CN112481230B

CN112481230B - 一种通过DNA合成改组组合突变获得的ω-转氨酶突变体及应用

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Publication number: CN112481230B
Application number: CN202011415007.1A
Authority: CN
Inventors: 黄�俊; 刘春燕; 梅乐和; 陈海滨; 吕常江; 胡升; 王宏鹏; 赵伟睿; 樊芳芳; 李业; 于林凯; 周一峰
Original assignee: Zhejiang Lover Health Science and Technology Development Co Ltd; Enzymaster Ningbo Bio Engineering Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Lover Health Science and Technology Development Co Ltd; Enzymaster Ningbo Bio Engineering Co Ltd
Priority date: 2020-12-04
Filing date: 2020-12-04
Publication date: 2021-12-07
Anticipated expiration: 2040-12-04
Also published as: CN114181918B; CN114107241A; CN114107241B; CN112481230A; US20220177933A1; CN114181918A

Abstract

本发明公开了一种通过DNA合成改组组合突变获得的ω‑转氨酶突变体，由来自土曲霉(Aspergillus terreus)的野生型ω‑转氨酶进行点突变而得，野生型ω‑转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述ω‑转氨酶突变体的突变位点为以下任意一种：(1)F115L‑H210N‑M150C‑M280C；(2)F115L‑H210N；(3)F115L‑H210N‑E253A‑I295V；(4)I77L‑F115L‑E133A‑H210N‑N245D；(5)I77L‑Q97E‑F115L‑L118T‑E253A‑G292D；(6)I77L‑E133A‑N245D‑G292D；(7)H210N‑N245D‑E253A‑G292D。本发明通过DNA合成改组组合突变方法，将前期所得到的正向突变随机组合，通过实验验证，该方法可有效地提高正突变概率，提高实验效率及可行性，并筛选得到热力学稳定性明显优于野生酶的突变酶。

Description

一种通过DNA合成改组组合突变获得的ω-转氨酶突变体及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种通过DNA合成改组组合突变获得的ω-转氨酶突变体及应用。

背景技术

手性胺是很多重要药物合成的关键中间体或者手性砌块。目前，这些重要的手性胺化合物的生产方式主要为化学合成法，且一般需要昂贵的钌、铑等过渡金属配合物催化剂或高压等极端反应条件，同时存在选择性差、收率低、排放多等先天不足。因此，能否通过不对称生物催化的方法实现手性胺的工业化生产已成为目前研究者普遍关注的焦点。利用酶催化不对称合成手性胺类化合物主要应用两种酶，一种是氨基脱氢酶，一种是ω-转氨酶。利用氨基脱氢酶前提是要有与之相适应的辅酶再生体系。而ω-转氨酶依赖辅酶磷酸吡哆醛(PLP)可逆地催化氨基转移到前手性酮制备手性胺类化合物，因其高立体选择性和温和的反应条件，成为制备光学纯手性胺的重要生物催化剂。

ω-转氨酶催化过程是由两步半转胺反应组成，遵循双底物乒乓机制，如图1所示，在第一个半反应中，氨基供体底物和辅酶形成一个席夫碱(醛亚胺)，醛亚胺经过进一步质子得失以及将氨基转移给辅酶，结果就得到酮酸和酶结合的5’-磷酸吡哆胺(PMP)。在第二个半反应中，氨基由PMP转移到受体上，得到PLP并且产生了手性胺。

来自于土曲霉(Aspergillus terreus)的ω-转氨酶以酮类化合物为原料，通过立体选择性地转氨基作用，可以高效生产手性胺。研究表明，该酶野生型在40℃下的半衰期仅为6.9min，其热稳定性有待进一步提高。如CN105441404A、CN105950581A公开了利用定点突变技术对ω-转氨酶野生型进行改造，获得热稳定性进一步提高的ω-转氨酶突变体，使其更适合工业应用。

目前，酶的定向进化技术是一种不需事先了解酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外改造酶基因，并定向选择或筛选出所需性能更加优良的酶或创造出自然界所没有且优良性质的新酶的方法。近年来，随着定向进化技术的建立与发展，通过它提高酶稳定性的研究越来越多。主要包括非理性设计，理性设计和半理性设计三大块。随着相关研究的深入，利用半理性设计策略对转氨酶进行分子改造的研究备受关注。

本发明申请人一直致力于转氨酶催化合成手性胺方面的工作。通过半理性设计方法对转氨酶进行改造，主要包括添加二硫键(基于结构的半理性设计)，序列一致性(基于序列的半理性设计)以及构建共进化网络来改造转氨酶的热稳定性并获得了一定的提升。但提高转氨酶热稳定性的各种手段均具有各自的优点和缺点，虽然上述实验获得的突变体与野生型ω-转氨酶相比能够提高半失活温度以及延长半衰期，但是若要在实际生产中更好地加以应用，上述突变体的半失活温度和半衰期仍有待进一步提高。

