CN103589699A - 一种可溶性淀粉底物特异性提高的环糊精糖基转移酶 - Google Patents

一种可溶性淀粉底物特异性提高的环糊精糖基转移酶 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可溶性淀粉底物特异性提高的环糊精糖基转移酶，属于遗传工程和酶工程领域。本发明将来源于P.macerans strain JFB05-01(CCTCC NO:M208063)的环糊精葡萄糖基转移酶作为原始CGTase，通过在原始CGTase的N端分别融合2种自组双亲短肽，构建了两种融合酶——SAP1-CGTase和SAP2-CGTase。与原始CGTase相比，它们以可溶性淀粉为糖基供体时，合成AA-2G产量分别提高了约1.33倍和2.36倍。因此，这些融合酶比原始环糊精葡萄糖基转移酶更利于利用可溶性淀粉为糖基供体生产AA-2G。

Description

一种可溶性淀粉底物特异性提高的环糊精糖基转移酶
技术领域
本发明涉及一种可溶性淀粉底物特异性提高的环糊精糖基转移酶，尤其是一种可溶性淀粉底物特异性提高的短肽融合型环糊精糖基转移酶及制备方法，属于遗传工程和酶工程领域。
背景技术
L-抗坏血酸（L-AA，维生素C）是水溶性维生素，参与很多体内的生理活动，在保持和促进人体健康中起到重要的作用，是人体无法自身合成的必需的营养元素。但L-AA极不稳定，在空气中易被氧化为脱氢抗坏血酸，破坏分子中的共轭体系，发生不可逆裂解反应，特别是在空气、光线、热和金属离子的存在下，反应更迅速，使L-AA的生理活性减弱甚至消失，这使得它在应用上受到很大的限制。因此，如何增强L-AA的稳定性是目前国内外学术界和产业界所关注的焦点问题。
2-O-α-D-吡喃型葡萄糖基-L-抗坏血酸（AA-2G）是L-AA的糖基衍生物，是将一个糖基以α-1,4-糖苷键连接于L-AA的C2位上。由于L-AA的C2位上有糖基掩蔽，不易发生氧化反应，所以在水溶液中特别稳定，并且AA-2G没有直接还原性，有效地保护了L-AA的生物活性。所以AA-2G是迄今发现的稳定性和性能最佳的L-AA替代品。
目前，AA-2G主要通过糖基转移酶生物催化生成，其中环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）是最常用的催化酶。通常以α-环糊精或β-环糊精为糖基供体，将葡萄糖基催化转移到受体L-AA上。然而，若以α-环糊精为糖基供体，成本太高；若以β-环糊精为糖基供体，由于它的溶解度较低，酶促反应效率受到较大限制。因此，选择一种既便宜又易溶的糖基供体（如可溶性淀粉）将会大大减少AA-2G的生产成本，提高其利润。但是，由于目前环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）对可溶性淀粉的底物特异性（转化率）较低，因此，通过分子改造CGTase技术提高其对可溶性淀粉的底物特异性，将推动与L-AA糖基衍生物相关行业的快速发展。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可溶性淀粉底物特异性提高的环糊精糖基转移酶，尤其是一种可溶性淀粉底物特异性提高的短肽融合型环糊精糖基转移酶；所述短肽融合型环糊精糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
所述可溶性淀粉底物特异性提高的环糊精糖基转移酶，是以Genbank AF047363.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶基因序列为出发序列，在该酶的N-末端分别融合了两种不同的自组双亲短肽，构建了两种短肽融合型环糊精糖基转移酶：SAP1-CGTase和SAP2-CGTase。
所述环糊精葡萄糖基转移酶来源于软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)。
所述SAP1-CGTase是融合了序列如SEQ ID NO.3所示自主双亲短肽的CGTase，SAP1-CGTase的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述SAP2-CGTase是融合了序列如SEQ IDNO.4所示自主双亲短肽的CGTase，SAP2-CGTase的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；。
