KR20200055137A - 액체 생검으로부터의 msi (msi from liquid biopsies) - Google Patents

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Abstract

종양 조직이 필요없는 고형 종양에서의 MSI 검출 방법이 제시된다. 특히 바람직한 방법에서, 환자로부터의 혈액 샘플은 혈청으로부터 ctDNA를 및 백혈구로부터 핵 DNA를 단리하는 데 사용된다. 이렇게 수득된 DNA는 이어서, 전형적으로 하나 이상의 MSI 유전자좌의 증폭을 통해, MSI 검출을 위한 공급원 물질로서 사용된다. 특히 바람직한 양태에서, 앰플리콘의 크기 분석은 형광 마커에 대한 필요 없이 수행된다.

Description

액체 생검으로부터의 MSI (MSI FROM LIQUID BIOPSIES)
본 출원은 참조로서 본원에 포함된, 2017년 10월 19일 출원된, 출원 번호 62/574,718을 갖는 우리의 동시계류중인 US 특허 가출원에 대한 우선권을 주장한다.
발명의 분야
본 발명의 분야는 암과 관련이 있다는 점에서, 특히 혈액 및 다른 생물학적 유체로부터의 고형 종양 세포에서의 미소부수체(microsatellite) 불안정성(MSI) 식별과 관련이 있다는 점에서 오믹스(omics) 데이터의 프로파일링이다.
배경 기술 기재는 본 발명을 이해하는 데에 있어서 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 본원에 제공된 정보 중 어느 것도 종래 기술이거나 현재 청구된 발명과 관련이 있는, 또는 명확하게 또는 암시적으로 참조된 어떤 간행물도 종래 기술이라는 인정이 아니다.
본원의 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 명확하고 개별적으로 참조로서 포함되는 것으로 표시되는 것과 동일한 정도로 참조로서 포함된다. 포함되는 참조에서 용어의 정의 또는 사용이 본원에 제공되는 그 용어의 정의와 불일치하거나 상반되는 경우, 본원에 제공되는 그 용어의 정의가 적용되며 참조에서의 그 용어의 정의는 적용되지 않는다.
미소부수체는 전형적으로 1개 내지 6개의 염기쌍 길이를 갖는, 짧은 연쇄 반복 DNA 서열이다. 이들 반복은 게놈 전체에 걸쳐 분포되어 있으며, 각각의 유전자좌에서의 연쇄 반복의 수의 차이로 인해, 종종 개체마다 길이가 다르다. 보다 최근에, 미소부수체 마커는 게놈 불안정성의 한 형태인, MSI(미소부수체 불안정성; microsatellite instability)를 검출하는 데 사용되었다. MSI는 DNA 복제 동안의 반복 단위의 삽입 또는 결실 및 이들 오류를 교정하는 DNA 미스매치 수선 시스템의 고장으로 인한 미소부수체 대립유전자의 길이 변화를 특징으로 한다.
전형적으로, MSI 분석은 매칭되는 정상 및 테스트 샘플로부터 DNA 증폭에 의해 생성된 미소부수체 마커의 대립유전자 프로파일을 비교하는 것을 포함하며, 이는 미스매치-수선(MMR) 결함일 수 있다. 테스트 샘플에는 존재하지만 상응하는 정상 샘플에는 존재하지 않는 대립유전자는 MSI를 나타낸다. 통상적으로, MSI 분석에 포함되는 모노뉴클레오티드 반복 마커는 미스매치 수선 결함을 함유하는 샘플에서의 변경에 대한 높은 민감도 및 특이성을 위해 선택되며, 가장 바람직하게는 이러한 모노뉴클레오티드 반복 마커는 준-단형성이다(즉, 거의 모든 개체(예를 들어, 개체의 적어도 90%, 보다 전형적으로는 적어도 95%)가 주어진 마커에 대한 동일한 공통의 대립유전자에 대해 동형접합성이다). 용이하게 인식될 바와 같이, 준-단형성 또는 단형성 마커의 사용은 데이터 해석을 단순화하고, MSI를 식별하기 위해 당업계에 공지된 수많은 적합한 유전자좌가 있다. 예를 들어, 적합한 유전자좌는 US 6150100, US 7662595, US 2003/0113723, US 2015/0337388, 및 WO 2017/112738에 기재되어 있다.
선택된 유전자좌로부터 MSI를 검출하는 당업계에 공지된 수많은 방법이 또한 있으며 가장 전형적으로는 PCR 기반 방법을 포함한다. 예를 들어, 상업적으로 이용 가능한 MSI 분석용 테스트 키트는 프로메가 코포레이션(Promega Corporation)(2800 Woods Hollow Road, Madison, WI 53711-5399 USA)에 의해 제공된다. 대안적으로, MSI는 US 2017/0032082에 기재된 특정 오믹스 분석으로부터 추론될 수 있다.
MSI 분석을 위한 대부분의 샘플은 수술 또는 생검 유래의 가공하지 않은 조직 샘플, 또는 포르말린-고정, 파라핀-포매된(FFPE) 샘플이다. 그러나, 파라핀에 포매하기 전 조직 샘플의 장기적인 또는 부적절한 고정으로 인해 DNA가 종종 분해되기 때문에 FFPE 샘플로부터 충분한 고-품질 DNA를 수득하는 것은 문제가 될 수 있다. MSI를 검출하는 또 다른 시도는 문헌[In Vivo 28: 349-354(2014)]에 기재된 바와 같이 혈액 내의 전체 cfDNA 양을 MSI와 상관시킴으로써 이루어졌으나, 이 연구에서 MMR 능력있는 샘플과 MMR 결함 샘플 사이의 어떠한 상관 관계도 밝혀지지 않았다. 따라서, 다양한 시스템 및 방법이 MSI를 결정하는 것으로 알려져 있음에도 불구하고, 이들 모두 또는 거의 모두는 하나 이상의 불리한 점을 겪는다. 가장 전형적으로, 순도 및 안정성이 높은 샘플은 오직 침습적 절차 또는 수술을 이용하여 수득될 수 있는 반면, FFPE 샘플은 종종 순도 및/또는 안정성의 부족을 겪는다.
따라서, 특히 생물학적 샘플이 단순하고 안전한 방식으로 수득될 수 있는, 암에서 MSI를 분석하는 개선된 방법에 대한 필요가 남아 있다.
