CN114134128A

CN114134128A - 一种基于祖先序列重建的ω-转氨酶突变体

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Publication number: CN114134128A
Application number: CN202111482472.1A
Authority: CN
Inventors: 黄�俊; 蔡婷婷; 邱帅; 吕常江; 樊芳芳; 李业; 王丰; 李元源
Original assignee: Zhejiang Lover Health Science and Technology Development Co Ltd
Current assignee: Shandong Yangcheng Biotech Co ltd
Priority date: 2021-12-07
Filing date: 2021-12-07
Publication date: 2022-03-04
Anticipated expiration: 2041-12-07
Also published as: CN114134128B; WO2023103947A1

Abstract

本发明公开了一种基于祖先序列重建的ω‑转氨酶突变体，涉及分子生物学技术领域。由来自土曲霉(Aspergillus terreus)的ω‑转氨酶突变所得，所述ω‑转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示。与野生型酶相比，ω‑转氨酶突变体的半衰期均在24h以上，而野生型仅为6.90min，突变体的半失活温度分别为49.00℃和49.03℃，比野生型(37.89℃)提高了约11℃，热稳定性显著提高。

Description

一种基于祖先序列重建的ω-转氨酶突变体

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种基于祖先序列重建的ω-转氨酶突变体。

背景技术

手性胺是指小分子化合物手性中心含有氨基的一类化合物，是一类重要的药物合成中间体。近年来，随着手性药物市场不断扩大，手性胺及其衍生物占据手性药物的份额超过70％，如神经类药物、心血管药物、抗高血压药物、抗感染药物及疫苗等；抗糖尿病药物的主要成分西他列汀就是R-型胺。市场对手性胺药物的需求巨大，使得高效制备手性胺药物极为重要。

转氨酶是生物法制备手性胺的关键酶，它能够可逆催化酮基与氨基之间的氨基转移反应以合成胺类化合物。来自于土曲霉(Aspergillus terreus)的ω-转氨酶以磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate，PLP)为辅酶，催化氨基供体上的氨基转移到具有手性的受体酮上，生成手性胺和副产物酮，催化过程如下所示：

虽然转氨酶在合成手性胺方面有较好的应用前景，但野生型酶在底物特异性、稳定性、催化效率等方面还存在诸多不足，不利于将其应用到工业生产中。来源于土曲霉(Aspergillus terreus)的野生型ω-转氨酶在40℃下的半衰期仅为6.90min，需对其进行热稳定性改造。申请号为CN105441404A、CN105950581A的申请专利利用定点突变技术对ω-转氨酶野生型进行改造，获得了热稳定性进一步提高的ω-转氨酶突变体。而随着计算机技术的不断发展，通过祖先序列重建技术获得热稳定性较好的祖先酶也已成为研究热点。

祖先序列重建(Ancestral sequence reconstruction，ASR)是指通过计算机算法推导灭绝生物的祖先酶氨基酸序列的技术。基于前寒武纪时期地球环境极端，如高温且原始细胞仅依耐少数酶系的假设，一般认为祖先酶通常具有更好的热稳定性。因而利用祖先序列重建技术获得现有酶的祖先酶也成为一种提高酶的热稳定性、活性的方法，如Hendrikse等(Yosephin Gumulya,et al.Engineering highly functional thermostableproteins using ancestral sequence reconstruction.Nature Catalysis,2018,1(11):878-888.)利用祖先酶序列重建技术提高了细菌二萜类环化酶的稳定性、活性；RissoValeria等(Risso Valeria A,et al.Hyperstability and substrate promiscuity inlaboratory resurrections of Precambrianβ-lactamases.Journal of the AmericanChemical Society,2013,135(8):2899-902.)通过ASR技术获得了比现有酶更耐热的β-内酰胺酶。

目前尚无利用祖先序列重建技术获得现有酶的祖先酶的方法来提高土曲霉(Aspergillus terreus)ω-转氨酶热稳定性的相关研究报道。

发明内容

本发明基于利用祖先序列重建技术获得现有酶的祖先酶的方法，通过该方法获得酶活、热稳定性进一步提高的土曲霉(Aspergillus terreus)ω-转氨酶突变体。

