CN104961813B

CN104961813B - 完整获取植物组织中核糖体新生肽链复合物的方法与应用

Info

Publication number: CN104961813B
Application number: CN201510332732.5A
Authority: CN
Inventors: 赵晶; 张弓
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2015-06-16
Filing date: 2015-06-16
Publication date: 2018-10-09
Anticipated expiration: 2035-06-16
Also published as: CN104961813A

Abstract

本发明公开一种完整获取植物组织中核糖体新生肽链复合物的方法与应用。该方法的步骤为：用水将新鲜的植物组织清洗干净，用液氮速冻处理至植物组织的温度低于‑80℃，后提取RNC；或是将液氮速冻的植物组织存储于不高于‑80℃的环境，在该条件下进行稳定的储存、运输后再提取RNC；提取RNC的步骤为：加液氮对植物组织进行研磨，得到粉末；保持在液氮环境下往粉末中加入预冷的细胞裂解液，研磨混匀；置于冰上等待融化后进行裂解反应；离心，取上清进行RNC的提取，得到RNC。该方法可方便有效地获取植物组织样品的RNC；且满足RNC样品的长期储存与运输的需要，便于分析基因功能。

Description

完整获取植物组织中核糖体新生肽链复合物的方法与应用

技术领域

本发明属于生命科学技术领域，特别涉及一种完整获取植物组织中核糖体新生肽链复合物的方法与应用。

背景技术

目前对植物基因表达水平的考察大多停留在转录层次上，即检测基因表达均为检测直接由细胞破碎，进而抽提得来总RNA，通过检测总RNA中的mRNA量来作为基因的表达量，然而一直以来基因的表达量不能等同于蛋白的表达量，在植物界一直以来是一个悬而未决的问题。

近年来发现翻译调控是生命体内的一个重要调控层次。mRNA进行翻译时，核糖体结合在mRNA链上并移动，依据mRNA上的密码子信息来逐步合成蛋白质多肽链(新生肽链，Nascent-chain)，这一复合物称为核糖体新生肽链复合物(Ribosome Nascent-chainComplex,RNC)。在细胞中，在翻译调控多种机制的调节下，一些基因进入翻译的比例高、有些基因进入翻译的比例低，还有部分基因完全不进入核糖体起始翻译，由此可知对细胞中mRNA的翻译状况进行研究显得极为必要。只有完整提取了RNC，才能对正在翻译的mRNA进行定性定量研究，因此，完整提取RNC对研究和应用都有重要的意义。

研究发现正在翻译的RNC-mRNA含量与细胞内蛋白质的含量之间存在较高相关性(Wang et al.,Translating mRNAs strongly correlate to proteins in amultivariate manner and their translation ratios are phenotypespecific.Nucleic acids research 41,4743-4754,2013)，因而对正在翻译的RNC-mRNA含量进行测定(翻译组测序)，结合对同一样品的转录组测序，可准确推算出细胞内翻译效率与蛋白质表达量，从而表征细胞的各种表型(Wang et al.,2013，下文中凡简写，均为文献名称已在背景技术提及过)、发现未知蛋白(Zhang et al.How to discover newproteins-translatome profiling.Science China Life sciences 57,358-360，2014b)，对蛋白质组研究也有重要的指导意义(Chang et al.Systematic analyses of thetranscriptome,translatome,and proteome provide a global view and potentialstrategy for the C-HPP.Journal of proteome research 13,38-49，2014；Liu etal.Chromosome-8-coded proteome of Chinese Chromosome Proteome Data set(CCPD)2.0with partial immunohistochemical verifications.Journal of proteomeresearch 13,126-136,2014；Wang et al.Omics evidence:single nucleotide variantstransmissions on chromosome 20in liver cancer cell lines.Journal of proteomeresearch 13,200-211,2014；Zhang et al.Systematic analysis of missing proteinsprovides clues to help define all of the protein-coding genes on humanchromosome 1.Journal of proteome research 13,114-125,2014a；Zhong etal.Resolving chromosome-centric human proteome with translating mRNAanalysis:a strategic demonstration.Journal of proteome research 13,50-59，2014)，被列为人类蛋白质组计划的第四支柱(Zhong et al.Resolving chromosome-centric human proteome with translating mRNA analysis:a strategicdemonstration.Journal of proteome research 13,50-59，2014)。

