CN105636937B - 用于保存生物样品的稳定剂 - Google Patents

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Abstract

用于保存生物样品的稳定剂，在非冷冻条件下保存生物样品中的核酸和/或多肽的组合物，包含该组合物的试剂盒、包含该组合物和生物样品的混合物，以及在非冷冻条件下保存生物样品中的核酸和/或多肽的方法。利用该稳定剂可以在非冷冻条件下长时间保持生物样品中的核酸和/或多肽的完整性和稳定性，具有良好的应用前景。

Description

用于保存生物样品的稳定剂
技术领域
本发明涉及用于保存生物样品的稳定剂，具体涉及用于在非冷冻条件下保存生物样品中的核酸和/或多肽的组合物，包含该组合物的试剂盒、包含该组合物和生物样品的混合物，以及在非冷冻条件下保存生物样品中的核酸和/或多肽的方法。
背景技术
生命科学领域的研究基于对生物材料或样品、矿物质或化学物质的分析。其中，生物材料或样品包括动物体表或体液样品，如口腔刮取物、唾液、痰液、血液、尿液等；核酸样品，如基因组DNA、PCR产物、基因克隆DNA及RNA等；蛋白样品，如酶、多肽等；微生物样品，包括原核生物，如细菌、古菌、病毒(如噬菌体、朊病毒)等；真核生物，如原生动物、真菌(如酵母)等；低等植物，如藻类等；高等植物和动物样品，包括各类细胞，如体细胞、干细胞、生殖细胞(精细胞和卵细胞)等，及其各类组织样品等。
生物样品经常置于装有液体培养基或缓冲液的容器里进行零度以下的低温保存(如-20℃或-70℃～-80℃)。在一些情况下，样品还需要首先进行干燥处理，然后保存于室温(WO 2005/113147,US 2005/0276728,US 2006/0099567)，或4℃，或-20℃，或-70～-80℃。然而，生物样品的高度不稳定性使其在长期保存过程中仍保持生物活性变得尤其困难。尽管对核酸和蛋白样品进行冷冻干燥可以延长其保存期限，但后续再次液体化仍会造成样品活性的丧失，因此冷冻干燥也不是理想的保存技术。
生物样品除了需要保存外，往往还需要进行运输。对于生物样品的运输，可以使用冰块、干冰或其他冷冻设备提供冷冻环境。然而，当运输时间较长的时候，如国际运输甚至洲际运输，尤其是冷冻设备能源缺乏的时候，获得低温甚至冷冻环境就不是那么容易了。
因此，在进行生物样品采样时，特别是针对地域广、大规模的人群采样时，如果能够使用室温保存方法，不依靠昂贵的冷冻设备，并能够长时间最大限度地保持样品完整性和稳定性，降低对后续分析的影响，将占有巨大的优势。
发明内容
本发明的发明人通过反复实验和大量创造性劳动，出人意料地获得了可在非冷冻条件下保存生物样品的组合物以及保存生物样品的方法，由此完成了本发明。
本发明第一方面涉及一种用于保存生物样品中核酸和/或多肽的组合物，其包含：
1)至少一种如式Ⅰ所示的化合物：
其中R代表取代的或未取代的以下基团：烷基、烯基、环烷基、环烯基、芳基甲酰烷基、所述取代基选自烷基、羟基、氨基、硝基、卤素；
m、n各自独立地为0、1、2、3；
X-代表阴离子；
2)以下三种中的一种、两种或三种：
(1)至少一种沉淀剂；
(2)至少一种低分子醇；和
(3)至少一种离液剂。
在本发明的实施方案中，其还包含选自以下几种中的一种或多种：
(a)还原剂；
(b)聚合酶抑制剂；
(c)pH缓冲剂；
(d)螯合剂；和
(e)水。
在本发明的实施方案中，其包含以下配方中的一种：
(i)上述式Ⅰ所示的化合物、沉淀剂、低分子醇、聚合酶抑制剂、pH缓冲剂；
(ii)上述式Ⅰ所示的化合物、离液剂、低分子醇、聚合酶抑制剂、pH缓冲剂；
(iii)上述式Ⅰ所示的化合物、沉淀剂、低分子醇、还原剂、pH缓冲剂；
(iv)上述式Ⅰ所示的化合物、离液剂、低分子醇、还原剂、pH缓冲剂。
在本发明的实施方案中，其中各成分的含量为：式Ⅰ所示的化合物为1-10％(w/v或v/v)、离液剂为2.5-5M(摩尔/升)、pH缓冲剂为50-400mM(毫摩尔/升)、低分子醇为20-50％(v/v)、还原剂为5-50mM、沉淀剂为2.5-5M、聚合酶抑制剂为0.1-0.5mM。
在本发明的具体实施方案中，所述式Ⅰ所示的化合物的含量例如为2-8％(w/v或v/v)，例如为4％(w/v或v/v)。
在本发明的具体实施方案中，所述离液剂的含量例如为3-4M，例如为3.5-4M。
在本发明的具体实施方案中，所述pH缓冲剂的含量例如为100-400mM，例如为200-300mM。
在本发明的具体实施方案中，所述低分子醇的含量例如为20-40％(v/v)，例如为25％-35％(v/v)、30％(v/v)。
在本发明的具体实施方案中，所述还原剂的含量例如为10-50mM，例如为15-40mM，例如为20-25mM。
在本发明的具体实施方案中，所述沉淀剂的含量例如为3-4.5M，例如为3.5-4.2M。
在本发明的具体实施方案中，所述聚合酶抑制剂的含量例如为0.2-0.3mM。
在本发明的实施方案中，其中R代表取代的或未取代的以下基团：C1-10烷基、C2-10烯基、C3-10环烷基、C3-10环烯基、芳基甲酰C1-10烷基、，所述取代基选自C1-10烷基、羟基、氨基、硝基、卤素；
m、n各自独立地为0、1、2、3。
在本发明的实施方案中，其中所述的阴离子选自溴离子、氯离子、碘离子、C1-10烷基磺酸盐、六氟磷酸盐、甲基硫酸盐、乙基硫酸盐、四氟硼酸盐、三氟甲磺酸盐和双(三氟甲基磺酰)亚胺。
在本发明的实施方案中，其中所述R选自C1-10烷基、苯甲酰C1-10烷基。
在本发明的实施方案中，其中所述式Ⅰ所示的化合物选自：
溴化N-辛基吡啶、溴化N-丁基吡啶、N-(苄甲基)溴化吡啶。
在本发明的实施方案中，其中所述沉淀剂选自氯化锂、氢氧化锂、磺基水杨酸、5-(4-二甲基氨基苯亚甲基)绕丹宁。
在本发明的实施方案中，其中所述低分子醇选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇和异丁醇。
在本发明的实施方案中，其中所述离液剂选自盐酸胍、硫氰酸胍、硫氰酸钾、硫氰酸钠和尿素。
在本发明的实施方案中，其中所述螯合剂选自二乙基三胺五乙酸(DTPA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、1,2-环己二胺四乙酸(CDTA)、1,2-双(2-氨基苯氧基)-乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸(BAPTA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、N-羟乙基乙二胺-N,N',N'-三乙酸(HEDTA)、氮川三乙酸(NTA)。
在本发明的实施方案中，其中所述还原剂选自2-巯基乙醇、硫代硫酸盐、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇。
在本发明的实施方案中，其中所述pH缓冲液选自柠檬酸、酒石酸、苹果酸、磺基水杨酸、5-磺基-1,3-苯二甲酸、草酸、硼酸、N-(羟乙基)哌嗪、3-(环己胺)-1-丙磺酸(CAPS)、3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸(HEPPS)、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙基磺酸(HEPES)、2-吗啉乙磺酸(MES)、3-吗啉丙磺酸(MOPS)、3-(N-吗啡啉)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES)、三羟甲基甲胺基丙磺酸(TAPS)、3-[N-三(羟甲基)甲胺]-2-羟基丙磺酸(TAPSO)、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)、二甘氨酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷(tris)和2-[双(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇。
在本发明的实施方案中，其中所述聚合酶抑制剂选自利福霉素-S、利福霉素-SV、抗霉素、红霉素中的一种或几种。
在本发明的实施方案中，所述组合物中还包含表面活性剂或去污剂。
在本发明的实施方案中，其中所述表面活性剂或去污剂选自TritonX-100、Nonidet P40和非离子去污剂Brij。
在本发明的实施方案中，其中所述的核酸包含一种或多种DNA和/或RNA分子。
