CN109852602A - 一种提高酶稳定性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高酶稳定性的方法，属于酶技术领域。本发明的方法通过在酶的N端由连接肽(linker)连接双亲短肽(SAP)大大提高了酶的稳定性；利用本发明的方法制备得到的脂肪氧合酶在50℃保温30min后仍然保持初始酶活的95％以上，而相同条件下野生型LOX只保留初始酶活20％左右；利用该方法制备得到的碱性果胶酶在60℃保温30min后仍然保持初始酶活的97％以上，而相同条件下野生型LOX只保留初始酶活35％左右；利用该方法制备得到的天冬酰胺酶在在60℃保温30min后可保持初始酶活的120％以上，而相同条件下野生型LOX只保留初始酶活30％左右。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高酶稳定性的方法，属于酶技术领域。
背景技术
基于热稳定性对酶应用性能的重要影响，获得高热稳定性的酶一直是酶工程领域的研究热点。
目前，随着结构生物学与生物信息学的发展，研究者已经可以通过一些结构参数的分析(如B-因子、RMSF值等)或同源序列比对，较准确地定位影响酶分子热稳定性的氨基酸残基或肽段，进而对其进行定点突变提高酶的热稳定性。
尽管上述分子改造技术已成为酶热稳定性改造的常规策略，但是，它仍有其固有的技术缺陷，例如，定点突变的前提是获得准确的酶分子结构信息，体外定向进化则面临大量的突变体筛选，导致短时间内难以获得热稳定性明显提升的突变体。因此，建立一种高效、便捷的酶稳定化策略成为国内外研究者关注的焦点。
值得注意的是，日本大阪大学Urabe团队在研究嗜热脂肪芽孢杆菌过氧化氢酶的热稳定性时发现(Nat Biotechnol,1999,17(1):58-61)，融合短肽对酶的热稳定性影响明显；也有研究者在将过氧化氢酶C-端与不同长度和氨基酸序列的短肽随机融合时，得到了一系列高热稳定性的突变体；另外，大阪大学Kanaya团队发现C-端融合嗜热古菌核糖核酸酶C-端七肽(IGCIILT)，可以不同程度地提高不同来源的核糖核酸酶的热稳定性(PLoSONE,2011,6(1):e16226)。可见，融合短肽是一种极具潜力的提高酶热稳定性的手段。
SAPs是一类亲疏水氨基酸交替分布，能自发组装成纳米结构的短肽，其特有的两亲性质使得其在水中能形成水凝胶，从而对目的蛋白或其他小分子进行固定化。基于此，本研究室早前期研究中(Appl Microbiol Biot,2013,97(21):9419-9427)，将一类SAPs融合在酶N端进行融合酶异源表达时发现，SAPs具有提高酶表达量及稳定性的功能，其中，具有特殊电荷分布的S1(AEAEAKAKAEAEAKAK)具有一定的普适性效果；清华大学Lin等(FaradayDiscuss,2013,166:233)则发现，利用与S1氨基酸组成类似的SAP(LELELKLKLELELKLK)融合在酶末端，可促进生成活性包涵体，说明氨基酸组成对SAPs融合蛋白的分泌表达及稳定性有重要影响。因此，可尝试以SAPs为基础，得到一种提高酶热稳定性的方法。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是得到一种提高酶热稳定性的方法。
[技术方案]
为解决上述问题，本发明提供了一种提高酶稳定性的方法，所述方法为在酶的N端通过连接肽(linker)连接双亲短肽(SAP)；
所述连接肽(linker)为包含刚性肽和柔性肽的组合单元；所述刚性肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1(EAAAK)所示；所述柔性肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2(GGGGS)所示；
所述双亲短肽(SAP)为氨基酸序列如SEQ ID NO.3(ADADAKAKADADAKAK)或SEQ IDNO.4(ADADARARADADARAR)所示的短肽组成的重复单元；
或所述双亲短肽(SAP)为以氨基酸序列如SEQ ID NO.3(ADADAKAKADADAKAK)或SEQID NO.4(ADADARARADADARAR)所示的短肽组成的重复单元为模板，进行氨基酸的随机突变所得的突变单元。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为在酶的N端通过连接肽(linker)连接双亲短肽(SAP)后，将得到的融合酶浸泡在稳定剂中；
所述稳定剂为含有聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、吐温(Tween)、蔗糖(Sucrose)、海藻糖(Trehalose)、甘油(Glycerol)、聚乙二醇(PEG)、氯化钠(NaCl)或硫酸铵((NH4)2SO4)中的一种或一种以上的溶液；所述聚乙二醇包含聚乙二醇-2000、聚乙二醇-4000、聚乙二醇-6000或聚乙二醇-8000中的一种或一种以上。所述溶液的溶剂不破坏酶的性能。
在本发明的一种实施方式中，所述稳定剂含有聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)且所述稳定剂中聚乙二醇辛基苯基醚的体积占稳定剂总体积的0.001～0.1％；
或所述稳定剂含有吐温且所述稳定剂中吐温的体积占稳定剂总体积的0.001～0.1％；
或所述稳定剂含有蔗糖且所述稳定剂中蔗糖的浓度为1～7g/L；
或所述稳定剂含有海藻糖且所述稳定剂中海藻糖的浓度为1～7g/L；
或所述稳定剂含有甘油且所述稳定剂中甘油在的体积占稳定剂总体积的10～50％；
或所述稳定剂含有聚乙二醇且所述稳定剂中聚乙二醇的体积占稳定剂总体积的1～20％；
或所述稳定剂含有氯化钠且所述稳定剂中氯化钠的浓度为0.5～4mol/L；
或所述稳定剂含有硫酸铵且所述稳定剂中硫酸铵的浓度为0.5～4mol/L。
在本发明的一种实施方式中，所述酶包含脂肪氧合酶、碱性果胶酶或天冬酰胺酶。
在本发明的一种实施方式中，当酶为脂肪氧合酶或天冬酰胺酶时，所述稳定剂中的吐温为吐温-80，聚乙二醇为聚乙二醇-8000或聚乙二醇-4000；
当酶为碱性果胶酶时，所述稳定剂中的吐温为吐温-60，聚乙二醇为聚乙二醇-8000或聚乙二醇-4000。
在本发明的一种实施方式中，当酶为脂肪氧合酶时，所述稳定剂的成分包含聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)且所述稳定剂中聚乙二醇辛基苯基醚的体积占稳定剂总体积的0.01％；或所述稳定剂的成分包含吐温-80且所述稳定剂中吐温-80的体积占稳定剂总体积的0.001％；或所述稳定剂的成分包含蔗糖且所述稳定剂中蔗糖的浓度为3g/L；或所述稳定剂的成分包含海藻糖且所述稳定剂中海藻糖的浓度为3.5g/L；或所述稳定剂的成分包含甘油且所述稳定剂中甘油在的体积占稳定剂总体积的35％；或所述稳定剂的成分包含聚乙二醇-8000且所述稳定剂中聚乙二醇-8000的体积占稳定剂总体积的5％；或所述稳定剂的成分包含聚乙二醇-4000且所述稳定剂中聚乙二醇-4000的体积占稳定剂总体积的10％；或所述稳定剂的成分包含氯化钠且所述稳定剂中氯化钠的浓度为2mol/L；或所述稳定剂的成分包含硫酸铵且所述稳定剂中硫酸铵的浓度为0.5mol/L。
