CN1910293B - 检测与抗病毒感染性有关的基因oas1中的突变的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测与编码OAS1的基因有关的突变的方法。这一突变和其他所揭示的突变与人类对包括C型肝炎的病毒感染的抗性有关。本发明也提供一种由所述突变基因编码的蛋白质或多肽或编码所述蛋白质或多肽的聚核苷酸组成的治疗剂。本发明也提供对人类OASI呈特异性的包括反义寡核苷酸的人类OAS1抑制剂、方法和组合物。

Description

检测与抗病毒感染性有关的基因OAS1中的突变的方法
技术领域
本发明涉及一种用于检测人类寡腺苷酸合成酶基因中的突变的方法及所编码的蛋白质及其抗体的用途，其中突变赋予对黄病毒感染(包括C型肝炎感染)的抗性，且突变与包括前列腺癌和糖尿病的其他病状有关。
背景技术
迄今为止已鉴别许多疾病，其中人类群体中存在天然的感染抗性。Alter和Moyer，J.Acquir.Immune Defic.Syndr.Hum Retrovirol.18增刊1：S6-10(1998)报导在诸如注射药物使用者的高危群组中的C型肝炎病毒感染(HCV)高达90％。然而，尚未有文献确认剩余的10％明显对抗感染的机制为何。在HCV感染中起作用的蛋白质包括2-端、5-端寡腺苷酸合成酶。OAS是干扰素诱导的蛋白质，其特征为能催化2-端、5-端腺苷寡聚物(2-5A)的合成。Hovanessian等人，EMBO 6：1273-1280(1987)发现经干扰素治疗的人类细胞含有数种与40(OAS1)、46(OAS1)、69及100kD的蛋白质对应的OAS。Marie等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.160：580-587(1989)产生高度特异性的抗p69(69-kD OAS)多克隆抗体。通过以抗p69抗体筛检经干扰素治疗的人类细胞表达文库，Marie和Hovanessian，J.Biol.Chem.267：9933-9939(1992)分离出部分OAS2 cDNA。他们以部分cDNA筛检另外的文库并回收编码两个OAS2同功异型物(isoform)的cDNA。较小的同功异型物由两个3-端未转译区长度不同的mRNA编码。
Northern印迹分析揭示OAS2表达为人类细胞中四个由干扰素诱导的mRNA。所预测的OAS2蛋白质具有共同的683-氨基酸序列及不同的3-端末端。根据活体外转录/转译产物的SDS-PAGE，两个同功异型物的分子质量为69和71kD。两个同功异型物在活体外均显示出OAS活性。序列分析表明OAS2含有两个由富含脯氨酸的假定连接子区所分隔的OAS1同源域。N末端及C末端域分别为41％和53％相同于OAS1。
通过荧光原位杂交和通过包含于定位克隆之内，Hovanian等人，Genomics 52：267-277(1998)确定OAS1、OAS2和OAS3基因是由12q24.2上的130-kb区丛集。2-5A结合至降解病毒及细胞RNA的核糖核酸酶I并激活其，从而导致细胞蛋白质合成的抑制和病毒复制的削弱。
被称为OASL的第四种人类OAS基因与OAS1、OAS2和OAS3的不同在于OASL缺乏酶活性。OASL基因编码双域蛋白质，其是由融合至与泛素的串联重复同源的164-氨基酸C末端域的OAS单元组成。(Eskildsen等人，Nuc.Acids Res.31：3166-3173，2003；Kakuta等人，J.Interferon & Cytokine Res.22：981-993，2002)
由于其在抑制病毒复制和病毒感染中的作用，因此此项技术中需要抑制与OAS1活性有关的病毒复制的方法和组合物，包括进一步需要抑制HCV复制的基于抑制剂的疗法。
发明内容
本发明涉及检测与C型肝炎抗性有关的突变，所述突变的特征在于其为寡腺苷酸合成酶1基因中的点突变。
在一实施例中，涵盖一种人类基因筛检方法。所述方法包含对分离自人类的核酸样本分析寡腺苷酸合成酶1基因点突变的存在，所述点突变的特征为在根据Genbank序列登记号第NT_009775.13号(连续核苷酸2,130,000-2,157,999，其以SEQ ID NO：19显示于图2中)的寡腺苷酸合成酶1基因(OAS1)的2135728、2135749、2135978、2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、2144985、2156523或2156638核苷酸位置处的碱基取代或在2156595核苷酸位置处的碱基缺失。
在一优选实施例中，所述方法包含于扩增条件下以聚合酶链式反应(PCR)引物对处理来自人类的基因组DNA样本，以扩增含有寡腺苷酸合成酶1基因NT_009775.13的2135728、2135749、2135978、2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、2144985、2156523、2156595或2156638核苷酸位置的人类基因组DNA区。PCR处理产生含有所述区的扩增产物，然后分析其点突变的存在。
在另一实施例中，本发明提供一种由在NT_009775.13的2135728、2135749、2135978、2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、2144985、2156523、2156595或2156638位置处具有至少一个突变的基因所编码的蛋白质，和所述蛋白质用以制备抗病毒感染、优选为黄病毒感染、最优选为C型肝炎感染用的诊断剂的用途。在特定实施例中，所述诊断剂为抗体。
在另一实施例中，本发明提供一种用于预防或抑制病毒感染、优选为黄病毒感染、最优选为C型肝炎病毒感染的治疗化合物，其中所述治疗化合物为由在NT_009775.13的2135728、2135749、2135978、2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、2144985、2156523、2156595或2156638位置处具有至少一个突变的OAS1基因所编码的蛋白质。在其他实施例中，所述治疗化合物为编码蛋白质的聚核苷酸，诸如DNA或RNA。
在另一实施例中，本发明提供一种用于预防或抑制病毒感染、优选为黄病毒感染、最优选为C型肝炎病毒感染的治疗化合物，其中所述治疗化合物为具有以下序列的蛋白质：SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47和/或SEQ ID NO：48。
在另一实施例中，本发明提供一种用于预防或抑制病毒感染、优选为黄病毒感染、最优选为C型肝炎病毒感染的治疗化合物，其中所述治疗化合物模拟在NT_009775.13的2135728、2135749、2135978、2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、2144985、2156523、2156595或2156638位置处的至少一个突变的有利作用。所述治疗化合物可为小分子、蛋白质、肽、DNA或RNA分子或抗体。
在另一实施例中，本发明提供一种用于预防或治疗癌症、优选为前列腺癌的治疗化合物，其中所述治疗化合物为由在NT_009775.13的2135728、2135749、2135978、2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、2144985、2156523、2156595或2156638位置处具有至少一个突变的OAS1基因所编码的蛋白质。在其他实施例中，所述治疗化合物为编码蛋白质的聚核苷酸，诸如DNA或RNA。
在另一实施例中，本发明提供一种用于预防或治疗癌症、优选为前列腺癌的治疗化合物，其中所述治疗化合物为具有以下序列的蛋白质：SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ IDNO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID N0：46、SEQ ID NO：47和/或SEQ ID NO：48。
在另一实施例中，本发明提供一种用于预防或治疗癌症、优选为前列腺癌的治疗化合物，其中所述治疗化合模拟在NT_009775.13的2135728、2135749、2135978、2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、2144985、2156523、2156595或2156638位置处的至少一个突变的有利作用。所述治疗化合物可为小分子、蛋白质、肽、DNA或RNA分子或抗体。
在其他实施例中，所述治疗化合物能够抑制OAS1或整个蛋白质的至少一个子区或子功能的活性，且所述化合物的代表为能特异性结合至OAS1聚核苷酸的反义分子、核酶和RNAi分子，以及能特异性结合至OAS1蛋白质和多肽的抗体及其片段。
在另一实施例中，本发明提供OAS1的抑制剂。本发明的抑制剂包括(但不限于)反义分子、核酶、RNAi、抗体或抗体片段、蛋白质或多肽以及小分子。例示性反义分子包含SEQ ID NO：19的至少10、15或20个连续核苷酸，或是在严格条件下杂交至SEQID NO：19的聚核苷酸的反义分子。更优选的是包含SEQ ID NO：19的至少25个连续核苷酸或在严格条件下杂交至SEQ ID NO：19的序列的反义分子。
在另一实施例中，设想OAS1的抑制剂特异性结合至由SEQ ID NO：30的多肽所界定的蛋白质区。本发明的抑制剂包括(但不限于)抗体、抗体片段、小分子、蛋白质或多肽。
在另一实施例中，设想OAS1的抑制剂包含特异性结合或杂交至SEQ ID NO：31的聚核苷酸的反义或RNAi分子。
在另一实施例中，提供包含在医药学上可接受的载剂中的一种或一种以上OAS1抑制剂的组合物。
额外的实施例提供降低OAS1基因表达或生物学活性的方法。
额外的实施例提供特异性增加或降低在NT_009775.13的2135728、2135749、2135978、2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、2144985、2156523、2156595或2156638位置处具有至少一个突变的OAS1基因的某些形式的表达的方法。
本发明提供包含至少一个经修饰的核苷间键合的反义寡核苷酸。
本发明进一步提供具有硫代磷酸酯键合的反义寡核苷酸。
本发明又进一步提供包含至少一个经修饰的糖部分的反义寡核苷酸。
本发明也提供包含至少一个经修饰的糖部分的反义寡核苷酸，其中所述糖部分为2′-O-甲基糖部分。
本发明进一步提供包含至少一个经修饰的核苷酸碱基的反义寡核苷酸。
本发明又进一步提供具有经修饰的核苷酸碱基的反义寡核苷酸，其中所述经修饰的核苷酸碱基为5-甲基胞嘧啶。
本发明也提供一种反义化合物，其中所述反义化合物为嵌合寡核苷酸。
本发明提供一种抑制人类细胞或组织中人类OAS1的表达的方法，其包含使活体内细胞或组织与靶向于编码人类OAS1的核酸分子的长度为8至35个核苷酸的反义化合物或核酶接触，从而抑制人类OAS1的表达。
本发明进一步提供一种使用反义或RNAi化合物或核酶降低或增加活体内OAS1的特定形式的表达的方法，所述形式是由在NT 009775.13的2135728、2135749、2135978、2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、2144985、2156523、2156595或2156638位置处具有至少一个突变来界定。
本发明进一步提供一种调节癌细胞生长的方法，其包含使活体内癌细胞与靶向于编码人类OAS1的核酸分子的长度为8至35个核苷酸的反义化合物或核酶接触，从而抑制人类OAS1的表达。
本发明又进一步提供鉴别OAS1聚核苷酸的目标区。本发明也提供用于通过原位杂交鉴别OAS1聚核苷酸的经标记的探针。
本发明提供根据本发明的OAS1抑制剂用以制备预防或抑制HCV感染用的药剂的用途。
本发明进一步提供使OAS1抑制剂针对OAS1蛋白质的特定区或所述蛋白质的特定功能。
本发明也提供一种用于抑制OAS1表达的医药组合物，其包含本发明的反义寡核苷酸与生理学上可接受的载剂或稀释剂的混合物。
本发明进一步提供能特异性裂解OAS1 RNA的核酶和包含所述核酶的医药组合物。
本发明也提供OAS1的小分子抑制剂，其中所述抑制剂能降低OAS1的活性或能降低或阻碍OAS1 mRNA的表达。
本发明进一步提供除修饰2′-5′寡腺苷酸的合成外还修饰蛋白质的特定功能的OAS1抑制剂，所述功能包括与诸如C型肝炎病毒NS5 A蛋白的其他蛋白质的相互作用。
本发明进一步提供改变包括(但不限于)糖基化和磷酸化作用的OAS1转译后修饰的化合物。本发明进一步提供用于鉴别寡腺苷酸合成酶基因突变的人类基因筛检方法，其包含：(a)于扩增条件下以聚合酶链式反应(PCR)引物对处理来自人类的基因组DNA样本，以扩增含有寡腺苷酸合成酶基因的2135728、2135749、2135978、2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、2144985、2156523、2156595或2156638核苷酸位置的人类基因组DNA区，所述处理产生含有所述区的扩增产物；及(b)检测步骤(a)的扩增产物中在2135728、2135749、2135978、2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、2144985、2156523、2156595或2156638核苷酸位置处的核苷酸点突变的存在，从而鉴别所述突变。
在此方法的某些实施例中，所述区包含以选自由SEQ ID NO：1-7及SEQ IDNO：57-64组成的群组的序列所代表的核苷酸序列。在其他实施例中，所述区基本上由选自由SEQ ID NO：1-7及SEQ ID NO：57-64组成的群组的核苷酸序列组成。本发明也提供一种检测方法，其中所述检测包含在杂交条件下以对点突变特异的寡核苷酸探针处理以上步骤(a)的扩增产物，并检测杂交产物的形成。在所述方法的某些实施例中，寡核苷酸探针包含选自由SEQ ID NO：12-18组成的群组的核苷酸序列。
本发明也涉及在人类中检测含有点突变的C型肝炎感染抗性疾病等位基因的方法，所述点突变包含在寡腺苷酸合成酶基因(OAS1)的2135728、2135749、2135978、2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、2144985、2156523、2156595或2156638核苷酸位置处以非野生型核苷酸取代野生型核苷酸，所述方法包含：(a)通过将来自所述人类的基因组DNA样本与选自由SEQ ID NO：8及9和SEQ ID NO：10及11组成的群组的寡腺苷酸合成酶基因特异性PCR引物对在PCR缓冲液中组合而形成聚合酶链式反应(PCR)混合物；(b)使PCR混合物经受多个PCR热循环以产生寡腺苷酸合成酶基因扩增产物；和(c)在杂交条件下以选自由SEQ ID NO：12-18组成的群组的探针处理步骤(b)中所产生的产物，从而检测所述突变。
本发明也提供一种经分离的OAS1抑制剂，其是选自由下列各物组成的群组：反义寡核苷酸、核酶、抑制性小RNA(RNAi)、蛋白质、多肽、抗体和小分子。所述经分离的抑制剂可为包含至少15个SEQ ID NO：19序列的连续核酸的反义分子或其互补序列。在其他实施例中，所述经分离的OAS1抑制剂(反义分子或其互补序列)在高度严格条件下与SEQ ID NO：19的序列杂交。
所述经分离的OAS1抑制剂可选自由抗体和抗体片段组成的群组。本发明也提供一种组合物，其包含在医药学上可接受的载剂中的治疗有效量的至少一种OAS1抑制剂。
本发明也涉及一种抑制哺乳动物细胞中OAS1表达的方法，其包含向所述细胞投与选自由下列各物组成的群组的OAS1抑制剂：反义寡核苷酸、核酶、蛋白质、RNAi、多肽、抗体和小分子。
本发明进一步涉及一种抑制受检者中OAS1基因表达的方法，其包含向所述受检者投与在医药学上有效的媒剂中的反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸的量可有效地与衍生自所述OAS1基因的经选定目标核酸序列的全部或部分特异性杂交。
本发明又进一步涉及一种预防易受感染的人类受检者中黄病毒感染的方法，其包含向所述人类受检者投与选自由下列各物组成的群组的OAS1抑制剂：反义寡核苷酸、核酶、RNAi、蛋白质、多肽、抗体和小分子，其中所述OAS1抑制剂预防所述黄病毒的感染。
本发明又进一步涉及一种预防或治愈易受感染的人类受检者中黄病毒或其他病毒感染的方法，其包含向所述人类受检者投与选自由下列各物组成的群组的OAS1抑制剂：反义寡核苷酸、核酶、RNAi、蛋白质、多肽、抗体和小分子，其中所述OAS1抑制剂预防所述黄病毒或其他病毒感染且其中所述OAS1抑制剂针对一种或一种以上由在NT_009775.13的2135728、2135749、2135978、2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、2144985、2156523、2156595或2156638位置处的突变所界定的蛋白质的特定形式。
本发明也进一步涉及一种通过投与具有下列序列的多肽中的一者来预防或治愈易受感染的人类受检者中黄病毒或任何其他病毒感染的方法：SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ED NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47和/或SEQ ID NO：48。
本发明也涉及人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的治疗。
本发明又进一步涉及一种预防人类受检者中的胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)的方法，其包含向所述人类受检者投与选自由下列各物组成的群组的OAS 1抑制剂：反义寡核苷酸、核酶、RNAi、蛋白质、多肽、抗体和小分子，其中所述OAS1抑制剂预防IDDM。
本发明又进一步涉及一种预防人类受检者中的IDDM的方法，其包含向所述人类受检者投与选自由下列各物组成的群组的OAS1抑制剂：反义寡核苷酸、核酶、RNAi、蛋白质、多肽、抗体和小分子，其中所述OAS1抑制剂预防IDDM且其中所述OAS1抑制剂针对一种或一种以上由在NT_009775.13的2135728、2135749、2135978、2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、2144985、2156523、2156595或2156638位置处的突变所界定的蛋白质的特定形式。