在本发明的实施方案中，其中所述的生物样品包含选自以下的一种或多种：DNA、RNA、全血、全血的白膜层、尿、粪便、血清、浆膜液、血浆、淋巴液、脑脊液、唾液、粘膜分泌物、阴道分泌物、腹水、胸水、心包液、腹膜液、腹腔液、细胞培养基、组织培养基、口腔细胞、细菌、病毒、酵母细胞、质粒DNA、mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、小RNA、hnRNA、cDNA、蛋白、多肽、脂质、糖脂、糖蛋白、低聚糖、多聚糖、疫苗、细胞、组织、细胞裂解物、均浆或提取物、组织裂解物、活检标本、血液样本、组织贴块、器官培养物和生物液体。
本发明第二方面涉及本发明第一方面任一项的组合物与生物样品混合后得到的混合物。
在本发明的实施方案中，其中所述生物样品包含选自以下的一种或多种：DNA、RNA、全血、全血的白膜层、尿、粪便、血清、浆膜液、血浆、淋巴液、脑脊液、唾液、粘膜分泌物、阴道分泌物、腹水、胸水、心包液、腹膜液、腹腔液、细胞培养基、组织培养基、口腔细胞、细菌、病毒、酵母细胞、质粒DNA、mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、小RNA、hnRNA、cDNA、蛋白、多肽、脂质、糖脂、糖蛋白、低聚糖、多聚糖、疫苗、细胞、组织、细胞裂解物、均浆或提取物、组织裂解物、活检标本、血液样本、组织贴块、器官培养物和生物液体。
在本发明的实施方案中，其为在非冷冻条件下保存至少1天、3天、7天、10天、20天、30天、40天、50天、60天、70天、90天或180天的本发明第二方面任一项的混合物。
本发明还涉及试剂盒，其包含本发明第一方面任一项的组合物，所述试剂盒用于在非冷冻条件下保存生物样品中的核酸和/或多肽。
在本发明的实施方案中，其中所述生物样品包含选自以下的一种或多种：DNA、RNA、全血、全血的白膜层、尿、粪便、血清、浆膜液、血浆、淋巴液、脑脊液、唾液、粘膜分泌物、阴道分泌物、腹水、胸水、心包液、腹膜液、腹腔液、细胞培养基、组织培养基、口腔细胞、细菌、病毒、酵母细胞、质粒DNA、mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、小RNA、hnRNA、cDNA、蛋白、多肽、脂质、糖脂、糖蛋白、低聚糖、多聚糖、疫苗、细胞、组织、细胞裂解物、均浆或提取物、组织裂解物、活检标本、血液样本、组织贴块、器官培养物和生物液体。
本发明还涉及一种在非冷冻条件下保存生物样品中的核酸和/或多肽的方法，所述方法包括：
1)将生物样品与本发明第一方面任一项的组合物进行混合；
2)将步骤1)得到的混合物在非冷冻条件下保存至少1天、3天、7天、10天、20天、30天、40天、50天、60天、70天、90天或180天。
在本发明的实施方案中，其中所述生物样品包含选自以下的一种或多种：DNA、RNA、全血、全血的白膜层、尿、粪便、血清、浆膜液、血浆、淋巴液、脑脊液、唾液、粘膜分泌物、阴道分泌物、腹水、胸水、心包液、腹膜液、腹腔液、细胞培养基、组织培养基、口腔细胞、细菌、病毒、酵母细胞、质粒DNA、mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、小RNA、hnRNA、cDNA、蛋白、多肽、脂质、糖脂、糖蛋白、低聚糖、多聚糖、疫苗、细胞、组织、细胞裂解物、均浆或提取物、组织裂解物、活检标本、血液样本、组织贴块、器官培养物和生物液体。
本发明还涉及本发明第一方面任一项的组合物用于在非冷冻条件下保存生物样品中的核酸和/或多肽的用途。
在本发明的实施方案中，其中所述生物样品包含选自以下的一种或多种：DNA、RNA、全血、全血的白膜层、尿、粪便、血清、浆膜液、血浆、淋巴液、脑脊液、唾液、粘膜分泌物、阴道分泌物、腹水、胸水、心包液、腹膜液、腹腔液、细胞培养基、组织培养基、口腔细胞、细菌、病毒、酵母细胞、质粒DNA、mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、小RNA、hnRNA、cDNA、蛋白、多肽、脂质、糖脂、糖蛋白、低聚糖、多聚糖、疫苗、细胞、组织、细胞裂解物、均浆或提取物、组织裂解物、活检标本、血液样本、组织贴块、器官培养物和生物液体。
本发明提供了一种用于保存生物样品的稳定剂组合物以及生物样品保存方法，其与现有技术相比具有以下优势：1、使用室温保存方法，不需要脱水处理，不需依靠昂贵的冷冻、干燥设备；2、能够长时间最大限度地保持样品的完整性和稳定性，降低对后续分析的影响；3、保存方法便于使用和运输，特别适用于地域广、大规模的人群采样；4、与现有的稳定剂相比，具有更好的效果。
以下对本发明以及本发明中的术语做进一步阐述。
本发明中使用的术语“烷基”是指直链或支链一价饱和烃基，例如为C1-10烷基、C1-6烷基、C1-3烷基。所述“C1-10烷基”是指具有1～10个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、异丁基、戊基、2-戊基、异戊基、新戊基、己基、2-己基、3-己基、3-甲基戊基、庚基和辛基等。术语“C1-6烷基”意指具有1～6，即1、2、3、4、5或6个碳原子的直链或支链烷基，典型地为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基和己基等。相似地，术语“C1-3烷基”意指具有1、2或3个碳原子的直链或支链烷基，即甲基、乙基、正丙基和异丙基。
本发明中使用的术语“烯基”是指直链或支链的具有至少一个不饱和双键的烃基。C2-Cl0烯基是指具有2-10个碳原子以及至少一个双键的烯基，并且包括乙烯基、丙烯基、1-丁-3-烯基、1-戊-3-烯基、1-己-5-烯基等。更优选的是具有3-5个碳原子的低级烯基；
本发明中使用的术语“卤素”是指氟、氯、溴以及碘原子。
本发明中使用的术语“环烷基”是指3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子的饱和碳环基团。这些基团的实例包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基等。
本发明中使用的术语“芳基”是指包含至少一个不饱和芳环的任选被取代的单环或二环不饱和芳香体系，优选具有6～10个碳原子，即6、7、8、9或10个碳原子的芳基。本发明中的芳基的实例包括苯基、萘基、1,2,3,4-四氢萘基和茚基等。
在本发明中，所述芳基甲酰烷基是指芳基烷基，例如芳基烷基，例如苯基烷基，所述烷基或C1-10烷基的定义如上所述。
在本发明中，所述例如为其中m、n各自独立地为0、1、2、3。
在本发明的实施方案中，所述生物样品选自于全血样品、胚胎肾细胞样品、脑组织样品、肿瘤组织样品(例如乳腺癌肿瘤组织样品)、尿液、唾液样品。
在本发明的实施方案中，所述生物样品来自于脊椎动物，例如为哺乳动物，如人、鼠、牛、羊、马、猪、猴等。
在本发明中，所述核酸包括DNA和/或RNA；所述DNA包括但不限于基因组DNA、cDNA、质粒DNA等；所述RNA包括但不限于mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、小RNA、hnRNA等。
在本发明中，所述多肽通常是指大于10个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物，当氨基酸个数大于50或100时，也称为蛋白。
在本发明中，所述沉淀剂是指能够影响核酸和/或多肽分子溶解性的化合物。在本发明的实施方案中，所述沉淀剂是指能够促进核酸和/或多肽分子从生物样品中沉淀的物质，其包括但不限于氯化锂、氢氧化锂、磺基水杨酸、5-(4-二甲基氨基苯亚甲基)绕丹宁；其浓度例如为0.05-5M，例如为0.1、0.5、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0M。
在本发明中，所述低分子醇具有相对较短的直链或支链碳链，例如碳链的长度不超过8、7、6、5、4、3个碳原子；其浓度例如为5-50％(v/v)，例如为5％、10％、15％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％(v/v)。
在本发明中，所述离液剂的种类为本领域所公知，其是指能够干扰生物大分子，例如多肽、蛋白、核酸(包括DNA和/或RNA)等的二级、三级或四级结构形成，例如使其变性的物质；本领域技术人员可以根据不同的生物样品选择不同的离液剂；其浓度例如为0.05-5M，例如为0.1、0.5、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0M。