본 발명은 종양 샘플이 아닌 환자 샘플로부터의 MSI 검출하는 다양한 방법에 관한 것이다. 가장 유리하게는, MSI는 혈청 유래의 ctDNA 및 혈액 내 세포(가장 전형적으로 백혈구) 유래의 핵 DNA를 제공하는 단일 전혈 샘플로부터 검출될 수 있다. ctDNA 및 핵 DNA는 바람직하게는 각각 종양 및 매칭되는 정상에 대한 샘플로서 증폭 및 크기 결정을 위한 출발 물질로서 사용된다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명자들은 고형 종양을 갖는 환자의 혈액 샘플로부터 세포-함유 분획(바람직하게는 백혈구연층(buffy coat) 분획) 및 세포-제거된 분획을 단리하는 단계, 및 세포-제거된 분획으로부터 무-세포 순환 종양 DNA(ctDNA)를 단리하는 또 다른 단계를 포함하는 고형 종양에서 미소부수체 불안정성(MSI)을 검출하는 방법을 고려한다. 추가의 단계에서, 핵 DNA는 세포-함유 분획으로부터 단리되고, 적어도 하나의 MSI 유전자좌는 ctDNA 및 핵 DNA에서 증폭된다. 이어서 ctDNA에서 증폭된 MSI 유전자좌와 핵 DNA에서 증폭된 MSI 유전자좌 사이의 크기 차이가 검출된다.
가장 전형적으로, 적어도 하나의 MSI 유전자좌를 증폭시키는 단계는 적어도 3개의 MSI 유전자좌, 또는 적어도 5개의 MSI 유전자좌를 증폭시키는 것을 포함한다. 적어도 하나의 MSI 유전자좌는 준-단형성 또는 단형성 반복 마커인 것, 및/또는 적어도 하나의 MSI 유전자좌는 모노뉴클레오티드 반복 또는 디뉴클레오티드 반복을 포함하는 것이 추가로 고려된다. 예를 들어, 적합한 MSI 유전자좌로는 NR-21, BAT-26, BAT-25, NR-24, 및 모노(MONO)-27이 포함된다. 추가로 고려되는 양태에서, 크기 차이를 검출하는 바람직한 단계는 모세관 전기영동, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 질량 분광법, 칩-기반 미세유동적 전기영동(Methods Mol Biol. 2013; 919: 287-96), 또는 변성 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 수행된다. 추가적으로, 크기 차이를 검출하는 단계는 증폭된 MSI 유전자좌의 크로마토그램의 용출 프로파일에서의 피크 형상 및 위치를 비교하는 단계를 포함하는 것이 고려된다. 예를 들어, 피크 형상은 곡선 하 면적 및/또는 피크 높이이거나, 비교 단계는 독립적인 성분 분석 단계를 포함하는 것이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명자들은 고형 종양을 갖는 환자의 혈액 샘플로부터 종양 및 매칭되는 정상 DNA를 수득하는 단계, 및 MSI 분석을 위한 공급원 물질로서 혈액 샘플로부터의 종양 및 매칭되는 정상 DNA를 사용하는 추가의 단계를 포함하는 고형 종양에서 미소부수체 불안정성(MSI)을 검출하는 방법을 고려한다.
바람직하게는, 종양 DNA는 ctDNA이고/이거나, 매칭되는 정상 DNA는 백혈구 유래의 DNA이다. 더욱이, MSI 분석은 적어도 하나의 MSI 유전자좌의 PCR 증폭 단계를 포함하는 것, 및/또는 MSI 분석은 모세관 전기영동 및 형광 검출 단계를 포함하는 것이 고려된다. 대안적으로, MSI 분석은 형광 검출없이 크기 분리 크로마토그래피 단계를 포함할 수 있다.
상이한 관점에서 볼 때, 본 발명자들은 환자의 고형 종양에서 미소부수체 불안정성(MSI)의 검출을 위한 환자의 혈액 샘플로부터의 무-세포 순환 종양 DNA(ctDNA) 및 핵 DNA의 용도를 고려한다. 가장 전형적으로, 종양 DNA는 ctDNA이고, 매칭되는 정상 DNA는 백혈구 유래의 DNA이다. MSI 분석은 적어도 5개의 MSI 유전자좌의 PCR 증폭 단계를 포함하는 것, 및/또는 MSI 유전자좌는 준-단형성 또는 단형성 반복 마커인 것이 추가로 바람직하다. 이전과 같이, MSI의 검출은 형광 검출 없는 크기 분리 크로마토그래피 단계 및 증폭된 MSI 유전자좌의 크로마토그램의 용출 프로파일에서의 피크 형상 및 위치를 비교하는 단계를 포함하는 것이 고려된다.
본 발명의 다양한 목적, 특징, 양태 및 이점은 첨부 도면과 함께, 다음의 바람직한 구현예의 상세한 설명으로부터 보다 명백해질 것이다.
종래 기술 도 1은 모세관 겔 전기영동에 의해 분리된 상업적으로 이용 가능한 MSI 검출 키트를 사용하여 선택된 MSI 유전자좌에 대한 증폭 산물의 크기 분포를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 방법에 대한 예시적인 워크플로우(workflow)를 도시하는 개략도이다.
도 3은 종양 및 정상 미량을 이용한 미소부수체 안정(MSS)인 샘플의 일 예시적인 용출 프로파일이다.
도 4는 종양 및 정상 미량을 이용한 미소부수체 안정(MSS)인 샘플의 또 다른 예시적인 용출 프로파일이다.
도 5는 종양 및 정상 미량을 이용한 미소부수체 안정(MSS)인 샘플의 추가의 예시적인 용출 프로파일이다.
도 6은 종양 및 정상 미량을 이용한 낮은 미소부수체 불안정성(MSI-L)을 갖는 샘플의 예시적인 용출 프로파일이다.
도 7은 종양 및 정상 미량을 이용한 높은 미소부수체 불안정성(MSI-H)을 갖는 샘플의 예시적인 용출 프로파일이다.
도 8은 종양 및 정상 미량을 이용한 미소부수체 안정(MSS)을 갖는 샘플의 예시적인 용출 프로파일이다.
도 9는 종양 및 정상 미량을 이용한 높은 미소부수체 불안정성(MSI-H)을 갖는 샘플의 예시적인 용출 프로파일이다.
도 10은 종양 및 정상 미량을 이용한 미소부수체 안정(MSS)을 갖는 샘플의 예시적인 용출 프로파일이다.
도 11은 종양 및 정상 미량을 이용한 낮은 미소부수체 불안정성(MSI-L)을 갖는 샘플의 예시적인 용출 프로파일이다.