本发明又进一步涉及一种通过增加OAS1基因表达或通过治疗性投与本文中所揭示的多肽来治疗癌症(诸如前列腺癌)的方法。
本发明也提供一种抑制活体外细胞中OAS1目标基因表达的方法，其包含将足以抑制OAS1目标基因表达的量的核糖核酸(RNA)引入细胞中，其中所述RNA为双股分子，第一股基本上由与OAS1目标基因的核苷酸序列对应的核糖核苷酸序列组成，且第二股基本上由与OAS1目标基因的核苷酸序列互补的核糖核苷酸序列组成，其中第一与第二核糖核苷酸股为互相杂交而形成所述双股分子的独立互补股，且所述双股分子抑制目标基因的表达。
在所述方法的某些实施例中，第一核糖核苷酸序列包含至少20个与OAS1目标基因对应的碱基且第二核糖核苷酸序列包含至少20个与OAS1目标基因的核苷酸序列互补的碱基。在其他实施例中，目标基因表达被抑制至少10％。
在所述方法的其他实施例中，双股核糖核酸结构为长度至少20个碱基且每一核糖核酸链都能特异性地与超过所述至少20个碱基的OAS1目标基因的脱氧核糖核酸链杂交。
本发明提供能恢复可能由于基因突变而减弱或失去的OAS1功能的多肽或蛋白质。在某些实施例中，所述多肽或蛋白质具有由包含SEQ ID NO：19的基因所编码的野生型OAS1的氨基酸序列。在其他实施例中，其中OAS1基因中的突变赋予OAS1蛋白增加的活性、稳定性和/或半衰期或其他使OAS1蛋白更适合于抗病毒活性的变化，由经突变的OAS1基因所编码的蛋白质或多肽是优选的。
任何上述蛋白质和多肽均可作为治疗组合物的组份来提供。
本发明也提供由以下各序列组成的蛋白质中的任一者作为治疗组合物的组份的用途：SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID UNO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：46、SEQ IDNO：47和/或SEQ ID NO：48。
在另一实施例中，编码OAS1蛋白、OAS1突变型蛋白或OAS1多肽的核酸可以基因疗法形式来投与。
附图说明
图1是显示OAS1基因中本发明突变的位置、等位基因变异体(碱基取代)、基因组序列上突变的座标和(若有的话)NCBI dbSNP ID的表。
图2(SEQ ID NO：19)是由在NCBI登记号NT_009775.13的2,130,000-2,157,999位置处的连续核苷酸碱基组成的聚核苷酸序列OAS1。
图3显示SEQ ID NO：20-64。
图4显示高加索群体中OAS1基因内的大致单倍体分布。
图5A及B阐明本发明所揭示的转录物变异体的种类及其与本发明所揭示的突变的关系。图5A显示转录物变异体(TV)形式1-6，且图5B显示TV形式7-10。图5C进一步阐明黑猩猩和大猩猩变异体相对于人类的推测结构。
图6是描述非人类的灵长类相对于人类的OAS1基因的突变和在对应人类基因组序列上的突变座标的表。
图7表明本发明的例示性多肽当自大肠杆菌表达和回收时的酶活性。
图8表明由本发明的聚核苷酸产生的例示性多肽于HeLa细胞中表达时的酶活性。
图9表明本发明的例示性多肽的抗体的显影。
图10是详述例示性蛋白质转导域多肽的表。
具体实施方式
引言和定义
本发明涉及寡腺苷酸合成酶基因的新颖突变、所述突变用于诊断对病毒感染的易感性或抗性的用途、由具有根据本发明的突变的基因所编码的蛋白质和使用所述蛋白质、抗体及相关核酸预防或抑制病毒感染。所述突变与携带者对黄病毒感染、尤其是C型肝炎病毒感染的抗性有关。
许多当前的医学研究集中于鉴别引起或有助于疾病的突变和缺陷。设计所述研究以导致针对病状来治疗的化合物和方法。对于尽管暴露于感染剂及其他危险因素下但仍然使人们保持健康的基因影响的研究则较少关注。本发明表示由发明者所研制的方法的成功应用，由此确定并分析人类受检者的特定群体以便揭示赋予对疾病的抗性的基因变异或突变。对具有对特定疾病或生物学病症的天然抗性的亚群体部分的鉴别使得能进一步鉴别对于药物介入、诊断评估或预防(诸如预防性接种)为适合目标的基因和蛋白质。
本文中所鉴别的亚群体部分包含尽管反复暴露于C型肝炎病毒(HCV)下但是仍保持血清阴性而同类者已受感染(血清阳性)的个体。所研究的群体包括经受反复输血的血友病患者，和通过共用的针及其他危险因素而暴露的静脉内药物使用者。
HCV感染包括一组共同作用以达成一定感染水平的复杂蛋白质和免疫系统组份，当所述感染水平引起疾病时，其可于受感染细胞内发展成病毒的低稳态，从而显然允许HCV逃离宿主免疫监视系统，同时促成病毒持久感染(Dansako等人，Virus Research97：17-30，2003)。本发明集中于这个系统中的一种组份，即可由干扰素诱导的2′-5′-寡腺苷酸合成酶基因，尤其是OAS1。OAS1基因通过激活核糖核酸酶L(RNase L)以裂解病毒RNA而于人类宿主细胞的抗病毒活性方面起主要作用。HCV RNA激活2′-5′-OAS/RNase L途径。如Dansako等人所指出，HCV RNA激活导致病毒RNA裂解的途径可看似矛盾。然而，所述活性可用来保持宿主免疫防御与可杀死宿主的感染水平之间的平衡。
鉴于OAS1基因的这种复杂作用，本发明已确定OAS1基因中的突变与所述突变的携带者中抗HCV感染性之间的强相关性具有显著重要性。现在所述个体的存在可允许阐明尽管反复暴露于感染水平的病毒下但是OAS1仍如何有助于对HCV感染产生抗性。这个信息随后将导致开发用于在缺少天然抗性的个体中复制抗性机制的方法和组合物。
因此，本发明提供：本文中所鉴别的突变无论机制为何均适用于鉴别抗HCV感染的个体。抗性可通过OAS1蛋白的功能丧失来产生，在此情况下预测HCV病毒含量将足够高以阻止病毒自宿主免疫监视系统逃离，从而有利于病毒的破坏。抗性也可通过功能的获得而产生，因为OAS1蛋白含量增加，蛋白质半衰期增加和/或蛋白质结构以增强其激活核糖核酸酶L裂解病毒RNA的能力的方式受影响。抗性也可通过对OAS1蛋白的修饰而产生，所述修饰阻止HCV病毒蛋白或核苷酸对正常OAS1蛋白功能的抑制。抗性也可通过对OAS1蛋白的修饰而产生，所述修饰阻止蛋白与正常HCV病毒寿命所必需的HCV病毒蛋白或核苷酸之间的相互作用。本发明不受限于一种机制。此外，尽管本文中揭示几种不同的点突变，然而这并非想要表明每一突变对于OAS1蛋白结构或功能均具有相同的作用。
OAS1在由HCV为其中一员的黄病毒家族的其他病毒引起的感染方面起作用。黄病毒家族也包括引起黄热病、登革热、圣路易斯脑炎(St.Louis encephalitis)、日本脑炎(Japanese encephalitis)和本文中所揭示的其他病毒疾病的病毒。宿主对于这些病毒的防御包括可由病毒诱导的干扰素。所述干扰素诱导2′-5′-寡腺苷酸合成酶，如上所讨论所述合成酶涉及于RNaseL的活化作用中。RNaseL接着裂解病毒RNA。其他病毒感染可通过本文中所揭示的方法得以预防和/或抑制，包括RSV。
关于详细描述和优选实施例，使用下列定义：
A：腺嘌呤；C：胞嘧啶；G：鸟嘌呤；T：胸腺嘧啶(DNA中)；和U：尿嘧啶(RNA中)
等位基因：特定基因的DNA序列的变异体。二倍体细胞中最多将存在两个等位基因，其各自位于染色体组的同源染色体的相同的相对位置或基因座上。当位于任一基因座上的等位基因相同时，认为就那个基因座而言个体是纯合的，而当其不同时，认为就那个基因座而言个体是杂合的。因为任一基因的不同等位基因可能仅有单个碱基改变，所以任一基因的等位基因的可能数目十分巨大。当等位基因不同时，一个相对于另一个是显性而另一个则被认为是隐性的。显性是表现型的性质且并不意味隐性等位基因由显性基因导致失活。在许多实例中，正常发挥功能(野生型)的等位基因对于所有或多或少缺陷功能的突变型等位基因均呈显性。在所述情况下，一般的解释是两个功能等位基因中的一个足以产生足够活性的基因产物以支持有机体的正常发育(即基因产物的数量通常存在2倍安全限度)。
单倍体：许多可能的多个等位基因中的一者，其通过染色体定位而连续排列，且呈现由染色体组的一个特定同源染色体所携带的等位基因组。
核苷酸：DNA或RNA的单体单元，由糖部分(戊糖)、磷酸酯和含氮杂环碱基组成。碱基与糖部分经由糖苷碳(戊糖的1′碳)连接，且碱基与糖的所述组合为核苷。当核苷含有键结于戊糖的3′或5′位置的磷酸酯基团时，称其为核苷酸。可经由操作连接的核苷酸的序列于本文中通常称为“碱基序列”或“核苷酸序列”及其合乎文法的等效物，且本文中由自左至右方向为5′-末端至3′-末端的常规定向的式来表示。
碱基对(bp)：双股DNA分子中腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)的配对或胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的配对。在RNA中，以尿嘧啶(U)替代胸腺嘧啶。当本文中提及RNA时，可互换使用符号T与U来表示处于RNA分子中的特定位置的尿嘧啶。
核酸：单股或双股的核苷酸聚合物。
聚核苷酸：单股或双股核苷酸的聚合物。本文中所用的“聚核苷酸”及其合乎文法的等效物包括全部范围的核酸。聚核苷酸通常意指包含两种或两种以上脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的直链的核酸分子。如此项技术中所熟知的，精确尺寸将取决于许多因素，而这些因素又取决于最终使用条件。本发明的聚核苷酸包括引物、探针、RNA/DNA节段、寡核苷酸(相对短的聚核苷酸)、基因、载体、质粒等等。
RNAi：RNA干扰(RNAi)是一种藉以将干扰性小RNA(siRNA)(通常约21-23个核苷酸长度的双螺旋)引入细胞内，最终导致含有相同或互补序列的目标基因的信使RNA降解并有效地使其沉默的方法。
基因：其核苷酸序列编码RNA或多肽的核酸。基因可为RNA或DNA。
双螺旋DNA：双股核酸分子，其包含两股由一个或一个以上存在于双螺旋碱基对中的每一互补碱基之间的氢键保持在一起的实质上互补的聚核苷酸。由于形成碱基对的核苷酸可为核糖核苷酸碱基或脱氧核糖核苷酸碱基，因此短语“双螺旋DNA”意指包含两股DNA(ds DNA)的DNA-DNA双螺旋，或包含一股DNA和一股RNA的RNA-DNA双螺旋。
互补碱基：当DNA或RNA采用双股构型时正常配对的核苷酸。
互补核苷酸序列：DNA或RNA的单股分子中的核苷酸序列，其与另一单股上的核苷酸序列充分互补，从而以所产生的氢键与其特异性地杂交。
保守：若核苷酸序列与预选(参考)序列的精确互补序列非随机杂交，则所述核苷酸序列对所述预选序列保守。
杂交：通过互补碱基对之间建立氢键的使实质上互补的核苷酸序列(核酸链)配对以形成双螺旋或异源双螺旋。其为两条互补聚核苷酸之间可竞争性抑制的特异性(即非随机的)相互作用。
核苷酸类似物：结构上与A、T、G、C或U不同但足够类似以取代核酸分子中的正常核苷酸的嘌呤或嘧啶核苷酸。
DNA同源体：具有预选保守核苷酸序列和编码能结合预选配位体的受体的序列的核酸。
上游：在与DNA转录方向相反的方向上，且因此在非编码链上为自5′至3′行进，或在mRNA上为自3′至5′行进。
下游：进一步在序列转录或读取的方向上沿着DNA序列，其沿DNA非编码链的3′至5′方向行进，或沿RNA转录物的5′至3′方向行进。
终止密码子：不编码氨基酸而是导致蛋白质合成终止的三个密码子中的任一者。它们是UAG、UAA及UGA且也称为无义或终止密码子。
阅读框：转译中使用的邻近核苷酸三联体(密码子)的特定序列。阅读框取决于转译起始密码子的位置。
内含子：也称为插入序列，其为最初复制入RNA但由最终RNA转录物切除的DNA非编码序列。
本发明的实施模式
本发明提供一种用于筛检人类中与对黄病毒感染、尤其是C型肝炎感染的抗性有关的寡腺苷酸合成酶等位基因的新颖方法。本发明是基于所述抗性与寡腺苷酸合成酶基因DNA序列中在编码人类OAS1基因的Genbank登记号NT_009775.13(SEQ ID NO：19)的2135728、2135749、2135978、2144072、2144088、2144116、2144321、213 1025、2133961、2139587、2144294、2144985、2156523、2156595或2156638核苷酸位置处的点突变(碱基取代)有关的发现。
本发明揭示鉴别对C型肝炎病毒(HCV)感染具有抗性或部分抗性的受检者群体和进一步鉴别赋予这种有益作用的基因突变的研究结果。鉴别2′-5′-寡腺苷酸合成酶基因中的几种基因突变，其与对HCV感染的抗性显著相关。所使用的研究设计为病例-对照型等位基因关联分析。指定为受检者的病例已经连续证实或推测暴露于HCV，但由于发展对病毒的抗体而经证实并未发展感染(即HCV血清阴性)。对照受检者为连续暴露且血清转变为HCV阳性的受检者。病例和对照受检者募集自三种群体：来自加拿大不列颠哥伦比亚省的范库弗峰(Vancouver)的血友病患者；来自法国西北部的血友病患者；和来自西雅图(Seattle)大都会地区的注射药物使用者。
病例和对照的定义在血友病组与注射药物使用者(IDU)组之间不同且是基于文献中所发表的感染风险的流行病学模型和如本文中所述由发明者提出的其他模型。对于血友病群体，使用商业诊断实验室测试证实对照受检者对于HCV抗体呈血清阳性。证实病例受检者为HCV血清阴性、具有低于5％的正常凝血因子且于1987年1月前已经接收浓缩凝血因子。将对照注射药物使用者定义为经证实的HCV血清阳性。将病例注射药物使用者定义为经证实的HCV血清阴性，其注射药物超过10年以上，且据报导其参与一种或一种以上额外的危险行为。额外的危险行为包括与另一名IDU共用注射器、蒸煮锅或棉球。在一特定高加索(Caucasian)群体中有20名病例和42名对照包括于本研究中。病例和对照受检者的选择基本上如美国专利申请案09/707,576中所述使用受感染的有风险(“对照”)和未受感染的有风险(“病例”)群体群组进行。
鉴别与HCV感染抗性有关的基因突变的本发明方法包括选择候选基因。调查约50种在病毒结合至细胞表面、细胞内病毒繁殖、干扰素反应和先天免疫系统方面和抗病毒反应中所涉及的候选基因。通过使用聚合酶链式反应以扩增来自每一受检者的基因组DNA的目标序列而在病例和对照中为候选基因测序。使用基于荧光的自动化DNA测序法和ABI3730自动化测序仪来直接测序来自候选基因的PCR产物。
鉴别寡腺苷酸合成酶基因(OAS1)中的基因突变，其单独或以联合形式与HCV感染抗性显著相关(p＜0.05)。图1中显示构成这些突变的碱基取代和缺失。OAS1基因的变异形式(“OAS1R”)是因本发明突变中的一种或一种以上的存在而产生(确定为SEQID NO：1-7和SEQ ID NO：57-64)。据信OAS1基因的这些变异OAS1R形式赋予抗病毒感染性。
自通过所属领域技术人员已知的期望最大化(Expectation Maximation)方法建立的病例-对照基因型数据计算推测包含多个OAS1突变(SEQ ID NO：1-7和SEQ IDNO：57-64)的群体和受检者亲本单倍体(Excoffier和Slatkin，Mol.Biol.Evol.12：921-927，1995)。本发明涵盖使用用于单倍体分析的全部范围的OAS1突变以及使用出于计算便利的OAS1突变的子集。对单倍体和单倍体子集的分离样式与病例和对照组的比较分析鉴别关于病毒抗性或易感性的特定功效的突变。
在一说明性实例中，计算包含多个由SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：6确定的OAS1突变的单倍体。通过此分析鉴别高加索人病例和对照群体中的数个单倍体。图4中显示这些单倍体的定义。确定两种常见单倍体(确定为HAP1和HAP2)，其占所推测的单倍体约85％且处于哈迪-韦伯格(Hardy-Weinberg)平衡中，所述平衡尤其是关于群体中单倍体纯合子的出现。各种人类群体和灵长类中的OAS1的进一步分析表明HAP2是遗传的灵长类单倍体，其预先表明旧世纪猴与原始人类的趋异。一种额外的单倍体(确定为HAP3)与这一特定群体中的持久HCV-抗性病例组有关。因此携带HAP3单倍体的受检者处于对HCV感染的实质上较低风险中。HAP3单倍体似乎是经由一系列源自遗传单倍体的复杂重组和突变而出现。与单倍体HAP3高发生率相结合的所述事件的结合少见性表明作出在群体中发展和保持单倍体HAP3的积极选择，其可能随时间推移作为对复发病毒攻毒的反应。在这个实例中，单倍体HAP3是以可评估的群体频率发生的仅有单倍体，其将单一前体RNA中的突变SEQ ID NO：2的G核苷酸的作用与突变SEQ ID NO：4的A核苷酸的作用相结合。
本发明不受限于上述说明性实例。本发明也不受限于提供对特定OAS1突变的相关性和效用的了解的其他说明性实例。在另一说明性实例中，SEQ ID NO：2中G核苷酸取代A核苷酸引起所预测的丝氨酸对甘氨酸的氨基酸取代。所属领域技术人员已知的计算预测高度表明：丝氨酸是磷酸化作用位点而甘氨酸不会经磷酸化。
在另一说明性实例中，突变SEQ ID NO：4中的A核苷酸取代G核苷酸发生于OAS1中的野生型第六外显子的一致剪接受体位点。此取代替代剪接受体辨别信号中所必需的G，但在这个过程中创造新的剪接识别位点，即一个下游碱基对。因此经突变形式于转译蛋白中创造移码。经突变位点也为较少有效的剪接信号，且因而促进除移码外显子6剪接之外的前体RNA的额外替代性剪接。图5A和5B中提供这些替代性剪接形式的优选实施例。以下提供基因分析的其他说明性实例。
OAS1转录物变异体的混乱剪接通过来源于自新鲜人血清分离而得的淋巴细胞系和周边血液单核细胞(PBMC)的RNA的逆转录而独立地确定。对来自携带各种单倍体的细胞系和PBMC的逆转录RNA产物的PCR分析表明携带突变SEQ ID NO：4的A核苷酸的RNA形式导致众多转录物变异体OAS1R形式。这些OAS1R转录物变异体于图5A及5B中图示描述且包含如图3中所提供的SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：47。
据信OAS1基因的这些变异OAS1R形式和相应的转录物变异体编码由SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：32、SEQ IDNO：35、SEQ ID NO：46和/或SEQ ID NO：47组成的多肽中的一种或一种以上。单个或多个上述多肽于本文中可互换地称作OAS1R多肽或OAS1R蛋白。许多上述多肽的共同特征在于其主要在其羧基末端不同而保留氨基末端部分。