在本发明中，所述式Ⅰ化合物的含量例如为0.1％-10％(w/v或v/v)，例如为0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、5.5％、6.0％、6.5％、7.0％、7.5％、8.0％、8.5％、9.0％、9.5％、10.0％(w/v或v/v)。
在本发明中，由于式Ⅰ化合物可能为液态、固态或粘稠液态，因此其含量或浓度的单位为w/v或v/v。
在本发明的实施方案中，所述用于保存生物样品的组合物与生物样品的体积比例如为10:1～1:10，例如为6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6。
在本发明的实施方案中，所述用于保存生物样品的组合物的pH值根据不同的生物样品进行调整，该调整方法为本领域技术人员所公知，例如所述pH为3-10；当保存RNA时，所述pH可以为3.0-8.0，例如为3.0-6.5，例如为3.2、3.5、3.7、4.0、4.2、4.5、4.7、5.0、5.3、5.5、5.8、6.0、6.3、6.5；当保存DNA时，所述pH可以为5.0-10.0，例如为6.0-9.0，例如为6.3、6.5、6.8、7.0、7.4、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0。
在本发明的实施方案中，当采用本发明的组合物保存生物样品时，其可以在非冷冻条件下(例如)长期、稳定的保存生物样品，保存时间例如为大于1天、3天、7天、10天、20天、30天、40天、50天、60天、70天、90天或180天，或者例如为至少1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个月，或者例如为至少1、2、3、4、5年。
在本发明的实施方案中，当采用本发明的组合物保存生物样品上述时间后，该生物样品中的DNA分子与该样品在-20℃或-80℃条件下保存相比，其完整性可至少保留70％以上，例如80％、85％、90％、95％、100％；该生物样品中的RNA分子与该样品在-80℃条件下保存相比，其完整性可至少保留70％以上，例如80％、85％、90％、95％、100％；该生物样品中的多肽分子与该样品在-20℃或-80℃条件下保存相比，其完整性可至少保留70％以上，例如80％、85％、90％、95％、100％。
在本发明中，所述冷冻条件是指低于0℃条件下，即本领域技术人员用于保存生物样品通常采用的气温条件，例如为在-10℃、-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃条件下等。
在本发明的实施方案中，所述非冷冻条件通常是指室温，例如20-27℃，但可能会根据不同的地理位置、季节以及周围环境变化，例如为从15-19℃或18-23℃到22-29℃或28-32℃。
附图说明
图1、图2显示了琼脂糖凝胶电泳图谱。
图3显示了16S rDNA分析方法流程图。
图4显示了属(Genus)水平上样品两两之间的相关性(使用Excel CORREL函数)。根据属水平上各个物种的相对丰度(表5-1、5-2、5-3)计算样品两两之间的相关系数，对照表6-1、6-2、6-3计算所得相关系数，灰度越高表示相关系数越高，相反，灰度越低表示相关系数越低。因单元格大小限制，数值显示为“1”或“0”，相关系数≥0.5，用“1”表示；相关系数＜0.5，用“0”表示。
图5显示了从不同条件保存的人全血样品中提取得到的DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱。人全血样品首先与稳定剂配方1.1或配方1.3以三种不同比例混合，然后进行室温保存；或不加稳定剂直接进行室温保存(NP)；或不加稳定剂置于-80℃保存。10天后，利用Qia Amp小柱纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)提取样品DNA，并于0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
图6显示了从不同条件保存的人全血样品中提取得到的DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱。人全血样品首先与稳定剂配方1.1或配方1.3以三种不同比例混合，然后进行室温保存；或不加稳定剂直接进行室温保存(NP)；或不加稳定剂置于-80℃保存。20天后，提取样品DNA，并于0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
图7显示了从不同条件保存的人全血样品中提取得到的DNA总量。人全血样品首先与稳定剂配方1.1或配方1.3以一定比例混合，然后进行室温保存；或不加稳定剂直接进行室温保存(NP)；或不加稳定剂置于-80℃保存。20天后，提取样品DNA，并利用分光光度计测定DNA的浓度。
图8显示了从不同条件保存的人全血样品中提取得到的DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱。人全血样品首先与稳定剂配方1.1或配方1.3以一定比例混合，然后进行一个模拟运输过程，再置于室温保存10天；或不加稳定剂先进行模拟运输再进行室温保存10天(NP)；或不加稳定剂只进行-80℃保存。保存结束后，提取样品DNA，并于0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
图9显示了从不同条件保存的人全血样品中提取得到的DNA的总量。人全血样品首先与稳定剂配方1.1或配方1.3以一定比例混合，然后进行一个模拟运输过程，再置于室温保存10天；或不加稳定剂先进行模拟运输再进行室温保存10天(NP)；或不加稳定剂只进行-80℃保存。保存结束后，取样品DNA，并利用分光光度计测定DNA的浓度。
图10显示了从不同条件保存的人全血样品中提取得到的总RNA的琼脂糖凝胶电泳图谱。人全血样品首先与稳定剂配方1.1-1.4分别以一定比例混合，然后进行室温保存；或不加稳定剂直接进行室温保存(NP)；或不加稳定剂置于-80℃保存。15天后，利用AmbionRiboPureTM血液试剂盒提取样品总RNA，并于1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
图11显示了从不同条件保存的人胚胎肾(HEK)293T细胞样品中提取得到的总RNA的琼脂糖凝胶电泳图谱。人胚胎肾293T细胞样品首先与稳定剂配方2.5或配方2.6以一定比例混合，然后进行室温保存；或不加稳定剂直接进行室温保存(NP)；或不加稳定剂置于-80℃保存。15天后，提取样品总RNA，并于1.2％琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
图12显示了从不同条件保存的人胚胎肾293T细胞样品中提取得到的DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱。人胚胎肾293T细胞样品首先与稳定剂配方2.5或配方2.6以一定比例混合，然后进行室温保存；或不加稳定剂直接进行室温保存(NP)；或不加稳定剂置于-80℃保存。15天后，提取样品DNA，并于1.2％琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
图13显示了从不同条件保存的小鼠脑组织样品中提取得到的总RNA的完整性(RIN)。小鼠脑组织样品(～25mg)加入稳定剂配方2.4(100μL)进行室温保存；或不加稳定剂直接进行室温保存(NP)；或不加稳定剂置于-80℃保存。分别在保存15天或24天后，提取样品总RNA，并使用Agilent RNA 6000纳米试剂盒和Agilent 2100生物分析仪(安捷伦科技公司，加利福尼亚州圣克拉拉)对RNA完整性进行评估。
图14显示了从不同条件保存的小鼠脑组织样品中GAPDH,P23和Cdk2基因转录水平情况。小鼠脑组织样品(～25mg)加入稳定剂配方2.4(100μL)进行室温保存；或不加稳定剂直接进行室温保存(NP)；或不加稳定剂置于-80℃保存。15天后，提取样品总RNA，利用RT-qPCR方法检测GAPDH,P23和Cdk2基因的转录水平。
图15显示了从不同条件保存的小鼠脑组织样品中提取得到的总蛋白的聚丙烯酰胺电泳图谱。首先，制备小鼠脑组织样品(～25mg)。将样品转移至PAXgeneTM Tissue FIXContainer(50ml)中固定后，去除PAXgene Tissue FIX，并在同一容器中加入PAXgeneTMTissue STABILIZER(Qiagen,Valencia,CA)，之后进行室温保存；或直接转移至收集管中，加入稳定剂2.4(表2)进行室温保存；或不加稳定剂进行室温保存(NP)；或不加稳定剂于-80℃保存。7天后，用SurePrepTM试剂盒提取各样品总蛋白，并于4-20％梯度的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测。