본 발명자들은 이제 환자 유래의 혈액 샘플을 사용함으로써 생검 또는 수술의 필요 없이 고형 종양에서의 MSI가 검출될 수 있음을 발견하였다. 바람직한 양태에서, 혈액 샘플은, 전형적으로 혈청으로부터 ctDNA 및, 전형적으로 백혈구연층으로부터 핵 DNA를 수득하기 위해 처리된다. 가장 전형적으로, ctDNA 및 핵 DNA는 동일한 채혈 또는 심지어 동일한 혈액 샘플로부터 수득될 수 있다. 이렇게 수득된 DNA는 이어서 하나 이상의 MSI 유전자좌의 증폭을 위한 공급원 물질로서 활용되며, 이어서 앰플리콘은 분석 속도를 증가시키고 비용을 감소시키는, 바람직하게는 형광 마커에 대한 필요 없는 크기 분석을 거친다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "종양"은 인체의 하나 이상의 해부학적 위치에서 배치되거나 발견될 수 있는, 하나 이상의 암 세포, 암 조직, 악성 종양 세포, 또는 악성 종양 조직을 지칭하고, 이와 상호교환적으로 사용된다. 본원에 사용되는 바와 같이, 약물 또는 암 치료를 "투여하는" 용어는 약물 또는 암 치료의 직접 및 간접 투여 둘 모두를 지칭한다. 약물 또는 암 치료의 직접 투여는 전형적으로 의료 전문가(예를 들어, 의사, 간호사, 등)에 의해 수행되며, 여기서 간접 투여는 직접 투여(예를 들어, 주사, 경구 섭취, 국소 도포, 등를 통해)를 위해 의료 전문가에게 약물 또는 암 치료를 제공하거나 이용 가능하게 하는 단계를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "환자"는 질환(예를 들어, 암)으로 진단된 개체뿐만 아니라 질환을 검출 또는 식별하기 위해 검사 및/또는 테스트를 받는 개체 둘 모두를 포함함에 유의해야 한다. 따라서, 종양을 갖는 환자는 암으로 진단된 개체뿐만 아니라 암을 갖는 것으로 의심되는 개체 둘 모두를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "제공하다" 또는 "제공하는"은 제조하는, 생성하는, 배치하는, 사용 가능하게 하는, 전달하는, 또는 사용 준비되도록 하는 임의의 행위를 지칭하고 포함한다.
종래의 MSI 검출 시스템은 전형적으로 가공되지 않은 생검 물질로부터 단리된 DNA 및 비-종양 조직으로부터의 매칭되는 정상 대조군 DNA 조제물을 사용한다. 이렇게 수득된 DNA는 이어서 표 1에 나타난 통상적인 MSI 유전자좌를 이용하여 MSI 유전자좌를 증폭시키는 데 사용된다. 예를 들어, 2 나노그램의 게놈 DNA를 증폭시키고 POP-4® 폴리머 및 36 cm 모세관을 갖는 ABI PRISM® 3100 유전적 분석기를 사용하여 분석하였으며, 정상 및 테스트 샘플의 결과로 생긴 대립유전자 패턴은 종래 기술 도 1에 나타난다. 정상 샘플에 존재하지 않았던 테스트 샘플의 새로운 대립유전자 존재(화살표로 표시됨)는 MSI를 나타낸다.
Figure pct00001
본 발명자들은 이제 FFPE 샘플, 가공되지 않은 종양 샘플, 또는 종양 생검 외의 다양한 물질이 생검 또는 수술과 비교하여 단순하고 환자에 대한 낮은 위험을 갖는 공정에서 사용될 수 있음을 발견하였다. 보다 구체적으로, 본 발명자들은 cfDNA를 포함하는 임의의 생물학적 유체, 특히 전혈이 적합함을 발견하였다. 유리하게는, 전혈은 단일 샘플에서 순환 종양 DNA 뿐만 아니라 비-종양 세포 유래(특히 백혈구 유래)의 핵 DNA 둘 모두를 제공할 것이다. 또한 추가로, 전혈은 또한 cfRNA/ctRNA의 공급원이며, 이는 종양 상태에 대한 추가 통찰력을 제공할 수 있음이 인식되어야 한다. 도 2는 혈액으로부터 고형 종양 내의 MSI 결정을 위한 예시적이고 개략적인 워크플로우를 도시한다. 여기서, 혈액 샘플은, 전형적으로 1 mL 내지 50 mL, 보다 전형적으로 5 mL 내지 10 mL의 부피로, 환자로부터 수득된다. 이어서 전혈 샘플은 혈장 분획 및 세포-함유 분획으로 분리되며, 이 중 백혈구연층은 핵 '매칭되는 정상' DNA의 단리를 위해 사용된다. ctDNA는 혈장 분획으로부터 단리되고, 이어서 선택된 MSI 유전자좌 상에서 종래의 방법을 사용하여 각각의 PCR 반응이 수행되어 앰플리콘을 수득한 다음 단편 크기 분석을 거친다.
용이하게 인식될 바와 같이, 단편 크기의 결정은 수많은 방식으로 수행될 수 있고, 모든 공지된 크기 결정 방식은 본원에 사용하기에 적합한 것으로 간주된다. 종래 기술 도 1은 형광 표지된 앰플리콘으로부터의 용출 프로파일을 도시하는 반면, 도 3 내지 도 7은 도 2에 개요된 절차를 사용하여 수득된 비표지된 앰플리콘으로부터의 용출 프로파일을 도시한다. 보다 구체적으로, 도 3 내지 도 5는 피크가 최대 위치에 의한 증거로서 실질적으로 동일한 위치를 갖고 피크가 또한 실질적으로 동일한 형상을 갖는 MSS 샘플의 앰플리콘으로부터의 용출 프로파일을 나타낸다. 대조적으로, 도 6은 피크 형상, 곡선-하-면적, 및/또는 최대 위치가 적어도 2개의 피크에 대해 변경된(106 대 109의 비는 109에서의 MSI 대립유전자의 상실 및 106에서의 대립유전자의 획득을 나타내고, 152 대 147의 비는 152 및 147에서의 대립유전자의 상실을 나타냄) MSI-L 샘플(즉, 낮은 등급의 MSI를 갖는 샘플)의 앰플리콘으로부터의 용출 프로파일을 나타낸다. 도 7은 MSI-L 샘플의 앰플리콘으로부터의 또 다른 용출 프로파일을 나타낸다. 여기서, 294 및 256에서의 대립유전자는 종양에서 실질적으로 상실되는 반면, 125 및 114에서의 대립유전자 상실이 있으며, 125에서 더욱 확연한 상실이 있다. MSI 샘플과의 MSS의 비교로부터 볼 수 있듯이, 크로마토그램의 용출 프로파일에서의 전체 피크 형상 및 피크 위치는 더 아래에 보다 상세하게 추가로 기재되는 바와 같이 MSI를 나타낼 수 있다.
