KR101884117B1

KR101884117B1 - Rna 분해 양상을 이용한 사후 경과시간 추정방법 및 이에 사용되는 사후 경과시간 추정용 조성물

Info

Publication number: KR101884117B1
Application number: KR1020170029896A
Authority: KR
Inventors: 손기훈; 김지연; 차효경
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2017-03-09
Filing date: 2017-03-09
Publication date: 2018-07-31

Abstract

본 발명의 일 실시예에 따르면, (a) 생물학적 시료로부터 2종 이상의 조직을 분리하는 단계; (b) 상기 각 조직별 동종 RNA의 제1 영역(domain) 및 제2 영역의 발현 수준을 정량하는 단계; (c) 상기 제1 영역 및 제2 영역의 상대적 발현 수준을 산출하는 단계; 및 (d) 상기 각 조직에 대해 산출된 상대적 발현 수준에 기초하여 사망시각을 추정하는 단계;를 포함하는, 사후 경과시간 추정방법이 제공된다.

Description

RNA 분해 양상을 이용한 사후 경과시간 추정방법 및 이에 사용되는 사후 경과시간 추정용 조성물{METHOD FOR ESTIMATING POSTMORTEM INTERVAL USING RNA DEGRADATION PATTERN AND COMPOSITION FOR ESTIMATING POSTMORTEM INTERVAL THEREFOR}

본 발명은 RNA 분해 양상을 이용한 사후 경과시간 추정방법 및 이에 사용되는 사후 경과시간 추정용 조성물에 관한 것이다.

범죄 수사에서 사후 경과시간(postmortem interval, PMI) 추정은 수사 대상 및 범위를 한정하기 위해 가장 중요한 법과학적 정보이다. 특히 형사 사건에서 알리바이 성립 여부를 가리거나 수사를 올바른 방향으로 진행하기 위한 핵심적인 정보로 사후 경과시간 추정이 사용되는 경우가 많다.

현재 시체의 체온 하강 정도, 시체 강직의 정도, 시반의 위치, 위장 내용물의 소화 상태, 부패 진행의 정도 등을 종합하여 사후 경과시간을 추정하고 있으나, 위 병리 지표들은 사후 변화 과정에서 외부 환경과 개인차 등 다양한 인자를 고려해야 하므로 그 정확성에는 논란의 여지가 많다.

이러한 문제점을 보완하기 위해 최근 사후 세포 내 RNA 분해 정도 등 분자생물학적 기법에 바탕을 둔 사후 경과시간 추정기술을 개발하려는 시도가 이루어지고 있다. 그러나 RNA를 이용한 사후 경과시간 및 사인 추정은 RNA 분해 속도가 조직에 따라 크게 다를 뿐만 아니라 온도, 습도, 조직의 산도 및 부패속도 등 외부 환경적 요인에 크게 영향을 받기 때문에 사망 후 검체에 대한 정량적 RNA 분석의 표준화가 어렵다는 한계가 존재한다.

사후 RNA의 분해 과정이 사후 경과시간에 비례하여 나타나며, 최근 정량적 RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction) 등 RNA 정량 분석기술의 발전에 따라 미량의 RNA 시료 분석이 가능해지면서 사후 RNA 분석 기술의 개발 및 법의학적 활용이 증대되고 있다.

예를 들면, 범죄 현장에서 조직 특이적으로 발현되는 RNA의 검출을 통한 체액 식별, 사인 특이적 표지 mRNA의 발현 양상 분석을 통한 사망원인 추정, RNA 분해 정도에 따른 사후 경과시간 추정 등에 대한 개념증명 연구들이 보고된 바 있다.

RNA 정량 분석법에서 표적 RNA와 더불어 internal control RNA를 함께 분석하는 경우, 그 비율을 측정함으로써 사용된 시료의 양과 질에 따른 편차를 보정하고, 표준화하는 방법을 사용하며, 다양한 ACTIN, GAPDH, HPRT 등의 house keeping 유전자 RNA들이 internal control RNA로 빈번하게 사용된다.

그러나, 사망 후 모든 RNA가 분해되고 있는 상황에서 통상적인 RNA 정량법으로는 분해 정도를 정량적으로 정밀하게 측정할 수 있는 internal control RNA가 존재하지 않기 때문에 분석에 한계가 있다. 이러한 한계는 DNA나 단백질 분석의 경우도 마찬가지이다.

