CN109486778B - 一种基于共进化网络的ω-转氨酶突变体以及制备方法和应用 - Google Patents
一种基于共进化网络的ω-转氨酶突变体以及制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109486778B CN109486778B CN201811230792.6A CN201811230792A CN109486778B CN 109486778 B CN109486778 B CN 109486778B CN 201811230792 A CN201811230792 A CN 201811230792A CN 109486778 B CN109486778 B CN 109486778B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- transaminase
- omega
- val
- gly
- ala
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
- C12N15/1031—Mutagenizing nucleic acids mutagenesis by gene assembly, e.g. assembly by oligonucleotide extension PCR
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y206/00—Transferases transferring nitrogenous groups (2.6)
- C12Y206/01—Transaminases (2.6.1)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于共进化网络的ω‑转氨酶突变体以及制备方法和应用。该ω‑转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。本发明获得的ω‑转氨酶突变体的半失活温度为42.2℃和43.8℃，比野生型酶提高3.7℃和5.3℃，在40℃下的半衰期为20.6min和26.0min，比野生型酶延长13.7min和19.1min。本发明利用蛋白质共进化网络指导ω‑转氨酶的研究，将生物信息学与计算机软件相结合，预测影响ω‑转氨酶结构和功能作用的重要位点，构建突变文库，以获得酶活及热稳定进一步改善的突变体，有效增加突变成功率，提高筛选工作量，提高实验效率。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种基于共进化网络的ω-转氨酶突变体以及制备方法和应用。
背景技术
转氨酶是5’-磷酸吡哆醛(pyridoxal-5'-phosphate,PLP)依赖性酶，广泛存在自然界中，能催化氨基由氨基供体向氨基受体的转移反应，在细胞的氮代谢过程中发挥着重要作用。转氨酶作为生物催化剂可用于催化制备手性胺类化合物，作为合成治疗糖尿病药物、心血管药物、神经类药物、抗高血压药物和抗感染药物的重要中间体。
根据PFAM数据库中的多序列比对，转氨酶可以被分为5类：天冬氨酸转氨酶、芳香族转氨酶、ω-转氨酶、支链转氨酶和D-转氨酶。由于ω-转氨酶(ω-transaminase，简称ω-AT)的底物结合口袋大于天冬氨酸转氨酶、芳香族转氨酶，并可以催化一些特定的底物，因此具有更好的工业应用价值。另外转氨酶还具有较高区域选择性和立体选择性等优点。转氨酶既可以通过动力学拆分消旋胺，也能通过酮的不对称合成生成手性胺，比传统化学催化方法更具有吸引力和竞争力。
来自土曲霉(Aspergillus terreus)的ω-AT能催化(R)-(+)-α-甲基苄胺与酮酸反应生成苯乙酮，手性选择性为(R)型。ω-转氨酶的催化过程如下所示：
目前，关于分子改造ω-转氨酶提高其热稳定性的研究已有报道。例如：
授权公告号为CN105441404B的发明专利文献公开了ω-转氨酶突变体及其编码基因和制备方法，该发明利用温度因子结合能量优化策略对野生型ω-转氨酶进行突变位点预测，进而进行定点突变，筛选得到的突变体的半失活温度高达40.9℃，比野生型酶提高2.9℃。
申请公布号为CN105950581A的发明专利申请文献公开了一种引入二硫键的ω-转氨酶突变体及其应用，该发明根据ω-转氨酶的三维结构模型，分析蛋白质结构中B-factor数据，结合键长、键角、能量等生物信息学特征，使用生物信息学计算软件Disulfide byDesign对该酶进行引入二硫键的理性设计，选出二硫键潜在的引入位点；然后结合相应位点B-factor值，选择该蛋白的不稳定区域引入二硫键，设计定点突变引物，以ω-转氨酶基因为模板，进行定点突变，PCR扩增、纯化后，筛选得到含有一个半胱氨酸的突变体，再以该突变体为模板，进行定点突变得到同时含有两个半胱氨酸的突变体，转化至宿主细胞，获得定点突变文库；最后从所述定点突变文库中筛选效果较好的ω-转氨酶突变体。该方法ω-转氨酶突变体由土曲霉(Aspergillus terreus)ω-转氨酶131位的精氨酸和134位的天冬氨酸分别突变为半胱氨酸获得，该ω-转氨酶突变体的半失活温度比野生型提高了1.6℃；在40℃下的半衰期为10.4min，比野生型延长了3.5min，较野生型提高了50.7％，热稳定性大大提高。
申请公布号为CN107058256A的发明专利申请文献公开了ω-转氨酶突变体及其制备方法和应用，该发明依据在自然进化过程中，同源蛋白质的氨基酸序列某些特定位置向蛋白质结构和功能有利的方面趋于一致的机制，利用生物信息学技术筛选出与待改造生物酶同源的序列，并进行序列一致性分析，确定待改造生物酶中与同源序列不一致的氨基酸残基位点作为突变对象，进而利用定点突变技术进行改造。
虽然，通过上述分子改造方法获得的突变体在一定程度上提高了野生型ω-转氨酶的热稳定性，但是上述ω-转氨酶仍有待进一步提高。
发明内容
本发明提供了一种基于共进化网络的ω-转氨酶突变体以及制备方法和应用，利用蛋白质共进化网络指导ω-转氨酶的研究，将生物信息学与计算机软件相结合，预测影响ω-转氨酶结构和功能作用的重要位点，构建突变文库，以获得酶活及热稳定进一步改善的突变体。
具体技术方案如下：
一种ω-转氨酶突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。
第一种ω-转氨酶突变体的第118位氨基酸由亮氨酸突变为丙氨酸，该ω-转氨酶突变体(L118A)的半失活温度为42.2℃，比野生型酶提高3.75.3℃；ω-转氨酶突变体(L118A)在40℃下的半衰期为20.6min，比野生型酶延长13.7min。