发明内容

本发明基于一种DNA合成改组的方法，通过该方法获得酶活、热稳定性进一步提高的土曲霉属(Aspergillus terreus)ω-转氨酶突变体。

本发明通过固体平板筛选结合96孔板筛选，大大提高了筛选效率和筛选数量。

本发明首先提供了一种通过DNA合成改组组合突变获得的ω-转氨酶突变体，其特征在于，由来自土曲霉(Aspergillus terreus)的野生型ω-转氨酶进行DNA合成改组的方法而得，野生型ω-转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述ω-转氨酶突变体的突变位点为以下任意一种：(1)F115L-H210N-M150C-M280C；(2)F115L-H210N；(3)F115L-H210N-E253A-I295V；(4)I77L-F115L-E133A-H210N-N245D；(5)I77L-Q97E-F115L-L118T-E253A-G292D；(6)I77L-E133A-N245D-G292D；(7)H210N-N245D-E253A-G292D。上述突变体中突变位点为多个位点的突变形式，比如(1)F115L-H210N-M150C-M280C表示第115位的氨基酸由苯丙氨酸突变为亮氨酸、第210位的氨基酸由组氨酸突变为天冬酰胺、第150位的氨基酸由甲硫氨酸突变为半胱氨酸以及第280位的氨基酸由甲硫氨酸突变为半胱氨酸，该突变体的半失活温度为52.2℃，比野生型ω-转氨酶提高了13.7℃，在40℃下的半衰期为172.7min，比野生型ω-转氨酶延长165.8min。野生型ω-转氨酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明又公开了所述的ω-转氨酶突变体在催化(R)-(+)-α-甲基苄胺生成苯乙酮中的应用。

本发明又公开了编码所述ω-转氨酶突变体的基因。优选的，所述的基因，核苷酸序列如SEQ ID No.3～9。突变体F115L-H210N-M150C-M280C的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；突变体F115L-H210N的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；突变体F115L-H210N-E253A-I295V的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；突变体I77L-F115L-E133A-H210N-N245D的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；突变体I77L-Q97E-F115L-L118T-E253A-G292D的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；突变体I77L-E133A-N245D-G292D的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；突变体H210N-N245D-E253A-G292D的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

本发明又公开了所述基因在催化(R)-(+)-α-甲基苄胺生成苯乙酮中的应用。

本发明还公开了包含所述基因的重组表达载体。

本发明还公开了包含所述重组表达质粒的基因工程菌。

本发明还公开了所述基因工程菌在催化(R)-(+)-α-甲基苄胺生成苯乙酮中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)本发明ω-转氨酶突变体由土曲霉(Aspergillus terreus)ω-转氨酶115位的苯丙氨酸、150位的甲硫氨酸、210位的组氨酸和280位的甲硫氨酸分别突变为亮氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和半胱氨酸获得，该ω-转氨酶突变体的半失活温度(T₅₀ ¹⁰)为52.2±0.42℃，比野生型提高了13.7℃，在40℃下的半衰期(t_1/2)为172.7±3.68min，是野生型的25倍，热稳定性显著提高。(2)本发明通过DNA合成改组组合突变方法，将前期所得到的正向突变随机组合，通过实验验证，该方法可有效地提高正突变概率，提高实验效率及可行性，并筛选得到热力学稳定性明显优于野生酶的突变酶。

附图说明

图1为ω-转氨酶依赖辅酶PLP可逆地催化氨基转移到前手性酮制备手性胺类化合物的催化过程示意图。

图2为DNA合成改组组合突变及固体平板筛选流程。

图3突变体的SDS-PAGE电泳分析结果图，其中，各泳道分别为M：protein marker；1：F115L-H210N-E253A-I295V，2：H210N-N245D-E253A-G292D，3：I77L-E133A-N245D-G292D，4：I77L-Q97E-F115L-L118T-E253A-G292D，5：I77L-F115L-E133A-H210N-N245D，6：F115L-H210N；7：F115L-H210N-M150C-M280C。

图4为实施例1中不同突变体酶和野生型酶的半衰期t_1/2结果。

图5为实施例1中不同突变体酶和野生型酶的半失活温度T₅₀ ¹⁰结果。

图6为实施例1中差示荧光扫描法测定转氨酶及其突变酶的热解折叠结果T_m。

具体实施方式

实施例1

1、实验材料

(1)LB培养基：10g/L胰蛋白胨(购于Oxoid)，5g/L酵母粉(购于Oxoid)，10g/L氯化钠(购于生工生物工程有限公司(上海))，pH 7.0。LB固体培养基：LB液体培养基加入2％(质量比)琼脂粉。

氯化钠、甘油、氯化钙、咪唑、冰醋酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、5-磷酸吡哆醛、考马斯亮蓝蛋白质浓度测定试剂盒、Ni-NTA层析介质、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、硫酸卡那霉素、辣根过氧化物酶、氨苄青霉素、DNA和蛋白质Marker购于生工生物工程有限公司(上海)。本发明中经密码子优化的ω-转氨酶基因(ω-TA基因)委托通用生物系统(安徽)有限公司进行全基因合成，基因合成服务中使用pET-21a质粒作为克隆载体。

(2)二甲基亚砜(DMSO)、丙酮酸、(R)-(+)-α-甲基苄胺、3，3二氨基联苯胺四盐酸盐水合物(DAB)购自阿拉丁生化科技股份有限公司，PrimeSTAR Max DNA聚合酶购自TaKaRa公司；核算转移膜(印记膜)购于GE Healthcare公司，Dpn I购自Thermo Scientific公司。

(3)缓冲液配方：

20mmol/L洗脱缓冲液：50mmol/L磷酸二氢钠，300mmol/L氯化钠，20mmol/L咪唑，pH8.0；50mmol/L洗脱缓冲液：50mmol/L磷酸二氢钠，300mmol/L氯化钠，50mmol/L咪唑，pH8.0；100mmol/L洗脱缓冲液：50mmol/L磷酸二氢钠，300mmol/L氯化钠，100mmol/L咪唑，pH8.0；250mmol/L洗脱缓冲液：50mmol/L磷酸二氢钠，300mmol/L氯化钠，250mmol/L咪唑，pH8.0。

