CN103881978A - 一种rna保存液、包含该保存液的试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种RNA保存液、包含该保存液的试剂盒及其应用，属于分子生物学领域，该保存液是浓度为3.8M-5.2M的甜菜碱水溶液，可以根据需要将该保存液制成商业化的试剂盒等；采用本发明的保存液，RNA样品以液态保存于低温条件下，可在-20℃条件下可完整保存至少一年，或在4℃可完整保存一周，可避免反复冰冻溶解对RNA样品造成的物理损害。并且在反转录、PCR等反应体系中不但不影响酶反应效率，还对反应效率和长链RNA的处理均有正面影响，还可用于溶解过度真空干燥保存的RNA。本保存液可以有效地解决RNA溶解、保存及使用时遇到的物理损伤、RNase降解、水解、容器吸附损失及细菌污染等影响，特别是对微量RNA的保存、重复使用及运输具有重大应用价值。

Description

一种 RNA 保存液、包含该保存液的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种RNA保存液、包含该保存液的试剂盒及其应用。

背景技术

核糖核酸（RNA,Nuecleic Acid）为细胞的主要成分之一，参与细胞的各种功能活动，是生物学，医学，药学等生命有关学科研究的重要对象。

在绝大多数涉及RNA表达的研究或医疗应用的诊断预后测定中，均需用高度纯化的RNA作反应的底物。但是，纯化后的RNA极易被核糖核酸酶（即RNase）降解和受冷冻融化过程的影响而断裂。在生物样品中广泛存在并极度稳定的RNase对RNA的水解作用很强，许多RNase对RNA的降解作用不需任何辅助因子，给RNA的纯化、储存和使用带来极大困难。

实际应用中，用不含RNase的水或加入了EDTA、柠檬酸钠等螯合剂的水溶解的RNA可在-80℃的超低温冰箱中保存一年，冻存过程中样品在水溶剂从液态转变为固态，使用时尚需融化成液态，部分RNA在此过程中因相变形成的物理张力的剪切作用而断裂，反复冻融引起不可忽视的损害，如果是微量的RNA样品这种保存方法几乎无法胜任。

为了解决反复冻融对RNA造成损害的问题，现有技术采用将RNA溶解于甲酰胺的方法。甲酰胺作溶剂可保证纯化后的RNA在-20℃条件下保存一年以上并可反复冻融使用而无降解。溶解于甲酰胺的RNA发生构象变化，RNA分子受到压缩，体积比在水溶剂里小。但是，甲酰胺虽然可以抑制RNase反应，同时也会致使RNA变性，增大溶解难度，直接将甲酰胺溶解的RNA用于酶反应会对反应效率带来不确定的影响，使用前需重新沉淀以去除甲酰胺，极大的限制了其应用。

另外，RNA经乙醇沉淀后存放于-20℃可以做到长期保存，但每次使用均需将RNA重新离心洗涤、溶解，给RNA验证引入额外的误差，影响测量的重复性，无助于RNA的反复使用。

当然，许多其他的化学变性剂被报道或者已经用于保存含有RNA的生物样品，如商业化了的RNAlater、TRIZol等，这些试剂含有酶反应抑制因子和蛋白质变性剂以保证RNA在纯化之前不被降解。这些抑制因子在随后的分离纯化过程中被除掉，不会存留于纯化后的RNA样本中。有时候这些试剂也笼统地被称为RNA保存液，其用途是保护生物样本中的RNA在纯化以前不受降解，而非纯化后RNA的保存。

综上所述，降解或部分降解的RNA会导致基因表达谱的改变，提取并保证高质量的RNA对准确测定目标基因有重大意义。一种能够有效阻止RNase降解、可避免RNA反复冻融造成的物理损伤并且不影响后续反应效率RNA保存液，对RNA的分子生物学研究和临床上的应用非常重要，也是目前RNA保存迫切需要解决的重要技术难题。

发明内容

本发明的发明目的之一，在于针对上述存在的问题，提供一种可避免RNA反复冻融造成的物理损伤并且不影响后续反应效率的RNA保存液。

本发明采用的技术方案是这样的：一种RNA保存液，该保存液是浓度为3.8M-5.2M的甜菜碱水溶液。

甜菜碱（Betaine,也称Trimethylglycine或Oxyneurine），是一种天然次生代谢产物，参与胆碱的氧化代谢和细胞渗透的平衡等多种生化生理功能活动。关于甜菜碱，已经有很多应用。本申请的发明人通过大量实验，得到上述的技术方案。甜菜碱属于惰性很高的化学物质，溶于高纯度的水可形成pH7.8左右的微碱溶液，甜菜碱溶液高度稳定，可在室温或4℃的条件下长期保存而无分解。将3.8M-5.2M的甜菜碱溶液保存于4℃的条件下3年之久后，仍可用于增强PCR扩增，不会引起DNA的降解。含有2.4 M的甜菜碱的PCR浓缩液，在-20℃条件下可稳定保存4年仍能用于扩增单位数的DNA分子。在实际应用中，3.8M-5.2M的甜菜碱溶液可保存在4℃潮湿的环境中，即使保存环境已出现细菌生长，也不影响其重复使用。由于甜菜碱的高渗透性，高浓度的甜菜碱溶液具有明显的抑制细菌生长的作用。而Tris或柠檬酸用作RNA溶解保存液，均需小心避免细菌污染，否则，细菌可在这些溶液里生长并提供大量的RNase，不利于微量RNA的保存和反复使用。