图16显示了从不同条件保存的小鼠脑组织样品中提取得到的总蛋白的WesternBlot检测结果。首先，制备小鼠脑组织样品(～25mg)。将样品转移至PAXgeneTM Tissue FIXContainer(50ml)中固定后，去除PAXgene Tissue FIX，并在同一容器中加入PAXgeneTMTissue STABILIZER(Qiagen,Valencia,CA)，之后进行室温保存；或直接转移至收集管中，加入稳定剂2.4(表2)进行室温保存；或不加稳定剂进行室温保存(NP)；或不加稳定剂于-80℃保存。7天后，提取各样总蛋白，并于4-20％梯度的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，电泳结束后，将蛋白电转染至硝酸纤维素薄膜上，利用鼠类动力蛋白(Dynein)和β-肌动蛋白(β-actin)特异性抗体，进行Western Blot分析。
图17显示了从不同条件保存的人乳腺癌肿瘤组织样品中提取得到的总蛋白的聚丙烯酰胺电泳图谱。首先，制备人乳腺癌肿瘤组织样品(～25mg)。将样品转移至PAXgeneTMTissue FIX Container(50ml)中固定后，去除PAXgene Tissue FIX，并在同一容器中加入PAXgeneTM Tissue STABILIZER(Qiagen,Valencia,CA)，之后进行室温保存；或直接转移至收集管中，加入稳定剂1.37(表1)进行室温保存；或不加稳定剂进行室温保存(NP)；或不加稳定剂于-80℃保存。7天后，提取各样品总蛋白，并于聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测。
图18显示了从不同条件保存的人全血样品中提取得到的DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱。人全血样品首先与稳定剂配方2.1-2.3分别以两种不同比例混合，然后进行室温保存；或不加稳定剂直接进行室温保存(NP)；或不加稳定剂置于-80℃保存。60天后，提取样品DNA，并于0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
图19显示了不同保存条件、不同保存时间下人全血样品中FOS基因的转录水平变化情况。人全血样品加入稳定剂配方2.4进行室温保存；或不加稳定剂直接进行室温保存(NP)；或不加稳定剂置于-80℃保存。分别在保存时(即0天)、1天、3天和7天，提取样品总RNA，利用RT-qPCR方法检测FOS基因的转录水平。
图20显示了不同保存条件、不同保存时间下人全血样品中IL-1β基因的转录水平变化情况。人全血样品加入稳定剂配方2.4进行室温保存；或不加稳定剂直接进行室温保存(NP)；或不加稳定剂置于-80℃保存。分别在保存时(即0天)、1天、3天和7天，提取样品总RNA，利用RT-qPCR方法检测IL-1β基因的转录水平。
图21显示了不同保存条件、不同保存时间后人全血样品中36个基因相对于保存前的转录水平变化情况。人全血样品加入稳定剂配方2.4进行室温保存3天或7天(图21-C、图21-D)；或利用PAXgeneTM Blood RNA Tube进行室温保存3天或7天(图21-E、图21-F)；或不加稳定剂直接进行室温保存3天(图21-A)；或不加稳定剂置于-80℃保存7天(图21-B)。以PRL13A和GAPDH看家基因作为内参，用ΔΔCq方法检测36个基因表达水平相对于采集时的变化情况。
图22显示了不同保存条件下人全血样品中提取得到的总RNA的完整性(RIN)。人全血样品加入稳定剂配方2.4进行室温保存3天或7天；或利用PAXgeneTM Blood RNA Tube进行室温保存3天或7天；或不加稳定剂直接进行室温保存3天；或不加稳定剂置于-80℃保存7天。保存时间结束后，提取样品总RNA，并对RNA完整性进行评估。
图23显示了不同保存条件下人全血样品中FOS和IL-1β基因的RT-qPCR分析结果。人全血样品加入稳定剂配方2.10-2.14进行室温保存；或利用PAXgeneTM Blood RNA Tube进行室温保存；或不加稳定剂直接进行室温保存(NP)；或不加稳定剂置于-80℃保存。7天后，利用RT-qPCR方法检测FOS和IL-1β基因的转录水平相对于时间“0”时的变化情况。
图24显示了不同保存条件下人全血样品中FOS、IL-1β、IL-16和18S rRNA基因的RT-qPCR分析结果。人全血样品加入稳定剂配方2.10-2.14进行室温保存；或利用PAXgeneTMBlood RNA Tube进行室温保存；或不加稳定剂直接进行室温保存(NP)；或不加稳定剂置于-80℃保存。14天后，利用RT-qPCR方法检测FOS、IL-1β、IL-16和18S rRNA基因的转录水平相对于时间“0”时的变化情况。
图25显示了从不同条件保存的人全血样品中提取得到的DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱。人全血样品分别添加稳定剂配方2.9-2.20中的一种进行室温保存；或不加稳定剂直接进行室温保存(NP)；或不加稳定剂置于-80℃保存。186天后，提取样品DNA，并于0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
图26显示了从不同条件保存的人尿液样品中提取得到的DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱。人尿液样品分别添加稳定剂配方2.6-2.8中的一种进行室温保存；或不加稳定剂直接进行室温保存(NP)；或不加稳定剂置于-80℃保存。30天后，提取样品DNA，并于1.2％琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
图27显示了从不同条件保存的人尿液样品中提取得到的总RNA的琼脂糖凝胶电泳图谱。人尿液样品分别添加稳定剂配方2.6-2.8中的一种进行室温保存；或不加稳定剂直接进行室温保存(NP)；或不加稳定剂置于-80℃保存。30天后，提取样品总RNA，并于1.2％琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
图28显示了从不同条件保存的人唾液样品中提取得到的DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱。人唾液样品分别添加稳定剂配方2.5-2.8中的一种进行室温保存；或不加稳定剂直接进行室温保存(NP)；或不加稳定剂置于-80℃保存。30天后，提取样品DNA，并于1.2％琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
图29显示了从不同条件保存的人唾液样品中提取得到的总RNA的完整性(RIN)。唾液样品加入稳定剂配方2.5-2.8中的一种进行室温保存；或不加稳定剂直接进行室温保存(NP)；或不加稳定剂置于-80℃保存。30天后，提取样品总RNA，并对RNA完整性进行评估。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
在下面的实施例中，均采用标准的细胞和分子生物学技术，该技术基本上是依据已知的方法(如：Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,1.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York；CurrentProtocols,Nucleic Acid Chemistry,Molecular Biology,Wiley and Sons,2003；Current Protocols,Protein Sciences,Cell Biology,Wiley and Sons,2003)。除另外说明，在下面的实施例中所使用的试剂均购自Sigma Aldrich公司(St.Louis，MO)。
以下表1和表2中为用于保存生物样品中的核酸及多肽分子的稳定剂配方举例，其配方编号与实施例中所使用的稳定剂的配方编号对应。
实施例1
1、粪便样品：1位健康志愿者提供新鲜粪便样品，将同一块粪便样品分为30等份，每份样品湿重约0.2g。
