心去除上清液后直接进行后续试验。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具备以下有益效果或优点：
本发明提供了一种RNA核酸保存液，其包括：焦碳酸二乙酯、单甲氧基聚乙二醇-二硫-二维生素E琥珀酸酯和RNA酶抑制剂。本发明还提供了该RNA核酸保存液用于RNA保存的方法，其使得RNA样品以液态保存于低温条件下，可避免反复冰冻溶解对RNA样品造成的物理损害。本发明提供的保存液，使得RNA样本在反转录、PCR等反应体系中不但不影响酶反应效率，还对反应效率和长链RNA的处理均有正面影响，特别对微量RNA的保存、重复使用及运输具有重大应用价值。
具体实施方式
下面，结合实施例对本发明的技术方案进行说明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下述各实施例中所述实验方法和检测方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到。
实施例1
本实施例提供了一种RNA核酸保存液的一种实施例，焦碳酸二乙酯的摩尔浓度为1mM，单甲氧基聚乙二醇-二硫-二维生素E琥珀酸酯(购自西安瑞禧生物科技有限公司)的摩尔浓度为30mM，甘氨酸的摩尔浓度为500mM。
实施例2
本实施例提供了一种RNA核酸保存液的一种实施例，焦碳酸二乙酯的摩尔浓度为3mM，单甲氧基聚乙二醇-二硫-二维生素E琥珀酸酯的摩尔浓度为50mM，甘氨酸的摩尔浓度为1000mM。
实施例3
本实施例提供了一种RNA核酸保存液的一种实施例，焦碳酸二乙酯的摩尔浓度为6mM，单甲氧基聚乙二醇-二硫-二维生素E琥珀酸酯的摩尔浓度为80mM，RNasin的摩尔浓度为1500mM。
实施例4
本实施例提供了一种RNA核酸保存液的一种实施例，焦碳酸二乙酯的摩尔浓度为3mM，单甲氧基聚乙二醇-二硫-二维生素E琥珀酸酯的摩尔浓度为50mM，甘氨酸的摩尔浓度为1000mM，氯化铵的摩尔浓度为10mM，三羟甲基氨基甲烷(Tris)的摩尔浓度为1000mM。
实施例5
本实施例提供了一种RNA核酸保存液的一种实施例，焦碳酸二乙酯的摩尔浓度为3mM，单甲氧基聚乙二醇-二硫-二维生素E琥珀酸酯的摩尔浓度为50mM，甘氨酸的摩尔浓度为1000mM，氯化铵的摩尔浓度为750mM，三羟甲基氨基甲烷(Tris)的摩尔浓度为380mM。
实施例6
本实施例提供了一种RNA核酸保存液的一种实施例，焦碳酸二乙酯的摩尔浓度为3mM，单甲氧基聚乙二醇-二硫-二维生素E琥珀酸酯的摩尔浓度为50mM，RNasin的摩尔浓度为1000mM，氯化铵的摩尔浓度为1000mM，三羟甲基氨基甲烷(Tris)的摩尔浓度为10mM。
实施例7
本实施例提供了本发明所述RNA核酸保存液对提取纯化后RNA的保存效果的研究。
miRNA样本：利用miRNA分离纯化试剂盒(上海沪震实业有限公司)提取人血清的样本。
试验设计如表1所示。
表1，试验设计
Figure BDA0004160809290000061
利用利用miRNA分离纯化试剂盒(购自上海沪震实业有限公司)提取人血清的样本，测定miRNA浓度和OD260nm/OD280nm比值(1.9)后，按表1的设计以体积比1:5的比例添加RNA保存液或DEPC水。将各组样品保存在相应的条件下，4周或1年后利用NanoDrop2000超微量分光光度计分别测定各组样品RNA的浓度，每组试验重复10次，同时利用以下公式计算RNA的降解率：降解率％＝(实验前RNA浓度-实验后RNA浓度)/实验前RNA浓度×100％。试验结果如表2所示。
表2，保存试验结果
分组 降解率/％ 分组 降解率/％
试验组1 0.45 试验组7 0.49
试验组2 0.15 试验组8 0.30
试验组3 0.49 试验组9 0.30
试验组4 0.38 试验组10 1.46
试验组5 0.16 试验组11 3.11
试验组6 0.23 试验组12 2.19
对照组1 15.13 对照组4 19.21
对照组2 13.12 对照组5 17.26
对照组3 30.34 对照组6 100.00
由表2可知，本发明提供的RNA核酸保存液以液态保存于低温条件下，可在-20℃条件下可完整保存至少一年，或在5℃可完整保存一周。
RNA样本：利用总RNA提取试剂盒(TaKaRaMiniBESTUniversalRNAExtractionKit)提取HEK293细胞的总RNA样本。按表1中试验组7～12和对照组4～6的设计以体积比1:5的比例添加RNA保存液或DEPC水，利用荧光定量PCR法检测样品中内参基因GAPDH的表达，并记录检测结果。检测方法为SYBRGreen法，检测体系和程序严格按照说明书进行。检测上游引物为：5’-GGTAGGGAGTTCGAGACCAG-3’；下游引物为：5’-GCCTCTTGAGTAGCTGGGAT-3’。-20℃，打入惰性气体加压1MPa，保存1年后再进行检测。
表3，保存试验荧光定量PCR法检测结果
分组 CT值 保存1年后CT值
试验组7 16.68 16.38
试验组8 16.82 16.75
试验组9 16.6 15.68
试验组10 16.68 16.23
试验组11 16.63 16.36
试验组12 16.57 15.90
对照组4 16.13 4.62
对照组5 16.16 5.19
对照组6 16.22 未见RNA
由表3可知，本发明提供的RNA核酸保存液对PCR等反应体系中不但不影响酶反应效率，还对反应效率和长链RNA的处理均有正面影响，且保存1年后CT值仍能维持较高的水平。
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种RNA核酸保存液，其特征在于，包括：焦碳酸二乙酯、单甲氧基聚乙二醇-二硫-二维生素E琥珀酸酯和RNA酶抑制剂。
2.根据权利要求1所述的RNA核酸保存液，其特征在于，以摩尔比计，所述焦碳酸二乙酯、单甲氧基聚乙二醇-二硫-二维生素E琥珀酸酯和RNA酶抑制剂的配比为1～6:30～80:500～1500。
3.根据权利要求1所述的RNA核酸保存液，其特征在于，还包括铵盐和缓冲剂。
4.根据权利要求1所述的RNA核酸保存液，其特征在于，所述RNA酶抑制剂选自甘氨酸或RNasin。
5.权利要求1～4任一项所述的RNA核酸保存液在RNA保存中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述RNA包括mRNA、miRNA、snRNA、scRNA、端粒酶RNA、反义RNA和核酶。
7.一种RNA核酸保存液的保存方法，其特征在于，包括：将纯化后的RNA样品溶解于权利要求1～4任一项所述的保存液，然后在0～25℃环境下直接保存或在低于-10℃环境下以液体形式保存。
8.根据权利要求7所述的RNA核酸保存液的使用方法，其特征在于，所述焦碳酸二乙酯的摩尔浓度为1～6mM，所述单甲氧基聚乙二醇-二硫-二维生素E琥珀酸酯的摩尔浓度为30～80mM，所述RNA酶抑制剂的摩尔浓度为500～1500mM，所述铵盐的摩尔浓度为10～1000mM，所述缓冲剂的摩尔浓度为10～1000mM。
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