在本申请中，我们把浓度大于3.8 M的甜菜碱溶液称为高浓度甜菜碱溶液。本领域公知的，本发明中的溶液浓度单位“M”为“mol/L”。

实验证明：用3.8M-5.2M的甜菜碱溶液保存的RNA可在-20℃条件下可完整保存至少一年，或在4℃储存可完整保存一周，因此可用冰袋保存，便于邮寄和运输。

SDS等表面活性剂，可助溶RNA和DNA，一般用于过度干燥的RNA或DNA的溶解。RNA溶解后，在用于酶反应以前，需经进一步纯化以去除SDS等对酶反应的负面影响。甜菜碱可降低GC碱基之间的氢键配对形成的结合力，5M的甜菜碱溶液可完全抵消GC与AT配对的差异，使得核糖核酸之间的联系更为松散，有利于加快核糖核酸的溶解速度和溶解度的提升。3.8M-5.2M的甜菜碱溶液是比水更好的DNA溶剂，可溶解DNA形成高达10 mg/ml的均匀溶液。而在水溶剂中，5mg/ml的DNA溶液已趋近溶解极限。高纯度甜菜碱对RNA和DNA无明显的降解作用，溶解于3.8M-5.2M的甜菜碱溶液的RNA，在-18℃至-26℃的低温保存条件下储藏至少12个月后，与用甲酰胺保存的相同样品比较浓度无改变，经琼脂糖电泳比较显示真核RNA特征性的28s和18s，无降解拖尾。

Ambion公司的The RNA Storage Solution (AM7000) 含有1mM的柠檬酸钠，可用于RNA的溶解和保存，但并不能防止反复冰冻融解对RNA造成的损害，并且很难防止细菌在柠檬酸溶液中的生长繁殖。

在反转录、PCR和RNA链接等反应体系可直接加入达反应总体积40%的3.8M-5.2M甜菜碱溶液而不影响酶反应效率。并因高浓度甜菜碱溶液具有松弛高GC含量引起的RNA链间吸引，减少RNA高级结构的稳定性，对反应效率和长链RNA的处理均有正面影响。高浓度甜菜碱溶液对紫外光谱范围的光波的吸收值极小，不影响测量核酸含量时常用的OD260/OD280/OD230读数，可用实验室通用的紫外分光光度计进行RNA浓度定量。也不影响RiboGreen、Qubit RNA 分析的荧光染料与RNA的结合，高浓度甜菜碱溶液中的RNA，其质量和浓度可直接利用于Qubit 2.0 荧光光度计、Agilent BioAnalyzer 2100分析鉴定。

作为优选方案：所述甜菜碱水溶液中还加入RNase抑制因子，所加入的RNase抑制因子与甜菜碱水溶液的比例，按体积比计，为1:（100-10000）。

加入适量的RNase抑制因子可中和微量RNase，进一步的保护RNA不受RNase的降解。

作为优选方案：所述甜菜碱水溶液中还加入螯合剂。所述螯合剂优选为柠檬酸钠或EDTA。

螯合剂可螯合部分RNase作用所需要的高价阳离子，均可不同程度的增进前述的甜菜碱溶液对RNA的保护作用。

作为优选方案：所述甜菜碱水溶液中还加入缓冲剂。所述缓冲剂优选为三羟甲基氨基甲烷，即Tris。

本发明的目的之二在于提供一种包含上述RNA保存液的试剂盒。更易于商业化应用。

本发明的目的之三在于，提供一种上述保存液在用于保存含有RNA的样品中的应用。

作为上述应用的技术方案之一：将纯化后的RNA样品溶解于所述保存液，然后在4℃保存，可保存至少一周。

作为上述应用的另一个技术方案：将纯化后的RNA样品溶解于所述保存液，然后在-10℃至-28℃环境下以液态形式保存，可保存至少12个月。

作为优选的技术方案：在-20℃环境下保存。

作为上述保存液的另一方面的应用：将所述保存液作为RNA溶剂或稀释液。

发明人通过大量实验发现，相比水溶剂，RNA更易溶解于高浓度甜菜碱溶液，可以更方便快捷地得到均匀溶液，用其作为RNA稀释液可降低因稀释操作带来的误差。本发明的保存液也可溶解冰冻干燥的RNA样品，可在20分钟内溶解过度干燥的RNA样品，形成浓度至少高达9.6 mg/ml的均匀透明液体。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：采用本发明的保存液，RNA样品以液态保存于低温条件下，可在-20℃条件下可完整保存至少一年，或在4℃可完整保存一周。这样，无须解冻RNA样本即可反复使用，避免反复冰冻溶解对RNA样品造成的物理损害。并且在反转录、PCR等反应体系中高达反应总体积40%的甜菜碱溶液不但不影响酶反应效率，而且因高浓度甜菜碱溶液具有松弛高GC含量引起的RNA链间吸引，减少RNA高级结构的稳定性，从而对反应效率和长链RNA的处理均有正面影响。高浓度甜菜碱溶液在紫外光谱范围的光吸收值甚微，不影响核酸含量用常规的OD260/OD280/OD230读数，可用实验室通用的紫外分光光度计进行RNA浓度定量。也不影响RiboGreen、Qubit RNA 分析 的荧光染料与RNA的结合，因此高浓度甜菜碱溶液中的RNA可直接用Qubit 2.0 荧光光度计、Agilent 2100 BioAnalyzer分析。