除其自身替代性转录物的产生之外，基因的OAS1R形式也可含有或除去特定序列背景(诸如外显子剪接增强子)，其改变对于特定转录物变异体的选择性优选。此举又引起大量所得蛋白质的相对含量不同。OAS1基因的这些变异OAS1R形式也可改变所得蛋白质的定位或转译后修饰。所属领域技术人员应了解特定OAS1蛋白形式的丰度增加或其他改良其活性、稳定性或可用性的修饰可改良2′-5′-OAS/RNase L途径的总体抗病毒性能。所属领域技术人员同样可了解在特定OAS1形式与其他特定OAS1形式相比并不有利或甚至不利的情况下，抑制所述特定蛋白的活性或可用性也可改良2′-5′-OAS/RNaseL途径的总体抗病毒性能。不利的OAS1蛋白的一实施例为(非局限于)以消除所述特定OAS1蛋白的酶活性的方式由病毒蛋白特异性靶向的蛋白。非有利的OAS1蛋白的另一实施例为具有与其他活性形式聚合的较低酶活性因此降低或消除聚合蛋白的总酶活性(且因而降低总体抗病毒效果)的蛋白。上述机制中的一种或一种以上可有助于对病毒感染产生抗性。然而，本发明不受限于所揭示的变异聚核苷酸或多肽的特定作用机制。
因此，本发明提供人类2′-5′-寡腺苷酸合成酶基因的新颖形式、新颖mRNA转录物和相关蛋白质。本发明也揭示新颖mRNA转录物和新颖蛋白质的效用。这些新颖形式的特征在于基因中存在公共数据库中未揭示的数种罕见基因突变或单倍体中的一种或一种以上。OAS1的这些新颖形式OAS1R赋予携带者对C型肝炎病毒和相关黄病毒一定程度的抗性，所述相关黄病毒包括(但不限于)西尼罗河病毒(West Nile virus)、登革热病毒、黄热病病毒、蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus)、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、墨累谷病毒(Murray Valley virus)、玻瓦桑病毒(Powassan virus)、罗西奥病毒(Rocio virus)、跳跃病病毒(louping-ill virus)、班奇病毒(Banzi virus)、伊列乌斯病毒(Ilheus virus)、科科贝拉病毒(Kokobera virus)、昆金病毒(Kunjin virus)、沃父病毒(Alfuy virus)、牛痢疾病毒和卡萨诺尔森林病病毒(Kyasanur forest disease virus)。OAS蛋白也已显示其在实验性呼吸融合病毒和小核糖核酸病毒细胞培养物感染系统的感染减弱中是重要的。已将受人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)感染的细胞无法释放病毒与高浓度的OAS和/或2-5A联系起来。此外，HIV-1反式激活蛋白(tat)已显示阻断OAS的活化(Muller等人，J Biol Chem.1990 Mar 5；265(7)：3803-8)，因而表明OAS的新颖形式可避开HIV-1防御机制且提供有效的治疗。因此本文中所揭示的这些OAS1的OAS1R形式也可赋予对这些非黄病毒感染剂的抗性。
本发明也提供对OAS1的黑猩猩(Pan troglodytes)和大猩猩(Gorilla gorilla)形式的新颖描述，每一形式均导致具有效用的新颖mRNA和多肽。虽然基因在关系密切的灵长类(诸如人类、黑猩猩和大猩猩)中通常高度保守，但是观察到三种物种之间OAS1的重要差异。最亲的人类亲属黑猩猩在OAS1外显子5中具有单个碱基取代(位于相当于人类NT_009775.13中的2,142,351的位点且由SEQ ID NO：53所界定)，其导致生成截短型蛋白质产物。黑猩猩OAS1多肽和mRNA序列分别由SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：55提供。大猩猩也在靠近受体剪接位点的外显子6中具有两碱基对缺失(位于相当于人类NT_009775.13中的2,144,089-2,144,090的位点且由SEQ ID NO：54所界定)，其导致转译提前终止。大猩猩部分多肽和部分mRNA序列分别由SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：56提供。图5C中提供相对于人类的黑猩猩和大猩猩转录物的推测结构。这些情况中的每一种(类似于人类OAS1R多肽)均具有高度保守的多肽序列，其在羧基末端尾部的结构和内容物方面最显著不同。这些多肽的共有氨基末端部分含有先前证实为OAS1酶活性所必需的所有元件。由于黑猩猩和大猩猩已经受与非洲人的病毒攻毒类似的病毒攻毒，因此这些不同但功能上类似的灵长类变异体的流行提供进一步证据表明较长OAS 1形式的羧基末端部分对于病毒攻毒后的继续存活为非必要或甚至不利的。黑猩猩具有OAS1多肽的完全截短(其与人类转录物变异体的异质性相对)的事实与以下观察相一致：尽管黑猩猩为已知的易受HCV感染的仅有其他灵长类，但黑猩猩确实具有相对于人类的非典型性感染，其特征为病毒清除频率增加和不导致纤维化或肝细胞癌。
每一新颖OAS1R cDNA都是克隆自携带这些突变的人类受检者。克隆是通过标准cDNA克隆方法进行，这些方法包括自细胞或组织分离RNA、将RNA转化为cDNA和将cDNA转化为适于克隆的双股DNA。正如所属领域技术人员将认识到的，所有这些步骤都是常规分子生物学分析。其他方法包括使用逆转录酶PCR、5′RACE(cDNA末端快速扩增)或传统的cDNA文库构建和Southern杂交筛检。本文中所述的所有OAS1R等位基因都是自患者携带者回收。对每一新近克隆的OAS1R cDNA测序以确定其身份且鉴别相对于野生型的任何额外序列差异。
新颖OAS1R基因突变可通过改变所得OAS1 mRNA的性质而影响对病毒感染的抗性。因此，评估OAS1R等位基因携带者与纯合野生型受检者之间的mRNA稳定性差异。使用包括Taqman
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和简单Northern杂交法的已知分析来评估并比较RNA稳定性。这些构成分子生物学中的常规方法。
OAS1R突变可通过改变OAS1基因的调控来影响感染抗性。已知OAS基因的表达是由干扰素治疗诱导且于病毒感染期间诱导。OAS1R等位基因可经由组成性表达、过度表达或其他不受调控型表达来赋予对病毒感染的抗性。使用数种方法评估具有或不具有干扰素或病毒刺激的基因表达。这些方法包括表达微阵列分析、Northern杂交法、Taqman
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及其他方法。自已知表达OAS基因的组织(诸如周边血液单核细胞)采集样本。比较来自OAS 1R携带者和非携带者的组织之间的基因表达。在一实施例中，自携带者和非携带者采集周边血液单核细胞，在培养物中繁殖且由干扰素刺激。将干扰素诱导期间OAS1R等位基因的表达水平与野生型等位基因进行比较。在另一实施例中，以干扰素治疗人类受检者并评估OAS1R突变的携带者中相对于非携带者中的OAS1基因的诱导程度。正如所属领域技术人员可了解，将组织、实验设计和分析方法的许多组合用于评估OAS1R基因调控。
一旦对每一OAS1R的新颖cDNA进行克隆，即可使用众多不同的已知表达克隆系统中的任一种将其用于制备重组OAS1R蛋白。在此方法的一实施例中，OAS1R cDNA是通过标准分子生物学方法克隆至大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体中邻近于含有编码聚组氨酸多肽的DNA序列的附加表位。随后使用固定化金属亲和色谱法或类似方法自大肠杆菌溶解产物纯化重组蛋白。所属领域技术人员将认识到有许多可用于纯化重组蛋白的不同表达载体和宿主细胞，包括(但不限于)酵母表达系统、杆状病毒表达系统、中国仓鼠卵巢细胞等等。
使用计算方法鉴别来自OAS1R蛋白的短肽序列，其独特地将这些蛋白与野生型OAS1蛋白区别开来。各种计算方法和市售软件包可用于肽选择。可使用FMOC肽合成化学或类似方法制备这些经计算选择的肽序列。所属领域技术人员将认识到有大量用于根据所供应序列合成短多肽的化学方法。
可使用来自OAS1R基因的肽片段和重组蛋白开发对此基因产物呈特异性的抗体。正如所属领域技术人员将认识到的，存在大量用于抗体开发的方法，包括使用多个不同的宿主有机体、佐剂等等。在一经典实施例中，将少量(150微克)纯化重组蛋白皮下注射入新西兰白兔(New Zealand White Rabbit)背部，随后每几个月注射类似数量作为辅助剂。随后通过静脉穿刺收集兔血清并可收集血清、纯化IgG或对免疫蛋白呈特异性的亲和纯化抗体。正如所属领域技术人员将认识到的，可使用类似方法开发大鼠、小鼠、山羊及其他有机体中的抗体。也可使用如上所述的肽片段开发对OAS1R蛋白呈特异性的抗体。单克隆抗体和多克隆抗体的开发都适于实施本发明。可通过标准分子技术产生分泌OAS1R蛋白的特异性单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞系。
可使用如上所述制备的抗体开发用于评估细胞、组织和有机体中OAS1R蛋白的存在或不存在的诊断方法。在此方法的一实施例中，可使用经纯化的重组OAS1R蛋白和特异性抗体开发酶联免疫吸附分析以检测人类血清中的这些蛋白。可使用这些诊断方法验证上述基因突变的携带者和非携带者的组织中OAS1R蛋白的存在或不存在。
也可使用如上所述制备的抗体自那些携带这些突变的患者纯化天然OAS1R蛋白。对于使用抗体自人类细胞和组织纯化天然蛋白有大量方法可利用。在一实施例中，抗体可用于包括均质化人类组织和使用蛋白A捕捉抗体的免疫沉淀实验中。这个方法能够浓缩且进一步评估突变型OAS1R蛋白。可利用许多其他用于分离OAS1R的天然形式的方法，包括柱色谱法、亲和色谱法、高压液相色谱法、盐析法、透析法、电泳法、等电聚焦法、差速离心法等等。
使用蛋白质体方法评估OAS1R突变对二级、三级和四级蛋白质结构的影响。也使用蛋白质体方法评估OAS1R突变对OAS蛋白的转译后修饰的影响。存在许多已知可能的蛋白质转译后修饰，包括蛋白酶裂解、糖基化、磷酸化、硫酸化、加入化学基团或复合分子等等。评估二级和三级蛋白质结构的一般方法为核磁共振(NMR)光谱法。使用NMR探测野生型OAS1蛋白与OAS1R蛋白之间二级和三级结构的差异。传统NMR的修改方案也是适合的，包括评估功能位点活性的方法，包括核转移欧佛豪瑟光谱法(TrNOESY)等等。正如所属领域技术人员将认识到的，可采用此方法和用于结果的数据解释的方法的许多微小修改方案。所有这些方法都意欲包括于本发明的实施之中。使用通过结晶和X光衍射来确定蛋白质结构的其他方法。
也可使用质谱法评估突变型与野生型OAS蛋白之间的差异。可使用此方法评估结构差异以及蛋白质转译后修饰的差异。在此方法的一典型实施例中，使用上述方法中的一种自人类周边血液单核细胞纯化野生型OAS1蛋白和突变型OAS1R蛋白。这些细胞可如上所述经干扰素刺激以增加OAS蛋白的表达。以特异性蛋白酶(诸如胰蛋白酶)消化经纯化蛋白并使用质谱法评估。正如所属领域技术人员将认识到的，也可使用许多替代方法。本发明涵盖这些额外的替代方法。例如，可使用基质辅助激光解吸附/电离法(MALDI)或电喷雾电离(ESI)质谱法。此外，质谱法可与细胞蛋白的二维凝胶电泳分离法联用以作为对综合预纯化法的替代。质谱法也可与肽指纹数据库和各种检索算法联用。也可通过质谱法与各种预处理(诸如以糖基化酶及磷酸酶预处理)联用来探测转译后修饰(诸如磷酸化或糖基化作用)的差异。将所有这些方法都视为本申请案的一部分。
OAS1为四聚物形式时有活性，且干扰自身缔合的突变影响酶活性。使用已知方法评估OAS1R突变对四聚物形成的影响。例如，以OAS1和OAS1R特异性抗体进行免疫沉淀以自患者细胞、细胞培养物或过度表达OAS1或OAS1R的经转染细胞分离OAS1/OAS1R复合物。随后可通过凝胶电泳法或所属领域技术人员熟知的其他色谱方法来评估这些复合物。
OAS1可通过与其他蛋白相互作用而赋予抗病毒性。酶含有与bcl-2家族的BH3域在结构上同源的区。此域可能对OAS1的功能是关键性的。根据本发明，可使用OAS1特异性抗体分离蛋白复合物，包括来自如上讨论的各种来源的OAS1蛋白。随后可通过凝胶电泳法评估这些复合物以分离相互作用的复合物的成员。可使用包括Western印迹法的许多方法探测凝胶，且可使用肽测序法分离并鉴别新颖的相互作用的蛋白质。也将评估野生型与OAS1R提取物中OAS复合物含量的差异。正如所属领域技术人员将认识到的，所述方法仅为许多可用于纯化、鉴别和评估OAS复合物中相互作用的蛋白质的不同方法中的一些。额外方法包括(但不限于)噬菌体展示技术和使用酵母双杂交体方法。
已知OAS1与C型肝炎病毒NS5A蛋白相互作用(Taguchi，T.等人，J.Gen.Virol.85：959-969，2004)。不受机制的约束，本发明因此涉及不与NS5A蛋白相互作用的OAS1蛋白，其中所述蛋白为本发明的多肽，其由本发明的聚核苷酸表达、由OAS1的剪接变异体所编码的mRNA表达、由含有至少一个本发明的突变的OAS1聚核苷酸表达、由编码区内具有至少一个突变的OAS1聚核苷酸表达和/或由具有至少一个碱基取代、缺失或添加的OAS1聚核苷酸表达，其中与NS5A蛋白的结合被改变或阻碍。
NS5A蛋白可通过抑制干扰素的抗病毒活性而发挥生物学活性。当干扰素在诸如双股RNA的辅因子的存在下刺激OAS1活性时，此抗病毒活性处于一正常实施的模型中。OAS1使ATP聚合成2′-5′-连接的寡腺苷酸，其激活RNase L以裂解包括mRNA的单股RNA。NS5A与OAS1的结合可抑制其活性，因此抑制或阻碍将另外导致病毒RNA破坏的活性级联。
尽管本发明并非取决于此模型，但是NS5A与OAS1的结合与其中OAS1的突变形式避免NS5A结合和抑制且因而能够实现聚合ATP的正常功能的模型相一致。在与本文中所述的临床结果相一致的这些情况下，携带这一突变的人对C型肝炎病毒感染存在抗性。类似地，如上所揭示黑猩猩所具有的OAS1的截短形式可避开与NS5A或其他病毒蛋白结合且因此可观察到更高的黑猩猩病毒清除频率。在某些情况下突变可直接影响OAS1用于NS5A的结合位点。在其他情况下，突变可位于与实际结合位点分开的位点，但引起构象改变使得OAS1与NS5A的结合受到抑制、减慢或阻止。
因此OAS1与NS5A以生理学和病理学上相关方式的结合提供用于分析OAS1聚核苷酸中碱基突变、缺失或添加对所编码的OAS1蛋白的生物学功能的影响的客观测试。以此项技术中已知的方式分析所述结合。在一诸如Taguchi，T.等人(J.Gen.Virol.85：959-969，2004)所述之例示性而非限制性方法中，HeLa细胞经编码GST标记的NS5A和HA标记的OAS1的表达质粒瞬时转染。此实例中的OAS1意指根据本发明的OAS1，包括由OAS1的剪接变异体、由在编码区内具有至少一个突变的OAS1聚核苷酸和/或由具有至少一个碱基取代、缺失或添加的OAS1聚核苷酸所编码的OAS1。在诸如12-16小时的适当培育时间之后，将细胞洗涤、溶解并离心，并将所得上清液与结合谷胱甘肽的琼脂糖(Sepharose)珠粒混合，此举有助于分离经GST标记的蛋白。通过使用并成像抗NS5A的抗体和抗HA抗体来鉴别经GST标记的NS5A与经HA标记的OAS1蛋白的复合物。此方法的变型包括对个别蛋白使用其他标记，诸如FLAG-标记。在本发明上下文中，主要变数为OAS1蛋白或多肽。使用这些分析法客观地测试OAS1蛋白或多肽进行一个生物学相关活动(即结合至已知对于病毒在宿主中复制的能力具有保护性的C型肝炎蛋白)的能力。未与NS5A结合的OAS1蛋白和多肽是作为治疗性蛋白的合适候选者。
OAS1蛋白是催化ATP转化为寡腺苷酸分子的酶。可利用数种方法来评估OAS1酶的活性。使用这些方法来确定OAS1R突变对突变型蛋白相对于野生型酶的活性的影响。例如，可通过量化并入聚腺苷酸中的经32P放射性同位素标记的ATP来测量寡腺苷酸合成活性。可通过包括电泳法或离子交换色谱法的许多色谱方法对经放射性同位素标记的聚腺苷酸的长度进行量化及表征。这些分析也能够表征底物(ATP)结合和酶动力学。OAS1是由dsRNA激活。使用本文中所述的活性分析和此项技术中所述的合成dsRNA来分析OAS1中此活化作用的动力学并与OAS1R作比较。
通过这些和此项技术中已知的其他方法证实本发明的多肽具有寡腺苷酸合成活性。图7和图8证实本发明的数种例示性多肽的活性。不管其活性的量化水平为何，这种产生2′-5′-寡腺苷酸的能力经由RNaseL的活化而产生抗病毒效果都为所属领域技术人员所十分了解。同样，本发明的多肽具有寡腺苷酸合成活性的纯粹事实表明所述多肽尤其是因为其于以下揭示的治疗用途而具有效用。
执行生物学研究以评估OAS1R突变基因使得免受病毒感染的程度。这些生物学研究一般采用以下形式：将突变型OAS1R基因或蛋白引入细胞或整个有机体中，并相对于野生型对照物评估其生物学及抗病毒活性。在此方法的一典型实施例中，通过将如本文中所述经分离的cDNA克隆到哺乳动物表达载体(所述载体驱动所克隆的cDNA自SV40启动子序列表达)中，从而将OAS1R基因引入培养物中的非洲绿猴肾(Vero)细胞中。此载体也含有SV40和细胞巨化病毒增强子元件，其允许OAS1R基因和用于在培养物中选择的新霉素抗性基因的有效表达。随后可评估在感染登革热病毒的Vero细胞中OAS1R表达的生物学作用。在OAS1R赋予对多种黄病毒的广泛抗性的情况下，将预期到表达这些OAS1突变形式的细胞系中的病毒繁殖相对于野生型有所减少。正如所属领域技术人员将认识到的，有多种不同实验方法可用于评估细胞和有机体中对不同感染剂有反应的OAS1R基因及蛋白的生物学效应。例如，在以上实例中，不同的表达载体、细胞类型和病毒物种可用于评估OAS1R抗性效应。相对于细胞系评估培养物中的初级人类细胞。在病毒引入前，细胞可由双股RNA或干扰素刺激。可评估含有替代启动子和增强子序列的表达载体。评估除黄病毒之外的病毒(例如呼吸融合病毒和小核糖核酸病毒)。
开发转基因动物模型以评定OAS1的突变形式在保护整个有机体不受病毒感染方面的适用性。在一实施例中，将OAS1R基因引入易受黄病毒感染的小鼠的基因组中(例如C3H/He近交系实验室菌株)。评估这些OAS1R基因于易受感染的小鼠中调节感染或赋予感染抗性的能力。正如所属领域技术人员将了解的，可使用许多标准方法将转基因人类OAS1R基因引入小鼠中。这些方法可与影响组织特异性表达样式或允许经由引入内源性化学品、使用可诱导性或组织特异性启动子等来调控转基因的其他方法联合。
作为C型肝炎感染的模型，评估表达OAS1R基因的细胞系对牛痢疾病毒(BVDV)感染的易感性、抗性或调节。BVDV是用于测试潜在抗HCV抗病毒药物的功效的常用模型(Buckwold等人，Antiviral Research 60：1-15，2003)。在一实施例中，可使用基本上如上所述的表达载体将OAS1R基因引入KL(小牛肺)细胞中并测试其于此细胞系中调节BVDV感染的能力。此外，也可对HCV感染的小鼠模型(例如，人肝脏移植入小鼠中、人肝细胞注入小鼠肝脏中等等)评估OAS1R基因的转基因组中HCV感染的改变。可进行实验由此在HCV病毒培养系统中评定OAS1R基因的表达效果。
