CN110144335B - 一种ω-转氨酶双突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种ω‑转氨酶双突变体及其应用，该ω‑转氨酶双突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明ω‑转氨酶双突变体由野生型的土曲霉(Aspergillus terreus)ω‑转氨酶第115位的苯丙氨酸突变成亮氨酸，第118位的亮氨酸突变成苏氨酸而获得；该ω‑转氨酶双突变体的半失活温度比野生型提高了8.8℃，热解折叠温度比野生型提高了7.7℃，在40℃时的半衰期较野生型延长了59.0min，是野生型的9.55倍。

Description

一种ω-转氨酶双突变体及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种ω-转氨酶双突变体及其应用。

背景技术

胺转氨酶(ATAs)以其高立体选择性和环境温和的反应条件，成为制备光学纯手性胺最主要的生物催化剂。一般来说，提高温度可以增加原料与产物的溶解度降低其粘度，加快反应速度，但天然状态下的酶的温度耐受性差，高温易使酶失活变性，如何提高酶的热稳定性是蛋白质工程极具挑战性的研究。

由Michael Smith发明兴起的定点突变技术，是在已知的基因序列中插入、取代和缺失特定核苷酸，从而改变蛋白质一级结构。张晓凤等(张晓凤.定点突变提高土曲霉Aspergillus terreus脂肪酶的催化活性[J].生物工程学报,2018,34(7):1091-1105)对酸性脂肪酶底物结合口袋附近和Lid区域的位点进行突变，获得了催化活性显著提高的ATLV218W和ATL Lid突变体。

定点饱和突变技术提升了点突变的可能性，能将某个预测功能位点同时替换成其它19种氨基酸。通过设计简并引物构建饱和突变文库因突变子数量庞大需要简单灵敏的高通量筛选方法以获得有效突变体。例如：林玲等(林玲.利用定向进化及半理性设计提高谷氨酸脱羧酶催化活性的研究[D].浙江:浙江大学,2013)对GAD1407谷氨酸脱羧酶的第51位点构建饱和突变文库，并采用郁凯等(Yu K,Hu S,Huang J,Mei L H.A high-throughputcolorimetric assay tomeasure the activity of glutamate decarboxylase[J].Enzyme Microb.Technol,2012,49(3):272-276)根据溴甲酚紫指示剂能反映谷氨酸脱羧酶催化底物脱羧引起体系pH值变化，而建立了通过观察颜色的深浅来判断谷氨酸脱羧酶活性高低的高通量筛选方法，最终筛选获得突变体Q51H，其催化活性是野生型的2.2倍。

申请公布号为CN109486778A的发明专利申请公开了一种基于共进化网络的ω-转氨酶突变体以及制备方法和应用，该ω-转氨酶突变体的第118位氨基酸由亮氨酸突变为丙氨酸或苏氨酸，与野生型相比，ω-转氨酶突变体的半失活温度提高3.7℃和5.3℃，半衰期延长13.7min和19.1min。

然而，单突变位点的突变对酶活稳定性的改善是有限的，为了进一步的提高转氨酶的热稳定性，需要在其他位点引入突变。

发明内容

本发明提供了一种ω-转氨酶双突变体，在利用蛋白质共进化网络预测高交联残基位点的基础上，结合迭代饱和突变技术，构建迭代饱和突变文库，筛选获得双突变体L118T-F115L，该双突变体的T_m和T₅₀ ¹⁰相比于野生型分别提高了7.7℃和8.8℃，其40℃时的t_1/2较野生型延长了59.0min。

具体技术方案如下：

本发明提供了一种ω-转氨酶双突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述双突变体是由野生型的土曲霉(Aspergillus terreus)ω-转氨酶第115位的苯丙氨酸(密码子TTT)突变成亮氨酸(密码子CTA)，第118位的亮氨酸(密码子TTG)突变成苏氨酸(密码子ACG)而获得的，称为L118T-F115L双突变体。

