CN104262478A - 完整获取组织内核糖体新生肽链复合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种完整获取组织内核糖体新生肽链复合物的方法。该方法为：使用0～4℃的含翻译延伸抑制剂和镁离子的等渗盐溶液清洗新鲜的组织；将清洗干净的组织中的多余液体去除，然后用液氮进行快速冷冻处理，冷冻至组织的温度稳定；将快速冷冻处理好的组织置于不高于-80℃的环境下保存，在该条件下，能进行储存和运输；对保存的组织样品提取RNC，得到组织内核糖体新生肽链复合物。本发明能够进行组织内RNC长期储存和运输，有效地获取组织样品的RNC；而且突破了时间和空间的限制，为进一步研究RNC以及RNC的商业化服务提供了便利。
Description
技术领域
本发明属于生命科学技术领域，特别涉及一种完整获取组织内核糖体新生肽链复合物(Ribosome Nascent-chain Complex，RNC)的方法。
背景技术
翻译调控是生命体内的重要调控层次。在细胞中有的基因翻译多、有的基因翻译少，有的基因根本就不被翻译。因此对细胞中的翻译状况进行研究显得极为必要。细胞进行翻译时，核糖体结合在mRNA链上并移动，依据mRNA上的三联密码子信息来逐步合成蛋白质多肽链(称为新生肽链，nascent-chain)。这一复合物称为核糖体新生肽链复合物(Ribosome Nascent-chain Complex,RNC)。只有完整提取了RNC，才能对正在翻译的mRNA进行定性定量研究，因此，完整提取得到RNC对研究和应用都有重要的意义。对正在翻译的mRNA进行测定(翻译组测序)，可用正在翻译的mRNA的含量推算蛋白质的含量(Wang et al.Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariatemanner and their translation ratios are phenotype specific.Nucleic acids research 41,4743-4754,2013)，可计算翻译效率从而表征细胞的各种表型(Wang et al.,2013，文献前面已提过，此处略，下文中，只要是简写的，均为文献名称已在背景技术提及过)，可以发现未知蛋白(Zhang et al.How to discover newproteins-translatome profiling.Science China Life sciences 57,358-360，2014b)，对蛋白质组研究也有重要的指导意义(Chang et al.Systematic analyses of thetranscriptome,translatome,and proteome provide a global view and potentialstrategy for the C-HPP.Journal of proteome research 13,38-49，2014；Liu et al.Chromosome-8-coded proteome of Chinese Chromosome Proteome Data set(CCPD)2.0 with partial immunohistochemical verifications.Journal of proteome research 13,126-136,2014；Wang et al.Omics evidence:single nucleotide variants transmissionson chromosome 20 in liver cancer cell lines.Journal of proteome research 13,200-211,2014；Zhang et al.Systematic analysis of missing proteins provides clues tohelp define all of the protein-coding genes on human chromosome 1.Journal ofproteome research 13,114-125,2014a；Zhong et al.Resolving chromosome-centrichuman proteome with translating mRNA analysis:a strategic demonstration.Journalof proteome research 13,50-59，2014)，被列为人类蛋白质组计划的第四支柱(Zhong et al.，2014)。