在本发明的一种实施方式中，当酶为碱性果胶酶时，所述稳定剂的成分包含聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)且所述稳定剂中聚乙二醇辛基苯基醚的体积占稳定剂总体积的0.02％；或所述稳定剂的成分包含吐温-60且所述稳定剂中吐温-60的体积占稳定剂总体积的0.002％；或所述稳定剂的成分包含蔗糖且所述稳定剂中蔗糖的浓度为2.5g/L；或所述稳定剂的成分包含海藻糖且所述稳定剂中海藻糖的浓度为3.5g/L；或所述稳定剂的成分包含甘油且所述稳定剂中甘油在的体积占稳定剂总体积的30％；或所述稳定剂的成分包含聚乙二醇-8000且所述稳定剂中聚乙二醇-8000的体积占稳定剂总体积的5％；或所述稳定剂的成分包含聚乙二醇-4000且所述稳定剂中聚乙二醇-4000的体积占稳定剂总体积的5％；或所述稳定剂的成分包含氯化钠且所述稳定剂中氯化钠的浓度为2mol/L；或所述稳定剂的成分包含硫酸铵且所述稳定剂中硫酸铵的浓度为1mol/L。
在本发明的一种实施方式中，当酶为天冬酰胺酶时，所述稳定剂的成分包含聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)且所述稳定剂中聚乙二醇辛基苯基醚的体积占稳定剂总体积的0.015％；或所述稳定剂的成分包含吐温-80且所述稳定剂中吐温-80的体积占稳定剂总体积的0.0015％；或所述稳定剂的成分包含蔗糖且所述稳定剂中蔗糖的浓度为3g/L；或所述稳定剂的成分包含海藻糖且所述稳定剂中海藻糖的浓度为3.5g/L；或所述稳定剂的成分包含甘油且所述稳定剂中甘油在的体积占稳定剂总体积的35％；或所述稳定剂的成分包含聚乙二醇-8000且所述稳定剂中聚乙二醇-8000的体积占稳定剂总体积的10％；或所述稳定剂的成分包含聚乙二醇-4000且所述稳定剂中聚乙二醇-4000的体积占稳定剂总体积的5％；或所述稳定剂的成分包含氯化钠且所述稳定剂中氯化钠的浓度为2mol/L；或所述稳定剂的成分包含硫酸铵且所述稳定剂中硫酸铵的浓度为1mol/L。
在本发明的一种实施方式中，所述酶为脂肪氧合酶时，连接肽(linker)的氨基酸序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示，双亲短肽(SAP)的氨基酸序列如SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示；
所述酶为碱性果胶酶时，连接肽(linker)的氨基酸序列如SEQ ID NO.11或SEQ IDNO.12所示，双亲短肽(SAP)的氨基酸序列如SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14所示；
所述酶为天冬酰胺酶时，连接肽(linker)的氨基酸序列如SEQ ID NO.16或SEQ IDNO.17所示，双亲短肽(SAP)的氨基酸序列如SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.19所示。
在本发明的一种实施方式中，所述脂肪氧合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述碱性果胶酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述天冬酰胺酶的氨基酸序列如SEQID NO.15所示。
本发明还提供了应用上述方法制备得到的酶。
本发明还提供了上述方法在提高酶稳定性方面的应用。
本发明还提供了一种脂肪氧合酶突变体，所述突变体包含氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示的脂肪氧合酶以及通过氨基酸序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的连接肽(linker)连接在脂肪氧合酶N端的氨基酸序列如SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示的双亲短肽(SAP)。
本发明还提供了一种碱性果胶酶突变体，所述突变体包含氨基酸序列如SEQ IDNO.10所示的碱性果胶酶以及通过氨基酸序列如SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12所示的连接肽(linker)连接在脂肪氧合酶N端的氨基酸序列如SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14所示的双亲短肽(SAP)。
本发明还提供了一种天冬酰胺酶突变体，所述突变体包含氨基酸序列如SEQ IDNO.15所示的天冬酰胺酶以及通过氨基酸序列如SEQ ID NO.16或SEQ ID NO.17所示的连接肽(linker)连接在脂肪氧合酶N端的氨基酸序列如SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.19所示的双亲短肽(SAP)。
有益效果：
(1)本发明的方法通过在酶的N端由连接肽(linker)连接双亲短肽(SAP)，并选择适宜的添加剂进行处理，大大提高了酶的稳定性；利用此方法制备得到的脂肪氧合酶热稳定性较野生型提高了23.45倍，碱性果胶酶热稳定性较野生型提高了37.65倍，天冬酰胺酶热稳定性较野生型提高了15.3倍；
(2)利用本发明的方法制备得到的脂肪氧合酶在50℃保温30min后仍然保持初始酶活的95％以上，而相同条件下野生型脂肪氧合酶只保留初始酶活20％左右；利用该方法制备得到的碱性果胶酶在60℃保温30min后仍然保持初始酶活的97％以上，而相同条件下野生型碱性果胶酶只保留初始酶活35％左右；利用该方法制备得到的天冬酰胺酶在在60℃保温30min后可保持初始酶活的120％以上，而相同条件下野生型天冬酰胺酶只保留初始酶活30％左右。
附图说明
图1为实施例1中重组质粒的构建图谱。
图2为不同稳定剂对野生型脂肪氧合酶的影响。
图3为不同稳定剂对融合脂肪氧合酶SAP1-L1-LOX的影响。
图4为不同稳定剂对融合脂肪氧合酶SAP2-L2-LOX的影响。
图5为不同稳定剂对野生型碱性果胶酶的影响。
图6为不同稳定剂对融合碱性果胶酶SAP1-L1-PGL的影响。
图7为不同稳定剂对融合碱性果胶酶SAP2-L2-PGL的影响。
图8为不同稳定剂对野生型天冬酰胺酶的影响。
图9为不同稳定剂对融合天冬酰胺酶SAP1-L1-ASN的影响。
图10为不同稳定剂对融合天冬酰胺酶SAP2-L2-ASN的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的载体pET22b(+)、大肠杆菌E.coli BL21(DE3)购自宝生物工程(大连)有限公司。
下述实施例中涉及的培养基如下：
种子培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L以及氯化钠5g/L。
发酵培养基：将蛋白胨12g、酵母提取物24g、甘油4mL溶解在0.9L水中后高压灭菌，冷却到60℃，再加100mL灭菌的0.17mol/L的KH2PO4、0.72mol/L的K2HPO4溶液。
A液：20mM的磷酸盐缓冲液、500mM的NaCl以及20mM的咪唑。
B液：20mM的磷酸盐缓冲液、500mM的NaCl以及500mM的咪唑。
磷酸盐缓冲液：190mL 20mM的NaH2PO4以及810mL 20mM的Na2HPO4。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
脂肪氧合酶酶活及热稳定性测定：
1、酶活的检测
采用分光光度法测定LOX酶活。