另外，相比水溶剂，RNA在本发明的甜菜碱溶液中具有很高的溶解度，即RNA更易溶解于甜菜碱溶液。溶解于本发明的保存液可形成高达9.6 mg/ml的均匀溶液，可以更方便快捷地得到均匀溶液。本发明的保存液还可以作为RNA稀释液，以降低因稀释操作带来的误差，这个特性使其可用于溶解过度真空干燥保存的RNA，从而避免使用SDS等表面活性剂溶液助溶。置于该溶液中核酸可在不用液氮或超低温冰箱的条件保存较长时间而不影响RNA的完整性，从而有效地解决RNA溶解、保存及使用时遇到的物理损伤、RNase降解、水解、容器吸附损失及细菌污染等影响，特别是对微量RNA的保存、重复使用及运输具有重大应用价值。

附图说明

图1为纯化后的RNA在不同保存液中、在-20℃保存12个月后的结果图；

图2为纯化后的RNA在-20℃低温保存360天后，再用不同的保存液在4℃保存，24及48小时后的RNA状态图；

图3为重复冻融过程造成不同溶剂中RNA物理损伤的比较图；

图4为RNase抑制因子增强甜菜碱溶液对抗RNase A降解能力图；

图5为高浓度的甜菜碱帮助DNA溶解图；

图6为过度干燥的RNA在高浓度甜菜碱溶液中的溶解情况图；

图7为高浓度甜菜碱溶液作为稀释液的效果图；

图8为不同浓度的甜菜碱溶液保存RNA的效果图；

图9为甲酰胺和高浓度甜菜碱溶液对Qubit RNA荧光定量的影响图；

图10为不同体积的5 M甜菜碱溶液和甲酰胺对反转录反应效率的影响图；

图11为5 M甜菜碱溶液中加入不同浓度的Tris对反转录反应效率的影响图；

图12为5 M 甜菜碱溶液中加入不同浓度的EDTA对反转录反应效率的影响图；

图13为不同保存时间对高浓度甜菜碱溶液中溶解的RNA总量的影响图；

图14为不同保存时间对水中溶解的RNA总量的影响图；

图15为RNA降解实验第8天时，miR-92a和miR-92b分子拷贝数变化的比较图；

图16为冰袋保存的RNA经4天时间的转运后RNA样本的电泳图；

图17和图18为图16中样品的RIN值分析图。

具体实施方式

下面对本发明作详细的说明。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：温度和浓度对甜菜碱溶液物理状态的影响

甜菜碱易溶于水，溶解饱和度可达5.5M以上。我们对浓度为2.4M–5.2M的甜菜碱溶液在分子生物学实验室常用的-20℃冰箱中保存条件下的物理状态进行了连续4天的观测。在整个实验的实施过程中，每天对冰箱实际温度进行两次测定（相隔至少8小时），实际测得的温度在-18℃至-26℃之间。冰箱的频繁使用是解释较大温度差异的一个主要原因。结果显示：3.8M以上浓度的甜菜碱溶液可以液态保持在-20℃的低温条件下，而浓度低于3.6M的溶液在相同条件下成固态。加入1M的KCl可降低3.6M甜菜碱溶液的凝固点，使其在-20℃冰箱的保存条件下转为液态。不同浓度的甜菜碱溶液在4℃的保存条件下均呈液态。在长达数年的实际使用中，-20C冰箱中保存的3.8M以上浓度的甜菜碱溶液均以液态形式成在，无一例固化。4℃和-20℃低温保存条件是现代生物医学实验室的对生物样品最基本的保存手段之一，与RNA保存有密切关系。我们的测试结果证明高浓度甜菜碱溶液尤其是3.8M-5.2M的甜菜碱溶液具有成为核糖核酸保护剂的潜在能力。具体结果见表1。

表1：不同甜菜碱溶液浓度在-20℃冰箱中保存120天后的溶液物理状态

实施例2 培养细胞总RNA的纯化、定量测定和完整程度的检测方法：

H1299, A549或Hela细胞培养于含有10%FBS的RPMI培养基的100mm的培养平皿，置于5% CO₂的37℃培养箱中培养至80%-90% 的饱和度。除去上清液，加入1.2mlTRIZol试剂（Invitrogen），轻摇让液体迅速覆盖整个表面。将细胞裂解物转移到1.5ml小管，均匀后，室温静置5分钟，然后加入300μl的氯仿，振荡15S，静置15分钟，12000g、4℃离心15分钟。取上清，加入50μlTE饱和的苯酚，振荡15S，静置5分钟，12000g、4℃离心5分钟。取上清，加入等体积异丙醇混匀，-20℃保存1小时，12000g，4℃离心15分钟。除去上清，加入500μl 70%的乙醇洗涤，震荡1分钟，12000g，4℃离心5分钟，除去上清。用500μl 70%的乙醇重复洗涤一次。尽量除去上清，室温下干燥10 - 15分钟，得到纯化的RNA。

依据不同的试验目的将RNA溶解于不同的溶解液中。

选用的溶解液有不含RNase的纯净水、甲酰胺、不同浓度的甜菜碱溶液和加入了不同RNA保护剂的甜菜碱溶液。50ng/μl以上浓度含量的RNA的定量测定由紫外分光光度法对RNA在OD260，OD280的光吸收值测得。具体做法为：将1-10μlRNA溶液稀释于1xTE溶液中，同时用相同比例相应的RNA溶解液稀释于1xTE作为对照液。RNA浓度由测得的OD260值乘以40及稀释倍数而得。OD260与OD280的比值可用于衡量RNA的质量。高纯度的RNA的OD260/OD280比值范围应该在2.00-2.10之间。