凝胶染色液：甲醇45.4mL，冰醋酸9.2mL，0.05g考马斯亮蓝R250，溶解于100mL去离子水；凝胶脱色液：甲醇5mL，冰醋酸7.5mL，溶解于100mL去离子水；电泳缓冲液：3.03gTris，14.4g甘氨酸，1g SDS，用去离子水定容至1L，0.22μm的滤纸抽滤后4℃冷藏。

2、组合突变

采用组合突变的方法，将前期筛选到的正向突变通过DNA合成改组被随机组合，以进一步提高转氨酶的热稳定性。用于创建组合基因库的寡核苷酸引物是基于Ness等所描述的方法，并通过利用简并密码子，以允许任何所需突变。其中，简并碱基S表示G/C，N表示A/T/C/G，R表示A/G，M表示A/C，K表示G/T，Y表示C/T。

表1组合突变引物及其序列

引物名称	序列5’-3’
		F1	ATGGCCAGTATGGATAAGGTTTTTGCAGGCTATGCTGCCCGTCAAGCAATC
F2	CCCGTTTGCCAAAGGAATTGCCTGGGTCGAAGGGGAACTCGTTCCTTTAGCTGAAGCACG
		F3	GCTTCATGCACTCCGATCTGACCTACGACGTACCGTCTGTTTGGGATGGGCGATTTTTTC
F4	TGGAAGCAAGCTGCACCAAGCTGAGGCTGCGTCTACCCTTACCACGTGAT<u>SAA</u>GTTAAAC
		F5	AATCTGGTATTCGGGATGCA<u>TTN</u>GTTGAA<u>TTG</u>ATAGTCACCCGCGGTCTTAAAGGGGTGC
F5-a	AATCTGGTATTCGGGATGCA<u>TTN</u>GTTGAA<u>ACG</u>ATAGTCACCCGCGGTCTTAAAGGGGTGC
		F6	TAGTGAACAACCTGTACATGTTTGTGCAGCCGTACGTGTGGGTT<u>ATG</u>GAGCCGGATATGC
F6-a	TAGTGAACAACCTGTACATGTTTGTGCAGCCGTACGTGTGGGTT<u>TGC</u>GAGCCGGATATGC
		F7	TGGTGGCTAGGACCGTCCGCCGGGTACCACCGGGCGCTATTGATCCGACCGTCAAGAATC
F8	TGTTCGTGGAATGTTTGAAGCGGCTGATCGTGGCGCAACATATCCCTTCCTTACCGACGG
		F9	GATCGGGTTTTAATATAGTATTAGTCAAAGATGGCGTCCTGTATACGCCAGATCGCGGGG
F10	AGTCCGTTATC<u>RAC</u>GCTGCTGAAGCCTTTGGAATA<u>GMA</u>GTGCGGGTTGAGTTCGTTCCAG
		F11	TGACGAGATTTTCATGTGCACGACGGCGGGTGGCATT<u>ATG</u>CCTATCACAACATTGGACGG
F11-a	TGACGAGATTTTCATGTGCACGACGGCGGGTGGCATT<u>TGC</u>CCTATCACAACATTGGACGG
		F12	AARTTGGGCCTATTACGAAAAAAATATGGGACGGTTATTGGGCGATGCATTATGACGCCG
R1	CAATTCCTTTGGCAAACGGGTTCGTAGTTTCGGTACTTTCTAAGATTGCTTGACGGGCAG
		R2	CAGATCGGAGTGCATGAAGCCCTGATCGAGGAGTGGAATGCGTGCTTCAGCTAAAGGAAC
R3	GTGCAGCTTGCTTCCAGGCGTGT<u>AAK</u>ATGATCATCTAAACGAAAAAATCGCCCATCCCAA
		R4	CATCCCGAATACCAGATTTTGCGACCATTTCCACCAGGATTTGTTTAAC<u>TTS</u>ATCACGTG
R5	CATGTACAGGTTGTTCACTATATC<u>TKC</u>CGGACGAGTTCCTCGCACCCCTTTAAGACCGCG
		R6	GCGGACGGTCCTAGCCACCACTGCGCTGCCGCCTACGCGCTGCATATCCGGCTC<u>CAT</u>AAC
R6-a	GCGGACGGTCCTAGCCACCACTGCGCTGCCGCCTACGCGCTGCATATCCGGCTC<u>GCA</u>AAC
		R7	CTTCAAACATTCCACGAACAAGATCACCCCACTGAAGATTCTTGACGGTCGGATCAATAG
R8	TACTATATTAAAACCCGATCCTTCAGTCAG<u>GTK</u>CGCATCGCCGTCGGTAAGGAAGGGATA
		R9	GCAGCGTYGATAACGGACTTGCGAGTCACTCCCTGCAGCACCCCGCGATCTGGCGTATAC
R10	GCACATGAAAATCTCGTCACACCGGTAGGCCAGCTCAACTGGAACGAACTCAACCCGCAC
		R11	TTTCGTAATAGGCCC<u>AAY</u>TTGCCC<u>AYC</u>ATTTACAGGCATACCGTCCAATGTTGTGATAGG
R12	CTAATTTCTCTCATTATAGTCGATCTCGAACGAATACGCGGCGTCATAATG
		ATA-F	GGCTAGCATGACTGGTGGACATGCACCACCACCACCACCACATGGCCAGTATGGATAAGGTTTTTG
ATA-R	GAGTGCGGCCGCAAGCTTGTCTAATTTCTCTCATTATAGTCGATCTCGAAC
		PET-21a-F	ACAAGCTTGCGGCCGCAC
PET-21a-R	GTCCACCAGTCATGCTAGCCATATG