产所述短肽融合型环糊精葡萄糖基转移酶的基因工程菌或转基因细胞系也为本发明要求保护的范围。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种产短肽融合型环糊精葡萄糖基转移酶基因工程菌的构建方法，具体步骤如下：
1）采用化学全合成或PCR方法克隆编码所述短肽融合型环糊精葡萄糖基转移酶基因；
2）将步骤1）获得的短肽融合型环糊精葡萄糖基转移酶基因连接到大肠杆菌表达载体，得到重组表达载体；
3）将步骤2）获得的重组表达载体转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)得到基因工程菌。
本发明要解决的第三个技术问题是提供一种所述短肽融合型环糊精葡萄糖基转移酶的生产制备方法，是以产短肽融合型环糊精葡萄糖基转移酶的大肠杆菌基因工程菌为生产菌株，活化后按4%接种量将种子发酵液接到含100μg/mL氨苄青霉素的TB液体培养基；在30℃摇床培养至OD600=0.6，加入0.1mM终浓度的IPTG诱导胞外表达，并在25℃摇床继续培养发酵90h后，将发酵液于4℃、10000rpm离心20min除菌体，收集富含环糊精葡萄糖基转移酶的上清液。上清液中加入70%固体硫酸铵盐析过夜，4℃、10000rpm离心20min，取沉淀物用适量含20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、20mM咪唑、pH7.4的缓冲液A溶解，并在缓冲液A中透析过夜后，通过0.22μm膜过滤后制成上样样品；Ni亲和柱用缓冲液A平衡后，将上样样品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分别用A、含20-480mM咪唑的缓冲液A、含480mM咪唑的缓冲液A的洗脱，流速1mL/min，检测波长为280nm，分部收集含CGTase酶活的洗脱液；活力组分在50mM磷酸钠缓冲液（pH=6）中透析过夜后，分别得到纯化的融合酶SAP1-CGTase和SAP2-CGTase。
来源于软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)JFB05-01的环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase），在CGTase的N-末端分别融合两种不同的自组双亲短肽，构建两种短肽融合型CGTase：SAP1-CGTase和SAP2-CGTase，它们相比于原始CGTase利用可溶性淀粉为糖基供体生产AA-2G时，产量分别提高约1.33倍和2.36倍。
本发明的有益效果：本发明构建了2种短肽融合型环糊精葡萄糖基转移酶，均实现了环糊精糖基转移酶对可溶性淀粉的底物特异性的提高，以此为糖基供体所产AA-2G产量均高于原始CGTase，更利于AA-2G工业化生产。
附图说明
图1融合酶SAP-CGTase的构建示意图；（1）：重组质粒pET-22b(+)/SAP-CGTase；（2）SAP-CGTase的详细示意图；SAP——自组双亲短肽；CGT——CGTase基因。
具体实施方式
实施例1底物特异性提高的短肽融合型环糊精葡萄糖基转移酶
本发明的短肽融合型环糊精糖基转移酶是在GenBank AF047363.1公布的糊精糖基转移酶的N-末端分别融合了六种不同的自组双亲短肽（SAP）（见表1），构建了六种融合酶：SAP1-CGTase到SAP6-CGTase。可以通过化学全合成或融合PCR的方式构建上述六种融合酶。短肽融合型环糊精糖基转移酶来源于软化类芽孢杆菌（P.macerans）JFB05-01（CCTCC NO：M208063）。
表1六种不同的自组双亲短肽的序列
Figure BDA0000408181470000031
实施例2底物特异性提高的短肽融合型环糊精葡萄糖基转移酶的制备方法
1）短肽融合型环糊精葡萄糖基转移酶构建
本例以化学全合成法为例进行说明，但被发明的保护并不限于仅通过化学全合成法获得融合酶的方法。融合酶SAP1-CGTase到SAP6-CGTase的制备方法如下：