본 발명은 전술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 조직의 종류, 환경적 요인, 개인차 등에 관계없이 정확하게 사후 경과시간을 추정할 수 있는 방법 및 이에 사용되는 사후 경과시간 추정용 조성물을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, (a) 생물학적 시료로부터 2종 이상의 조직을 분리하는 단계; (b) 상기 각 조직별 동종 RNA에 대해, 제1 영역(domain) 및 제2 영역 각각의 발현 수준을 산출하는 단계; (c) 상기 제1 영역 및 제2 영역의 상대적 발현 수준을 산출하는 단계; 및 (d) 상기 각 조직에 대해 산출된 상대적 발현 수준에 기초하여 사망시각을 추정하는 단계;를 포함하는, 사후 경과시간 추정방법이 제공된다.

일 측에 따르면, 상기 조직은 뇌, 폐, 근육 및 간으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 조직일 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 RNA는 28S rRNA일 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 제1 영역은 28S rRNA의 5' 말단 영역이고, 상기 제2 영역은 28S rRNA의 D8 영역일 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 (b) 단계에서, 상기 RNA의 제1 영역 및 제2 영역 각각의 발현 수준은 하기 수학식 1을 통해 산출될 수 있다.

[수학식 1]

발현 수준(ΔCt) = Ct - Ct_t=0

상기 수학식 1에서 Ct는 측정 시점의 순환임계값(cycle threshold value)이고, Ct_t=0은 사망 시점의 순환임계값이다.

일 측에 따르면, 상기 (c) 단계에서, 상기 제1 영역 및 제2 영역의 상대적 발현 수준은 하기 수학식 2를 통해 산출될 수 있다.

[수학식 2]

상대적 발현 수준 = ΔCt_{(제1 영역)} - ΔCt_{(제2 영역)}

상기 수학식 2에서 ΔCt_{(제1 영역)}은 제1 영역의 ΔCt 값이고, ΔCt_{(제2 영역)}은 제2 영역의 ΔCt 값이다.

일 측에 따르면, 상기 (d) 단계는 상기 각 조직에 대해 상대적 발현 수준으로 표시되는 각 함수의 교차점을 사망시각으로 추정할 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 28S rRNA의 5' 말단 영역에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트; 및 28S rRNA의 D8 영역에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트;를 포함하는, 사후 경과시간 추정용 조성물이 제공된다.

일 측에 따르면, 상기 5' 말단 영역에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 D8 영역에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열; 또는 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 염기서열;로 이루어질 수 있다.