예를 들어, MSI 대립유전자는 종양 cfDNA 및 핵 DNA 둘 모두로부터 증폭되어 약 110(염기 길이), 120, 128, 150, 및 230에서의 최대를 갖는 피크를 갖는 앰플리콘을 생산할 수 있다. 물론, 이러한 앰플리콘이 피크 시프트(shift)에 의해 분리되거나 달리 구별될 수 있는 피크 최대를 갖는 한 다양한 대안적인 앰플리콘이 생성될 수 있다. 단순화된 분리 및 검출 기술이 사용되는 경우, 단일-염기 차이의 분해능은 별개의 피크로서 명백하지 않을 것이나, 전체 피크 프로파일로 뒤얽힐 것임에 유의해야 한다. 이어서 이러한 피크 프로파일은 분석되어 최대 위치에서의 시프트(길이 상실을 나타냄), 형상에서의 시프트(길이 분포의 변화를 나타내며, 이는 대립유전자의 불완전한 상실 또는 단축으로 인한 것일 수 있음), 및/또는 매칭되는 정상 샘플 대비 피크 높이의 증가 또는 감소(이는 대립유전자 상실을 나타낼 수 있음)를 검출할 수 있다. 용이하게 인식될 바와 같이, 이러한 피크 분석은 의료 전문가에 의해, 보다 바람직하게는 이어서 MSI를 검출하고/하거나 MSI의 유형을 결정할 알고리즘(전형적으로 기계 학습 알고리즘)에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, cfDNA 및 핵 DNA 샘플이 피크 형상, 최대, 및/또는 또 다른 피크에 대한 비에 있어서 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 변화를 나타내는 경우, MSI 불안정성(예를 들어, MSI-높음)이 표시된다. 한편, cfDNA 및 핵 DNA 샘플이 피크 형상, 최대, 및/또는 또 다른 피크에 대한 비에 있어서 1개 또는 2 개의 변화를 나타내는 경우, MSI 불안정성(예를 들어, MSI-낮음)이 표시되고, cfDNA 및 핵 DNA 샘플이 피크 형상, 최대, 및/또는 또 다른 피크에 대한 비에 있어서 하나의 변화를 나타내거나 또는 변화를 나타내지 않는 경우, MSI 안정성(예를 들어, MSI-낮음)이 표시된다.
용이하게 인식될 바와 같이, MSI 불안정성(낮음 또는 높음)의 검출 시, 환자는 MSI를 갖는 암의 치료에 적합한 하나 이상의 치료제를 투여받을 것이다. 예를 들어, 적합한 제제로는 다양한 체크포인트 저해제(예를 들어, 표적화 PD-1 또는 CTLA4 매개 신호전달), 재조합 백신(예를 들어, 바이러스, 효모, 또는 박테리아)을 사용하는 면역 요법, DNA 손상 제제(예를 들어, 5-FU 및/또는 옥살리플라틴, DNA 알킬화 또는 삽입 제제 등) 및/또는 DNA 수선(예를 들어, 미스매치 수선, 염기 절제 수선, 뉴클레오티드 절제 수선, 및 상동성 유도된 수선)에 개입하는 제제가 포함된다.
무세포 DNA/RNA의 단리 및 증폭
무세포 DNA/RNA를 단리 및 증폭시키는 임의의 적합한 방법이 고려된다. 가장 전형적으로, 무세포 DNA/RNA는, 무세포 RNA를 안정화시키는 조건을 포함하여, 적합한 조건 하에서 처리되는 체액(예를 들어, 전혈)으로부터 단리된다. 바람직하게는, 무세포 DNA 및 RNA 둘 모두는 동일한 샘플 또는 환자 체액 채집으로부터 동시에 단리된다. 그러나, 체액 샘플은 DNA 또는 RNA가 개별적으로 단리될 수 있는 둘 이상의 더 작은 샘플로 나눠질 수 있음이 또한 고려된다. 비-핵산 성분으로부터 일단 분리되면, 무세포 DNA 또는 RNA는 이어서, 바람직하게는 실시간, 정량적 PCR 또는 실시간, 정량적 RT-PCR을 사용하여 정량된다.
환자의 체액은 오믹스 분석의 목적에 따라 임의의 원하는 시점(들)에서 수득될 수 있다. 예를 들어, 환자의 체액은 무세포 DNA/RNA 데이터를 암 및 MSI 상태의 예후와 관련시키기 위해 환자가 종양을 갖는 것으로 확인되기 전 및/또는 후에 및/또는 그 후 주기적으로(예를 들어, 매주, 매월 등) 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 환자의 체액은 암 치료 전후(예를 들어, 화학 요법, 방사선 요법, 약물 치료, 암 면역 요법 등 전/후) 환자로부터 수득될 수 있다. 치료 유형 및/또는 암 유형에 따라 달라질 수 있지만, 환자의 체액은 암 치료 후 적어도 24시간, 적어도 3일, 적어도 7일에 수득될 수 있다. 보다 정확한 비교를 위해, 암 치료 전 환자 유래의 체액은 암 치료 시작 전 1시간 미만, 6시간 미만 전, 24시간 미만 전, 1주일 미만 전에 수득될 수 있다. 추가로, 환자의 체액의 복수의 샘플은 암 치료 전 및/또는 후 기간 동안(예를 들어, 24시간 후 1일 1회 7일 동안 등) 수득될 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 건강한 개체의 체액은 무세포 DNA의 서열/변형, 및/또는 무세포 RNA의 양/서브타입 발현을 비교하기 위해 수득될 수 있다. 본원에 사용된 건강한 개체는 종양이 없는 개체를 지칭한다. 바람직하게는, 건강한 개체는 환자와 특징(예를 들어, 연령, 성별, 인종, 식이, 생활 환경, 가족력 등)을 공유하는 사람들의 그룹 중에서 선택될 수 있다.