备注：下划线表示突变位点，引物名称中带有F的表示上游引物，带有R的表示下游引物。

突变文库及完整的目的基因片段如图2通过三步独立的PCR(两步组装PCR和一步放大PCR)完成，然后将PCR产物与pET-21a载体通过引物无缝克隆连接并转入大肠杆菌BL21(DE3)(含pRSF-DAAO质粒)感受态中。

(1)第一步PCR使用表1中的引物(F1-R12)，每一组PCR使用四个相邻的寡核苷酸引物(两个正向和两个相反)，PCR扩增体系：25μL PrimeSTAR Max Premix 2×；0.4μL内引物(10μM)，2μL外引物(10μM)，高温灭菌的超纯水补至总体积50μL。PCR扩增条件：98℃变性20s，55℃退火15s，72℃延伸30s，30个循环。取5μL PCR产物与loading buffer混匀后1％琼脂糖凝胶电泳分析检验后，将获得的11组不同的PCR产物分别取5μL混合并通过PCR产物纯化试剂盒进行纯化。

(2)第一步每一相邻两组PCR产物均有60bp左右重叠，第二部PCR则是将混合的各个片段进行组装成完整的目的基因。其50μL PCR扩增体系包含10μL纯化的PCR产物混合物，25μL PrimeSTAR Max Premix 2×和15μL高温灭菌的超纯水。PCR扩增条件：94℃变性30s，68℃延伸120s，20个循环。PCR产物经纯化试剂盒纯化。

(3)在经过第二部组装后，通过在线设计引物使其与目的基因和载体均有15～20bp左右重叠，并进一步设计引物在其蛋白质N端添加组氨酸标签。根据引物ATA-F，ATA-R进行第三步PCR，增加经过重新组装后的完整基因的数量。PCR扩增体系：25μL PrimeSTARMax Premix2×；2μL上游引物(10μM)，2μL下游引物(10μM)，1μL PCR产物模板(100ng/μL)，高温灭菌的超纯水补至总体积50μL。PCR扩增条件：98℃变性1min；98℃变性20s，55℃退火15s，72℃延伸2min，共循环30次；72℃延伸7min。PCR产物经过电泳检测正确。

(4)pET-21a载体PCR：利用引物PET-21a-F，PET-21a-R进行载体PCR，使载体线性化并与目的基因存在15～20bp的同源臂。PCR扩增体系：25μL PrimeSTAR Max Premix 2×；2μL上游引物(10μM)，2μL下游引物(10μM)，1μL质粒模板(10ng/μL)，高温灭菌的超纯水补至总体积50μL。PCR扩增条件：98℃变性1min；98℃变性20s，55℃退火15s，72℃延伸2min，共循环30次；72℃延伸7min。PCR产物经过电泳检测正确并通过胶回收试剂盒回收。所得胶回收产物采用Dpn I识别甲基化修饰的母本模板并将其降解。消化反应：PCR产物17μL，Buffer 2μL，Dpn I 1μL，37℃消化2h。

(5)同源重组：将目的基因与线性化载体连接。克隆载体使用量＝[0.02×克隆载体碱基对数]ng(0.03pm)，插入片段使用量＝[0.04×克隆载体碱基对数]ng(0.03pm)。于冰上配制10μL重组反应体系：pET-21a线性化载体2μL(100ng/μL)，目的基因片段2μL(40ng/μL)，5μL ClonExpress Mix 2×，1μL ddH₂O。重组条件：50℃连接30min，降至4度或立即置于冰上冷却。

将连接产物采用热击法转入E.coli BL 21感受态细胞(含pRSF-DAAO质粒)中。

3、含单质粒pRSF-DAAO大肠杆菌BL21(DE3)感受态的制备

(1)挑取新鲜的大肠杆菌单菌落于5mL LB液体培养基中，37℃下160r/min过夜培养至OD₆₀₀为0.6-0.8左右。

(2)将2mL上述培养液按1％(v/v)的比例接入200mLLB液体培养基中，37℃、180r/min培养2h至OD600约为0.4左右。

(3)培养液冰水浴放置半小时，于4℃，4500r/min，离心10min收集菌体。

(4)用10mL预冷的10mM CaCl₂重悬菌体细胞，置于冰水浴15min，于4℃，4500r/min，离心10min，收集菌体。

(5)重复步骤(4)。

(6)往菌体中加入6mL预冷的10mM CaCl₂溶液(含15％甘油)。重悬菌体细胞，冰上放置3～5min，分装于无菌EP管中，保存于-80℃冰箱。

4、突变文库的建立

取出-80℃保藏的E.coli BL 21感受态细胞(含pRSF-DAAO质粒)，冰上解冻后加入同源重组连接产物溶液(5～10μL)，轻轻摇匀后置于冰上30min。42℃水浴中热击90s后，迅速置于冰上充分冷却3min。向管中加入0.8mLLB液体培养基，37℃培养1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达双质粒编码的卡那霉素抗性和氨苄青霉素抗性基因。取100μL菌液均匀涂布于覆盖Hybond-N印记膜的LB平板上(含有50μg/mL的卡那霉素和100μg/mL的氨苄青霉素)，正面向上放置0.5h，待菌液完全被培养基吸收后倒置平板，37℃培养16h。将膜印记于母板置于37℃继续生长12h后置于4度冰箱保存。然后将膜转移至含有0.2mm异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，50μg/mL的卡那霉素和100μg/mL的氨苄青霉素的LB平板上，置于25℃培养箱培养20h后将膜置于-80℃冰箱保存。