本发明将土曲霉(Aspergillus terreus)ω-转氨酶的蛋白质序列上传至FireProtASR(https://loschmidt.chemi.muni.cz/fireprotasr/，一个全自动祖先序列重建的服务器)，通过该网站全自动分析获得了土曲霉ω-转氨酶的系统进化树，然后选定进化树上最终进化为土曲霉ω-转氨酶这一分支的各个节点，并从该网站下载这些节点对应的基因序列，然后全基合成得到相应的突变后基因序列。经过酶的表达纯化和热稳定性检测，最终获得了热稳定性显著提高的两个突变体：

突变体1，命名为Ancata-101：

D5E-A12Q-I17V-S20A-T21S-E22A-T23S-A42H-I77L-T78S-T85S-L87M-R90K-D96E-Q97E-E104D-T130S-R131K-D134E-I135L-138insN-V143I-D153E-V157T-V162I-V163I-A174S-I175M-V188T-A195S-H210N-Q236E-N245D-A246V-E248R-F250N-F258V-R266Q-T284S-M288K-G292D-Q294K-I295V-A313P-N322E-E323S-R324A-N325S-325insKKSG；

突变体2，命名为Ancata-124：

D5E-A12Q-I17V-S20A-T21S-E22A-T23S-A42H-I77L-T78S-T85A-R90K-D96E-Q97E-E104D-T130S-R130K-I135L-138insN-V143I-D153E-M154V-V157T-V162I-V163I-A195S-H210N-Q236E-N245D-A246V-E248R-F250N-F258V-L263M-R266Q-T284S-M288K-G292D-Q294K-I295V-A313P-N322E-E323S-R324A-N325S-325insKS，

其中，138insN意为在野生型酶氨基酸序列的138号位点后面插入(insert)N(天冬酰胺)；325insKKSG意为在野生型酶氨基酸序列的325号位点后面插入(insert)KKSG(K：赖氨酸，S：丝氨酸，G：甘氨酸)；325insKS意为在野生型酶氨基酸序列的325号位点后面插入(insert)KS。

本发明提供了一种基于祖先序列重建的ω-转氨酶突变体，由来自土曲霉(Aspergillus terreus)的ω-转氨酶突变所得，野生型ω-转氨酶的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示，所述ω-转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示。

本发明又提供了所述ω-转氨酶突变体在催化(R)-(+)-α-甲基苄胺生成苯乙酮中的应用。相较于野生型酶，突变体酶在较高温条件下具有较好的热力学稳定性，更适合工业应用。

本发明又提供了编码所述ω-转氨酶突变体的基因。

优选的，两种ω-转氨酶突变体的基因序列为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示。

本发明又提供了所述基因在催化(R)-(+)-α-甲基苄胺生成苯乙酮中的应用。

本发明还提供了包含上述基因的重组表达质粒。

本发明还提供了包含上述重组表达质粒的基因工程菌。

本发明还提供了上述基因工程菌在催化(R)-(+)-α-甲基苄胺生成苯乙酮中的应用。

本发明还提供了一种催化(R)-(+)-α-甲基苄胺生成苯乙酮的方法，以(R)-(+)-α-甲基苄胺和丙酮酸作为底物，使用上述ω-转氨酶突变体或上述基因工程菌进行催化发生转氨反应，生成苯乙酮。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)与野生型酶相比，ω-转氨酶突变体的半衰期均在24h以上，而野生型仅为6.90min，突变体的半失活温度分别为49.00℃和49.03℃，比野生型(37.89℃)提高了约11℃，热稳定性显著提高。

(2)利用祖先序列重建技术，筛选获得热力学稳定性、酶活性方面明显优于野生酶的ω-转氨酶突变体。

附图说明

图1为野生型和突变体的SDS-PAGE电泳分析结果图；其中，各泳道分别为M：protein marker；1：野生型酶液(未纯化)；2：野生型酶液(纯化)；3：突变体Ancata-101酶液(纯化)；4：突变体Ancata-124酶液(纯化)。

图2为野生型ω-转氨酶和ω-转氨酶突变体酶的酶活力检测结果图；其中，a为比酶活，b为相对酶活。

图3为野生型ω-转氨酶和ω-转氨酶突变体酶的稳定性检测结果图；其中，a为野生型和Ancata-101、Ancata-124的T₅₀ ¹⁰；b为野生型和Ancata-101、Ancata-124在40℃、45℃和47℃下的t_1/2。