本发明首先通过分析转氨酶氨基酸残基间的共进化关系，筛选获得8个具有共进化关系的氨基酸位点，建立相应的突变文库，发现L118T突变体具有较高的活性，再以L118T突变体为起点，构建迭代饱和突变文库；从近900个突变子中筛选出来最佳双突变组合L118T-F115L。该双突变体L118T-F115L的稳定性分析结果表明，其T₅₀ ¹⁰值较野生型提高了8.8℃，t_1/2是野生型的9.55倍。对该组合突变酶的热解折叠温度进行测定，其T_m值较野生型提高了7.7℃，突变使蛋白的刚性得到加强。无论是动力学稳定性还是热力学稳定性结果一致表明，双突变L118T-F115L的热稳定性有大幅的提高。

本发明还提供了编码所述ω-转氨酶双突变体的基因。

编码所述ω-转氨酶双突变体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种包含所述基因的表达单元。

本发明还提供了一种包含所述表达单元的重组质粒。

本发明还提供了一种包含所述重组质粒的基因工程菌。

可以将目的基因片段整合到基因工程菌的基因组上，以获得稳定表达的ω-转氨酶双突变体的基因工程菌，也可以通过质粒的形式存在。可以选择常用的用于蛋白表达的基因工程菌，优选为E.coli BL21(DE3)。

本发明提供的ω-转氨酶双突变体能够以(R)-(+)-α-甲基苄胺和丙酮酸为底物催化发生转氨反应生成苯乙酮，手性选择性为(R)型。

本发明还提供了所述ω-转氨酶双突变体或所述基因工程菌在催化(R)-(+)-α-甲基苄胺中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明ω-转氨酶双突变体由野生型的土曲霉(Aspergillus terreus)ω-转氨酶第115位的苯丙氨酸突变成亮氨酸，第118位的亮氨酸突变成苏氨酸而获得的；该ω-转氨酶双突变体的半失活温度比野生型提高了8.8℃，热解折叠温度比野生型提高了7.7℃，在40℃时的半衰期较野生型延长了59.0min，是野生型的9.55倍。

附图说明

图1为实施例1中ω-转氨酶(PDB ID：4CE5)与其同源蛋白家族序列利用蛋白质共进化网络互信息预测的重要位点图。

图2为实施例1中L118T-F115位点迭代饱和突变文库的初筛示意图。

图3为实施例1中L118T-F115L双突变体的SDS-PAGE分析；

其中，1为粗酶液；2为穿透液；3为20mM咪唑洗脱液；4为50mM咪唑洗脱液；5为100mM咪唑洗脱液；6为250mM咪唑洗脱液。

图4为实施例2中L118T-F115L双突变体的动力学稳定性分析；

其中，A为酶液在不同温度下孵育10min后测得的T₅₀ ¹⁰值；B为40℃下酶液保温不同时间时的残余酶活；Residual activity表示剩余活力；Temperature表示温度。

图5为实施例2中差示荧光扫描法测定转氨酶及其突变酶的热解折叠情况；

其中，Relative fluorescence表示相对荧光；Temperature表示温度。

图6为实施例2中酶催化底物的动力学曲线；

其中，A为底物丙酮酸浓度为2.5mM时，R-MBA的浓度(0-4.0mM)；B为底物R-MBA浓度为2.5mM时，丙酮酸的浓度(0-4.0mM)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。

实施例1

1、共进化网络预测

蛋白质共进化对于洞悉功能蛋白质的作用过程和蛋白质结构具有重要意义。通过对蛋白质共进化的度量，可以找到对蛋白质结构和功能具有重要作用的残基位点。

具体步骤如下：

(1)将土曲霉(Aspergillus terreus)ω-转氨酶的PDB文件(PDB ID：4CE5)在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中通过BLASTP多序列比对，获得相关的蛋白质家族编号pfam:01063。

(2)以互信息(Mutual Information，MI)为基础，通过不同生物学特征，借助互信息推断蛋白共进化网站MISTIC(Mutual Information Server To Infer Coevolution)，生成氨基酸残基共进化网络；