第二种ω-转氨酶突变体的第118位氨基酸由亮氨酸突变为苏氨酸，该ω-转氨酶突变体(L118T)的半失活温度为43.8℃，比野生型酶提高5.3℃；ω-转氨酶突变体(L118T)在40℃下的半衰期为26.0min，比野生型酶延长19.1min。
本发明还提供了编码所述ω-转氨酶突变体的基因。
本发明提供了编码所述ω-转氨酶突变体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示。
其中，ω-转氨酶突变体的核苷酸序列变化情况为：将编码野生型ω-转氨酶第118位亮氨酸的密码子TTG分别突变为GCG和ACC。
本发明还提供了一种所述基因的表达单元。
本发明还提供了一种所述表达单元的重组质粒。
本发明还提供了一种所述重组质粒的转化子。
在蛋白质进化过程中，一些相互作用的氨基酸残基之间存在一种“共进化”(co-evolving)模式，形成了所谓的“共进化网络”，即当一个氨基酸残基发生变异时，与其相关联一个或多个氨基酸残基也要发生相应的变异，以维持蛋白质整体的空间结构以及生物学功能。
本发明还提供了一种ω-转氨酶突变体的制备方法，包括以下步骤：
(1)利用NCBI数据库中的多重序列比对工具，获得与野生型ω-转氨酶同源的转氨酶家族序列；
(2)利用共进化互信息模型对转氨酶家族序列进行分析，得到转氨酶家族的共进化网络，将共进化网络投射到野生型ω-转氨酶上，并根据不同位点上氨基酸残基之间的互信息，筛选出影响野生型ω-转氨酶结构和功能的相关氨基酸位点，作为待突变的氨基酸残基位点；
(3)根据待突变的氨基酸残基位点，设计定点突变引物，以野生型酶基因为模板，进行定点PCR扩增，转化至宿主细胞，获得定点突变文库；
(4)从定点突变文库中筛选获得热稳定性提高的ω-转氨酶突变体。
进一步地，所述的野生型ω-转氨酶为分离自土曲霉(Aspergillus terreus)的ω-转氨酶；得到的ω-转氨酶突变体对应的定点突变引物为：
L118A-F：5’-GCATTTGTTGAAGCGATAGTCACCCG-3’；
L118A-R：5’-GCGGGTGACTATCGCTTCAACAAATGCATC-3’；
或者，
L118T-F：5’-GGGATGCATTTGTTGAAACCATAGTCACCCGCGGTC-3’；
L118T-R：5’-GACCGCGGGTGACTATGGTTTCAACAAATGCATCCC-3’。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明利用蛋白质内氨基酸共进化网络指导转氨酶的理性改造，在丙氨酸扫描基础上结合定点饱和突变，以获得热稳定性提高的突变体；获得的ω-转氨酶突变体的半失活温度为42.2℃和43.8℃，比野生型酶提高3.7℃和5.3℃，在40℃下的半衰期为20.6min和26.0min，比野生型酶延长13.7min和19.1min。
(2)利用蛋白质共进化网络指导ω-转氨酶的研究，将生物信息学与计算机软件相结合，预测影响ω-转氨酶结构和功能作用的重要位点，构建突变文库，以获得酶活及热稳定进一步改善的突变体，有效增加突变成功的概率，提高筛选工作量，提高实验效率。
附图说明
图1为ω-转氨酶(PDB ID：4CE5)与其同源蛋白家族序列利用蛋白质共进化网络互信息预测的重要位点图。
图2为质粒pET28a(+)-ω-AT的基因图谱示意图。
图3为ω-转氨酶及其突变体的酶活检测结果。
图4为半失活温度的检测结果图。
图5为酶活半衰期的检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
实施例1
1.共进化网络预测
蛋白质共进化对于洞悉功能蛋白质的作用过程和蛋白质结构具有重要意义。通过对蛋白质共进化的度量，可以找到对蛋白质结构和功能具有重要作用的残基位点。
具体步骤如下：
(1)将土曲霉(Aspergillus terreus)ω-转氨酶的PDB文件(PDB ID：4CE5)在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中通过BLASTP多序列比对，获得相关的蛋白质家族编号pfam:01063。
(2)以互信息(Mutual Information，MI)为基础，通过不同生物学特征，借助互信息推断蛋白共进化网站MISTIC(Mutual Information Server To Infer Coevolution)，生成氨基酸残基共进化网络；
将蛋白家族pfam序号(01063)和ω-转氨酶的PDB文件(PDB ID：4CE5)上传到MISTIC网站上，MISTIC网站的网址服务器为http://mistic.leloir.org.ar；选定参比序列(Reference Sequence)A3XII7_LEEBM/39-275，MISTIC网站会根据上述信息生成氨基酸残基共进化网络，将生成的蛋白质共进化网络映射到ω-AT(PDB ID：4CE5)上，根据蛋白质中氨基酸残基之间的相互作用关系预测突变氨基酸位点，包括互信息(MI)21，保守值1.1，累积互信息(cMI)501，邻近互信息(pMI)1924。结果如图1所示，筛选了8个氨基酸位点。
2.定点突变
首先，对在MISTIC软件中预测的氨基酸残基位点设计引物，定点突变成丙氨酸，突变体引物如表1。
表1突变体引物
PCR扩增：以野生型ω-转氨酶基因的pET28a-ω-opt-TA质粒为模板，分别进行定点突变。
50μL体系包括：PrimeSTAR Max Premix(2x)25μL，上下游引物各1μL，质粒模板1μL，灭菌超纯水22μL。
PCR扩增程序为：98℃变性1min，98℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸2min，共循环30次；72℃延伸7min。1％的琼脂电泳检验PCR产物。
将PCR产物用Dpn I酶在37℃下酶解2h以消除野生模板。
消化体系：17μL PCR产物，2μL Buffer，1μL Dpn I。消化产物在42℃热击90s转化入感受态细胞E.coli DH 5α，37℃，200r，孵育1h后，涂布含有卡那霉素(50μg/μL)的LB固体平板，于37℃培养12h得到带突变的克隆，测序并提取其质粒。
3.表达、纯化阶段