具体实施方式

实施例1

来自于土曲霉(Aspergillus terreus)的野生型ω-转氨酶的氨基酸序列如SEQID No.2所示，基因序列如SEQ ID No.1所示。

将土曲霉ω-转氨酶的蛋白质序列上传至Fire ProtASR(https://loschmidt.chemi.muni.cz/fireprotasr/，一个全自动祖先序列重建的服务器)，通过该网站全自动分析获得了土曲霉ω-转氨酶的系统进化树，然后选定进化树上最终进化为土曲霉ω-转氨酶这一分支的各个节点，并从该网站下载这些节点对应的基因序列，然后全基因合成得到相应的突变后基因序列。经过酶的表达纯化和热稳定性检测，最终获得了热稳定性显著提高的两个突变体，分别命名为Ancata-101和Ancata-124，突变位点和序列如下：

Ancata-101：D5E-A12Q-I17V-S20A-T21S-E22A-T23S-A42H-I77L-T78S-T85S-L87M-R90K-D96E-Q97E-E104D-T130S-R131K-D134E-I135L-138insN-V143I-D153E-V157T-V162I-V163I-A174S-I175M-V188T-A195S-H210N-Q236E-N245D-A246V-E248R-F250N-F258V-R266Q-T284S-M288K-G292D-Q294K-I295V-A313P-N322E-E323S-R324A-N325S-325insKKSG，基因序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

Ancata-124：D5E-A12Q-I17V-S20A-T21S-E22A-T23S-A42H-I77L-T78S-T85A-R90K-D96E-Q97E-E104D-T130S-R130K-I135L-138insN-V143I-D153E-M154V-V157T-V162I-V163I-A195S-H210N-Q236E-N245D-A246V-E248R-F250N-F258V-L263M-R266Q-T284S-M288K-G292D-Q294K-I295V-A313P-N322E-E323S-R324A-N325S-325insKS，基因序列如SEQID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

实施例2

(1)材料与试剂

(R)-ω-TA及突变体全基因由安徽通用生物公司合成，载体为pET-28a(+)，表达宿主菌株为E.coli BL21(DE3)；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、硫酸卡那霉素(Kanamycinsulfate)、磷酸吡哆醛(pyrodoxal-5’-phosphate，PLP)、改良型Bradford蛋白浓度测定试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；Protein Marker、Ni-NTA层析介质购自北京全式金生物技术有限公司；十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶制备试剂盒购于康为世纪生物科技有限公司；二甲基亚砜(DMSO)、丙酮酸、(R)-α-甲基苄胺购自阿拉丁生化科技股份有限公司。

(2)酶的表达与纯化

取10μL野生型重组质粒菌液及突变体菌液分别接种于5mL含有终浓度为50μg/mLKanamycin的Luria-Bertani液体培养基(LB培养基)中，37℃、200rpm条件下摇床培养12h。菌液以2％的接种量(V/V)转接至200mL含有终浓度为50μg/mL Kanamycin的LB液体培养基中，37℃、200rpm条件下继续培养2-3h。当OD₆₀₀达到0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，并在25℃、150rpm条件下诱导蛋白表达。诱导20h后，在6000rpm，4℃条件下离心收集菌体。

菌体细胞用50mM的PBS缓冲液(50mM磷酸二氢钠，50mM磷酸氢二钠，300mM氯化钠，pH为8.0)洗涤1次去除残留培养基后重悬于上述PBS缓冲液中。冰浴条件下对菌体细胞进行均质机破碎细胞。细胞破碎液在8000rpm，4℃条件下离心1h，收集得到的上清液即为含有ω-转氨酶的粗酶液。随后，将粗酶液用0.45μm滤膜过滤后采用Ni-NTA亲和层析柱分离纯化目的蛋白。

纯化缓冲液如下：

20mM咪唑清洗缓冲液：50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，20mM咪唑，pH 8.0；

50mM咪唑清洗缓冲液：50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，50mM咪唑，pH 8.0；

250mM咪唑洗脱缓冲液：50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，250mM咪唑，pH 8.0。

具体纯化步骤：

1)平衡Ni-NTA亲和层析柱：按顺序用20％(V/V)乙醇水溶液、去离子水和20mM咪唑清洗缓冲液各洗3个柱体积；

2)上样：注射器取粗酶液经0.45μm滤膜过滤，带有6个组氨酸标签的目的蛋白能与填料结合。

3)清洗：20mM咪唑清洗缓冲液和50mM咪唑清洗缓冲液各洗3柱体积，Bradford溶液检测是否洗干净杂蛋白；

4)洗脱：250mM咪唑洗脱缓冲液冲洗，收集5mL穿流液。

5)保存柱子：按顺序用20mM咪唑清洗缓冲液、去离子水和20％(V/V)乙醇水溶液各洗3个柱体积，最后保存于20％(V/V)乙醇水溶液中。

(3)蛋白含量的测定。

采用改良型Bradford蛋白浓度测定试剂盒建立蛋白含量标准曲线，测定实施例2中步骤(2)得到的纯酶的浓度，蛋白标准曲线的制备步骤参照说明书进行。采用SDS-PAGE方法鉴定纯化后蛋白的分子量和纯度。具体步骤如下：

制胶：12％分离胶，5％浓缩胶。配方如表1所示。

表1 SDS-PAGE蛋白电泳分离胶和浓缩胶配方

注：Acr-Bis：Acrylamide-Bisacrylamide，丙烯酰胺/亚甲基双丙烯酰胺；

TEMED：N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine，四甲基乙二胺。

样品处理：酶液40μL与5×蛋白加样缓冲液10μL混匀，沸水浴10min。

上样：蛋白Marker 10μL，样品15μL。

电泳条件：电压120V，电泳约90min，待溴酚蓝指示剂移至距凝胶下端边缘约1cm处停止电泳。

染色：染色液没过凝胶，微波炉加热1min，于摇床染色25min。

脱色：回收染色液，换上脱色液，每小时换一次脱色液，至蛋白条带清晰。

蛋白含量测定：将目的蛋白稀释到BSA标准曲线的线性范围内，通过酶标仪测定A595值，求得稀释后的蛋白浓度。

野生型和突变体的SDS-PAGE电泳图谱如图1所示。野生型和突变体的电泳条带位于同一位置，且与理论分子量36.1kDa一致，为后续实验奠定了基础。

(4)酶活力的测定

1)酶活力的测定

20μL纯酶与180μL底物溶液(10mM PLP，2.5mM(R)-α-MBA((R)-(+)-α-甲基苄胺)，2.5mM丙酮酸，0.25％DMSO，50mM PBS，pH8.0)于25℃条件下反应3min，测定OD₂₄₅苯乙酮的生成量，具体方法参考文献(Rapid and sensitive kinetic assay for characterizationofω-transaminases.Anal Chem,2009,81:8244-8248.)。酶活力(U)定义为在一定条件下，每分钟转氨酶催化底物丙酮酸和(R)-α-MBA发生转氨反应生成1μmoL苯乙酮所需酶量。

野生型和2个突变体的酶活力如图2(a)所示，与ω-转氨酶野生型的酶活力相比，2个突变体的的酶活力显著提高，分别是野生型酶活力的1.67倍和1.46倍。

2)酶残余活力的测定

将纯化的野生型和突变体在40℃下孵育10min，孵育结束后，立即放冰上冷却10min。随后，20μL经热处理的酶液与180μL底物溶液(10mM PLP，2.5mM(R)-α-MBA，2.5mM丙酮酸，0.25％DMSO，50mM PBS，pH 8.0)于25℃条件下反应3min，测定野生型和突变体的残余活力。实验平行三次，以未经40℃下孵育处理的野生型酶活力为100％，筛选出相对酶活力比野生型高的突变体。40℃下热处理10min后，野生型和2个突变体的残余活力如图2(b)所示。突变体Ancata-101、Ancata-124的活力基本未下降，而野生型的活力下降了约60％。

综上所述，利用祖先序列重建方法，筛选到2个热稳定性均显著提升的突变体Ancata-101(D5E-A12Q-I17V-S20A-T21S-E22A-T23S-A42H-I77L-T78S-T85S-L87M-R90K-D96E-Q97E-E104D-T130S-R131K-D134E-I135L-138insN-V143I-D153E-V157T-V162I-V163I-A174S-I175M-V188T-A195S-H210N-Q236E-N245D-A246V-E248R-F250N-F258V-R266Q-T284S-M288K-G292D-Q294K-I295V-A313P-N322E-E323S-R324A-N325S-325insKKSG，基因序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)、Ancata-124(D5E-A12Q-I17V-S20A-T21S-E22A-T23S-A42H-I77L-T78S-T85A-R90K-D96E-Q97E-E104D-T130S-R130K-I135L-138insN-V143I-D153E-M154V-V157T-V162I-V163I-A195S-H210N-Q236E-N245D-A246V-E248R-F250N-F258V-L263M-R266Q-T284S-M288K-G292D-Q294K-I295V-A313P-N322E-E323S-R324A-N325S-325insKS，基因序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示)。

(5)酶动力学参数的测定

用含0.01mM PLP的PBS缓冲液(50mM，pH 8.0)分别配制0、0.125、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mM不同浓度的(R)-α-MBA和丙酮酸底物溶液。采用酶活力测定的方法测定在不同浓度下ω-转氨酶野生型和突变体的酶活力。将不同底物以及不同底物浓度[S]下对应的反应速率V带入米氏方程V＝V_max×[S]/(K_m+[S])，利用Origin 8.0软件进行非线性拟合，并计算野生型和突变体对应的酶动力学参数K_m和V_max；由公式k_cat＝V_max/[E]计算野生型和突变体对应的转化数k_cat和催化效率k_cat/K_m，其中[E]为酶的摩尔浓度。结果如表2所示，两种突变酶对丙酮酸的转化数提升幅度低于亲和力的提升幅度，比野生型对丙酮酸的催化效率要低。突变酶Ancata-101和Ancata-124的K_m ^α-MBA值都为0.28mM，略高于野生型，但前者的k_cat ^α-MBA值是野生型的1.67倍，而后者k_cat ^α-MBA值略低于野生型，计算得到Ancata-101和Ancata-124的k_cat/K_m ^α-MBA分别为3.81s^-1·mM^-1和2.07s^-1·mM^-1，前者对α-MBA的催化效率为野生型的1.35倍，略有提升，而后者低于野生型。综上所述，两种突变体的催化效率并未得到显著提升。

表2野生型和突变体的动力学参数

名称	WT-AT	Ancata-101	Ancata-124
				k<sub>cat</sub><sup>pyruvate</sup>(s<sup>-1</sup>)	0.50±0.01	1.50±0.03	0.74±0.03
K<sub>m</sub><sup>pyruvate</sup>(mM)	0.23±0.02	1.15±0.02	0.93±0.01
				k<sub>cat</sub>/K<sub>m</sub><sup>pyruvate</sup>(L/(s·mmol))	2.22	1.30	0.79
k<sub>cat</sub><sup>α-MBA</sup>(s<sup>-1</sup>)	0.64±0.01	1.07±0.02	0.60±0.01
				K<sub>m</sub><sup>α-MBA</sup>(mM)	0.23±0.03	0.28±0.03	0.28±0.01
k<sub>cat</sub>/K<sub>m</sub><sup>α-MBA</sup>(L/(s·mmol))	2.82	3.81	2.07

(6)热稳定性的测定。

1)T₅₀ ¹⁰的测定

T₅₀ ¹⁰是指纯酶在4-60℃下孵育10min后，酶残余活力降低到50％时所对应的温度。将纯化后的野生酶及其突变体分别在4℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、47℃、49℃、50℃和55℃下孵育10min，孵育结束后迅速放置冰上冷却10min，测定野生型及其突变体的残余活力。以温度为横坐标，以热处理后与未经热处理的酶活力比值为纵坐标，运用Origin8.0软件作图，计算野生型和突变体的T₅₀ ¹⁰。

2)t_1/2的测定

t_1/2是指纯酶在40℃下孵育不同时间后，酶残余活力降低到50％时所对应的时间。将纯化后的野生型及其突变体分别在40℃下孵育0-24h，孵育结束后立即放冰上冷却10min，测定野生型及其突变体的残余活力。以时间为横坐标，以热处理后与未经热处理的酶活力比值为纵坐标，运用Origin 8.0软件作图，计算野生型和突变体在40℃下的t_1/2。

表3野生型和突变体的稳定性参数

名称	WT-AT	Ancata-101	Ancata-124
				T<sub>50</sub><sup>10</sup>(℃)	37.89±0.5	49.00±0.4	49.03±0.5
T<sub>50</sub><sup>10</sup>提高温度(℃)	-	11.11	11.14
				t<sub>1/2</sub>(min)	6.90±0.6	>1440	>1440
t<sub>1/2</sub>提升的倍数	-	207	207

突变体Ancata-101、Ancata-124的稳定性测定结果如图3和表3所示。野生型的T₅₀ ¹⁰为37.89℃，突变体Ancata-101、Ancata-124的T₅₀ ¹⁰分别为49.00℃和49.03℃，分别比野生型提高了11.11℃和11.14℃。突变体Ancata-101、Ancata-124的t_1/2均大于24h(1440min)，而野生型t_1/2仅6.90min。在45℃时，野生型酶孵育不到一分钟残余活力就降低到50％，而两个突变体孵育6h以上残余活力仍大于50％。

序列表

<110> 浙江科技学院

<120> 一种基于祖先序列重建的ω-转氨酶突变体

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 978

<212> DNA

<213> 土曲霉(Aspergillus terreus)

<400> 1

atggccagta tggataaggt ttttgcaggc tatgctgccc gtcaagcaat cttagaaagt 60

accgaaacta cgaacccgtt tgccaaagga attgcctggg tcgaagggga actcgttcct 120

ttagctgaag cacgcattcc actcctcgat cagggcttca tgcactccga tctgacctac 180

gacgtaccgt ctgtttggga tgggcgattt tttcgtttag atgatcatat tacacgcctg 240

gaagcaagct gcaccaagct gaggctgcgt ctacccttac cacgtgatca agttaaacaa 300

atcctggtgg aaatggtcgc aaaatctggt attcgggatg catttgttga attgatagtc 360

acccgcggtc ttaaaggggt gcgaggaact cgtccgcatg atatagtgaa caacctgtac 420

atgtttgtgc agccgtacgt gtgggttatg gagccggata tgcagcgcgt aggcggcagc 480

gcagtggtgg ctaggaccgt ccgccgggta ccaccgggcg ctattgatcc gaccgtcaag 540

aatcttcagt ggggtgatct tgttcgtgga atgtttgaag cggctgatcg tggcgcaaca 600

tatcccttcc ttaccgacgg cgatgcgcac ctgactgaag gatcgggttt taatatagta 660

ttagtcaaag atggcgtcct gtatacgcca gatcgcgggg tgctgcaggg agtgactcgc 720

aagtccgtta tcaacgctgc tgaagccttt ggaatagaag tgcgggttga gttcgttcca 780

gttgagctgg cctaccggtg tgacgagatt ttcatgtgca cgacggcggg tggcattatg 840

cctatcacaa cattggacgg tatgcctgta aatggtgggc aaattgggcc tattacgaaa 900

aaaatatggg acggttattg ggcgatgcat tatgacgccg cgtattcgtt cgagatcgac 960

tataatgaga gaaattag 978

<210> 2

<211> 326

<212> PRT

<213> 土曲霉(Aspergillus terreus)

<400> 2

Met Ala Ser Met Asp Lys Val Phe Ala Gly Tyr Ala Ala Arg Gln Ala

1 5 10 15

Ile Leu Glu Ser Thr Glu Thr Thr Asn Pro Phe Ala Lys Gly Ile Ala

20 25 30

Trp Val Glu Gly Glu Leu Val Pro Leu Ala Glu Ala Arg Ile Pro Leu

35 40 45

Leu Asp Gln Gly Phe Met His Ser Asp Leu Thr Tyr Asp Val Pro Ser

50 55 60

Val Trp Asp Gly Arg Phe Phe Arg Leu Asp Asp His Ile Thr Arg Leu

65 70 75 80

Leu Glu Ala Ser Cys Thr Lys Leu Arg Leu Arg Leu Pro Leu Pro Arg

85 90 95

Asp Gln Val Lys Gln Ile Leu Val Glu Met Val Ala Lys Ser Gly Ile

100 105 110

Arg Asp Ala Phe Val Glu Leu Ile Val Thr Arg Gly Leu Lys Gly Val

115 120 125

Arg Gly Thr Arg Pro Glu Asp Ile Val Asn Asn Leu Tyr Met Phe Val

130 135 140

Gln Pro Tyr Val Trp Val Met Glu Pro Asp Met Gln Arg Val Gly Gly

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Ser Ala Val Val Ala Arg Thr Val Arg Arg Val Pro Pro Gly Ala Ile

165 170 175

Asp Pro Thr Val Lys Asn Leu Gln Trp Gly Asp Leu Val Arg Gly Met

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210 215 220

Asp Gly Val Leu Tyr Thr Pro Asp Arg Gly Val Leu Gln Gly Val Thr

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Arg Lys Ser Val Ile Asn Ala Ala Glu Ala Phe Gly Ile Glu Val Arg

245 250 255

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Met Cys Thr Thr Ala Gly Gly Ile Met Pro Ile Thr Thr Leu Asp Gly

275 280 285

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<212> DNA

<213> 土曲霉(Aspergillus terreus)

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ctgcatgaag cgcgcattcc gctgctggat cagggcttta tgcatagcga tctgacctat 180

gatgtgccga gcgtgtggga tggccgcttt tttcgcctgg atgatcatct gagccgcctg 240

gaagcgagct gcagcaaaat gcgcctgaaa ctgccgctgc cgcgcgaaga agtgaaacag 300

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acccgcggcc tgaaaggcgt gcgcggcagc aaaccggaag aactggtgaa caacaacctg 420

tatatgttta ttcagccgta tgtgtgggtg atggaaccgg aaatgcagcg caccggcggc 480

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acctatccgt ttctgaccga tggcgatgcg aacctgaccg aaggcagcgg ctttaacatt 660

gtgctggtga aagatggcgt gctgtatacc ccggatcgcg gcgtgctgga aggcgtgacc 720

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<212> PRT

<213> 土曲霉(Aspergillus terreus)

<400> 4

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Val Leu Glu Ala Ser Ala Ser Thr Asn Pro Phe Ala Lys Gly Ile Ala

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agcgcaagta ccaatccgtt tgcaaaaggc attgcctggg tggaaggcga actggttccg 120

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gaagcatcat gcgccaaact gcgcctgaaa ctgccgctgc cgcgtgaaga agttaaacag 300

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ccggtggaaa tggcatatca gtgtgatgaa atttttatgt gcaccaccgc cggcggcatt 840

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<211> 328

<212> PRT

<213> 土曲霉(Aspergillus terreus)

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Asp Gly Tyr Trp Ala Met His Tyr Asp Pro Ala Tyr Ser Phe Glu Ile

305 310 315 320

Asp Tyr Glu Ser Ala Ser Lys Ser

325

Claims

1.一种基于祖先序列重建的ω-转氨酶突变体，其特征在于，由来自土曲霉(Aspergillus terreus)的ω-转氨酶突变所得，所述ω-转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQID NO.4或SEQ ID NO.6所示。

2.如权利要求1所述ω-转氨酶突变体在催化(R)-(+)-α-甲基苄胺生成苯乙酮中的应用。

3.编码如权利要求1所述ω-转氨酶突变体的基因。

4.如权利要求3所述的基因，其特征在于，ω-转氨酶突变体的基因序列为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示。

5.如权利要求3所述基因在催化(R)-(+)-α-甲基苄胺生成苯乙酮中的应用。

6.包含如权利要求3所述基因的重组表达质粒。

7.包含如权利要求6所述重组表达质粒的基因工程菌。

8.如权利要求7所述基因工程菌在催化(R)-(+)-α-甲基苄胺生成苯乙酮中的应用。

9.一种催化(R)-(+)-α-甲基苄胺生成苯乙酮的方法，其特征在于，以(R)-(+)-α-甲基苄胺和丙酮酸作为底物，使用权利要求1所述ω-转氨酶突变体或权利要求7所述基因工程菌进行催化发生转氨反应，生成苯乙酮。