将蛋白家族pfam序号(01063)和ω-转氨酶的PDB文件(PDB ID：4CE5)上传到MISTIC网站上，MISTIC网站的网址服务器为http://mistic.leloir.org.ar；选定参比序列(Reference Sequence)A3XII7_LEEBM/39-275，MISTIC网站会根据上述信息生成氨基酸残基共进化网络，将生成的蛋白质共进化网络映射到ω-AT(PDB ID：4CE5)上，根据蛋白质中氨基酸残基之间的相互作用关系预测突变氨基酸位点，包括互信息(MI)21，保守值1.1，累积互信息(cMI)501，邻近互信息(pMI)1924。结果如图1所示，筛选了8个氨基酸位点。

在此基础上，通过进一步分析发现F115、N181和W184三个位点与L118位点存在相互作用关系并将它们作为组合突变的靶点。运用迭代饱和突变手段进行突变位点的叠加，期望获得热稳定性进一步提高的转氨酶。

2、迭代饱和突变文库的构建

设计简并引物进行PCR反应使相应位点氨基酸引入其它19种不同的氨基酸，引物设计如表1：

表1 F115、N181和W184位点的饱和突变引物

下划线表示突变位置，NNN代表简并引物。

在设计突变引物时，由于L118位点与F115位点非常接近，需要先将野生型基因序列中118位点的密码子TTG(亮氨酸)替换成密码子ACG(苏氨酸)，再去设计F115位点的突变引物，最后相应突变位点碱基用NNN简并碱基替代。55℃是比较合适的退火温度，容易将转氨酶的重组目的基因克隆。将纯化后的三个组合突变的PCR产物导入经验证可行的大肠杆菌BL21(DE3)超级感受态中，适宜条件下培养，每个文库的抗性筛选板至少有400个突变子。

3、大肠杆菌的电转化

(1)将纯化后的PCR产物，大肠杆菌BL21(DE3)电击感受态，无菌电极杯和LB培养基于冰水浴中放置8min。

(2)添加10μL PCR纯化产物到电击感受态中，轻轻混匀，冰上放置180s。

(3)将混合物转移到无菌电极杯中，2.5kV，4ms条件下电击后，往电击杯中补充600μL预冷的LB培养基。

(4)转移电击后混合物于无菌EP管中，冰上放置3-5min。

(5)37℃，160r/min摇床复苏2h。

(5)复苏液适当低速离心，取150μL浓缩复苏液涂布含卡那霉素的选择性平板，于37℃培养箱过夜培养。

三个组合突变的PCR产物经核酸电泳检测有目的条带后，限制性内切酶Dpn I降解模板。纯化后的扩增片段在42℃水浴锅中热击90s转化入大肠杆菌超级感受态中，补充600μL LB培养基，摇床37℃，160r/min，复苏1h。将复苏菌液浓缩后，涂布卡那霉素选择性平板，置于培养箱培养过夜，待平板长满单菌落。

4、迭代饱和突变文库的初筛与复筛

从上述构建的L118T-F115、L118T-N181和L118T-W184三个迭代饱和突变文库中，分别随机挑选约300个突变子，突变体L118T作为对照，同时于96孔板中培养并筛选热力学稳定性更高的突变子。

具体操作如下：用无菌牙签挑大约300个单菌落到1mL LB培养液(含卡那霉素50μg/mL)的96深孔板，37℃、200r/min培养8h至指数生长后期。母板每孔移取200μL菌液于种子板相应孔，各孔加入100μL甘油(50％)，混匀后菌种保存-80℃医用冰箱。母板中剩余的菌液每孔补充200μL LB培养液(含2.5mM IPTG)，25℃，150r/min诱导20h，诱导结束后母板于4500r/min，离心10min，收集菌体。菌体用PBS(pH 8.0)缓冲液清洗两遍，相同条件下离心，弃尽上清。将母板于超低温冰箱冷冻过夜后，取出母板室温解冻30min后，超低温冷冻20min，反复冻融三次。母板各孔中加入250μL溶菌酶(5mg/mL)重悬菌体，母板置于37℃，200r/min恒温孵育30min以充分裂解细胞释放胞内酶，然后4500r/min，离心10min以将分离粗酶液和菌体。