低浓度RNA的定量测定用Qubit荧光光度计2.0测定。具体做法为：将Qubit RNA试剂以1：200的比例稀释，按厂家的使用说明配制标准液并对仪器进行校正。然后将10 μl RNA溶液稀释到190 μl的Qubit工作液，25℃保温2分钟后将样品管置于Qubit 2.0荧光光度计测定，获得RNA的浓度值。我们通过对4个RNA样品在6个时间点用Qubit RNA 分析分别进行了测定，并对每个样品独立地重复3次，利用所得的测定数据对Qubit RNA 分析在本实验室实施过程中的测定误差进行了统计学界定。结果显示该法在同批次测定中的检测误差范围为2.45%，不同次间的测定误差范围为6.84%。

实施例3 甜菜碱溶液对RNA的保存实验

用实施例2所述方法从H1299细胞提纯的RNA，被分别溶解于4.8M的甜菜碱溶液和100%的甲酰胺溶液。经紫外分光法对RNA浓度的测定，甜菜碱溶液中RNA浓度为1.72μg/μl,OD260/OD280比值为2.02，溶解于甲酰胺的RNA浓度为1.66μg/μl，OD260/OD280比值为2.04RNA溶液分别用4.8 M的甜菜碱溶液和甲酰胺稀释至1.0μg/μl,并保存于-20℃冰箱历时360天。在RNA的保存期间，由于频繁使用，冰箱的实际温度保持在-10℃至-26℃之间。经历了360天的低温保存后，对不同溶解液保存的RNA质量用1xTB 配制的0.7%琼脂糖电泳后的结果如图1所示，在4.8M甜菜碱溶液保存的1μg RNA(图1中的条带“1”)和甲酰胺保存的1 μg RNA(图1中的条带“2”)，结果显示，同甲酰胺中保存的RNA相比，4.8M甜菜碱溶液保存的RNA的28s rRNA,18s rRNA及小RNA的条带清晰可见，无降解迹象；

将上述4.8M甜菜碱溶液保存的RNA进一步溶解于不同比例配制的甲酰胺-甜菜碱溶液混合液，经-20℃保存2周后，RNA在0.5%的琼脂糖凝胶电泳结果也如图1所示。图1中的条带“3”为4.8M甜菜碱溶液-1mM柠檬酸钠；条带“4”为100%甲酰胺；条带“5”为75%甲酰胺-1.2M甜菜碱溶液；条带“6”为50%甲酰胺-2.4M甜菜碱溶液；条带“7”为25%甲酰胺-3.6M甜菜碱溶液；条带“8”为4.8M甜菜碱溶液；条带“M”为0.5μg 1Kb DNA标准。电泳条件：75V，60分钟，1xTB，结果显示，甲酰胺浓度降至50%以下的混合液保存的RNA出现部分降解。而加入1 mM柠檬酸钠，对RNA的保存无影响。

实施例4： 甜菜碱溶液和甲酰胺对RNA的长期保存比较

将360天的低温保存后的RNA溶入不同成分的溶液，保存于4℃，24小时后（如图2中的A所示），50%及25%的甲酰胺-甜菜碱混合液溶解的RNA已出现明显降解。加入1 mM柠檬酸钠，对RNA的保存有帮助。48小时后（如图2中的B所示），保存于在纯甲酰胺、含1 mM柠檬酸的甜菜碱溶液及4.8 M甜菜碱溶液的RNA未出现降解。

图2中，是RNA在0.5%的琼脂糖凝胶电泳结果。其中条带“1”为4.8M 甜菜碱溶液-1mM柠檬酸钠；条带“2”为100%甲酰胺；条带“3”为75%甲酰胺-1.2M甜菜碱溶液；条带“4”为50%甲酰胺-2.4M甜菜碱溶液；条带“5”为25%甲酰胺-3.6M甜菜碱溶液；条带“6”为4.8M甜菜碱溶液；条带“M”为0.5 μg 1Kb DNA标准（marker）;电泳条件：75V，60 分钟，1xTB。

对RNA完整性的估算由常规的琼脂糖凝胶电泳进行。无降解的RNA样本其28s rRNA与18s rRNA的质量相比应为2:1，当样本中其比值为1时，被认为有中度降解。如果只有18s rRNA条带并伴有RNA降解的拖尾，将视为RNA有严重降解。图2A中的样本4为中度降解，图2B中的样本4可视为重度降解的样本；

