CN103540575A - 医药制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明描述制造在医药组合物中用作活性医药成分的寡腺苷酸合成酶(oligoadenylate synthetase,OAS)蛋白的方法。本发明描述一种制造方法,其产生大量用于医药组合物中的浓缩的高活性OAS蛋白来治疗包括病毒感染的多种疾病。本发明还描述监测和验证所述制造过程的方法。
Description
本申请是申请号为200780035985.X、申请日为2007年7月31日、发明名称为“医药制造方法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及制造用于治疗哺乳动物的病毒感染和癌症的医药组合物的方法。
背景技术
寡腺苷酸合成酶(OAS)蛋白是以催化腺苷的2’、5’寡聚物(2-5As)的能力为特征的干扰素诱导蛋白。OAS蛋白介导哺乳动物细胞的抗病毒活性和促细胞凋亡活性。我们先前已证明OAS基因家族成员的突变与人类群体的病毒感染抗性有关。我们已描述使用OAS基因和蛋白作为医药组合物的方法且进一步描述了具有改进的药物性质的OAS基因和蛋白的变异、经修饰和衍生形式。
霍凡尼斯恩(Hovanessian)等人,EMBO 6:1273-1280(1987)发现经干扰素处理的人类细胞含有多种对应于具有40(OAS1)、46(OAS1)、69(OAS2)和100(OAS3)kD的蛋白质的OAS同种型。玛丽(Marie)等人,生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)160:580-587(1989)产生对p69(69kD OAS2)具有高度特异性的多克隆抗体。通过用抗p69抗体筛选经干扰素处理的人类细胞表达文库,玛丽(Marie)和霍凡尼斯恩(Hovanessian),生物化学杂志(J.Biol.Chem.)267:9933-9939(1992)分离了部分OAS2 cDNA。其用所述部分cDNA筛选其它文库且回收编码两种OAS2同种型的cDNA。较小同种型是由3’非翻译区的长度不同的两种mRNA编码。
Northern印迹分析揭示,OAS2在人类细胞中是表达为四种干扰素诱导mRNA。预测的OAS2蛋白具有常见的683-氨基酸序列和不同的3’末端。根据活体外转录/翻译产物的SDS-PAGE,两种同种型具有69kD和71kD的分子质量。这两种同种型都展现活体外OAS活性。序列分析指示,OAS2含有两个由脯氨酸富集的推定连接区隔开的OAS1同源域。N-末端域和C-末端域与OAS1分别41%和53%一致。同样地,OAS3含有OAS1同源域的三个串联单元。
通过荧光原位杂交且通过包括在定位克隆内,霍夫纳尼安(Hovnanian)等人,基因组(Genomics)52:267-277(1998)确定OAS1、OAS2和OAS3基因与12q24.2上的130kb区团簇在一起。2-5As结合且激活核糖核酸酶L,而核糖核酸酶L降解病毒和细胞RNA,从而导致抑制细胞蛋白质合成和削弱病毒复制。
称为OASL的第四人类OAS基因与OAS1、OAS2和OAS3的不同之处在于OASL缺乏酶活性。OASL基因编码双域蛋白质,所述蛋白质包含与泛素的串联重复单元的同源164氨基酸C-末端域融合的OAS单元。(艾斯凯尔森(Eskildsen)等人,核酸研究(Nuc.Acids Res.)31:3166-3173,2003;卡库塔(Kakuta)等人,干扰素与细胞因子研究杂志(J.Interferon & Cytokine Res.)22:981-993,2002。)
本发明通过提供制造用于多种用途、包括用于医药组合物中的寡腺苷酸合成酶蛋白的方法来满足所属领域的需求。
发明内容
本发明涉及制造诸如哺乳动物或人类寡腺苷酸合成酶蛋白等寡腺苷酸合成酶蛋白的方法。
本发明进一步涉及测试许多所制造的OAS蛋白的比活性和抗病毒效价的方法。
本发明进一步涉及验证OAS蛋白制造过程的方法。
本发明进一步涉及药品、活性医药成分和医药组合物的制造。
本发明涉及在良好制造规范(Good Manufacturing Practices)指导下OAS蛋白的制造。在另一个实施例中,本发明涉及用于监测和验证在良好制造规范指导下OAS蛋白制造的分析方法。
本发明涉及编码OAS蛋白的核酸在制造过程中的用途。在另一个实施例中,制造过程是药物或活性医药成分制造过程。
在另一个实施例中,可使用OAS基因利用重组DNA技术来制造药品。在另一个实施例中,可在哺乳动物、昆虫、植物、细菌或真菌细胞或生物体中实现OAS多肽的表达。在另一个实施例中,T7噬菌体启动子驱动OAS基因的表达,且宿主大肠杆菌菌株表达T7噬菌体聚合酶。在另一个实施例中,通过改变培养温度、碳源,通过添加天然或合成糖或通过添加渗透调节物质(osmolyte)来实现重组OAS基因表达的诱导。
本发明涉及制造包括可溶和不可溶蛋白中间体的OAS蛋白的方法。本发明进一步涉及有利于不可溶或可溶OAS蛋白中间体的制造方法。本发明进一步涉及制造OAS蛋白的方法,所述方法包括形成包涵体。在一个实施例中,在大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)中形成包涵体。本发明进一步涉及利用一种或一种以上下列方法从重组宿主生物体分离含OAS蛋白的包涵体:均质化、离心、中空纤维过滤、膜过滤、切向流过滤和膨胀床吸附。在另一个实施例中,可利用含有一种或一种以上下列物质的溶液来洗涤含OAS蛋白的包涵体以增加纯度:螯合剂、清洁剂、缓冲剂、盐、离液剂等。
在另一个实施例中,利用一种或一种以上下列方法来细胞溶解重组宿主生物体:化学物质、清洁剂、酶和机械方法。在另一个实施例中,酶包括溶菌酶、脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶。
本发明涉及溶解和再折叠OAS蛋白的方法。在一个实施例中,通过利用离液剂、还原剂或两者来实现溶解和再折叠。在另一个实施例中,通过添加一种或一种以上下列溶液组分来增强溶解和再折叠:盐、缓冲剂、螯合剂、清洁剂、含胺试剂、氨基酸、多元醇、聚合物和螯合剂。在另一个实施例中,使用一种或一种以上下列方法来增强OAS蛋白的溶解和再折叠:改变温度、低温、改变pH值、高压、增加体积、稀释和超声处理。
本发明涉及稳定和溶解OAS蛋白的方法,所述方法包括使用一种或一种以上下列物质:离液剂、表面活性剂、还原剂、多元醇、聚合物、糖、环糊精、白蛋白、氨基酸等。本发明进一步涉及监测OAS蛋白的正确且完全再折叠的方法。在一个实施例中,通过监测再折叠的OAS蛋白的寡腺苷酸合成能力或比活性来测量再折叠效率。在另一个实施例中,利用诸如高效液相色谱(HPLC)和快速蛋白质液相色谱(FPLC)等色谱方法来测量再折叠。
本发明涉及从复杂生物基质捕获、分离或纯化OAS蛋白的方法。在一个实施例中,从哺乳动物或原核细胞或从包涵体中捕获、分离或纯化OAS蛋白。在另一个实施例中,从原核或真核生物体或组织中捕获、分离或纯化OAS蛋白。在另一个实施例中,通过利用阳离子交换色谱来实现捕获、分离或纯化。本发明不受所使用的阳离子交换树脂的类型限制。在另一个实施例中,通过利用诸如由脱氧核糖核酸或核糖核酸衍生的柱等亲和柱来介导最初的捕获、分离或纯化。在另一个实施例中,使用烟酰胺染料柱。在另一个实施例中,使用具有亲和和阳离子交换性质的肝素柱来捕获、分离和纯化OAS蛋白。在另一个实施例中,使用羧甲基(carboxymethyl,CM)阳离子交换树脂。
本发明涉及纯化或分离OAS蛋白的方法,所述方法包括使用疏水性相互作用色谱。本发明不受所使用的疏水性相互作用色谱介质的类型限制。在一个特定实施例中,使用苯基HP柱从污染蛋白质和从内毒素或脂多糖中纯化OAS蛋白。
本发明涉及纯化或分离OAS蛋白的方法,所述方法包括使用反相HPLC或FPLC。本发明不受所使用的反相HPLC或FPLC的特定方法限制。
本发明涉及使用色谱方法从OAS蛋白的酶促非活性形式分离酶促活性形式。
本发明涉及纯化或分离OAS蛋白的方法,所述方法包括使用阴离子交换色谱。本发明不受用作阴离子交换剂的介质的类型限制。在一个特定实施例中,使用二乙基氨基乙基(diethylaminoethyl,DEAE)琼脂糖进行OAS蛋白纯化。本发明涉及使用阴离子交换色谱从污染蛋白质、内毒素、脂多糖、核酸和致热原纯化OAS蛋白。本发明也涉及使用不同于传统柱色谱的阴离子交换膜和阴离子交换柱体。本发明不受所使用的阴离子交换膜、树脂或柱体的类型限制。
本发明涉及通过利用亲和色谱从复杂生物基质纯化OAS蛋白。在一个实施例中,使用镍衍生的色谱柱。在另一个实例中,使用脱氧核糖核酸和核糖核酸柱。在另一个实例中,表达OAS蛋白的转基因含有亲和标签,以致表达在单一多肽中同时含有亲和标签和OAS蛋白的融合蛋白。本发明不受(如果有)所使用的亲和标签的类型和纯化所使用的亲和介质的类型限制。
本发明涉及使用阳离子交换色谱、肝素柱色谱、切向流过滤、阴离子交换色谱、超滤、透滤、疏水性相互作用色谱、凝胶过滤或亲和色谱来进行纯化、缓冲液交换和浓缩含有OAS蛋白的溶液。本发明进一步涉及使用这些方法的组合来进行缓冲液交换和OAS蛋白浓缩。
附图说明
图1是OAS制造过程的综述。如此图中所述,OAS蛋白的制造过程可分为9个个别步骤。
图2是如图1中所述的制造过程的步骤4-8期间由FPLC产生的若干色谱图的实例。
图3是制造过程期间所产生的样品的SDS-PAGE凝胶色谱分析的实例,其绘示OAS蛋白的纯度随着制造步骤的完成和将产物纯化到均质而增加。
图4和表1是利用说明书中所述的放射性酶测定对过程中制造的样品和纯化蛋白质进行的OAS酶活性测定(为测量比活性)的结果的实例。
图5证明不同缓冲条件、还原剂、pH值、时间和温度对所制造的OAS蛋白的再折叠效率和随后的比活性的影响。
图6绘示NAD-dATP测定的例示性HPLC色谱图,证明通过根据本说明书的方法纯化的OAS蛋白由NAD和dATP产生NAD-AMP。
图7绘示评定经由本说明书中所述的方法纯化的OAS蛋白的抗病毒效价后所获得的典型结果。
图8是适用于实施本发明的例示性模式的多核苷酸序列的清单(SEQ ID NO:1-8)。
图9是以实施本发明的例示性模式所产生的多肽序列的清单(SEQ ID NO:9-16)。
具体实施方式
引言和定义
我们已证明OAS基因的突变赋予病毒感染抗性。(2003年10月23日申请的美国专利申请案第60/513,888号;2004年2月6日申请的第60/542,373号;2004年3用19日申请的第60/554,758号;2004年4月8日申请的第60/560,524号;2004年6月8日申请的第60/578,323号;2004年8月26日申请的第60/605,243号;2004年10月22日申请的第10/972,135号;2005年5月4日申请的第60/677,680号;和2004年8月23日申请的第60/710,704号,其都以引用的方式并入本文中。)我们已克隆出OAS1、OAS2和OAS3基因的若干新颖形式,且我们已研发出源自这些形式和其它新颖的寡腺苷酸合成酶蛋白形式的医药组合物(2005年12月21日申请的专利申请案第60/752,668号,且其以引用的方式并入本文中)。我们已证明这些医药组合物具有活体外抗病毒性。我们已进一步证明这些医药组合物促进某些细胞系中的细胞生长。我们已进一步证明这些医药组合物具有促有丝分裂作用。我们已进一步证明这些医药组合物具有进入细胞并在细胞内保存中若干天或更长时间保留酶促活性的能力。我们已进一步证明这些医药组合物具有广泛的抗病毒活性。我们已进一步证明这些医药组合物可经聚乙二醇衍生并保留其酶促活性。我们已证明医药组合物的稳定性视还原剂和稳定剂的存在而定。我们已证明利用重组DNA技术通过在大肠杆菌中表达可制造大量医药组合物。我们已进一步证明这些所制造的医药组合物可投与哺乳动物并且不产生可观察到的有毒作用。我们已进一步证明这些所制造的医药组合物在通过注射投与哺乳动物时具有良好的生物分布和药物动力学性质。
本发明描述制造用作治疗哺乳动物疾病的活性医药成分的寡腺苷酸合成酶蛋白的方法。本发明涉及用于治疗病毒感染、炎症和肿瘤性疾病且促进哺乳动物的细胞生长和再生的OAS蛋白和多肽的制造和使用。
关于具体实施方式,使用下列定义:
A:腺嘌呤;C:胞嘧啶;G:鸟嘌呤;T:胸苷嘧啶(DNA中);和U:尿嘧啶(RNA中)。
等位基因:特定基因的DNA序列的变异体。在二倍体细胞中,最多将出现两个等位基因,其各自在染色体组的同源染色体上的相同相对位置或基因座处。当任一个基因座处的等位基因相同时,认为个体对这个基因座来说是纯合型,且当其不同时,认为个体对于这个基因座来说是杂合型。因为任一个基因的不同等位基因可因仅单个碱基而不同,所以任一个基因的等位基因的可能的数目都非常庞大。当等位基因不同时,一个相对另一个来说通常是显性的,而认为所述另一个是隐性的。显性是表型的性质且并不意谓显性等位基因使隐性等位基因失活。在许多实例中,正常起作用的(野生型)等位基因相对或多或少功能不全的所有突变等位基因来说是显性的。在这些情况下,一般解释是两个等位基因中的一个功能性等位基因足以产生足够的活性基因产物来支持生物体的正常发育(即,基因产物的量通常存在两倍安全限度)。
单倍型:许多可能的多个等位基因中的一个,通过染色体定位连续排序且代表那组由染色体组的一个特定同源染色体所携带的等位基因。
核苷酸:由糖部分(戊糖)、磷酸盐和含氮杂环碱基组成的DNA或RNA的单体单元。碱基经由糖苷碳(戊糖的1′碳)与糖部分连接,且碱基和糖的组合为核苷。当核苷含有键结到戊糖的3’或5’位置的磷酸基时,将其称为核苷酸。可操作性连接的核苷酸的序列在本文中通常称为“碱基序列”或“核苷酸序列”和其语法等价用语,且所述序列在本文中由从左到右的定向为5′-末端到3′-末端的常规定向的式子表示。
碱基对(Base Pair,bp):双链DNA分子中腺嘌呤(A)与胸苷嘧啶(T)的配对,或胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的配对。在RNA中,由尿嘧啶(U)取代胸苷嘧啶。当本文中提及RNA时,符号T可与U互换使用来表示RNA分子中特定位置处的尿嘧啶。
核酸:单链或双链核苷酸的聚合物。
多核苷酸:单链或双链核苷酸的聚合物。如本文中所使用,“多核苷酸”和其语法等价用语将包括所有核酸。多核苷酸通常将是指包含两个或两个以上脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的线性链的核酸分子。如所属领域所熟知,确切大小将视许多因素而定,这些因素又视所使用的最终条件而定。本发明的多核苷酸包括引物、探针、RNA/DNA区段、寡核苷酸或“寡聚物”(相对较短的多核苷酸)、基因、载体、质粒等。
基因:核苷酸序列编码RNA或多肽的核酸。基因可为RNA或DNA。
双链DNA:包含两条实质上互补的多核苷酸链的双链核酸分子,所述链通过一个或一个以上位于所述双链体的碱基对中所存在的各互补碱基之间的氢键结合在一起。因为形成碱基对的核苷酸可为核糖核苷酸碱基或脱氧核糖核苷酸碱基,所以短语“双链DNA”是指包含两条DNA链(ds DNA)的DNA-DNA双链体或包含一条DNA链和一条RNA链的RNA-DNA双链体。
互补碱基:当DNA或RNA采用双链构型时通常配对的核苷酸。
互补核苷酸序列:单链DNA或RNA分子中的核苷酸序列,其与另一单链上的核苷酸序列充足互补从而以所得氢键与其特异性杂交。
保守:如果核苷酸序列非随机地与预选序列的确切补体杂交,那么所述核苷酸序列相对于预选(参考)序列来说是保守的。
杂交:通过在互补碱基对之间建立氢键来形成双链体或异源双链体的实质上互补的核苷酸序列(核酸链)的配对。这是两个互补多核苷酸之间的可受到竞争性抑制的特异性(即,非随机)相互作用。
核苷酸类似物:结构上与A、T、G、C或U不同但与核酸分子中的正常核苷酸的取代物充分类似的嘌呤或嘧啶核苷酸。
DNA同系物:具有预选的保守核苷酸序列和编码能够结合预选的配位体的受体的序列的核酸。
上游:与DNA转录的方向相反的方向,且因此在非编码链上从5′到3′或在mRNA上从3′到5′。
下游:进一步沿着DNA序列的序列转录或读出方向,也就是沿DNA的非编码链在3′-5′方向上行进或沿RNA转录物在5′-3′方向上行进。
终止密码子:不编码氨基酸而是引起蛋白质合成终止的任何三个密码子。其为UAG、UAA和UGA且也称为无义密码子或终止密码子。