每孔取80μL母板中的上清液(粗酶液)到96微量孔板的相应孔中，96微量孔板膜封后放入PCR仪中50℃恒温处理10min后，冰浴放置10min，粗酶液各20μL与180μL底物溶液混合，酶标仪检测粗酶液热处理前后催化转氨反应的酶活，定义相应酶未做热处理时候的酶活为100％。计算粗酶液热处理后的残余酶活百分比，选择残余酶活百分比高于野生型的突变子，从母板中找到对应的孔，重新挑取于新96孔板中，重复上述步骤进行复筛。最后选择残余酶活百分比TOP10的突变子，活化后送安徽通用生物公司测序分析。

结果：

L118T-N181饱和突变体初筛过程中，大部分突变子几乎没有酶活或者酶活很低，表现出来的疑似突变体L118T-N181X测序验证为L118T，而在181位点密码子为AAT编码天冬酰胺，并未发生突变。这就意味着，联合N181位点的饱和突变没有筛选到更稳定的突变子。同样在L118T-W184饱和突变体初筛过程中，大部分突变子几乎没有酶活或者酶活很低，表现出来的疑似突变体L118T-W184X测序验证为L118T，在184位点密码子仍为TGG编码色氨酸，联合W184位点的饱和突变也没有筛选到更稳定的突变子。

L118T-F115迭代饱和突变文库的初筛过程中如图2，图2A代表未经热处理的原酶液的酶活，图2B代表酶液在50℃下保温10min后的酶活。计算每个突变酶热处理前后的残余酶活，比对照G12(L118T)的残余酶活高的为潜在优异突变体L118T-F115X，测序公司对潜在优异突变体L118T-F115X测序分析，通过与野生型基因序列比对，发现在两个地方发生改变，分别在115位点由TTT密码子(编码苯丙氨酸)突变成CTA密码子(编码亮氨酸)和118位点TTG密码子(编码亮氨酸)突变成ACG密码子(编码苏氨酸)，因此称为L118T-F115L突变体。

5、L118T-F115L突变体的表达与纯化

从三个组合突变的迭代饱和突变文库中筛选的疑似突变体经安徽通用生物公司测序，通过DNAMAN软件与突变体L118T基因序列比对，确实在相应位点引入突变，突变结果为L118T-F115L。将该热稳定性提高的潜在双突变体进行诱导表达与纯化，具体步骤如下：

将该热稳定性提高的潜在双突变体进行诱导表达与纯化，将野生型、突变体L118T与组合突变体菌种于小试管活化后，按1％(v/v)的接种量转接于200mL LB培养基(含卡那霉素50μg/mL)，37℃、200r/min，摇床培养至OD₆₀₀值0.6～0.8。在25℃，150r/min的条件下以终浓度0.5mM的IPTG诱导蛋白表达。诱导20～24h后，4℃下，6000r/min离心8min，弃上清，菌体用磷酸缓冲液(50mM，pH 8.0)洗涤2次以去除残留培养基，菌体重悬于30mL破胞缓冲液中(50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，20mM咪唑，pH 8.0)，超声破碎细胞，4℃下，8000r/min离心35min，收集上清即为粗酶液。粗酶液经0.45μm滤膜过滤后采用Ni-NTA亲和层析柱分离纯化重组蛋白。

纯化缓冲液如下：

20mM咪唑缓冲液：50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，20mM咪唑，pH 8.0；

50mM洗脱缓冲液：50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，50mM咪唑，pH 8.0；

100mM洗脱缓冲液：50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，100mM咪唑，pH 8.0；

250mM洗脱缓冲液：50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，250mM咪唑，pH 8.0。

具体纯化步骤：

(1)平衡Ni-NTA亲和层析柱：20％乙醇，去离子水和20mM咪唑缓冲液各3柱体积；

(2)上样：注射器取粗酶液经0.45μm滤膜过滤，带有6个组氨酸标签的重组蛋白能与填料结合。

(3)清洗：20mM咪唑缓冲液2-3柱体积，Bradford溶液检测是否洗干净杂蛋白；

(4)洗脱：50mM洗脱缓冲液1柱体积，100mM洗脱缓冲液5mL，250mM洗脱缓冲液5mL

(5)保存柱子：20mM咪唑缓冲液，去离子水和20％乙醇各3柱体积，最后保存于20％乙醇中。

6、L118T-F115L突变体的SDS-PAGE分析和蛋白含量测定

L118T-F115L突变体的重组蛋白流经Ni-NTA亲和层析柱时与镍离子结合，被250mM咪唑缓冲液洗脱，得到纯化重组蛋白用于SDS-PAGE非连续电泳分析和蛋白含量测定。