即，在4.8M甜菜碱溶液中保持1年后的RNA在不同成分的溶液中的降解情况说明RNA经过高浓度甜菜碱溶液保存一年后仍能被降解，没有发生永久性的改变。

实施例5: 甜菜碱溶液和水作RNA溶剂对RNA受反复冻融作用影响的比较

等量的RNA分别溶解于5.2 M的甜菜碱溶液和不含RNase A的水溶液中，形成3ng/μl的溶液。每个试验重复三次。RNA浓度经Qubit RNA 分析荧光定量记录，为冻融前的RNA参照浓度。将所有样本置于-20℃冰箱1小时，水溶液发生相变形成固态结晶，而甜菜碱溶液仍为液态。将所有样本置于4℃冰箱大约60分钟，让RNA溶液慢慢融化。重复上述操作以模拟对RNA样品的重复使用。反复冻融5次及10次后，分别测定RNA的含量。结果如图3所示，图3中横坐标为冻融次数，纵坐标为RNA浓度，“A”为RNA溶解于5.2M的甜菜碱的情况，“B”为RNA溶解于水中的情况。从图3中可以看出：经5次冻融，溶解于5.2M甜菜碱溶液的RNA含量仅降低 5.6%，在方法的测定误差范围内。而水溶液里的RNA降低31%。经10次冻融处理，溶解于水的RNA降解明显，有59% RNA降解。而溶解于甜菜碱溶液的RNA仅有6.7%的降低。反复冻融对RNA有很大的破坏作用，甜菜碱溶液能保证RNA一直保存在液体状态，甜菜碱溶液中RNA的浓度一直在测定方法的误差范围内，没有明显的降低，甜菜碱溶液对反复冻融的RNA有保护作用，方便RNA的频繁使用。

实施例6：甜菜碱溶液中加入RNase抑制因子(RI)可保护RNA免受RNaseA降解

等量的RNA溶解于加入了不同稀释度RNase 抑制因子（RI)的3.8 M的甜菜碱溶液和100%的甲酰胺形成0.3μg/μl的溶液。在甜菜碱溶液的样品分成三组，加入4U,0.4U以及0.04U的RI，然后在分别加入梯度稀释的RNase A，经过一段时间的保温，用0.5%的琼脂糖凝胶电泳检查RNA的完整性。具体做法为：分别将15 μg的H1299 RNA稀释到50 μl的3.8 M的甜菜碱溶液（即图4中的“B”）或100%的甲酰胺（即图4中的“FM”）。然后再分别加入100pg或10pg的RNase A,混合均匀，置于室温反应30分钟。分别从各个反应中取出10μl的反应液进行0.5%的琼脂糖凝胶电泳分析。结果如图4所示，可以看出加入微量RI的甜菜碱溶液对低浓度的RNase A的降解的抑制超过甲酰胺的作用。

实施例7：高浓度甜菜碱溶液有助RNA和DNA的溶解

过度干燥的RNA沉淀颗粒和大分子DNA极难溶解于水，溶解过程中使用的加热，搅拌等助溶手段会引起RNA及DNA的断裂而降解。目前，过度干燥的RNA一般可用含0.1%的SDS等表面活性剂的溶液帮助其溶解，但对后续的反应带来不良影响。在RNA的乙醇沉淀制备中往往建议不要长时间的干燥尤其是避免对RNA、DNA沉淀物的真空干燥，以利核糖核酸的溶解。如果干燥不完全，残留的乙醇液对后续的酶反应带来影响，对进行RNA乙醇沉淀干燥的把控引入不定的因素。高浓度的甜菜碱溶液能解离GC配对的高结合力，使得DNA、RNA等形成的分子间结合力更为松散的结构，因而易于其溶解。将5mg长度为7.8kb的质粒及8mg长度为5.5 kb的质粒B用乙醇沉淀、洗涤后冰冻干燥24小时。各加入500μl、4.8M的甜菜碱溶液，形成均匀溶液，经紫外分光光度法测定得到10.6mg/ml及16.8mg/μl的DNA溶液，OD260/OD280 比值均为1.94。在室温保存3天后，分别将0.5μg质粒A（即图5中的条带“1”）、0.25μg质粒A（即图5中的条带“2”）、0.5μg质粒B（即图5中的条带“3”）、0.25μg质粒B（即图5中的条带“4”）用0.5%的琼脂糖凝胶电泳分析，所得的电泳图显示两个质粒的保存均无降解，如图5所示，显示高浓度甜菜碱溶液帮助DNA溶解。

将500μg H1299 RNA用乙醇沉淀后，同样经24小时的冰冻干燥，置于室温干燥器保存两个月后再用4.8M的甜菜碱溶液溶解，RNA在1小时内形成均匀透明的溶液，用紫外分光光度计测定浓度为9.6μg/μl,OD260/280比值为2.02。0.5μg沉淀前后的RNA质量经0.5%的琼脂糖凝胶电泳分析，如图6的结果显示无明显差异，高浓度的甜菜碱溶液可以帮助真空过度干燥的RNA的溶解,图6中条带“1”为0.5μg乙醇沉淀的RNA；图6中条带“2”为0.5μg的乙醇沉淀后、经冰冻干燥后于室温保存两个月后溶于4.8M甜菜碱溶液的RNA。

实施例8：高浓度甜菜碱溶液助溶过度干燥的RNA结晶

将25μg H1299 RNA和23μg A549 RNA经乙醇沉淀后，分别溶于不含RNase的水和4.8 M的甜菜碱溶液,经紫外分光光度计测定，测得RNA的浓度和OD260/OD280比值，H1299 RNA 为1.304μg/μl及2.05，A549 RNA为1.364μg/μl及2.09。再分别用水或甜菜碱溶液进行系列梯度稀释至 2 ng/μl后用Qubit RNA荧光定量法测定。每个样品均三次重复，由不同的实验者以双盲实验的方式进行测定。RNA的浓度测定结果见表2，用OD260的方法同RNA荧光法测得的RNA浓度有较大的差异，RNA样品均以预先用紫外法测得的浓度值标定，为2.00ng/μl。而用荧光法测得为2.66–2.98ng/μl。用水或高浓度甜菜碱溶液溶解稀释，对RNA的紫外分光光度法及荧光定量法无影响，但甜菜碱溶液稀释的重复组对比的差异较小，为1.2%-1.8%，而用水溶液稀释的实验组为4.4%-4.7%。两者具有显著差异。显示出RNA在甜菜碱溶液和水溶液中溶解难易的差别，甜菜碱溶液具有明显的助溶作用。结合实施例7的结果，显示出核糖核酸在高浓度甜菜碱溶液的溶解度更大，有利于减少容器介质对核酸吸附，对微量RNA的保存有特殊的意义。图7显示高浓度甜菜碱溶液助溶过度干燥的RNA，图7中纵坐标为RNA浓度，“C为溶于4.2M的甜菜碱溶液，“D”为溶于水中。具体的数据分析见表2