무세포 DNA/RNA를 단리하기 위한 임의의 적합한 방법이 고려된다. 예를 들어, DNA 단리의 일 예시적인 방법에서, 시험관 내로 채혈된 전혈 10 ml로서 표본을 수용하였다. 무세포 DNA는 100 bps 내지 300 bps의 크기의 무세포 DNA를 분리해낼 수 있는 자기 비드를 사용하여 모노-뉴클레오솜 및 디-뉴클레오솜 복합체와는 다른 것으로부터 단리될 수 있다. RNA 단리의 또 다른 실시예에서, 각각 무세포 RNA BCT® 관 또는 RNA 안정화제를 함유하는 무세포 DNA BCT® 관 내로 채혈된 전혈 10 ml로서 표본을 수용하였다. 유리하게는, 무세포 RNA는 7일 동안 무세포 RNA BCT 관 내 전혈에서 안정한 반면 무세포 RNA는 14일 동안 무세포 DNA BCT 관 내 전혈에서 안정하여, 무세포 RNA의 분해 없이 전세계 위치로부터의 환자 샘플 운송을 위한 시간을 가능하게 한다. 더욱이, 무세포 RNA는 혈액 세포를 용해시키지 않을 또는 실질적으로 용해시키지 않을(예를 들어, 1% 이하, 또는 0.1% 이하, 또는 0.01% 이하, 또는 0.001% 이하) RNA 안정화 제제를 사용하여 단리되는 것이 일반적으로 바람직하다. 상이한 관점에서 볼 때, RNA 안정화 시약은 시약이 혈액과 결합된 후 혈청 또는 혈장 내의 RNA 양에서의 실질적 증가로 이어지지 않을 것이다(예를 들어, 총 RNA 10% 이하, 또는 5% 이하, 또는 2% 이하, 또는 1% 이하에서의 증가). 마찬가지로, 이들 시약은 또한 혈액 세포에서 발견되는 세포 RNA의 방출을 감소시키거나 심지어 제거하기 위해 혈액 내 세포의 물리적 완전성을 보존할 것이다. 이러한 보존은 분리되었을 수 있거나 분리되지 않았을 수 있는 수집된 혈액의 형태일 수 있다. 덜 바람직한 양태에서, 고려되는 시약은 2일, 보다 바람직하게는 적어도 5일, 가장 바람직하게는 적어도 7일 동안 수집된 혈액 외 조직에서 무세포 RNA를 안정화시킬 것이다. 물론, 다수의 다른 수집 양상이 또한 적절한 것으로 간주되고, 무세포 RNA는 적어도 부분적으로 정제되거나 고체상에 흡착되어 추가 가공 전에 안정성을 증가시킬 수 있음이 인식되어야 한다. 유사하게, 무세포 DNA 및 ctDNA는 상업적으로 이용 가능한 시약 및 방법을 사용하여 단리될 수 있으며, 특히 바람직한 키트 및 방법으로는 셀-프리(CELL-FREE) DNA BCT(Streck Inc., 7002 S. 109th Street, La Vista, NE 68128)가 포함된다.
따라서, 혈장의 분별 및 무세포 DNA/RNA의 추출은 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 일 예시적인 바람직한 양태에서, 10 mL 관 내의 전혈이 1600 rcf에서 20 분 동안 원심 분리되어 혈장을 분별한다. 이렇게 수득된 혈장은 이어서 분리되고 16,000 rcf에서 10분 동안 원심 분리되어 세포 잔해물을 제거한다. 물론, 원심 분리가 실질적인 세포 용해로 이어지지 않는 한(예를 들어, 모든 세포의 1% 이하, 또는 0.1% 이하, 또는 0.01% 이하, 또는 0.001% 이하의 용해), 다양한 대안적인 원심 분리 프로토콜이 또한 적합한 것으로 간주된다. 무세포 RNA는 키아젠(Qiagen) 시약을 사용하여 2 mL의 혈장으로부터 추출된다. 추출 프로토콜은 잠재적으로 오염시키는 혈액 세포, 기타 불순물을 제거하고, 추출 동안 핵산의 안정성을 유지하도록 설계하였다. DNA를 -4℃에 보관하고 RNA를 -80℃에 보관하거나 cDNA로 역-전사된 것을 이어서 -4℃에 보관하며 모든 핵산을 바-코딩된 매트릭스 저장 관에 보관하였다. 특히, 이렇게 단리된 무세포 RNA는 추가 가공 전에 동결될 수 있다.
용이하게 인식될 바와 같이, 세포-함유 분획, 특히 백혈구연층(큰 분획의 백혈구를 함유)은 잘 알려진 프로토콜에 따라 핵 DNA를 단리하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, J Transl Med. 2011 Jun 10; 9:91 참고). 대안적으로, 또는 추가로, 다양한 상업적으로 이용 가능한 키트가 사용될 수 있으며, 키아앰프(QIAamp) DNA 혈액 미니 키트(Qiagen, 1700 Seaport Blvd, 3rd Floor, Redwood City, CA 94063)가 포함된다.
ctDNA 유래의 MSI-유전자좌, 증폭, 및 크기 결정
적합한 MSI 유전자좌와 관련하여 본 발명자들은 임의의 공지된 MSI 유전자좌가 본원에서 사용하기에 적합한 것으로 간주됨을 고려한다. 그러나, 특히 바람직한 MSI 유전자좌는 모노- 및 디-뉴클레오티드 반복 마커, 가장 바람직하게는 미스매치 수선 결함 관련된 것들을 포함한다. 따라서, 그리고 상이한 관점에서 볼 때, 고려되는 반복 마커는 준-단형성이다(즉, 거의 모든 개체(예를 들어, 개체의 적어도 90%, 보다 전형적으로는 적어도 95%)가 주어진 마커에 대한 동일한 공통의 대립유전자에 대해 동형접합성이다). 적합한 유전자좌는 본원에 참조로서 포함된 US 6150100, US 7662595, US2003/0113723, US 2015/0337388, 및 WO 2017/112738 모두에 기재되어 있다. 따라서, 예시적인 반복으로는 NR-21, BAT-26, BAT-25, NR-27, NR-24, D2S123, D5S346, D17S250, BAT40, MONO-27, 펜타(Penta) C, 펜타 D, D 18535, D1S2883 등이 포함된다.
구체적인 반복 서열/MSI 유전자좌에 따라, 증폭 조건은 예상될 수 있는 바와 같이 달라질 수 있다. 그러나, 특정 MSI 유전자좌에 대한 구체적인 PCR 조건은 과도한 실험 없이 용이하게 확인 가능할 것이다. 예를 들어, NR-21, BAT26, BAT-25, NR-24, 및 모노-27의 증폭을 위한 PCR 조건 및 시약은 프로메가 사(Promega Corp.)에서 상업적으로 이용 가능한 MSI 분석 시스템의 제품 설명서에 기재되어 있다. 이 맥락에서, 증폭 시약은 형광 또는 달리 표지된 뉴클레오티드를 포함할 수 있거나, 검출 가능한 마커 없이 수행될 수 있음이 인식되어야 한다. 따라서, 검출 방식이 달라질 것이다.