将测序正确的质粒转化入E.coli BL21(DE3)中，挑取单菌落接种至加有5mL LB液体培养基的试管中，37℃、200r/min条件下培养过夜。将培养好菌液以1％比例(V/V)的接种量接种至含50μg/mL卡那霉素的200mL的LB培养基(LB培养基每升含胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，调节pH 7.0)中，37℃、180r/min培养至OD600值为0.4～0.6，加入适量体积的IPTG(终浓度为0.5mmol/L)，然后在25℃、150r/min条件下诱导表达20h后收集菌体。
将收集的菌体用去离子水洗涤两次，用破胞缓冲液重悬，超声波破碎细胞，超声破胞工作条件为：功率300W，工作3s，间歇6s，超声15min。破胞液于8000r/min，4℃条件下离心处理30min，收集上清液，即得到含有ω-转氨酶突变体的粗酶液。
用Ni-NTA亲和层析对所得的粗酶液进行分离纯化。平衡柱子后经上样、清洗和洗脱，收集洗脱液，将获得的粗酶液、穿透液、各梯度洗脱液变性处理后跑SDS-PAGE蛋白电泳，进而确定目的蛋白，适当稀释后，以考马斯亮蓝法测定纯酶的浓度。
所用缓冲液配制如下：
20mM洗脱缓冲液：50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，20mM咪唑，pH 8.0；
50mM洗脱缓冲液：50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，50mM咪唑，pH 8.0；
100mM洗脱缓冲液：50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，100m M咪唑，pH 8.0；
250mM洗脱缓冲液：50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，250m M咪唑，pH 8.0。
野生型和突变体的酶活，如下图3所示；由图3可知，丙氨酸扫描阶段，L118A突变体酶活是野生型的2.5倍多，并对残基L118位点进行定点饱和突变获得突变体L118T，其酶活是野生型的3.5倍。
实施例2
1、定点突变以及表达、纯化阶段
对118位的氨基酸残基位点设计引物，定点突变成苏氨酸(T)，突变体引物如下：
L118T-F：5’-GGGATGCATTTGTTGAAACCATAGTCACCCGCGGTC-3’；
L118T-R：5’-GACCGCGGGTGACTATGGTTTCAACAAATGCATCCC-3’。
后续PCR扩增和表达、纯化阶段的步骤与实施例1完全相同。
2.突变体热力学稳定性考察
1)半失活温度(T50 10)是指酶在特定温度下孵育10min后，酶活力丧失一半的温度，这是表征酶热稳定性的一个重要参数。
分别将野生型ω-转氨酶和突变体ω-转氨酶在25、30、35、40、45、50、55℃水浴中，恒温10min后迅速放置在冰上冷却，然后测定酶的残余比活力。以温度为横坐标，以热处理后与处理前的比活力的比值为纵坐标作图，orgin 8.0拟合计算半失活温度(T50 10)。
结果如图4所示，实验结果表明，ω-转氨酶突变体L118A和L118T的T50 10分别为42.2和43.8℃，比野生型酶分别提高3.7和5.3℃。
2)半衰期(t1/2)是指特定温度下酶活力丧失一半的时间，是表征酶热稳定性的另一个重要参数。
将野生型ω-转氨酶和突变体ω-转氨酶置于40℃恒温水浴中温浴不同时间，迅速取出置冰上10min，然后测定酶的残余比活力。
以时间为横坐标，以酶热处理一定时间后与处理前的比活力的比值为纵坐标作图，orgin 8.0拟合计算半衰期(t1/2)。
结果如图5所示，实验结果表明，ω-转氨酶突变体L118A和L118T的t1/2分别为20.6和26.0min，比野生型酶分别延长13.7min和19.1m in。
此说明，该突变体增强了该蛋白的热稳定性，减缓了酶的热失活速率，使得突变酶可以耐受更高的温度而不丧失活力。
表2ω-转氨酶及其突变体热稳定性结果
3.突变酶动力学的测定
用磷酸盐缓冲液(50mM，pH 8.0)配制，不同浓度(0-3mmol/L)的底物(R)-α-MBA和丙酮酸。200μL的反应体系中包括180μL底物溶液(0.25％DMSO，0.1mmol/L辅酶PLP)20μL纯酶液(约1mg/mL)。利用MD190酶标仪检测波长245nm处OD值随时间的变化曲线。以底物浓度[S]对反应速率[V]作图，通过非线性拟合计算相应的Km和Vmax值，然后根据kcat＝Vmax/[E0]([E0]为酶初始浓度，单位mmol/L)，计算求得kcat和催化效率kcat/Km。结果如表2所示。
表3动力学参数
序列表
<110> 浙江科技学院
<120> 一种基于共进化网络的ω-转氨酶突变体以及制备方法和应用
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 1
Met Ala Ser Met Asp Lys Val Phe Ala Gly Tyr Ala Ala Arg Gln Ala
1 5 10 15
Ile Leu Glu Ser Thr Glu Thr Thr Asn Pro Phe Ala Lys Gly Ile Ala
20 25 30
Trp Val Glu Gly Glu Leu Val Pro Leu Ala Glu Ala Arg Ile Pro Leu
35 40 45
Leu Asp Gln Gly Phe Met His Ser Asp Leu Thr Tyr Asp Val Pro Ser
50 55 60
Val Trp Asp Gly Arg Phe Phe Arg Leu Asp Asp His Ile Thr Arg Leu
65 70 75 80
Glu Ala Ser Cys Thr Lys Leu Arg Leu Arg Leu Pro Leu Pro Arg Asp
85 90 95
Gln Val Lys Gln Ile Leu Val Glu Met Val Ala Lys Ser Gly Ile Arg
100 105 110
Asp Ala Phe Val Glu Ala Ile Val Thr Arg Gly Leu Lys Gly Val Arg
115 120 125
Gly Thr Arg Pro Glu Asp Ile Val Asn Asn Leu Tyr Met Phe Val Gln
130 135 140
Pro Tyr Val Trp Val Met Glu Pro Asp Met Gln Arg Val Gly Gly Ser
145 150 155 160
Ala Val Val Ala Arg Thr Val Arg Arg Val Pro Pro Gly Ala Ile Asp