表2：用高浓度甜菜碱溶液作为稀释溶剂可缩小测定的误差范围

实施例9：不同浓度的甜菜碱溶液均可用于溶解RNA免受冻融过程对RNA损伤

图8为0.4μg RNA溶解于不同浓度甜菜碱溶液（分别实验3.6M、4.0M、4.2M、4.4M、4.8M、5.0M和5.2M）并于-20℃保存360天后的琼脂糖凝胶电泳分析结果。结果显示不同浓度的甜菜碱溶液均可用于RNA的保存，不会因甜菜碱溶液的浓度不同而导致RNA的降解。甲酰胺通过对RNA结构的改变而使其免受核酸酶的降解，另一方面也直接抑制酶的活性。与甲酰胺对RNA的保护方式不同，甜菜碱溶液并不抑制核酸酶的活性，其保护机理在于对RNA的低温保存和实际使用时的温度变化范围内提供一个稳定的液态环境。实施例1证实了3.6M以上浓度的甜菜碱溶液可在-20C 冰箱中以液态形式保存，本实施例旨在说明3.8M-5.2M的高纯度甜菜碱溶液不会对RNA在所述条件下保存时造成直接降解，因而可独自或与别的核酸酶抑制因子混合后用于对RNA的低温保存。甜菜碱溶液的溶解度大于5.5M，由于高浓度的甜菜碱溶液粘稠度增加，从技术的角度来讲，极难制备大于5.5M的均匀的甜菜碱溶液。依据我们对甜菜碱溶液的浓度、物理状态和温度的规律的了解，5.5M的甜菜碱溶液也应具备所述的高浓度甜菜碱溶液所表现出的保护RNA完整性的特性。

实施例10：5.2 M甜菜碱溶液不影响Qubit RNA 荧光定量法对RNA的测定

储存于甲酰胺（FM)或5.2M甜菜碱溶液里的RNA，在-20℃冰箱保存2个月后，分别用不含RNase的水和5.2M的甜菜碱溶液稀释至2ng/μl,然后经Qubit RNA 荧光法对RNA浓度进行测定。储存于5.2M甜菜碱溶液里的RNA经水和5.2M甜菜碱溶液分别稀释后的RNA浓度实测值为3.11ng/μl±1.34%和3.13ng/μl±0.71%,与预期的3.0ng/μl相符。而储存于甲酰胺里的RNA经水和5.2M甜菜碱溶液分别稀释后的RNA浓度实测值为2.27ng/μl±1.35%和3.01ng/μl±0.77%, 残留于水溶液里的微量甲酰胺对RNA的荧光定量造成影响，降低RNA的实际测定值。结果与文献中甲酰胺对Qubit RNA 荧光定量有抑制作用的报道一致。甜菜碱溶液可抵消甲酰胺的影响，所测得的RNA浓度与预期的相吻合。图9比较了甲酰胺和高浓度甜菜碱溶液对Qubit RNA荧光定量的影响，图9中纵坐标为RNA浓度，“E”为溶解于5.2M甜菜碱，“F”为溶解于水中。

实施例11：5 M 甜菜碱溶液和甲酰胺对反转录反应效率的影响

我们在反转录反应中比较了加入不同体积的5 M甜菜碱溶液和甲酰胺对反应效率的影响。我们 使用了Applied Biosystems公司的反转录试剂盒及其推荐的反应条件，反应体系为：1μl 10xRT 缓冲液， 0.4μl 25xdNTP,0.5 μl MMLV 反转录酶,0.1μlRNase抑制因子（1:100) ，1μl 6聚体随机引物及7μl的RNA溶液。在-20℃、4.8M甜菜碱溶液中保存了12个月的H1299 RNA，经用5 M的甜菜碱溶液或甲酰胺稀释成0.1μg/μl溶液。然后用不同量的5 M甜菜碱溶液或甲酰胺调整为总反应体积的0%，5%，10%，20%，40%，60% 及70%。设置不含甜菜碱和甲酰胺的反应为的阳性对照，为100%。反转录反应条件为：37℃ 1min,16℃ 30min， 37℃ 30min，42℃ 30min，85℃ 5min，完成的反应液保存于4℃。将反转录产物按1:10稀释后，用2.6μl与25μl加入5uM GAPDH引物的SYBR® Green JumpStart Taq ReadyMix (Sigma,S4438)定量PCR混合液混匀，然后取7 μl进行实时荧光PCR反应，反应条件为：95℃ 2分钟,40个循环的95℃ 10”，61℃ 1’，72℃ 30”。记录每个循环的荧光强度及循环完成后的PCR反应产物温度融解曲线。所用GAPDH引物为：GCACCACCAACTGCTTAGC 及 GCATGGACTGTGGTCATGAG。每个反应重复3次。结果以35个循环数的模版数计为0，并以不含甜菜碱和甲酰胺的反应值计为100%。不同体积的甜菜碱及甲酰胺对应的反转录反应效率显示如图10。在反应中，10%甲酰胺对反转录反应已有明显的影响，增加至反应体积的20%则完全地抑制了反转录的进行。反转录反应中加入40%的5 M甜菜碱溶液反转录效率不受影响，甚至加入高达反应体积的70%的甜菜碱溶液仍能维持50%以上的反转录效率。高浓度甜菜碱溶液的长期保存，不影响RNA作为反转录反应的模版。具体见图10，不同体积的5 M 甜菜碱溶液（图10中的折线“G”）和甲酰胺（图10中的折线“H”）对反转录反应效率的影响。