能高效完整提取RNC的方法是利用蔗糖密度梯度离心法，此方法能完整提出RNC，定量保留核糖体上全长的mRNA和新生肽链以供其后的各种生化与分子生物学研究(Wang et al.,2013；Zhang et al.,2009)。然而此法只适用于新鲜细胞提取RNC。由于组织内部环境的复杂化，以及RNC本身非常脆弱，使组织样品内部的RNC的获取相对于新鲜细胞更加难以获取。从培养细胞提取RNC时，需要事先加入翻译延伸抑制剂(如氯霉素、放线菌酮等)将核糖体固定在核糖体上以保持当时细胞内的真实翻译状况，但组织块通常由多层相互连接的细胞所组成，翻译延伸抑制剂很难快速渗透进入组织块内部的细胞而固定核糖体。培养细胞可用Triton等去垢剂快速温和地破细胞膜而释放细胞内容物，而组织块由于细胞间连接紧密，Triton等去垢剂难以将组织块良好破碎，使得提取效率非常低。因此，组织样品的RNC提取过程无法沿用细胞提取RNC的策略。完整获取组织样品的RNC是一个实验室及商业服务面临的巨大挑战。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种完整获取组织内核糖体新生肽链复合物的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种完整获取组织内核糖体新生肽链复合物的方法，包括如下步骤：
(1)使用0～4℃的含翻译延伸抑制剂和镁离子的等渗盐溶液清洗新鲜的组织；翻译延伸抑制剂和镁离子的浓度以能有效抑制组织内细胞翻译延伸为基准；
(2)将清洗干净的组织中的多余液体去除，然后用液氮进行快速冷冻处理，冷冻至组织的温度稳定；
(3)将快速冷冻处理好的组织置于不高于-80℃的环境下保存，在该条件下，能进行储存和运输；
(4)对步骤(3)保存的组织提取RNC，得到组织内核糖体新生肽链复合物。
当组织块较大，如1mm3以上，步骤(1)优选为：将新鲜组织置于0～4℃的含翻译延伸抑制剂和镁离子的等渗盐溶液中剪碎；然后用0～4℃的含翻译延伸抑制剂和镁离子的等渗盐溶液清洗；剪碎清洗有利于去除大块组织间隙中的组织液，也有利于翻译延伸抑制剂和镁离子有效稳定抑制细胞翻译延伸；；翻译延伸抑制剂和镁离子的浓度以能有效抑制组织内细胞翻译延伸为基准；
步骤(1)中所述的翻译延伸抑制剂为放线菌酮；
所述的放线菌酮在所述的等渗盐溶液中的终浓度为0.3mg/ml或超过0.3mg/ml；
步骤(1)中所述的镁离子在所述的等渗盐溶液中的终浓度为50mM或超过50mM；
步骤(1)中所述的等渗盐溶液为DPBS溶液、PBS溶液或D-Hank’s溶液；
步骤(1)中所述的清洗的次数为1～2遍；
步骤(1)中所述的新鲜组织通过如下步骤得到：从生物体上提取组织，保证在30min以内完成，而且在提取过程中避免其他组织和杂质混入，尽量保证组织的单一性；
步骤(2)中所述的将清洗干净的组织中的多余液体去除为通过使用洁净的滤纸实现；
步骤(3)中所述的不高于-80℃的环境为-196℃～-80℃的环境，更优选为-80℃的环境；
步骤(4)中所述的对步骤(3)保存的组织提取RNC包含如下具体步骤：将组织置于液氮环境中，将其进行磨碎；研磨完毕后保持在液氮环境中加入预冷至0～4℃的细胞裂解液，继续研磨混匀；然后置于冰上等待完全融化，进行裂解反应；将裂解好的组织样品于2～6℃离心，取上清；使用蔗糖密度梯度离心法获取组织样品的RNC复合体；
所述的细胞裂解液为组成如下细胞裂解液的：20mM、pH7.4的HEPES-KOH溶液，15mM MgCl2，200mM KCl，100μg/ml放线菌酮，2mM二硫苏糖醇，体积百分比1％的Triton X-100，pH＝7.4；
所述的细胞裂解液配制时使用无菌无RNase的水和无菌器具，配制完毕后溶液需过滤除菌；
所述的继续研磨的时间为1～2min；
所述的离心的条件为4℃、16200×g离心至少20min；
所述的蔗糖密度梯度离心法可参考文献“Wang et al.Translating mRNAsstrongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios arephenotype specific.Nucleic acids research 41,4743-4754,2013”。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明提供的方法可有效地获取组织样品内完整的RNC。
(2)本发明提供的方法突破了时间和空间的限制，可将组织内RNC长期(可达一个月)储存和运输，为进一步研究RNC以及RNC的商业化服务提供了便利。
附图说明
图1是按实施例1方法提取小鼠六种组织RNC的琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道M为DNA Marker，泳道1为空白对照，泳道2为心，泳道3为肝，泳道4为肺，泳道5为肾，泳道6为精巢，泳道7为脑。