본 발명의 사후 경과시간 추정방법은 단일 RNA 종 내의 영역(domain)별 차등 분해 양상을 정량적으로 분석하고, 그 비율을 측정함으로써 별도의 internal control RNA를 사용하지 않고서도 사망시각 내지 사후 경과시간을 정밀하게 추정할 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 동물 모델에서 적출한 뇌, 폐, 근육 및 간 조직에서 사후 경과시간에 따른 RNA 시료의 RIN(RNA integrity number) 변화를 측정한 결과이다. 도 1A는 Bioanalyzer를 이용하여 28S rRNA와 18S rRNA 시료를 분석한 결과를 나타내는 것이며, 도 1B는 반복 실험에 따른 RIN의 평균과 표준오차를 나타낸 것이다.
도 2는 동물 모델에서 적출한 뇌, 폐, 근육 및 간 조직에서 사후 경과시간에 따른 28S rRNA의 5' 말단 영역(5' end domain) 및 D8 영역(D8 domain)의 발현 수준을 RT-PCR로 정량한 뒤, 사망 시점 대조군의 평균 순환임계값(Ct_t=0)에 대한 상대적 발현양상(-ΔCt)을 나타낸 것이다. 모든 조직에서 공통적으로 28S rRNA의 D8 영역이 5' 말단 영역에 비해 상대적으로 빠르게 분해되는 현상이 나타났다.
도 3은 도 2의 결과값을 이용하여 28S rRNA의 5' 말단 영역에 대한 D8 영역의 상대적 발현 수준을 측정하고, 이에 대해 2를 밑으로 하는 로그 값을 이용하여 회귀/상관 분석을 수행한 결과이다. 특히, 피어슨 상관계수(Pearson correlation) 분석 결과, 모든 조직에서 통계적으로 유의한 수준으로 강한 음의 상관관계를 나타내었다(r < -0.5, p < 0.01).
도 4는 생쥐로부터 적출된 뇌와 간 조직을 체외에서 방치한 후, 사후 72시간까지 4시간 간격으로 RNA를 추출하여 28S rRNA의 D8 영역 및 5' 말단 영역의 발현 수준을 정량적 RT-PCR을 통해 검증한 결과이다(도 4A 및 4B). 도 3에서 제시한 것과 같은 방식으로 5' 말단 영역에 대한 D8 영역의 상대적 발현 수준을 산출하고, 이에 대한 로그 값을 계산한 지표를 사후 경과시간에 따라 도시한 결과, 조직별 특이적 기울기를 나타내는 회귀직선을 구할 수 있으며, 두 조직 모두통계적으로 유의한 수준의 음의 상관관계가 나타났다(도 4C; 뇌 조직: r = -0.831, p < 0.001 및 간 조직: r = -0.921, p < 0.001).
도 4D는 살아있는 생쥐의 뇌 조직과 간 조직에서 RNA를 추출하여 28S rRNA의 D8 영역 및 5' 말단 영역의 발현 수준을 정량적 RT-PCR을 통해 검증한 결과이다. 5' 말단 영역에 대한 D8 영역의 상대량 지표로서 두 영역에 대한 Ct 값의 차이(Ct_D8 - Ct₅ _'-end)를 구하여 도시한 결과, 살아있는 세포에서는 28S rRNA의 5' 말단 영역에 대한 D8 영역의 비율이 뇌와 간 조직 사이에 통계적으로 유의한 수준으로 차이가 없는 것을 확인하였다.
도 5는 사망시각을 정확히 알고 있는 인체 부검조직을 대상으로 도 3 및 도 4C와 동일한 방식의 분석을 수행한 결과이다. 인체 조직의 경우 사망 후 일정 시간 경과 후 실험을 개시하였으며, 생쥐의 경우와 동일한 온도 조건(20~24℃) 하에서 방치한 뒤 4시간 간격으로 RNA 시료를 채취하여 분석하였다. 각 조직별로 측정된 28S rRNA의 5' 말단 영역에 대한 D8 영역의 상대비에 대한 로그 값 지표를 사후 경과시간에 따라 도시하고 직선 회귀분석을 수행하였다. 각 증례에서 두 조직의 결과로부터 도시된 회귀직선의 교차점이 사망 추정시각이 되며, 그래프 하단에 실제 사망시각과의 차이를 나타내었다.

이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 각 도면에 제시된 동일한 참조 부호는 동일한 부재를 나타낸다.

아래 설명하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

실시예에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 실시예를 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조 부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

상기 (a) 단계에서, 상기 생물학적 시료는 동물일 수 있으며, 예를 들어 인간, 생쥐, 소, 돼지, 닭 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 생물학적 시료로부터 1종의 조직만을 추출하여 분석을 수행하는 경우, 사후 경과시간 추정의 정밀도가 저하될 수 있으므로, 2종 이상의 조직을 추출하여 이들 간 비교 분석을 수행하는 것이 바람직할 수 있다.

또한, 상기 조직은 뇌, 폐, 근육 및 간으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 조직일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 신체를 구성하는 어떠한 조직이라도 사용될 수 있다.

상기 (b) 단계에서는 상기 (a) 단계에서 분리한 2종 이상의 조직을 대상으로, 각 조직 내에 존재하는 동종의 RNA를 분석할 수 있다. 구체적으로 상기 RNA는 28S rRNA일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

28S 리보솜 RNA(28S rRNA)는 포유류의 모든 세포에서 발현되며, 하나의 전구체에서 특이적 절단을 통해 다른 아형의 rRNA(28S, 18S 및 5.8S rRNA)가 생성된다.

상기 28S rRNA는 세포 내에서 부분적인 염기쌍 형성을 통해 서열 특이적인 2차 구조를 형성하며, 다양한 리보솜 구성 단백질 단위체들과 결합하여 최종적인 3차 구조를 형성한다. 이러한 2차 및 3차 구조는 RNA 분해효소의 접근성 차이를 유발하며, 결과적으로 분해효소의 작용 효율을 조절한다.