也可使用细胞培养系统来评定突变型OAS1R基因在不同条件下在促进细胞凋亡方面的影响。在一实施例中，可相对于野生型OAS1序列评定OAS1R的细胞培养突变形式在受包括BVDV、HCV及其他黄病毒的许多病毒所感染的细胞中促进细胞凋亡的能力。正如所属领域技术人员将认识到的，可利用许多方法测量细胞凋亡。最常用的方法包括联合使用荧光结合方法与琼脂糖凝胶电泳法检测凋亡细胞中的特征性基因组“DNA阶梯(DNA laddering)”效应。
可在细胞培养物和小动物模型中测试缺陷型干扰病毒增强OAS1R突变形式的效应的能力。
也可检测OAS1R基因型的存在或不存在影响其他人类表现型的程度。例如，评估OAS1R突变在感染HCV的受检者中与病毒滴度和自发病毒清除的相关性。也可采取将宿主OAS1基因型与其他黄病毒感染的过程相联系的类似方法。也检测在感染HCV的患者中干扰素治疗或干扰素与病毒唑(ribavirin)治疗期间OAS1R突变在促进成功结果方面的影响。这些突变不仅可赋予一定程度的感染抗性，而且也促进经或未经干扰素-病毒唑治疗的受感染受检者中的自发病毒清除。此外，已报导精神分裂症在黄病毒感染具地域性的地理区域发生频率较高，表明黄病毒抗性等位基因与易患精神分裂症的体质之间存在联系。通过进行额外的涉及精神分裂症表现型和OAS1R突变的基因关联性研究来评估此联系。也将评估OAS1R突变对IDDM、前列腺癌及其他癌症及精神分裂症的易感性的影响。
本发明揭示新颖且具有效用的OAS1R变异型mRNA(确定为SEQ ID NO：36至SEQID NO：43)。本发明不受限于所揭示的变异型mRNA的使用模式。在一优选实施例中，这些变异型mRNA是用于差别筛检人类受检者增加或降低的病毒(包括HCV)易感性。在其他优选实施例中，这些变异型mRNA适用于筛检对IDDM、前列腺癌及其他癌症和/或精神分裂症的易感性。通过所属领域技术人员已知的表达分析执行所述差别筛检以测定一种或一种以上存在于来源于给定人类受检者的样本中的变异型OAS1R mRNA的相对量。相对于对照样本而言，人类受检者样本中一种或一种以上OAS1R mRNA变异体的量增加或降低表明受检者易感染病毒、IDDM、前列腺癌及其他癌症和/或精神分裂症的程度，此适于所考虑的测试。
如本文中所讨论，2′，5′-寡腺苷酸合成酶(OAS)为IFN-α诱导性、RNA依赖性效应分子酶家族，其自ATP合成短的2′至5′连接的寡腺苷酸(2-5A)分子。OAS酶构成对病毒感染的非特异性免疫防御的重要部分且已用作病毒感染的细胞标记物。除在本文中所讨论的C型肝炎感染中的作用外，在其他病状、尤其是那些其中病毒感染起作用的病状中也涉及OAS活性。
虽然当前分析的主题为特异性致病机制，但是据信病毒感染在诸如糖尿病的疾病的发展中起作用。1型糖尿病患者中淋巴细胞OAS活性显著提高，表明OAS可能为病毒感染与疾病发展之间的重要联系。在涉及来自单卵双生对的糖尿病双胞胎的研究中，Bonnevie-Nielsen等人(Clin Immunol.2000 Jul；96(1)：11-8)显示OAS在新近发作和长期存在的1型糖尿病中均得以持久激活。1型糖尿病中连续升高的OAS活性与正常抗病毒反应明显不同且可能表示酶的慢性刺激、下调机制的失效或对内源性或外源性病毒或其产物的异常反应。
病毒感染与糖尿病发展之间更直接的联系由许多研究加以例证，这些研究显示介于13％与33％之间的慢性C型肝炎患者患有糖尿病(2型糖尿病)，此水平与匹配的健康对照或慢性B型肝炎患者相比显著增加(Knobler等人，Am J Gastroenterol.2003 Dec；98(12)：2751-6)。虽然迄今为止尚未报导OAS对在C型肝炎感染之后发展成糖尿病起作用，但是其可为用于抗病毒反应系统的有用标记物。此外，根据本发明所报导的结果说明，若C型肝炎感染与糖尿病有因果关系，则使用本文中所揭示的组合物和方法抑制或消除C型肝炎感染可有利于预防或减轻糖尿病的发展。
另一公开研究已显示OAS在伤口痊愈及其病理学病症方面、尤其是在静脉溃疡和与糖尿病相关的不易痊愈伤口的情况下起本质作用(WO 02/090552)。在不易痊愈伤口的情况下，受感染组织中OAS mRNA含量减少，而不是象在来源于1型糖尿病患者的淋巴细胞中那样升高。这些发现针对OAS作为糖尿病和与糖尿病相关的伤口痊愈中的免疫反应的病因学上的重要标记物。
OAS也可在前列腺癌中所涉及的细胞过程中起中间物作用。OAS的主要生物学功能为促进RNaseL的活性，RNase L是一种由2-5A分子进行酶刺激的受独特调控的核糖核酸内切酶。RNaseL在调节IFN的抗病毒效应上具有非常确实的作用，且为遗传性前列腺癌1等位基因(HPC1)的强力候选物。已显示RNaseL中的突变倾向于增加男性中的前列腺癌发病率，在某些情况中其表现为与非RNaseL相关病例相比更具侵袭性的疾病和/或发作年龄降低。Xiang等人(Cancer Res.2003 Oct 15；63(20)：6795-801)证实2-5A的生物稳定性硫代磷酸酯类似物诱导RNaseL活性并引起晚期转移性人类前列腺癌细胞系培养物中的细胞凋亡。他们的发现表明同时伴随2-5A含量增加的OAS活性提高可经由有效的细胞凋亡途径而有利于癌细胞的毁灭。因此，本文中所揭示的组合物和方法的使用可在前列腺癌的检测、治疗和/或预防中具有效用。
另外OAS可通过其对RNaseL的调控或经由另一尚未发现的途径而在正常细胞生长调控中起作用。有大量证据支持OAS在负调控细胞生长中的重要性。Rysiecki等人(J.Interferon Res.1989 Dec；9(6)：649-57)证实人类OAS至神经胶母细胞瘤细胞系中的稳定转染导致细胞增殖减少。在几项将静止细胞系与增殖细胞系相比的研究中OAS含量也已显示为可测量的(例如Hassel和Ts′O，Mol Carcinog.1992；5(1)：41-51及Kimchi等人，Eur J Biochem.1981；114(1)：5-10)且在每一情况下OAS含量均为在静止细胞中最高。其他研究已显示OAS含量与细胞周期阶段之间的相关性，其中OAS含量在后S阶段急剧上升而接着在G2阶段突然下降(Wells和Mallucci，Exp Cell Res.1985 Jul；159(1)：27-36)。几项研究已显示在经各种形式的干扰素刺激后OAS诱导作用与抗增殖效应发作之间的相关性(参见Player和Torrence，Pharmacol Ther.1998 May；78(2)：55-113)。细胞分化期间也显示出OAS的诱导作用(例如Salzberg等人，J Cell Sci.1996 Jun；109(Pt6)：1517-26及Schwartz和Nilson，Mol Cell Biol.1989 Sep；9(9)：3897-903)。关于OAS由血小板衍生生长因子(PDGF)(Zullo等人，Cell.1985 Dec；43(3 Pt 2)：793-800)在热休克诱导生长条件下(Chousterman等人，J Biol Chem.1987 Apr 5；262(10)：4806-11)诱导的其他报导导致以下假设：OAS的诱导作用为正常细胞生长控制机制。因此，本文中所揭示的组合物和方法的使用可在癌症的检测、治疗和/或预防中具有广泛效用。
聚核苷酸分析
寡腺苷酸合成酶基因是一种核酸，其核苷酸序列编码寡腺苷酸合成酶、突变型寡腺苷酸合成酶或寡腺苷酸合成酶假基因。其可呈基因组DNA、mRNA或cDNA形式，且呈单股或双股形式。优选使用基因组DNA，因为其相对于mRNA而言在生物学样本中具有相对稳定性。在序列表中以SEQ ID NO：19提供由参考寡腺苷酸合成酶基因的完整基因组序列的连续核苷酸2,130,000-2,157,999组成的聚核苷酸序列，且对应于Genbank登记号NT_009775.13。
自细胞(通常为周边血液白细胞)获得核酸样本。在使用mRNA时，于RNase抑制条件下溶解细胞。在一实施例中，第一步为分离总细胞mRNA。随后可通过与寡聚dT纤维素柱杂交来选择Poly A+mRNA。
在一优选实施例中，富集核酸样本以获得寡腺苷酸合成酶等位基因物质。通常通过使用如本文中所述的聚核苷酸合成引物使基因组DNA或mRNA经受引物延伸反应来实现富集。用于产生待分析样本的尤其优选方法为在聚合酶链式反应(PCR)中使用预选的聚核苷酸作为引物以形成扩增(PCR)产物。
聚核苷酸引物的制备
将本文中关于欲通过引物延伸而合成的引物、探针和核酸片段或节段所使用的术语“聚核苷酸”定义为包含两种或两种以上、优选为三种以上脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子。其精确大小将取决于许多因素，这些因素又取决于最终使用条件。
本文中所用的术语“引物”意指自核酸限制性消化纯化或由合成产生的聚核苷酸，当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下(即在核苷酸和诸如DNA聚合酶、逆转录酶等等的聚合剂存在下且在合适温度和pH下)时，其能够充当核酸合成的起始点。引物优选为单股以达成最大效率，但或者可呈双股形式。若引物为双股，则在用于制备延伸产物之前首先对其加以处理以与其互补股分离。引物优选为聚脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在聚合剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的精确长度将取决于许多因素，包括温度和引物的来源。例如，视目标序列的复杂性而定，聚核苷酸引物通常含有15至25个或更多核苷酸，虽然其也可含有较少的核苷酸。短引物分子一般需要较低温度以与模板形成足够稳定的杂交体复合物。
选择本文中所用的引物以与待合成或扩增的每一特定序列的不同链“实质上”互补。此意谓引物必须充分互补以与其各自的模板链非随机杂交。因此，引物序列可能反映或可能不反映模板的精确序列。例如，非互补核苷酸片段可连接于引物的5′末端，而引物序列的剩余部分与所述链实质上互补。这些非互补片段通常编码核酸内切酶限制性位点。或者，非互补碱基或更长序列可引入引物中，条件是引物序列具有与待合成或扩增的链序列的足够互补性以与其非随机杂交且因而在聚核苷酸合成条件下形成延伸产物。
本发明的引物也可含有DNA依赖性RNA聚合酶启动子序列或其互补序列。例如参见Krieg等人，Nucl.Acids Res.，12：7057-70(1984)；Studier等人，J.Mol.Biol.，189：113-130(1986)；和Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Maniatis等人编，Cold SpringHarbor，N.Y.(1989)。
当使用含DNA依赖性RNA聚合酶启动子的引物时，所述引物与待扩增的聚核苷酸链杂交且使用诸如大肠杆菌DNA聚合酶I或大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段的诱导剂完成DNA依赖性RNA聚合酶启动子的第二聚核苷酸链。起始聚核苷酸通过RNA聚核苷酸产生与DNA聚核苷酸产生之间交替来扩增。
引物也可含有用于RNA指导的RNA聚合酶的模板序列或复制起始位点。典型的RNA指导的RNA聚合酶包括由Lizardi等人，Biotechnology，6：1197-1202(1988)描述的QB复制酶。RNA指导的聚合酶自少量含有模板序列或复制起始位点的模板RNA链生成大量RNA链。如Kramer等人，J.Mol.Biol.，89：719-736(1974)已描述，这些聚合酶通常使模板链扩增一百万倍。
可使用任何合适方法制备聚核苷酸引物，诸如磷酸三酯法或磷酸二酯法，参见Narang等人，Meth.Enzymol.，68：90，(1979)；美国专利第4,356,270号、第4,458,066号、第4,416,988号、第4,293,652号；和Brown等人，Meth.Enzymol.，68：109(1979)。
引物的核苷酸序列的选择取决于下列因素：诸如自杂交点至编码待检测突变的区的核酸距离、核酸上相对于任何待使用的第二引物的杂交位点等等。若通过PCR扩增来富集核酸样本以获得寡腺苷酸合成酶基因物质，则必须使用两个引物(即PCR引物对)以用于待扩增核酸的每一编码链。第一引物成为非编码(反义或负或互补)链的一部分且与正链或编码链上的核苷酸序列杂交。第二引物成为编码(有义或正)链的一部分且与负链或非编码链上的核苷酸序列杂交。第一和第二引物中的一者或两者可含有界定核酸内切酶识别位点的核苷酸序列。所述位点可与正在扩增的寡腺苷酸合成酶基因异源。
在一实施例中，本发明使用一组形成具有位于引物3′-末端的引发区的引物的聚核苷酸。引发区通常为3′-端(3′-末端)15至30个核苷酸碱基。每一引物的3′-末端引发部分均能作为引物以催化核酸合成，即引发自其3′末端起始的引物延伸反应。引物中的一者或两者可另外含有5′-末端(5′-端)非引发部分，即不参与与优选模板杂交的区。
在PCR中，每一引物与第二引物一起发挥作用以扩增目标核酸序列。用于PCR中的PCR引物对的选择是由如本文中对于生成寡腺苷酸合成酶基因区所讨论的考虑因素来决定。当选择引物序列以与寡腺苷酸合成酶基因等位基因内含子内的目标序列杂交  (退火)时，目标序列在等位基因中应为保守的以确保产生待分析的目标序列。
聚合酶链式反应
寡腺苷酸合成酶基因包含聚核苷酸编码链，诸如mRNA和/或基因组DNA的有义链。若待分析的遗传物质呈双股基因组DNA的形式，则通常通过熔融首先将其变性成为单股。通过以PCR引物对处理(接触)样本而使核酸经受PCR反应，引物对中的每一成员具有经预选的核苷酸序列。PCR引物对能够通过与长度优选为至少约10个核苷酸、更优选为至少约20个核苷酸且在寡腺苷酸合成酶等位基因内为保守的核苷酸序列杂交来引发引物延伸反应。PCR引物对的第一引物在本文中有时称为“反义引物”，因为其与核酸的非编码链或反义链(即编码链的互补链)杂交。PCR引物对的第二引物在本文中有时称为“有义引物”，因为其与核酸的编码链或有义链杂交。
通过将PCR引物对(优选为其预定量)与样本核酸(优选为其预定量)在PCR缓冲液中混合以形成PCR反应混合物来进行PCR反应。将所述混合物热循环足以形成PCR反应产物的若干周期(通常为预定的)，从而富集待分析样本以获得寡腺苷酸合成酶遗传物质。
PCR通常通过热循环进行，即在下限为约30摄氏度(30℃)至约55℃和上限为约90℃至约100℃的温度范围内重复增加及降低PCR反应混合物的温度。所述增加及降低可是连续的，但优选为在每一有利于聚核苷酸合成、变性和杂交的温度下具有相对温度稳定性时期的时相。
在每一扩增中均可使用多个第一引物和/或多个第二引物，例如，一类第一引物可与许多不同的第二引物配对以形成几种不同的引物对。或者，可使用第一与第二引物的个别对。在任何情况下，均可将使用第一引物与第二引物的相同或不同组合所扩增的扩增产物组合用于分析突变。
使用任何合适方法进行PCR反应。其一般于pH值优选为7-9、最优选为约8的缓冲水溶液(即PCR缓冲液)中发生。优选地，将摩尔过量(对于基因组核酸而言，通常引物∶模板约为106∶1)的引物与含有模板链的缓冲液混合。优选为大量摩尔过量以提高过程的效率。
PCR缓冲液也含有三磷酸脱氧核糖核苷酸(聚核苷酸合成底物)dATP、dCTP、dGTP和dTTP和通常热稳定的聚合酶，所有物质均为用于引物延伸(聚核苷酸合成)反应的足够量。将所得溶液(PCR混合物)加热至约90℃-100℃历时约1至10分钟，优选为1至4分钟。在此加热时期之后，将溶液冷却至54℃，此温度对于引物杂交是优选的。合成反应可在室温至超过聚合酶(诱导剂)不再有效发挥作用的温度下发生。重复进行热循环直至生成所要量的PCR产物。例示性PCR缓冲液包含下列物质：每100微升缓冲液中有50mM KCl；10mM pH值为8.3的Tris-HCl；1.5mM MgCl2；0.001％(重量/体积)明胶；200μM dATP；200μM dTTP；200 μM dCTP；2002μM dGTP；和2.5单位水生栖热菌(Thermus aquaticus)(Taq)DNA聚合酶I(美国专利第4,889,818号)。
诱导剂可为将发挥作用以实现引物延伸产物的合成的任何化合物或系统，包括酶。为达成此目的的合适酶例如包括大肠杆菌DNA聚合酶I、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段、T4 DNA聚合酶、其他可利用的DNA聚合酶、逆转录酶及其他酶(包括热稳定性酶)，其将有利于核苷酸以适当方式组合以形成与每一核酸链互补的引物延伸产物。一般来说，合成将于每一引物的3′末端引发且沿模板链以5′方向行进直至合成终止，产生不同长度的分子。然而，可存在使用如上所述的相同过程而于5′末端引发合成且以上述方向行进的诱导剂。
诱导剂也可为将发挥作用以实现RNA引物延伸产物的合成的化合物或系统，包括酶。在优选实施例中，诱导剂可为DNA依赖性RNA聚合酶，诸如T7 RNA聚合酶、T3RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶。这些聚合酶生成互补RNA聚核苷酸。如Chamberlin等人，The Enzymes，P.Boyer编，第87-108页，Academic Press，New York(1982)已描述，RNA聚合酶的高转换率(turn-over rate)扩增起始聚核苷酸。基于转录的扩增系统已由Gingeras等人在PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，第245-252页，Innis等人编，Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.(1990)中描述。
若诱导剂为DNA依赖性RNA聚合酶且因而合并三磷酸核糖核苷酸，则将足够量的ATP、CTP、GTP和UTP与引物延伸反应混合物混合并如上所述处理所得溶液。
新合成链及其互补核酸链形成可用于所述过程的随后步骤中的双股分子。
PCR反应可有利地用于将适用于检测寡腺苷酸合成酶基因中的突变的预选限制性位点并入所述产物中。
PCR扩增方法在美国专利第4,683,192号、第4,683,202号、第4,800,159号和第4,965,188号中和至少在包括PCR Technology：Principles and Applications for DNAAmplification，H.Erlich编，Stockton Press，New York(1989)和PCR Protocols：A Guide toMethods and Applications，Innis等人编，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)的若干教科书中详细描述。
在某些实施例中，每个扩增反应使用两对第一和第二引物。自多个不同扩增反应(每个反应使用多个不同引物对)获得的扩增反应产物可一起或单独进行分析。