일반적으로, 앰플리콘의 크기 결정을 위해, 증폭된 산물은 앰플리콘의 크기 범위에서 충분한 분해능을 제공하는 크로마토그래피 단계를 거칠 것이 고려된다. 예를 들어, 적합한 단편 크기 결정은 모세관 전기영동(예를 들어, ABI PRISM 310 또는 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 3130 유전적 분석기를 사용하여), 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 질량 분광법, 칩-기반 미세유동적 전기영동(Methods Mol Biol. 2013; 919: 287-96), 및 변성 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 수행될 수 있다. 일반적으로, 크기 결정은 대립유전자 크기 분포에서의 시프트를 검출하기 위해 환자 매칭되는 정상 샘플과 병행하여 수행됨이 고려된다. 이러한 크기 결정 및 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며 과도한 실험을 필요로 하지 않는다.
비-형광성 앰플리콘의 사용에 의해 고려되는 시스템 및 방법에 추가의 개선이 더해질 수 있다. 종래 기술 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 각각의 앰플리콘 크기에 대한 형광 신호는 단일 염기쌍 수준으로 분해되고 독립적인 신호를 생산한다. 그러나, UV 검출, 전류 측정 검출 등과 같은, 다른 검출 방법이 사용될 때 이러한 분해능은 전형적으로 상실된다. 그럼에도 불구하고, 비-형광성 방법이 사용될 때, 개별 피크는 최종 신호에 겹쳐질 것이며, 이는 방정식 I 및 II에 나타난 바와 같이 수학적으로 서술될 수 있다
f(x) = [f1(x), f2(x), ..., fn(x)] 방정식 I
최종 규모 신호는 독립 신호의 중첩으로서 표현될 수 있다:
ff = [ff1, ff2, ..., ffn ] 방정식 II
g(x) = ff.f(x)
각각의 개별 피크의 최종 신호(상기 방정식에 따라 계산된 값)는 컷-오프 값 30%에 대해 비교될 것이다. 그 값이 30% 이상인 경우 개별 피크는 시프트로 결정될 것이다. 2개 이상의 피크 시프트는 샘플의 상태를 MSI 높음으로 결정할 것이다(도 8 내지 도 11 참고).
본 발명자들은 이제, 충분한 훈련 데이터가 이용 가능하다면, 독립적인 성분 분석을 이용하여 독립적인 신호가 회복될 수 있음을 고려한다. 선형 중첩 및 다른 방법이 이용될 수 있는 반면, 신경 네트워크는 신호가 고정된 크기 특징으로 변환될 수 있기 때문에 보다 유리한 선택일 수 있다.
예를 들어, 규칙 기반 시스템에서, 다음 절차가 사용될 수 있다: (a) 기준 및 테스트 샘플 둘 모두에 대한 모든 최대 및 최소를 찾는다; (b) 피크의 특질을 확실하게 한다; (c) 기준 샘플에 대한 주 피크를 찾는다; (d) 테스트 샘플에 대해 기준 피크를 기반으로 주 피크를 찾는다; (e) 피크 값 비(이전(prev), 현재(curr)), (현재, 이후(next)), 피크 면적 비, 및 피크 폭과 같은 각각의 주 피크와 관련된 정보를 컴퓨터로 계산한다; (f) 각각의 테스트 주 피크에 대한 확률을 컴퓨터로 계산한다; 및 (g) 피크 확률을 기반으로 MSI-H, MSI-L, 또는 MSS 확률을 평가한다. 이러한 접근은 전형적으로 훈련 샘플을 필요로 하지 않을 것이며 데이터에 대한 이해를 개선시키는 데 사용될 수 있다.
또 다른, 보다 바람직한 실시예에서, 수 작업 특징(hand crafted feature) 기반 시스템이 이용될 수 있으며, 여기서 특징 벡터는 각각의 주 피크에 대한 다음의 양을 포함한다: 피크 값, 피크 폭, 피크 면적, (이전, 현재), (현재, 이후) 사이의 피크 값 비, 및 (이전, 현재), (현재, 이후) 사이의 피크 면적 비. 따라서, 이 실시예에서의 특징 벡터 크기는 5 개의 주 피크에 대해 5*5 = 25가 될 것이다. 지원 벡터 방법 또는 랜덤 포레스트(Random Forest)를 사용하여 분류가 수행될 수 있다. 가장 통상적으로, 훈련 샘플 크기는 100개 샘플을 초과할 것이다.
대안적으로, 미가공 특징 기반 시스템이 이용될 수 있다. 예를 들어, 특징 벡터는 삼차 스플라인 보간법(cubic spline interpolation)을 이용한, 모든 형광 판독을 포함할 수 있어 데이터가 염기쌍 크기([80, 250] 사이, 특징 크기는 170)로 균등하게 분배된다. 샴(Siamese) 신경 네트워크는 하나의 완전히 연결된 네트워크로서 기준 샘플과, 그리고 제2의 완전히 연결된 네트워크로서 테스트 샘플과 사용될 수 있다. 가장 통상적으로, 훈련 샘플 크기는 1,000개 샘플을 초과할 것이다. 도 8 내지 도 11은 형광 마커 사용 없는 앰플리콘에 대한 용출 프로파일(예를 들어, 애질런트(Agilent) 2100 바이오분석기 상의 미세유체 기반 온-칩(on-chip) 전기영동)을 도시한다. 여기서, 고형 종양(결장직장 암)을 갖는 환자 유래의 혈액 샘플 및 알려진 종양 MSI 상태(종래의 방법을 사용하여 가공되지 않은 종양 샘플로부터 사전 확립됨)를 수득하였다. cfDNA 및 핵 DNA를 상기 언급된 바와 같이 제조하고 공지된 방법에 따라 증폭된 MSI 대립유전자를 선택하였다. 상기 기재된 이미지 분석을 시행하였고 용출 프로파일에서 검출된 가장 두드러진 피크 특징이 도 8 내지 도 11에 예시적으로 도시되어 있다. 보다 구체적으로, 도 8 및 도 10은 미소부수체 안정성(MSS)의 예를 도시한다. 도 9는 높은 미소부수체 불안정성(MSI-H)의 일 예를 도시하나, 도 11은 낮은 미소부수체 불안정성(MSI-L)의 일 예를 도시한다.
cfRNA 분석을 위한 다른 관심 서열
본 발명자들은 종양 세포 및/또는 종양 세포와 상호 작용하거나 이를 둘러싼 일부 면역 세포가 환자의 체액으로 무세포 DNA/RNA를 방출하여, 건강한 개체와 비교하여 환자의 체액 내 특정 무세포 DNA/RNA의 양을 증가시킬 수 있음을 추가로 고려한다. 상기 언급한 바와 같이, 환자의 체액으로는 환자의 혈액, 혈청, 혈장, 점액, 뇌척수액, 복수액, 타액, 및 소변이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 대안적으로, 무세포 DNA/RNA가 이러한 유체에 존재하는 한, 다양한 다른 체액이 또한 적절한 것으로 간주됨에 유의해야 한다. 환자의 체액은 가공되지 않거나 보존/동결될 수 있다. 적절한 유체로는 타액, 복수액, 척수액, 소변 등이 포함되며, 이는 가공되지 않거나 보존/동결될 수 있다.