从上述平板上随机挑取单菌落接种至5mL含50μg/mL卡那霉素和100μg/mL的氨苄青霉素的LB培养基中，37℃、200r/min条件下培养3～4h。取1-2ul菌液稀释为100倍体积，沸水浴10-15mins进行菌液PCR验证双质粒的存在。以pET21a-ATA(Colony-F/R)和pRSF-DAAO(DAA0-F/R)质粒为模板设计引物菌落PCR体系如下：25μL PrimeSTAR Max Premix 2×；1μL上游引物(10μM)，1μL下游引物(10μM)，2μL模板，高温灭菌的超纯水补至总体积50μL。用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

5、突变文库的初筛与复筛

将含有马萝卜过氧化物酶(0.1mg/mL)、丙酮酸(0.2mg/mL)和50mM PBS(pH 8.0)的预筛选溶液预先浸泡在滤纸上。NC膜铺在滤纸上，室温下放置1h。将膜用液氮冻化，然后转移到预浸泡过的滤纸中，其中含有比色测定溶液：1x 3，3′-二氨基联苯胺片(麦克林)，10mM底物，辣根过氧化物酶(0.1mg/mL)，50mM PBS(pH 8.0)。将膜放在室温下，随着时间的推移，可以观察到颜色的变化。

用无菌牙签挑取出现颜色变化对应母板单菌落逐个接种于每孔含有1mL LB培养液(含卡那霉素50mg/mL和100mg/mL)96深孔板中，37℃，200r/min培养8h至指数生长后期。母板每孔移取200μL菌液于种子板相应孔，各孔加入100μL甘油(50％)，混匀后菌种保存-80℃医用冰箱。母板中剩余的菌液每孔补充200μL LB培养液(含2.5mMIPTG)，25℃，150r/min诱导20h，诱导结束后母板于4500r/min，离心10min，收集菌体。菌体用PBS(pH8.0)缓冲液清洗两遍，相同条件下离心，弃尽上清。将母板于超低温冰箱冷冻过夜后，取出母板室温解冻30min后，超低温冷冻20min，反复冻融三次。母板各孔中加入250μL溶菌酶(5mg/mL)重悬菌体，母板置于37℃，200r/min恒温孵育30min以充分裂解细胞释放胞内酶，然后离心10min(4500r/min)分离粗酶液和菌体。

每孔取80μL母板中的上清液(粗酶液)到96微量孔板的相应孔中，96微量孔板膜封后放入PCR仪中50℃恒温处理10min后，冰浴放置10min，粗酶液各20μL与180μL底物溶液混合，酶标仪检测粗酶液热处理前后催化转氨反应的酶活，定义相应酶未做热处理时候的酶活为100％。计算粗酶液热处理后的残余酶活百分比，选择残余酶活百分比高于野生型的突变子。最后选择残余酶活百分比位于TOP10的正向突变子，活化后送安徽通用生物公司测序分析。

6、突变体的表达与纯化

通过平板筛选了大约3000个菌落之后获得了一些残余活力较高的正向突变，将E.coli BL 21感受态细胞与测序正确的转氨酶突变体质粒置于冰水浴5min，取10μL质粒加到感受态细胞，轻轻混匀，冰上放置30min，42℃水浴锅热击90s，迅速放回冰浴中3min，加入600μL LB培养基，于37℃、180r/min复苏50min。150μL培养液均匀涂布于LB固体平板(含卡那霉素50μg/mL和氨苄青霉素100μg/mL)，37℃培养箱培养30min，再倒置平板过夜培养。

挑取单菌落接种至加有5mLLB液体培养基的试管中，37℃、200r/min条件下培养过夜。将培养好的菌液以1％比例(体积比)的接种量接种至含50μg/mL卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素的200mL LB培养基中，37℃、180r/min培养至OD₆₀₀值为0.4～0.6时，加入适量体积的IPTG(终浓度为1mmol/L)，然后在16～30℃、150～200r/min条件下诱导培养18h后，收集菌体。

将收集的菌体用磷酸盐缓冲液洗涤两次，悬浮于50mL破胞缓冲液(50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，20mM咪唑，pH 8.0)中。冰浴条件下对菌体细胞进行均质机破碎细胞。破胞液于12000r/min、4℃条件下离心处理30min，收集上清液，即得到含有的ω-转氨酶粗酶液。

采用Ni-NTA亲和层析对所得的粗酶液进行分离纯化。经上样、清洗和洗脱，收集洗脱液，透析除去小分子即得到纯酶。适当稀释后，以考马斯亮蓝法测定纯酶的浓度。具体纯化步骤：

(1)平衡Ni-NTA亲和层析柱：20％乙醇，去离子水和20mM咪唑缓冲液各3柱体积；

(2)上样：注射器吸取粗酶液经0.45μm滤膜过滤，带有6个组氨酸标签的重组蛋白与填料特异性结合；

(3)清洗：50mM咪唑缓冲液2-3柱体积，Bradford溶液检测是否除尽杂蛋白；

(4)洗脱：100mM洗脱缓冲液5mL，250mM洗脱缓冲液5mL；

(5)保存柱子：20mM咪唑缓冲液，去离子水和20％乙醇各3柱体积，最后保存于20％乙醇中。

7、转氨酶突变体的SDS-PAGE分析

采用改良型Bradford蛋白浓度测定试剂盒建立蛋白含量标准曲线，测定纯酶的浓度，蛋白标准曲线的制备步骤参照说明书进行。采用SDS-PAGE方法(12％分离胶和5％浓缩胶)鉴定纯化后蛋白的分子量和纯度。