예를 들어, 28S rRNA 단일 분자 내 5' 말단 영역(5' end domain)은 특유의 견고한 2차 구조를 형성하며, mRNA 번역을 위해 성숙한 리보솜 복합체를 형성하는 과정에서 5.8S rRNA와 결합하기 때문에 RNA 분해효소로부터 보호된다.

이에 반해, 28S rRNA 단일 분자 내 D-영역(D-domain) 중 8번째 영역(D8 domain)은 RNA 분해효소에 의해 용이하게 절단되는 AT 염기가 내부에 존재하여 세포사 과정에서 RNA 분해효소에 특히 취약하다.

즉, 28S rRNA는 영역(domain)마다 RNA 분해효소로부터 보호되는 정도가 다르기 때문에, 본 발명자들은 상기 28S rRNA의 제1 영역 및 제2 영역의 발현 수준 내지 분해 양상을 비교함으로써 정밀하게 사후 경과시간을 추정할 수 있는 방법을 완성하였다. 구체적으로, 상기 제1 영역은 28S rRNA의 5' 말단 영역이고, 상기 제2 영역은 28S rRNA의 D8 영역일 수 있다.

상기 28S rRNA가 생쥐 유래인 경우 5' 말단 영역과 D8 영역은 각각 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 염기서열일 수 있고, 상기 28S rRNA가 인간 유래인 경우 5' 말단 영역과 D8 영역은 각각 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어진 염기서열일 수 있다.

상기 (b) 단계에서, 상기 RNA의 제1 영역 및 제2 영역 각각의 발현 수준은 하기 수학식 1을 통해 산출될 수 있다.

[수학식 1]

발현 수준(ΔCt) = Ct - Ct_t=0

상기 Ct 값은 RT-PCR 분석에서 threshold와 접점을 나타내는 형광신호의 cycle 수를 의미하는 것으로, 특정 시점에서 분석 대상인 RNA 영역의 발현 수준이 높을수록 Ct 값은 낮게 나타난다.

상기 (c) 단계에서는 상기 (b) 단계에서 산출한 제1 및 제2 영역 각각의 발현 수준을 기초로 이들 간 상대적 발현 수준을 산출할 수 있다. 구체적으로, 상기 제1 영역 및 제2 영역의 상대적 발현 수준은 하기 수학식 2를 통해 산출될 수 있다.

[수학식 2]

상대적 발현 수준 = ΔCt_{(제1 영역)} - ΔCt_{(제2 영역)}

본 발명자들은 기존 RNA 발현 양상을 나타내는 RIN(RNA integrity number) 지표의 그래프가 직선으로 표시되지 않기 때문에 정확한 사후 경과시간 추정이 용이하지 않음을 확인하였다. 이에 대해, 상기 제1 영역과 제2 영역의 상대적 발현 수준을 직선으로 표현하기 위해 2를 밑으로 하는 로그 값을 취하여 직선회귀 시켰다. 즉, 제1 영역과 제2 영역의 상대적 발현 수준은 Log₂[제2 영역/제1 영역]을 의미하며, 이는 상기 수학식 2의 함수로 표현될 수 있다.

상기 (d) 단계에서는, 상기 (c) 단계에서 산출한 상대적 발현 수준을 조직별로 그래프화하여 표시한 뒤 이들의 교차점의 시간을 사망시각으로 추정할 수 있다. 즉, 각 조직마다 rRNA 분해 양상이 상이하므로, 2종 이상의 조직에서 28S rRNA 영역별 상대적 발현 수준을 비교함으로써 정밀하게 사후 경과시간을 추정할 수 있다.

상기 프라이머 세트는 28S rRNA의 발현 수준 측정을 위해 사용될 수 있으며, 구체적으로 상기 (b) 단계의 분석을 위해 사용될 수 있다. 이 때, 상기 5' 말단 영역에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있다.