2、保存方法：其中有3份直接保存在-80℃冰箱中(对照组)、9份各加500μL StoolDNA Stabilizer(购自B-Bridge International公司)商用稳定剂(第1组)、9份各加500μL配方2.37(表2)稳定剂(第2组)、9份不加稳定剂(第3组)。
第1组、第2组、第3组的样品分别在三个温度(室温/25摄氏度、4摄氏度、-20摄氏度)条件下保存1天、3天、7天，然后放入-80℃冰箱中；
样品编号格式为A-B-C，A为稳定剂配方编号(N：无稳定剂、4：Stool DNAStabilizer商用稳定剂、6：配方2.37)，B为保存温度(N：室温、4：4℃、20：-20℃)，C为保存时间(单位：天)。对照(Control)组为-80℃保存。
3、粪便总基因组DNA的提取：所有样品均完成保存处理后在同一时间进行总基因组DNA的提取，DNA提取方法与前述相同(Manichanh,C.et al.Reduced diversity offecal microbiota in Crohn's disease revealed by a metagenomic approach.Gut55,205-211,doi:gut.2005.073817[pii]10.1136/gut.2005.073817(2006)，通过参照将其并入本文)。
4、DNA浓度检测：采用荧光定量仪(Qubit Fluorometer)和检测试剂盒(dsDNA BR)进行DNA的浓度检测，具体步骤参照制造商的说明书，结果见表3。
表3 DNA浓度检测的结果
5、样品完整性检测：采用琼脂糖凝胶电泳进行样品完整性检测，将试样上样(检测浓度×上样量＝100±1.5ng，见表4)于1％琼脂糖凝胶上进行分离，并在恒定的150V的凝胶进行电泳40分钟后，用紫外线(UVI)成像系统检测照相，电泳图谱见图1、图2。
可以发现从添加稳定剂的组(第1组、第2组)和无稳定剂的组(第3组)的样品中提取得到的DNA的电泳图谱存在很明显的差异：无稳定剂组样品提取得到的DNA电泳条带(点样孔次19-27)相对弥散、向小片段方向拖尾，这显示无稳定剂组样品中的DNA存在相对较严重的降解现象；从主要电泳条带的信号强度看，稳定剂组样品提取得到的DNA主带(点样孔次1-18)亮度较强，无稳定剂组的亮度较弱，特别是样品N-N-7(点样孔次21)的亮度趋向消失，这同样证明了稳定剂能够使样品中更多的DNA保持在未降解的长链状态。上述结果表明，本发明的稳定剂能显著地保持样品完整性。
表4 电泳检测的上样数据和结果
实施例2
对从实施例1中获得的各个样品中提取的DNA建库(插入片段≤800bp)后进行宏基因组16S rDNA基因V4-V5区域测序，使用Ion PGM和318-v2芯片，测序量为8Mb/样品，具体步骤参照制造商的说明书。
基于测序结果对各个样品中的微生物构成(百分比)进行分析，并在属(Genus)水平上计算各个样品间的相关性(使用Excel CORREL函数)。
16S rDNA分析方法：
1、测序仪使用：
Ion Torrent PGM(Personal Genome Machine)
2、测序策略：
16S rDNA基因V4-V5区域定向测序(反向：V5->V4)
3、使用软件：
mothur v.1.33.3(http://www.mothur.org)
4、16S rDNA数据库：
RDP(Ribosomal Database Project，http://rdp.cme.msu.edu/)
Silva(http://www.arb-silva.de/)
5、分析流程：
采用16S rDNA基因的高变区测序技术，对样品16S rDNA的V4-V5区的PCR产物进行测序。测序得到的reads过滤后与16S rDNA数据库Silva进行比对；reads对齐过滤后进行OTU聚类并根据RDP数据库注释得到了物种分类信息，接着进行多样性等分析，分析流程参见图3。图4为统计属水平上样品两两之间的相关性(见表6-1、6-2、6-3)：根据属水平上各个物种的相对丰度(见表5-1、5-2、5-3)计算样品两两之间的相关系数。
6、结果分析：
从属水平上样品两两之间的相关性看，2.37配方相比于Stool DNA Stabilizer商用稳定剂，与对照组更为相似(平均0.9829相比于平均0.9676)，且组内不同保存温度、时间条件下相关性更高(平均0.9937相比于平均0.9862)。不加稳定剂的阴性对照组(第3组)仅在-20℃的保存条件下能够保持与对照组的相关性(平均0.9966)。因此，上述结果表明，本发明的稳定剂能够长时间保持生物样品(粪便)中DNA分子的完整性和稳定性，且保存效果优于现有技术的产品。
实施例3血液样品的保存
将一份新鲜血液(全血)样品收集到含抗凝剂K2-EDTA的离心管中，以一定比例与稳定剂配方1.1和配方1.3(表1)混合。如比例为2：1，分别取100μL血液与50μL稳定剂加入到微量离心管中，漩涡混合。如比例为4：1，分别取100μL血液与25μL稳定剂漩涡混合。如比例为8：1，分别取100μL血液与12.5μL稳定剂漩涡混合。根据不同检测时间点制备多组样品，置于室温保存。取100μL血液样品在室温保存作为未保护对照样品(NP)，取100μL血液样品于-80℃保存作为冷冻对照样品。10天后，用QIAampTM小柱纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)提取DNA，具体步骤参照制造商对血液样品的说明书，每个样品两次重复。最后，将提取得到的基因组DNA用100μL洗脱液进行洗脱，洗脱后取10μL加到含有溴化乙锭的0.8％琼脂糖凝胶的胶孔中，120V电泳40分钟。用紫外线(UVI)成像系统检测照相，电泳图谱见图5。
结果显示，稳定剂与血液样品以不同比例进行混合并室温保存后，得到的DNA在电泳图谱中显示出较完整的条带，而未加稳定剂室温保存样品得到的DNA的电泳条带模糊，且有轻微弥散现象。
实施例4室温保存20天血液样品中DNA稳定性
将一份新鲜血液(全血)样品收集到含抗凝剂K2-EDTA的离心管中，分别与稳定剂配方1.1和配方1.3(表1)以一定比例混合，室温保存20天后进行DNA提取。同时采用未加稳定剂室温保存(NP)和未加稳定剂于-80℃保存的样品作为对照样品。所有样品的DNA用100μL洗脱液洗脱。洗脱后分别取10μL加到含有溴化乙锭的0.8％琼脂糖凝胶的胶孔中，120V电泳40分钟。用紫外线(UVI)成像系统检测照相，电泳图谱见图6。结果显示，血液样品与稳定剂配方1.1和配方1.3以一定比例进行混合，并室温保存20天后，得到的DNA在电泳图谱中仍然显示出较完整的条带，而未加稳定剂室温保存样品得到的DNA的电泳条带有出现严重弥散现象，表明DNA降解严重。
通过260nm紫外光谱利用Biotek Synergy 2读取器测定DNA的浓度。将保存比例为4：1的样品与对照样品相比，结果示于图7、表7。结果显示，稳定剂室温保存样品得到的DNA总量与-80℃保存样品得到的DNA总量相当，差异不显著，而未加稳定剂室温保存样品得到的DNA总量明显偏低。
表7 DNA总量结果
组别 配方1.1 配方1.3 -80℃ NP
DNA总量(μg) 4.52±0.25 4.54±0.37 4.65±0.42 3.41±0.38
实施例5非冷冻保存血液样品中的DNA稳定性
将一份新鲜血液(全血)样品收集到含抗凝剂K2-EDTA的离心管中，分别与稳定剂配方1.1和配方1.3(表1)以不同比例混合，同时采用未加稳定剂室温保存(NP)和未加稳定剂于-80℃保存的样品作为对照样品。然后进行一个模拟运输过程，步骤如下：
a)室温2天
b)45℃2天
c)室温3天
d)-20℃2天
e)室温3天
f)45℃2天。
经上述步骤处理后，血液样品置于室温继续保存10天后进行DNA提取。所有的样品的DNA用100μL洗脱液洗脱。洗脱后分别取10μL加到含有溴化乙锭的0.8％琼脂糖凝胶的胶孔中，120V电泳50分钟。用紫外线(UVI)成像系统检测照相，电泳图谱见图8。通过260nm紫外光谱利用Biotek Synergy 2读取器测定DNA的浓度。将保存比例为4：1的样品与对照样品相比，结果示于图9、表8。
结果显示，血液样品与稳定剂配方1.1和配方1.3以不同比例进行混合，并经历模拟运输过程后，得到的DNA在电泳图谱中显示出相对较完整的条带，其总量也与-80℃保存对照样品得到的DNA总量相当；而未加稳定剂室温保存样品得到的DNA的电泳条带有出现严重弥散现象，DNA总量也相对较低，表明DNA降解严重。
表8 DNA总量结果
组别 配方1.1 配方1.3 -80℃ NP
DNA总量(μg) 3.57±0.32 3.72±0.22 3.68±0.29 2.90±0.19
实施例6室温保存15天血液样品中RNA的稳定性