样品处理：粗酶液40μL与5×蛋白加样缓冲液10μL混匀，沸水浴10min。

上样：蛋白Marker 5μL，样品10μL。

电泳条件：电压170V，电泳约45min，待溴酚蓝指示剂移至距凝胶下端边缘约1cm处停止电泳。

染色：染色液没过凝胶，微波炉加热1min，于摇床染色25min。

脱色：回收染色液，换上脱色液，每小时换一次脱色液，至蛋白条带清晰。

转氨酶突变体L118T的SDS-PAGE分析如图3，蛋白分子量接近于野生型酶理论分子量36.1kDa。

8、突变酶的浓缩

转氨酶的分子量大约是36.1kDa，一般截留分子量为目的蛋白分子量的1/5～1/3之间，选择截留分子量为10kDa的浓缩管。

浓缩管的预处理：依次用20％乙醇、去离子水和PBS缓冲液(pH 8.0)，于4℃，4000r/min，离心10min。

酶的浓缩：往浓缩管加入5mL待浓缩的酶，于4℃，4000r/min，离心15-20min至酶液体积约1mL。然后加入多倍体积的PBS缓冲液(pH 8.0)，于4℃，4000r/min，离心20min，重复两次。取出内管浓缩的酶液，低温保存。

浓缩管的后处理：依次用PBS缓冲液、去离子水和20％乙醇，在4℃，4000r/min，离心10min，最后往内管中加20％乙醇没过膜上端，保存于4℃冰箱。

9、突变酶活力的测定

以(R)-(+)-α-甲基苄胺和丙酮酸为底物，底物溶液用磷酸盐缓冲液(50mM，pH8.0)配制，200μL的反应体系中包括180μL底物溶(0.25％DMSO，2.5mM(R)-(+)-α-甲基苄胺，2.5mM丙酮酸，0.1mM PLP)，20μL纯酶液(约0.3mg/mL)。利用酶标仪检测波长245nm处OD值随时间的变化曲线。酶活计算方法如下公式1：

其中，ΔOD₂₄₅：在245nm处每分钟吸光度的变化；V：酶反应体系总体积(200μL)；d：光径(0.6cm)；ε：为苯乙酮的摩尔吸光系数(12000L/(mol·cm))；V_E：反应体系中酶的体积(20μL)；[E]：酶的浓度(mg/mL)。结果如表2所示。

表2野生型和突变体的动力学参数

10、突变酶热稳定性参数的测定

分别将纯化后的野生酶和突变酶在25-55℃水浴中孵育10min，随后迅速放置在冰上冷却10min。底物溶液用磷酸盐缓冲液(50mmol/L，pH 8.0)配制，200μL的反应体系中包括180μL的底物溶液(0.25％DMSO、2.5mmol/L(R)-(+)-α-甲基苄胺((R)-α-MBA)、2.5mmol/L丙酮酸以及0.1mmol/L PLP)，20μL纯酶液(约0.3mg/mL)，采用MD190酶标仪检测波长在245nm处相应的酶活力(Purmonen M，Valjakka J，Takkinen K，et al.Molecular dynamicsstudies on the thermostability of family 11xylanases[J].Protein EngineeringDesign and Se1ection，2007，20(11)：551-559.)。

以温度为横坐标，以热处理后与处理前酶活力的比值为纵坐标作图，采用Origin8.0软件进行Boltzmann S型函数拟合，计算半失活温度(T₅₀ ¹⁰)。

将野生酶和突变酶在40℃下分别孵育2-50min，孵育结束后迅速放置在冰上冷却10min，采用上述方法测定酶活力。以时间为横坐标，以热处理后与处理前的比活力的比值为纵坐标作图，通过Origin 8.0软件拟合非线性方程y＝exp(-k_d·t)，一阶速率常数(k_d)经非线性回归确定，并计算酶活力降低为50％时所对应的半衰期(t_1/2)。

实验结果如表3和图4、图5所示。

11、突变酶热力学稳定性表征

差示扫描荧光测定法(DSF)是一种快速、低成本的研究蛋白质稳定性及蛋白质与小分子作用的方法。适当稀释待分析纯酶(浓缩除咪唑)(0.1mg/mL)与荧光染料SYPROOrange dye 2×，50mM PBS缓冲液(pH 8.0)和150mM NaCl混合，总体积50μL，以酶缓冲液为阴性对照，每个样品平行测定三组。装有待分析样品的PCR管放入实时荧光定量PCR仪中进行程序升温，温度上升速率为0.7℃/30s。实时荧光定量PCR仪记录酶样品在25℃升至70℃条件下的荧光强度变化。其中激发波长为490nm，发射波长为605nm。以荧光强度对温度作图，曲线呈S型，其中曲线的拐点即为蛋白质的热解折叠温度(T_m)。

酶的热动力学分析采用二态平衡模型，T_m值根据Boltzmann公式2计算获得：

其中，y代表不同温度下的荧光强度，UF是酶天然折叠状态的荧光强度，NF为解折叠状态下最大荧光强度，x指温度，dx是荧光强度与温度关系曲线的斜率。使用软件Origin8.0进行拟合，求得T_m。