또한, 상기 D8 영역에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열; 또는 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 염기서열;로 이루어질 수 있다. 분석 대상이 생쥐 유래의 조직인 경우 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트를 이용할 수 있고, 인간 유래의 조직인 경우 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트를 이용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기술된 것으로서, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 검체 준비

24마리의 생쥐를 경추 탈골하여 희생시킨 뒤, 특정 사후 경과시간에 따라 4가지 조직(뇌, 간, 폐, 근육)을 적출하였다. 추가의 RNA 분해를 방지하기 위해 조직들은 적출과 동시에 RNAlater^TM를 12시간 동안 처리한 뒤 -70℃에 냉동보관하였다. 인간의 검체는 부검 증례 중 사망시각이 정확히 기재된 사체의 뇌와 간 조직을 적출하였으며, 이 조직들 또한 동물 조직과 같은 방법으로 사용 전까지 -70℃에 냉동보관하였다.

실시예 2: RNA 추출

상기 실시예 1에서 적출된 조직을 각각 20~40㎎씩 cryo-tube에 넣고, 액체 질소에 5분 동안 방치하여 급속 냉각시킨 후, 휴대용 파쇄기(SKMILL-200)을 이용하여 분쇄하였다. 분쇄된 조직으로부터 miRNeasy mini kit를 사용하여 전체 RNA를 추출하였다.

실시예 3: RNA 분해 양상 측정

상기 실시예 2에 따라 추출된 생쥐 RNA의 흡광도를 측정하여 농도를 확인하였고, 추가로 Bioanalyzer를 이용하여 RNA 시료의 농도 및 RIN(RNA integrity number) 지표를 도출하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1A의 결과와 같이, 사후 경과시간에 따른 RNA 분해 속도가 조직별로 상이한 것을 확인할 수 있었다. 상대적으로 뇌 조직의 RNA 분해 속도가 가장 느린 반면, 간 조직의 경우가 가장 빠른 RNA 분해 속도를 나타내었다.

구체적으로, 생쥐의 간 조직은 사후 6시간이 경과하면서 타 조직들에 비해 RNA 분해가 빠르게 일어나며, 사후 24시간이 경과되면서 대부분의 RNA가 분해되는 것으로 확인되었다. 이에 비해 생쥐의 뇌 조직은 사후 48시간이 경과되기까지 대부분의 RNA가 보존되는 것을 확인할 수 있었다. 그 외 폐와 근육 조직은 12시간에서 48시간 이내에 대부분의 RNA가 분해되었다.

도 1B에서 도시된 바와 같이 사망 후 시간의 경과에 따라 RIN 값은 점차 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 다만, 감소 양상이 직선적이지 않기 때문에 RIN 값을 통해 사망시각 혹은 사후 경과시간 추정이 용이하지 않음을 알 수 있다.

실시예 4: 정량적 RT-PCR

상기 실시예 2에 따라 추출된 전체 RNA 500ng에 대해 cDNA 합성 키트를 사용하여 37℃에서 60분, 95℃에서 5분 조건 하에 cDNA를 합성하였다. 전체 RNA 중 28S rRNA 단일 분자 내 5' 말단 영역(서열번호 7)과 D8 영역(서열번호 8)의 검체 내 발현 수준은 실시간 정량적 RT-PCR(real time quantitative RT-PCR)을 통해 측정하였다.

구체적으로, 상기 cDNA를 1/30으로 1차 희석한 후, SYBR Green Ⅰ PCR master mixture와 하기 표 1에 기재된 프라이머를 이용하여 정량적 RT-PCR을 수행하여 cDNA 시료에 포함된 표적 rRNA 영역의 발현 수준을 측정하였다. PCR 반응은 50℃에서 2분, 95℃에서 10분 동안 반응시킨 후, 95℃에서 15초, 62℃에서 30초, 72℃에서 30초의 순환 반응을 최대 50회까지 실시하였다. 동일 cDNA 시료에 대해 정량 실시간 PCR을 독립적으로 2회 반복한 후 평균치를 결과 분석에 이용하였다. PCR 산물은 염기서열 분석을 통해 유전자 특이적 증폭을 확인하였으며 사용된 프라이머의 염기서열 정보는 하기 표 1에 나타내었다.