165 170 175
Pro Thr Val Lys Asn Leu Gln Trp Gly Asp Leu Val Arg Gly Met Phe
180 185 190
Glu Ala Ala Asp Arg Gly Ala Thr Tyr Pro Phe Leu Thr Asp Gly Asp
195 200 205
Ala His Leu Thr Glu Gly Ser Gly Phe Asn Ile Val Leu Val Lys Asp
210 215 220
Gly Val Leu Tyr Thr Pro Asp Arg Gly Val Leu Gln Gly Val Thr Arg
225 230 235 240
Lys Ser Val Ile Asn Ala Ala Glu Ala Phe Gly Ile Glu Val Arg Val
245 250 255
Glu Phe Val Pro Val Glu Leu Ala Tyr Arg Cys Asp Glu Ile Phe Met
260 265 270
Cys Thr Thr Ala Gly Gly Ile Met Pro Ile Thr Thr Leu Asp Gly Met
275 280 285
Pro Val Asn Gly Gly Gln Ile Gly Pro Ile Thr Lys Lys Ile Trp Asp
290 295 300
Gly Tyr Trp Ala Met His Tyr Asp Ala Ala Tyr Ser Phe Glu Ile Asp
305 310 315 320
Tyr Asn Glu Arg Asn
325
<210> 2
<211> 978
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 2
atggccagta tggataaggt ttttgcaggc tatgctgccc gtcaagcaat cttagaaagt 60
accgaaacta cgaacccgtt tgccaaagga attgcctggg tcgaagggga actcgttcct 120
ttagctgaag cacgcattcc actcctcgat cagggcttca tgcactccga tctgacctac 180
gacgtaccgt ctgtttggga tgggcgattt tttcgtttag atgatcatat tacacgcctg 240
gaagcaagct gcaccaagct gaggctgcgt ctacccttac cacgtgatca agttaaacaa 300
atcctggtgg aaatggtcgc aaaatctggt attcgggatg catttgttga agcgatagtc 360
acccgcggtc ttaaaggggt gcgaggaact tgcccggaat gcatagtgaa caacctgtac 420
atgtttgtgc agccgtacgt gtgggttatg gagccggata tgcagcgcgt aggcggcagc 480
gcagtggtgg ctaggaccgt ccgccgggta ccaccgggcg ctattgatcc gaccgtcaag 540
aatcttcagt ggggtgatct tgttcgtgga atgtttgaag cggctgatcg tggcgcaaca 600
tatcccttcc ttaccgacgg cgatgcgcac ctgactgaag gatcgggttt taatatagta 660
ttagtcaaag atggcgtcct gtatacgcca gatcgcgggg tgctgcaggg agtgactcgc 720
aagtccgtta tcaacgctgc tgaagccttt ggaatagaag tgcgggttga gttcgttcca 780
gttgagctgg cctaccggtg tgacgagatt ttcatgtgca cgacggcggg tggcattatg 840
cctatcacaa cattggacgg tatgcctgta aatggtgggc aaattgggcc tattacgaaa 900
aaaatatggg acggttattg ggcgatgcat tatgacgccg cgtattcgtt cgagatcgac 960
tataatgaga gaaattag 978
<210> 3
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 3
Met Ala Ser Met Asp Lys Val Phe Ala Gly Tyr Ala Ala Arg Gln Ala
1 5 10 15
Ile Leu Glu Ser Thr Glu Thr Thr Asn Pro Phe Ala Lys Gly Ile Ala
20 25 30
Trp Val Glu Gly Glu Leu Val Pro Leu Ala Glu Ala Arg Ile Pro Leu
35 40 45
Leu Asp Gln Gly Phe Met His Ser Asp Leu Thr Tyr Asp Val Pro Ser
50 55 60
Val Trp Asp Gly Arg Phe Phe Arg Leu Asp Asp His Ile Thr Arg Leu
65 70 75 80
Glu Ala Ser Cys Thr Lys Leu Arg Leu Arg Leu Pro Leu Pro Arg Asp
85 90 95
Gln Val Lys Gln Ile Leu Val Glu Met Val Ala Lys Ser Gly Ile Arg
100 105 110
Asp Ala Phe Val Glu Thr Ile Val Thr Arg Gly Leu Lys Gly Val Arg
115 120 125
Gly Thr Arg Pro Glu Asp Ile Val Asn Asn Leu Tyr Met Phe Val Gln
130 135 140
Pro Tyr Val Trp Val Met Glu Pro Asp Met Gln Arg Val Gly Gly Ser
145 150 155 160
Ala Val Val Ala Arg Thr Val Arg Arg Val Pro Pro Gly Ala Ile Asp