表3野生型和突变体的稳定性参数

名称	T<sub>50</sub><sup>15</sup>(℃)	t<sub>1/2</sub>(min)	T<sub>m</sub>
				WT-ATA	38.50±0.5	6.90±0.6	41.4±0.2
F115L-H210N-M150C-M280C	52.20±0.42	172.7±3.68	55.3±0.29
				F115L-H210N	49.78±0.5	101.2±0.13	54.3±0.25
F115L-H210N-E253A-I295V	47.86±0.28	65.54±1	50.0±0.34
				177L-F115L-E133A-H210N-N245D	47.65±0.22	60.8±0.7	53.8±0.28
177L-Q97E-F115L-L118T-E253A-G292D	45.62±0.44	41.68±0.9	49.9±0.13
				177L-E133A-N245D-G292D	44.81±0.45	37.4±2.4	48.7±0.34
H210N-N245D-E253A-G292D	41.8±0.53	12.55±0.48	44.3±0.33

实验结果如表3，图6所示。

序列表

<110> 浙江科技学院

宁波酶赛生物工程有限公司

<120> 一种通过DNA合成改组组合突变获得的ω-转氨酶突变体及应用

<160> 41

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 325

<212> PRT

<213> 土曲霉(Aspergillus terreus)

<400> 1

Met Ala Ser Met Asp Lys Val Phe Ala Gly Tyr Ala Ala Arg Gln Ala

1 5 10 15

Ile Leu Glu Ser Thr Glu Thr Thr Asn Pro Phe Ala Lys Gly Ile Ala

20 25 30

Trp Val Glu Gly Glu Leu Val Pro Leu Ala Glu Ala Arg Ile Pro Leu

35 40 45

Leu Asp Gln Gly Phe Met His Ser Asp Leu Thr Tyr Asp Val Pro Ser

50 55 60

Val Trp Asp Gly Arg Phe Phe Arg Leu Asp Asp His Ile Thr Arg Leu

65 70 75 80

Glu Ala Ser Cys Thr Lys Leu Arg Leu Arg Leu Pro Leu Pro Arg Asp

85 90 95

Gln Val Lys Gln Ile Leu Val Glu Met Val Ala Lys Ser Gly Ile Arg

100 105 110

Asp Ala Phe Val Glu Leu Ile Val Thr Arg Gly Leu Lys Gly Val Arg

115 120 125

Gly Thr Arg Pro Glu Asp Ile Val Asn Asn Leu Tyr Met Phe Val Gln

130 135 140

Pro Tyr Val Trp Val Met Glu Pro Asp Met Gln Arg Val Gly Gly Ser

145 150 155 160

Ala Val Val Ala Arg Thr Val Arg Arg Val Pro Pro Gly Ala Ile Asp

165 170 175

Pro Thr Val Lys Asn Leu Gln Trp Gly Asp Leu Val Arg Gly Met Phe

180 185 190

Glu Ala Ala Asp Arg Gly Ala Thr Tyr Pro Phe Leu Thr Asp Gly Asp

195 200 205

Ala His Leu Thr Glu Gly Ser Gly Phe Asn Ile Val Leu Val Lys Asp

210 215 220

Gly Val Leu Tyr Thr Pro Asp Arg Gly Val Leu Gln Gly Val Thr Arg

225 230 235 240

Lys Ser Val Ile Asn Ala Ala Glu Ala Phe Gly Ile Glu Val Arg Val

245 250 255

Glu Phe Val Pro Val Glu Leu Ala Tyr Arg Cys Asp Glu Ile Phe Met

260 265 270

Cys Thr Thr Ala Gly Gly Ile Met Pro Ile Thr Thr Leu Asp Gly Met

275 280 285

Pro Val Asn Gly Gly Gln Ile Gly Pro Ile Thr Lys Lys Ile Trp Asp

290 295 300

Gly Tyr Trp Ala Met His Tyr Asp Ala Ala Tyr Ser Phe Glu Ile Asp

305 310 315 320

Tyr Asn Glu Arg Asn

325

<210> 2

<211> 978

<212> DNA

<213> 土曲霉(Aspergillus terreus)

<400> 2

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<210> 3

<211> 978

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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<212> DNA

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<210> 7

<211> 978

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

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<210> 8

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<212> DNA

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ttagtcaaag atggcgtcct gtatacgcca gatcgcgggg tgctgcaggg agtgactcgc 720

aagtccgtta tcgacgctgc tgaagccttt ggaatagaag tgcgggttga gttcgttcca 780

gttgagctgg cctaccggtg tgacgagatt ttcatgtgca cgacggcggg tggcattatg 840

cctatcacaa cattggacgg tatgcctgta aatgatgggc aaattgggcc tattacgaaa 900

aaaatatggg acggttattg ggcgatgcat tatgacgccg cgtattcgtt cgagatcgac 960

tataatgaga gaaattag 978

<210> 10

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atggccagta tggataaggt ttttgcaggc tatgctgccc gtcaagcaat c 51

<210> 11

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cccgtttgcc aaaggaattg cctgggtcga aggggaactc gttcctttag ctgaagcacg 60

<210> 12

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcttcatgca ctccgatctg acctacgacg taccgtctgt ttgggatggg cgattttttc 60

<210> 13

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> variation

<222> (51)..(51)

<223> s stands for g/c.

<400> 13

tggaagcaag ctgcaccaag ctgaggctgc gtctaccctt accacgtgat saagttaaac 60

<210> 14

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> variation

<222> (23)..(23)

<223> n stands for a/t/c/g.