实施例12；5 M 甜菜碱溶液加入不同浓度的Tris及EDTA对反转录反应效率的影响

pH对RNA及DNA的水解有效大的影响。碱性的环境有助于核酸的水解，而酸性pH的溶液有助于RNA的稳定，可帮助减缓RNA水解。1xTE(10mM Tris,1mM EDTA)溶液常用来溶解DNA和RNA。Tris可为溶液稳定pH值。EDTA是二价金属离子的螯合剂，一些核酸酶对RNA的水解作用需要二价阳离子，而EDTA能有效的去除核酸酶的活性，保护RNA。因而甜菜碱溶液中如果加入Tris和EDTA可以帮助保护RNA。但EDTA或Tris对后续利用RNA的酶反应、如反转录酶、可能产生不利的影响。为对比这些试剂对酶反应效率的影响，我们在反转录反应中比较了加入含不同浓度EDTA或Tris（pH7.6）的5M甜菜碱溶液，并通过对反转录合成的cDNA中GAPDH分子数目的相对定量测定来衡量其对反转录效率的影响。我们使用Applied Biosystems的反转录试剂盒及其推荐的反应条件，反应体系为：1μl 10xRT 缓冲液，0.4μl 25xdNTP,0.5μl MMLV 反转录酶, 0.1μl RNase 抑制因子（1:100)，1μl 6聚体随机引物及 7μl的RNA溶液。RNA分别溶解于含10mM–0.01mM EDTA的4.8M甜菜碱溶液，或为含100mM–0.1mM Tris的5M的甜菜碱溶液。所用反转录和PCR条件与实施例11所用条件相同。每个反应重复3次。结果以35个循环数的模版数计为零，并以不含甜菜碱反应值为阳性对照。不同浓度EDTA及Tris对反转录反应效率的影响如图11及图12所示。从图11和12中可以看出，在目前反应的体系，甜菜碱溶液中含0.5mM的EDTA对反转录反应已有明显的影响，浓度增加到1 mM时对反转录的抑制已不可忽视。而含0.1mM 浓度以下EDTA的甜菜碱溶液对反转录反应效率无影响。相对于EDTA对反转录效率的影响，加入高达100mM的Tris仍不会影响反转录反应效率。图11显示5M甜菜碱溶液中加入不同浓度的Tris对反转录反应效率的影响（图11中横坐标为Tris浓度）。图12显示5M甜菜碱溶液中加入不同浓度的EDTA对反转录反应效率的影响（图12中横坐标为EDTA浓度）。

实施例13：不同温度条件下保存的极度稀释的RNA溶液中RNA水解程度的微定量研究

稀释程度越大的RNA完整性受水解的影响越大，也越难保存。而实际应用中，临床相关的样品中仅能获得ng甚至pg量级的RNA，现代的分子鉴定方法，如RT-qPCR，已能利用pg量级的RNA给出对疾病诊断、治疗或预后相关的信息。但因没有对微量RNA适当的溶解保存方法而要浪费大量RNA资源，并直接影响到鉴定结果的验证和可行性。正如我们在先前的实验中所证实的一样，目前最常用的水溶解分装冻存法，会对RNA造成不可预估的损失，尤其是在RNA浓度很低的情形下，RNA受损的程度更为严重。这也可以部分地用来解释目前用RNA表达来作生物标记时，检测结果所显示出的不确定性。本发明的具体实施例之一，4.8M甜菜碱溶液能将RNA在-20℃的低温下保存，用琼脂糖凝胶电泳方法检测证明其的完整性至少达到12个月，在这个测试中，RNA的浓度相对比较高，为1μg/μl。

我们用加入1:1000稀释的RNase抑制因子的5.2M甜菜碱溶液(Bet+溶液)对纳克量级的RNA在不同温度条件下的保存状况进行了分析。结果显示Bet+溶液对微量RNA在-20℃的低温保存达15天时，RNA的荧光定量值及更为严格的微小RNA的数目均没有变化。RNA被分别用Bet+溶液和不含RNase的水稀释至大约3ng/μl，然后用Qubit RNA 分析定量测定，所得浓度与第0天的记录一致。