무세포 RNA는 세포체 또는 핵 내에 둘러싸이지 않고 사람의 체액 내에서 순환하는 임의의 유형의 DNA/RNA를 포함할 수 있다. 가장 전형적으로, 무세포 DNA/RNA의 공급원은 종양 세포이다. 그러나, 무세포 DNA/RNA의 공급원은 면역 세포(예를 들어, NK 세포, T 세포, 대식세포 등)임이 또한 고려된다. 따라서, 무세포 DNA/RNA는 순환 종양 DNA/RNA(ctDNA/RNA) 및/또는 순환 유리 DNA/RNA(cfDNA/RNA, 종양으로부터 유래하지 않은 순환 핵산)일 수 있다. 특정 이론에 얽매이기 원하지 않지만, 종양 세포가 면역 세포와 상호 작용할 때 또는 종양 세포가 세포 사멸(예를 들어, 괴사, 아폽토시스, 자가 포식 등)을 겪을 때 종양 세포로부터 기원한 무세포 DNA/RNA의 방출이 증가될 수 있음이 고려된다. 따라서, 일부 구현예에서, 무세포 DNA/RNA는 (예를 들어, 세포질 물질의 엑소좀 방출을 통해) 소포 구조 내에 둘러싸일 수 있어 일부 유형의 체액에서 뉴클레아제(예를 들어, RNA아제) 활성으로부터 보호될 수 있다. 그러나, 다른 양태에서, 무세포 DNA/RNA는 임의의 막 구조에 둘러싸이지 않은 네이키드(naked) DNA/RNA이나, 그 자체로 안정한 형태이거나 하나 이상의 비-뉴클레오티드 분자(예를 들어, 임의의 RNA 결합 단백질 등)와의 상호 작용을 통해 안정화될 수 있음이 또한 고려된다.
상기를 고려하여, 무세포 DNA/RNA는 암 세포 또는 면역 세포로부터 방출될 수 있는 임의의 유형의 DNA/RNA일 수 있음이 고려된다. 따라서, 무세포 DNA는 임의의 전체 또는 단편화된 게놈 DNA, 또는 미토콘드리아 DNA를 포함할 수 있고, 무세포 RNA는 mRNA, tRNA, 마이크로 RNA, 작은 간섭 RNA, 긴 비-코딩 RNA(lncRNA)를 포함할 수 있다. 가장 전형적으로, 무세포 DNA는 전형적으로 적어도 50개 염기쌍(bp), 100 개 염기쌍(bp), 200 bp, 500 bp, 또는 1 kbp의 길이를 갖는 단편화된 DNA이다. 또한, 무세포 RNA는 mRNA의 전장 또는 단편(예를 들어, 전장의 적어도 70%, 전장의 적어도 50%, 전장의 적어도 30% 등)임이 고려된다. 무세포 DNA/RNA는 임의의 세포, 세포외 단백질 또는 비-단백질 요소를 인코딩하는 임의의 유형의 DNA/RNA를 포함할 수 있는 반면, 무세포 DNA/RNA의 적어도 일부는 하나 이상의 암-관련 단백질, 또는 염증-관련 단백질을 인코딩하는 것이 바람직하다. 또 다른 실시예에서, 대안적 또는 추가로 고려되는 cfDNA/mRNA는 HMGB1, HMGB2, HMGB3, MUC1, VWF, MMP, CRP, PBEF1, TNF-α, TGF-β, PDGFA, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL- 10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, 에오탁신, FGF, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, IP-10, MCP-1, PDGF, 및 hTERT를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 염증-관련 단백질의 전장 또는 단편을 인코딩하는 것들 또는 그의 단편이고, 또한 또 다른 실시예에서, 무세포 mRNA는 HMGB1의 전장 또는 단편을 인코딩하였다. 또한 또 다른 실시예에서, 무세포 DNA/mRNA는 염기 절제 수선(BER) 관련 유전자, 미스매치 수선(MMR) 관련 유전자, 뉴클레오티드 절제 수선(NER) 관련 유전자, 상동 재조합(HR), 및 비-상동 말단-접합(NHEJ) 관련 유전자와 같은, DNA 수선-관련 단백질 또는 RNA 수선-관련 단백질의 전장 또는 단편을 인코딩하는 것들 또는 그의 단편이다.
원하는 경우, 무세포 DNA/mRNA는 전사 인자(예를 들어, ATF1, ATF2, ATF4, ATF6, ATF7, ATFIP, BTF3, E2F4, ERH, HMGB1, ILF2, IER2, JUND, TCEB2 등), 리프레서(예를 들어, PUF60), RNA 스플라이싱(예를 들어, BAT1, HNRPD, HNRPK, PABPN1, SRSF3 등), 번역 인자(EIF1, EIF1AD, EIF1B, EIF2A, EIF2AK1, EIF2AK3, EIF2AK4, EIF2B2, EIF2B3, EIF2B4, EIF2S2, EIF3A 등), tRNA 신테타제(예를 들어, AARS, CARS, DARS, FARS, GARS, HARS, IARS, KARS, MARS 등), RNA 결합 단백질(예를 들어, ELAVL1 등), 리보솜 단백질(예를 들어, RPL5, RPL8, RPL9, RPL10, RPL11, RPL14, RPL25 등), 미토콘드리아 리보솜 단백질(예를 들어, MRPL9, MRPL1, MRPL10, MRPL11, MRPL12, MRPL13, MRPL14 등), RNA 폴리메라제(예를 들어, POLR1C, POLR1D, POLR1E, POLR2A, POLR2B, POLR2C, POLR2D, POLR3C 등), 단백질 가공(예를 들어, PPID, PPI3, PPIF, CANX, CAPN1, NACA, PFDN2, SNX2, SS41, SUMO1 등), 열 충격 단백질(예를 들어, HSPA4, HSPA5, HSBP1 등), 히스톤(예를 들어, HIST1HSBC, H1FX 등), 세포 주기(예를 들어, ARHGAP35, RAB10, RAB11A, CCNY, CCNL, PPP1CA, RAD1, RAD17 등), 탄수화물 대사(예를 들어, ALDOA, GSK3A, PGK1, PGAM5 등), 지질 대사(예를 들어, HADHA), 시트르산 회로(예를 들어, SDHA, SDHB 등), 아미노산 대사(예를 들어, COMT 등), NADH 데하이드로게나제(예를 들어, NDUFA2 등), 시토크롬 c 옥시다제(예를 들어, COX5B, COX8, COX11 등), ATP아제(예를 들어 ATP2C1, ATP5F1 등), 리소좀(예를 들어, CTSD, CSTB, LAMP1 등), 프로테아솜(예를 들어, PSMA1, UBA1 등), 세포골격 단백질(예를 들어, ANXA6, ARPC2 등), 및 세포기관 합성(예를 들어, BLOC1S1, AP2A1 등)과 관련된 것을 포함하는, 질병과 관련되지 않은 유전자(예를 들어, 하우스키핑 유전자)의 전장 또는 단편을 인코딩하는 것들 또는 그의 단편이다.