然而，本发明涵盖使用仅一对第一和第二引物的扩增反应。以下表1中显示用于扩增含有本文中所揭示的突变的DNA部分的例示性引物。扩增子A对应于含有SEQ IDNO：1-3中所指的突变的聚核苷酸序列。扩增子B对应于含有SEQ ID NO：4-7和SEQ IDNO：60中所指的突变的聚核苷酸序列。扩增子C对应于含有SEQ ID NO：57中所指的突变的聚核苷酸序列。扩增子D对应于含有SEQ ID NO：58中所指的突变的聚核苷酸序列。扩增子E对应于含有SEQ ID NO：59中所指的突变的聚核苷酸序列。扩增子F对应于含有SEQ ID NO：61中所指的突变的聚核苷酸序列。扩增子G对应于含有SEQ ID NO：62-64中所指的突变的聚核苷酸序列。
表1
含有本发明的突变的扩增子
扩增子 引物A 引物B 产物大小(bp)
扩增子A 5′-AATGGACCTCAAGACTTCCC-3′(SEQ ID NO：8) 5′-ATTCTCCCTTCTGTTGCAGG-3′(SEQ ID NO：9) 509
扩增子B 5′-TCCAGATGGCATGTCACAGT-3′(SEQ ID NO：10) 5′-GAGCTATGCTTGGCACATAG-3′(SEQ ID NO：11) 747
扩增子C 5′-CACAAGAGTGAACCTTAATGT-3′(SEQ ID NO：65) 5′-CCAGGAAGTGGAAAGATCAT-3′(SEQ ID NO：66) 603
扩增子D 5′-ATCTCCCACAGTTTGAGAGC-3′(SEQ ID NO：67) 5′-TCAGCCTCCAAAAGTGTTGG-3′(SEQ ID NO：68) 553
扩增子E 5′-GGGTACATGTGCACAATGTG-3′(SEQ ID NO：69) 5′-CCCTTATACAAAATTCAACTC-3′(SEQ ID NO：70) 532
扩增子F 5′-GAGCCAAGAAGTACAGATGC-3′(SEQ ID NO：71) 5′-AGGACAGAGCTGTCCAATAG-3′(SEQ ID NO：72) 648
扩增子G 5′-GGCTCAGAGAAGCTAAGTGA-3′(SEQ ID NO：73) 5′-CCACAGCATCCTTTTCAGTC-3′(SEQ ID NO：74) 581
表2揭示以上扩增子中本发明突变的位置
表2
扩增子中本发明的突变的位置
 突变 扩增子  扩增子中的位置(相对于扩增子的引物A侧的5′末端)
 1(SEQ ID NO：1) 扩增子A  134
 2(SEQ ID NO：2) 扩增子A  155
 3(SEQ ID NO：3) 扩增子A  384
 4(SEQ ID NO：4) 扩增子B  98
 5(SEQ ID NO：5) 扩增子B  114
 6(SEQ ID NO：6) 扩增子B  142
 7(SEQ ID NO：7) 扩增子B  347
 8(SEQ ID NO：57) 扩增子C  319
 9(SEQ ID NO：58) 扩增子D  404
 10(SEQ ID NO：59) 扩增子E  133
 11(SEQ ID NO：60) 扩增子B  320
 12(SEQ ID NO：61) 扩增子F  367
 13(SEQ ID NO：62) 扩增子G  138
 14(SEQ ID NO：63) 扩增子G  210
 15  (SEQ ID NO：64) 扩增子G  253
核酸序列分析
通过(a)基于探针链及其互补目标的杂交或变性的物理化学技术与(b)与核酸内切酶、连接酶和聚合酶的酶促反应的组合来进行核酸序列分析。可在DNA或RNA水平上分析核酸。前者分析个体人类的遗传潜力而后者分析特定细胞的表达信息。
在使用核酸杂交的分析中，可通过多种手段实现检测在本发明的过程中DNA双螺旋的存在。
在一用于检测DNA双螺旋存在的方法中，在DNA双螺旋中经杂交的寡核苷酸包括使双螺旋可检测的标记或指示基团。所述标记通常包括放射性原子、经化学修饰的核苷酸碱基等等。
可对寡核苷酸进行标记，即可经由操作与指示工具或基团连接，且可将其用于检测目标模板中特定核苷酸序列的存在。可经由操作连接至寡核苷酸探针(经标记的寡核苷酸)或作为寡核苷酸探针的一部分存在的放射性元素提供有利于检测DNA双螺旋的有用方法。典型的放射性元素为产生β射线发射的元素。诸如3H、12C、32P和35S等发射β射线的元素代表一类产生β射线发射的放射性元素标记。通常通过使用DNA激酶将经放射性标记的核苷酸以酶促法并入核酸中来制备放射性聚核苷酸探针。经放射性标记的寡核苷酸的替代物为经化学修饰以含有金属络合剂、含生物素基团、荧光化合物等等的寡核苷酸。
一种有用的金属络合剂为由镧系元素与芳族β-二酮形成的镧系元素螯合物，镧系元素经由形成螯合物的化合物(诸如EDTA类似物)结合至核酸或寡核苷酸，从而形成荧光性镧系元素络合物。参见美国专利第4,374,120号、第4,569,790号和公开专利申请案EP0139675及W087/02708。
已描述经生物素或吖啶酯标记的寡核苷酸及其在标记聚核苷酸上的用途。参见美国专利第4,707,404号、公开专利申请案EP0212951和欧洲专利第0087636号。有用的荧光标记化合物包括荧光素、若丹明(rhodamine)、德克萨斯红(Texas Red)、NBD等等。
存在于DNA双螺旋中的经标记的寡核苷酸使双螺旋自身得以标记且因此可区别于待分析样本中所存在的其他核酸。检测双螺旋中标记的存在且藉此检测双螺旋的存在，通常包括将DNA双螺旋自任何经标记的未与DNA双螺旋杂交的寡核苷酸探针中分离。
用于自DNA双螺旋中分离单股寡核苷酸(诸如未经杂交的经标记寡核苷酸探针)的技术为人所熟知，且通常包括基于其化学性质将单股核酸自双股核酸中分离。更常用的分离技术包括使用异质杂交型式，其中未经杂交的探针通常通过洗涤而自与不溶性基质结合的DNA双螺旋中分离。例示性实例为Southern印迹技术，其中基质为硝化纤维素薄片且标记为32P。Southern，J.Mol.Biol.，98：503(1975)。
也可通常于其5′-末端或附近处有利地将寡核苷酸连接至固体基质，即非水溶性固体支撑物。有用的固体基质为此项技术中所熟知且包括诸如以SEPHADEX为商品名购自Pharmacia Fine Chemicals(Piscataway，N.J.)的交联葡聚糖、琼脂糖、直径为约1微米至约5毫米的聚苯乙烯或乳胶珠粒、聚氯乙烯、聚苯乙烯、交联聚丙烯酰胺、基于硝化纤维素或尼龙的织物，诸如薄片、条带、桨叶、平板、微滴定板孔等等。
也有可能将“连接”核苷酸加入成员寡核苷酸的5′或3′末端，并使用所述连接寡核苷酸经由操作将此成员连接到固体支撑物。在核苷酸杂交分析中，在所涵盖方法中杂交反应混合物于杂交条件下维持一段足够长时间以使得与模板上的预定序列互补的寡核苷酸与存在于模板中的互补核酸序列杂交以形成杂交产物，即含有寡核苷酸和目标核酸的复合物。当使用维持时期时，短语“杂交条件”及其合乎文法的均等物表示使杂交反应混合物在反应物和伴随试剂于混合物中的浓度范围内经受足以使一种或一种以上寡核苷酸与目标序列退火以形成核酸双螺旋的时间、温度和pH条件。如此项技术中所熟知，这些为实现杂交所需要的时间、温度和pH条件取决于以下因素：待杂交寡核苷酸的长度、寡核苷酸与目标之间的互补性程度、寡核苷酸的鸟嘌呤及胞嘧啶含量、所要的杂交严格度和在杂交反应混合物中可影响杂交动力学的盐或额外试剂的存在。用于优化给定杂交反应混合物的杂交条件的方法为此项技术中所熟知。典型杂交条件包括使用缓冲至介于4与9之间的pH值的溶液，并在4℃至37℃、优选为约12℃至约30℃、更优选为约22℃的温度下进行，且持续0.5秒至24小时、优选为2分钟至1小时的时期。
如所熟知的，杂交可以同质或异质型式进行。同质杂交反应完全于溶液中发生，其中寡核苷酸和待杂交的核酸序列(目标)均以可溶形式存在于溶液中。异质反应包括使用不溶于反应介质且寡核苷酸、聚核苷酸探针或目标核酸与其相结合的基质。
当含有目标序列的核酸呈双股(ds)形式时，则最好在进行杂交反应之前首先通过加热或碱处理来使双股DNA变性。双股DNA的变性可在与待杂交的寡核苷酸混合之前进行，或可在双股DNA与寡核苷酸混合之后进行。
寡核苷酸与模板之间的预定互补性是以两种替代方式达成。模板DNA中的序列可为已知，诸如其中待形成的引物可与已知寡腺苷酸合成酶序列杂交并可引发引物延伸至用于测序目的以及随后的上述分析目的的DNA区中，或其中先前测序已确定核苷酸序列的区且引物经设计为自最近经测序区向未知序列区延伸。已将后一种方法称为“定向测序”，因为每一轮测序都是由基于先前确定的序列而设计的引物来指导。
存在于杂交反应混合物中的寡核苷酸的有效量为一般熟知的且通常以待杂交的寡核苷酸与模板之间的摩尔比表示。优选比率为含有等摩尔量的目标序列与寡核苷酸的杂交反应混合物。如人们所熟知，偏离等摩尔浓度时仍将产生杂交反应产物，只是效率较低。因此，尽管比率中一种组份可相对于另一组份摩尔过量多达100倍，但在实施本发明中所想要的是过量小于50倍、优选为小于10倍且更优选为小于2倍。
经薄膜固定化的目标序列的检测
在DNA(Southern)印迹技术中，通过先前讨论的PCR扩增来制备DNA。在琼脂糖凝胶中根据尺寸分离PCR产物(DNA片段)并将其转移(转渍)至硝化纤维素或尼龙薄膜上。常规电泳法分离长度范围为100至30,000个碱基对的片段而脉冲场凝胶电泳法离析长达20,000,000个碱基对的片段。在薄膜上含有特定PCR产物的位置是通过与特异性经标记的核酸探针杂交来确定。
在优选实施例中，使用斑点印迹(dot-blot)(细长印迹(slot-blot))装置将PCR产物直接固定至固体基质(硝化纤维素膜)上，且通过探针杂交来分析。参见美国专利第4,582,789号和第4,617,261号。
可通过以等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针探测来分析经固定的DNA序列，这些探针为长度约15、17、20、25或长达约30个核苷酸的合成DNAn寡聚物。这些探针足够长以呈现基因组中的独特序列，但足够短以便由于其与目标分子杂交中的内部错配而失去稳定。因此，可通过在小心控制的杂交条件下ASO探针与正常或突变型目标之间的杂交体的不同变性行为来区分在单个核苷酸上不同的任何序列。例示性探针在本文中揭示为SEQ ID NO：1-7和SEQ ID NO：57-64(表3)，但只要探针与携带所选择的点突变的OAS1基因区特异性杂交且能够特异性区分携带点突变的聚核苷酸与野生型聚核苷酸，则任何探针均为适合的。
溶液中目标序列的检测
已开发出数种不需要核酸纯化或固定化的快速技术。例如，可将探针/目标杂交体于优选结合双股核酸的固体基质(诸如羟基磷灰石)上选择性分离。或者，可将探针核酸固定于固体支撑物上并用于自溶液中俘获目标序列。目标序列的检测可在第二经标记探针的辅助下实现，所述探针在竞争型分析法中由目标序列自支撑物中置换或经由目标序列的桥接作用以夹层型式连接至支撑物。
在寡核苷酸连接分析法(OLA)中，酶DNA连接酶是用于共价连接两条所选择的合成寡核苷酸序列，使得两者可以精确的头尾(head-to-tail)并置方式与目标序列碱基配对。接合区的错配核苷酸的存在防碍两种寡聚物连接。此程序考虑到在不需DNA纯化的情况下细胞样本中已知序列变异体之间的差别。可通过固定两种寡核苷酸中的一种并观察第二经标记寡核苷酸是否也被俘获来监控两种寡核苷酸的连接。
用于检测碱基取代的扫描技术
三种技术允许分析长度为几百个碱基对的探针/目标双螺旋中未知的单一核苷酸取代或其他序列差异。在核糖核酸酶(RNase)A技术中，所述酶在经标记的RNA探针与目标RNA或DNA序列错配的位置处裂解经标记的RNA探针。考虑到对突变大致位置的确定，可按照尺寸分离片段。参见美国专利第4,946,773号。
在变性梯度凝胶技术中，用电泳法以渐增强度的变性梯度来分析探针-目标DNA双螺旋。变性伴随着迁移率降低。带有错配碱基对的双螺旋比完美配对的双螺旋变性更快。
第三种方法依赖于错配碱基对的化学裂解。可在异源双螺旋中检测T与C、G或T之间的错配以及C与T、A或C之间的错配。与四氧化锇(T与C错配)或羟基胺(C错配)反应之后以哌啶处理可在适当错配处裂解探针。
用于恢复和/或增强OAS1功能的治疗剂
无论是经由OAS1蛋白的含量降低、影响蛋白功能的蛋白突变还是经由其他机制，当OAS1基因中的突变导致缺陷性OAS1功能且此缺陷性功能与患者对病原体感染的易感性增加相关时，用野生型OAS1蛋白治疗患者均可能是有利的。此外，若突变在抗感染携带者中产生与野生型蛋白不同且在抑制HCV感染方面具有优势的蛋白形式，则投与由突变基因编码的蛋白可为有利的。如先前所述，在包括(但不限于)癌症、糖尿病和伤口痊愈的其他病症的治疗中，投与天然或突变形式的OAS1蛋白或多肽也可为有利的。以下讨论是关于任何上述蛋白或多肽的投与。
本发明的多肽(包括那些由OAS1R编码者)可为天然纯化产物或化学合成程序的产物，或通过重组技术自本发明的聚核苷酸序列的原核或真核宿主(例如培养物中的细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)产生。视重组生产程序中所用的宿主而定，本发明的多肽可经哺乳动物或其他真核生物碳水化合物进行糖基化或可未经糖基化。本发明的多肽也可包括初始甲硫氨酸氨基酸残基(于负1位置处)。
本发明的多肽也包括SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQID NO：29、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47及其衍生物中所界定的蛋白质序列。
除天然产生的等位基因形式的多肽之外，本发明也包含其类似物和片段，其功能与天然产生的等位基因形式相似。因此，举例而言，只要保持OAS1R蛋白的功能，则多肽的氨基酸残基中的一种或一种以上可由保守氨基酸残基置换。以下实例8-10提供关于本发明多肽的合适氨基酸置换的代表性例证。作为另一实例，本发明的多肽特定地包括SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52中所界定的OAS1R的截短形式或类似物形式。如先前所讨论，SEQ ID NO：51表示黑猩猩所具有的OAS1的截短形式而SEQ ID NO：52表示大猩猩所具有的稍长但仍为截短形式的羧基末端片段。SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50分别表示按照对应的黑猩猩和大猩猩截短位点而截短的合成人类OAS1R构筑体。SEQ ID NO：48表示按照黑猩猩与大猩猩形式的长度中间值而截短的合成人类OAS1R多肽。通过如本文中其他处所揭示的此项技术中已知的方法进一步证明SEQ ID NO：48具有酶活性。因此，也可证明剩余高度类似的截短形式具有酶活性。正如所属领域技术人员所了解的，OAS1R多肽的截短形式而非功能性形式的治疗用途可阻止另外阻碍多肽治疗功效的抗体反应的发展。上述截短型多肽和所属领域技术人员所设想的其他形式多肽保持功能但却移除多肽的非普遍存在部分，所述部分能诱导不具有内源性全长OAS1R多肽的个体中的抗体反应。所属领域技术人员也将了解较小多肽一般来说更经受得住在治疗进程中通常所遭遇的制造、传递和清除的复杂性。另外，所属领域技术人员将了解黑猩猩和大猩猩中不同纯合截短变异体的出现也高度表明目前所揭示的截短型OAS1形式的广泛抗病毒效力。尽管以上特定揭示的截短型多肽形式表示对多肽羧基末端的截短，但是本发明不受限于所述片段的形式且特定包括保留酶促功能的氨基末端截短和内部氨基酸缺失。
保留特定揭示的多肽的至少一种活性但与所揭示的氨基酸序列不同的多肽也包括在本发明的范畴内。如使用标准比对方法所计算的，所述多肽优选地具有与相应所揭示的SEQ ID NO：相比至少80％序列同源性、优选为85％序列同源性、更优选为90％序列同源性、最优选为95％以上序列同源性。
多肽也可通过所述多肽在活体内的表达根据本发明来使用，此举通常称为基因治疗。因此，举例而言，可以编码多肽的聚核苷酸(DNA或RNA)在活体外转导细胞，随后将这些经转导细胞提供给待用所述多肽治疗的患者。所述方法在此项技术中为熟知的。例如，可通过使用含有编码本发明多肽的RNA的逆转录病毒粒子经由此项技术中已知的程序来转导细胞。
类似地，例如可通过此项技术中已知的程序在活体内完成细胞转导以用于在活体内表达多肽。如此项技术中已知，可将产生含有编码本发明多肽的RNA的逆转录病毒粒子的生产细胞投与患者以用于活体内转导和多肽在活体内的表达。
对于所属领域技术人员而言，这些方法及其他通过所述方法投与本发明多肽的方法由于本发明的教示应变得显而易见。例如，用于转导细胞的表达媒剂可为除逆转录病毒以外的媒剂，例如与合适传递媒剂组合之后可用于活体内转导细胞的腺病毒。
在多肽制备成液体调配物并通过注射投与的情况下，溶液优选为含有140毫摩尔氯化钠和10毫摩尔钙的pH值为7.4的等渗盐溶液。举例而言，可将注射液以治疗有效量投与，考虑到投与途径、患者健康状况等因素，优选的每日剂量为约1μg/kg体重至约5mg/kg体重。
本发明的多肽可与合适的医药载剂联合使用。所述组合物包含治疗有效量的蛋白质和医药学上可接受的载剂或赋形剂。所述载剂包括(但不限于)盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其组合。调配物应适于投与模式。
本发明的多肽也可通过多肽与一种或一种以上部分或共轭物化学连接而进行修饰以增强多肽的活性、细胞分布或细胞摄取。所述部分或共轭物包括脂质，诸如胆固醇、胆酸、硫醚、脂族链、磷脂及其衍生物；多元胺；聚乙二醇(PEG)；棕榈基部分；和例如于美国专利第5,514,758号、第5,565,552号、第5,567,810号、第5,574,142号、第5,585,481号、第5,587,371号、第5,597,696号及第5,958,773号中所揭示的其他物质。
也可修饰本发明的多肽以靶向于特定病症的特定细胞类型，包括(但不限于)C型肝炎感染情况中的肝细胞。如所属领域技术人员所能了解，已描述达成所述靶向目标的适当方法且这些方法包括(但不限于)脂质体靶向、受体调节的内吞作用和抗体-抗原结合。在一实施例中，可通过将半乳糖部分加入多肽中而使脱唾液酸糖蛋白受体用于靶向于肝细胞。在另一实施例中，可将甘露糖部分共轭至多肽以便靶向于巨噬细胞和肝细胞上所发现的甘露糖受体。也可通过所属领域技术人员已知的方法修饰本发明的多肽以用于胞质传递，这些方法包括(但不限于)内体逃离机制或蛋白转导域(PTD)系统。例如，Vives E等人(1997)J.Biol.Chem.272：16010-16017、Derossi等人(1994)J.Biol.Chem.269：10444-10450、Elliott等人(1997)Cell 88：223-233、Wadia，JS等人(2004)Nat.Med.10：310-315和Kabouridis，PS.(2003)Trends Biotech.，21：498-503中揭示PTD系统。已知的内体逃离系统包括使用pH值响应性聚合载剂，诸如聚(丙基丙烯酸)。已知的PTD系统的范围为诸如HIV-1 TAT、HSV-1 VP22、果蝇触角足(Drosophila Antennapedia)或白喉毒素的天然肽至合成肽载剂(Wadia和Dowdy，Cur.Opin.Biotech.13：52-56，2002；Becker-Hapak等人，Methods 24：247-256，2001)。图10提供这些例示性PTD中的几种的详细描述。正如所属领域技术人员认识到的，可将多重传递与靶向方法相联合。例如，可通过在脂质体内封装使本发明的多肽靶向于肝细胞，其中所述脂质体共轭至半乳糖以用于靶向于脱唾液酸糖蛋白受体。