서열번호	프라이머 명칭	염기서열
1	28S rRNA 5'-end-F	CCTCAGATCAGACGTGGCGA
2	28S rRNA 5'-end-R	CTGGGCTCTTCCCTGTTCAC
3	생쥐 28S rRNA D8-F	CATCGCCTCTCCCGAGGTGCGTG
4	생쥐 28S rRNA D8-R	GTTCTAAGTCGGCTGCTAGGC
5	인간 28S rRNA D8-F	CCNNCGNNGCCGCGGTTCCG
6	인간 28S rRNA D8-R	CAGTTCTAAGTCGGCTGCTAGG

실시예 5: 데이터 분석 및 rRNA 분해지표 산출

상기 실시예 4의 정량적 RT-PCR에 따라 조직별 28S rRNA 각 영역의 Ct 값(cycle threshold value)을 측정하였고, 하기 수학식 1에 따라 -Ct 값을 산출하였다. Ct 값은 28S rRNA 각 영역의 발현 수준을 의미한다. 하기 수학식 1에서 Ct는 측정 시점의 순환임계값(cycle threshold value)이고, Ct_t ₌₀은 사망 시점의 순환임계값이다

[수학식 1]

ΔCt = Ct - Ct_t=0

또한, 28S rRNA의 5' 말단 영역과 D8 영역의 상대적 비율에 대해 2를 밑으로 하는 로그 값을 28S rRNA의 분해지표로 정의하였고, 하기 수학식 2에 따라 28S rRNA의 분해지표를 산출하였다. Log₂[D8/5'-end] 값은 5' 말단 영역과 D8 영역의 상대적 발현 수준을 의미한다. 하기 수학식 2에서 ΔCt_(5'-end)은 5' 말단 영역의 ΔCt 값이고, ΔCt_(D8)은 D8 영역의 ΔCt 값이다.

[수학식 2]

Log₂[D8/5'-end] = ΔCt_(5'-end) - ΔCt_(D8)

실시예 6: 동물 모델 내 rRNA 발현 수준 분석 1

상기 실시예 4에 따라 생쥐 28S rRNA에 대해 RT-PCR을 수행하였고, 상기 실시예 5의 -Ct 값을 통해 각 영역의 발현 수준을 산출하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2를 참고하면, 생쥐의 뇌, 폐, 근육, 간 조직에서 사후 경과시간에 따라 28S rRNA 5' 말단 영역의 유전자 발현 수준은 일정시간 동안 높은 상태로 유지되었으나, D8 영역은 지속적으로 분해되는 것을 확인할 수 있다.

또한, RNA 분해효소에 대해 상대적으로 불안정한 D8 영역의 경우, 사후 경과시간에 따라 조직별 상이한 분해 양상을 확인할 수 있다. 구체적으로, 뇌 조직은 타 조직 대비 D8 영역의 분해 속도가 상대적으로 느리지만(도 2A), 간 조직은 D8 영역이 빠르게 분해되고(도 2D), 폐 및 근육 조직에서는 중간 정도의 분해 속도를 나타낸다(도 2B 및 2C).

또한, 상기 실시예 5의 Log₂[D8/5'-end] 값을 통해 28S rRNA의 분해지표를 산출하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3을 참고하면, rRNA의 분해지표 값의 그래프는 통계적으로 유의한 수준의 음의 상관관계를 나타내는 것을 확인할 수 있다. 특히 상기 실시예 3의 RIN 값과 달리, rRNA 분해지표 값은 72시간까지 직선 회귀 가능한 선형 감소 양상(linearity)을 나타내는 것을 알 수 있다.

이는 사후 경과시간에 따른 28S rRNA 단일 분자의 5' 말단 영역과 D8 영역의 상대 잔량에 대한 정량적 분석을 통해 도출된 상기 rRNA 분해지표가 사후 경과시간 추정방법의 정밀성, 정확성을 제고할 수 있는 평가기술이 될 수 있음을 시사한다.

실시예 7: 동물 모델 내 rRNA 발현 수준 분석 2

상기 실시예 6에서 사체 상태에서 특정 시간 경과 시점에 조직을 적출하여 분석한 것과 달리, 실제 활용 가능성을 확인하기 위해 적출된 조직을 시험관 내에서 일정 시간 유지하면서 특정 시간별 rRNA 발현 수준을 분석하였다. 이 때, 조직 적출 시점을 제외하면 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 rRNA 발현 수준을 분석하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4를 참고하면, 사체로부터 특정 시간 경과 후 조직을 적출하여 실험한 경우와 마찬가지로, 뇌 조직과 간 조직을 사망 직후 적출하여 시험관 내에 일정 기간 유지하면서 실온(22~23℃)에서 부패를 유도한 경우에도 동등한 양상의 RNA 분해 현상을 확인할 수 있다.