纯化蛋白采用SDS-PAGE非连续电泳进行检测，具体步骤如下：

制胶：12％分离胶，5％浓缩胶。配方如表2所示。

表2 SDS-PAGE蛋白电泳分离胶和浓缩胶配方

样品处理：粗酶液40μL与5×蛋白加样缓冲液10μL混匀，沸水浴10min。

上样：蛋白Marker 5μL，样品10μL。

电泳条件：电压170V，电泳约45min，待溴酚蓝指示剂移至距凝胶下端边缘约1cm处停止电泳。

染色：染色液没过凝胶，微波炉加热1min，于摇床染色25min。

脱色：回收染色液，换上脱色液，每小时换一次脱色液，至蛋白条带清晰。

蛋白含量测定：将目的蛋白稀释到BSA标准曲线的线性范围内，通过酶标仪测定A₅₉₅值，代入线性方程求得稀释后的蛋白浓度。

纯化蛋白的过程中，我们收集了L118T-F115L的粗酶液，穿透液，20mM咪唑的酶洗脱液，50mM咪唑的酶洗脱液，100mM咪唑的酶洗脱液，250mM咪唑的酶洗脱液。取这些酶样品40μL与10μL蛋白加样缓冲液混匀经沸水浴变性处理10min，处理后蛋白样品与蛋白Marker经SDS-PAGE分析。

结果如图3所示，100mM或者250mM咪唑洗脱液都能将L118T-F115L重组蛋白洗脱下来，目的蛋白条带单一清晰，分子量大小接近于野生型转氨酶的理论分子量36.1kDa。

7、L118T-F115L突变体的动力学稳定性表征

(1)酶保温10min的半失活温度(T₅₀ ¹⁰)

T₅₀ ¹⁰是指酶在一定温度下保温10min后，酶残余活力是未受热处理酶活50％的温度。

纯化后的野生型酶、L118T和L118T-F115L突变酶(0.2mg/mL)每管120μL分装于1.5mL EP管中，将EP管插入漂浮阀中置于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃和55℃恒温水浴中，热处理10min后，迅速取出置冰浴10min，利用酶标仪测定酶的残余活力。定义未经热处理的酶液活性为100％，计算酶在不同温度下的残余比活力，在软件Origin 8.0中，以酶热处理后的残余活性为纵坐标，温度为横坐标，采用Sigmoidal Boltzmann Fit非线性拟合，反S型曲线的拐点即为T₅₀ ¹⁰。

(2)酶特定温度下活力丧失一半的时间(t_1/2)

将野生型酶、L118T和L118T-F115L突变酶(0.2mg/mL)置于40℃恒温水浴中温浴0-40min，保温时间结束后迅速转移至冰上10min，然后测定酶的残余活性。

酶高温下的失活一般视为一级不可逆失活，符合一级不可逆失活模型，那么酶活与时间的关系符合公式1：

其中，[E₀]为初始酶活，k_d称为一级失活常数，t代表时间。当[E_t]降为[E₀]一半所需的时间称为半衰期(t_1/2)。t_1/2与k_d之间的关系如公式2：

t_1/2＝ln2/k_d 公式2)

数据处理的过程中，定义未受热处理的酶液活性为100％，计算在40℃时，酶液保温不同时间的残余活力，以酶残余比活力，对时间作图，在Origin 8.0软件中进行非线性拟合(y＝exp(-k_d·t))，所得斜率即为酶在40℃时的一级失活常数(k_d)。再由公式2求得t_1/2。

(3)酶的最适温度：

转氨酶底物的配制为：2.5mM丙酮酸，2.5mM(R)-(+)-α-甲基苄胺((R)-α-MBA)作为双底物，0.25％二甲基亚砜(DMSO)助溶，0.1mM PLP，用磷酸盐缓冲液(50mM，pH 8.0)配制成50mL的底物体系，现配现用。