本发明也提供医药包或试剂盒，其包含一种或一种以上填充有本发明医药组合物的成份中的一种或一种以上的容器。与所述容器相关的是呈管理医药品或生物产品的制备、使用或销售的政府机构所规定形式的公告，此公告反映该机构对用于人投与的所述产品的制备、使用或销售的批准。另外，本发明的多肽可与其他治疗性化合物联合使用。
当本发明的OAS1变异体用作医药品时，其可在适当媒剂中给予哺乳动物。当本发明的多肽用作如上所述的医药品时，考虑到投与途径、患者健康状况等因素，其例如以每日约10μg/kg体重至约4mg/kg体重的治疗有效剂量来给药。给药量优选为足以达成预防或抑制病毒感染、优选为黄病毒感染、最优选为HCV感染，从而复制携带本文中所揭示的OAS1R等位基因的人中所发现的天然抗性。
也预见到模拟在NT_009775.13的2135728、2135749、2135978、2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、2144985、2156523、2156595或2156638位置处至少一个突变的有益作用的基于抑制剂的药物疗法，如以下详细讨论。如先前所讨论，开发所述抑制剂的一例示性原理为有益突变减弱或消除一种或一种以上OAS1特定同功异型物的表达、转译或功能的情况。本发明既不受限于有益突变的精确形式或效应也不受限于因此受影响的特定同功异型物的生物学活性。在所述情况下，所属领域技术人员将了解治疗学上抑制OAS1的所述特定同功异型物的效用。这些基于抑制剂的疗法可采用以下形式：化学个体、肽或蛋白质、反义寡核苷酸、干扰性小RNA和抗体。
蛋白质、其片段或其他衍生物或其类似物或表达其的细胞可用作免疫原以产生其抗体。举例而言，这些抗体可为多克隆、单克隆、嵌合、单链、Fab片段或Fab表达文库的产物。此项技术中已知的各种程序可用于产生多克隆抗体。
可通过将多肽直接注射至动物或通过将多肽投与动物(优选为非人类)来获得针对由本发明的OAS1R编码的多肽而产生的抗体。由此获得的抗体随后将结合多肽本身。以此方式，甚至仅编码多肽片段的序列也可用于产生结合整个天然多肽的抗体。此外，对大量多肽具有特异性的一组所述抗体可用于鉴别和区分所述组织。举例而言，图9演示对本发明的特定例示性多肽呈特异性的抗体的显影。
提供由连续细胞系培养物产生的抗体的任何技术均可用于制备单克隆抗体。实例包括杂交瘤技术(Kohler和Milstein，1975，Nature，256：495-597)、Trioma技术、人类B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人，1983，Immunology Today 4：72)和用以产生人类单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(Coe等人，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.第77-96页)。
用于产生单链抗体的所述技术(美国专利第4,946,778号)可适于产生抗本发明的免疫原性多肽产物的单链抗体。
所述抗体可用于与本发明的蛋白序列定位和活性有关的方法中，例如用于为这些蛋白成像、测量其在适当生理学样本中的含量等等。
本发明提供用于为细胞内的OAS1聚核苷酸成像的可检测性经标记的寡核苷酸。所述寡核苷酸适用于确定是否发生基因扩增，且适用于例如使用此项技术中已知的原位杂交技术分析细胞或组织中的表达水平。
抑制OAS1功能的治疗剂
本发明也涉及为干扰OAS1聚核苷酸正常功能而设计的反义寡核苷酸。此项技术中已知有待广泛应用于反义技术的反义分子的任何修饰或变体均包括于本发明的范畴内。所述修饰包括如美国专利第5,536,821号、第5,541,306号、第5,550,111号、第5,563,253号、第5,571,799号、第5,587,361号、第5,625,050号和第5,958,773号中所揭示的含磷键的制备。
本发明的反义化合物可包括如5,958,773和本文中所揭示的专利中所揭示的经修饰碱基。本发明的反义寡核苷酸也可通过将寡核苷酸与一种或一种以上部分或共轭物化学连接来加以修饰以增强反义寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取。所述部分或共轭物包括脂质，诸如胆固醇、胆酸、硫醚、脂族链、磷脂；多元胺；聚乙二醇(PEG)；棕榈基部分；和例如于美国专利第5,514,758号、第5,565,552号、第5,567,810号、第5,574,142号、第5,585,481号、第5,587,371号、第5,597,696号及第5,958,773号中所揭示的其他物质。
嵌合反义寡核苷酸也属于本发明范畴内，且可使用例如美国专利第5,013,830号、第5,149,797号、第5,403,711号、第5,491,133号、第5,565,350号、第5,652,355号、第5,700,922号和第5,958,773号中所述的方法自本发明的寡核苷酸制备。
优选的反义寡核苷酸可通过常规实验使用例如实例中所述的分析来选择。尽管发明者不受特定作用机制约束，但是据信反义寡核苷酸通过使用Watson-Crick碱基配对来与目标聚核苷酸的互补区在细胞内结合而达成抑制效果。当目标聚核苷酸为RNA时，实验证据表明杂交体的RNA组份是由RNase H裂解(Giles等人，Nuc.Acids Res.23：954-61，1995；美国专利第6,001,653号)。一般来说，含有10个碱基对的杂交体具有足够长度以用作RNase H的底物。然而，为达成结合的特异性，最好使用具有至少17个核苷酸的反义分子，因为此长度的序列在人类基因的中有可能是独特的。
如以引用方式并入本文中的美国专利第5,998,383号中所揭示，选择寡核苷酸使得序列展现对与其互补模板形成寡核苷酸双螺旋来说为重要的适当能量相关特征，并显示自身二聚化或自身互补的低可能性(Anazodo等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.229：305-09，1996)。将计算机程序OLIGO(引物分析软件，3.4版)用于确定反义序列熔融温度、自由能性质且用于评估潜在的自身二聚体形成及自身互补性质。所述程序允许确定这两项参数(潜在的自身二聚体形成及自身互补性)的定性评估且提供“不可能”、“有一些可能”或“基本完全可能”的指示。一般选择在这些参数中具有不可能评估的OAS1聚核苷酸节段。然而，可使用在这些范畴的一者中具有“一些可能”的节段。在选择中使用这些参数的平衡。
在反义技术中需要一定程度的常规实验以选择用于特定目标的最佳反义分子。为了有效起见，优选将反义分子靶向于目标RNA分子的易接近或已暴露部分。尽管在某些情况下可利用关于目标mRNA分子结构的信息，但目前使用反义进行抑制的方法是经由实验法达成。根据本发明，此实验法可通过使用实例中所述的方法以反义寡核苷酸转染细胞来常规地进行。细胞中mRNA含量可通过逆转录mRNA和检定cDNA含量而在经处理细胞及对照细胞中常规地测量。如此项技术中已知，可通过测量细胞生长或生存能力来常规地测定生物学效应。
通过检定和分析cDNA含量来测量反义活性的特异性是验证反义结果的技术认可方法。已表明来自经处理细胞及对照细胞的RNA应经逆转录且应分析所得cDNA群体。(Branch，A.D.，T.I.B.S.23：45-50，1998.)根据本发明，以为了靶向于OAS1而设计的两条不同的反义寡核苷酸转染细胞培养物。在经处理细胞和对照细胞中测量对应于OAS1的mRNA含量。
额外的抑制剂包括核酶、蛋白质或多肽、抗体或其片段以及小分子。这些OAS1抑制剂中的每一种的共同特征在于其减少OAS1的表达和/或生物学活性。除了本文中所揭示的例示性OAS1抑制剂之外，可利用本文中特定揭示或另外不难获得且在熟练技工的专业技术之内的方法经由常规实验法获得替代性抑制剂。
核酶
OAS1抑制剂可为核酶。核酶是特异性地裂解诸如mRNA的RNA底物、从而导致特异性抑制或干扰细胞基因表达的RNA分子。如本文中所用，术语核酶包括含有用于特异性辨别的反义序列且含有RNA裂解酶活性的RNA分子。催化链于高于化学计量浓度时裂解目标RNA中的特异性位点。
在本发明的上下文中可利用多种核酶，例如包括锤头状核酶(例如，如由Forster和Symons，Cell 48：211-20，1987；Haseloff和Gerlach，Nature 328：596-600，1988；Walbot和Bruening，Nature 334：196，1988；Haseloff和Gerlach，Nature 334：585，1988所述)；发夹状核酶(例如，如1993年10月19日颁发的Haseloff等人的美国专利第5,254,678号和1990年3月26日公开的Hempel等人的欧洲专利公告第0 360 257号)；和基于四膜虫(Tetrahymena)核糖体RNA的核酶(参见Cech等人，美国专利第4,987,071号)。本发明的核酶通常是由RNA组成，但也可由DNA、核酸类似物(例如硫代磷酸酯)或其嵌合体(例如DNA/RNA/RNA)构成。
核酶可靶向于任何RNA转录物且可催化性地裂解所述转录物(例如参见Cech等人的美国专利第5,272,262号；美国专利第5,144,019号；和美国专利第5,168,053号、第5,180,818号、第5,116,742号及第5,093,246号)。根据本发明的某些实施例，可将任何所述OAS1 mRNA-特异性核酶或编码所述核酶的核酸传递至宿主细胞中以实现对OAS1基因表达的抑制。因此可通过编码与真核生物启动子(诸如真核病毒启动子)相连接的核酶的DNA将核酶等等传递至宿主细胞，使得在引入核内之后核酶将直接得以转录。
RNAi
本发明也提供将带有部分或全部双股特征的RNA引入细胞或细胞外环境中。抑制对OAS1表达为特异性的，因为来自目标OAS1基因的一部分的核苷酸序列经选择以用于产生抑制性RNA。此过程为(1)有效产生对基因表达的抑制和(2)对目标OAS1基因为特异性。所述程序可提供目标OAS1基因的部分或全部功能丧失。使用与其他目标基因相当的技术已显示至少99％的目标细胞中基因表达减少或损失。较低剂量的注射物质和双股RNA投与后的较长时间可导致较低百分率的细胞的抑制。细胞中基因表达的量化可显示在目标mRNA积累水平或目标蛋白转译水平上类似的抑制量。制备和使用RNAi的方法一般揭示于美国专利6,506,559中，此专利以引用的方式并入本文中。
RNA可包含一条或一条以上聚合的核糖核苷酸链；其可包括对磷酸酯-糖骨架或核苷的修饰。双股结构可由单条自身互补RNA链或两条互补RNA链形成。可在细胞内或细胞外引发RNA双螺旋形成。可以允许每个细胞传递至少一个拷贝的量将RNA引入。更高剂量的双股物质可导致更高效的抑制。抑制具有序列特异性，因为对应于RNA双螺旋区的核苷酸序列是以基因抑制为目标。含有与一部分OAS1目标基因相同的核苷酸序列的RNA对于抑制是优选的。也已发现相对于目标序列具有插入、缺失和单点突变的RNA序列对抑制有效。因此，可通过此项技术中已知的比对算法和计算核苷酸序列之间的差异百分比来优化序列一致性。或者，RNA双螺旋区可在功能上定义为能与一部分目标基因转录物杂交的核苷酸序列。
可在活体内或活体外合成RNA。细胞的内源性RNA聚合酶可调节活体内转录，或经克隆的RNA聚合酶可用于活体内或活体外转录。对于自活体内转基因或表达构筑体转录而言，调节区可用于转录RNA链。
对于RNAi，可将RNA直接引入细胞中(即细胞内地)，或细胞外地引入空腔(胞间隙)中，引入有机体循环中，经口引入，或可通过将有机体浸泡在含有RNA的溶液中而引入。经口引入方法包括将RNA与有机体的食物直接混合，以及基因工程学方法，其中对用作食物的物质进行基因工程改造以表达RNA，随后喂入待感染的有机体中。引入核酸的物理方法包括将RNA溶液直接注射至细胞中或细胞外注射至有机体中。
所述方法的优势包括易于将双股RNA引入细胞内、可使用低浓度的RNA、双股RNA的稳定性和抑制的有效性。
抑制基因表达意指不存在(或明显降低)来自OAS1目标基因的蛋白质和/或mRNA产物的含量。特异性意指在不对细胞其他基因产生明显影响的情况下抑制目标基因的能力。抑制结果可通过检测细胞或有机体的外部性质或通过生物化学技术来确定，这些生物化学技术例如为RNA溶液杂交法、核酸酶保护法、Northern杂交法、逆转录、以微阵列监控基因表达、抗体结合法、酶联免疫吸附分析(ELISA)、Western印迹法、放射性免疫分析(RIA)、其他免疫分析和荧光活化细胞分析法(FACS)。对于细胞系或整个有机体中由RNA调节的抑制而言，基因表达是通过使用其蛋白产物易于检定的报道基因或药物抗性基因而方便地检定。所述报道基因包括乙酰羟基酸合酶(AHAS)、碱性磷酸酶(AP)、β半乳糖苷酶(LacZ)、β葡萄糖醛酸苷酶(GUS)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、绿色荧光蛋白(GFP)、辣根过氧化物酶(HRP)、荧光素酶(Luc)、胭脂氨酸(nopaline)合酶(NOS)、章鱼氨酸(octopine)合酶(OCS)及其衍生物。可利用多种可选择的赋予对胺苄青霉素(ampicillin)、博莱霉素(bleomycin)、氯霉素(chloramphenicol)、庆大霉素(gentamycin)、潮霉素(hygromycin)、卡那霉素(kanamycin)、林可霉素(lincomycin)、甲胺喋呤(methotrexate)、草铵膦(phosphinothricin)、嘌呤霉素(puromycin)和四环素(tetracyclin)的抗性的标记物。
视分析而定，基因表达量的量化允许确定与未根据本发明处理的细胞相比超过10％、33％、50％、90％、95％或99％的抑制程度。较低剂量的注射物质和双股RNA投与后的较长时间可引起较低百分率的细胞的抑制(例如目标细胞的至少10％、20％、50％、75％、90％或95％)。细胞中OAS1基因表达的量化可显示在OAS1目标mRNA积累水平或OAS1目标蛋白转译水平上类似的抑制量。举例而言，抑制效率可通过分析细胞中基因产物的量来确定：可以具有在用于抑制性双股RNA的区以外的核苷酸序列的杂交探针来检测mRNA，或可以针对所述区的多肽序列而产生的抗体来检测经转译多肽。
RNA可包含一条或一条以上聚合的核糖核苷酸链。其可包括对磷酸酯-糖骨架或核苷的修饰。举例而言，可修饰天然RNA的磷酸二酯键以包括氮或硫杂原子中的至少一个。RNA结构中的修饰可适于允许特异性基因抑制同时避免在某些有机体中由双股RNA产生的普遍惊恐反应。同样地，可修饰碱基以阻断腺苷脱氨酶的活性。RNA可由酶促法产生或通过部分/全部有机合成产生，可通过活体外酶促合成或有机合成将任何经修饰的核糖核苷酸引入。
双股结构可由单条自身互补RNA链或两条互补RNA链形成。可在细胞内或细胞外引发RNA双螺旋形成。可以允许每个细胞传递至少一个拷贝的量将RNA引入。更高剂量(例如每个细胞至少5、10、100、500或1000个拷贝)的双股物质可导致更高效的抑制；较低剂量也可适用于特殊应用。抑制具有序列特异性，因为对应于RNA双螺旋区的核苷酸序列是以基因抑制为目标。
含有与一部分OAS1目标基因相同的核苷酸序列的RNA对抑制是优选的。相对于目标序列具有插入、缺失和单点突变的RNA序列可对抑制有效。因此，可通过序列对比和此项技术中已知的比对算法(参见Gribskov和Devereux，Sequence Analysis Primer，Stockton Press，1991及其中所引用的文献)及通过例如如BESTFIT软件程序中所实施的Smith-Waterman演算法使用默认参数(例如University of Wisconsin Genetic ComputingGroup)计算核苷酸序列之间的差异百分比来优化序列一致性。在抑制性RNA与部分OAS1目标基因之间超过90％序列一致性或甚至100％序列一致性是优选的。或者，RNA双螺旋区可在功能上定义为能与一部分OAS1目标基因转录物杂交(例如，400 mMNaCl，pH值为6.4的40 mM PIPES，1 mM EDTA，50℃或70℃下杂交12-16小时；随后洗涤)的核苷酸序列。相同核苷酸序列的长度可为至少25、50、100、200、300或400个碱基。
实施本发明并不需要RNA与OAS1目标基因之间100％的序列一致性。因此，所述方法具有能接受可能由于基因突变、菌株多形态或进化趋异而预期的序列变异的优势。
可在活体内或活体外合成OAS1 RNA。细胞的内源性RNA聚合酶可调节活体内转录，或经克隆的RNA聚合酶可用于活体内或活体外转录。对于自活体内转基因或表达构筑体转录而言，调节区(例如启动子、增强子、沉默子、剪接供体及受体、多聚腺苷酸化作用)可用于转录RNA链。有机体、组织或细胞类型中的特异性转录；环境条件刺激(例如感染、应激、温度、化学诱导剂)；和/或在发育阶段或时期的遗传工程转录均可以抑制为目标。RNA链可经或未经多聚腺苷酸化；RNA链能或不能通过细胞转译装置转译为多肽。可通过手动或自动反应而化学合成或酶促合成RNA。可通过细胞RNA聚合酶或噬菌体RNA聚合酶(例如T3、T7、SP6)合成RNA。表达构筑体的使用和产生在(参见WO第97/32016号；美国专利第5,593,874号、第5,698,425号、第5,712,135号、第5,789,214号和第5,804,693号；及其中所引用的文献)中已知。若化学合成或通过活体外酶促法合成，则RNA可在引入细胞之前进行纯化。例如，RNA可通过以溶剂或树脂萃取、沉淀、电泳、色谱分析或其组合而自混合物中纯化。或者，可使用未经纯化或最小限度纯化的RNA以避免因样本处理而引起的损失。可将RNA干燥储存或溶解于水溶液中。所述溶液可含有缓冲液或盐以促进双螺旋链的退火和/或稳定化。