具体做法是：溶于Bet+溶液的RNA被均分为3份，分别保存于-20℃、4℃及37℃。溶于水的RNA样本被均分为2份，分别保存于4℃及37℃。因水溶液在-20℃的保存下RNA样本发生冻融，我们的前述实验中已经证实其对RNA的损害，因此水溶解的RNA样本没有设置-20℃保存的实验组。样本均为3次重复。在不同温度条件下保存不同时间后，用Qubit RNA Assay对RNA样本进行测定，Bet+溶液保存的RNA显示出极高的稳定性，在15天后仍无差别，而水溶液中的RNA在37℃的保存条件下随时间的推移而降解，在第10天时，RNA含量已低于荧光法的测定极限。保存于水中4℃的RNA在第10天出现可见的降解。由于Qubit荧光测定法能测定非常短的RNA，因而长链RNA即使发生了断裂成为较小的片段，并不会在RNA的测定量上表现出来，除非有足够量的RNA降解成为寡核苷酸。这种方法的数据不能揭示RNA降解的全貌，但RNA的质量不能仅仅以重量的不改变来衡量，RNA的完整性是衡量其质量好坏的一个更重要的方面。

本实验我们使用高浓度的甜菜碱溶液避免了RNA的冻融损坏，而RNases对RNA的水解对大小不同的RNA来说是随机的反应，小分子RNA的数目可以很准确的反映RNA样本的降解程度。微小RNA只有22nt，其定量测定严格地要求有完整的分子，其顺序的任何改变均会引起测定出的微小RNA的数目的灵敏的改变。在我们使用的细胞中，miR-92a的含量很高，如1ng的H1299细胞RNA含有近2百万个miR-92a分子，其分子数目的降低可为RNA的降解提供灵敏的标记。在降解测试进行到第8天时，我们选择了miRNA多目标同步扩增荧光片段长度多态性分析法，对不同处理组的RNA样本中miR-92a和miR-92b的分子数目进行了定量分析。37℃保存的水溶液中的RNA总量已几乎降解到原始量的25%，而别的实验组尚未出现明显降解。原始RNA经用Bet溶液稀释同样的倍数，作为测定的阳性对照。经t-test的统计学模型分析处理，对比BET+溶液于-20℃及4℃保存的RNA，miR-92a及miR-92b的分子数目的差异不大。而保存于37℃的RNA样本及水溶液中保存的RNA均大部降解。统计结果表明用微小RNA的数目作RNA质量的检控，比仅测RNA的重量要更准确和灵敏。图13为不同保存时间对BET+溶液中溶解的RNA总量的影响，图14中横坐标为天数，纵坐标为RNA浓度，“a”为-20℃，“b”为4℃，“c”为37℃，图中第0、1、3、8、10和15天的顺序均为“a”、“b”、“c”。图14为不同保存时间对水中溶解的RNA总量的影响，图14中横坐标为天数，纵坐标为RNA浓度，“d”为4℃，“e”为37℃，图中第0、1、3、8、10和15天的顺序均为“d”、“e”。表3列出了RNA降解实验第8天时，miR-92a和miR-92b分子拷贝数的具体变化及统计学分析。图15中以柱形图的方式更为形象地表述RNA降解实验第8天时，miR-92a和miR-92b分子拷贝数变化的比较，图15中纵坐标为微小RNA的分子拷贝数，“f”为miR-92b，“g”为miR-92a。

表3：RNA降解实验第8天时，miR-92a和miR-92b分子拷贝数的变化及统计学分析

实施例14：冰袋保存的RNA经长时间的转运后完整性分析

H1299、A549和Hela细胞RNA经TRIZol试剂提纯后，以1ng/μl的浓度稀释溶解于5.2M的甜菜碱溶液。RNA样本以冰袋保存的方式经4天陆运从成都运至杭州。受试的样本被置于-20℃冰箱保存直到分析。RNA完整性的分析服务由杭州锐创生物技术有限公司提供的Agilent 2100 Bioanalyzer RNA质量分析服务提供测定服务完成。电泳分析结果见图16。经过冰袋保存条件下长时间运送的6个RNA样本（每个细胞的RNA均有一次重复），其衡量RNA降解程度的RIN值见图17和图18，从图17和图18中可以看出RIN均为8.40以上，其中4个样本的RIN高达9.0 以上，显示所有样本均保存完好。图16、图17和图18中的7-1、8-1为H1299 RNA，9-1、10-1为A549 RNA，11-1、12-1为Hela RNA,图17和图18中，7-1的RIN值为8.60,8-1的RIN值为8.40，9-1的RIN值为9.70，10-1的RIN值为9.30，11-1的RIN值为9.40，12-1的RIN值为9.60。

Claims (10)

1.一种RNA保存液，其特征在于：所述保存液是浓度为3.8M-5.2M的甜菜碱水溶液。

2.根据权利要求1所述的RNA保存液，其特征在于：所述甜菜碱水溶液中还加入RNase抑制因子，所加入的RNase抑制因子与甜菜碱水溶液的比例，按体积比计，为1:（100-10000）。

3.根据权利要求1所述的RNA保存液，其特征在于：所述甜菜碱水溶液中还加入螯合剂。

4.根据权利要求1所述的RNA保存液，其特征在于：所述甜菜碱水溶液中还加入缓冲剂。

5.包含权利要求1至4任意一项所述的RNA保存液的试剂盒。

6.权利要求1至4任意一项所述的RNA保存液在用于保存含有RNA的样品中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：将纯化后的RNA样品溶解于所述保存液，然后在4℃保存。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：将纯化后的RNA样品溶解于所述保存液，然后在-10℃至-28℃环境下以液态形式保存。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：在-20℃环境下保存。

10.权利要求1至4任意一项所述的RNA保存液的应用，其特征在于：将所述保存液作为RNA溶剂或稀释液。

Images