165 170 175
Pro Thr Val Lys Asn Leu Gln Trp Gly Asp Leu Val Arg Gly Met Phe
180 185 190
Glu Ala Ala Asp Arg Gly Ala Thr Tyr Pro Phe Leu Thr Asp Gly Asp
195 200 205
Ala His Leu Thr Glu Gly Ser Gly Phe Asn Ile Val Leu Val Lys Asp
210 215 220
Gly Val Leu Tyr Thr Pro Asp Arg Gly Val Leu Gln Gly Val Thr Arg
225 230 235 240
Lys Ser Val Ile Asn Ala Ala Glu Ala Phe Gly Ile Glu Val Arg Val
245 250 255
Glu Phe Val Pro Val Glu Leu Ala Tyr Arg Cys Asp Glu Ile Phe Met
260 265 270
Cys Thr Thr Ala Gly Gly Ile Met Pro Ile Thr Thr Leu Asp Gly Met
275 280 285
Pro Val Asn Gly Gly Gln Ile Gly Pro Ile Thr Lys Lys Ile Trp Asp
290 295 300
Gly Tyr Trp Ala Met His Tyr Asp Ala Ala Tyr Ser Phe Glu Ile Asp
305 310 315 320
Tyr Asn Glu Arg Asn
325
<210> 4
<211> 978
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 4
atggccagta tggataaggt ttttgcaggc tatgctgccc gtcaagcaat cttagaaagt 60
accgaaacta cgaacccgtt tgccaaagga attgcctggg tcgaagggga actcgttcct 120
ttagctgaag cacgcattcc actcctcgat cagggcttca tgcactccga tctgacctac 180
gacgtaccgt ctgtttggga tgggcgattt tttcgtttag atgatcatat tacacgcctg 240
gaagcaagct gcaccaagct gaggctgcgt ctacccttac cacgtgatca agttaaacaa 300
atcctggtgg aaatggtcgc aaaatctggt attcgggatg catttgttga aaccatagtc 360
acccgcggtc ttaaaggggt gcgaggaact tgcccggaat gcatagtgaa caacctgtac 420
atgtttgtgc agccgtacgt gtgggttatg gagccggata tgcagcgcgt aggcggcagc 480
gcagtggtgg ctaggaccgt ccgccgggta ccaccgggcg ctattgatcc gaccgtcaag 540
aatcttcagt ggggtgatct tgttcgtgga atgtttgaag cggctgatcg tggcgcaaca 600
tatcccttcc ttaccgacgg cgatgcgcac ctgactgaag gatcgggttt taatatagta 660
ttagtcaaag atggcgtcct gtatacgcca gatcgcgggg tgctgcaggg agtgactcgc 720
aagtccgtta tcaacgctgc tgaagccttt ggaatagaag tgcgggttga gttcgttcca 780
gttgagctgg cctaccggtg tgacgagatt ttcatgtgca cgacggcggg tggcattatg 840
cctatcacaa cattggacgg tatgcctgta aatggtgggc aaattgggcc tattacgaaa 900
aaaatatggg acggttattg ggcgatgcat tatgacgccg cgtattcgtt cgagatcgac 960
tataatgaga gaaattag 978
<210> 5
<211> 325
<212> PRT
<213> 土曲霉(Aspergillus terreus)
<400> 5
Met Ala Ser Met Asp Lys Val Phe Ala Gly Tyr Ala Ala Arg Gln Ala
1 5 10 15
Ile Leu Glu Ser Thr Glu Thr Thr Asn Pro Phe Ala Lys Gly Ile Ala
20 25 30
Trp Val Glu Gly Glu Leu Val Pro Leu Ala Glu Ala Arg Ile Pro Leu
35 40 45
Leu Asp Gln Gly Phe Met His Ser Asp Leu Thr Tyr Asp Val Pro Ser
50 55 60
Val Trp Asp Gly Arg Phe Phe Arg Leu Asp Asp His Ile Thr Arg Leu
65 70 75 80
Glu Ala Ser Cys Thr Lys Leu Arg Leu Arg Leu Pro Leu Pro Arg Asp
85 90 95
Gln Val Lys Gln Ile Leu Val Glu Met Val Ala Lys Ser Gly Ile Arg
100 105 110
Asp Ala Phe Val Glu Leu Ile Val Thr Arg Gly Leu Lys Gly Val Arg
115 120 125
Gly Thr Arg Pro Glu Asp Ile Val Asn Asn Leu Tyr Met Phe Val Gln
130 135 140
Pro Tyr Val Trp Val Met Glu Pro Asp Met Gln Arg Val Gly Gly Ser
145 150 155 160
Ala Val Val Ala Arg Thr Val Arg Arg Val Pro Pro Gly Ala Ile Asp
165 170 175