目前能高效完整提取动物细胞RNC的方法是利用蔗糖密度梯度离心法对破膜后的细胞溶液进行超速离心分离，此方法能完整提出动物细胞中的RNC，定量核糖体上全长的mRNA和新生肽链以供其后的各种生化与分子生物学研究(Wang et al.,2013；Zhang etal.,2009)。然而此法只适用于动物新鲜细胞RNC的直接提取，不能对大块组织以及低温保存的组织中的RNC。并且，由于植物组织内部化学环境复杂(富含多糖多酚经常造成核糖核酸难以提取)，又有结构坚固的细胞壁，使植物组织样品的RNC提取相对于动物细胞组织更加困难。由动物细胞或细菌提取RNC时，需要在提取前先加入翻译延伸抑制剂(如氯霉素、放线菌酮等)通过细胞膜渗透至细胞内，固定正在mRNA上翻译的核糖体，以保持细胞处理时的真实翻译状况，进而通过系列操作提取出完整RNC。但对于植物组织来说，由于含有纤维素以及多糖的细胞壁可以阻隔各种外界物质的进入，且细胞壁之间均紧密连接少有缝隙，翻译延伸抑制剂很难在短时间内渗入组织内部细胞成功固定核糖体；对于动物细胞，可用Triton X-100等去垢剂快速温和地破细胞膜而释放细胞内容物，而植物组织由于具有坚硬的细胞壁，而且细胞间细胞壁厚且紧密衔接，只用Triton X-100等去垢剂并不能破碎强大的植物细胞壁，使得植物的RNC提取难以进行。因此，植物组织样品的RNC提取过程无法沿用动物细胞提取RNC的策略，如何使翻译延伸抑制剂迅速与核糖体结合并且完整获取植物组织样品的RNC，是实验室及商业服务所面临的巨大挑战。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种完整获取植物组织中核糖体新生肽链复合物的方法。

本发明的另一目的在于提供所述完整获取植物组织中核糖体新生肽链复合物的方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种完整获取植物组织中核糖体新生肽链复合物的方法，包括如下步骤：

(1)用水将新鲜的植物组织清洗干净，用液氮进行冷冻处理至植物组织的温度稳定至低于-80℃；

(2)将步骤(1)冷冻处理好的植物组织存储于不高于-80℃的环境，在该条件下，可以进行稳定的储存、运输；

(3)从步骤(1)冷冻处理好的植物组织或是步骤(2)进行储存、运输的植物组织中提取核糖体新生肽链复合物时，步骤如下：

①在研钵内加液氮对植物组织进行研磨，得到粉末；

②保持在液氮环境下往粉末中加入预冷至0～6℃的细胞裂解液，继续研磨混匀；然后置于冰上等待完全融化，进行裂解反应；细胞裂解液的组成如下：190～210mM、pH 7.8～8.2的Tris-HCl，45～55mM MgCl₂，390～410mM KCl，0.05～0.15mg/mL放线菌酮，4～6mM二硫苏糖醇(DTT)，体积百分比0.5～1.5％的Triton X-100；

③离心，取上清进行RNC的提取，得到植物组织中的核糖体新生肽链复合物。

步骤(1)中所述新鲜的植物组织通过如下步骤得到：从植物体上分离植物组织，控制在5min以内完成，得到新鲜的植物组织；在分离过程中避免其他无关组织和杂质混入。

步骤(1)中所述的清洗的次数为1～2遍。

步骤(1)中所述的水为电导率不超过20μS/cm的水，优选为蒸馏水或超纯水。

步骤(1)中所述的新鲜的植物组织在用水清洗干净后、用液氮进行冷冻处理前还进行如下处理：去除新鲜的植物组织表面的水分。

所述的去除新鲜的植物组织表面的水分优选通过使用洁净的滤纸实现。

步骤(1)中所述的冷冻处理优选为将植物组织完全浸入液氮中进行冷冻处理。

步骤(2)中所述的不高于-80℃的环境为-196℃～-80℃的环境，一般为-80℃的环境。

步骤(3)中所述的细胞裂解液配制时使用无菌无RNase的水和无菌器具，配制完毕后溶液需过滤除菌。

步骤(3)中所述的继续研磨的时间优选为1～5min。

步骤(3)中所述的细胞裂解液的组成优选如下：200mM、pH 8.0的Tris-HCl，50mMMgCl₂，400mM KCl，0.1mg/mL放线菌酮，5mM二硫苏糖醇(DTT)，体积百分比1％的Triton X-100。