본원에서 본 발명의 개념을 벗어나지 않고서 이미 기재된 것들 외에 다수의 더 많은 변형이 가능함이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구범위의 범위에서를 제외하고는 제한되지 않아야 한다. 더욱이, 명세서 및 청구범위 둘 모두를 해석함에 있어서, 모든 용어는 문맥과 일치하는 가능한 가장 넓은 방식으로 해석되어야 한다. 구체적으로, 용어 "포함한다" 및 "포함하는"은 비-배타적인 방식으로 요소, 성분, 또는 단계를 언급하는 것으로 해석되어야 하며, 언급된 요소, 성분, 또는 단계가 명시적으로 언급되지 않은 다른 요소, 성분, 또는 단계와 함께 존재하거나, 활용되거나, 조합될 수 있음을 나타낸다. 본원의 설명에서 및 뒤따르는 청구범위 전체에서 사용된 "a", "an," 및 "the"의 의미는 문맥이 분명히 달리 지시하지 않는 한 복수의 언급을 포함한다. 또한, 본원의 설명에서 사용된 "in"의 의미는 문맥이 분명히 달리 지시하지 않는 한 "in" 및 "on"을 포함한다. 명세서 청구범위가 A, B, C ... 및 N으로 구성된 군으로부터 선택되는 것 중 적어도 하나를 언급하는 경우, 본문은 A 더하기 N, 또는 B 더하기 N, 등이 아니고, 그룹으로부터의 오직 하나의 요소를 요구하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (15)

  1. 고형 종양을 갖는 환자의 혈액 샘플로부터 세포-함유 분획 및 세포-제거된 분획을 단리하는 단계;
    세포-제거된 분획으로부터 무-세포 순환 종양 DNA(ctDNA)를 단리하는 단계;
    세포-함유 분획으로부터 핵 DNA를 단리하는 단계;
    ctDNA 및 핵 DNA에서 적어도 하나의 MSI 유전자좌를 증폭시키는 단계; 및
    ctDNA에서 증폭된 MSI 유전자좌와 핵 DNA에서 증폭된 MSI 유전자좌 사이의 크기 차이를 검출하는 단계를 포함하는, 고형 종양에서 미소부수체 불안정성(MSI)을 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 세포-함유 분획은 백혈구연층(buffy coat) 분획인, 방법.
  3. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 MSI 유전자좌를 증폭시키는 단계는 적어도 3개의 MSI 유전자좌를 증폭시키는 단계 또는 적어도 하나의 MSI 유전자좌를 증폭시키는 단계는 적어도 5개의 MSI 유전자좌를 증폭시키는 단계 중 적어도 하나의 단계를 포함하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 MSI 유전자좌가 준-단형성 또는 단형성 반복 마커이거나, 또는
    적어도 하나의 MSI 유전자좌가 모노뉴클레오티드 반복 또는 디뉴클레오티드 반복을 포함하는, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 MSI 유전자좌는 NR-21, BAT-26, BAT-25, NR-24, 및 모노(MONO)-27로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 크기 차이를 검출하는 단계는 모세관 전기영동, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 질량 분광법, 칩-기반 미세유동적 전기영동, 및 변성 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 수행되는, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 크기 차이를 검출하는 단계는 증폭된 MSI 유전자좌의 크로마토그램의 용출 프로파일에서의 피크 형상 및 위치를 비교하는 단계를 포함하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 피크 형상은 곡선 하 면적 또는 피크 높이 중 적어도 하나를 포함하거나, 또는
    비교하는 단계는 독립적인 성분 분석 단계를 포함하는, 방법.
  9. 고형 종양을 갖는 환자의 혈액 샘플로부터 종양 및 매칭되는 정상 DNA를 수득하는 단계;
    MSI 분석을 위한 공급원 물질로서 혈액 샘플로부터의 종양 및 매칭되는 정상 DNA를 사용하는 단계를 포함하는, 고형 종양에서 미소부수체 불안정성(MSI)을 검출하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 종양 DNA는 ctDNA이고, 매칭되는 정상 DNA는 백혈구 유래의 DNA인, 방법.
  11. 제9항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, MSI 분석이 적어도 하나의 MSI 유전자좌의 PCR 증폭 단계를 포함하거나, 또는
    MSI 분석이 모세관 전기영동 및 형광 검출 단계 중 적어도 하나의 단계를 포함하는, 방법.
  12. 제9항에 있어서, MSI 분석은 형광 검출없이 크기 분리 크로마토그래피 단계를 포함하는, 방법.
  13. 환자의 고형 종양에서 미소부수체 불안정성(MSI)의 검출을 위한 용도를 가지는 환자의 혈액 샘플로부터의 무-세포 순환 종양 DNA(ctDNA) 및 핵 DNA.
  14. 제13항에 있어서, 종양 DNA는 ctDNA이고, 매칭되는 정상 DNA는 백혈구 유래의 DNA이거나, 또는
    MSI 분석은 적어도 5개의 MSI 유전자좌의 PCR 증폭 단계를 포함하는, 무-세포 순환 종양 DNA(ctDNA) 및 핵 DNA.
  15. 제13항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 MSI 유전자좌는 준-단형성 또는 단형성 반복 마커이거나, 또는
    상기 용도는 MSI의 검출은 형광 검출 없는 크기 분리 크로마토그래피 단계 및 증폭된 MSI 유전자좌의 크로마토그램의 용출 프로파일에서의 피크 형상 및 위치를 비교하는 단계를 포함하는, 무-세포 순환 종양 DNA(ctDNA) 및 핵 DNA.
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