즉, 조직 간 RNA 분해 양상 비교 결과, 뇌 조직에 비해 간 조직에서 rRNA의 분해가 더 빠르게 일어나며(도 4A 및 4B), 5' 말단 영역과 D8 영역 간의 잔량비는 72시간까지 음의 상관관계를 나타내는 직선으로 회귀된다(도 4C).

한편, 살아있는 생쥐의 뇌 조직과 간 조직에서 RNA를 추출하여 위와 같은 실험을 수행한 결과, 5' 말단 영역과 D8 영역의 비율 간 차이가 없음을 확인하였고(도 4D), 이를 통해 상기 rRNA 분해지표가 사후 경과시간 추정에 특화된 것임을 알 수 있다.

실시예 8: 실제 부검 증례에의 적용

사망시각이 정확하게 기입된 변사체의 부검 과정에서 적출한 인간 뇌와 간 조직을 시험관 내에서 유지하면서 실온(22~23℃)에서 부패를 유도하고, 이로부터 4시간 간격으로 조직을 수집한 후 상기 실시예 7과 동일한 방법으로 RNA 분석을 수행하였다. 다음으로, 조직별 rRNA 분해지표를 그래프로 도시하고, 이들 직선이 교차하는 지점의 시간을 사망시각으로 추정하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 이 때, 28S rRNA의 5' 말단 영역과 D8 영역은 각각 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 표시된다.

도 5A는 사망 28시간 후 적출된 조직을 대상으로 분석한 결과이며, 도 5B는 사망 52시간 경과 후 적출된 조직을 분석한 결과이다. 도 5A 및 5B를 참고하면, 사망 후 약 1일이 경과한 경우 실제 사망시각과의 오차가 +1.29시간이었으며, 2일 이상이 경과한 경우 약 +7.00시간의 오차가 관찰되었다.

위와 같은 결과는 통상적인 병리 지표를 통해 추정이 어려운 시점에서 사체 주변의 온도 및 습도 조건을 고려하지 않았음에도 불구하고, 각각 4.6% 및 13.4%의 오차 내에서 사망시각을 성공적으로 추정한 결과이며, 이를 통해 높은 정밀도로 사후 경과시간을 추정할 수 있음을 알 수 있다.

이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.