步骤(3)中所述的离心的条件优选为4℃、16200×g离心至少10min。

步骤(3)中所述的RNC的提取的方法优选为蔗糖密度梯度离心法。

所述的蔗糖密度梯度离心法可参考文献“Wang et al.,2013”。

所述的完整获取植物组织中核糖体新生肽链复合物的方法可用于分析基因功能。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)现有技术方法不能从植物组织中完整提取RNC，而应用本发明提供的方法可方便有效地获取植物组织样品的RNC。

(2)现有技术方法不能满足用于提取RNC的植物组织保存与运输的需要，本发明提供的方法可以满足RNC样品的长期储存与运输的需要，为进一步研究植物RNC提供了便利。

附图说明

图1是按实施例1和对比例1方法提取水稻叶片组织RNC以及小鼠肝脏组织RNC的琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道M为DNA Marker，泳道1～4分别为利用本发明所列试剂方法提取得到的水稻叶片RNC，泳道5为利用动物细胞提取方法提取得到的水稻叶片RNC，泳道6～7为动物细胞提取液提取得到的小鼠肝脏RNC。

图2是两份植物组织样品的翻译组测序与转录组测序定量比较图；其中，图A是叶片组织1，图B是叶片组织2；图A和B中的横轴“log10mRNA丰度(rpkM)”表示转录组定量，纵轴“log10RNC丰度(rpkM)”表示翻译组定量。

图3是按实施例2方法提取水稻叶片组织RNC的琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道M为DNA Marker，泳道1～5为利用本发明所列试剂方法提取经液氮储存15天后的叶片组织得到的水稻叶片RNC。

图4是按对比例2方法提取水稻叶片组织RNC的琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道M为DNA Marker，泳道1～3为利用本发明所列试剂方法提取得到的水稻叶片RNC。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明实施例涉及的主要材料如下：

-生长期60天的水稻叶片，在广州华南农业大学实验田中获得。

-A溶液：200mM、pH 8.0的Tris-HCl，50mM MgCl₂，400mM KCl，5mM二硫苏糖醇(DTT)，0.1mg/mL放线菌酮；配制时使用无菌无RNase的水和无菌器具，配制完毕后溶液需过滤除菌。

-分离用蔗糖溶液：蔗糖溶于上述A溶液，其中，蔗糖的终浓度为30％(w/v)，预冷至0～6℃。

-放线菌酮母液：浓度为10mg/mL。

-植物细胞裂解液：Triton X-100溶于上述A溶液中，Triton X-100的终浓度为体积百分比1％。

-动物细胞裂解液：20mM、pH 7.4的HEPES-KOH溶液、15mM MgCl₂、200mM KCl、100μg/mL放线菌酮，2mM二硫苏糖醇，体积百分比1％的Triton X-100，pH 7.4。配制时使用无菌无RNase的水和无菌器具，配制完毕后溶液需过滤除菌。

实施例1

(1)剪取自然生长60天的水稻叶片，用超纯水迅速清洗叶片，达到尽量去除表面无关杂质的目的。

(2)收集叶片组织，迅速放入液氮中速冻，至低温稳定。

(3)不断添加液氮，保持液氮温度下(-196℃)使用研钵迅速研磨组织至粉末。

(4)研磨完毕后加入植物细胞裂解液，继续研磨混匀，冰上放置20min裂解。

(5)将裂解好的组织样品置于预冷至0～4℃的离心机中以16200×g转速离心20min，用枪头小心吸取上清液至另一个EP管中，弃掉组织碎片。

(6)立刻继续进行蔗糖密度梯度离心及后续提取RNC的步骤，具体如下：

②上清液小心转移至事先准备好的在超速离心管中预冷的分离用蔗糖溶液表层。

②4℃、330000×g超速离心3小时。

③小心弃上清，将沉淀溶于适量A溶液或H₂O中，得到植物组织的RNC。

(7)使用RNA提取试剂(Invitrogen公司)，按其说明手册方法操作，从RNC中提取RNC-RNA。

(8)利用浓度为2％(w/v)的琼脂糖凝胶将提取出来的组织RNC-RNA进行电泳分离，SYBRGreen II染色，用紫外凝胶成像系统成像检测。

(9)使用NEBNext mRNA library construction kit for Illumina(New EnglandBiolabs公司)对组织RNC-RNA中的mRNA进行二代测序文库构建，Ion Torrent Proton测序仪进行二代测序，获得水稻叶片组织的翻译组测序信息(正在翻译的mRNA的定量信息)。

为检验本发明方法可以从植物组织中提出未降解的RNC-RNA，我们利用浓度为2％的琼脂糖凝胶将提取出来的叶片组织RNC-RNA进行电泳分离，SybrGreen II染色，用紫外凝胶成像系统成像检测。结果显示，本发明提取的组织RNC-RNA量多，带型清晰，无降解(图1)。

为检验本发明方法是否在样品间稳定，将上述获得的两个植物叶片组织测序结果进行RNC样品比较获得相关性及Pearson相关系数(图2)。由图2可知，两株水稻的叶片组织之间的基因翻译量的相关系数R²分别为0.82、0.83，符合预期。这说明本发明的方法在不同样品间较为稳定。

同一组织内因为有的基因翻译效率高，有的基因翻译效率低，RNC-mRNA(正在翻译的mRNA)与总mRNA的量应有不同(Wang et al.,2013)。为检验本发明所提取的组织中RNC-mRNA与总mRNA确实存在着差异，将叶片组织的RNC-mRNA二代测序定量结果和mRNA二代测序定量结果进行对比(图2)。结果显示，来自于两株水稻的2个叶片组织中RNC-mRNA与mRNA的Pearson相关系数分别为0.82、0.83，表明基因的翻译水平与转录水平并不完全相同，符合文献中的报道(Wang et al.,2013)。同时我们检测到植物组织中只有一部分mRNA可以被翻译，存在数千种不被翻译的mRNA，结果见表1，也符合文献中的报道(Wang et al.,2013)。这些结果说明应用本发明方法提取出的RNC-mRNA确实是正在翻译中的与核糖体结合的mRNA，并非总mRNA。

表1

组织名称	转录和翻译同时检测到的基因数	有检测到转录，但未检测到翻译的基因数
			叶片组织1	16922	2136
叶片组织2	15724	3887

实施例2

(2)收集叶片组织，迅速放入液氮中速冻，至低温稳定后放入-80℃超低温冰箱储存15天后进行提取。

(3)同实施例1步骤(3)。

(4)同实施例1步骤(4)。

(5)同实施例1步骤(5)。

(6)同实施例1步骤(6)。

(7)同实施例1步骤(7)。

(8)同实施例1步骤(8)，提取效果见图3中的泳道1-5.

从电泳结果可看出，所提取得到的RNC-RNA质量较好，可以用于后续实验，说明本方法可以有效的在液氮储存后的植物组织中提取RNC-RNA。

对比例1

利用动物细胞提取液提取植物组织RNC与小鼠肝脏RNC

(1)植物组织处理同实施例1步骤(1)。

(2)获取小鼠(六周龄BALB/C小鼠，南方医科大学实验动物中心)肝组织，将肝脏切碎，置于含100μg/mL放线菌酮及15mM MgCl₂的0～6℃、pH 7.0～7.2的DPBS(LifeTechnology)溶液中，清洗两遍。配制文献“Wang et al.,2013”中的所述试剂进行实验。

(3)植物组织和小鼠肝脏组织的冷冻处理、研磨处理、细胞裂解处理以及RNC、RNC-RNA的提取，同实施例1步骤(2～7)，区别仅在于细胞裂解液使用的是动物细胞裂解液。

(4)检测：使用2％琼脂糖凝胶电泳检测，SYBR Green II染料染色，紫外凝胶成像系统拍摄(图1)。图1显示的条带泳道5显示用动物细胞提取液提取植物组织的RNC，泳道6～7为动物细胞提取液提取的小鼠肝脏RNC。

从电泳结果可看出，使用与本发明中所用配方不同的动物细胞RNC提取溶液，由动物组织可以提取出质量较好的RNC，而植物组织会发生非常明显的降解，无法得到正常的RNC-RNA，因此无法进行后续测序实验。

对比例2

常温提取叶片组织中的RNC

(1)同实施例1步骤(1)。

(2)将室温(25℃)的植物细胞裂解液，加入剪碎的植物叶片组织中研磨。

(3)将研磨好的样品放于冰上20min。

(4)同实施例1步骤(5)。

(5)同实施例1步骤(6)。

(6)同实施例1步骤(7)。

(7)同实施例1步骤(8)，电泳条带为图4中的泳道1～3。

从电泳结果可看出，所提取得到的RNC-RNA带型有非常明显的弥散现象，看不到明显条带，说明样品发生了明显降解，无法用于后续实验。这说明如果不采用低温冷冻研磨的方法，植物RNC的提取不稳定。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种完整获取植物组织中核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）用水将新鲜的植物组织清洗干净，用液氮进行冷冻处理至植物组织的温度低于-80℃；

（2）将步骤（1）冷冻处理好的植物组织存储于不高于-80℃的环境，在该条件下，能进行稳定的储存、运输；

（3）从步骤（1）冷冻处理好的植物组织或是步骤（2）进行储存、运输的植物组织中提取核糖体新生肽链复合物时，步骤如下：

①在研钵内加液氮对植物组织进行研磨，得到粉末；

②保持在液氮环境下往粉末中加入预冷至0～6℃的细胞裂解液，继续研磨混匀；然后置于冰上等待完全融化，进行裂解反应；细胞裂解液的组成如下：190～210 mM、pH 7.8～8.2的Tris-HCl，45～55 mM MgCl₂，390～410 mM KCl，0.05～0.15 mg/mL 放线菌酮，4～6mM 二硫苏糖醇，体积百分比0.5～1.5 %的Triton X-100；

③离心，取上清进行核糖体新生肽链复合物的提取，得到植物组织中的核糖体新生肽链复合物。

2.根据权利要求1所述的完整获取植物组织中核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于：步骤（1）中所述新鲜的植物组织通过如下步骤得到：从植物体上分离植物组织，控制在5 min以内完成，得到新鲜的植物组织。

3.根据权利要求1所述的完整获取植物组织中核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的清洗的次数为1～2遍；

步骤（1）中所述的水为电导率不超过20 μS/cm的水；

步骤（1）中所述的冷冻处理为将植物组织完全浸入液氮中进行冷冻处理。

4.根据权利要求3所述的完整获取植物组织中核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于：所述的电导率不超过20 μS/cm的水为蒸馏水或超纯水。

5.根据权利要求1所述的完整获取植物组织中核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的新鲜的植物组织在用水清洗干净后、用液氮进行冷冻处理前还进行如下处理：去除新鲜的植物组织表面的水分。

6.根据权利要求5所述的完整获取植物组织中核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于：所述的去除新鲜的植物组织表面的水分通过使用洁净的滤纸实现。

7.根据权利要求1所述的完整获取植物组织中核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的不高于-80℃的环境为-196℃～-80℃的环境。

8.根据权利要求1所述的完整获取植物组织中核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于：

步骤（3）中所述的继续研磨的时间为1～5 min；

步骤（3）中所述的离心的条件为4℃、16200×g离心至少10 min；

步骤（3）中所述的核糖体新生肽链复合物的提取的方法为蔗糖密度梯度离心法。

9.根据权利要求1所述的完整获取植物组织中核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于：

步骤（3）中所述的细胞裂解液的组成如下：200 mM、pH 8.0的Tris-HCl，50 mM MgCl₂，400 mM KCl，0.1 mg/mL 放线菌酮，5 mM 二硫苏糖醇，体积百分比1 %的Triton X-100。

10.权利要求1～9任一项所述的完整获取植物组织中核糖体新生肽链复合物的方法在基因功能分析中的应用。