可将RNA直接引入细胞中(即细胞内地)；或细胞外地引入空腔(胞间隙)中，引入有机体的循环中，经口引入，或可通过将有机体浸泡在含有RNA的溶液中而引入。经口引入方法包括将RNA与有机体食物直接混合，以及遗传工程学方法，其中对用作食物的物质进行遗传工程操作以表达RNA，随后喂入待感染的有机体中。举例而言，可将RNA喷射在植物上或可以基因工程学方法改造植物使其表达足够量的RNA以杀灭一些或全部已知会感染植物的病原体。也可使用引入核酸的物理方法，例如直接注射至细胞内或细胞外注射至有机体内。RNA可引入的位点为血管或血管外循环、血液或淋巴系统和脑脊髓液。表达来自重组构筑体的RNA的转基因有机体可通过将所述构筑体引入来源于适当有机体的接合子、胚胎干细胞或另一多潜能细胞而产生。
引入核酸的物理方法包括注射含有RNA的溶液、通过经RNA覆盖的粒子轰击、将细胞或有机体浸泡在RNA溶液中或在RNA存在下电穿孔细胞膜。封装入病毒粒子中的病毒构筑体将实现表达构筑体至细胞内的有效引入和由所述表达构筑体所编码的RNA的转录。可使用此项技术中已知的将核酸引入细胞内的其他方法，诸如由脂质调节的载剂输送、由化学品(诸如磷酸钙)调节的输送等等。因此可将RNA连同执行下列活动中的一种或一种以上的组份一起引入：增强RNA被细胞摄取、促进双螺旋链退火、稳定退火链或另外增加目标基因的抑制。
本发明可单独使用或作为试剂盒的组份使用，所述试剂盒含有为进行活体外或活体内将RNA引入测试样本或受检者所必需的试剂中的至少一种。优选的组份为双股RNA和促进双股RNA引入的媒剂。所述试剂盒也可包括允许试剂盒使用者实施本发明的说明书。
建构适当的注射混合物使得动物接收平均0.5×106至1.0×106个RNA分子。为比较有义、反义和双股RNA活性，以相等质量RNA(即双股RNA摩尔浓度为单股摩尔浓度的一半)来比较注射。基于注射物质中的RNA浓度(由溴化乙锭染色评估)和注射体积(由注射部位的可见位移评估)粗略大致地给出每个成人所注射的分子数。个别动物之间注射体积上的数倍变化性是可能的。
蛋白质和多肽
除本文中所揭示的反义分子和核酶以外，本发明的OAS1抑制剂也包括有效减少OAS1基因表达或有效降低OAS1生物学活性中的一种或一种以上的蛋白质或多肽，所述生物学活性包括(但不限于)酶活性；与单股RNA构型相互作用；和与诸如C型肝炎病毒NS5A或其片段的其他蛋白结合。熟练技工可通过此项技术中易于利用的多种方法经由常规实验法快速鉴别所述OAS1抑制剂。本发明不受限于以下例示性方法。
熟练技工可利用描述检测和分析蛋白与蛋白之间相互作用的文献。于Phizicky等人，Microbiological Reviews 59：94-123，1995中评述，此文献以引用的方式并入本文中。所述方法包括(但不限于)：物理方法，例如蛋白亲和色谱法、亲和印迹法、免疫沉淀法和交联法；以及基于文库的方法，例如蛋白探测法、噬菌体展示法和双杂交体筛检法。其他可用于鉴别蛋白与蛋白之间相互作用的方法包括基因方法，诸如使用基因外抑制基因、合成致死效应和未连接型非互补。例示性方法在以下进一步详细描述。
可经由依赖于OAS1蛋白与潜在抑制剂蛋白组或文库之间的直接相互作用的生物学筛检分析来鉴别本发明的OAS1抑制剂。包括各种“n杂交体技术”的生物学筛检方法例如描述于Vidal等人，Nucl.Acids Res.27(4)：919-29，1999；Frederickson，R.M.，Curr.Opin.Biotechnol.9(1)：90-96，1998；Brachmann等人，Curr.Opin.Biotechnol.8(5)：561-68，1997；和White，M.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：10001-03，1996中，各文献均以引用的方式并入本文中。
双杂交体筛检方法可用于寻找具有抑制性质的OAS1结合蛋白的新颖或现有目标cDNA文库。双杂交体系统是借助于增加报道基因的转录来检测蛋白与蛋白之间相互作用的基因方法。所述系统依赖于位点特异性转录活化子具有DNA结合域和转录活化域的事实。DNA结合域使活化域靶向于待表达的特异基因。由于转录活化子的模块式性质，因此DNA结合域可自转录活化域共价分开而不会损失任一域的活性。此外，这两个域可因两种与转录机构无关的蛋白之间的蛋白与蛋白接触而毗邻。因此，建构双杂交体以创建功能系统。第一杂交体(即诱饵)是由融合至相关蛋白的转录活化子DNA结合域组成。第二杂交体(目标)是由转录活化域与蛋白或多肽文库融合而产生。诱饵蛋白与目标文库的成员之间的相互作用导致DNA结合域与转录活化域毗邻和随之发生的报道基因表达的上调。
熟练技工可利用多种基于双杂交体的系统，最常用的是酵母Gal4或大肠杆菌LexADNA结合域(BD)和酵母Gal4或单纯疱疹病毒VP16转录活化域。Chien等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88：9578-82，1991；Dalton等人，Cell 68：597-612，1992；Durfee等人，Genes Dev.7：555-69，1993；Vojtek等人，Cell 74：205-14，1993；和Zervos等人，Cell72：223-32，1993。常用报道基因包括大肠杆菌lacZ基因以及可选择的酵母基因，诸如HIS3和LEU2。Fields等人，Nature(London)340：245-46，1989；Durfee，T.K.，同上；和Zervos，A.S.，同上。此项技术中有多种活化域文库易于利用，使得可通过常规实验法进行相互作用的蛋白的筛检。
用于鉴别OAS 1相互作用蛋白的适当诱饵蛋白可基于本文中作为SEQ ID NO：19呈现的OAS1 DNA序列而设计。所述诱饵蛋白包括全长OAS1蛋白或其片段。
用于制备OAS1诱饵构筑体和目标文库的质粒载体(诸如pBTM116和pAS2-1)为技工易于利用的且可自诸如Clontech(Palo Alto，CA)、Invitrogen(Carlsbad，CA)和Stratagene(La Jolla，CA)的商业来源获得。这些质粒载体允许cDNA与分别作为LexA或Gal4BD的DNA结合域框内融合。
或者可通过此项技术中可利用的检测蛋白与蛋白相互作用的物理或生化方法中的一种来鉴别本发明的OAS1抑制剂。
经由蛋白亲和色谱方法，作为潜在OAS1抑制剂的待测试的先导化合物可借助其在共价或非共价偶合至固体基质(诸如琼脂糖珠粒)时对OAS1的特异性滞留而加以鉴别。蛋白亲和柱的制备在例如Beeckmans等人，Eur.J.Biochem.117：527-35，1981和Formosa等人，Methods Enzymol.208：24-45，1991中描述。含有细胞蛋白的完全补体的细胞溶解产物可穿过OAS1亲和柱。对OAS1具有高亲和性的蛋白在低盐条件下将特异性滞留，而大多数细胞蛋白将穿过柱。可在高盐条件下以离液溶剂或以十二烷基硫酸钠(SDS)将所述高亲和性蛋白自固定化OAS1洗提。在某些实施例中，最好在制备溶解产物之前对细胞进行放射性同位素标记以有助于鉴别OAS1特异性结合蛋白。对哺乳动物细胞进行放射性同位素标记的方法在此项技术中为熟知的且例如在Sopta等人，J.Biol.Chem.260：10353-60，1985中提供。
可将用于亲和色谱法的适当OAS1蛋白融合至蛋白或多肽以允许在适当亲和树脂上快速纯化。例如，可将OAS1 cDNA融合至有利于融合蛋白吸附至谷胱甘肽-琼脂糖柱上的谷胱甘肽S-转移酶(GST)的编码区。Smith等人，Gene 67：31-40，1988。或者，融合蛋白可包括：蛋白A，其可在具有免疫球蛋白G的柱上纯化；含有寡组氨酸的肽，其可在具有Ni2+的柱上纯化；麦芽糖结合蛋白，其可在含有直链淀粉的树脂上纯化；和二氢叶酸还原酶，其可在甲胺喋呤柱上纯化。一种适于制备本文中所提供的OAS1融合蛋白的例示性标记为流感病毒红血球凝聚素(HA)的抗原决定基，可易于获得针对其的单克隆抗体且可自所述抗体制备亲和柱。
在经受SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)后可鉴别特异性滞留在OAS1亲和柱上的蛋白。因此，在制备细胞溶解产物且穿过OAS1亲和柱之前对细胞进行放射性同位素标记时，可通过放射自显影法检测对OAS1具有高亲和性的蛋白。可通过熟练技工易于使用的蛋白测序技术确定OAS1特异性结合蛋白的一致性，诸如Mathews，C.K.等人，Biochemistry，The Benjamin/Cummings Publishing Company，Inc.，1990，第166-70页。
小分子
本发明也提供可经由常规应用高通量筛检(HTS)方法而易于鉴别的小分子OAS1抑制剂。由Persidis，A.，Nature Biotechnology 16：488-89，1998评述。HTS方法一般意指允许快速分析先导化合物(诸如小分子)的治疗潜力的那些技术。HTS方法采用测试物质的自动机械处理、正信号检测和数据解译。举例而言，所述方法包括使用可溶性分子以及基于细胞的系统(诸如以上详述的双杂交体系统)的自动机械筛检技术。
可利用多种基于细胞系的HTS方法，其优点为操作简便和相对于溶液形式在细胞背景中所发生的相互作用的临床关联性。先导化合物可经由并入放射性或经由依赖于所读取的吸光度、荧光性或发光性的光学分析来鉴别。例如参见Gonzalez等人，Curr.Opin.Biotechnol.9(6)：624-31，1998，其以引用的方式并入本文中。
举例而言，HTS方法可用于筛检阻断OAS1的一种生物学活性的先导化合物。通过此方法，OAS1蛋白可自表达所述蛋白的细胞中免疫沉淀且施加于适于自动机械筛检的分析板上的孔中。随后个别测试化合物可与免疫沉淀的蛋白接触且分析每个测试化合物对OAS1的效应。
评定OAS1抑制剂功效的方法
通过一种本文中所述的方法或经由此项技术中另外可利用的技术鉴别的先导分子或化合物，不论其为反义分子或核酶、蛋白和/或肽、抗体和/或抗体片段或小分子，均可在多种试管内、活体外和活体内动物模型分析系统中进一步表征其抑制OAS1基因表达的能力或生物学活性。如下提供的实例中进一步详细讨论，本发明的OAS1抑制剂可有效降低OAS1表达水平。因此，本发明进一步揭示允许熟练技工评定候选抑制剂的作用的方法。
候选OAS1抑制剂可通过投与表达内源性OAS1或通过以重组OAS1质粒构筑体转染哺乳动物细胞来表达OAS1的细胞而进行测试。
有效OAS1抑制性分子将有效减少OAS1的酶活性或OAS1对IFN诱导的反应能力。测量OAS1酶活性和IFN诱导的方法在此项技术中为已知的，例如如Eskildsen等人，Nuc.Acids Res.31：3166-3173，2003和Justesen等人，Nuc.Acids Res.8：3073-3085，1980中所述，所述文献以引用的方式并入本文中。可通过与已知在投与哺乳动物细胞时对OAS1表达无实质影响的对照“反义”分子相比来评定给定候选反义分子的有效性。
进一步在活体外表征通过如上所讨论的方法中的一种或一种以上有效减少OAS1基因表达的OAS1抑制剂在一种如本文中所讨论的易于建立的细胞培养物或原始细胞培养模型系统中的功效，参考通过诸如登革热病毒的黄病毒感染而攻毒的Vero细胞的用途。
医药组合物
可通过此项技术中已知的任何用于核糖核酸核苷酸或脱氧核糖核酸核苷酸的方法来合成本发明的反义寡核苷酸和核酶。例如，可使用固相合成诸如在Applied Biosystems380B DNA合成仪中制备寡核苷酸。如此项技术中所知来测定寡核苷酸的最终纯度。
使用本发明方法所鉴别的反义寡核苷酸调节肿瘤细胞增殖。因此，提供用于干扰病毒感染、优选为黄病毒感染、最优选为HCV感染的医药组合物和方法，其包含将组织或细胞与使用本发明方法所鉴别的反义寡核苷酸中的一种或一种以上接触。
本发明提供与OAS1 mRNA基因序列互补的反义寡核苷酸和核酶的医药组合物作为活性成份用于治疗应用。这些组合物也可用于本发明的方法中。当需要时，所述化合物具有核酸酶抗性。一般来说，用于抑制哺乳动物中病毒感染的医药组合物包括有效量的至少一种如上所述为实施本发明所需要的反义寡核苷酸，或显示具有相同作用的其片段，和医药学及生理学上可接受的载剂或稀释剂。
组合物可经口、皮下或非经肠(包括静脉内、动脉内、肌肉内、腹膜内和鼻内投与)以及视需要的鞘内和输注技术投与。医药学上可接受的载剂、稀释剂、佐剂和媒剂以及植入式载体一般意指不与本发明的活性成份反应的惰性、无毒固体或液体填料、稀释剂或封装物质。组合物中也可包括阳离子脂质以有利于寡核苷酸摄取。化合物的植入也适用。一般来说，医药组合物是无菌的。
生物活性(可表达的)意指当寡核苷酸直接传递至细胞时其在细胞内具有生物学活性和/或当在如下描述的载体中传递至细胞时其由适当启动子来表达并呈活性。核酸酶抗性是由此项技术中已知的不实质上干扰如本文中所述的生物学活性的任何方法提供。
“接触细胞”意指将反义寡核苷酸直接或通过病毒或非病毒载体暴露或传递至细胞且其中在传递后反义寡核苷酸具有生物活性的方法。
可直接或以病毒或非病毒载体传递本发明的核苷酸序列。当直接传递时所述序列一般赋予核酸酶抗性。或者，可将序列并入表达框或构筑体中使得所述序列在细胞内得以表达。一般来说，所述构筑体含有适当的调节序列或启动子以使序列将在目标细胞中得以表达。
一旦寡核苷酸序列准备开始传递，则如此项技术中已知可将其引入细胞中。转染、电穿孔、融合、脂质体、胶状聚合粒子和病毒载体以及此项技术中已知的其他方法可用于将寡核苷酸序列传递至细胞。所选方法将至少取决于待处理的细胞和所述细胞的位置且为所属领域技术人员所知。定位可由表面具有用于指导脂质体的特异性标记物的脂质体、通过直接注入含有目标细胞的组织中、通过具有与目标细胞在空间邻接性上相关的储槽、由特异性受体调节的摄取、病毒载体等等来达成。
本发明提供包含可经由操作连接至本发明的寡核苷酸序列的表达控制序列的载体。本发明进一步提供选自适当的真核和原核生物细胞的宿主细胞，其必要时以这些载体转化。
载体为已知的或可由所属领域技术人员建构且应含有为达成所要序列转录所必需的所有表达元件。载体内也可含有其他有益特征，诸如回收不同形式的寡核苷酸的机制。噬菌粒为所述有益载体的特例，因为其可用作质粒或噬菌体载体。其他载体的实例包括诸如噬菌体、杆状病毒和逆转录病毒的病毒、DNA病毒、脂质体及其他重组载体。所述载体也可含有用于原核或真核生物宿主系统中的元件。一般技术者将了解何种宿主系统与特定载体相容。
可通过多种此项技术中已知的方法中的任一种将载体引入细胞或组织中。可发现所述方法概述于Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringsHarbor Laboratory，New York，1989，1992；Ausubel等人，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley and Sons，Baltimore，MD，1989；Chang等人，Somatic Gene Therapy，CRC Press，Ann Arbor，Mich.，1995；Vega等人，Gene Targeting，CRC Press，Ann Arbor，Mich.，1995；Vectors：A Survey of Molecular Cloning Vecors and Their Uses，Butterworths，Boston，Mass.，1988；和Gilboa等人，BioTechniques 4：504-12，1986中，且例如包括稳定或瞬时转染、脂质转染(lipofection)、电穿孔和以重组病毒载体感染。
此项技术中已知的重组方法也可用于达成目标核酸的反义抑制。例如，含有反义核酸的载体可用于表达反义信息以减少目标核酸的表达且因此降低其活性。
本发明也提供一种评估化合物是否抑制OAS1基因转录或转译且因此调节(即削弱)细胞活化RNaseL的能力的方法，其包含以包含编码OAS1的核酸序列、核酸转录或转译的必要元件的表达载体来转染细胞；投与测试化合物；和将OAS1表达水平与不存在所述测试化合物的对照所获得的水平相比较。
优选实施例
利用上述方法和此项技术中已知的其他方法，本发明涵盖一种筛检方法，其包含在扩增条件下以PCR引物对处理分离自人类的基因组DNA样本，以用于扩增含有寡腺苷酸合成酶(OAS1，SEQ ID NO：19)的核苷酸(nt)位置2135728、2135749、2135978、2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、2144985、2156523、2156595或2156638的任一者的人类基因组DNA区。扩增条件包括存在对DNA合成有效量的PCR缓冲液和热循环温度。分析如此产生的PCR产物在相应核苷酸位置处点突变的存在。在一实施例中，PCR产物含有包含自5′至3′方向书写的约358个碱基对(bp)且包括位置2135728(突变1)、2135749(突变2)、2135978(突变3)、2144072(突变4)、2144088(突变5)、2144116(突变6)或2144321(突变7)和在每一侧与所述位置侧接的约175个碱基的连续核苷酸序列。在另一实施例中，表1和表2中如上所述的扩增子为PCR产物和相应引物的例证。
在一优选实施例中，通过在杂交条件下以对相应突变呈特异性的寡核苷酸探针处理扩增产物且检测任何杂交产物的形成来检定PCR产物的相应突变。优选的寡核苷酸探针包含以下表3中所指明的核苷酸序列。寡核苷酸与目标核酸的杂交描述于美国专利第4,530,901号中。
表3
突变SEQ IDNO  探针序列
SEQ ID NO：1  GTAGATTTTGCCYGAACAGGTCAGT(SEQ ID NO：12)
SEQ ID NO：2  CAGTTGACTGGCRGCTATAAACCTA(SEQ ID NO：13)
SEQ ID NO：3  CAGAGGAGGGGTRGGGGGAGGAGA(SEQ ID NO：14)
SEQ ID NO：4  TCTCACCCTTTCARGCTGAAAGCAAC(SEQ ID NO：15)
SEQ ID NO：5  GAAAGCAACAGTRCAGACGATGAGA(SEQ ID NO：16)
SEQ ID NO：6  ACGATCCCAGGASGTATCAGAAATAT(SEQ ID NO：17)
SEQ ID NO：7  TTGATCCAGAGARGACAAAGCTCCTC(SEQ ID NO：18)
其中R＝A/G、S＝C/G且Y＝C/T。
使如此形成的PCR混合物经受多个PCR热循环以产生OAS1和OAS1R基因扩增产物。随后在杂交条件下以对每一突变均呈特异性的寡核苷酸探针处理扩增产物。随后检测任何杂交产物。
以下实例旨在阐明本发明而并非理解为以任何方式限制本说明书和权利要求。
实例
实例1
基因组DNA的制备和初步筛检
此实例涉及自两类特定患者群体筛检DNA，但同样应用于其他经证实反复暴露于HCV的患者组，其中所述暴露并未导致感染。所述实例也涉及筛检已暴露于如上所述的其他黄病毒的患者，其中所述暴露并未导致感染。