从志愿者身上采集一份血液(全血)样品至含抗凝剂K2-EDTA的真空采血管中，分别与稳定剂1.1-1.4(表1)中的一种混合，混合比例为2：1或4：1，漩涡混合后置于室温保存。取300μL血液样品室温保存作为未受保护的对照样品(NP)，取300μL血液样品于-80℃保存作为冷冻对照样品。室温保存15天后，将样品在14000g的离心力下离心5分钟，除去上清液。将沉淀物与Ambion RiboPureTM血液试剂盒(Ambion，Austin,TX)中的裂解缓冲液(800μL)和醋酸钠溶液(50μL)充分混合进行溶解，然后根据试剂盒的说明书，从血液样品中提取得到RNA。对于未加稳定剂-80℃保存的样品，待其融解后与未加稳定剂室温保存的样品分别进行RNA提取。将提取得到的RNA分别加到含有溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶孔中，150V电泳35分钟。用紫外线(UVI)成像系统检测照相，电泳图谱见图10。
结果显示，未加稳定剂室温保存的样品，其得到的RNA完全降解，在泳道上呈现出严重的弥散现象，看不到RNA条带，相反，利用稳定剂室温保存的样品，其得到的RNA在电泳图谱上有比较清晰的条带(包括18S和28S rRNA两条主条带)，其完整性也相对较高。
实施例8细胞293T中基因组DNA和RNA的稳定性
按照标准的细胞培养方法对人胚胎肾(HEK)293T细胞(ATCC,马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国)进行培养，并对获得的细胞进行洗涤。将细胞按2：1、4：1和8：1的比例分别与稳定剂2.5或稳定剂2.6(表2)混合，室温保存；另外取两份等量细胞不加任何稳定剂用作对照，一份室温保存(NP)，另一份于-80℃保存。所有样品保存15天后，用RNAqueousTM试剂盒(Ambion公司，德克萨斯州奥斯汀)提取基因组DNA和总RNA，具体步骤参照制造商的使用说明书。得到的核酸样品用1.2％琼脂糖凝胶电泳进行检测。RNA电泳图谱显示(图11)，未加稳定剂室温保存的样品，其RNA完全降解，看不到独立的RNA条带，相反，利用稳定剂2.5和稳定剂2.6室温保存的样品，其RNA在电泳图谱上有比较清晰的条带(包括18S和28S rRNA两条主条带)，其完整性与未加稳定剂-80℃保存样品的相当，甚至更好。DNA电泳图谱显示(图12)，利用稳定剂2.5和稳定剂2.6室温保存样品的DNA在电泳图谱上条带也比较单一明亮，不亚于-80℃保存的对照样品的DNA，而未加稳定剂室温保存样品的DNA降解严重，条带出现严重弥散。
实施例9室温保存下小鼠脑组织样品中RNA和蛋白质的稳定性
根据现有的实验室动物组织收集流程，获得新鲜小鼠脑组织样品(大约每份25mg)，并单独存储在离心管中，分4种方法进行保存：一种不加任何保护的添加剂，一种加入100μL稳定剂2.5，一种加入100μL稳定剂2.6(表2)，三种处理样品均在室温进行保存；另外一种同样不加任何保护的添加剂，在-80℃下保存作为对照。所有处理2次重复，相应条件下保存15天或24天。保存完成后，用RNAqueousTM试剂盒(Ambion公司，德克萨斯州奥斯汀)对上述各样品进行总RNA提取，具体步骤参照制造商的使用说明。并使用Agilent RNA 6000纳米试剂盒和Agilent 2100生物分析仪(安捷伦科技公司，加利福尼亚州圣克拉拉)对RNA完整性进行评估，结果用RIN(RNA integrity)表示。
15天后，利用稳定剂2.5和2.6室温保存样品的RNA的RIN平均值分别为8.1和8.3(图13)，比-80℃保存样品的RNA的RIN平均值(8.6)略低，而未加稳定剂室温保存样品的RNA的RIN平均值仅为3.2。24天后，利用稳定剂2.5和2.6室温保存的样品的RNA的RIN平均值分别为7.4和7.7，接近-80℃保存样品的RNA的RIN平均值(8.0)，而此时未加稳定剂室温保存样品的RNA的RIN值只有2.6。
用前述方法制备小鼠脑组织样品(各约25mg)，或利用稳定剂2.4(表2)进行室温保存，或不加稳定剂进行室温保存(NP)，或不加稳定剂于-80℃保存。15天后，分别提取各样品的总RNA。利用鼠类GAPDH,P23和Cdk2的cDNA片段设计特异性引物，进行实时定量PCR(RT-qPCR)分析。取250pg,2.5ng或25ng分别进行反转录，并利用标准的定量PCR方法进行扩增，对RNA样品进行比较分析。结果显示(图14)，利用稳定剂2.4室温保存15天后，样品三个基因的转录水平均与-80℃对照样品的相当；而未加稳定剂室温保存样品三个基因的转录水平出现较大幅度的升高。
用前述方法制备小鼠脑组织样品(各约25mg)，转移至PAXgeneTM Tissue FIXContainer(50ml)中固定后，去除PAXgene Tissue FIX，并在同一容器中加入PAXgeneTMTissue STABILIZER(Qiagen,Valencia,CA)，之后进行室温保存；或直接转移至收集管中，加入稳定剂2.4(表2)进行室温保存，或不加稳定剂进行室温保存(NP)，或不加稳定剂于-80℃保存。7天后，用SurePrepTM试剂盒((Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)提取上述各样品蛋白，具体步骤参照制造商的使用说明。并用Pierce BCA分析试剂盒(Thermo FisherScientific,Rockford,IL)测定蛋白浓度。取等量蛋白提取物于4-20％梯度的tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen,Carlsbad,CA)上进行电泳。电泳结束后，将蛋白电转染至硝酸纤维素薄膜上，并用丽春红溶液进行染色。利用鼠类动力蛋白和肌动蛋白特异性抗体，进行Western Blot分析。
通过丽春红S染色，蛋白提取物在电泳图谱上，稳定剂2.4较稳定剂PAXgeneTMTissue STABILIZER Concentrate保存样品的条带更加明显和清晰(图15)；而未加稳定剂室温保存的样品的蛋白电泳图谱，条带明显较弱，条带较为弥散。免疫印迹分析表明(图16)：利用稳定剂2.4室温保存样品的蛋白提取物和未加稳定剂-80℃保存样品的蛋白提取物中，动力蛋白含量比较一致，印迹亮度相当；而稳定剂PAXgeneTM Tissue STABILIZERConcentrate室温保存样品的蛋白提取物中，动力蛋白含量相对低一些，印迹条带亮度稍低；未加稳定剂室温保存样品的蛋白提取物中，动力蛋白含量明显偏低，印迹条带不明显。三种条件下保存样品的蛋白提取物在Western Blot中都能明显地检测到肌动蛋白条带，同样，稳定剂2.4对组织样品中蛋白的保存效果明显好于稳定剂PAXgeneTM TissueSTABILIZER Concentrate，而未加稳定剂室温保存样品的蛋白提取物的印迹条带相对较弱，保存效果最差。
实施例10室温保存下人乳腺癌肿瘤样品中蛋白质的稳定性
用前述方法制备人乳腺癌样品(各约25mg)，转移至PAXgeneTM Tissue FIXContainer(50ml)中固定后，去除PAXgene Tissue FIX，并在同一容器中加入PAXgeneTMTissue STABILIZER(Qiagen,Valencia,CA)，之后进行室温保存；或直接转移至收集管中，加入稳定剂1.37(表1)进行室温保存，或不加稳定剂进行室温保存(NP)，或不加稳定剂于-80℃保存。保存7天后，如前述方法进行蛋白质提取，并对蛋白质提取物进行电泳分离。电转至硝酸纤维素薄膜上后，利用酰胺黑进行染色，结果示于图17。结果显示，稳定剂1.37室温保存样品的蛋白提取物在电泳图谱上具有多条清晰的条带，相比而言，稳定剂1.37较稳定剂PAXgeneTM Tissue STABILIZER Concentrate保存样品的条带更加明显和清晰；而未加稳定剂室温保存的样品的蛋白电泳图谱，条带亮度较弱，条带较为弥散。
实施例11室温长时间保存下人体血液样品中RNA和DNA的稳定性
从志愿者身上采集一份血液(全血)样品至含抗凝剂K2-EDTA的真空采血管中，分别与稳定剂2.1-2.3(表2)中的一种按2：1或8：1进行混合，室温保存，或不加稳定剂室温保存(NP)，或不加稳定剂于-80℃保存。60天后，利用QIAampTM mini DNA试剂盒提取样品基因组DNA，纯化后进行琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果示于图18。从电泳图谱上可以看出，利用稳定剂2.1-2.3室温保存样品的DNA的条带亮度和单一性均明显高于未加稳定剂室温保存样品的DNA条带。