如图1所示，分别将上述6种短肽通过PT linker连接到CGTase的N-末端，并在短肽N-末端插入组氨酸标签方便纯化。然后，将构建好的短肽融合CGTase通过NdeI和XhoI酶切位点连接至pET-22b(+)表达质粒上。将构建好的重组质粒pET-22b(+)/SAP-CGTase转化致表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。
2）融合酶的表达与纯化
挑取转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)的单克隆于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养生长8～10h，按4%接种量将种子发酵液接到含100μg/mL氨苄青霉素的TB液体培养基；大肠杆菌在30℃摇床培养至OD600=0.6，加入0.1mM终浓度的IPTG诱导胞外表达，并在25℃摇床继续培养发酵90h后，将发酵液于4℃、10000rpm离心20min除菌体，收集上清液。
上清液中加入70%固体硫酸铵盐析过夜，4℃、10000rpm离心20min，取沉淀物用适量含20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、20mM咪唑、pH7.4的缓冲液A溶解，并在缓冲液A中透析过夜后，通过0.22μm膜过滤后制成上样样品；Ni亲和柱用缓冲液A平衡后，将上样样品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分别用A、含20-480mM咪唑的缓冲液A、含480mM咪唑的缓冲液A的洗脱，流速1mL/min，检测波长为280nm，分部收集含CGTase酶活的洗脱液；活力组分在50mM磷酸钠缓冲液（pH=6）中透析过夜后，分别得到纯化的融合酶SAP1-CGTase和SAP2-CGTase。
实施例3酶活分析及AA-2G的合成及检测。
1）酶活测定方法：
甲基橙法测定α-环化活力的方法:取适当稀释的酶液0.1mL，加入装有0.9mL预先用50mM磷酸缓冲液（pH6.5）配制的3%可溶性淀粉溶液中，在40℃下反应10min后，加入1.0mL1.0M的盐酸停止反应，再加入1.0mL用50mM磷酸缓冲液配制的0.1mM甲基橙，在16℃下保温20min，在505nm下测定吸光度。一个酶活单位定义在该条件下每分钟生成1μmolα-环糊精所需酶量。
淀粉水解活力测定方法：将适量的酶液加入到含1%可溶性淀粉的50mM磷酸缓冲液中（pH6.5），50℃反应10min，然后用DNS法测定还原糖浓度。一个酶活单位定义在该条件下每分钟生成1μmol还原糖所需酶量。
歧化反应活力测定方法：将含有6mM供体底物4-硝基苯基-α-D-麦芽庚糖-4-6-O-亚乙基（EPS）和10mM受体底物麦芽糖的10mM柠檬酸缓冲液（pH6.0）在50℃保温10min中，然后加入适当稀释的酶液0.1mL反应，每0.5min取100μL反应样品加入20μL1.2M HCl(4℃)，然后在60℃保温10min使CGTase失活。随后，加入20μL1.2M NaOH中和，将样品加到磷酸缓冲液（pH7.0），并加入60μL（1U）α-糖苷酶于37℃反应60min。加入1mL1M碳酸钠使样品pH升至8以上，在401nm波长下侧吸光值（ε401=18.4mM-1）。1单位酶活定义为每分钟转化1μmol的酶的量。
AA-2G的合成及检测方法：将适量酶液加入含有麦芽糊精和L-AA（终浓度为5%）的醋酸-醋酸钠缓冲液中（pH5.5），于避光避氧条件下37℃反应24h，然后加入10U/mL糖化酶在65℃，pH5.5条件下反应24h，通过HPLC方法检测AA-2G产量。
HPLC检测AA-2G产量方法：酶反应样品通过0.22μm滤膜过滤，使用Amethyst C18-H柱(4.6×250mm,Sepax,America)检测。检测波长：238nm；流动相：0.05M KH2PO4/H3PO4(pH2.0)；流速：0.6mL/min。在此条件下，在大约10min时会出现AA-2G的流出峰。AA-2G浓度通过峰面积计算而得。
酶活比较：实验结果见下表，将上述融合酶纯酶制品与原始CGTase纯酶制品相比，可以发现：
表2融合酶纯酶制品与原始CGTase纯酶制品活力比较
Figure BDA0000408181470000051
融合酶SAP1-CGTase和SAP2-CGTase以可溶性淀粉为糖基供体时生成AA-2G产量较原始CGTase分别提高了1.33倍和2.36倍。而融合酶SAP3-CGTase～SAP6-CGTase均未有大幅度的提高。