将纯化酶稀释至适当浓度(0.2mg/mL)，在石英96孔板中加入20μL纯酶液，180μL底物，平行三组，并以双蒸水为对照，MD190酶标仪检测245nm处由酶催化的底物反应生成苯乙酮的初始速率，按公式3计算酶的比活力：

其中，ΔOD₂₄₅：在245nm处每分钟吸光度的变化

V：酶反应体系总体积(200μL)

d：光径(0.6cm)

ε：为苯乙酮的旋光吸收系数(12000/(M·cm))

V_E：反应体系中酶的体积(20μL)

[E]：酶的浓度(mg/mL)

配制转氨酶的底物后，40μL酶液(0.2mg/mL)与360μL底物溶液混合于1.5mL EP管中，置于金属浴中不同温度25-60℃，转速400r/min，反应3min后，将EP管于沸水浴煮沸使酶变性失活终止催化反应，冰上冷却10min后，以25℃双蒸水代替酶液的反应体系为对照，各平行三组，酶标仪测定不同温度下相同量的酶催化甲基苄胺发生转氨反应生成苯乙酮在245nm处的吸光度，苯乙酮的含量与245nm处的吸光度成正比，通过比较A₂₄₅值大小来反映酶催化的最适温度。

结果：

如图4A所示，酶液在不同温度下孵育10min后，测得双突变体L118T-F115L的T₅₀ ¹⁰值为47.3℃，比突变体L118T的T₅₀ ¹⁰提高了3.5℃，比野生型提高了8.8℃。

如图4B，测定了40℃下，酶液保温不同时间时的残余酶活。经公式3分别计算得野生型、单突变L118T和双突变L118T-F115L的半衰期分别为6.9min，26.0min和65.9min。双突变L118T-F115L在40℃下的半衰期比单突变L118T延长了39.9min，比野生型延长了59.0min，是野生型的9.55倍。运用迭代饱和突变的手段联合115位点的迭代饱和突变获得了动力学稳定性显著提高的组合突变体L118T-F115L。

8、L118T-F115L突变酶的热解折叠

制备检测样品：适当稀释待分析纯酶(0.1mg/mL)与荧光染料SYPRO Orange dye 2×，50mM PBS缓冲液(pH 8.0)和150mM NaCl混合，总体积50μL，以酶缓冲液为阴性对照，各平行三组。装有待分析样品的PCR管放入实时荧光定量PCR仪中进行程序升温，温度上升速率为0.7℃/30s。实时荧光定量PCR仪记录酶样品在25℃升至70℃条件下的荧光强度变化。其中激发波长为490nm，发射波长为605nm。以荧光强度对温度作图，曲线呈S型，其中曲线的拐点即为蛋白质的热解折叠温度(T_m)。

酶的热动力学分析采用二态平衡模型，T_m值根据Boltzmann公式4计算获得：

其中，y代表不同温度下的荧光强度，UF是酶天然折叠状态的荧光强度，NF为解折叠状态下最大荧光强度，x指温度，dx是荧光强度与温度关系曲线的斜率。使用软件Origin8.0进行拟合，求得T_m。

结果：

借助实时荧光定量PCR仪分析L118T-F115L突变酶热解折叠过程。将浓度为0.1mg/mL的L118T-F115L突变酶与荧光染料SYPRO Orange dye 2×，50mM PBS缓冲液(pH 8.0)和150mM NaCl混合。将样品中的酶液用等体积双蒸水代替并作为阴性对照。定义最大荧光吸收强度为100％，绘制温度与相对荧光强度之间的关系曲线如图5。

表3野生型和突变体AT-ATA的热稳定性参数

经二态公式4拟合，求得L118T-F115L突变酶的T_m值如表3。在L118T基础上联合F115位点的L118T-F115L双突变酶T_m为49.1℃，比原来的单突变体L118T提高了2.7℃，较野生型提高了7.7℃。联合118和115这两个位点的突变对提高热稳定性存在协同作用。