从志愿者身上采集一份人血液(全血)样品至含抗凝剂K2-EDTA的真空采血管中，或利用稳定剂2.4进行室温保存，或不加稳定剂进行室温保存(NP)，或不加稳定剂于-80℃保存。分别在0，1，3，7天时，以肌动蛋白基因作为内参，利用RT-qPCR方法分别检测低聚果糖(FOS)基因和IL-1β基因的转录水平。结果显示(图19、图20)，利用稳定剂2.4室温保存样品的FOS基因和IL-1β基因的转录水平在各个检测时间点上均与-80℃对照相当；相反，未加稳定剂室温保存样品的的FOS基因转录水平逐渐增高，而IL-1β基因的转录水平出现较大幅度的波动。
实施例12非冷冻保存血液样品中RNA的稳定性从志愿者身上采集血液(全血)样品至PAXgeneTM Blood RNA Tube中，并置于室温保存3天或7天；或采集至含抗凝剂K2-EDTA的真空采血管中，或利用稳定剂2.4室温保存3天或7天，或不加稳定剂室温保存3天，或不加稳定剂于-80℃保存7天。用ΔΔCq方法检测36个基因(表9)表达水平相对于采集时候的变化情况，以PRL13A和GAPDH看家基因作为内参，每个样品三次重复。基因在零时间具有相同的表达水平，而在特定的测试时
间点上落在线性图上(图21A-F)。散点图边界设定为2倍，如果基因表达量明显高于上边界，就认为是上调；相反，如果基因表达量明显低于下边界，则认为是下调。
表9利用RT-qPCR方法分析血液样品在不同条件下保存前后36个基因表达水平变化情况
表10总结了利用RT-qPCR方法分析血液样品在室温保存后多个基因表达稳定性的结果。从志愿者身上采集血液(全血)样品至PAXgeneTM BloodRNA Tube中，并置于室温保存3天或7天；或采集至含抗凝剂K2-EDTA的真空采血管中，或利用稳定剂2.4室温保存3天或7天，或不加稳定剂室温保存3天，或不加稳定剂于-80℃保存7天。用ΔΔCq方法检测36个基因表达水平相对于采集时的变化情况，以PRL13A和GAPDH看家基因作为内参，每个样品三次重复。结果显示，未加稳定剂室温保存3天的样品，其上调基因数目达到7，下调基因数目达到10，两者加在一起占到所有检测基因的47％；而-80保存样品的上调基因数目和下调基因数目分别是1和2，两者相加仅占到总数的8％。相比而言，稳定剂2.4室温保存样品3天后，其上调基因数目和下调基因数目分别是2和1，占到总数的8％；保存7天后，下调基因数目增加一个，总共占到总数的11％，与-80保存结果相近。同时，通过比较，发现稳定剂2.4的保存效果优于PAXgeneTM Blood RNA Tube。
表10 RT-qPCR结果
在另一个实验中，从志愿者身上采集血液(全血)样品至PAXgeneTM Blood RNATube中，并置于室温保存3天或7天；或采集至含抗凝剂K2-EDTA的真空采血管中，或利用稳定剂2.4室温保存3天或7天，或不加稳定剂室温保存3天，或不加稳定剂于-80℃保存7天。使用RNAqueousTM试剂盒(Ambion，Austin,TX)提取血液样品总RNA，并使用Agilent2100Bioanalyzer和RNA 6000纳米试剂盒分析RNA的完整性(RIN)，结果示于图22中。结果显示，利用稳定剂2.4室温保存样品3天后，测定RNA的RIN平均值为8.5，远高于未加稳定剂室温保存3天的样品得到的RNA的RIN值(2.95)。利用稳定剂2.4室温保存样品7天后，测定RNA的RIN平均值为8.3，稍低于-80℃保存样品的RNA的RIN平均值(8.6)。同时，发现利用PAXgeneTM Blood RNA Tube室温保存3天或7天的样品，得到的RNA的RIN值均低于稳定剂2.4保存样品得到的RNA的RIN值，表明稳定剂2.4保存效果更优。
在另一项研究中，从志愿者身上采集血液(全血)样品至PAXgeneTM Blood RNATube中，并置于室温保存；或采集至含抗凝剂K2-EDTA的真空采血管中，或分别利用稳定剂2.10-2.14(表2)进行室温保存，或不加稳定剂进行室温保存(NP)，或不加稳定剂于-80℃保存。分别在样本采集时(“时间0”)和指定条件保存7天后提取各样品总RNA。采用前述方法，利用RT-qPCR技术分析保存后血液中编码FOS和IL-1β的基因相对于时间“0”时转录水平的变化情况，采用人β-肌动蛋白基因作为内参。结果示于图23。结果显示，利用稳定剂2.10-2.11室温保存样品的FOS基因和IL-1β基因的转录水平均与-80℃对照相当，差异不大；而利用PAXgeneTM Blood RNA Tube室温保存样品的两个基因的转录水平相对-80℃对照均有明显降低；相反，未加稳定剂室温保存样品的两个基因转录水平变化较大，其中，FOS基因转录水平显著降低，而IL-1β基因的转录水平出现较大幅度的增加。
同时，我们还进行了一个类似的分析，保存时间为14天而不是7天，分析的基因也进行了扩展，即还包括了IL-16和18S rRNA基因。从志愿者身上采集血液(全血)样品至PAXgeneTM Blood RNA Tube中，并置于室温保存；或采集至含抗凝剂K2-EDTA的真空采血管中，或分别利用稳定剂2.10-2.14(表2)进行室温保存，或不加稳定剂进行室温保存(NP)，或不加稳定剂于-80℃保存。分别在样品采集时(“时间0”)和指定条件下保存14天后提取样品总RNA。采用前述方法，利用RT-qPCR技术分析保存后编码FOS、IL-1β、IL-16和18S rRNA的基因的转录水平相对于时间“0”时的变化情况，采用β-肌动蛋白基因作为内参。结果示于图24。结果显示，利用稳定剂2.10-2.11室温保存样品的4个基因的转录水平均与-80℃对照更相近，差异不大，且保存效果优于PAXgeneTM Blood RNA Tube；而未加稳定剂室温保存样品的4个基因转录水平变化较大，均显著降低。
实施例13非冷冻保存大于6个月血液样品中DNA的稳定性
从志愿者身上采集血液(全血)样品至至含抗凝剂K2-EDTA的真空采血管中，或分别利用稳定剂2.9-2.20(表2)进行室温保存，或不加稳定剂进行室温保存(NP)，或不加稳定剂于-80℃保存。
室温保存的样品置于实验室工作台上，186天后，根据说明书，利用QiaAmpTM mini试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)进行基因组DNA的提取。提取的DNA在含有溴化乙锭的0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳进行检测。结果显示(图25)，与未加稳定剂于-80℃保存样品的DNA条带相比，稳定剂保存样品的DNA条带更清晰、更明亮，而未加稳定剂室温保存的DNA条带出来严重弥散，向小片段方向拖尾，降解严重。
实施例14非冷冻保存尿液样品中RNA和DNA的稳定性
从志愿者身上采集尿液样品，置于冰上保存备用。取200μL尿液样品与等量稳定剂2.6-2.8(表2)分别充分混合。另外制备两份不加稳定剂对照样品，其中一份置于-80℃保存作为冷冻对照，另一份(NP)与稳定剂保存样品一起置于室温下避光保存。每组处理2个重复。保存30天后，利用上述DNA和RNA提取试剂盒分别提取基因组DNA和总RNA，具体步骤参照制造商的使用说明书。得到的核酸样品用1.2％琼脂糖凝胶电泳进行检测。DNA电泳图谱显示(图26)，利用稳定剂室温保存样品的DNA在电泳图谱上条带明亮，与-80℃保存的对照样品的DNA条带亮度相当。而未加稳定剂室温保存样品的DNA降解严重，条带模糊，亮度非常低。RNA电泳图谱显示(图27)，未加稳定剂室温保存的样品，其RNA完全降解，看不到独立的RNA条带，相反，利用稳定剂室温保存的样品，其RNA在电泳图谱上均有比较清晰的条带，且28S条带和18S条带亮度比接近2：1，表明得到的RNA质量较高。
实施例15非冷冻保存唾液样品中RNA和DNA的稳定性
从志愿者身上采集唾液样品，置于冰上保存备用。将唾液样品充分混匀，取200μL与等量稳定剂2.5-2.8(表2)分别于带有螺旋盖的聚丙烯小瓶中混合。另外制备两份不加稳定剂对照样品，其中一份置于-80℃保存作为冷冻对照，另一份(NP)与稳定剂保存样品一起置于室温下避光保存。每组处理2个重复。保存30天后，每个样品取300μl，利用QIAamp小柱纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)提取DNA，具体步骤参照制造商提供的说明书。最后，将提取得到的基因组DNA用100μL AE洗脱液进行洗脱，取10μL洗脱液加到含有溴化乙锭的1.2％琼脂糖凝胶的胶孔中，120V电泳40分钟。用紫外线(UVI)成像系统检测照相，电泳图谱见图28。