Pro Thr Val Lys Asn Leu Gln Trp Gly Asp Leu Val Arg Gly Met Phe
180 185 190
Glu Ala Ala Asp Arg Gly Ala Thr Tyr Pro Phe Leu Thr Asp Gly Asp
195 200 205
Ala His Leu Thr Glu Gly Ser Gly Phe Asn Ile Val Leu Val Lys Asp
210 215 220
Gly Val Leu Tyr Thr Pro Asp Arg Gly Val Leu Gln Gly Val Thr Arg
225 230 235 240
Lys Ser Val Ile Asn Ala Ala Glu Ala Phe Gly Ile Glu Val Arg Val
245 250 255
Glu Phe Val Pro Val Glu Leu Ala Tyr Arg Cys Asp Glu Ile Phe Met
260 265 270
Cys Thr Thr Ala Gly Gly Ile Met Pro Ile Thr Thr Leu Asp Gly Met
275 280 285
Pro Val Asn Gly Gly Gln Ile Gly Pro Ile Thr Lys Lys Ile Trp Asp
290 295 300
Gly Tyr Trp Ala Met His Tyr Asp Ala Ala Tyr Ser Phe Glu Ile Asp
305 310 315 320
Tyr Asn Glu Arg Asn
325
<210> 6
<211> 978
<212> DNA
<213> 土曲霉(Aspergillus terreus)
<400> 6
atggccagta tggataaggt ttttgcaggc tatgctgccc gtcaagcaat cttagaaagt 60
accgaaacta cgaacccgtt tgccaaagga attgcctggg tcgaagggga actcgttcct 120
ttagctgaag cacgcattcc actcctcgat cagggcttca tgcactccga tctgacctac 180
gacgtaccgt ctgtttggga tgggcgattt tttcgtttag atgatcatat tacacgcctg 240
gaagcaagct gcaccaagct gaggctgcgt ctacccttac cacgtgatca agttaaacaa 300
atcctggtgg aaatggtcgc aaaatctggt attcgggatg catttgttga aacgatagtc 360
acccgcggtc ttaaaggggt gcgaggaact tgcccggaat gcatagtgaa caacctgtac 420
atgtttgtgc agccgtacgt gtgggttatg gagccggata tgcagcgcgt aggcggcagc 480
gcagtggtgg ctaggaccgt ccgccgggta ccaccgggcg ctattgatcc gaccgtcaag 540
aatcttcagt ggggtgatct tgttcgtgga atgtttgaag cggctgatcg tggcgcaaca 600
tatcccttcc ttaccgacgg cgatgcgcac ctgactgaag gatcgggttt taatatagta 660
ttagtcaaag atggcgtcct gtatacgcca gatcgcgggg tgctgcaggg agtgactcgc 720
aagtccgtta tcaacgctgc tgaagccttt ggaatagaag tgcgggttga gttcgttcca 780
gttgagctgg cctaccggtg tgacgagatt ttcatgtgca cgacggcggg tggcattatg 840
cctatcacaa cattggacgg tatgcctgta aatggtgggc aaattgggcc tattacgaaa 900
aaaatatggg acggttattg ggcgatgcat tatgacgccg cgtattcgtt cgagatcgac 960
tataatgaga gaaattag 978
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 7
cgtttagatg atgcgattac acgcctgg 28
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 8
gcttccaggc gtgtaatcgc atcatctaaa c 31
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 9
gtattcggga tgcagcggtt gaattgatag tc 32
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 10
actatcaatt caaccgctgc atcccgaata ccag 34
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 11
gatgcatttg ttgcgttgat agtcacccgc 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 12
cgggtgacta tcaacgcaac aaatgcatcc 30
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 13
gcatttgttg aagcgatagt cacccg 26
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 14
gcgggtgact atcgcttcaa caaatgcatc 30
<210> 15
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 15
ctattgatcc gaccgtcaag gcgcttcagt gg 32
<210> 16
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 16