9、L118T-F115L突变体的动力学参数测定

因转氨酶催化的反应是双底物体系，当底物(R)-α-MBA在饱和浓度下，磷酸缓冲液(50mM，pH 8.0)配制不同浓度(0-3mM)的丙酮酸；当底物丙酮酸在饱和浓度下，配制不同浓度(0-3mM)的(R)-α-MBA。底物混合物中助溶剂(DMSO)和辅酶PLP含量不变。利用MD190酶标仪分别检测反应初始速率与不同底物浓度之间的变化曲线。以反应速率[V]对底物浓度[S]作图，在底物浓度较低时，反应速率[V]与底物浓度[S]之间的关系如公式5。

通过非线性拟合计算相应的米氏常数(K_m)和最大反应速度(V_max)值，再由公式6计算转化数k_cat，和催化效率k_cat/K_m，其中[E]为酶的摩尔浓度。

h_cat＝V_max/[E] (公式6)

当底物丙酮酸浓度为2.5mM时，R-MBA的浓度(0-4.0mM)；当底物R-MBA浓度为2.5mM时，丙酮酸的浓度(0-4.0mM)；酶标仪分别监测L118T-F115L突变酶对不同浓度丙酮酸或R-MBA的初始反应速率。

如图6A和6B，在一定底物浓度范围内，酶催化反应速率随R-MBA或者丙酮酸浓度增加而增加，底物饱和后，酶催化反应速率基本保持不变趋于稳定。与野生型和L118T突变体相比，L118T-F115L突变酶反应速率达平衡时的底物浓度更高。

表4转氨酶及其突变酶的动力学参数

经米氏方程拟合求得L118T-F115L突变酶的K_m ^pyruvate，K_m ^α-MBA(表4)。L118T-F115L突变酶的K_m ^pyruvate值为1.31mM，是野生型的5.7倍，是突变体L118T的3.27倍；其K_m ^α-MBA值为0.99mM，野生型的4.3倍，是突变体L118T的5.5倍，这可能是115位点的苯丙氨酸突变成亮氨酸后使底物结合区域空间变大对底物R-MBA和丙酮酸的亲和力减弱。

此外，L118T-F115L突变酶对底物R-MBA和丙酮酸的转化数分别是野生型的2.79倍和3.74倍。然而，由于L118T-F115L突变酶对底物R-MBA和丙酮酸的转化数提升幅度不如对底物亲和力的增加幅度，计算得到的其k_cat/K_m ^pyruvate和k_cat/K_m ^α-MBA分别为1.43s^-1·mM^-1和1.81s^-1·mM^-1，比野生型催化效率降低。