融合酶SAP1-CGTase和SAP2-CGTase的α-环化活力较原始CGTase分别降低了39.3%和65.1%；
融合酶SAP1-CGTase的淀粉水解活力较原始CGTase提高了20.9%而SAP2-CGTase则降低了29.1%
融合酶SAP1-CGTase和SAP2-CGTase的歧化活力较原始CGTase分别提高了20.4%和48.5%。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Figure IDA0000408181550000021
Figure IDA0000408181550000031
Figure IDA0000408181550000041
Figure IDA0000408181550000051
Figure IDA0000408181550000071
Figure IDA0000408181550000081
Figure IDA0000408181550000091
Figure IDA0000408181550000101

Claims (10)

1.一种可溶性淀粉底物特异性提高的环糊精糖基转移酶，是在环糊精葡萄糖基转移酶N-末端融合了自组双亲短肽，构建短肽融合型环糊精糖基转移酶。
2.根据权利要求1所述的环糊精糖基转移酶，其特征在于，是以Genbank AF047363.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶基因序列为出发序列，在该酶的N-末端融合自组双亲短肽，构建短肽融合型环糊精糖基转移酶。
3.根据权利要求1所述的环糊精糖基转移酶，其特征在于，所述短肽融合型环糊精糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的环糊精糖基转移酶，其特征在于，所述自组双亲短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
5.携带编码权利要求1所述环糊精糖基转移酶的基因的质粒、基因工程菌和转基因细胞系。
6.一种产权利要求1所述酶的基因工程菌的构建方法，具体步骤如下：
1）采用化学全合成或PCR方法克隆编码所述短肽融合型环糊精葡萄糖基转移酶基因；
2）将步骤1）获得的短肽融合型环糊精葡萄糖基转移酶基因连接到大肠杆菌表达载体，得到重组表达载体；
3）将步骤2）获得的重组表达载体转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)得到基因工程菌。
7.一种应用权利要求6所述方法构建得到的大肠杆菌基因工程菌。
8.一种应用权利要求7所述基因工程菌发酵生产环糊精葡萄糖基转移酶的方法，以产短肽融合型环糊精葡萄糖基转移酶的基因工程菌为生产菌株，活化后按4%接种量将种子发酵液接到含100μg/mL氨苄青霉素的TB液体培养基；在30℃摇床培养至OD600=0.6，加入0.1mM终浓度的IPTG诱导胞外表达，并在25℃摇床继续培养发酵90h后，将发酵液于4℃、10000rpm离心20min除菌体，收集富含环糊精葡萄糖基转移酶的上清液。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，向所述上清液中加入70%固体硫酸铵盐析过夜，4℃、10000rpm离心20min，取沉淀物用含20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、20mM咪唑、pH7.4的缓冲液A溶解，并在缓冲液A中透析过夜后，通过0.22μm膜过滤后制成上样样品；Ni亲和柱用缓冲液A平衡后，将上样样品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分别用A、含20-480mM咪唑的缓冲液A、含480mM咪唑的缓冲液A的洗脱，流速1mL/min，检测波长为280nm，分部收集含CGTase酶活的洗脱液；活力组分在50mM磷酸钠缓冲液（pH=6）中透析过夜后，分别得到纯化的融合酶SAP1-CGTase和SAP2-CGTase。
10.权利要求1所述环糊精糖基转移酶在生产2-O-α-D-吡喃型葡萄糖基-L-抗坏血酸中的应用。
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