酶活测定条件：将发酵液8000rpm离心10min，并将所得菌液做破壁处理，再次8000rpm离心10min后LOX酶即包含于上清液之中，取一定量做检测；
LOX反应体系：含1％亚油酸(底物)的20mM磷酸盐缓冲液1mL、待测样品100μL，以无活性的酶液为空白对照；
LOX反应条件：将酶解反应液在25℃下利用Shimadzu UV-2450分光光度计在线测定234nm下吸光值的变化，以吸光值变化曲线初始部分的斜率计算酶活；
1个单位LOX酶活定义为：25℃下每分钟催化底物亚油酸形成1μmol亚油酸氢过氧化物(HPOD旋光系数＝25000L/(mol×cm))所需的酶量。
2、稳定性的检测
将纯化后的酶用BufferA(20mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH 7.4)稀释到蛋白浓度为100μg/mL并在50℃保温，间隔3min测定残余酶活，计算半衰期。
碱性果胶酶酶活及热稳定性测定：
1、酶活的检测
采用分光光度法测定PGL酶活。
酶活测定条件：将发酵液8000rpm离心10min，胞外PGL即包含于发酵上清液之中，取一定量做检测；
PGL反应体系：含0.2％聚半乳糖醛酸(底物)的甘氨酸-NaOH缓冲液(0.2mol/L，0.44mmol/L的CaCl2，pH 9.4)2mL、待测样品20μL，以无活性的酶液为空白对照；
PGL反应条件：将反应体系置于45℃下水浴15min，用3mL磷酸溶液(0.03mol/L)终止反应，得到酶解反应液；
PGL酶活的检测：将酶解反应液在235nm处测定吸光度值，以吸光值变化曲线初始部分的斜率计算酶活；
1个单位PGL酶活定义：单位时间裂解聚半乳糖醛酸产生1μmol的不饱和聚半乳糖醛酸所用的酶量。
2、稳定性的检测
将稀释好的酶解反应液分装并置于60℃金属浴中，每隔3min取样进行残余酶活测定，计算半衰期。
天冬酰胺酶酶活及热稳定性测定：
1、酶活的检测
采用奈氏试剂法测定ASN的酶活。
酶活测定条件：将发酵液8000rpm离心10min，胞外ASN即包含于发酵上清液之中，取一定量做检测；
ASN反应体系：1mL磷酸盐缓冲液(10mmol/L，pH 7.5)、300μL酶液、100μL的L-天冬酰胺(200mM)，以无活性的酶液为空白对照；
ASN反应条件：将反应体系置于37℃反应30min后加入100μL三氯乙酸终止反应，得到酶解反应液；
ASN酶活的检测：将得到的酶解反应液混匀后12000r/min离心2min后，取酶解反应液200μL、去离子水3.3mL、奈氏试剂500μL混匀后于436nm处测定吸光值；
其中，标准曲线的绘制方法为：配制18mmol/L的(NH4)2SO4的标准溶液，分别在1.5mL管中加入0μL、50μL、100μL、200μL、250μL、300μL、350μL、400μL的(NH4)2SO4的标准溶液，用去离子水补至400μL，然后加入1mL磷酸盐缓冲液(10mmol/L，pH 7.5))，37℃反应30min后加入100μL三氯乙酸终止反应，混匀后12000r/min离心2min后进行显色反应；
1个单位ASN酶活定义：每分钟水解L-天冬酰胺生成1μmol氨所需要的酶量定义为ASN活力单位。
2、稳定性的检测
将稀释好的酶解反应液分装并置于60℃金属浴中，每隔3min取样进行残余酶活测定，计算半衰期。
下述实施例中涉及的纯化方法如下：
脂肪氧合酶纯化方法：
将发酵液在9000r/min条件下离心15min获得含有脂肪氧合酶的发酵上清液并加入10％(w/v)的甘油，缓慢加入研磨、干燥的硫酸铵粉末至硫酸铵的饱和度为40％并继续缓慢搅拌30min；随后将样品在12000rpm下离心15min，收集沉淀并复溶于含有50mmol/LNaCl的缓冲液A中，离心去除沉淀后得到的上清液即为硫酸铵沉淀后的样品；将硫酸铵沉淀后的样品用截留分子量为50kDa的透析袋在含有50mmol/LNaCl的缓冲液A中透析24h，随后再在缓冲液A中透析24h脱盐；将1mLHistrap FF纯化柱用缓冲液A以1mL/min的流速平衡，随后上样，平衡，B液线性洗脱收集重组LOX的组分；
将获得的含有LOX的洗脱液在A液中透析除盐，4℃保存，得到纯酶液。
碱性果胶酶纯化方法：
将发酵液在9000r/min条件下离心15min获得含有碱性果胶酶的发酵上清液；在冰上进行硫酸铵沉淀对发酵液进行初步浓缩，透析除盐后，样品用0.22μm微孔滤膜过滤后，用5mL阳离子交换层析柱(HiTrapTM SPFF，GE)进行分离纯化；
纯化条件为：10～15倍柱体积缓冲液A(20mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH7.4)平衡疏水柱，流速为2mL/min，1mL/min流速进样5mL后，2mL/min继续A液平衡至曲线平稳，用B缓冲液(20mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、1mol/LNaCl，pH 7.4)进行线性洗脱；
将获得的含有PGL的洗脱液在A液中透析除盐，4℃保存，得到纯酶液。
天冬酰胺酶纯化方法：
将发酵液在9000r/min条件下离心15min获得含有天冬酰胺酶的发酵上清液；在冰上进行硫酸铵沉淀对发酵液进行初步浓缩；透析除盐后，样品用0.22μm微孔滤膜过滤后，用A液复溶，用5mL的疏水层析柱(HiTrapTM SPFF，GE)进行分离纯化；
纯化条件为：10～15倍柱体积缓冲液A(20mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH7.4)平衡疏水柱，流速为2mL/min，1mL/min流速进样5mL后，2mL/min继续A液平衡至曲线平稳，用B缓冲液(20mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，1mol/LNaCl，pH 7.4)进行线性洗脱；
将获得的含有ASN的洗脱液在A液中透析除盐，4℃保存，得到纯酶液。
实施例1：可表达融合酶的重组菌的构建
具体步骤如下：
可表达融合碱性果胶酶的重组菌的构建：
以pET22b(+)为质粒骨架，将脂肪氧合酶(LOX)的基因克隆至Nco I和Xho I之间，获得表达野生LOX的重组质粒pET22b(+)/lox，并将SAP和linker的编码基因插入至pET22b(+)/lox的Nde I和Nco I之间(如图1所示)，分别获得表达LOX融合酶SAP1-L1-LOX和SAP2-L2-LOX的质粒pET22b(+)/sap1-L1-lox和pET22b(+)/sap2-L2-lox，并将其转入表达宿主大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中(SAP1-L1-LOX包含氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的脂肪氧合酶以及通过氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的linker连接在脂肪氧合酶N端的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的SAP；SAP2-L2-LOX包含氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的脂肪氧合酶以及通过氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的linker连接在脂肪氧合酶N端的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的SAP)。