序列表

<110> 浙江科技学院

<120> 一种ω-转氨酶双突变体及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 325

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 1

Met Ala Ser Met Asp Lys Val Phe Ala Gly Tyr Ala Ala Arg Gln Ala

1 5 10 15

Ile Leu Glu Ser Thr Glu Thr Thr Asn Pro Phe Ala Lys Gly Ile Ala

20 25 30

Trp Val Glu Gly Glu Leu Val Pro Leu Ala Glu Ala Arg Ile Pro Leu

35 40 45

Leu Asp Gln Gly Phe Met His Ser Asp Leu Thr Tyr Asp Val Pro Ser

50 55 60

Val Trp Asp Gly Arg Phe Phe Arg Leu Asp Asp His Ile Thr Arg Leu

65 70 75 80

Glu Ala Ser Cys Thr Lys Leu Arg Leu Arg Leu Pro Leu Pro Arg Asp

85 90 95

Gln Val Lys Gln Ile Leu Val Glu Met Val Ala Lys Ser Gly Ile Arg

100 105 110

Asp Ala Leu Val Glu Thr Ile Val Thr Arg Gly Leu Lys Gly Val Arg

115 120 125

Gly Thr Arg Pro Glu Asp Ile Val Asn Asn Leu Tyr Met Phe Val Gln

130 135 140

Pro Tyr Val Trp Val Met Glu Pro Asp Met Gln Arg Val Gly Gly Ser

145 150 155 160

Ala Val Val Ala Arg Thr Val Arg Arg Val Pro Pro Gly Ala Ile Asp

165 170 175

Pro Thr Val Lys Asn Leu Gln Trp Gly Asp Leu Val Arg Gly Met Phe

180 185 190

Glu Ala Ala Asp Arg Gly Ala Thr Tyr Pro Phe Leu Thr Asp Gly Asp

195 200 205

Ala His Leu Thr Glu Gly Ser Gly Phe Asn Ile Val Leu Val Lys Asp

210 215 220

Gly Val Leu Tyr Thr Pro Asp Arg Gly Val Leu Gln Gly Val Thr Arg

225 230 235 240

Lys Ser Val Ile Asn Ala Ala Glu Ala Phe Gly Ile Glu Val Arg Val

245 250 255

Glu Phe Val Pro Val Glu Leu Ala Tyr Arg Cys Asp Glu Ile Phe Met

260 265 270

Cys Thr Thr Ala Gly Gly Ile Met Pro Ile Thr Thr Leu Asp Gly Met

275 280 285

Pro Val Asn Gly Gly Gln Ile Gly Pro Ile Thr Lys Lys Ile Trp Asp

290 295 300

Gly Tyr Trp Ala Met His Tyr Asp Ala Ala Tyr Ser Phe Glu Ile Asp

305 310 315 320

Tyr Asn Glu Arg Asn

325

<210> 2

<211> 978

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 2

atggccagta tggataaggt ttttgcaggc tatgctgccc gtcaagcaat cttagaaagt 60

accgaaacta cgaacccgtt tgccaaagga attgcctggg tcgaagggga actcgttcct 120

ttagctgaag cacgcattcc actcctcgat cagggcttca tgcactccga tctgacctac 180

gacgtaccgt ctgtttggga tgggcgattt tttcgtttag atgatcatat tacacgcctg 240

gaagcaagct gcaccaagct gaggctgcgt ctacccttac cacgtgatca agttaaacaa 300

atcctggtgg aaatggtcgc aaaatctggt attcgggatg cactagttga aacgatagtc 360

acccgcggtc ttaaaggggt gcgaggaact tgcccggaat gcatagtgaa caacctgtac 420

atgtttgtgc agccgtacgt gtgggttatg gagccggata tgcagcgcgt aggcggcagc 480

gcagtggtgg ctaggaccgt ccgccgggta ccaccgggcg ctattgatcc gaccgtcaag 540

aatcttcagt ggggtgatct tgttcgtgga atgtttgaag cggctgatcg tggcgcaaca 600

tatcccttcc ttaccgacgg cgatgcgcac ctgactgaag gatcgggttt taatatagta 660

ttagtcaaag atggcgtcct gtatacgcca gatcgcgggg tgctgcaggg agtgactcgc 720

aagtccgtta tcaacgctgc tgaagccttt ggaatagaag tgcgggttga gttcgttcca 780

gttgagctgg cctaccggtg tgacgagatt ttcatgtgca cgacggcggg tggcattatg 840

cctatcacaa cattggacgg tatgcctgta aatggtgggc aaattgggcc tattacgaaa 900

aaaatatggg acggttattg ggcgatgcat tatgacgccg cgtattcgtt cgagatcgac 960

tataatgaga gaaattag 978

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(20)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 3

ctggtattcg ggatgcannn gttgaaacga ta 32

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(20)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 4

gtgactatcg tttcaacnnn tgcatcccga at 32

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(23)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 5

ctattgatcc gaccgtcaag nnncttcagt gg 32

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(18)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 6

atcaccccac tgaagnnnct tgacggtcgg atcaata 37

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(18)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 7

gtcaagaatc ttcagnnngg tgatcttg 28

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(16)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 8

gaacaagatc accnnnctga agattcttga cg 32

Claims (8)

1.一种ω-转氨酶双突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码如权利要求1所述ω-转氨酶双突变体的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种包含权利要求2或3所述基因的表达单元。

5.一种包含权利要求4所述表达单元的重组质粒。

6.一种包含权利要求5所述重组质粒的基因工程菌。

7.如权利要求1所述的ω-转氨酶双突变体在催化(R)-(+)-α-甲基苄胺生成苯乙酮中的应用。

8.如权利要求6所述的基因工程菌在催化(R)-(+)-α-甲基苄胺生成苯乙酮中的应用。

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