atcaccccac tgaagcgcct tgacggtcgg atcaata 37
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 17
gtcaagaatc ttcaggcggg tgatcttg 28
<210> 18
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 18
gaacaagatc acccgcctga agattcttga cg 32
<210> 19
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 19
gacgagattt tcatgtgcgc aacggcgggt ggc 33
<210> 20
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 20
cataatgcca cccgccgttg cgcacatgaa aatct 35
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 21
gattttcatg tgcacggcgg cgggt 25
<210> 22
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 22
cataatgcca cccgccgccg tgcacatgaa aat 33
<210> 23
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 23
gggatgcatt tgttgaaacc atagtcaccc gcggtc 36
<210> 24
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 24
gaccgcgggt gactatggtt tcaacaaatg catccc 36
Claims (6)
1.一种ω-转氨酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。
2.编码如权利要求1所述ω-转氨酶突变体的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQID NO.4所示。
4.一种包含权利要求2或3所述基因的表达单元。
5.一种包含权利要求4所述表达单元的重组质粒。
6.一种包含权利要求5所述重组质粒的转化子。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811230792.6A CN109486778B (zh) | 2018-10-22 | 2018-10-22 | 一种基于共进化网络的ω-转氨酶突变体以及制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811230792.6A CN109486778B (zh) | 2018-10-22 | 2018-10-22 | 一种基于共进化网络的ω-转氨酶突变体以及制备方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109486778A CN109486778A (zh) | 2019-03-19 |
| CN109486778B true CN109486778B (zh) | 2020-08-25 |
Family
ID=65692436
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201811230792.6A Active CN109486778B (zh) | 2018-10-22 | 2018-10-22 | 一种基于共进化网络的ω-转氨酶突变体以及制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109486778B (zh) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110144335B (zh) * | 2019-04-26 | 2021-02-19 | 浙江科技学院 | 一种ω-转氨酶双突变体及其应用 |
| CN110964705A (zh) * | 2019-12-02 | 2020-04-07 | 浙江科技学院 | (R)-ω-转氨酶突变体的新应用 |
| CN111826362B (zh) * | 2020-07-13 | 2022-05-10 | 李元源 | 一种ω-转氨酶突变体、基因及应用 |
| CN111996222A (zh) * | 2020-09-09 | 2020-11-27 | 赣江新区生鸿企业管理中心(有限合伙) | 采用酶突变技术制备药物中间体(r)-2-(氨乙基)-4-氯苯酚的方法 |
| CN113284562B (zh) * | 2021-06-07 | 2021-12-24 | 中国农业科学院农业基因组研究所 | 一种酶的改良方法 |
| CN115873819B (zh) * | 2023-01-05 | 2023-05-02 | 山东省计算中心（国家超级计算济南中心） | 基于超级计算辅助获得d-氨基酸转氨酶突变体及其应用 |
| CN116486903B (zh) * | 2023-04-17 | 2023-12-29 | 深圳新锐基因科技有限公司 | 基于同源蛋白序列进化方向结合自由能变提高蛋白稳定性的方法及装置 |
| CN116206696B (zh) * | 2023-04-27 | 2024-04-19 | 深圳先进技术研究院 | 一种酶动力学参数预测方法及装置 |
| CN118064400B (zh) * | 2024-04-18 | 2024-06-25 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 高催化活性的S选择性ω-转氨酶突变体及其构建方法和应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102367483B (zh) * | 2011-11-07 | 2013-04-17 | 中国农业大学 | 辅助鉴定肺炎克雷伯氏菌的特异引物对 |
| CN104894148A (zh) * | 2015-04-13 | 2015-09-09 | 浙江科技学院 | 一种ω-转氨酶突变体基因及其应用 |