可表达野生型碱性果胶酶的重组菌的构建：
以pET22b(+)为质粒骨架，将脂肪氧合酶(LOX)的基因克隆至Nco I和Xho I之间，获得表达野生LOX的重组质粒pET22b(+)/lox，并将其转入表达宿主大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)中(LOX的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示)。
可表达融合脂肪氧合酶的重组菌的构建：
以pET22b(+)为质粒骨架，将碱性果胶酶(PGL)的基因克隆至Nco I和Xho I之间，获得表达野生PGL的重组质粒pET22b(+)/pgl，并将SAP和linker的编码基因插入至pET22b(+)/pgl的Nde I和Nco I之间(如图1所示)，分别获得表达PGL融合酶SAP1-L1-PGL和SAP2-L2-PGL的质粒pET22b(+)/sap1-L1-pgl和pET22b(+)/sap2-L2-pgl，并将其转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中(SAP1-L1-PGL包含氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示的碱性果胶酶以及通过氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的linker连接在碱性果胶酶N端的氨基酸序列如SEQID NO.13所示的SAP；SAP2-L2-PGL包含氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示的碱性果胶酶以及通过氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示的linker连接在碱性果胶酶N端的氨基酸序列如SEQID NO.14所示的SAP)。
可表达野生型脂肪氧合酶的重组菌的构建：
以pET22b(+)为质粒骨架，将碱性果胶酶(PGL)的基因克隆至Nco I和Xho I之间，获得表达野生PGL的重组质粒pET22b(+)/pgl，并将其转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中(PGL的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示)。
可表达融合天冬酰胺酶的重组菌的构建：
以pET22b(+)为质粒骨架，将天冬酰胺酶(ASN)的基因克隆至Nco I和Xho I之间，获得表达野生ASN的重组质粒pET22b(+)/asn，并将SAP和linker的编码基因插入至pET22b(+)/asn的Nde I和Nco I之间(如图1所示)，分别获得表达ASN融合酶SAP1-L1-ASN和SAP2-L2-ASN的质粒pET22b(+)/sap1-L1-asn和pET22b(+)/sap2-L2-asn，并将其转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中(SAP1-L1-ASN包含氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示的天冬酰胺酶以及通过氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示的linker连接在天冬酰胺酶N端的氨基酸序列如SEQID NO.18所示的SAP；SAP2-L2-ASN包含氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示的天冬酰胺酶以及通过氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示的linker连接在天冬酰胺酶N端的氨基酸序列如SEQID NO.19所示的SAP)。
可表达野生型天冬酰胺酶的重组菌的构建：
以pET22b(+)为质粒骨架，将天冬酰胺酶(ASN)的基因克隆至Nco I和Xho I之间，获得表达野生ASN的重组质粒pET22b(+)/asn，并将其转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中(ASN的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示)。
实施例2：融合酶以及野生酶的制备
具体步骤如下：
挑取实施例1得到的重组菌的单菌落接入装液量为25mL的三角瓶(250mL)中，培养温度37℃，摇床转速200r/min，培养12h，得到种子液；按3％的接种量将种子液接入装液量为25mL的三角瓶(250mL)中，培养温度37℃，当OD600达到0.6时，加入IPTG诱导(其中LOX诱导量为1mM、PGL为0.04mM、ASN为1mM))，并同时调整温度到该酶最适宜的诱导温度下培养(其中，LOX为20℃培养24h、PGL为30℃培养48h、ASN为30℃培养12h)，得到含有不同融合酶SAP1-L1-LOX、SAP2-L2-LOX、SAP1-L1-PGL、SAP2-L2-PGL、SAP1-L1-ASN、SAP2-L2-ASN以及野生酶LOX、PGL、ASN的发酵液。
实施例3：不同稳定剂对融合酶以及野生酶的影响
具体步骤如下：
将实施例2得到的含有不同融合酶SAP1-L1-LOX、SAP2-L2-LOX、SAP1-L1-PGL、SAP2-L2-PGL、SAP1-L1-ASN、SAP2-L2-ASN以及野生酶LOX、PGL、ASN的发酵液进行纯化，得到纯酶液；以不添加任何稳定剂的纯酶液作为对照，在纯酶液中按照表1-3所示添加不同种类和浓度的稳定剂后，对对照组(无稳定剂添加)以及实验组(添加稳定剂)的纯酶液进行热稳定性的检测(检测结果如图2-10)。
表1 LOX纯酶液中添加的稳定剂的种类及浓度
| 稳定剂 | 浓度 |
| 聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100) | 0.01％(v/v) |
| 吐温(Tween 80) | 0.001％(v/v) |
| 蔗糖(Sucrose) | 3g/L |
| 海藻糖(Trehalose) | 3.5g/L |
| 甘油(Glycerol) | 35％(v/v) |
| 聚乙二醇(PEG8000) | 5％(v/v) |
| 聚乙二醇(PEG4000) | 10％(v/v) |
| 氯化钠(NaCl) | 2M |
| 硫酸铵((NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>) | 0.5M |
表2 PGL纯酶液中添加的稳定剂的种类及浓度
表3 ASN纯酶液中添加的稳定剂的种类及浓度
| 稳定剂 | 浓度 |
| 聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100) | 0.015％(v/v) |
| 吐温(Tween 80) | 0.0015％(v/v) |
| 蔗糖(Sucrose) | 3g/L |
| 海藻糖(Trehalose) | 3.5g/L |
| 甘油(Glycerol) | 35％(v/v) |
| 聚乙二醇(PEG8000) | 10％(v/v) |
| 聚乙二醇(PEG4000) | 5％(v/v) |
| 氯化钠(NaCl) | 2M |
| 硫酸铵((NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>) | 1M |
如图2-4，SAP1-L1-LOX和SAP2-L2-LOX在50℃保温30min后仍然保持初始酶活的95％以上，而相同条件下野生型LOX只保留初始酶活20％左右；经过稳定剂处理后的SAP1-L1-LOX和SAP2-L2-LOX在50℃的半衰期分别较野生型提高了23.45和22.74倍，比相同稳定剂处理的野生型LOX分别提高了5.4和7.2倍；对于SAP1-L1-LOX和SAP2-L2-LOX，NaCl、(NH4)2SO4、PEG8000和PEG4000均有较好的稳定化效果；
如图5-7，SAP1-L1-PGL和SAP2-L2-PGL在60℃保温30min后仍然保持初始酶活的97％以上，而相同条件下野生型LOX只保留初始酶活35％左右；经过稳定剂处理后的SAP1-L1-PGL和SAP2-L2-PGL在60℃的半衰期分别较野生型提高了27.6和30.3倍，比相同稳定剂处理的野生型PGL分别提高了10.25和11.42倍；对于SAP1-L1-PGL和SAP2-L2-PGL，NaCl、(NH4)2SO4、PEG8000和PEG4000均有较好的稳定化效果；
如图8-10，SAP1-L1-ASN和SAP2-L2-ASN在60℃保温30min后可保持初始酶活的120％以上，而相同条件下野生型LOX只保留初始酶活30％左右；经过稳定剂处理后的SAP1-L1-ASN和SAP2-L2-ASN在60℃的半衰期分别较野生型提高了17.65和16.4倍，比相同稳定剂处理的野生型ASN分别提高了7.4和6.37倍；对于SAP1-L1-ASN和SAP2-L2-ASN，NaCl、海藻糖和蔗糖均有较好的稳定化效果。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种提高酶稳定性的方法
<160> 19
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Glu Ala Ala Ala Lys
1 5
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Ala Asp Ala Asp Ala Lys Ala Lys Ala Asp Ala Asp Ala Lys Ala Lys
1 5 10 15
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Ala Asp Ala Asp Ala Arg Ala Arg Ala Asp Ala Asp Ala Arg Ala Arg
1 5 10 15
<210> 5
<211> 669
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Ala Met Asp Asn Asp Ser Ile Phe Phe Ser Pro Leu Lys Tyr Leu Gly
1 5 10 15
Ala Glu Gln Gln Arg Ser Ile Asp Ala Ser Arg Ser Leu Leu Asp Asn
20 25 30
Leu Ile Pro Pro Ser Leu Pro Gln Tyr Asp Asn Leu Ala Gly Lys Leu
35 40 45
Ala Arg Arg Ala Val Leu Thr Ser Lys Lys Leu Val Tyr Val Trp Thr
50 55 60
Glu Asn Phe Gly Asn Val Lys Gly Val Pro Met Ala Arg Ser Val Pro
65 70 75 80
Leu Gly Glu Leu Pro Asn Val Asp Trp Leu Leu Lys Thr Ala Gly Val
85 90 95
Ile Val Glu Leu Ile Val Asn Phe Val Ala Ser Leu Pro Ala Ser Ala
100 105 110
Ala Ala Gln Phe Glu Arg Ile Ala Thr Gly Leu Ser Gly Asp Leu Glu
115 120 125
Ala Ala Arg Gln Val His Glu Ala Leu Leu Glu Glu Ala Lys Asn Asp
130 135 140
Pro Ala Ala Ala Gly Ser Leu Leu Leu Arg Phe Thr Glu Leu Gln Thr
145 150 155 160
Arg Val Ile Ala Ile Leu Thr Arg Val Gly Leu Leu Val Asp Asp Ile
165 170 175
Leu Lys Ser Ala Ser Asn Leu Val Thr Gln Arg Gly Gln Gly Asp Gly
180 185 190
Leu Asn Arg Phe Arg Ala Val Phe Gly Thr Leu Arg Leu Pro Glu Val
195 200 205
Ala Asp Ser Phe Arg Asp Asp Glu Ala Phe Ala Tyr Trp Arg Val Ala
210 215 220
Gly Pro Asn Pro Leu Leu Ile Arg Arg Val Asp Ala Leu Pro Ala Asn
225 230 235 240
Phe Pro Leu Gly Glu Glu Gln Phe Arg Arg Val Met Gly Ala Asp Asp
245 250 255
Ser Leu Leu Glu Ala Ala Ala Ser Arg Arg Leu Tyr Leu Leu Asp Tyr
260 265 270
Ala Glu Leu Gly Lys Leu Ala Pro Ser Gly Ala Val Asp Lys Leu Leu
275 280 285
Thr Gly Thr Gly Phe Ala Tyr Ala Pro Ile Ala Leu Phe Ala Leu Gly
290 295 300
Lys Asp Arg Ala Arg Leu Leu Pro Val Ala Ile Gln Cys Gly Gln Asp
305 310 315 320
Pro Ala Thr His Pro Met Phe Val Arg Pro Ala Glu Ser Glu Ser Asp
325 330 335
Leu Tyr Trp Gly Trp Gln Met Ala Lys Thr Val Val Gln Val Ala Glu
340 345 350
Glu Asn Tyr His Glu Met Phe Val His Leu Ala Gln Thr His Leu Val
355 360 365
Ser Glu Ala Phe Cys Leu Ala Thr Gln Arg Thr Leu Ala Pro Ser His
370 375 380
Pro Leu His Val Leu Leu Ala Pro His Phe Glu Gly Thr Leu Phe Ile
385 390 395 400
Asn Glu Gly Ala Ala Arg Ile Leu Leu Pro Ser Ala Gly Phe Ile Asp
405 410 415
Val Met Phe Ala Ala Pro Ile Gln Asp Thr Gln Ala Thr Ala Gly Gly
420 425 430
Asn Arg Leu Gly Phe Asp Phe Tyr Arg Gly Met Leu Pro Glu Ser Leu
435 440 445
Lys Ala Arg Asn Val Asp Asp Pro Leu Ala Leu Pro Asp Tyr Pro Tyr
450 455 460
Arg Asp Asp Gly Leu Leu Val Trp Asn Ala Ile Arg Gln Trp Ala Ala
465 470 475 480
Asp Tyr Val Ala Val Tyr Tyr Ala Ser Asp Gly Asp Val Thr Ala Asp
485 490 495
Val Glu Leu Ala Ala Trp Val Gly Glu Val Ile Gly Ser Gly Lys Val
500 505 510
Ala Gly Phe Arg Pro Ile Thr Gly Arg Ser Gln Leu Val Glu Val Leu
515 520 525
Thr Met Val Ile Phe Thr Ala Ser Ala Gln His Ala Ala Val Asn Phe
530 535 540
Pro Gln Pro Ser Met Met Thr Tyr Ala Pro Ala Ile Cys Ala Met Ser
545 550 555 560
Ala Ala Pro Ala Pro Asp Ser Pro Ser Gly Lys Ser Glu Ala Asp Trp
565 570 575
Leu Lys Met Met Pro Pro Thr Leu Val Ala Leu Glu Lys Val Asn Ile
580 585 590
Tyr His Leu Leu Gly Ser Val Tyr His Gly Arg Leu Gly Asp Tyr Arg
595 600 605
Gln Thr Gly Phe Pro Tyr Ala Pro Val Phe Ser Asp Arg Arg Val Thr
610 615 620
Ala Ser Gly Gly Pro Leu Glu Arg Phe Gln Ala Arg Leu Lys Glu Val
625 630 635 640
Glu Ala Thr Ile Arg Thr Arg Asn Gln Ala Arg Arg Arg Pro Tyr Glu
645 650 655
Tyr Leu Leu Pro Ser Arg Ile Pro Ala Ser Thr Asn Ile
660 665
<210> 6
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
1 5 10 15
Ala Ala Ala Lys Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 7
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 8
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Ala Asp Ala Asp Ala Lys Ala Lys Ala Asp Ala Asp Ala Lys Ala Lys
1 5 10 15
Ala Asp Ala Asp Ala Lys Ala Lys Ala Asp Ala Asp Ala Lys Ala Lys
20 25 30
Ala Asp Ala Asp Ala Lys Ala Lys Ala Asp Ala Asp Ala Lys Ala Lys
35 40 45
Ala Asp Ala Asp Ala Lys Ala Lys Ala Asp Ala Asp Ala Lys Ala Lys
50 55 60
Ala Asp Ala Asp Ala Lys Ala Lys Ala Asp Ala Asp Ala Lys Ala Lys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Asp Ala Lys Ala Lys Ala Asp Ala Asp Ala Lys Ala Lys
85 90 95
<210> 9
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Ala Asp Ala Asp Ala Arg Ala Arg Ala Asp Ala Asp Ala Arg Ala Arg
1 5 10 15
Ala Asp Ala Asp Ala Arg Ala Arg Ala Asp Ala Asp Ala Arg Ala Arg
20 25 30
Ala Asp Ala Asp Ala Arg Ala Arg Ala Asp Ala Asp Ala Arg Ala Arg
35 40 45
Ala Asp Ala Asp Ala Arg Ala Arg Ala Asp Ala Asp Ala Arg Ala Arg
50 55 60
Ala Asp Ala Asp Ala Arg Ala Arg Ala Asp Ala Asp Ala Arg Ala Arg
65 70 75 80
Ala Asp Ala Asp Ala Arg Ala Arg Ala Asp Ala Asp Ala Arg Ala Arg
85 90 95
<210> 10
<211> 385
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Met Lys Lys Val Met Leu Ala Thr Ala Leu Phe Leu Gly Leu Thr Pro
1 5 10 15
Ala Gly Ala Asn Ala Ala Asp Leu Gly His Gln Thr Leu Gly Ser Asn
20 25 30
Asp Gly Trp Gly Ala Tyr Ser Thr Gly Thr Thr Gly Gly Ser Lys Ala
35 40 45
Ser Ser Leu Asn Val Tyr Thr Val Ser Asn Arg Asn Gln Leu Val Ser
50 55 60
Ala Leu Gly Lys Glu Thr Asn Thr Thr Pro Lys Ile Ile Tyr Ile Lys
65 70 75 80
Gly Thr Ile Asp Met Asn Val Asp Asp Asn Leu Lys Pro Leu Gly Leu
85 90 95
Asn Asp Tyr Lys Asp Pro Glu Tyr Asp Leu Asp Lys Tyr Leu Lys Ala
100 105 110
Tyr Asp Pro Ser Thr Trp Gly Lys Lys Glu Pro Ser Gly Thr Gln Glu
115 120 125
Glu Ala Arg Ala Arg Ser Gln Lys Asn Gln Lys Ala Arg Val Met Val
130 135 140
Asp Ile Pro Ala Asn Thr Thr Ile Val Gly Ser Gly Thr Asn Ala Lys
145 150 155 160
Val Val Gly Gly Asn Phe Gln Ile Lys Ser Asp Asn Val Ile Ile Arg
165 170 175
Asn Ile Glu Phe Gln Asp Ala Tyr Asp Tyr Phe Pro Gln Trp Asp Pro
180 185 190
Thr Asp Gly Ser Ser Gly Asn Trp Asn Ser Gln Tyr Asp Asn Ile Thr
195 200 205
Ile Asn Gly Gly Thr His Ile Trp Ile Asp His Cys Thr Phe Asn Asp
210 215 220
Gly Ser Arg Pro Asp Ser Thr Ser Pro Lys Tyr Tyr Gly Arg Lys Tyr
225 230 235 240
Gln His His Asp Gly Gln Thr Asp Ala Ser Asn Gly Ala Asn Tyr Ile
245 250 255
Thr Met Ser Tyr Asn Tyr Tyr His Asp His Asp Lys Ser Ser Ile Phe
260 265 270
Gly Ser Ser Asp Ser Lys Thr Ser Asp Asp Gly Lys Leu Lys Ile Thr
275 280 285
Leu His His Asn Arg Tyr Lys Asn Ile Val Gln Arg Ala Pro Arg Val
290 295 300
Arg Phe Gly Gln Val His Val Tyr Asn Asn Tyr Tyr Glu Gly Ser Thr
305 310 315 320
Ser Ser Ser Ser Tyr Pro Phe Ser Tyr Ala Trp Gly Ile Gly Lys Ser
325 330 335
Ser Lys Ile Tyr Ala Gln Asn Asn Val Ile Asp Val Pro Gly Leu Ser
340 345 350
Ala Ala Lys Thr Ile Ser Val Phe Ser Gly Gly Thr Ala Leu Tyr Asp
355 360 365
Ser Gly Thr Leu Leu Asn Gly Thr Gln Ile Asn Ala Ser Ala Ala Asn
370 375 380
Gly
385
<210> 11
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ala Ala Ala Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
20 25
<210> 12
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Ala Lys Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 13
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 13
Ala Asp Ala Asp Ala Lys Ala Lys Ala Asp Ala Asp Ala Lys Ala Lys
1 5 10 15
<210> 14
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 14
Ala Asp Ala Asp Ala Arg Ala Arg Ala Asp Ala Asp Ala Arg Ala Arg
1 5 10 15
<210> 15
<211> 348
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 15
Met Glu Phe Phe Lys Lys Thr Ala Leu Ala Ala Leu Val Met Gly Phe
1 5 10 15
Ser Gly Ala Ala Leu Ala Leu Pro Asn Ile Thr Ile Leu Ala Thr Gly
20 25 30
Gly Thr Ile Ala Gly Gly Gly Asp Ser Ala Thr Lys Ser Asn Tyr Thr
35 40 45
Val Gly Lys Val Gly Val Glu Asn Leu Val Asn Ala Val Pro Gln Leu
50 55 60
Lys Asp Ile Ala Asn Val Lys Gly Glu Gln Val Val Asn Ile Gly Ser
65 70 75 80
Gln Asp Met Asn Asp Asn Val Trp Leu Thr Leu Ala Lys Lys Ile Asn
85 90 95
Thr Asp Cys Asp Lys Thr Asp Gly Phe Val Ile Thr His Gly Thr Asp
100 105 110
Thr Met Glu Glu Thr Ala Tyr Phe Leu Asp Leu Thr Val Lys Cys Asp
115 120 125
Lys Pro Val Val Met Val Gly Ala Met Arg Pro Ser Thr Ser Met Ser
130 135 140
Ala Asp Gly Pro Phe Asn Leu Tyr Asn Ala Val Val Thr Ala Ala Asp
145 150 155 160
Lys Ala Ser Ala Asn Arg Gly Val Leu Val Val Met Asn Asp Thr Val
165 170 175
Leu Asp Gly Arg Asp Val Thr Lys Thr Asn Thr Thr Asp Val Ala Thr
180 185 190
Phe Lys Ser Val Asn Tyr Gly Pro Leu Gly Tyr Ile His Asn Gly Lys
195 200 205
Ile Asp Tyr Gln Arg Thr Pro Ala Arg Lys His Thr Ser Asp Thr Pro
210 215 220
Phe Asp Val Ser Lys Leu Asn Glu Leu Pro Lys Val Gly Ile Val Tyr
225 230 235 240
Asn Tyr Ala Asn Ala Ser Asp Leu Pro Ala Lys Ala Leu Val Asp Ala
245 250 255
Gly Tyr Asp Gly Ile Val Ser Ala Gly Val Gly Asn Gly Asn Leu Tyr
260 265 270
Lys Ser Val Phe Asp Thr Leu Ala Thr Ala Ala Lys Thr Gly Thr Ala
275 280 285
Val Val Arg Ser Ser Arg Val Pro Thr Gly Ala Thr Thr Gln Asp Ala
290 295 300
Glu Val Asp Asp Ala Lys Tyr Gly Phe Val Ala Ser Gly Thr Leu Asn
305 310 315 320
Pro Gln Lys Ala Arg Val Leu Leu Gln Leu Ala Leu Thr Gln Thr Lys
325 330 335
Asp Pro Gln Gln Ile Gln Gln Ile Phe Asn Gln Tyr
340 345
<210> 16
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 16
Glu Ala Ala Ala Lys Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ala Ala Ala Lys Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 17
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 17
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ala Ala Ala Lys Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 18
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 18
Ala Asp Ala Asp Ala Lys Ala Lys Ala Asp Ala Asp Ala Lys Ala Lys
1 5 10 15
Ala Asp Ala Asp Ala Lys Ala Lys Ala Asp Ala Asp Ala Lys Ala Lys
20 25 30
Ala Asp Ala Asp Ala Lys Ala Lys Ala Asp Ala Asp Ala Lys Ala Lys
35 40 45
<210> 19
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 19
Ala Asp Ala Asp Ala Arg Ala Arg Ala Asp Ala Asp Ala Arg Ala Arg
1 5 10 15
Ala Asp Ala Asp Ala Arg Ala Arg Ala Asp Ala Asp Ala Arg Ala Arg
20 25 30
Ala Asp Ala Asp Ala Arg Ala Arg Ala Asp Ala Asp Ala Arg Ala Arg
35 40 45
Claims (10)
1.一种提高酶稳定性的方法，其特征在于，所述方法为在酶的N端通过连接肽(linker)连接双亲短肽(SAP)；
所述连接肽(linker)为包含刚性肽和柔性肽的组合单元；所述刚性肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述柔性肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述双亲短肽(SAP)为氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的短肽组成的重复单元；
或所述双亲短肽(SAP)为以氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的短肽组成的重复单元为模板，进行氨基酸的随机突变所得的突变单元。
2.如权利要求1所述的一种提高酶稳定性的方法，其特征在于，所述方法为在酶的N端通过连接肽(linker)连接双亲短肽(SAP)后，将得到的融合酶浸泡在稳定剂中；
所述稳定剂为含有聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、吐温(Tween)、蔗糖(Sucrose)、海藻糖(Trehalose)、甘油(Glycerol)、聚乙二醇(PEG)、氯化钠(NaCl)或硫酸铵((NH4)2SO4)中的一种或一种以上的溶液；所述聚乙二醇包含聚乙二醇-2000、聚乙二醇-4000、聚乙二醇-6000或聚乙二醇-8000中的一种或一种以上。
3.如权利要求2所述的一种提高酶稳定性的方法，其特征在于，所述稳定剂含有聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)且所述稳定剂中聚乙二醇辛基苯基醚的体积占稳定剂总体积的0.001～0.1％；
或所述稳定剂含有吐温且所述稳定剂中吐温的体积占稳定剂总体积的0.001～0.1％；
或所述稳定剂含有蔗糖且所述稳定剂中蔗糖的浓度为1～7g/L；
或所述稳定剂含有海藻糖且所述稳定剂中海藻糖的浓度为1～7g/L；
或所述稳定剂含有甘油且所述稳定剂中甘油在的体积占稳定剂总体积的10～50％；
或所述稳定剂含有聚乙二醇且所述稳定剂中聚乙二醇的体积占稳定剂总体积的1～20％；
或所述稳定剂含有氯化钠且所述稳定剂中氯化钠的浓度为0.5～4mol/L；
或所述稳定剂含有硫酸铵且所述稳定剂中硫酸铵的浓度为0.5～4mol/L。
4.如权利要求2或3所述的一种提高酶稳定性的方法，其特征在于，所述酶包含脂肪氧合酶、碱性果胶酶或天冬酰胺酶。
5.如权利要求1-4任一所述的一种提高酶稳定性的方法，其特征在于，当酶为脂肪氧合酶或天冬酰胺酶时，所述稳定剂中的吐温为吐温-80，聚乙二醇为聚乙二醇-8000或聚乙二醇-4000；
当酶为碱性果胶酶时，所述稳定剂中的吐温为吐温-60，聚乙二醇为聚乙二醇-8000或聚乙二醇-4000。
6.应用权利要求1-5任一所述的方法制备得到的酶。
7.权利要求1-5任一所述的方法在提高酶稳定性方面的应用。
8.一种脂肪氧合酶突变体，其特征在于，所述突变体包含氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的脂肪氧合酶以及通过氨基酸序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的连接肽(linker)连接在脂肪氧合酶N端的氨基酸序列如SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示的双亲短肽(SAP)。
9.一种碱性果胶酶突变体，其特征在于，所述突变体包含氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示的碱性果胶酶以及通过氨基酸序列如SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12所示的连接肽(linker)连接在脂肪氧合酶N端的氨基酸序列如SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14所示的双亲短肽(SAP)。
10.一种天冬酰胺酶突变体，其特征在于，所述突变体包含氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示的天冬酰胺酶以及通过氨基酸序列如SEQ ID NO.16或SEQ ID NO.17所示的连接肽(linker)连接在脂肪氧合酶N端的氨基酸序列如SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.19所示的双亲短肽(SAP)。
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|---|---|---|---|
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2019
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