阅读框架:翻译中所使用的邻接核苷酸三联体(密码子)的特定序列。阅读框架视翻译起始密码子的位置而定。
内含子:也称为介入序列,是最初复制到RNA中但从最终RNA转录物中切除的DNA非编码序列。
蛋白质或多肽:术语“蛋白质”或“多肽”是指氨基酸的聚合物且不指产物的特定长度。肽、寡肽、多肽、蛋白质和聚合蛋白质以及这些物质的片段都包括在这一定义内。该术语可包括蛋白质的表达后修饰,例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。例如,含有氨基酸的一个或一个以上类似物(例如包括非天然氨基酸等)的蛋白质、具有经取代键的蛋白质以及所属领域中已知的天然存在和非天然存在的其它修饰包括在这一定义内。
“变异体”是包含一个或一个以上氨基酸位置与亲本多肽序列有所不同的序列的多肽。
术语“亲本多肽”打算指欲根据本发明修饰的多肽序列。
“片段”或“子序列”是整个序列的任何部分,至多(但不包括)整个序列。因此,片段或子序列是指包含较长氨基酸序列(例如,多肽)或核酸(例如,多核苷酸)的一部分的氨基酸序列或核酸。
当多肽、核酸或其它组分部分或完全地与其通常缔合的组分(其它肽、多肽、蛋白质(包括复合物,例如可随附天然序列的聚合酶和核糖体)、核酸、细胞、合成试剂、细胞污染物、细胞组分等)分开时,例如在其最初起源的细胞中与其通常缔合的其它组分分开时,其为“分离”的。当多肽、核酸或其它组分部分或完全地从其自然环境的其它组分回收或与所述其它组分分开以致其为组分的组合物、混合物或集合中存在的主要物质(即,以摩尔浓度计,其比组合物中的任何其它个别物质都丰富)时,其是分离的。在一些情况下,制剂是由超过约60%、70%或75%,通常超过约80%或优选超过约90%的分离物质组成。
“实质上纯”或“分离”的核酸(例如,RNA或DNA)、多肽、蛋白质或组合物的意思还是目标物质(例如,核酸或多肽)占所存在的所有大分子物质的至少约50重量%、60重量%或70重量%(以摩尔浓度计)。实质上纯或分离的组合物还可占组合物中所存在的所有大分子物质的至少约80重量%、90重量%或95重量%。分离的目标物质还可被纯化到必需的均质性(通过常规检测方法在组合物中不能检测到污染物质),其中组合物基本上由单一的大分子物质的衍生物组成。术语“纯化”通常表示核酸、多肽或蛋白质在电泳凝胶中基本上产生一个带。其意思通常是核酸、多肽或蛋白质为至少约50%纯、60%纯、70%纯、75%纯,更优选至少约85%纯,且最优选至少约99%纯。
术语“分离的核酸”可指不与在产生本发明的核酸的生物体的天然存在基因组中直接邻接的两个编码序列(即,5′端处的编码序列和3′端处的编码序列)直接邻接的核酸(例如,DNA或RNA)。因此,这一术语例如包括通过聚合酶链反应(PCR)或限制性核酸内切酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段,而不管所述cDNA或基因组DNA片段是否并入载体中,是否整合到与生物体(例如,包括其最初起源的病毒)相同或不同的物种的基因组中,是否与另一编码序列连接形成编码嵌合多肽的杂合基因,或是否与任何其它DNA序列无关。DNA可为双链或单链,有义或反义的。
“重组多核苷酸”或“重组多肽”为分别可包括来自超过一种核酸或多肽来源的核酸或氨基酸序列的非天然存在多核苷酸或多肽,所述核酸或多肽来源可为天然存在核酸或多肽或可自身已经受诱变或其它修饰类型。当核酸或多肽为合成的或人工的或经工程改造或源自合成或人工或经工程改造的多肽或核酸时,可认为其是“重组”的。重组核酸(例如,DNA或RNA)可通过组合(例如,人工组合)序列的至少两个通常不包括在一起、通常彼此不缔合或相反通常彼此分开的区段来制备。重组核酸可包含通过将来自不同来源的核酸区段连接在一起或组合所形成和/或人工合成的核酸分子。“重组多肽”通常是指由克隆或重组核酸产生的多肽。产生不同核酸或氨基酸序列的多核苷酸或多肽来源有时是同源的(即,具有相同或类似结构和/或功能,或编码编码相同或类似结构和/或功能的多肽)且通常来自例如生物体的不同分离物、血清型、菌株、物质或来自不同疾病状态。
当例如参考细胞、多核苷酸、载体、蛋白质或多肽使用术语“重组”时,所述术语通常指示已通过引入异源(或外来)核酸或改变天然核酸来修饰细胞、多核苷酸或载体,或已通过引入异源氨基酸来修饰蛋白质或多肽,或细胞是源自所修饰的细胞。重组细胞表达细胞的天然(非重组)形式中未见的核酸序列,或表达另外将异常表达、表达不足或根本不表达的天然核酸序列。当参考细胞使用术语“重组”时,所述术语指示细胞复制异源核酸或表达由异源核酸编码的多肽。重组细胞可含有细胞的天然(非重组)形式中未见的编码序列。重组细胞也可含有细胞的天然形式中可见的编码序列,其中通过人工手段修饰所述编码序列或将其再引入到细胞中。所述术语还涵盖含有在不移出核酸的情况下经修饰的细胞的内源性核酸的细胞,所述修饰包括通过基因置换、位点特异性突变、重组和相关技术获得的修饰。
术语“重组产生”是指通常通过化学合成手段、核酸区段的递归序列重组或核苷酸的其它多样性产生方法(诸如改组)实现的人工组合,或例如通过所属领域的一般技术人员已知的遗传工程改造技术实现的对分离的核酸区段的操纵。“重组表达”通常是指活体外产生重组核酸和活体内、活体外或离体将重组核酸转移到其可表达或繁殖的细胞中的的技术。
“免疫原”是指能够引起免疫反应的物质且例如包括抗原、在诱发自体免疫疾病中起作用的自身抗原和在癌细胞上表达的肿瘤相关抗原。免疫反应一般是指对诸如抗原或其片段等药剂或编码所述药剂的核酸起细胞或抗体介导的反应。在一些情况下,所述反应包含产生特异性针对表达所关注的抗原的抗原提呈细胞的CTL、B细胞或各类T细胞中的至少一种或其组合。
“抗原”是指能够引起宿主中抗体的形成或产生一组与所述抗原反应的特异性淋巴细胞的物质。抗原通常是对宿主来说为外来的大分子(例如,蛋白质和多糖)。
“佐剂”是指增强抗原的免疫刺激性质或药物的药理学作用的物质。佐剂可非特异性地增强对抗原的免疫反应。例如,“弗氏完全佐剂(Freund′s Complete Adjuvant)”是含有免疫原、乳化剂和分枝杆菌(mycobacteria)的油和水的乳液。另一个实例“弗氏不完全佐剂(Freund′s incomplete adjuvant)”除不含分枝杆菌外与弗氏完全佐剂相同。
“载体”是有利于通过所选择的核酸进行细胞转导或转染或有利于在细胞中表达核酸的组分或组合物。例如,载体包括质粒、粘粒(cosmid)、病毒、YAC、细菌、聚赖氨酸等。“表达载体”是由允许特定核酸在宿主细胞中转录的一系列特异性核酸元件重组或合成产生的核酸构筑体或序列。表达载体可为质粒、病毒或核酸片段的一部分。表达载体通常包括欲转录以与启动子可操作性连接的核酸。欲转录的核酸通常在启动子的引导和控制下。
如本文中所使用的术语“个体”包括(但不限于)生物体;哺乳动物,例如包括人类、非人类灵长类动物(例如狒狒、猩猩、猴)、小鼠、猪、母牛、山羊、猫、兔子、大鼠、天竺鼠、仓鼠、马、猴、绵羊或其它非人类哺乳动物;非哺乳动物,例如包括诸如禽类(例如鸡或鸭)或鱼类等非哺乳动物脊椎动物和非哺乳动物无脊椎动物。
术语“医药组合物”意思是适于在包括动物或人类的个体中用于医药用途的组合物。医药组合物通常包含有效量的活性剂“活性医药成分”和载剂(例如包括医药学上可接受的载剂)。
术语“有效量”意思是足以产生期望结果的剂量或量。期望结果可包含剂量或量的接受者的客观或主观改进。
“预防性治疗”是向未显示疾病、病理或医学病症的病征或症状或仅显示疾病、病理或病症的早期病征或症状的个体投与的治疗,以致为了减弱、预防或降低发展疾病、病理或医学病症的风险而投与治疗。预防性治疗充当针对疾病或病症的预防治疗。“预防性活性”是在向未显示病理、疾病或病症的病征或症状或仅显示病理、疾病或病症的早期病征或症状的个体投与时减弱、预防或降低个体发展病理、疾病或病症的风险的诸如核酸、载体、基因、多肽、蛋白质、物质或其组合物等药剂的活性。“预防上适用”的药剂或化合物(例如核酸或多肽)是指适用于减弱、预防、治疗或降低病理、疾病或病症的发展的药剂或化合物。
“治疗性治疗”是向显示病理、疾病或病症的症状或病征的个体投与的治疗,其中为了减弱或消除病理、疾病或病症的所述病征或症状而向个体投与治疗。“治疗活性”是在向患有病理、疾病或病症的病征或症状的个体投与时消除或减弱所述病征或症状的诸如核酸、载体、基因、多肽、蛋白质、物质或其组合物等药剂的活性。“治疗上适用”的药剂或化合物(例如核酸或多肽)指示适用于减弱、治疗或消除病理、疾病或病症的所述病征或症状的药剂或化合物。
“还原剂”意思是维持硫氢基处于还原状态且还原二硫化物分子内或分子间键的化合物。还原剂包括谷胱甘肽、二硫赤藓糖醇、二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)或2-巯基乙醇。
“透析”或“超滤/透滤”是指将一种缓冲液(例如溶解溶液和/或纯化缓冲液)换成不同的缓冲液(例如调配溶液)以使溶解蛋白质和/或最终纯化产物稳定的标准方法。超滤/透滤可用于缓冲液交换和浓缩蛋白质。
“包涵体”(或折光体(refractile body))意思是通常通过发酵期间异源基因的高表达水平在某些微生物的细胞内产生的致密、不可溶(即,不容易溶解)的蛋白质聚集体(即,凝块)。在一些情况下使用术语折光体,因为当光穿过其时,其较高的密度(高于微生物的体重的其余部分)引起光折射(弯曲)。光的这一弯曲引起折光体周围出现极亮区和极暗区,从而使其在显微镜下可见。
术语“折光体”和“包涵体”涵盖重组宿主生物体内所产生的不可溶的细胞质聚集体,其中聚集体至少部分含有待回收的异源蛋白质。
“破坏”或“细胞溶解”宿主生物体(细胞)意思是破坏细菌细胞以分离包涵体或重组多肽或蛋白质的过程。
“细胞溶解物”意思是由于本发明方法破坏宿主生物体所产生的残基。细胞溶解物通常是由尤其通过破坏细胞表面膜所实现的细胞溶解(cytolysis)(细胞的溶解)产生。在一些实施例中,溶菌酶通过溶解细菌的细胞壁的多糖组分来细胞溶解某些种类的细菌。当所述细胞壁受到削弱时,细菌细胞然后因为渗透压(所述细菌细胞内部)大于受削弱的细胞壁可含有的渗透压而破裂。在一个特定实施例中,通过用溶菌酶消化来细胞溶解细胞,或通过用特氟隆(Teflon)均质器进行细胞分散、接着离心的三次循环来破坏细胞。在另一个实施例中,通过在加压均质器(例如,Gaulin)或微流化床(microfluidizer)中穿过若干次来破坏细胞。也使用超声处理。可对培养基中纯化或未纯化的细胞进行细胞溶解。
“离液剂”是指以合适浓度存在于水溶液中时能够通过表面变化来改变蛋白质的立体构型或构象,从而使蛋白质经分离、可溶于水性介质但无生物活性的化合物。
“还原剂”是在氧化还原反应中充当电子供体的化合物。例示性还原剂包括:盐酸2-巯基乙胺、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、爱尔曼试剂(Ellman′s reagent)、盐酸三-(2-羧乙基)-膦、半胱氨酸等。
“螯合剂”是能够与一个或一个以上金属离子形成配位键的化合物。
“稳定性化合物”意思是诸如糖、表面活性剂(诸如聚山梨醇酯-10、聚山梨醇酯-80和PEG)、多元醇、螯合剂、氨基酸和聚合物等化合物,其组合将增加蛋白质的溶解性和生物活性。蛋白质的结构受pH值强烈影响。因此,在存在含有少量OH-或H+离子和稳定剂的溶液的情况下,发生侧链的电离作用且发生溶解。离子在非缓冲水溶液中的浓度较低时,包涵体中的缠结蛋白质的展开会释放单体蛋白质。含有诸如糖和多元醇(polyol,polyhydric alcohol)等渗透稳定剂的水溶液提供蛋白质稳定性,且因此维持蛋白质的溶解性和生物活性。由糖产生的蛋白质结构的所述稳定性是因为蛋白质与溶剂组分的优先相互作用。稳定性化合物的主要作用是作用于水的粘度和表面张力。这些化合物中有一些包括糖、多元醇、多糖、中性聚合物、氨基酸(甘氨酸和丙氨酸)和衍生物以及大偶极分子(即,三甲胺N-氧化物)。诸如甘露糖醇和乳糖等糖维持蛋白质稳定性。蛋白质优选在存在糖的情况下水合。通过添加乳糖来诱导蛋白质的化学势存在阳性变化,且因此使蛋白质稳定。也使用诸如甘露糖醇和甘油等多元醇作为蛋白质稳定剂。甘露糖醇诱导水分子中的结构且通过与水竞争使蛋白质稳定。认为这是因为疏水基对之间的疏水性相互作用在甘露糖醇溶液中比在纯水中强。在不受任何特定理论限制的情况下,认为甘露糖醇(和诸如甘油、山梨醇、阿拉伯糖醇和木糖醇等其它多元醇)置换水,从而使作为使蛋白质的三维结构稳定的主要因素的疏水性相互作用稳定。甘油使蛋白质在溶液中稳定,很可能是因为其进入并强化水晶格结构的能力。认为通过辅助优先的水合作用来阻止沉淀物形成且这使得蛋白质的天然结构最终稳定。山梨醇很可能竞争蛋白质的水合水,从而使蛋白质稳定以免变性,且诸如L-精氨酸、牛磺酸(taurine)、肌氨酸、甘氨酸和丝氨酸等氨基酸很可能增加水的表面张力,从而使蛋白质稳定并抑制聚集作用。
“启动子”是引导结构基因转录的核苷酸序列。启动子通常位于基因的5′非编码区,邻近结构基因的转录起始位点。启动子内作用为起始转录的序列元件通常以一致核苷酸序列为特征。例如,这些启动子包括(但不限于)IPTG诱导性启动子、噬菌体T7启动子和噬菌体λpL。参见山姆布鲁克(Sambrook)等人,分子克隆:实验室手册(MolecularCloning:A Laboratory Manual),第3版,冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press),冷泉港(Cold Spring Harbor),纽约(N.Y.),2001。典型的启动子将具有三个组件,所述组件由-35和-10处的一致序列以及其间具有16-19个核苷酸的序列组成(李斯特·S(Lisset,S.)和玛格丽特·H(Margalit,H.),核酸研究(Nucleic AcidsRes.)21:1512,1993)。这类启动子包括lac、trp、trp-lac(tac)和trp-lac(trc)启动子。如果启动子是诱导性启动子,那么转录的速率响应诱导剂而增加。相反,如果启动子是组成性启动子,那么转录速率不受诱导剂调控。也已知可抑制性启动子。
“核心启动子”含有对启动子功能(包括起始转录)来说必需的核苷酸序列。根据这个定义,核心启动子在不存在可增强活性或赋予组织比活性的特异性序列的情况下可具有或可不具有可检测的活性。
“调控元件”是调节核心启动子活性的核苷酸序列。举例来说,真核生物调控元件可含有与使得仅在或优先在特定细胞、组织或细胞器中转录的细胞因子结合的核苷酸序列。这些类型的调控元件通常与以“细胞特异性”、“组织特异性”或“细胞器特异性”方式表达的基因相关。细菌启动子具有结合核心启动子并调节其活性的调控元件,诸如结合激活或抑制分子的操纵序列。
“克隆载体”是具有自动在宿主细胞中复制的能力的核酸分子,诸如质粒、粘粒或噬菌体。克隆载体通常含有一个或少量允许以可测定的方式插入核酸分子而不损失载体的必需生物功能的限制性核酸内切酶识别位点,以及编码适用于鉴别和选择经克隆载体转化的细胞的标记基因的核苷酸序列。标记基因通常包括提供抗生素抗性的基因。
“表达载体”是编码在宿主细胞中表达的基因的核酸分子。表达载体通常包含转录启动子、基因、复制起点、可选择标记和转录终止子。基因表达通常处于启动子的控制下,且认为所述基因与启动子“可操作性连接”。类似地,如果调控元件调节核心启动子的活性,那么调控元件与核心启动子可操作性连接。表达载体也可称为表达构筑体。
术语“表达”是指基因产物的生物合成。举例来说,在结构基因的情况下,表达包括将结构基因转录到mRNA中且将mRNA翻译成一种或一种以上多肽。
术语“分泌信号序列”表示编码作为较大多肽的组件的引导较大多肽穿过合成所述多肽的细胞的分泌途径的肽(“分泌肽”)的DNA序列。通常裂解较大多肽以在转运穿过分泌途径期间去除分泌肽。
术语“氨基末端”或“N-末端”和“羧基末端”或“C-末端”在本文中用于表示多肽内的位置。如果上下文允许,那么参考多肽的特定序列或部分使用这些术语来表示邻近或相对位置。举例来说,多肽内位于参考序列的羧基末端的某一序列是位于参考序列的羧基末端,但不一定位于完全多肽的羧基末端。
“融合蛋白”是由包含具有至少两个基因的核苷酸序列的核酸分子表达的杂交蛋白。
术语“亲和标签”在本文中用于表示可与第二种多肽连接以提供第二种多肽的纯化或检测或提供使第二种多肽与底物连接的位点的多肽区段。原则上,可将可使用抗体或其它特异性结合药剂的任何肽或蛋白质用作亲和标签。亲和标签包括聚组氨酸段(poly-histidine tract)、蛋白质A(尼尔森(Nilsson)等人,EMBO J.4:1075(1985);尼尔森(Nilsson)等人,酶学方法(Methods Enzymol.)198:3(1991))、谷胱甘肽S转移酶(史密斯(Smith)和约翰逊(Johnson),基因(Gene)67:31(1988))、Glu-Glu亲和标签(格鲁森梅尔(Grussenmeyer)等人,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82:7952(1985))、P物质、FLAG肽(霍普(Hopp)等人,生物技术(Biotechnology)6:1204(1988))、抗生蛋白链菌素结合肽或其它抗原表位或结合域。通常参见福特(Ford)等人,蛋白质表达和纯化(Protein Expression and Purification)2:95(1991)。编码亲和标签的DNA分子可从供应商(例如安发玛西亚生物技术公司(Pharmacia Biotech),皮斯卡塔市(Piscataway),新泽西州(N.J))购得。
如本发明中关于产生活性医药成分所使用,术语“OAS蛋白”、“OAS多肽”和“由OAS核苷酸表达的多肽”意思是与已知寡腺苷酸合成酶多肽具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%同源性的任何多肽,包括(但不限于)SEQ ID NO:9-16,而不管所述多肽是否具有寡腺苷酸合成酶活性。
如本发明中关于OAS蛋白或多肽所使用,术语“制造”意思是在各种条件下产生毫克或克数量的适用作医药组合物中的活性成分(即,活性医药成分)或活性剂的期望蛋白质或多肽的过程。
实施本发明的模式
2′,5′-寡腺苷酸合成酶(OAS)是由ATP合成短的2′-5′连接的寡腺苷酸(2-5A)分子的IFN-α诱导性RNA依赖型效应器酶的家族。2-5A分子结合并激活RNAseL酶,所述酶在激活后会降解病毒和细胞RNA且阻断细胞蛋白质合成。OAS酶构成针对病毒感染的非特异性免疫防御的重要部分且已用作病毒感染的细胞标记。除本文中所论述的在丙型肝炎感染中的作用外,OAS活性还涉及其它疾病状态,尤其病毒感染发挥作用的疾病状态。
虽然特定的发病机理是目前分析的目标,但认为病毒感染在诸如糖尿病等疾病的发展中起作用。淋巴细胞OAS活性在患有1型糖尿病的患者中显著升高,表明OAS可能是病毒感染与疾病发展之间的重要联系。在涉及单卵双胞胎对的糖尿病性双胞胎的研究中,波奈维(Bonnevie)-尼尔森(Nielsen)等人(临床免疫学(Clin Immunol.),2000年7月;96(1):11-8)显示OAS在最近发作和长期存在的1型糖尿病中持久激活。1型糖尿病中连续升高的OAS活性明显与正常抗病毒反应不同且可指示酶的慢性刺激、下调机理的衰退或对内源或外源病毒或其产物的异常反应。
病毒感染与糖尿病发展之间更直接的联系由许多研究得到例证,所述研究显示13%-33%的患有慢性丙型肝炎的患者患有糖尿病(2型糖尿病),与匹配的健康对照或患有慢性乙型肝炎的患者相比程度明显增加(诺伯勒(Knobler)等人,美国胃肠杂志(AmJ Gastroenterol.),2003年12月;98(12):2751-6)。虽然至今尚未报导OAS在丙型肝炎感染之后糖尿病的发展中起作用,但其可能是抗病毒反应系统的适用标记。进一步公开的研究已显示,OAS在伤口愈合和其病理学病症(尤其在静脉性溃疡和糖尿病相关的不良愈合伤口的情况下)中发挥主要作用(WO 02/090552)。在不良伤口愈合的情况下,受感染组织中OAS mRNA的含量减小,而不是像源自患有1型糖尿病的患者的淋巴细胞中一样升高。这些研究结果指出,OAS在糖尿病和糖尿病相关的伤口愈合中作为免疫反应的重要病因学指标。
OAS也可在前列腺癌症所涉及的细胞过程中起媒介作用。OAS的主要生物化学功能是促进RNaseL的活性,RNaseL为受2-5A分子酶促刺激的独特调控的内切核糖核酸酶。RNaseL在介导IFN的抗病毒作用时起明确作用且是遗传性前列腺癌症1等位基因(HPC1)的强势候选物。已展示RNaseL的突变使男性的前列腺癌症发病率倾向于增加,这在一些情况下反映与非RNaseL相关情况相比疾病更具侵袭性和/或发作年龄降低。向(Xiang)等人(癌症研究(Cancer Res.)2003年10月15日;63(20):6795-801)证明2-5A的生物稳定性硫代磷酸酯(phosphorothiolate)类似物诱导RNaseL活性且引起晚期转移性人类前列腺癌细胞系培养物的细胞凋亡。其研究结果表明,伴随2-5A含量增加的OAS活性的升高可有利于经由有效的细胞凋亡途径破坏癌细胞。
OAS可进一步通过其对RNaseL的调控或通过至今尚未发现的另一途径在正常细胞生长调节中起作用。相当多的证据支持OAS在细胞生长的负调控中的重要性。里斯奇(Rysiecki)等人(干扰素研究杂志(J.Interferon Res.),1989年12月;9(6):649-57)证明人类OAS在胶质母细胞瘤细胞系中的稳定转染产生降低的细胞增殖。也显示在比较休眠细胞系对增殖细胞系的若干研究中可测量OAS含量(例如海休尔(Hassel)和兹奥(Ts′O),分子癌变学(Mol Carcinog).1992;5(1):41-51和奇米仕(Kimchi)等人,欧洲生物化学杂志(Eur J Biochem).1981;114(1):5-10)且在各情况下,休眠细胞中的OAS含量最大。其它研究已显示OAS含量与细胞周期阶段之间的相关性,其中OAS含量在晚S期中急剧上升,且然后在G2中突然下降(威尔斯(Wells)和马鲁西(Mallucci),实验细胞研究(Exp Cell Res).1985年7月;159(1):27-36)。若干研究已显示受干扰素的各种形式刺激之后,OAS的诱发与抗增殖作用的发生之间的相关性(参见普莱尔(Player)和特仑斯(Torrence),药理学与治疗学(Pharmacol Ther).1998年5月;78(2):55-113)。也已显示细胞分化期间诱发OAS(例如谢尔兹伯格(Salzberg)等人,细胞科学杂志(JCell Sci.)1996年6月;109(第6部分):1517-26;和施瓦茨(Schwartz)和尼尔森(Nilson),分子细胞生物学(Mol Cell Biol).1989年9月;9(9):3897-903)。关于由血小板衍生的生长因子(PDGF)(Zullo等人,细胞(Cell).1985年12月;43(3 Pt 2):793-800)在热休克诱导的生长条件下((Chousterman)等人,生物化学杂志(J Biol Chem.),1987年4月5日;262(10):4806-11)诱发OAS的其它报告得出OAS诱发是正常细胞生长控制机理的假设。
纯化OAS蛋白的前述成果与本说明书中所述的过程截然不同且不能产生医药组合物的实质上纯的有效医药成分。舍巴斯(Chebath)和同事(莫里(Mory)等人,(1989)干扰素研究杂志(J.Interferon Res.)9:295-304)使用离子交换和亲和色谱来纯化通过在大肠杆菌中重组表达所产生的OAS蛋白。然而,所得蛋白质具有有限的纯度,这取决于昂贵的亲和纯化步骤,且无法产生适于医药组合物的OAS蛋白产物;所述过程也无法以适于商业制造的规模操作。沙卡(Sarkar)和森(Sen)无法在大肠杆菌中产生酶促活性OAS蛋白且因此使用昆虫细胞中的杆状病毒表达系统(S·N·沙卡(S.N.Sarkar)和G·C·森(G.C.Sen),(1998)方法(Methods),15:233-242)。作者通过细胞溶解昆虫细胞来分离可溶性OAS蛋白,且利用大小分馏(size fractionation)(Sephacryl S-300)和磷酸纤维素亲和纯化柱来纯化OAS蛋白。另外,所研发的过程不具有适于在商业装置中制备用于医药组合物的活性成分的规模、成本效率或纯度。
我们先前已证明多种寡腺苷酸合成酶蛋白可用作抗病毒药剂。本发明通过提供制造用作治疗疾病的医药组合物中的活性成分的OAS蛋白的方法来满足所属领域中的需求。
OAS蛋白的重组表达和纯化
本文中描述产生和分离OAS多肽或蛋白质的重组方法。一种所述方法包含将与有效产生编码OAS多肽的调控序列可操作性连接的任何核酸引入一组细胞中,在培养基中培养细胞以表达多肽,和从细胞或培养基中分离所述多肽。利用足以有利于细胞摄取(转染)和/或OAS多肽表达的量的OAS编码核酸。通过所属领域中已知的任何传递方法将核酸引入所述细胞中,所述方法例如包括注射、基因枪(gene gun)、被动摄取等。所属领域的技术人员将认识到,核酸可为载体的一部分,所述载体诸如重组表达载体(包括DNA质粒载体)或所属领域中已知的任何载体。可通过所属领域中已知的标准重组DNA技术和分离方法来制备和调配编码OAS多肽的核酸或包含所述核酸的载体。可在活体内将所述核酸或表达载体引入哺乳动物的一组细胞中,或可从哺乳动物中移出所选择的哺乳动物细胞(例如肿瘤细胞)且以足以产生编码多肽的摄取和表达的量将核酸表达载体离体引入这组所述细胞中。或者,利用所培养的细胞在活体外产生编码OAS多肽的核酸或包含所述核酸的载体。一方面,产生OAS多肽的方法包含在一组细胞中引入将产生载体摄取和编码多肽的表达的量和配方的包含编码OAS多肽的任何核酸的重组表达载体;通过本文中所述的任何引入/传递格式向哺乳动物投与表达载体;和从哺乳动物或哺乳动物的副产物中分离所述多肽。
本发明提供编码OAS多肽的分离或重组的核酸(在本文中也称为多核苷酸),总称为“本发明的核酸(或多核苷酸)”。本发明的多核苷酸适用于多种应用。如以上所讨论,多核苷酸适用于产生OAS多肽。
本发明的任何多核苷酸(包括上述多核苷酸)都可编码包含至少一个其它氨基酸序列的融合蛋白,所述氨基酸序列诸如分泌/定位序列、适用于溶解或固定(例如,用于细胞表面呈现)OAS多肽的序列、适用于检测和/或纯化OAS多肽的序列(例如,多肽纯化子序列,诸如表位标签、聚组氨酸序列等)或增加细胞摄取的序列。另一方面,本发明提供包含一种或一种以上本发明的多核苷酸的细胞。所述细胞可表达由本发明的多核苷酸编码的一种或一种以上OAS多肽。
本发明还提供包含本发明的任何多核苷酸的载体。所述载体可包含质粒、粘粒、噬菌体、病毒或病毒的片段。所述载体可包含表达载体,且必要时,核酸与包括本文中和下文中所论述的那些启动子的启动子可操作性连接。
本发明还包括包含一个或一个以上如上文广泛描述的核酸序列的重组构筑体。所述构筑体包含已正向或反向插入本发明的核酸序列的载体,诸如质粒、粘粒、噬菌体、病毒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)等。在一些情况下,构筑体进一步包含调控序列,例如包括与核酸序列可操作性连接的启动子。所属领域的技术人员已知大量合适的载体和启动子且其在市面上有售。
描述本文中适用的分子生物技术(包括载体的使用、启动子和许多其它相关专题)的普通文章包括伯格(Berger),同上;山姆布鲁克(Sambrook)(1989),同上;和奥苏贝尔(Ausubel),同上。足以指导技术人员通过活体外扩增方法(包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、Qβ-复制酶扩增和其它RNA聚合酶介导技术(例如,NASBA))来例如产生本发明的同源核酸的技术的实例可见于伯格(Berger),山姆布鲁克(Sambrook)和奥苏贝尔(Ausubel),所有都同上;以及穆利斯(Mullis)等人,(1987)美国专利第4,683,202号;PCR方案:方法和应用指南(PCR Protocols:A Guide to Methodsand Applications)(因尼斯(Innis)等人编),学术出版社(Academic Press Inc.),圣地亚哥(San Diego),加利福尼亚州(Calif.)(1990)(“因尼斯”);阿恩海姆(Arnheim)和莱维森(Levinson)(1990年10月1日)C&EN 36-47;NIH研究杂志(The Journal OfNIH Research)(1991)3:81-94;孔(Kwoh)等人,(1989)美国国家科学院院刊(Proc NatlAcad Sci USA)86:1173-1177;盖特力(Guatelli)等人,(1990)美国国家科学院院刊(ProcNatl Acad Sci USA)87:1874-1878;洛梅力(Lomeli)等人,(1989)临床化学杂志(J ClinChem)35:1826-1831;蓝德格(Landegren)等人,(1988)科学(Science)241:1077-1080;凡·布鲁特(Van Brunt)(1990)生物技术(Biotechnology)8:291-294;吴(Wu)和瓦伦斯(Wallace)(1989)基因(Gene)4:560-569;巴林格(Barringer)等人,(1990)基因(Gene)89:117-122,和苏克那南(Sooknanan)和马来克(Malek)(1995)生物技术(Biotechnology)13:563-564。瓦伦斯(Wallace)等人的美国专利第5,426,039号中描述活体外克隆扩增核酸的改进方法。通过PCR扩增大核酸的改进方法是概述于郑(Cheng)等人,(1994)自然(Nature)369:684-685和其中的参考文献中,其中产生具有多达40千碱基(kb)的PCR扩增子。技术人员应了解,可使基本上任何RNA转化为适于利用反转录酶和聚合酶进行限制消化、PCR扩展和测序的双链DNA。参见奥苏贝尔(Ausubel)、山姆布鲁克(Sambrook)和伯格(Berger),所有都同上。
本发明还提供经本发明载体转导的宿主细胞,和通过重组技术产生本发明的OAS多肽。用本发明的载体(例如,其可为克隆载体或表达载体)遗传工程改造(例如转导、转化或转染)宿主细胞。例如,载体可呈质粒、病毒粒子、噬菌体等形式。可在经适当修饰以激活启动子、选择转化体或扩增基因的常规营养培养基中培养工程改造的宿主细胞。诸如温度、pH值等培养条件是选择用于表达的宿主细胞先前所使用的条件,且对所属领域的技术人员来说将显而易见且可见于本文中所引用的参考文献中,所述参考文献例如包括弗雷谢尼(Freshney)(1994)基本技术手册,动物细胞的培养(Culture ofAnimal Cells,a Manual of Basic Technique),第3版,威利-利斯(Wiley-Liss),纽约(NewYork)和其中所引用的参考文献。
也可在诸如植物、酵母、真菌、细菌等非动物细胞中产生OAS多肽。除山姆布鲁克(Sambrook)、伯格(Berger)和奥苏贝尔(Ausubel)外,关于细胞培养的详情例如可见于培尼(Payne)等人,(1992)液体系统中的植物细胞和组织培养(Plant Cell andTissue Culture in Liquid Systems),约翰威立父子出版社(John Wiley & Sons,Inc.),纽约(New York,N.Y.);甘保伯格(Gamborg)和飞利浦(Phillips)(编)(1995)植物细胞、组织和器官培养(Plant Cell,Tissue and Organ Culture);基本方法斯柏林格实验室手册(Fundamental Methods Springer Lab Manual),斯柏林格-维拉格(Springer-Verlag),(柏林(Berlin),海德尔堡(Heidelberg),纽约(New York));阿特拉斯(Atlas)和帕克斯(Parks)(编),微生物学培养基手册(The Handbook of Microbiological Media)(1993),CRC出版社(CRC Press),波卡瑞顿(Boca Raton),佛罗里达州(Fla)。
表达OAS多肽的多种表达载体中的任一种都可包括本发明的多核苷酸和其片段。所述载体包括染色体、非染色体和合成DNA序列,例如SV40衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、源自质粒和噬菌体DNA的组合的载体。可使用将遗传物质转导到细胞中且如果需要复制,那么在相关宿主中可复制且有活力的任何载体。
表达载体中的核酸序列与适当转录控制序列(启动子)可操作性连接以引导mRNA合成。所述启动子的实例包括:LTR或SV40启动子、大肠杆菌lac或trp启动子、噬菌体λPL启动子、CMV启动子和已知在原核或真核细胞中控制基因表达的其它启动子。表达载体还含有起始翻译的核糖体结合位点和转录终止子。载体任选包括适用于扩增表达的序列,例如强化子。另外,表达载体任选包含一个或一个以上提供用于选择转化的宿主细胞的表型特性的可选择标记基因,所述特性诸如真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性或诸如在大肠杆菌中的四环素(tetracycline)、卡那霉素(kanamycin)或氨苄青霉素(ampicillin)抗性。
可使用含有编码本发明的OAS多肽的适当DNA序列以及适当启动子或控制序列的载体来转化适当宿主以允许所述宿主表达所述多肽。适当表达宿主的实例包括诸如大肠杆菌、链霉菌(Streptomyces)和鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)等细菌细胞;诸如酿酒酵母、毕赤酵母(Pichia pastoris)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)等真菌细胞;诸如果蝇(Drosophila)和草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)等昆虫细胞;诸如CHO、COS、BHK、HEK 293或人黑色素瘤(Bowes melanoma)等哺乳动物细胞;植物细胞等。应了解,并不是所有细胞或细胞系都需要能够产生完全功能OAS多肽或其片段;例如,可在细菌或其它表达系统中产生多肽的抗原片段。本发明不受所使用的宿主细胞限制。
在细菌系统中,视OAS多肽或其片段的预定用途而定,可选择许多表达载体。举例来说,当需要大量多肽或其片段来诱发抗体时,可能需要引导容易纯化的融合蛋白的高水平表达的载体。所述载体包括(但不限于)多功能大肠杆菌克隆和表达载体,诸如BLUESCRIPT(Stratagene),其中核苷酸编码序列可与氨基末端Met和β-半乳糖苷酶的随后7个残基的序列同框接合到载体中以产生杂交蛋白;pIN载体(凡海克(Van Heeke)和舒斯特(Schuster)(1989)生物化学杂志(J Biol Chem)264:5503-5509);pET载体(诺瓦根(Novagen),威斯康星州麦迪逊(Madison Wis.))等。
类似地,在酵母酿酒酵母中,可使用许多含有组成性或诱导性启动子(诸如α因子、醇氧化酶和PGH)的载体来产生本发明的多肽。关于综述,参见奥苏贝尔(Ausubel),同上;伯格(Berger),同上;和格兰特(Grant)等人,(1987)酶学中的方法(Methods inEnzymology)153:516-544。
在哺乳动物宿主细胞中,可利用许多表达系统,诸如基于病毒的系统。在使用腺病毒作为表达载体的情况下,将编码序列任选接合到由晚期启动子和三联前导序列组成的腺病毒转录/翻译复合物中。插入病毒基因组的非必需E1或E3区中产生能够在受感染宿主细胞中表达OAS多肽的有活力病毒(洛甘(Logan)和谢克(Shenk)(1984)美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA),81:3655-3659)。另外,使用诸如劳氏肉瘤病毒(RSV)强化子等转录强化子来增加哺乳动物宿主细胞中的表达。宿主细胞、培养基、表达系统和产生方法包括那些已知用于克隆和表达各种哺乳动物蛋白质的方法。
特定的起始信号可有助于有效翻译本发明的多核苷酸编码序列和/或其片段。例如,这些信号可包括ATG起始密码子和邻接序列。在将编码序列、其起始密码子和上游序列插入适当表达载体中的情况下,可不需要其它翻译控制信号。然而,在仅插入编码序列(例如成熟蛋白质编码序列)或其部分的情况下,必须提供包括ATG起始密码子的外源核酸转录控制信号。此外,起始密码子必须位于正确的阅读框架内以确保转录整个插入物。外源转录元件和起始密码子可来自各种天然和合成来源。可通过纳入适于所用细胞系统的强化子来增强表达效率(例如参见薛夫·D(Scharf D.)等人,(1994)细胞分化的结果和间题(Results Probl Cell Differ),20:125-62;和比特纳(Bittner)等人,(1987)酶学中的方法(Methods in Enzymol),153:516-544)。
例如,编码OAS多肽的多核苷酸也可与编码分泌/定位序列的核酸同框融合以使多肽表达靶向期望的细胞隔室、膜或细胞器或引导多肽分泌到细胞周质间隙或细胞培养基中。所述序列为技术人员所知且包括分泌前导或信号肽、细胞器靶向序列(例如核定位序列、ER保留信号、线粒体转运序列、叶绿体转运序列)、膜定位/锚定序列(例如停止转运序列、GPI锚定序列)等。
另一方面,本发明涉及含有本发明任何上述核酸、载体或其它构筑体的宿主细胞。宿主细胞可为诸如哺乳动物细胞、酵母细胞或植物细胞等真核细胞,或宿主细胞可为诸如细菌细胞等原核细胞。将构筑体引入宿主细胞中可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔、基因或疫苗枪、注射或用于活体内、离体或活体外方法的其它常见技术(例如参见戴维斯·L(Davis,L.),迪伯纳·M(Dibner,M.)和巴特·I(Battey,I.)(1986)分子生物学中的基本方法(Basic Methods in Molecular Biology))来实现。
宿主细胞菌株可根据其以期望方式调节所插入序列的表达或加工所表达蛋白质的能力任选地加以选择。蛋白质的所述修饰包括(但不限于)乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂质化和酰化。用于裂解蛋白质的“前体(pre)”或“前体原(prepro)”形式的翻译后加工对正确插入、折叠和/或功能来说也很重要。诸如大肠杆菌、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、酵母或哺乳动物细胞(诸如CHO、HeLa、BHK、MDCK、HEK 293、W138等)等不同宿主细胞具有用于所述翻译后活动的特定细胞机构和特征机理,并且可选择所述不同的宿主细胞来确保正确修饰和加工所引入的外源蛋白质。
对于重组OAS蛋白的长期高产率产生来说,可使用稳定表达。举例来说,使用含有病毒复制起点或内源性表达元件和可选择标记基因的表达载体来转导稳定表达本发明的多肽的细胞系。在引入载体后,可使细胞在富集培养基中生长1-2天,随后将其转换到选择性培养基中。可选择标记的目的在于赋予选择抗性,且其存在允许成功表达所引入的序列的细胞的生长和回收。举例来说,可使用适于所述细胞类型的组织培养技术使稳定转化的细胞的抗性凝块增殖。
任选在适于表达编码蛋白质和从细胞培养物中回收编码蛋白质的条件下培养经编码OAS多肽的核苷酸序列转化的宿主细胞。视所使用的序列和/或载体而定,重组细胞所产生的多肽可为分泌型、膜结合型或含于细胞内。所属领域的技术人员将了解,含有编码本发明的多肽的多核苷酸的表达载体可经设计具有引导成熟多肽分泌通过原核或真核细胞膜的信号序列。
本发明的多核苷酸任选包含与例如有利于编码多肽的纯化和/或检测的标记序列同框融合的编码序列。所述纯化子序列包括(但不限于)诸如允许在固定金属上纯化的组氨酸-色氨酸组件等金属螯合肽、结合谷胱甘肽的序列(例如GST)、血凝素(HA)标签(对应于源自流感血凝素蛋白的表位;威尔逊·I(Wilson I.)等人,(1984)细胞(Cell),37:767)、麦芽糖结合蛋白序列、FLAGS延长/亲和纯化系统中所使用的FLAG表位等。在纯化域与多肽序列之间包括蛋白酶可裂解的多肽连接序列适用于促进纯化。
举例来说,一种可能用于本文中所述的组合物和方法中的表达载体提供包含与通过肠激酶裂解位点隔开的聚组氨酸区融合的OAS多肽的融合蛋白的表达。组氨酸残基有利于在固定的金属离子亲和色谱(immobilized metal ion affinity chromatography,IMIAC,如波拉斯(Porath)等人,(1992)蛋白质表达和纯化(Protein Expression and Purification)3:263-281)中所述)上纯化,而肠激酶裂解位点提供从聚组氨酸区分离所需多肽的方法。任选使用pGEX载体(普洛麦格(Promega);威斯康星州麦迪逊(Madison,Wis))来表达外来多肽,使其作为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。一般来说,所述融合蛋白是可溶的且可易于通过吸附到配位体-琼脂糖珠粒(例如,在GST融合物的情况下,谷胱甘肽-琼脂糖)上、接着在存在游离配位体的情况下洗脱而从细胞溶解的细胞进行纯化。
在转导合适的宿主菌株且使宿主菌株生长到适当细胞密度后,通过适当手段(例如,温度变动或化学诱导)来诱导所选择的启动子,且将细胞再培养一段时期。通常通过离心收集细胞,通过物理或化学手段破坏细胞,且保留所得粗提取物以用于进一步纯化。可通过任何便利方法来破坏蛋白质表达中所采用的真核或微生物细胞,所述方法包括冷冻-解冻循环、超声处理、机械破坏或使用细胞溶解试剂或所属领域的技术人员熟知的其它方法。
如所说明,关于许多细胞(包括具有细菌、植物、动物(尤其哺乳动物)和古细菌(archebacterial)起源的细胞)的培养和产生,可获得许多参考文献。例如参见山姆布鲁克(Sambrook)、奥苏贝尔(Ausubel)和伯格(Berger)(所有同上),以及弗雷谢尼(Freshney),(1994)基本技术手册,动物细胞的培养(Culture of Animal Cells,a Manual of BasicTechnique),第3版,威利-利斯(Wiley-Liss),纽约(New York)和其中所引用的参考文献;多力(Doyle)和格力弗兹(Griffiths)(1997)哺乳动物细胞培养:基本技术(Mammalian Cell Culture:Essential Techniques),约翰威利父子(John Wiley and Sons),纽约(New York);赫马森(Humason)(1979)动物组织技术(Animal Tissue Techniques),第4版,W·H·弗里曼出版社(W.H.Freeman and Company);和里西戴力(Ricciardelli)等人,(1989)活体外细胞发展生物学(In vitro Cell Dev Biol),25:1016-1024。关于植物细胞培养和再生,例如参见培尼(Payne)等人,(1992)液体系统中的植物细胞和组织培养(Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems),约翰威立父子出版社(John Wiley &Sons,Inc.),纽约(New York,N.Y.);甘保伯格(Gamborg)和飞利浦(Phillips)(编)(1995)植物细胞、组织和器官培养(Plant Cell,Tissue and Organ Culture);基本方法斯柏林格实验室手册(Fundamental Methods Springer Lab Manual),斯柏林格-维拉格(Springer-Verlag)(柏林(Berlin),海德尔堡(Heidelberg),纽约(New York));和植物分子生物学(Plant Molecular Biology)(1993)R.R.D科里(R.R.D.Croy)(编)生物科学出版社(Bios Scientific Publishers),牛津大学(Oxford),英国(U.K.)ISBN0 12 198370 6。细胞培养基通常陈述于阿特拉斯(Atlas)和帕克斯(Parks)(编)微生物学培养基手册(The Handbook of Microbiological Media)(1993),CRC出版社(CRC Press),波卡瑞顿(Boca Raton),佛罗里达州(Fla)中。关于细胞培养的其它信息可见于可获得的商业文献中,诸如来自西格马-阿尔德里奇公司(Sigma-Aldrich,Inc)(圣路易斯,密苏里州(St Louis,Mo.))的生命科学研究细胞培养物目录(Life Science Research CellCulture Catalogue)(“Sigma-LSRCCC”)和例如也来自西格马-阿尔德里奇公司(Sigma-Aldrich,Inc)(圣路易斯,密苏里州(St Louis,Mo.))的植物培养目录和补充物(“Sigma-PCCS”)。
可根据所属领域中熟知的许多方法中的任一种从重组细胞培养物中回收和纯化OAS多肽,所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水性相互作用色谱、亲和色谱(例如利用本文中所说明的任一种标签系统)、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱。可按需要在成熟OAS蛋白的完全构型或其片段中使用蛋白质再折叠步骤。最后,可在最后纯化步骤中使用高效液相色谱(HPLC)。除所说明的同上文的参考文献外,所属领域中还熟知多种纯化方法,例如包括山达纳(Sandana)(1997)蛋白质的生物分离(Bioseparation of Proteins),学术出版社(AcademicPress,Inc.);波拉格(Bollag)等人,(1996)蛋白质方法(Protein Methods),第2版,威利-利斯(Wiley-Liss),纽约(New York);沃尔克(Walker)(1996)蛋白质方案手册(The Protein Protocols Handbook),胡玛纳出版社(Humana Press),新泽西州(NewJersey);哈里斯(Harris)和安吉拉(Angal)(1990),蛋白质纯化应用:一种实用方法(Protein Purification Applications:A Practical Approach),牛津IRL出版社(IRL Press atOxford),牛津(Oxford),英国(England);哈里斯(Harris)和安吉拉(Angal),蛋白质纯化方法:一种实用方法(Protein Purification Methods:A Practical Approach),牛津IRL出版社(IRL Press at Oxford),牛津(Oxford),英国(England);司考普斯(Scopes)(1993)蛋白质纯化:原理和实践(Protein Purification:Principles and Practice),第3版,斯柏林格-维拉格(Springer-Verlag),纽约(New York);杰逊(Janson)和雷登(Ryden)(1998)蛋白质纯化:原理、高拆分度方法和应用(Protein Purification:Principles,HighResolution Methods and Applications),第2版,威利-VCH(Wiley-VCH),纽约(NewYork);和沃尔克(Walker)(1998)CD-ROM上的蛋白质方案,胡玛纳出版社(HumanaPress),新泽西州(New Jersey)中所述的方法。
实施例
OAS蛋白活性医药成分(API)表达和发酵
在一个例示性实施例中,用编码对应于一种或一种以上OAS蛋白或多肽的核酸序列且含有异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导性启动子的细菌表达载体转化含有λDE3的细胞溶素原且因此携带受lacUV5启动子控制的T7RNA聚合酶基因的染色体复本的大肠杆菌菌株。使培养物在37℃下在补充有15μg/mL卡那霉素的卢瑞亚(Luria)肉汤培养基中生长。当OD600达到>0.6时,将温度降到18℃且用0.5mM IPTG诱导细胞17小时。上述低温诱导有利于在包涵体外部表达主要全长可溶性OAS蛋白。然后,将细菌细胞再悬浮于含有50mM NaH2PO4(pH 8)、300mM NaCl、20mM咪唑、10%甘油、0.1%NP40、2mM DTT和蛋白酶抑制剂的缓冲液中,使细胞溶解于Gaulin均质器中且在蛋白质纯化之前离心以去除细胞碎片。
在另一个例示性实施例中,通过克隆到pET9d表达载体中并转化到BL21(DE3)宿主大肠杆菌菌株中来表达OAS蛋白。使重组细菌培养物在卢瑞亚肉汤中生长直到OD(600nm)为约0.6,且通过加入IPTG直到最终浓度为1mM并在37℃下保持3-4小时来诱导其表达OAS蛋白。在这些诱导条件下,可见大部分全长OAS蛋白在包涵体中呈不可溶形式。使细菌细胞培养物在9000×g下离心以收集细胞沉淀物。将细胞沉淀物再悬浮于50mM NaH2PO4、0.5%Triton X-100、100mM NaCl、1mM EDTA(pH 7.4)中。加入溶菌酶直到达1mg/mL且使用超声处理来破坏细胞膜。加入DNAse和RNAse直到各自最终浓度为50μg/ml,从而降低细胞溶解物的粘度。加入等体积的50mM NaH2PO4、5%Triton X-100、2M脲、100mM NaCl、1mM EDTA的溶液(pH 7.4)且在室温下搅拌混合物30分钟。快速冷冻、解冻细胞溶解物且在9000×g下离心以回收包涵体。在50mM NaH2PO4、5%Triton X-100、2M脲、100mM NaCl、1mM EDTA的溶液(pH 7.4)中洗涤包涵体一次,接着在9000×g下离心30分钟。使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.4)再进行包涵体洗涤,接着如同上述进行离心。通过以每2.5克湿包涵体沉淀物加入50mL的50mM NaH2PO4、6M盐酸胍溶液(pH 8.0)的量添加该溶液来溶解包涵体沉淀物。加入二硫苏糖醇(DTT)直到最终浓度为50mM。在室温下搅拌混合物至少两小时或直到澄清。使用超声处理来提高包涵体的澄清度和溶解性。可通过溶解的包涵体制剂的SDS-PAGE来评估OAS蛋白的细菌表达。可见约50%或以上的溶解的包涵体蛋白为OAS蛋白。
在一个实施例中,所使用的细菌菌株为BL21衍生物。在另一个实施例中,使细菌在极佳肉汤或合成培养基中生长。在另一个实施例中,培养基补充有缓冲液、氨基酸、糖或其它碳源。在另一个实施例中,使细菌在震荡烧瓶、种子培养物或发酵罐中生长。在诱导OAS蛋白表达之前,视培养条件而定,使细菌培养物生长到多种细胞密度。如在600nm波长下根据光密度所测量,诱导时的细胞密度例如为约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.5、2.0或2.5,例如5.0或10.0。视所使用的重组蛋白质表达载体和宿主大肠杆菌菌株而定,使细菌在多种选择性条件下生长。在优选实施例中,使细菌在存在例如约1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、50μg/mL或100μg/mL卡那霉素的情况下生长。在另一个实施例中,可使细菌培养物在介于30℃与40℃之间的任何温度下生长。
在IPTG诱导物的多种浓度下进行诱导,所述浓度诸如为约0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.5mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM、4.0mM或5.0mM。在另一个实施例中,可在介于4℃与40℃之间的温度下进行OAS蛋白诱导且历时30分钟与48小时之间的时间。在另一个实施例中,在37℃下用最终浓度为1mM的IPTG诱导适当密度的细菌培养物3-4小时或在37℃下用最终浓度为1mM的IPTG诱导适当密度的细菌培养物10小时来进行OAS蛋白表达。多种诱导温度和时间适用于OAS蛋白表达。较短诱导时间和较高温度有利于将全长不可溶OAS蛋白表达到包涵体中。较长诱导时期和较低温度有利于将可溶性OAS蛋白表达到包涵体外部。在诱导OD600值的终点达到高达50个(例如60、70、80、90、约100、110、120、130、140或150个)单位的发酵罐中或发酵条件下进行OAS蛋白的诱导。在诱导结束时,通过包括离心和过滤的多种方法收集细胞,或在不分离的情况下直接在培养基中细胞溶解或均质化。所属领域的技术人员将认识到,本说明书预想多种细胞收集方法。OAS蛋白超过总细胞蛋白的10%,例如11%、12%、13%、约15%、约20%。
收集含有重组OAS蛋白的细菌细胞和包涵体,洗涤,细胞溶解并使其在多种缓冲液和溶液条件下溶解。使用多种pKa值的多种缓冲液来缓冲溶液,所述缓冲液包括N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙烷磺酸(ACES)、咪唑、磷酸盐、N-吗啉基丙烷磺酸(MOPS)、N-三(羟基甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸(TES)、三乙醇胺、三(羟基甲基)氨基甲烷(TRIS)、N-三(羟基甲基)甲基-甘氨酸(Tricine)、三(羟基甲基)氨基丙烷(TAPS)、N-(2-羟基乙基)哌嗪-N′-(2-乙烷磺酸)(HEPES)、2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇、二乙醇胺、硼酸、NaH2PO4以及乙醇胺。使用多种浓度和多种pH值的缓冲液,所述浓度诸如1mM、5mM、10mM、约25mM、约50mM、约100mM、约200mM,所述pH值诸如6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.8、7.9、8.0,诸如约8.2、约8.5、约8.7、约9.0、约9.2、约9.5、约10、约10.5、约11、约11.5、约12、约12.5和以上。加入盐以使OAS蛋白稳定,所述盐诸如氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、氯化锰、硫酸镁、硫酸钠、溴化钠、乙酸钠、硫酸钙、氯化锂、碘化钠、高氯酸钠和硫氰酸钠,其浓度为约10mM、约25mM、约50mM、约75mM、约100mM、约200mM、约300mM、约500mM、约700mM、约1M。使用离液剂来增强含有OAS蛋白的包涵体的洗涤和溶解,所述离液剂包括:脲、盐酸胍、硫脲等,其浓度诸如为约0.25M、0.5M、1.0M、2.0M、3.0M、4.0M、5.0M、6.0M、7.0M,诸如8.0M和以上(包括几乎饱和的溶液)。加入多种清洁剂以促进细菌细胞溶解和包涵体洗涤和溶解,所述清洁剂诸如Nonidet P-40、Tween-80Tween-20Triton-X100Triton-X114Emulgens、Lubrol、洋地黄皂苷(Digitonin)、辛基葡糖苷、溶血卵磷脂、CHAPSCHAPSO两性清洁剂、胆酸盐、脱氧胆酸盐、十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide)、N-月桂基肌氨酸、聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯80、泊洛尼克F-68(pluronic F-68)、皂角苷、聚山梨酸酯40、月桂基二甲基胺氧化物、3-(癸基二甲基铵)丙烷磺酸内盐(SB3-10)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethylammonium bromide,CTAB)、氨基磺基甜菜碱-16(ASB-16)、3-(1-吡啶基)-1-丙烷磺酸盐(NDSB 201)和十二烷基硫酸盐,其浓度例如为约0.1%w/v、0.2%w/v、0.3%w/v、0.4%w/v、0.5%w/v、约1%w/v、约5%w/v、约10%w/v、10%w/v以上。在其它特定实施例中,加入螯合剂,诸如柠檬酸盐、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)和乙二醇四乙酸(ethylene glycol tetraacetic acid,EGTA),其浓度介于1mM与20mM之间,例如2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约10mM、约15mM,诸如约17mM。在细胞溶解和包涵体溶解期间可加入稳定剂以使OAS蛋白稳定,所述稳定剂包括表面活性剂、糖和多元醇(例如甘油、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、乳糖、肌醇、甘露糖醇、木糖醇、乙二醇)、多糖(例如环糊精)、中性聚合物(例如聚乙二醇(PEG)-400、PEG-4000、PEG-8000)氨基酸和衍生物(例如精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、甜菜碱、三甲胺-N-氧化物(TAMO)、苯丙氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、组氨酸)、白蛋白(例如牛或人类血清白蛋白)以及大偶极分子。加入硫醇保护剂或还原剂以阻止错误双硫键形成,所述硫醇保护基包括二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、2-巯基乙醇、2-3-二巯基丙醇、三丁基膦(tributylphosphine,TBP)、三-羧基乙基膦(tris-carboxyethylphosphine,TCEP)、巯基乙酸盐、谷胱甘肽和半胱氨酸,其浓度介于0.5mM与100mM之间,诸如1mM、约5mM、约10mM、约25mM、约50mM、约100mM。
加入酶以有助于细胞溶解,诸如浓度为1mg/mL、约2mg/mL、约5mg/mL或约10mg/mL的溶菌酶。使用机械破坏来细胞溶解细菌细胞且澄清和溶解包涵体,所属领域的技术人员将认识到,所述适当的机械方法包括:超声处理、Gaulin均质化、使用搅拌机、使用弗氏细胞压碎器(French pressure cell)、Dounce均质化、Polytron均质化、Potter-Elvehjem均质化以及冷冻/解冻方法。也使用热、不同pH值缓冲液、不同还原剂和高压来增强包涵体的溶解。使用多种技术来分离包涵体与其它细胞蛋白质和碎片,所述技术包括:离心、膜过滤、切向流过滤、中空纤维过滤以及膨胀床吸附。也可在水中洗涤包涵体。
例示性包涵体溶解溶液包括:6M盐酸胍、50mM磷酸钠、100mM DTT、10mMEDTA,pH 8.0;8M盐酸胍、50mM磷酸钠、100mM DTT、10mM EDTA,pH 8.0;8.4M脲、2M盐酸胍、50mM磷酸钠、100mM DTT、10mM EDTA,pH 8.0;8M脲、4M盐酸胍、50mM磷酸钠、100mM DTT、10mM EDTA,pH 8.0;和6M脲、4M盐酸胍、50mM磷酸钠、100mM DTT、10mM EDTA,pH 8.0。
不可溶制剂的OAS蛋白API再折叠
在一个例示性实施例中,将溶解的包涵体调节到最终蛋白质浓度为10-15mg/mL,接着将其脉冲稀释到适当的再折叠缓冲液中。最终蛋白质浓度大于30mg/mL的溶解的包涵体证明较差的再折叠可能性。通过经16小时的时间在4℃下且以0.2毫升/分钟的流速脉冲稀释到包含50mM NaH2PO4、300mM盐酸胍、0.5%Tween-2010%甘油、5mMβ-巯基乙醇的搅拌溶液(pH 8.0)中来进行OAS蛋白质再折叠。溶解的包涵体和再折叠溶液都提前冷却到4℃。溶解的包涵体在再折叠溶液中的最终总稀释比为约1∶20。在例示性实施例中,使用清洁剂来促进OAS蛋白API的适当再折叠。使用0.1%、0.5%和1%w/v的CHAPS以及最终浓度介于0.1%与1.0%w/v之间的Tween-20显示1%Tween-20减少再折叠期间OAS蛋白API的聚集。pH值为8.0的再折叠溶液比pH值为6.8的再折叠溶液效果好。同样地,含有2-巯基乙醇作为还原剂的再折叠溶液比含有DTT的再折叠溶液效果好。在4℃下进行的再折叠比在室温下进行的再折叠过程有效。离液剂的存在和高含盐量也增强OAS蛋白再折叠;例如加入300mM NaCl和300mM盐酸胍会增强蛋白质再折叠效率。在一个例示性实施例中,介于10与120之间的溶解的包涵体的稀释倍数产生大量适当折叠且具有高活性的OAS蛋白API。实现大于40%的再折叠效率。再折叠的温度可在4℃与16℃之间变化,例如5℃、6℃、7℃、8℃、约10℃、11℃、12℃、约14℃、约16℃。脉冲稀释可发生1到24小时,例如约1、2、4、6、8、10、约12、约16、约20、约24小时或以上。例示性再折叠缓冲液包括(但不限于):300mM GuHCl、50mM NaH2PO4、2mM DTT、1mM EDTA、10%甘油、0.5%Tween 20,pH 8.0;400mM GuHCl、50mM NaH2PO4、2mM DTT、1mM EDTA、10%甘油、0.5%Tween 20,pH 8.0;500mM L-精氨酸、50mM NaH2PO4、2mM DTT、1mM EDTA、10%甘油、0.5% Tween 20,pH 8.0;2M脲、50mM NaH2PO4、2mM DTT、1mM EDTA、10%甘油、0.5%Tween 20,pH 8.0;500mM L-组氨酸、50mM NaH2PO4、2mM DTT、1mM EDTA、10%甘油、0.5%Tween 20,pH 8.0;300mM L-组氨酸、50mM NaH2PO4、2mM DTT、1mM EDTA、10%甘油、0.5% Tween 20,pH 8.0;和500mM NaCl、50mMNaH2PO4、2mM DTT、1mM EDTA、10%甘油、0.5%Tween 20,pH 8.0。
其它例示性再折叠缓冲液包括(但不限于):100mM L-精氨酸、300mM L-组氨酸、50mM NaH2PO4、2mM DTT、1mM EDTA、10%甘油、0.5%Tween 20,pH 8.0;200mML-精氨酸、300mM L-组氨酸、50mM NaH2PO4、2mM DTT、1mM EDTA、10%甘油、0.5%Tween 20,pH 8.0;300mM L-精氨酸、300mM L-组氨酸、50mM NaH2PO4、2mMDTT、1mM EDTA、10%甘油、0.5%Tween 20,pH 8.0;400mM L-精氨酸、300mM L-组氨酸、50mM NaH2PO4、2mM DTT、1mM EDTA、10%甘油、0.5%Tween 20,pH 8.0;500mM L-精氨酸、300mM L-组氨酸、50mM NaH2PO4、2mM DTT、1mM EDTA、10%甘油、0.5%Tween 20,pH 8.0;500mM L-精氨酸、500mM NaCl、50mM NaH2PO4、2mMDTT、1mM EDTA、10%甘油、0.5%Tween 20,pH 8.0;300mM L-组氨酸、500mM NaCl、50mM NaH2PO4、2mM DTT、1mM EDTA、10%甘油、0.5%Tween 20,pH 8.0;800mML-精氨酸、300mM L-组氨酸、50mM NaH2PO4、2mM DTT、1mM EDTA、10%甘油、0.5%Tween 20,pH 8.0;500mM L-精氨酸、300mM L-组氨酸、500mM脲、50mMNaH2PO4、2mM DTT、1mM EDTA、10%甘油、0.5%Tween 20,pH 8.0;500mM L-精氨酸、300mM L-组氨酸、200mM NaCl、50mM NaH2PO4、2mM DTT、1mM EDTA、10%甘油、0.5%Tween 20,pH 8.0;和300mM L-精氨酸、200mM L-组氨酸、50mMNaH2PO4、2mM DTT、1mM EDTA、10%甘油、0.5%Tween 20,pH 8.0。
其它例示性再折叠缓冲液包括(但不限于):300mM L-精氨酸、200mM L-组氨酸、10%蔗糖、50mM NaH2PO4、2mM DTT、1mM EDTA、0.5%Tween 20,pH 8.0;300mML-精氨酸、200mM L-组氨酸、20%蔗糖、50mM NaH2PO4、2mM DTT、1mM EDTA、0.5%Tween 20,pH 8.0;300mM L-精氨酸、200mM L-组氨酸、20%甘油、50mMNaH2PO4、2mM DTT、1mM EDTA、0.5%Tween 20,pH 8.0;100mM L-精氨酸、100mML-组氨酸、2%Tween 20、50mM NaH2PO4、2mM DTT、1mM EDTA、10%甘油,pH 8.0;100mM L-精氨酸、100mM L-组氨酸、20%甘油、2%Tween 20、50mM NaH2PO4、2mMDTT、1mM EDTA,pH 8.0;100mM L-精氨酸、100mM L-组氨酸、20%甘油、2%Tween20、10mM DTT、50mM NaH2PO4、1mM EDTA,pH 8.0;100mM L-精氨酸、100mML-组氨酸、30%甘油、2%Tween 20、10mM DTT、50mM NaH2PO4、1mM EDTA,pH 8.0;和100mM L-精氨酸、100mM L-组氨酸、30%蔗糖、2%Tween 20、10mM DTT、50mMNaH2PO4、1mM EDTA,pH 8.0。
在另一个实施例中,使用立即稀释来进行不可溶OAS蛋白的再折叠。在另一个实施例中,使用通过透析、切向流过滤和凝胶过滤进行的缓冲液交换来介导OAS蛋白再折叠。
在另一个实施例中,使用多种pKa值的替代缓冲液来缓冲再折叠溶液,所述缓冲液包括ACES、咪唑、磷酸盐、MOPS、TES、三乙醇胺、HEPES、TRIS、Tricine、TAPS、2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇、二乙醇胺、硼酸以及乙醇胺。使用多种浓度和多种pH值的缓冲液,所述浓度诸如1mM、5mM、10mM、约25mM、约50mM、约100mM、约200mM,所述pH值诸如约5.0、5.5、5.6、5.7、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、8.0,诸如约8.2、约8.5、约8.7、约9.0、约9.2、约9.5、约10、约10.5、约11、约11.5、约12、约12.5和以上。加入盐以使OAS蛋白稳定,所述盐诸如氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、氯化锰、硫酸镁、硫酸钠、溴化钠、乙酸钠、硫酸钙、氯化锂、碘化钠、高氯酸钠、硫氰酸钠以及硫酸铵,其浓度为约10mM、约25mM、约50mM、约75mM、约100mM、约200mM、约300mM、约500mM、约700mM、约1M。
使用离液剂来增强OAS蛋白的再折叠,所述离液剂包括:脲、盐酸胍、硫脲等,其浓度诸如为约0.05M、0.1M、0.25M、0.5M、1.0M、2.0M、3.0M、4.0M、5.0M、6.0M、7.0M,诸如8.0M和以上(包括几乎饱和的溶液)。加入多种清洁剂以改进OAS蛋白再折叠效率,所述清洁剂诸如Nonidet P-40、Tween-80Tween-20Triton-X100Triton-X114Emulgens、Lubrol、洋地黄皂苷、辛基葡糖苷、溶血卵磷脂、CHAPSCHAPSO两性清洁剂、胆酸盐、脱氧胆酸盐、十六烷基三甲基溴化铵、N-月桂基肌氨酸、聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯80、泊洛尼克F-68、皂角苷、聚山梨酸酯40、月桂基二甲基胺氧化物、3-(癸基二甲基铵)丙烷磺酸内盐(SB3-10)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、3-(1-吡啶基)-1-丙烷磺酸盐(NDSB 201)、氨基磺基甜菜碱-16(ASB-16)和十二烷基硫酸盐,其浓度例如为约0.1%w/v、0.2%w/v、0.3%w/v、0.4%w/v、0.5%w/v、约1%w/v、约5%w/v、约10%w/v、10%w/v以上。
在其它特定实施例中,加入螯合剂,诸如柠檬酸盐、乙二胺四乙酸(EDTA)和乙二醇四乙酸(EGTA),其浓度介于1mM与20mM之间,例如2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约10mM、约15mM,诸如约17mM。螯合剂增加硫醇还原剂的半衰期。再折叠期间可加入稳定剂以使OAS蛋白稳定,所述稳定剂包括表面活性剂、糖和多元醇(例如甘油、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、乳糖、肌醇、甘露糖醇、木糖醇、乙二醇)、多糖(例如环糊精)、中性聚合物(例如聚乙二醇(PEG)-400、PEG-4000、PEG-8000)氨基酸和衍生物(例如精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、甜菜碱、三甲胺-N-氧化物(TAMO)、苯丙氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、组氨酸)、白蛋白(例如牛或人类血清白蛋白)以及大偶极分子。
加入硫醇保护剂或还原剂以阻止错误双硫键形成且裂解包涵体内的不适当双硫键,所述硫醇保护基包括二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、2-巯基乙醇、2-3-二巯基丙醇、三丁基膦(TBP)、三-羧基乙基膦(TCEP)、巯基乙酸盐、谷胱甘肽和半胱氨酸,其浓度介于0.5mM与150mM之间,诸如1mM、约5mM、约10mM、约25mM、约50mM、约100mM、约150mM。
OAS蛋白API纯化、浓缩和杀菌
在一个例示性实施例中,通过0.45微米膜来过滤含适当再折叠的OAS蛋白的包涵体制剂以使其澄清,且将所述包涵体装载到HiTrap Heparin HPFPLC柱上以进行最初捕获和纯化。肝素柱中每毫升树脂结合约4-5mg OAS蛋白。在施加再折叠包涵体制剂之前,用50mM NaH2PO4、25mM NaCl、5%甘油、1mM EDTA、0.01%Tween-202mM DTT(pH 6.8)使肝素柱达到预平衡。OAS蛋白有效地结合肝素柱。结合后,用两个柱体积的50mM NaH2PO4、25mM NaCl、5%甘油、1mM EDTA、0.01%Tween-202mM DTT(pH 6.8)来洗涤固定的OAS蛋白且用50mM NaH2PO4、1M NaCl、30%甘油、1mM EDTA、2mM DTT(pH 6.8)以分级梯度(step gradient)洗脱。利用快速蛋白质液相色谱(FPLC),用市面上供应的柱或树脂进行柱色谱。
在另一个例示性实施例中,当再折叠蛋白质制剂的电导率低于6mS/cm时,使用HiTrap SP Fast Flow柱。在另一个实施例中,使用证明对OAS蛋白具有较低结合能力(约1mg/mL)的Cibacron Blue F3G-A(Blue Sepharose)树脂。在另一个例示性实施例中,使用以低亲和力(例如<1mg/mL树脂)结合OAS蛋白的混合模式树脂(例如通用电气医疗集团(GE Healthcare)的Capto MMC)。在另一个例示性实施例中,使用CaptoS和Phenyl HP柱从再折叠的包涵体制剂中捕获OAS蛋白。
另一个例示性实施例包括使用羧基-甲基(CM)阳离子交换树脂,其已证明结合OAS蛋白并从再折叠缓冲液中捕获OAS蛋白。所述例示性CM树脂包括(但不限于):SP-FF(通用电气医疗集团(GE Healthcare))和CM Hyper-D(PALL)。其它例示性CM捕获树脂包括(但不限于):CM Sephadex C-25、CM Sephadex C-50、CM Sepharose HighPerformance、CM Sepharose Fast Flow(通用电气医疗集团(GE Healthcare))、CM CeramicHyperD F、CM Ceramic HyperZ(PALL)、CM SephadexC-25、CM SephadexC-50、CM Dextranomer C-25-120、CM Dextranomer C-50-120、CM-Cellulose(西格马-阿尔德里奇公司(Sigma-Aldrich))、Macro-Prep CM(美国伯乐公司(BioRad))、TSKgel CM-2SW、TSKgel CM-3SW、TSKgel CM-5PW(日本东曹达公司(Tosoh))、CM32、CM52(英国沃特曼公司(Whatman))以及Fractogel EMD COO-(M)(EMD生物科学公司(EMDBiosciences))。
所属领域的技术人员将认识到,多种阳离子交换树脂适用于从再折叠的溶解包涵体制剂中最初捕获OAS蛋白。适当的阳离子交换树脂官能团的实施例包括:甲基磺酸酯基(methyl sulfonate)、磺丙基、羧基甲基、磺酸、碳酸以及羧酸。也可使用由脱氧核糖核酸或核糖核酸官能团衍生的亲和树脂来实施本发明。也使用烟酰胺染料柱来实施本发明。所属领域的技术人员将认识到,多种柱负荷条件和流速适用于多种工业规模和应用。
其它实施例包括使用切向流过滤、透滤、透析或凝胶过滤来进行缓冲液交换和浓缩。可由用例如硫酸铵进行选择性沉淀来代替一个或一个以上柱步骤。
在一个实施例中,可改变缓冲液和缓冲条件(包括缓冲液pH值)来改进柱结合能力和效率。也可改变缓冲液pH值来改进从捕获柱进行洗脱的动力学。柱负荷、洗涤和洗脱溶液中使用下列缓冲液组分:ACES、咪唑、磷酸盐、MOPS、TES、三乙醇胺、HEPES、TRIS、Tricine、TAPS、2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇、二乙醇胺、硼酸以及乙醇胺。使用多种浓度和多种pH值的缓冲液,所述浓度诸如1mM、5mM、10mM、约25mM、约50mM、约100mM、约200mM,所述pH值诸如小于5.0、约5.0、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0,诸如约8.2、约8.5、约8.7、约9.0、约9.2、约9.5、约10、约10.5、约11、约11.5、约12、约12.5和以上。可稀释再折叠溶液以降低电导率和改进柱结合。
加入清洁剂以阻止OAS蛋白聚集和限制非特异性蛋白质与柱基质的相互作用。预想多种清洁添加剂作为柱负荷、洗涤和洗脱溶液的组分,所述清洁添加剂包括(但不限于)Nonidet P-40、Tween-80Tween-20Triton-X100Triton-X114Emulgens、Lubrol、洋地黄皂苷、辛基葡糖苷、溶血卵磷脂、CHAPSCHAPSO两性清洁剂、胆酸盐、脱氧胆酸盐、十六烷基三甲基溴化铵、N-月桂基肌氨酸、聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯80、泊洛尼克F-68、皂角苷、聚山梨酸酯40、月桂基二甲基胺氧化物、3-(癸基二甲基铵)丙烷磺酸内盐(SB3-10)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、3-(1-吡啶基)-1-丙烷磺酸盐(NDSB 201)、氨基磺基甜菜碱-16(ASB-16)和十二烷基硫酸盐,其浓度例如为约0.001%w/v、约0.01%w/v、0.02%w/v、约0.05%w/v、0.1%w/v、0.2%w/v、0.3%w/v、0.4%w/v、0.5%w/v、约1%w/v、约2%w/v、2%w/v以上。
使用还原剂来阻止非特异性双硫键的形成。柱负荷、洗涤和洗脱缓冲液含有多种还原剂中的任一种,所述还原剂包括(但不限于)DTT、DTE、2-巯基乙醇、2-3-二巯基丙醇、TBP、TCEP、巯基乙酸盐、谷胱甘肽和半胱氨酸,其浓度介于0.5mM与150mM之间,诸如0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM、约5mM、约10mM、约25mM、约50mM、约100mM、约150mM。
使用盐来限制非特异性蛋白质-蛋白质相互作用、阻止蛋白聚集和实现从阳离子交换树脂进行柱洗脱;通常所使用的盐包括:氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、氯化锰、硫酸镁、硫酸钠、溴化钠、乙酸钠、硫酸钙、氯化锂、碘化钠、高氯酸钠、硫氰酸钠和硫酸铵,其浓度为约10mM、约25mM、约50mM、约75mM、约100mM、约200mM、约300mM、约500mM、约700mM、约1M、约2M、约3M。低浓度的离液剂起到类似作用。柱洗涤和洗脱缓冲液中还包括如本说明书中其它部分所描述的螯合剂和稳定剂。预想各种组合和浓度的螯合剂和稳定剂作为柱洗涤和洗脱缓冲液的组分。
接着,使用疏水性相互作用色谱(HIC)来纯化OAS蛋白,从而使其不含大肠杆菌宿主细胞污染物。HIC是去除细菌内毒素和其它致热原的有效方法。在一个例示性实施例中,在从最初的阳离子交换捕获柱洗脱含OAS蛋白的洗脱份后,汇集各洗脱份且用50mM NaH2PO4、300mM NaCl、20%甘油、1mM EDTA、2mM DTT(pH 6.8)进行1∶1稀释,并将其调节到最终浓度为1M硫酸铵。以不超过7.5mg/mL树脂的蛋白质密度将OAS洗脱份装载到Phenyl HP HIC柱上。用三个柱体积的50mM NaH2PO4、300mMNaCl、1M(NH4)2SO4、1mM EDTA、20%甘油、2mM DTT的溶液(pH 6.8)洗涤柱,接着用三个柱体积的40%下列缓冲液的分级梯度洗涤:50mM NaH2PO4、300mM NaCl、20%甘油、1mM EDTA、2mM DTT(pH 6.8)。通过三个柱体积的85%下列缓冲液的分级梯度来洗脱含OAS蛋白的洗脱份:50mM NaH2PO4、300mM NaCl、20%甘油、1mMEDTA、2mM DTT(pH 6.8)。
所属领域的技术人员将认识到,多种柱体积和梯度功能在HIC之后将实现相同水平的OAS蛋白纯度。所属领域的技术人员将进一步认识到,多种盐和盐浓度适用于柱负荷、洗涤和洗脱,在所有洗涤和洗脱步骤中重要之处在于降低电导率。
在一个实施例中,使用丁基、丁基S、辛基或苯基衍生的HIC柱来进行OAS捕获和洗脱。由一种或一种以上如本说明书中其它部分所描述的在多种适当浓度和pH值下的盐、缓冲液、稳定剂、清洁剂、还原剂和螯合剂有效地调配柱负荷、洗涤和洗脱缓冲液。
在HIC捕获和洗脱之后,使含OAS蛋白的洗脱份经受阴离子交换色谱以去除大肠杆菌宿主细胞污染性致热原和核酸。用包含10mM NaH2PO4、20%甘油、1mM EDTA、2mM DTT的溶液(pH 8)1∶5稀释含OAS的洗脱份。通过加入HCl将所得溶液的pH值调节到8.0。以1.5毫升/分钟的速率将pH值经调节的样品装载到二乙基氨基乙基(DEAE)FF柱上,且然后用五个柱体积的包含10mM NaH2PO4、20%甘油、1mM EDTA、2mM DTT的溶液(pH 8)洗涤。可见OAS蛋白流过柱。所述步骤将内毒素污染减小到1EU/mL以下。
所属领域的技术人员将认识到,可用其它阴离子交换树脂来代替DEAE,包括(但不限于)由季铵基和二乙基氨基丙基衍生的阴离子交换树脂。可使用特别用于去除内毒素污染的其它实施例,包括(但不限于)使用多粘菌素B柱。
用一种或一种以上如本说明书中其它部分所描述的在多种适当浓度和pH值下的缓冲液、稳定剂、清洁剂、还原剂和螯合剂有效地调配柱负荷和洗涤缓冲液。
在利用阴离子交换色谱去除内毒素后,通过包括阳离子交换色谱、超滤或切向流过滤的多种方法中的一种来浓缩纯化的OAS蛋白。通过凝胶过滤、切向流过滤/透滤或超滤/透滤来实现缓冲液交换。缓冲液交换、蛋白质浓缩和杀菌产生适于包括在医药组合物中的API。
在一个例示性实施例中,稀释纯化的OAS蛋白直到电导率小于6mS/cm且将pH值调节到6.8。然后,使OAS蛋白与在包含50mM NaH2PO4、25mM NaCl、20%甘油、1mMEDTA、2mM DTT的溶液(pH 6.8)中达到预平衡的阳离子交换柱(诸如HiTrap SP FF柱)结合。用三个柱体积的包含50mM NaH2PO4、25mM NaCl、20%甘油、1mM EDTA、2mM DTT的溶液(pH 6.8)洗涤结合的OAS蛋白且用70%包含50mM NaH2PO4、1MNaCl、30%甘油、2mM DTT、1mM EDTA的溶液(pH 6.8)的分级梯度洗脱。汇集纯化的OAS洗脱份且使其经受凝胶过滤以利用2毫升/分钟流速和HiTrap脱盐柱进行缓冲液交换。所属领域的技术人员将认识到,多种阳离子交换和凝胶过滤柱中的任一种将适于进行如本说明书中其它部分所描述的蛋白质浓缩和缓冲液交换。在其它实施例中,通过在Amicon聚醚砜10,000膜上进行超滤来浓缩纯化的OAS制剂。可通过透滤进行缓冲液交换。基于API所需的医药组合物来选择最终缓冲液。
纯化的OAS蛋白的例示性赋形剂组分
通过含盐赋形剂使OAS蛋白稳定;在300mM NaCl下稳定的溶液可在150mM NaCl下开始沉淀。出于此原因,赋形剂混合物将有利于这些稳定盐浓度,其可包括(但不限于)氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、氯化锰、硫酸镁、硫酸钠、溴化钠、乙酸钠、硫酸钙、氯化锂、碘化钠、高氯酸钠、硫氰酸钠和硫酸铵。
已证明加入诸如精氨酸或谷氨酰胺等基于氨基酸的赋形剂使纯化的OAS蛋白稳定。加入2%w/v精氨酸使OAS蛋白在3mg/mL下稳定。加入诸如甘油等赋形剂使OAS多肽稳定。举例来说,在一个实施例中,多肽在10%甘油(v/v)下具有1mg/mL的最大浓度;而在40%甘油下,OAS多肽在高达12mg/mL下也是稳定的。已发现诸如蔗糖等二糖在10%w/v下是稳定的;也使用其它二糖,包括(但不限于)麦芽糖和海藻糖。许多稳定剂适于用作赋形剂组分,包括(但不限于)糖和多元醇(例如甘油、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、乳糖、肌醇、甘露糖醇、木糖醇、乙二醇)、表面活性剂(例如Tween-20Tween-80)、多糖(例如环糊精)、中性聚合物(例如聚乙二醇(PEG)-400、PEG-4000、PEG-8000)氨基酸和衍生物(例如精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、甜菜碱、三甲胺-N-氧化物(TAMO)、苯丙氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、组氨酸)、白蛋白(例如牛或人类血清白蛋白)以及大偶极分子。
也使用抗氧化剂和防腐剂来确保存储期间纯化的OAS蛋白的稳定性。包括(但不限于)柠檬酸钠的抗氧化剂可使OAS蛋白的长期存储稳定。包括(但不限于)苯甲醇的防腐剂也可使多肽在存储期间稳定且可用于最终赋形剂混合物中。例示性API静脉内调配物包括(但不限于)10mM柠檬酸钠、270mM氯化钠、7%w/v蔗糖(pH 6.4)。
缓冲液组分
收集含有重组OAS蛋白的细菌细胞和包涵体,洗涤,细胞溶解并使其在多种缓冲液和溶液条件下溶解。此外,多种缓冲液和溶液条件适用于整个制造过程中的各纯化步骤,从而导致产生纯化的API。在不受本发明方法的概论限制的情况下,本文中所揭示的方法包括(但不限于)使用所属领域的技术人员已知或下文进一步例示的替代缓冲液、添加剂和试剂。
使用各种pKa值的缓冲液来缓冲溶液,所述缓冲液包括ACES、咪唑、磷酸盐、MOPS、TES、三乙醇胺、HEPES、TRIS、Tricine、TAPS、2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇、二乙醇胺、硼酸以及乙醇胺。使用多种浓度和多种pH值的缓冲液,所述浓度诸如1mM、5mM、10mM、约25mM、约50mM、约100mM、约200mM,所述pH值诸如约5.0、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0,诸如约8.2、约8.5、约8.7、约9.0、约9.2、约9.5、约10、约10.5、约11、约11.5、约12、约12.5和以上。
加入盐以使OAS蛋白稳定,所述盐诸如氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、氯化锰、硫酸镁、硫酸钠、溴化钠、乙酸钠、硫酸钙、氯化锂、碘化钠、高氯酸钠、硫氰酸钠以及硫酸铵,其浓度为约10mM、约25mM、约50mM、约75mM、约100mM、约200mM、约300mM、约500mM、约700mM、约1M。使用离液剂来增强再折叠和使OAS蛋白稳定,所述离液剂包括:脲、盐酸胍、硫脲等,其浓度诸如为约0.05M、0.1M、0.25M、0.5M、1.0M、2.0M、3.0M、4.0M、5.0M、6.0M、7.0M,诸如8.0M和以上(包括几乎饱和的溶液)。
加入多种清洁剂以改进OAS蛋白再折叠效率,降低蛋白质聚集和减少OAS蛋白与固体支撑物、树脂、管、容器等的非特异性相互作用。清洁剂还改进OAS蛋白在溶液中的稳定性。例示性清洁添加剂包括Nonidet P-40、Tween-80Tween-20Triton-X100Triton-X114Emulgens、Lubrol、洋地黄皂苷、辛基葡糖苷、溶血卵磷脂、CHAPSCHAPSO两性洗涤剂、胆酸盐、脱氧胆酸盐、十六烷基三甲基溴化铵、N-月桂基肌氨酸、聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯80、泊洛尼克F-68、皂角苷、聚山梨酸酯40、月桂基二甲基胺氧化物、3-(癸基二甲基铵)丙烷磺酸内盐(SB3-10)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、3-(1-吡啶基)-1-丙烷磺酸盐(NDSB 201)、氨基磺基甜菜碱-16(ASB-16)和十二烷基硫酸盐,其浓度例如为约0.01%、约0.02%、约0.05%、约0.07%、0.1%w/v、0.2%w/v、0.3%w/v、0.4%w/v、0.5%w/v、约1%w/v、约5%w/v、约10%w/v、10%w/v以上。
在其它特定实施例中,加入螯合剂,诸如柠檬酸盐、乙二胺四乙酸(EDTA)和乙二醇四乙酸(EGTA),其浓度介于1mM与20mM之间,例如2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约10mM、约15mM,诸如约17mM。螯合剂增加硫醇还原剂的半衰期。整个制造过程中可加入稳定剂以使OAS蛋白稳定,所述稳定剂包括糖和多元醇(例如甘油、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、乳糖、肌醇、甘露糖醇、木糖醇、乙二醇)、多糖(例如环糊精)、中性聚合物(例如聚乙二醇(PEG)-400、PEG-4000、PEG-8000)氨基酸和衍生物(例如精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、甜菜碱、三甲胺-N-氧化物(TAMO)、苯丙氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、组氨酸)、白蛋白(例如牛或人类血清白蛋白)以及大偶极分子。
加入硫醇保护剂或还原剂以阻止错误双硫键形成和裂解包涵体内的不适当双硫键,所述硫醇保护基包括二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、2-巯基乙醇、2-3-二巯基丙醇、三丁基膦(TBP)、三-羧基乙基膦(TCEP)、巯基乙酸盐、谷胱甘肽和半胱氨酸,其浓度介于0.5mM与100mM之间,诸如1mM、约5mM、约10mM、约25mM、约50mM、约100mM。
例示性制造过程验证方法
可利用许多生物化学方法来验证根据本说明书制造的过程中和最后阶段纯化的OAS蛋白的纯度和活性。分析方法包括(但不限于)下列方法:定量蛋白质浓度、测量蛋白质纯度、测量诸如内毒素等污染物、测量酶促活性(比活性)和测量抗病毒效价。
定量蛋白质浓度
通过所属领域的技术人员已知的各种测定来测量过程中和纯化的OAS蛋白的浓度。一个例示性实施例是市面上有售的二辛可宁酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒,诸如来自皮尔斯生物化学公司(Pierce Biochemicals)的还原剂相容性BCA蛋白测定试剂盒(Reducing Agent Compatible BCA Protein Assay Kit)。第二个例示性实施例是280nm波长下的紫外线(UV)光谱学。用6M盐酸胍(GuHCl)稀释过程中和纯化的蛋白质和其适当缓冲液且记录280nm下的吸光度。预想用于测量蛋白质浓度的其它适当的稀释剂。通过将修正吸光度(A280样品-A280背景)乘以适当消光系数来计算以mg/ml计的浓度。
测量蛋白质纯度
通过各种分析方法来测量过程中和纯化的OAS蛋白质的纯度。一个例示性实施例是如图3中所示的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。通过SDS-PAGE来分离过程中或纯化的OAS蛋白且利用任何适当方法进行目测,所述方法包括(但不限于)考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)染色、银染色或用OAS或污染蛋白质的特异性抗体进行western印迹分析。通过所属领域的技术人员已知的标准密度测定技术来比较特异性OAS带和污染带的强度。第二个例示性实施例是利用适当色谱系统的尺寸排阻色谱法(SEC)。举例来说,在尺寸排阻柱上利用FPLC或HPLC色谱系统来分离过程中和纯化的OAS蛋白以确保纯化蛋白质是单体。第三个例示性实施例是电喷雾电离质谱(ESI-MS),其中通过分析柱来分离样品,使其电离且通过质谱仪来检测质荷比。根据不同的质量比电荷信号检测蛋白质制剂中的杂质。蛋白质纯度分析方法的其他实施例包括使用反相和离子交换HPLC。
OAS蛋白活性医药成分的纯度
活性医药成分中的OAS蛋白具有如在与无其它蛋白质带的可见污染的参考标准相同的位置处迁移的单一观察带的SDS-PAGE所测量的纯度。进一步通过反相(RP)HPLC测量纯度。OAS API具有70%、约71%、约72%、73%、74%、75%、约78%、约80%、81%、82%、83%、约85%、约87%、约90%、约92%、93%、94%、约95%、95%以上的RP-HPLC纯度。进一步通过离子交换(IEX)HPLC测量纯度。OAS API具有70%、约71%、约72%、73%、74%、75%、约78%、约80%、81%、82%、83%、约85%、约87%、约90%、约92%、93%、94%、约95%、95%以上的IEX-HPLC纯度。OAS蛋白API中的内毒素含量小于20EU/mg、19EU/mg、18EU/mg、17EU/mg、约15EU/mg、14EU/mg、13EU/mg、约12EU/mg、约10EU/mg、约8EU/mg、小于约5EU/mg、约4EU/mg、3EU/mg、2EU/mg、小于1EU/mg或小于测定的检测极限,以致每剂量API剂量向人类个体投与的总内毒素负荷不超过每小时每公斤5EU。OAS蛋白API中的生物负荷含量小于100个集落形成单位(CFU)/毫升、小于80CFU/ml、小于约50CFU/ml、小于25CFU/mL、小于10CFU/mL、小于约5EU/mL、小于约1EU/mL或小于测定的检测极限。
OAS蛋白API中的宿主细胞DNA污染小于500pg/mg、小于约200pg/mg、小于约150pg/mg、小于约100pg/mg、小于约80pg/mg、小于约60pg/mg、小于约40pg/mg、小于约20pg/mg、小于约10pg/mg、9pg/mg、8pg/mg、7pg/mg、6pg/mg、小于5pg/mg或小于测定的检测极限。OAS蛋白API中的宿主细胞蛋白质污染小于250ng/mg、小于约150ng/mg、小于约100ng/mg、小于约80ng/mg、小于约60ng/mg、小于约40ng/mg、小于约20ng/mg、小于约10ng/mg、9ng/mg、8ng/mg、7ng/mg、6ng/mg、小于5ng/mg或小于测定的检测极限。通过SEC-HPLC所得的API中OAS蛋白质的总量小于总蛋白的10%、小于约9%、小于约7%、小于约5%、小于约2%或小于1%。OAS蛋白API中的抗生素污染小于1000ng/mg、小于约500ng/mg、小于约250ng/mg、小于约100ng/mg或小于测定的检测极限。OAS蛋白API中的IPTG污染小于约250ng/mg、小于约100ng/mg、小于约75ng/mg、小于约50ng/mg、小于约25ng/mg或小于测定的检测极限。
测量污染物
过程中和最终纯化的蛋白质纯度的评定包括测量污染物,所述污染物包括(但不限于)宿主细胞蛋白质和诸如内毒素等致热原。可利用以上部分(测量蛋白质纯度)中所述的相同技术以及标准酶联免疫吸附测定方法来评定其它蛋白质(包括宿主细胞蛋白质)造成的污染。致热原测试的一个例示性实施例是鲎变形细胞溶解物(LimulusAmoebocyte Lysate,LAL)内毒素测定。可利用各种市面上有售的测定试剂盒,其利用经修饰的LAL和合成产色底物来检测内毒素的存在。所属领域的技术人员将认识到,测量所制造的API中的宿主细胞DNA和蛋白质污染、致热原污染和内毒素污染的多种方法普遍用于药品的商业制造中,且本发明不受任何特定方法的使用限制。
测量OAS酶促活性
根据先前公开的方法(杰斯特森·J(Justesen J.)等人,核酸研究(Nuc Acids Res.)8:3073-3085,1980)来测量按照本发明制造的过程中样品和最终纯化的OAS蛋白质的寡腺苷酸合成酶活性。简单来说,用含有20mM Tris-HCl(pH 7.8)、50mM Mg(OAc)2、1mM DTT、0.2mM EDTA、2.5mM ATP、α[32P]ATP、0.5mg/ml BSA和10%甘油的缓冲液中的200μg/ml聚肌苷酸:聚胞苷酸(polyinosinic:polycytidylic acid,聚I:C)激活蛋白质。使反应在37℃下进行30分钟到24小时,且通过加热到90℃历时3分钟使反应终止。将2-4微升反应混合物点样到聚乙烯亚胺PEI-纤维素薄层板(TLC)上。干燥后,用0.4M Tris-HCl、30mM MgCl2(pH 8.7)使板显色。使板干燥并通过磷相仪分析进行目测;代表性TLC图像绘示于图4中。或者,可进一步将反应混合物与0.05U/μl小牛肠道磷酸酶一起培育以去除末端磷酸酯基。利用0.76M KH2PO4(pH 3.6)显色缓冲系统来实现薄层色谱分离。然后,使板干燥并通过磷相仪分析进行目测。
评定酶促活性的方法的第二个例示性实施例是测量通过OAS蛋白由底物β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(β-Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)和dATP对NAD-AMP的催化作用。将不同浓度的蛋白质与2mM NAD、2mM dATP、4mM Tris(pH 7.8)、4mMMg(OAc)2、0.2mM DTT、0.04mM EDTA、0.1mg/ml BSA以及0.05mg/mL聚I:C混合。将样品在37℃下培育20min,且通过在80℃下加热2min或通过反应产物的柱或膜纯化使反应停止。使样品离心并取出等分试样,且用适当流动相缓冲液1∶1稀释。在HPLC上通过C18柱色谱来分离分析物。实例绘示于图6中。使用峰的曲线下面积分析来计算NAD和dATP转化为NAD-AMP产物的转化率。
测量OAS多肽的抗病毒活性
利用多种细胞培养抗病毒测定来证明过程中和最终纯化的OAS蛋白的效价。抗病毒活性的一个例示性实施例是所制造的蛋白质保护所培养的细胞免受由鼠类脑心肌炎病毒(EMCV,ATCC菌株VR-129B)诱导的细胞毒性的能力。以1×104个细胞/孔的密度将人类Huh7肝癌细胞接种到96孔培养板中并在完全培养基(含10%胎牛血清的DMEM)中培育整夜。第二天早晨,用含有0-10μM蛋白质或等量的蛋白质稀释缓冲液的完全培养基更换所述培养基。需要时,加入浓度为100IU/ml的α-干扰素。在病毒感染之前,将细胞预处理2-8小时。预处理后,将含有EMC病毒在完全培养基中的稀释液的等体积培养基加入孔中。
在本文中所述的实验中,每孔加入一系列50-250个空斑形成单位(pfu)。使病毒感染进行整夜(约18小时),且利用任何可利用的细胞生活力或细胞毒性试剂来计算有活力细胞的比例。利用测量有活力细胞中四唑化合物[3-(4,5-二甲基-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑内盐;MTS]向有色甲臜(formazan)化合物的转化的细胞生活力测定来获得本文中所述的结果。在96孔板读取器中在492nm的吸光度下检测MTS向甲臜的转化。直接绘制所得光密度曲线(例如图7)以估算细胞生活力,或通过对照处理的样品使所得光密度归一化,从而计算处理后有活力细胞的百分比。
其它活体外病毒感染模型包括(但不限于)诸如HCV、牛腹泻病毒、西尼罗病毒(WestNile Virus)和GBV-C病毒等黄病毒;和诸如呼吸道合胞病毒等其它RNA病毒;和HCV复制系统(例如布莱特·K·J(Blight,K.J.)等人,2002.病毒学杂志(J.Virology),76:13001-13014)。抗病毒测定中可利用任何能够胜任病毒复制的适当培养细胞。
实例
实例1
适用于实施本发明的例示性多核苷酸
图8的序列(SEQ ID NO:1-8)所描述的各多核苷酸都适用于实施本发明。具体来说,这些多核苷酸编码作为本发明过程的有效产物的OAS1型变异多肽。举例来说,将这些多核苷酸各自用作用于在合适表达系统中表达所需多肽或蛋白质的表达载体(其构筑是如本发明的其它部分所描述和/或为所属领域的技术人员所知)的组分。
实例2
通过实施本发明所产生的例示性多肽
图9的序列(SEQ ID NO:9-16)所描述的各多肽都是通过实施本发明所获得的有效产物。这些多肽是OAS1型变异体,即一类本身具有如本发明的其它部分所描述的效用且因此证明本发明的效用的蛋白质。
实例3
制造过程的例示性色谱图
制造过程的步骤4-8的代表性色谱图绘示于图2的图A-E中。对于各柱,在蛋白质洗脱份收集期间监测280nm下的紫外线(UV)吸光度。图(A)绘示过程步骤4(再折叠蛋白质的最初捕获)期间所观察到的典型峰的实例。在这一实例中,OAS蛋白的捕获在HiTrap肝素柱上发生。在室温下,以50mM NaH2PO4、25mM NaCl、10%甘油、1mM EDTA、0.01%Tween-202mM DTT(pH 6.8)将纯度为约20%的再折叠包涵体制剂装载到肝素柱上。利用由50mM NaH2PO4、25mM NaCl、10%甘油、1mM EDTA、0.01%Tween-202mM DTT组成的缓冲液(pH 6.8)到100%由50mM NaH2PO4、1MNaCl、30%甘油、2mM DTT、1mM EDTA组成的缓冲液(pH 6.8)的梯度洗脱蛋白质,且收集峰洗脱份。
在步骤5中,利用疏水性相互作用柱(HIC)纯化来去除内毒素并进一步纯化蛋白质。图(B)绘示过程的步骤5的代表性色谱图。在这一实例中,用由50mM NaH2PO4、300mM NaCl、20%甘油、1mM EDTA、2mM DTT组成的缓冲液(pH 6.8)1∶1稀释肝素柱纯化步骤的汇集洗脱份。将经稀释的蛋白质调节到1M(NH4)2SO4并装载到PhenylFF HP柱上。用由50mM NaH2PO4、300mM NaCl、20%甘油、1mM EDTA、2mM DTT、1M(NH4)2SO4组成的缓冲液(pH 6.8)洗涤柱。用下列三个分级梯度洗脱蛋白质:(i)40%由50mM NaH2PO4、300mM NaCl、20%甘油、2mM DTT、1mM EDTA组成的缓冲液,pH 6.8;(ii)85%由50mM NaH2PO4、300mM NaCl、20%甘油、2mM DTT、1mMEDTA组成的缓冲液,pH 6.8;和(iii)100%由50mM NaH2PO4、300mM NaCl、20%甘油、2mM DTT、1mM EDTA组成的缓冲液,pH 6.8。
本文中所述的过程的步骤6利用阴离子交换色谱来去除污染性致热原。阴离子交换色谱的代表性色谱图绘示于图2的图(C)中。在这一实例中,OAS的阴离子交换色谱利用DEAE柱且允许流过柱色谱以去除内毒素(致热原)。用由10mM NaH2PO4、20%甘油、2mM DTT、1mM EDTA组成的缓冲液(pH 8)稀释(1∶5)汇集的HIC洗脱份且以相同缓冲液将其装载到柱上。将蛋白质收集在流过的洗脱份中。用100%由50mMNaH2PO4、1M NaCl、30%甘油、2mM DTT组成的缓冲液(pH 6.8)的分级梯度洗涤柱。
本文中所述的过程的步骤7提供通过阳离子交换色谱、超滤或其它等效方法浓缩OAS蛋白。在这一实例中,使用阳离子交换色谱来浓缩蛋白质溶液;峰洗脱份的代表性色谱图绘示于图2的图(D)中。用10mM NaH2PO4、20%甘油、2mm DTT、1mM EDTA(pH 6.8)稀释(1∶1)汇集的阴离子交换洗脱份,并将其装载到HiTrap SPFF阳离子交换柱上。利用70%由50mM NaH2PO4、1M NaCl、30%甘油、2mM DTT、1mM EDTA组成的缓冲液(pH 6.8)的分级梯度洗脱蛋白质。
图(E)绘示OAS纯化过程的步骤8(凝胶过滤以将蛋白质交换到期望缓冲液中)的实例。将阳离子交换色谱步骤的洗脱份装载到凝胶过滤柱上,并将其交换到由50mMNaH2PO4、300mM NaCl、25%甘油、1mM EDTA、2mM DTT组成的缓冲液(pH 6.8)中。
实例4
过程中制造样品的电泳分析
图3提供由本说明中所描述的制造过程产生的OAS蛋白的纯化实例。通过SDS-PAGE凝胶电泳和SimplyBlueTM SafeStain(英杰公司(Invitrogen Corporation))目测(与考马斯亮蓝目测等效)分析各纯化阶段OAS的表达和纯度。各图中用箭头指示代表OAS的带。如本说明书中所述进行发酵、包涵体制备和纯化。(A)表达OAS的大肠杆菌的发酵在细胞糊状物中产生明显的蛋白质带(总细胞蛋白质的约10%)。(B)在制造过程的步骤2中包涵体的纯化和溶解证明OAS明显富集到包涵体中。(C)步骤8中OAS的最后纯化产生实质上纯的蛋白质产物。
实例5
测量过程中和实质上纯的OAS蛋白质样品的比活性
本说明书中所描述的制造过程使得产生高活性蛋白质。图4和表1提供用于测量各种过程中和最终API OAS蛋白样品的比活性的OAS活性测定的实例(表1)。图4代表当利用放射性测定来评定OAS活性时所获得的典型结果。将不同浓度的OAS混合到4mM Tris-HCl(pH 7.8)、10mM Mg(OAc)2、2.5mM ATP、200μg/ml聚I:C、0.1mg/ml BSA、2%甘油、0.2mM DTT、0.04M EDTA和α[32P]ATP中,并在37℃下培育30min。煮沸样品以使酶促反应停止且将4微升施加到PEI板上以进行薄层色谱。使板在0.4mMTris-HCl(pH 8.65)、30mM MgCl2中显色,并利用磷相仪进行分析。结果以每毫克OAS蛋白每分钟并入的ATP的纳摩尔数表示。在这一实例中,代表由50ng、25ng、40ng、20ng、0ng(空白)和阳性对照(1μg)蛋白质形成寡腺苷酸。图像上指示代表未并入的ATP和寡腺苷酸二聚物、三聚物、四聚物和五聚物的点。
表1绘示制造过程的不同步骤的OAS的代表性比活性,从而证明活性一致性。在制造过程中的所指示步骤后收集蛋白质的等分试样,并在多种浓度下测试以确定比活性。在这一实例中,最终纯化产物具有每毫克蛋白质每分钟并入17.6纳摩尔ATP的比活性。
表1
过程中和纯化的OAS蛋白的例示性比活性
实例6
影响OAS蛋白再折叠效率的参数
图5描述改变条件对OAS再折叠效率的影响。图5证明不同缓冲液、还原剂、pH值、时间和温度对再折叠效率和随后的蛋白质的比活性的影响。视所测试的再折叠条件而定,再折叠包涵体制剂的比活性的显著差异是显而易见的。
图(A)绘示在一组经设计以测试时间、清洁剂、盐或精氨酸浓度对再折叠的影响的缓冲液中再折叠的蛋白质的比活性。将包涵体溶解于50mM NaH2PO4、6M盐酸胍、100mM DTT(pH 8)中。通过在室温下脉冲稀释到再折叠缓冲液的搅拌溶液中将蛋白质再折叠。所测试的再折叠缓冲液包括加入:条件1:50mM NaH2PO4(pH 6.8)、10%甘油、1.2mM DTT、1%Tween-2025mM NaCl;条件2:50mM NaH2PO4(pH 6.8)、10%甘油、1.2mM DTT、0.5%Tween-2025mM NaCl;条件3:50mM NaH2PO4(pH6.8)、10%甘油、1.2mM DTT、0.5%Tween-20500mM NaCl;和条件4:50mM NaH2PO4(pH 6.8)、10%甘油、1.2mM DTT、0.5%Tween-20500mM NaCl、300mM精氨酸。0分钟、10分钟、1小时、4小时和16小时后,测试50ng再折叠蛋白质的OAS活性。在这一实验中,条件2-4产生比条件1稍多的活性蛋白质。
图(B)绘示一组独立进行以测试时间、还原剂、pH值、温度、牛血清白蛋白(BSA)的存在和盐酸胍的存在对再折叠的影响的实验的结果。4小时、16小时和40小时后,测量再折叠蛋白质的比活性。所使用的再折叠条件包括:
条件1:将溶解的包涵体溶液加入50mM NaH2PO4(pH 6.8)、10%甘油、1mM EDTA、0.05%Tween-20、0.3M NaCl、20mM DTT中,并在室温下旋转。4小时后,再添加DTT到20mM。
条件2:将溶解的包涵体溶液加入50mM NaH2PO4(pH 6.8)、10%甘油、1mM EDTA、0.05%Tween-20、0.3M NaCl、1.8μM 2-巯基乙醇(BME)中,并在室温下旋转。4小时后,再添加BME到5mM。
条件3:在冰上冷却20mM NaH2PO4(pH 6.8)、10%甘油、1mM EDTA、0.05%Tween-20、0.3M NaCl、20mM DTT的溶液1小时。然后,将溶解的包涵体溶液加入冷溶液中并在4℃下旋转最初16小时。然后,在室温下将溶液从16小时旋转到40小时。4小时后,再添加DTT到20mM。
条件4:将溶解的包涵体溶液加入20mM NaH2PO4(pH 8.0)、10%甘油、1mM EDTA、0.05%Tween-20、0.3M NaCl、20mM DTT中,并在室温下旋转。4小时后,再添加DTT到50mM。
条件5:将溶解的包涵体溶液加入20mM NaH2PO4、10%甘油、1mM EDTA、0.05%Tween-20、0.3M GuHCl、20mM DTT中,并在室温下旋转。4小时后,再添加DTT到50mM。
条件6:将溶解的包涵体溶液加入50mM NaH2PO4(pH 6.8)、10%甘油、1mM EDTA、0.05%Tween-20、0.3M NaCl、50mM DTT、0.01%BSA中,并在室温下旋转。4小时后,再添加DTT到50mM。
实例7
测量OAS比活性的基于HPLC的例示性测定
图6绘示NAD-dATP测定的样品HPLC色谱图,证明由通过本说明书的方法纯化的OAS蛋白产生NAD-AMP。将不同浓度的蛋白质与2mM NAD、2mM dATP、4mM Tris(pH 7.8)、4mM Mg(OAc)2、0.2mM DTT、0.04mM EDTA、0.1mg/ml BSA以及0.05mg/ml聚I:C混合。将样品在37℃下培育20min且通过在80℃下加热2min使反应停止。使样品离心并取出等分试样,且用流动相缓冲液1∶1稀释。关于HPLC分析,在由50mMNH4H2PO4(pH 7)组成的流动相中利用1.5ml/min的流速将10微升稀释样品装载到Supelco Ascentis C18柱上。用5-60%MeOH∶水(1∶1)(v/v)的梯度洗脱分析物。使用峰的曲线下面积分析来计算NAD-AMP产物转化率。dATP、NAD和NAD-AMP分别在6.435min、8.622min和9.511min时洗脱。
实例8
测量OAS蛋白抗病毒活性的例示性方法
利用本说明书中所描述的方法纯化的OAS蛋白是抗病毒的。图7绘示在评定纯化的OAS蛋白的抗病毒效价后所获得的典型结果。用指示剂量的OAS蛋白或等效赋形剂(exc.)浓度预处理单层(约85%长满)Huh7人类肝癌细胞,历时8小时。8小时后,向孔中加入含有0(模拟物)、50或250个空斑形成单位(plaque forming unit,pfu)的细胞病变鼠类脑心肌炎病毒(EMCV)的培养基。使病毒感染进行18小时。利用在有活力细胞中使四唑化合物[3-(4,5-二甲基-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑内盐;MTS]转化为有色甲臜化合物来测量EMCV诱导的细胞病变效应的救援。在96孔板读取器中在492nm下检测MTS向甲臜的转化,且直接绘制所得光密度曲线以估算细胞生活力(O.D.越高指示有活力细胞越多)。
实例9
测量OAS比活性的第二个基于HPLC的例示性测定
将不同浓度的蛋白质与2.5mM NAD、2.5mM dATP、20mM Tris(pH 7.8)、25mMMg(OAc)2、2mM DTT、1mM EDTA以及0.25mg/ml聚I:C混合。将各样品在37℃下培育20min且通过冷却到4℃历时至少10min使反应停止。使样品离心且取出50微升等分试样用于HPLC分析。将50微升等分试样个别装载到25cm Supelco Ascentis C18柱(5微米珠粒)上以进行HPLC分离。利用0-60%MeOH∶流动相缓冲液(50mMNH4H2PO4,pH 7)(1∶1)(v/v)的非线性梯度,利用1.5ml/min的流速洗脱分析物。在254nm下检测分析物和产物。使用峰的曲线下面积分析来计算NAD-AMP产物转化率。dATP、NAD和NAD-AMP分别在4.1min、4.7min和5.5min时洗脱。
实例10
例示性静脉内调配物
将OAS蛋白调配到适于静脉内投与哺乳动物的包括下列组分的缓冲溶液中:9.9mg/mL OAS蛋白、10mM组氨酸、500mM NaCl、5%甘露糖醇(pH 5.5)。
实例11
例示性OAS蛋白药物GMP释放规格
1非GMP实验室规模药物批次符合或超出GMP规格,证明为稳定的制造方法。
2根据本说明书制造的实验室规模药物批次。
实例12
例示性OAS蛋白药物GMP释放规格2
实例13
由8-100L规模的过程产生的药物(OAS蛋白API)批次的分析测试
实例14
例示性静脉内调配物2
将OAS蛋白调配到适于静脉内投与哺乳动物的包括下列组分的缓冲溶液中:10.8mg/mL OAS蛋白、10mM柠檬酸钠、270mM氯化钠、7%蔗糖(pH 6.4)。
包括特定实施例和实例的上述说明打算说明本发明且不应视为对本发明的限制。在不背离本发明的真正精神和范围的情况下,可实现许多其它变化和修改。所引用的所有专利、专利公开案和非专利公开案都以引用的方式并入本文中。
Claims (10)
1.一种产生寡腺苷酸合成酶(OAS)蛋白的方法,其包含:
a)在表达所述OAS蛋白的条件下在生长培养基中培养含有表达载体的宿主细胞;
b)从所述生长培养基中回收所述宿主细胞;和
c)从所述宿主细胞分离所述OAS蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述OAS蛋白选自由SEQ ID NO:9-16组成的群组。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述表达载体包含选自由SEQ ID NO:1-8组成的群组的多肽。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
5.根据权利要求1所述的方法,其进一步包含评定过程中蛋白质纯度的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述步骤包含酶联免疫吸附测定。
7.根据权利要求5所述的方法,其中所述步骤包含鲎变形细胞溶解物内毒素测定。
8.根据权利要求1所述的方法,其进一步包含评定最终纯化的蛋白质纯度的步骤。
9.一种纯化OAS蛋白的方法,其包含:
a)在表达所述OAS蛋白的条件下在生长培养基中培养含有表达载体的宿主细胞;
b)从所述培养基中回收所述宿主细胞;
c)从所述宿主细胞分离所述OAS蛋白;和
d)利用亲和色谱纯化所述OAS蛋白。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述OAS蛋白包含亲和标签。
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