结果显示，与未加稳定剂于-80℃保存样品的DNA条带相比，稳定剂保存样品的DNA条带同样得到清晰、明亮的条带，而未加稳定剂室温保存的DNA条带模糊且亮度较低。
从志愿者身上采集唾液样品，将唾液样品充分混匀，取200μL与等量稳定剂2.5-2.8配方于带有螺旋盖的聚丙烯小瓶中混合。另外制备两份不加稳定剂对照样品，其中一份置于-80℃保存作为冷冻对照，另一份(NP)与稳定剂保存样品一起置于室温下避光保存。所有处理2次重复，相应条件下保存30天。保存完成后，用RNAqueousTM试剂盒(Ambion公司，德克萨斯州奥斯汀)对上述各样品进行总RNA提取，具体步骤参照制造商的使用说明。并使用Agilent RNA 6000纳米试剂盒和Agilent 2100生物分析仪(安捷伦科技公司，加利福尼亚州圣克拉拉)对RNA完整性进行评估，结果用RIN(RNA integrity)表示。
结果显示(图29)，保存30天后，利用稳定剂2.5-2.8室温保存样品的RNA的RIN平均值分别为8.45、8.55、8.3和8.45(图13)，与-80℃保存样品的RNA的RIN平均值(8.65)基本一致，而未加稳定剂室温保存样品的RNA的RIN平均值仅为2.85。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (24)

1.一种用于保存生物样品中核酸和/或多肽的组合物，其包含：
1)至少一种如式Ⅰ所示的化合物：
其中R代表取代的或未取代的以下基团：C1-10烷基、C3-10环烷基、芳基甲酰C1-10烷基、所述取代基选自C1-10烷基、卤素；
m、n各自独立地为0、1、2、3；
X-代表阴离子，所述阴离子选自溴离子、氯离子和碘离子；
2)以下三种中的两种或三种：
(a)至少一种沉淀剂，所述沉淀剂选自氯化锂、氢氧化锂、磺基水杨酸和5-(4-二甲基氨基苯亚甲基)绕丹宁；
(b)至少一种低分子醇，所述低分子醇选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇和异丁醇；和
(c)至少一种离液剂，所述离液剂选自盐酸胍、硫氰酸胍、硫氰酸钾、硫氰酸钠和尿素；
3)还原剂或聚合酶抑制剂，所述还原剂选自2-巯基乙醇、硫代硫酸盐、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇；所述聚合酶抑制剂选自利福霉素-S、利福霉素-SV、抗霉素、红霉素中的一种或几种；和
4)pH缓冲剂，所述pH缓冲剂选自柠檬酸、酒石酸、苹果酸、磺基水杨酸、5-磺基-1,3-苯二甲酸、草酸、硼酸、N-(羟乙基)哌嗪、3-(环己胺)-1-丙磺酸(CAPS)、3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸(HEPPS)、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙基磺酸(HEPES)、2-吗啉乙磺酸(MES)、3-(N-吗啡啉)丙磺酸(MOPS)、3-(N-吗啡啉)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES)、三羟甲基甲胺基丙磺酸(TAPS)、3-[N-三(羟甲基)甲胺]-2-羟基丙磺酸(TAPSO)、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)、二甘氨酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷(tris)和2-[双(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇。
2.权利要求1的组合物，其还包含：
(e)水。
3.权利要求1的组合物，其包含以下配方中的一种：
(i)权利要求1中式Ⅰ所示的化合物、沉淀剂、低分子醇、聚合酶抑制剂、pH缓冲剂；
(ii)权利要求1中式Ⅰ所示的化合物、离液剂、低分子醇、聚合酶抑制剂、pH缓冲剂；
(iii)权利要求1中式Ⅰ所示的化合物、沉淀剂、低分子醇、还原剂、pH缓冲剂；
(iv)权利要求1中式Ⅰ所示的化合物、离液剂、低分子醇、还原剂、pH缓冲剂。
4.权利要求3的组合物，其中各成分的含量为：式Ⅰ所示的化合物为1-10％v/v、离液剂为2.5-5M、pH缓冲剂为50-400mM、低分子醇为20-50％v/v、还原剂为5-50mM、沉淀剂为2.5-5M、聚合酶抑制剂为0.1-0.5mM。
5.权利要求1的组合物，其中所述式Ⅰ所示的化合物选自：
溴化N-辛基吡啶、溴化N-丁基吡啶、N-(苄甲基)溴化吡啶。
6.权利要求1的组合物，其中所述沉淀剂选自氯化锂。
7.权利要求1的组合物，其中所述低分子醇选自乙醇。
8.权利要求1的组合物，其中所述离液剂选自盐酸胍。
9.权利要求1的组合物，其中所述还原剂选自三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)和二硫苏糖醇。
10.权利要求1的组合物，其中所述pH缓冲液选自N-(羟乙基)哌嗪、3-(N-吗啡啉)丙磺酸(MOPS)、和三羟甲基氨基甲烷(tris)。
11.权利要求1或2的组合物，其还包含表面活性剂或去污剂。
12.权利要求11的组合物，其中所述表面活性剂或去污剂选自TritonX-100、NonidetP40和非离子去污剂Brij。
13.权利要求1的组合物，其中所述的核酸选自下组的一种或多种DNA和/或RNA分子，所述DNA选自下组：基因组DNA、cDNA和质粒DNA；所述RNA选自下组：mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、小RNA和hnRNA。
14.权利要求1的组合物，其中所述的生物样品选自以下的一种或多种：全血的白膜层、尿、粪便、粘膜分泌物、阴道分泌物、细胞培养基、组织培养基、口腔细胞、细菌、病毒、酵母细胞、疫苗、细胞、组织、细胞裂解物、均浆或提取物、组织裂解物、活检标本、血液样本、组织贴块、器官培养物和生物液体。
15.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述血液样本选自下组：全血、血清和血浆。
16.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述生物液体选自下组：浆膜液、淋巴液、脑脊液、唾液、心包液、腹膜液、腹腔液、腹水和胸水。
17.权利要求1-16任一项的组合物与生物样品混合后得到的生物样品制品，其中所述生物样品选自以下的一种或多种：全血的白膜层、尿、粪便、粘膜分泌物、阴道分泌物、细胞培养基、组织培养基、口腔细胞、细菌、病毒、酵母细胞、疫苗、细胞、组织、细胞裂解物、均浆或提取物、组织裂解物、活检标本、血液样本、组织贴块、器官培养物和生物液体。
18.在非冷冻条件下保存至少1天、3天、7天、10天、20天、30天、40天、50天、60天、70天、90天或180天的权利要求17的生物样品制品。
19.试剂盒，其包含权利要求1-16任一项的组合物，所述试剂盒用于在非冷冻条件下保存生物样品中的核酸和/或多肽。
20.权利要求19的试剂盒，其中所述生物样品选自以下的一种或多种：全血的白膜层、尿、粪便、粘膜分泌物、阴道分泌物、细胞培养基、组织培养基、口腔细胞、细菌、病毒、酵母细胞、疫苗、细胞、组织、细胞裂解物、均浆或提取物、组织裂解物、活检标本、血液样本、组织贴块、器官培养物和生物液体。
21.一种在非冷冻条件下保存生物样品中的核酸和/或多肽的方法，所述方法包括：
1)将生物样品与权利要求1-16任一项的组合物进行混合；
2)将步骤1)得到的混合物在非冷冻条件下保存至少1天、3天、7 天、10天、20天、30天、40天、50天、60天、70天、90天或180天。
22.权利要求21的方法，其中所述生物样品选自以下的一种或多种：全血的白膜层、尿、粪便、粘膜分泌物、阴道分泌物、细胞培养基、组织培养基、口腔细胞、细菌、病毒、酵母细胞、疫苗、细胞、组织、细胞裂解物、均浆或提取物、组织裂解物、活检标本、血液样本、组织贴块、器官培养物和生物液体。
23.权利要求1-16任一项的组合物用于在非冷冻条件下保存生物样品中的核酸和/或多肽的用途。
24.权利要求23的用途，其中所述生物样品选自以下的一种或多种：全血的白膜层、尿、粪便、粘膜分泌物、阴道分泌物、细胞培养基、组织培养基、口腔细胞、细菌、病毒、酵母细胞、疫苗、细胞、组织、细胞裂解物、均浆或提取物、组织裂解物、活检标本、血液样本、组织贴块、器官培养物和生物液体。
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