此处，研究两类群体：(1)血友病群体，选择标准为中度至严重血友病且在1987年1月之前接收浓缩凝血因子；和(2)静脉药物使用者群体，其注射史超过10年且证明有其他危险行为，诸如共用注射针。所述研究包括经暴露但HCV阴性的患者和经暴露且HCV阳性的患者。
自来自静脉药物使用者、血友病患者及其他具有C型肝炎感染或其他黄病毒感染风险的群体的白细胞中萃取高分子量DNA。为进行基因组DNA的初始筛检，在得到如上所述的组中的患者同意之后采集血液并用0.14M柠檬酸、0.2M柠檬酸三钠和0.22M右旋糖的混合物防止凝血。将未凝固血液在室温下以800×g离心15分钟并丢弃富含血小板的血浆上清液。将粒状红血球、单核及多核细胞再悬浮并以与初始血液体积相同体积的pH值为7.4的冰冷0.14 M磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释。通过在低内毒素Ficoll-Hypaque(Sigma Chem.Corp.St.Louis，Mo.)上于18℃下以400×g离心10分钟而自经稀释的细胞悬浮液回收周边血液白细胞。随后将粒状白细胞再悬浮并用于高分子量DNA的来源。
使用所属领域技术人员熟知和由Maniatis等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Sections 9.16-9.23，(1989)及美国专利号第4,683,195号所描述的方法自经分离的白细胞纯化高分子量DNA。
随后检查每一DNA样本在对应于寡腺苷酸合成酶1基因(OAS1)的Genbank登记号第NT_009775.13号的核苷酸位置的2135728、2135749、2135978、2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、2144985、2156523、2156595或2156638位置处的任一核苷酸的点突变。
实例2
与HCV感染抗性相关的OAS1基因中的突变
使用实例1中所述的方法，研究一群非相关血友病患者和静脉药物使用者，并确定是否存在如SEQ ID NO：1-7和SEQ ID NO：57-64中所揭示的OAS1中的突变。
在对高加索群体中20个病例和42个对照的研究中，在C型肝炎感染抗性的情况下发现了这些突变。HCV感染抗性与OAS1中点突变的存在之间存在统计学上的显著相关性。
实例3
cDNA的制备和测序
自来自具有C型肝炎抗性表现型的患者的经培养的淋巴母细胞或成纤维细胞纯化总细胞RNA。如Chomczynski等人，Anal.Biochem.，162：156-159(1987)所述执行纯化程序。简言之，如实例1中所述制备细胞。随后在10毫升(ml)含有4.0M硫氰酸胍、pH值为7.5的0.1M Tris-HCl和0.1M β-巯基乙醇的变性溶液中将所述细胞均质化以形成细胞溶解产物。随后将十二烷基肌氨酸钠混合至细胞溶解产物中直至最终浓度为0.5％，其后将混合物在室温下以5000×g离心10分钟。将所得含有总RNA的上清液在pH值为7.5的5.7M氯化铯和0.01M EDTA缓冲垫上分层并通过离心颗粒化。将所得RNA颗粒溶解于含有0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)的pH值为7.6的10mM Tris-HCl与1mM EDTA(TE)的溶液中。在苯酚氯仿萃取和乙醇沉淀之后，通过测量260nm下的光密度来估计纯化的细胞RNA总浓度。
以上制备的总RNA是用作cDNA合成的模板，cDNA合成中使用逆转录酶用于第一链合成并以所设计的寡核苷酸引物进行PCR以致在命名为5′和3′片段的两个重叠片段中扩增cDNA。按照厂商说明书在Applied Biosystems 381A DNA合成仪上合成用于实施本发明的寡核苷酸。使用此项技术中已知的方法进行PCR。PCR扩增方法详细描述于美国专利第4,683,192号、第4,683,202号、第4,800,159号和第4,965,188号中且至少描述于包括PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification，H.Erlich编，Stockton Press，New York(1989)和PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，Innis等人编，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)及本文表1所述的引物的若干本教科书中。
分析来自感染HCV或未感染HCV患者的经PCR扩增的DNA所直接测定的序列。可检测尽管反复暴露于病毒下但仍呈HCV血清阴性的患者中OAS基因编码区上游中突变的存在。
实例4
经PCR扩增的含有点突变的基因组DNA的制备和通过等位基因特异性寡核苷酸杂交的检测
寡腺苷酸合成酶(OAS1)基因中在核苷酸位置2135728、2135749、2135978、2144072、2144088、2144116、2144321、2131025、2133961、2139587、2144294、2144985、2156523、2156595或2156638中的一个位置的点突变可通过以下方法确定：其中经由以与所述区杂交的寡核苷酸探针杂交来检测经PCR扩增的含有突变的基因组DNA。为扩增含有点突变的区以用于与寡核苷酸特异性探针杂交，例如用180 ng表1中所示的每一个引物基本上如实例3中所述执行PCR扩增。
PCR扩增之后，将2μl经扩增的寡腺苷酸合成酶DNA产物转渍于硝化纤维素的单独薄片上。在干燥经转渍的扩增DNA之后，以0.5N NaOH处理硝化纤维素2分钟，以pH值为7.5的1M Tris-HCl处理2分钟，随后以含有1.5M NaCl的pH值为7.5的0.5MTris-HCl处理2分钟以使DNA变性并随后中和。将所得滤器在80℃下于真空中烘焙1小时，并以由6×SSC(1×＝0.15M NaCl、0.15M柠檬酸钠)、5×Denhardt溶液(5×＝0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％菲可(ficoll)和0.1％牛血清白蛋白)、5mM pH值为7.0的磷酸钠缓冲液、0.5mg/ml鲑鱼睾丸DNA和1％SDS组成的预杂交溶液在42℃下预杂交至少20分钟。
预杂交步骤之后，将硝化纤维素滤器分别暴露于32P标记的于预杂交缓冲液中稀释的寡核苷酸探针。通过将2.5μl激酶缓冲液的10×浓缩液(10×＝pH值为7.6的0.5MTris[羟甲基]氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、0.1M MgCl2、50mM二硫苏糖醇(DTT)、1mM亚精胺-HCl和1mM乙二胺四乙酸(EDTA))、1.1μl 60μg/μl的所选寡核苷酸、18.4μl水、浓度为150mCi/μl的2μl 6000Ci/mM的γ32P ATP和1μl 10U/μl的聚核苷酸激酶混合来进行32P对探针的标记。将标记混合物在37℃下保持20分钟，随后在68℃下保持2分钟。随后将经保持混合物施用于Sephadex G50(Pharmacia，Inc.，Piscataway，NJ)旋转柱以移除未并入的经32P标记的ATP。
以上表3中显示用于与含有突变的区杂交的寡核苷酸探针。有下划线的核苷酸对应于突变核苷酸。在用于检测野生型(正常)的探针中，以野生型核苷酸置换有下划线的核苷酸。
将10×106cpm的正常和突变型经标记探针分别与每一滤器混合。随后在42℃下保持硝化纤维素滤器整夜以使得形成杂交产物。将暴露于正常探针的硝化纤维素滤器以含有0.1％SDS的6×SSC于46℃下洗涤，而将暴露于突变型探针的滤器以相同溶液在更严格温度52℃下洗涤。随后将硝化纤维素滤器干燥并经受放射自显影术。
仅那些具有点突变的产物与突变型探针杂交。每一分析中均包括阳性和阴性对照以确定PCR扩增是否成功。因此，通过此方法确定实例1中所制备的患者基因组DNA在指定位置具有由非野生型核苷酸取代野生型核苷酸的独特点突变。
实例5
目标RNA的反义抑制
A.用于转染的寡核苷酸的制备
通过在水中稀释至0.5mM、随后通过超声波处理以产生均匀溶液并滤经0.45μmPVDF薄膜来制备包含类脂质或胆固醇的载剂分子以用于转染。随后将类脂质或胆固醇稀释至适当体积的OptiMEMTM(Gibco/BRL)中使得最终浓度为约1.5-2nmol类脂质/μg寡核苷酸。
通过首先在无菌Millipore水中稀释至100μM的工作浓度、随后在OptiMEMTM中稀释至2μM(约20mg/mL)来制备反义和对照寡核苷酸。随后立即将经稀释的寡核苷酸加入经稀释的类脂质中并通过上下吹吸而混合。
B.转染
使用易受HCV感染且支持HCV复制的人类PH5CH8肝细胞(Dansako等人，VirusRes.97：17-30，2003；Ikeda等人，Virus Res.56：157-167，1998；Noguchi和Hirohashi，InVitro Cell Dev.Biol Anim.32：135-137，1996)。所述细胞是通过在混合后立即加入寡核苷酸/类脂质混合物直到寡核苷酸最终浓度为300nM而转染。随后将细胞与转染混合物在37℃、5％CO2下培育整夜并将转染混合物在细胞上保持3-4天。
C.总RNA萃取和逆转录
按照生产商提供的方案使用RNeasyTM试剂盒(Qiagen Corporation，Chatsworth，CA)自经转染细胞萃取总RNA。萃取后将RNA逆转录以用作PCR模板。一般将0.2-1μg经萃取的总RNA置放于无菌微离心管中，并加水使总体积达到3μL。向每一管中加入7μL缓冲液/酶混合物。通过按所列次序混合来制备缓冲液/酶混合物：
4μL 25mM MgCl2
2μL 10×反应缓冲液
8μL 2.5mM dNTP
1μL MuLV逆转录酶(50u)(Applied Biosystems)
1μL RNase抑制剂(20u)
1μL寡聚dT(50pmol)
通过上下吹吸来混合微离心管中的内容物，并在42℃下培育反应物1小时。
D.目标序列的PCR扩增和量化
逆转录之后，使用Roche Light CyclerTM即时PCR仪扩增目标基因。通过将以下组份按所列次序混合来制备PCR扩增混合物的20μL等份试样：2μL 10×PCR缓冲液II(含有10mM pH值为8.3的Tris和50mM KCl，Perkin-Elmer，Norwalk，CT)、3mMMgCl2、140μM每一dNTP、0.175pmol每一OAS1寡聚物、SYBR
Figure 048386069_2
Green的1∶50,000稀释液、0.25mg/mL BSA、1单位Taq聚合酶和为达到20μL的H2O。SYBRGreen(Molecular Probes，Eugene，OR)是一种当与双股DNA结合时发出荧光的染料，由此可直接测量每一反应中产生的PCR产物量。将2μL完全逆转录反应物加入PCR扩增混合物的每一20μL等份试样中，并根据标准实验方案进行扩增。
实例6
以OAS1 RNAi处理细胞
使用实例5的用于反义处理的方法以基于OAS1序列(SEQ ID NO：19)的寡核苷酸处理细胞。合成并退火两个在3′末端具有脱氧-TT延伸的互补核糖核苷酸单体。以50-200nM具有1∶3 L2类脂质的RNAi处理PH3CH8肝细胞系的细胞。在第1、2、3和4天收集细胞并通过Western分析法分析OAS 1蛋白，如Dansako等人，Virus Res.97：17-30，2003所述。
实例7
OAS1与C型肝炎病毒NS5A蛋白的相互作用
使用Taguchi，T.等人，J.Gen.Virol.85：959-969，2004中所述的方法分析本发明的OAS1蛋白或多肽与C型肝炎病毒NS5A蛋白相互作用的能力。如上所述制备编码OAS1蛋白和多肽的聚核苷酸，并使用诸如Taguchi，T.等人所述的常规方法建构质粒。一种质粒含有编码OAS1蛋白或多肽的聚核苷酸，而另一质粒含有编码NS5A的聚核苷酸。所述质粒也编码各自蛋白的适当标记，诸如FLAG-标记、HA或GST。以编码标记和NS5A蛋白的质粒和编码不同标记和OAS1蛋白或多肽的质粒瞬时转染适当的细胞，诸如HeLa细胞。如(Taguchi，T.等人)所述培育并制备上清液之后，可使用多种分析技术检测和量化NS5A与OAS1蛋白或多肽的结合。所述技术为此项技术中已知且包括共沉淀分析法、免疫荧光分析法和免疫印迹分析法。未显示与NS5A结合的OAS1蛋白和聚核苷酸适于作为C型肝炎感染的抑制剂而进一步分析。
实例8
OAS1的化学和空间保守区
如所属领域技术人员所认为的，当修饰OAS1的结构以提高酶活性或治疗潜力时，某些残基或残基区必定在化学及结构上为保守的。以实例说明，以下描述几种保守域。如所属领域技术人员所认为的，可容许对一些保持蛋白质结构和功能的氨基酸进行化学保守性改变。例如，Asp75和Asp77均与对OAS1功能为必要的催化性二价金属离子配位。当容许对这些碱基进行修饰时(例如对天冬酰氨酸或谷氨酸)，这些残基的本质上的极性和酸性性质必须受到保持。
举例而言，关于SEQ ID NO：26-29、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：50，以下多肽片段表示保守域：
氨基酸40-47：FLKERCFR(SEQ ID NO：75)
氨基酸55-82：VSKVVKGGSSGKGTTLRGRSDADLVVFL(SEQ ID NO：76)
氨基酸94-112：RRGEFIQEIRRQLEACQRE(SEQ ID NO：77)
氨基酸128-138：NPRALSFVLSS(SEQ ID NO：78)
氨基酸145-158：VEFDVLPAFDALGQ(SEQ ID NO：79)
氨基酸182-198：KEGEFSTCFTELQRDFL(SEQ ID NO：80)
氨基酸201-217：RPTKLKSLIRLVKHWYQ(SEQ ID NO：81)
氨基酸225-241：KLPPQYALELLTVYAWE(SEQ ID NO：82)
氨基酸296-307：PVILDPADPTGN(SEQ ID NO：83)
氨基酸337-343：GSPVSSW(SEQ ID NO：84)
实例9
改良酶活性位点的氨基酸变化
可设想改良蛋白质酶活性的OAS氨基酸序列变化。在一优选实施例中，可对酶的活性位点内的氨基酸进行修饰以改良ATP或金属离子结合、酶效率和酶的可反应性。所述改变的一实例为在SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：48的氨基酸位置61处以酪氨酸取代甘氨酸。以化学上无害的甘氨酸取代极性酪氨酸将有利于ATP的N3原子与此氨基酸位置之间的氢键合，从而改良此相互作用的解离常数和能量学。举例而言，在可反应性更高的poly-A聚合酶中于此位置上发现了酪氨酸。如所属领域技术人员所了解的，可设想其他修饰。
实例10
改良双股RNA结合的氨基酸变化
对OAS进行的改良酶活性的氨基酸修饰的第二实例可为那些稳定此蛋白与双股病毒RNA之间相互作用的修饰。下表列出那些处在蛋白的RNA结合槽中的氨基酸和几种为稳定碱性、带正电荷的氨基酸侧链与带负电荷的核糖核酸之间的相互作用而设计的建议变化。设想增加蛋白的RNA结合槽中的正电荷密度的变化。如所属领域技术人员所认为的，可设想对RNA结合槽的相似类型的修饰。
表4
对RNA结合槽中氨基酸的建议变化
氨基酸 位置 建议修饰
甘氨酸 39 精氨酸或赖氨酸
赖氨酸 42 精氨酸
赖氨酸 60 精氨酸
精氨酸 195 赖氨酸
赖氨酸 199 精氨酸
赖氨酸 204 精氨酸
实例11
基因突变分析
所属领域技术人员认为，存在大量其他分析方法以评定基因分析中特定突变的进化重要性。一个实例为熟知的通常称为D′的连锁不均衡估计值的计算(Lewontin，Genetics49：49-67，1964)。其他尤其相关方法试图通过比较基因座中高、中或低频率突变的相对丰度来评估基因座内选择压力和/或近代进化事件(例如选择性清洗)。这些测试中最熟悉的是Tajima D统计法(Tajima，Genetics 123：585-595，1989)。Fu和Li，Genetics133：693-709(1993)已开发出Tajima的变型及其他也利用关于每一突变的遗传等位基因的知识的统计法。将这些及其他方法应用于本发明的突变以评定对所观察到的效应的相对贡献。
上述包括特定实施例和实例的说明书是用以阐明而非限制本发明。在不偏离本发明的真实精神和范畴的情况下可进行许多其他改变和修改。所引用的所有专利、专利公开案和非专利公开案均以引用的方式并入本文中。

Claims (17)

1.一种经分离的多肽，其是由选自由SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50组成的群组的氨基酸序列组成。
2.根据权利要求1所述的经分离的多肽，其N末端仅存在单个甲硫氨酸残基。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的经分离的多肽，其与包含蛋白转导域的多肽共价连接。
4.根据权利要求3所述的经分离的多肽，其中所述蛋白转导域包含选自由SEQ IDNO：85-94组成的群组的多肽。
5.根据权利要求3所述的经分离的多肽，其中所述蛋白转导域因精氨酸、赖氨酸或组氨酸的加入或取代而不同于选自由SEQ ID NO：85-94组成的群组的多肽。
6.根据权利要求1-5中任一权利要求所述的经分离的多肽，其与聚乙二醇共价连接。
7.根据权利要求1-5中任一权利要求所述的经分离的多肽，其封装于脂质体中。
8.根据权利要求1-5中任一权利要求所述的经分离的多肽，其与内体破裂剂共价连接。
9.根据权利要求1-5中任一权利要求所述的经分离的多肽，其与内体破裂剂非共价连接。
10.根据权利要求8所述的经分离的多肽，其中所述内体破裂剂具有pH敏感性。
11.根据权利要求9所述的经分离的多肽，其中所述内体破裂剂具有pH敏感性。
12.根据权利要求1-5中任一权利要求所述的经分离的多肽，其与糖部分共价共轭。
13.根据权利要求12所述的经分离的多肽，其中所述糖部分包含半乳糖或甘露糖。
14.根据权利要求1-5中任一权利要求所述的经分离的多肽，其是由重组宿主细胞产生。
15.根据权利要求1-5中任一权利要求所述的经分离的多肽，其包含异源多肽序列。
16.一种经分离的多肽，其是通过包含以下步骤的方法产生：
(a)由细胞表达根据权利要求1-5中任一权利要求所述的多肽；和
(b)回收所述多肽。
17.一种组合物，其包含根据权利要求1-16中任一权利要求所述的经分离的多肽和医药学上可接受的载剂。
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