그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

<110> KOREA UNIVERSITY <120> METHOD FOR ESTIMATING POSTMORTEM INTERVAL USING RNA DEGRADATION PATTERN AND COMPOSITION FOR ESTIMATING POSTMORTEM INTERVAL THEREFOR <130> APC-2017-0103 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 28S rRNA 5'-end-F primer <400> 1 cctcagatca gacgtggcga 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 28S rRNA 5'-end-R primer <400> 2 ctgggctctt ccctgttcac 20 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse 28S rRNA D8-F primer <400> 3 catcgcctct cccgaggtgc gtg 23 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse 28S rRNA D8-R primer <400> 4 gttctaagtc ggctgctagg c 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human 28S rRNA D8-F primer <400> 5 ccnncgnngc cgcggttccg 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human 28S rRNA D8-R primer <400> 6 cagttctaag tcggctgcta gg 22 <210> 7 <211> 146 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 7 cgcgacctca gatcagacgt ggcgacccgc tgaatttaag catattagtc agcggaggaa 60 aagaaactaa ccaggattcc ctcagtaacg gcgagtgaac agggaagagc ccagcgccga 120 atccccgccg cgcgtcgcgg cgtggg 146 <210> 8 <211> 517 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 8 cggggccccg tcgtcccccg cgtcgtcgcc acctctcttc ccccctcctt cttcccgtcg 60 gggggcgggt cgggggtcgg cgcgcggcgc gggctccggg gcggcgggtc caaccccgcg 120 ggggttccgg agcgggagga accagcggtc cccggtgggg cggggggccc ggacactcgg 180 ggggccggcg gcggcggcga ctctggacgc gagccgggcc cttcccgtgg atcgcctcag 240 ctgcggcggg cgtcgcggcc gctcccgggg agcccggcgg gtgccggcgc gggtcccctc 300 cccgcggggc ctcgctccac ccccccatcg cctctcccga ggtgcgtggc gggggcgggc 360 gggcgtgtcc cgcgcgtgtg gggggaacct ccgcgtcggt gttcccccgc cgggtccgcc 420 ccccgggccg cggttttccg cgcggcgccc ccgcctcggc cggcgcctag cagccgactt 480 agaactggtg cggaccaggg gaatccgact gtttaat 517 <210> 9 <211> 161 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 cgcgacctca gatcagacgt ggcgacccgc tgaatttaag catattagtc agcggaggag 60 aagaaactaa ccaggattcc ctcagtaacg gcgagtgaac agggaagagc ccagcgccga 120 atccccgccc cgcggcgggg cgcgggacat gtggcgtacg g 161 <210> 10 <211> 843 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 cggatccgta acttcgggat aaggattggc tctaagggct gggtcggtcg ggctggggcg 60 cgaagcgggg ctgggcgcgc gccgcggctg gacgaggcgc cgccgccccc cccacgcccg 120 gggcaccccc ctcgcggccc tcccccgccc caccccgcgc gcgccgctcg ctccctcccc 180 accccgcgcc ctctctctct ctctctcccc cgctccccgt cctcccccct ccccggggga 240 gcgccgcgtg ggggcggcgg cggggggaga agggtcgggg cggcaggggc cggcggcggc 300 cgccgcgggg ccccggcggc gggggcacgg tcccccgcga ggggggcccg ggcacccggg 360 gggccggcgg cggcggcgac tctggacgcg agccgggccc ttcccgtgga tcgccccagc 420 tgcggcgggc gtcgcggccg cccccgggga gcccggcggg cgccggcgcg ccccccccac 480 ccccacccca cgtctcgtcg cgcgcgcgtc cgctgggggc ggggagcggt cgggcggcgg 540 cggcggtcgg cgggcggcgg ggcggggcgg ttcgtccccc cgccctaccc ccccggcccc 600 gtccgccccc cgttcccccc tcctcctcgg cgcgcggcgg cggcggcggc ggcgggcggc 660 ggaggggccg cgggccggtc ccccccgccg ggtccgcccc cggggccgcg gttccgcgcg 720 gcgcctcgcc tcggccggcg cctagcagcc gacttagaac tggtgcggac caggggaatc 780 cgactgttta attaaaacaa agcatcgcga aggcccgcgg cgggtgttga cgcgatgtga 840 ttt 843

Claims

(a) 생물학적 시료로부터 2종 이상의 조직을 분리하는 단계;
(b) 상기 각 조직별 동종 28S rRNA에 대해, 28S rRNA의 5' 말단 영역 및 D8 영역 각각의 발현 수준을 산출하는 단계;
(c) 상기 5' 말단 영역 및 D8 영역의 상대적 발현 수준을 산출하는 단계; 및
(d) 상기 각 조직에 대해 산출된 상대적 발현 수준에 기초하여 사망시각을 추정하는 단계;를 포함하고,
상기 (b) 단계에서, 상기 28S rRNA의 5' 말단 영역 및 D8 영역 각각의 발현 수준은 하기 수학식 1을 통해 산출되는, 사후 경과시간 추정방법.
[수학식 1]
발현 수준(ΔCt) = Ct - Ct_t=0
상기 수학식 1에서 Ct는 측정 시점의 순환임계값(cycle threshold value)이고, Ct_t=0은 사망 시점의 순환임계값이다.
제1항에 있어서,
상기 조직은 뇌, 폐, 근육 및 간으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 조직인, 사후 경과시간 추정방법.
제1항에 있어서,
상기 (c) 단계에서, 상기 5' 말단 영역 및 D8 영역의 상대적 발현 수준은 하기 수학식 2를 통해 산출되는, 사후 경과시간 추정방법.
[수학식 2]
상대적 발현 수준 = ΔCt_{(5' 말단 영역)} - ΔCt_{(D8 영역)}
상기 수학식 2에서 ΔCt_{(5' 말단 영역)}은 5' 말단 영역의 ΔCt 값이고, ΔCt_{(D8 영역)}은 D8 영역의 ΔCt 값이다.
제3항에 있어서,
상기 (d) 단계는 상기 각 조직에 대해 상대적 발현 수준으로 표시되는 각 함수의 교차점을 사망시각으로 추정하는, 사후 경과시간 추정방법.
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