图2是小鼠各组织的翻译组测序的基因翻译量的两两比较；其中，散点图为两种组织的基因表达量对比图，位于对角线的直方图为该组织的基因表达量的分布图，数字为散点图对应的两种组织的基因表达量的Pearson相关系数R。
图3是小鼠各组织的翻译组测序与转录组测序定量比较图，每个子图的横轴为转录组定量[log10 mRNA(rpkM)]，纵轴为翻译组定量[log10 RNC-mRNA(rpkM)]。
图4是使用含不同浓度的放线菌酮及MgCl2的0～4℃、pH 7.0～7.2的DPBS溶液处理小鼠组织后得到的样品抽提RNC后的琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道一为样品一、泳道二为样品二、泳道三为样品三、泳道四为样品四、泳道五为样品五、泳道六为样品六。
图5是用不同方法提取小鼠组织RNC的琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道1为按对比例2的方法提取的卵巢RNC，泳道2和3分别为按对比例3的方法提取的肌肉组织RNC和肺组织RNC，泳道4和5分别为按对比例4的方法提取的肾组织RNC和脑组织RNC，泳道N1和N2分别为按实施例1的方法提取的肾、脾RNC。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明实施例涉及的主要材料如下：
-六周龄BALB/C小鼠购买自南方医科大学实验动物中心。
-DPBS溶液购自Life Technology。
-RB溶液：20mM、pH7.4的HEPES-KOH溶液、15mM MgCl2、200mM KCl、100μg/ml放线菌酮，2mM二硫苏糖醇，pH＝7.4。配制时使用无菌无RNase的水和无菌器具，配制完毕后溶液需过滤除菌。
-蔗糖溶液：30％(w/v)蔗糖溶于上述RB溶液，预冷至0～4℃。
-放线菌酮(广州捷倍斯公司)水溶液储液：浓度为100mg/ml。
-细胞裂解液：Triton X-100溶于上述RB溶液中，Triton X-100的终浓度为体积百分比1％。
实施例1
(1)使用颈部脱臼法杀死六周龄BALB/C小鼠，并用70％(w/v)酒精浸泡小鼠，达到消毒的目的。
(2)获取小鼠组织器官(获取肺、肝、骨骼肌、精巢、卵巢、脑、脾、肾、肾上腺、心脏、胸腺，共11种组织)，并分别置于含放线菌酮(终浓度为0.3mg/ml)及MgCl2(终浓度为50mM)的0～4℃、pH 7.0～7.2的DPBS溶液中，清洗两遍。对取出组织块体积较大的组织块(如肝、心脏、骨骼肌，估计体积大约大于1mm3)，浸泡在上述溶液中剪碎至每块组织小于1mm3，再用上述溶液清洗两遍。
(3)小心收集步骤(2)处理好的组织样品，并用滤纸吸干液体，将组织样品放入收集的EP管中，迅速放入液氮中保存。速冻后，可以将冻存的组织样品放入-80℃冰箱保存。
(4)在液氮中，保持液氮温度下(-196℃)使用研磨棒研磨组织样品。
(5)研磨完毕后加入细胞裂解液，继续研磨混匀，冰上放置20min。
(6)将裂解好的组织样品置于预冷至4℃的离心机中以16200×g转速离心20min，去除组织碎片，小心吸取上清。
(7)立刻继续进行蔗糖密度梯度离心及后续提取RNC的步骤。该步骤见文献“Wang et al.Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariatemanner and their translation ratios are phenotype specific.Nucleic acids research 41,4743-4754,2013”，具体如下：
①上清液小心转移至事先准备好的在超速离心管中2ml蔗糖溶液表层。
②4℃、330000×g超速离心3小时。
③弃上清，将沉淀溶于RB溶液中，得到各组织的RNC。
(8)使用RNA提取试剂(Invitrogen公司)，按其说明手册方法操作，从RNC中提取RNC-RNA。
(9)使用NEBNext mRNA library construction kit for Illumina(New EnglandBiolabs公司)对组织RNC-RNA中的mRNA进行测序建库，Illumina HiSeq-2500测序仪进行二代测序，获得组织细胞的翻译组测序信息(正在翻译的mRNA的定量信息)。
为检验本发明方法可以从组织中提出未降解的RNC-RNA，我们将部分小鼠组织的RNC-RNA用2％琼脂糖凝胶电泳进行分离，SybrGreen II染色，紫外凝胶成像系统成像检测(图1)。结果显示，本发明提取的组织RNC-RNA量多，带型清晰，无降解。
为检验本发明方法对组织RNC的定量提取效果，将上述获得的测序结果进行组织间的RNC样品进行比较获得相关性及Pearson相关系数(图2)。由于各组织内的基因翻译量理应各不相同，我们应看到各组织内的RNC-mRNA的量相关性各有高低。图2显示，绝大部分组织之间的基因翻译量的相关系数R在0.48～0.86之间，符合预期。这说明本发明的方法能反映各组织类型间的基因翻译状况的差异。
同一组织内的RNC-mRNA(正在翻译的mRNA)与总mRNA的量应有不同，因为有的基因翻译效率高，有的基因翻译效率低(Wang et al.,Nucleic acidsresearch 41,4743-4754,2013)。为检验本发明所提取的组织中RNC-mRNA(正在翻译的mRNA)与总mRNA确实存在着差异，将各组织的RNC-mRNA测序结果和mRNA测序结果对比(图3)。结果显示，各组织中RNC-mRNA与mRNA的定量相关系数为Pearson R＝0.5～0.97，表明基因的翻译与转录并不完全相同，这符合文献中的报道(Wang et al.,Nucleic acids research 41,4743-4754,2013)。而在测序结果中可以看到，各组织中都存在着数量不等的不被翻译的mRNA，结果见表1，也符合文献中的报道(在Wang et al.,Nucleic acids research 41,4743-4754,2013中有综述)。以上结果反映出RNC-mRNA与mRNA在定量上确实存在差异。这说明本发明所提取出的RNC-mRNA并非总mRNA，而确实是正在翻译中的mRNA。
表1
| 组织名称 | 转录和翻译同时检测到的基因数 | 有检测到转录，但未检测到翻译的基因数 |
| 肾上腺 | 12240 | 3649 |
| 肺 | 14245 | 474 |
| 肾 | 13625 | 1553 |
| 肝 | 13310 | 1155 |
| 精巢 | 14766 | 476 |
| 卵巢 | 12599 | 619 |
| 脾 | 11767 | 1053 |
| 心 | 13452 | 1376 |
| 肌 | 10442 | 2968 |
| 胸腺 | 12961 | 1740 |
| 脑 | 13286 | 2874 |
对比例1
提取肝脏组织的RNC
(1)同实施例1步骤(1)。
(2)获取小鼠组织器官后，将肝脏切成基本均等的六块，并分别置于含放线菌酮及MgCl2的0～4℃、pH 7.0～7.2的DPBS溶液中，清洗两遍。放线菌酮与MgCl2分别使用下表中浓度进行实验。其中样品六与实施例1的处理条件(即放线菌酮和Mg2+浓度)相同。
表2
| 样品名称 | 一 | 二 | 三 | 四 | 五 | 六 |
| 放线菌酮 | 0.1mg/ml | 0.2mg/ml | 0.1mg/ml | 0.2mg/ml | 0.3mg/ml | 0.3mg/ml |
| Mg2+ | 30mM | 50mM | 30mM | 50mM | 15mM | 50mM |
(3)同实施例1步骤(3)。
(4)同实施例1步骤(4)。
(5)同实施例1步骤(5)。
(6)同实施例1步骤(6)。
(7)同实施例1步骤(7)。
(8)同实施例1步骤(8)。
(9)检测：使用2％琼脂糖凝胶电泳检测，SYBR Green II染料染色，紫外凝胶成像系统拍摄。电泳条带为图4显示的条带。
从电泳结果可看出，使用比实施例1中所用浓度低的放线菌酮和/或MgCl2的离子浓度，均会发生降解，无法保证得到正常的RNC-mRNA，因此无法进行后续测序实验。
对比例2
提取卵巢组织的RNC
(1)同实施例1步骤(1)。
(2)同实施例1步骤(2)。
(3)同实施例1步骤(3)。
(4)同实施例1步骤(4)。
(5)同实施例1步骤(5)。
(6)将裂解好的组织样品置于预冷至4℃离心机中以16200×g离心10min。去除组织碎片，吸取上清。
(7)解冻及提取RNC，同实施例1步骤(7)～(8)。
(8)检测：使用2％琼脂糖凝胶电泳检测，SYBR Green II染料染色，紫外凝胶成像系统拍摄。电泳条带为图5中的泳道1。
从电泳结果可看出，所提取得到的RNC-RNA混有较多未知成分，且主带(rRNA)与本发明方法所提出的正常RNC-RNA(N1、N2泳道)相比，位置发生偏移。因此本对比例所提出的并非正常的RNC-RNA，不能用于后续实验。
对比例3
提取肌肉组织和肺组织中的RNC
(1)同实施例1步骤(1)。
(2)同实施例1步骤(2)。
(3)同实施例1步骤(3)。
(4)在0℃上低温研磨组织样品。
(5)同实施例1步骤(5)。
(6)同实施例1步骤(6)。
(7)解冻及提取RNC，同实施例1步骤(7)～(8)。
(8)检测：使用2％琼脂糖凝胶电泳检测，SYBR Green II染料染色，紫外凝胶成像系统拍摄。电泳条带为图5中的泳道2(肌肉组织)和泳道3(肺组织)。
从电泳结果可看出，所提取得到的RNC-RNA带型不清晰，有明显的弥散现象和拖尾现象，说明均有明显的降解，无法用于后续实验。这说明如果不采用超低温冷冻研磨的方法，RNC是不稳定的。
对比例4
提取肾组织和脑组织中的RNC
(1)同实施例1步骤(1)。
(2)获取小鼠的肾组织和脑组织，并分别置于含放线菌酮(终浓度为0.1mg/ml)及MgCl2(终浓度为15mM)的DPBS溶液中清洗两遍。
(3)同实施例1步骤(3)。
(4)同实施例1步骤(4)。
(5)同实施例1步骤(5)。
(6)同实施例1步骤(6)。
(7)解冻及提取RNC，同实施例1步骤(7)～(8)。
(8)检测：使用2％琼脂糖凝胶电泳检测，SYBR Green II染料染色，紫外凝胶成像系统拍摄。电泳条带为图5中的泳道4(肾组织)和泳道5(脑组织)。
从电泳结果可看出，所提取得到的RNC-RNA带型不清晰，有明显的弥散现象和拖尾现象，说明均有明显的降解，无法用于后续实验。这说明样品处理前期，低浓度的放线菌酮和MgCl2(按照提取培养细胞RNC的方法)无法起到足够的稳定作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种完整获取组织内核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)使用0～4℃的含翻译延伸抑制剂和镁离子的等渗盐溶液清洗新鲜的组织；翻译延伸抑制剂和镁离子的浓度以能有效抑制组织内细胞翻译延伸为基准；
(2)将清洗干净的组织中的多余液体去除，然后用液氮进行快速冷冻处理，冷冻至组织的温度稳定；
(3)将快速冷冻处理好的组织置于不高于-80℃的环境下保存，在该条件下，能进行储存和运输；
(4)对步骤(3)保存的组织提取RNC，得到组织内核糖体新生肽链复合物。
2.根据权利要求1所述完整获取组织内核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于：步骤(1)为：将新鲜组织置于0～4℃的含翻译延伸抑制剂和镁离子的等渗盐溶液中剪碎；然后用0～4℃的含翻译延伸抑制剂和镁离子的等渗盐溶液清洗；翻译延伸抑制剂和镁离子的浓度以能有效抑制组织内细胞翻译延伸为基准。
3.根据权利要求1或2所述完整获取组织内核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的翻译延伸抑制剂为放线菌酮。
4.根据权利要求3所述完整获取组织内核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于：所述的放线菌酮在所述的等渗盐溶液中的终浓度为0.3mg/ml或超过0.3mg/ml。
5.根据权利要求1或2所述完整获取组织内核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的镁离子在所述的等渗盐溶液中的终浓度为50mM或超过50mM。
6.根据权利要求1或2所述完整获取组织内核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的等渗盐溶液为DPBS溶液、PBS溶液或D-Hank’s溶液。
7.根据权利要求或21所述完整获取组织内核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的新鲜组织通过如下步骤得到：从生物体上提取组织，保证在30min以内完成，而且在提取过程中避免其他组织和杂质混入，尽量保证组织的单一性；
步骤(2)中所述的将清洗干净的组织中的多余液体去除为通过使用洁净的滤纸实现。
8.根据权利要求1或2所述完整获取组织内核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的不高于-80℃的环境为-196℃～-80℃的环境。
9.根据权利要求1或2所述完整获取组织内核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于：步骤(4)中所述的对步骤(3)保存的组织提取RNC包含如下具体步骤：将组织置于液氮环境中，将其进行磨碎；研磨完毕后保持在液氮环境中加入预冷至0～4℃的细胞裂解液，继续研磨混匀；然后置于冰上等待完全融化，进行裂解反应；将裂解好的组织样品于2～6℃离心，取上清；使用蔗糖密度梯度离心法获取组织样品的RNC复合体；
所述的细胞裂解液为组成如下细胞裂解液的：20mM、pH7.4的HEPES-KOH溶液，15mM MgCl2，200mM KCl，100μg/ml放线菌酮，2mM二硫苏糖醇，体积百分比1％的Triton X-100，pH＝7.4；
所述的细胞裂解液配制时使用无菌无RNase的水和无菌器具，配制完毕后溶液需过滤除菌。
10.根据权利要求1或2所述完整获取组织内核糖体新生肽链复合物的方法，其特征在于：所述的离心的条件为4℃、16200×g离心20min。
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