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(23)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 14

aatctggtat tcgggatgca ttngttgaat tgatagtcac ccgcggtctt aaaggggtgc 60

<210> 15

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> variation

<222> (23)..(23)

<223> n stands for a/t/c/g.

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(23)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 15

aatctggtat tcgggatgca ttngttgaaa cgatagtcac ccgcggtctt aaaggggtgc 60

<210> 16

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tagtgaacaa cctgtacatg tttgtgcagc cgtacgtgtg ggttatggag ccggatatgc 60

<210> 17

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tagtgaacaa cctgtacatg tttgtgcagc cgtacgtgtg ggtttgcgag ccggatatgc 60

<210> 18

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tggtggctag gaccgtccgc cgggtaccac cgggcgctat tgatccgacc gtcaagaatc 60

<210> 19

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tgttcgtgga atgtttgaag cggctgatcg tggcgcaaca tatcccttcc ttaccgacgg 60

<210> 20

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gatcgggttt taatatagta ttagtcaaag atggcgtcct gtatacgcca gatcgcgggg 60

<210> 21

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> variation

<222> (12)..(12)

<223> r stands for a/g.

<220>

<221> variation

<222> (37)..(37)

<223> m stands for a/c.

<400> 21

agtccgttat cracgctgct gaagcctttg gaatagmagt gcgggttgag ttcgttccag 60

<210> 22

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tgacgagatt ttcatgtgca cgacggcggg tggcattatg cctatcacaa cattggacgg 60

<210> 23

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tgacgagatt ttcatgtgca cgacggcggg tggcatttgc cctatcacaa cattggacgg 60

<210> 24

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> variation

<222> (3)..(3)

<223> r stands for a/g.

<400> 24

aarttgggcc tattacgaaa aaaatatggg acggttattg ggcgatgcat tatgacgccg 60

<210> 25

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

caattccttt ggcaaacggg ttcgtagttt cggtactttc taagattgct tgacgggcag 60

<210> 26

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

cagatcggag tgcatgaagc cctgatcgag gagtggaatg cgtgcttcag ctaaaggaac 60

<210> 27

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> variation

<222> (26)..(26)

<223> k stands for g/t.

<400> 27

gtgcagcttg cttccaggcg tgtaakatga tcatctaaac gaaaaaatcg cccatcccaa 60

<210> 28

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> variation

<222> (52)..(52)

<223> s stands for g/c.

<400> 28

catcccgaat accagatttt gcgaccattt ccaccaggat ttgtttaact tsatcacgtg 60

<210> 29

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> variation

<222> (26)..(26)

<223> k stands for g/t.

<400> 29

catgtacagg ttgttcacta tatctkccgg acgagttcct cgcacccctt taagaccgcg 60

<210> 30

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gcggacggtc ctagccacca ctgcgctgcc gcctacgcgc tgcatatccg gctccataac 60

<210> 31

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

gcggacggtc ctagccacca ctgcgctgcc gcctacgcgc tgcatatccg gctcgcaaac 60

<210> 32

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

cttcaaacat tccacgaaca agatcacccc actgaagatt cttgacggtc ggatcaatag 60

<210> 33

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> variation

<222> (33)..(33)

<223> k stands for g/t.

<400> 33

tactatatta aaacccgatc cttcagtcag gtkcgcatcg ccgtcggtaa ggaagggata 60

<210> 34

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> variation

<222> (8)..(8)

<223> y stands for c/t.

<400> 34

gcagcgtyga taacggactt gcgagtcact ccctgcagca ccccgcgatc tggcgtatac 60

<210> 35

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

gcacatgaaa atctcgtcac accggtaggc cagctcaact ggaacgaact caacccgcac 60

<210> 36

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> variation

<222> (18)..(18)

<223> y stands for c/t.

<220>

<221> variation

<222> (26)..(26)

<223> y stands for c/t.

<400> 36

tttcgtaata ggcccaaytt gcccaycatt tacaggcata ccgtccaatg ttgtgatagg 60

<210> 37

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

ctaatttctc tcattatagt cgatctcgaa cgaatacgcg gcgtcataat g 51

<210> 38

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

ggctagcatg actggtggac atgcaccacc accaccacca catggccagt atggataagg 60

tttttg 66

<210> 39

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

gagtgcggcc gcaagcttgt ctaatttctc tcattatagt cgatctcgaa c 51

<210> 40

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

acaagcttgc ggccgcac 18

<210> 41

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

gtccaccagt catgctagcc atatg 25

Claims

1.一种通过DNA合成改组组合突变获得的ω-转氨酶突变体，其特征在于，由来自土曲霉（Aspergillus terreus）的野生型ω-转氨酶进行点突变而得，野生型ω-转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述ω-转氨酶突变体的突变位点为：

（1）F115L-H210N-M150C-M280C。

2.如权利要求1所述的ω-转氨酶突变体在催化(R)-(+)-α-甲基苄胺生成苯乙酮中的应用。

3.编码如权利要求1所述ω-转氨酶突变体的基因。

4.如权利要求3所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No.3。

5.如权利要求3所述基因在催化(R)-(+)-α-甲基苄胺生成苯乙酮中的应用。

6.包含如权利要求3所述基因的重组表达载体。

7.包含如权利要求6所述重组表达载体的基因工程菌。

8.如权利要求7所述基因工程菌在催化(R)-(+)-α-甲基苄胺生成苯乙酮中的应用。