| CN105441404A (zh) * | 2015-12-08 | 2016-03-30 | 浙江科技学院 | ω-转氨酶突变体及其编码基因和制备方法 |
| CN105950581A (zh) * | 2016-06-21 | 2016-09-21 | 浙江科技学院 | 一种引入二硫键的ω-转氨酶突变体及其应用 |
| CN107058256A (zh) * | 2017-05-04 | 2017-08-18 | 浙江科技学院 | ω‑转氨酶突变体及其制备方法和应用 |
-
2018
- 2018-10-22 CN CN201811230792.6A patent/CN109486778B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102367483B (zh) * | 2011-11-07 | 2013-04-17 | 中国农业大学 | 辅助鉴定肺炎克雷伯氏菌的特异引物对 |
| CN104894148A (zh) * | 2015-04-13 | 2015-09-09 | 浙江科技学院 | 一种ω-转氨酶突变体基因及其应用 |
| CN105441404A (zh) * | 2015-12-08 | 2016-03-30 | 浙江科技学院 | ω-转氨酶突变体及其编码基因和制备方法 |
| CN105950581A (zh) * | 2016-06-21 | 2016-09-21 | 浙江科技学院 | 一种引入二硫键的ω-转氨酶突变体及其应用 |
| CN107058256A (zh) * | 2017-05-04 | 2017-08-18 | 浙江科技学院 | ω‑转氨酶突变体及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| "A Single Mutation Increases the Thermostability and Activity of Aspergillus terreus Amine Transaminase";Wan-Li Zhu et al.;《Molecules》;20190327;第24卷(第7期);全文 * |
| "CorNet: Assigning function to networks of coevolving residues by automated literature mining";Tom van den Bergh et al.;《PLoS One》;20170518;第12卷(第5期);第1页摘要，第4页结果章节，第12-16页材料与方法章节 * |
| "MISTIC: mutual information server to infer coevolution";Franco L. Simonetti et al.;《Nucleic Acids Research》;20130528;第41卷;全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109486778A (zh) | 2019-03-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109486778B (zh) | 一种基于共进化网络的ω-转氨酶突变体以及制备方法和应用 | |
| CN107058256B (zh) | ω-转氨酶突变体及其制备方法和应用 | |
| CN112553178B (zh) | 热稳定性和活性增强的烟酰胺核糖激酶突变体及其编码基因和应用 | |
| CN108913671B (zh) | 一种ω-转氨酶突变体及其应用 | |
| CN113832125B (zh) | 一种烟酰胺核糖激酶突变体及其编码基因和应用 | |
| CN110229805B (zh) | 一种通过序列一致性制备的谷氨酸脱羧酶突变体及其应用 | |
| CN110846291B (zh) | 热稳定性提高的胺脱氢酶突变体及其基因工程菌的构建和应用 | |
| CN112877307B (zh) | 一种氨基酸脱氢酶突变体及其应用 | |
| CN112852790B (zh) | 一种植物腈水解酶嵌合酶突变体、编码基因及其应用 | |
| CN112522228B (zh) | 一种来源于氨氧化假诺卡氏单胞菌的r-转氨酶及其合成方法 | |
| CN112908417A (zh) | 功能序列和结构模拟相结合的基因挖掘方法、nadh偏好型草铵膦脱氢酶突变体及应用 | |
| Li et al. | Characterization and mutagenesis of a novel Mycobacterium smegmatis-derived glutamate decarboxylase active at neutral pH | |
| CN114134135B (zh) | 一种h-蛋白突变体 | |
| CN112626044B (zh) | 一种突变体及其构建方法和应用 | |
| US20210238576A1 (en) | L-aspartate alpha-decarboxylase Mutant and Application thereof | |
| CN110938608A (zh) | 醛酮还原酶突变体、编码基因及其在合成(s)-tcpe中的应用 | |
| CN110229798B (zh) | 一种含硒蛋白及其制备方法 | |
| CN114250206B (zh) | 甲基转移酶突变体、重组载体、重组工程菌及其应用 | |
| CN112646791B (zh) | 一种突变体及其构建方法和应用 | |
| CN113444700B (zh) | 一种提高乙酰丙酮合成效率的乙酰丙酮裂解酶突变体、核苷酸、表达载体、重组菌及应用 | |
| CN110004119B (zh) | ε-酮酯还原酶突变体及其催化合成(R)-α-硫辛酸前体的应用 | |
| CN116814586A (zh) | 一种吡哆醛激酶突变体及其在磷酸吡哆醇合成中的应用 | |
| CN118291417A (zh) | 磷酸吡哆醛依赖半胱氨酸脱硫酶突变体及其编码基因、重组载体、重组菌株、酶制剂及它们的应用 | |
| CN117821410A (zh) | 一种重组ω-转氨酶突变体、编码基因及其应用 | |
| CN118147103A (zh) | 一种α1,3/4-岩藻糖基转移酶突变体及其生物合成二岩藻糖基乳糖的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |