CN104561251A - 用于细胞凋亡调解子基因(bim)缺失突变的检测方法及其检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属分子生物学和医学领域，涉及一种检测细胞凋亡调解子基因(BIM)缺失突变的方法及其检测试剂盒，本发明提供了一种检测细胞凋亡调解子基因(BIM)缺失突变的方法，它包括检测BIM基因上第三、第四外显子之间内含子上2903bp缺失的检测。本发明还公开了相应的检测试剂盒，该试剂盒还含有扩增BIM上2903bp缺失区域的引物。利用本发明检测BIM缺失情况，方法简单易行，快速高效，成本低廉。

Description

用于细胞凋亡调解子基因(BIM)缺失突变的检测方法及其检测试剂盒

技术领域

本发明属分子生物学和医学领域，涉及细胞凋亡调解子基因(BIM)缺失突变的检测方法及其检测试剂盒，具体涉及一种用于检测BIM基因第三、第四外显子之间的内含子上2903bp缺失突变的检测方法及其检测试剂盒。 

背景技术

现有技术公开了BIM基因是编码细胞凋亡基因BCL2蛋白家族中的一个成员,在细胞凋亡中发挥重要的调节作用。研究表明BIM基因外显子3和外显子4之间存在的2903bp的缺失会造成BIM亚型BH3结构缺乏表达。而这种缺乏表达会导致肺癌病人对部分治疗药物有更强的耐药性。有研究表明，在癌症病人体内，这种删除与药物反应的持续时间相关联，并且能够被用来预测病人在没有疾病恶化时的存活时间，如携带这种删除突变的患者的平均无疾病恶化存活期限为大约6个半月时间，而没有这种突变的患者则为12个月左右。因此，业内认为BIM缺失的检测对于肺癌患者有相当重要的现实意义。 

目前，临床实践中对BIM基因突变检测的方法主要包括：电泳、测序、变性高效液相色谱（DHPLC）、荧光定量PCR法、基因芯片、液相芯片等方法。其中，测序法由于可以读到DNA每个碱基的变化，目前被认为是检测基因突变的金标准方法，但因为该方法存在灵敏度低的缺陷，检测异质性较高的临床肿瘤组织样本时假阴性率高，同时，还存在测序步骤繁琐、耗时长，对设备和操作人员要求较高等缺陷，因此，不易形成标准化操作的临床诊断产品。另外，DHPLC、基因芯片、液相芯片等方法也存在操作复杂，对设备要求高等缺陷，因此，目前仅应用用科研单位实验室。 

综上所述，为了临床最终实现治疗肺癌的目标，本领域迫切需要寻求简单易行，快速高效的检测肺癌相关基因的方法、试剂盒，以及相关治疗药物。 

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种检测（包括早期诊断）BIM基因缺失情况的方法及其检测试剂盒。具体涉及一种检测细胞凋亡调解子基因(BIM)缺失突变的方法及其检测试剂盒，尤其是检测BIM基因上第三、第四外显子之间内含子上2903bp缺失突变的方法及其检测试剂盒。 

本发明方法简单易行，快速高效，成本低廉。 

本发明的一种检测BIM基因缺失情况的方法,具体即检测BIM基因第三、第四外显子之间的内含子上2903bp缺失突变情况，缺失型个体相对普通人群对某些药物的耐药性更高。 

本发明所述的2903bp缺失，位于BIM基因第三、第四外显子之间的内含子上（脱氧核糖核酸（DNA）序列编号：2903bp缺失位置基于SEQ ID NO：1/5、1/6，上游引物基于SEQ ID NO:2/5、2/6；下游引物1基于SEQ ID：3/5；下游引物2基于SEQ ID：4/6；扩增产物基于SEQ ID：5/6、6/6。 

具体而言，本发明的检测细胞凋亡调解子基因(BIM)缺失突变的方法,其包括步骤： 

（a）抽提样品的基因组DNA，扩增获得BIM基因第三、第四外显子之间的内含子上包括2903bp缺失在内的产物； 

（b）检测步骤（a）产物中2903bp缺失情况。 

本发明中，所述的扩增BIM基因第三、第四外显子之间的内含子上2903bp缺失的引物序列如SEQ ID NO2和SEQ ID NO3所示。 

上述方法中涉及的扩增、抽提基因组DNA等技术均可采用本领域的常规操作方法。 

本发明还提供了检测BIM基因缺失情况的检测试剂盒，它含有与BIM基因第三、第四外显子之间的内含子上2903bp缺失区域结合的探针，所述试剂盒还可以包括特异性扩增BIM基因第三、第四外显子之间的内含子上2903bp缺失区域的引物；在本发明的一个实施例中，与特异性扩增BIM基因第三、第四外显子之间的内含子上2903bp缺失区域的引物的序列如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示。 

本发明中，检测BIM基因缺失情况,即检测BIM基因第三、第四外显子之间的内含子上2903bp缺失突变情况，相关研究表明缺失型个体相对普通人群对某些药物的耐药性更高； 

本发明的方法中，包括检测某个体的BIM缺失情况的步骤，以此判断某个体是否存在有耐药可能性高于普通人群的差异。 

在本发明的一优选例中，所述的差异是选自2903bp的缺失情况，2903bp的缺失位于BIM基因第三、第四外显子之间的内含子上，其中脱氧核糖核酸（DNA）序列编号：2903bp缺失位置基于SEQ ID NO 1/6。 

更进一步的，本发明提供了检测样品中是否存在BIM基因第三、第四外显子之间的内含子上2903bp缺失的方法，其包括步骤： 

（a）用BIM缺失检测特异性引物扩增样品的基因组DNA，得到扩增产物；和 

（b）检测扩增产物中缺失情况。 

本发明所述的BIM基因的详细序列可登见美国国立生物技术信息中心（NCBI)（可参见网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/） 

本发明中，对肺癌病例和正常对照人群进行了BIM缺失情况实验检测，结果表明本发明方法简单易行，快速高效，成本低廉。为BIM基因缺失检测提供了一个简捷的新途径。 

本发明的一种用于细胞凋亡调解子基因(BIM)缺失突变的快速检测方法其优点有： 

1、通量更高：相比传统的PCR而言，本发明使用Roche480实时荧光定量系统，通量更高； 

2、速度更快：传统的方法需要扩增几千bp的片段，另需要进行电泳鉴定扩增片段，实验时间预计在5个小时以上，而本发明的方法只需要扩增100个bp左右的片段，所有实验在2个小时内即可完成； 

3、结果更直观：传统的结果需要进行电泳分析，耗时耗力，而本方法只需要在实时PCR结束后进行分析即可获得结果； 

4、结果更准确：众所周知，检测过程中，每开盖一次便增加一次污染的可能性，相较传统检测需要开盖后进行电泳而言，本方法无需开盖，将污染可能性降到最小的程度。 

附图说明

图1为本发明的一个实施方式的样本中含有BIM基因2903bp纯合缺失的熔解曲线分析图。 

图2为本发明的一个实施方式的样本中含有BIM基因2903bp杂合缺失的熔解曲线分析图。 

图3为本发明的一个实施方式的样本中不含有BIM基因2903bp缺失的熔解曲线分析图。 

图4为本发明的一个实施方式的样本中含有BIM基因2903bp纯合缺失、杂合缺失以及不含有BIM基因2903bp缺失的PCR产物琼脂糖电泳图。 

具体实施方式

下面结合具体实施方式和实验详细说明本发明的特征，但是，可以理解的是，说明书的具体实施方式仅仅用于对本发明进行说明，并不能被解释为对本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆；实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 

实施例1实时荧光PCR检测 

（一）、实验材料 

480II荧光定量PCR仪购自瑞士Roche公司，聚合酶链式反应液（FastStart Universal SYBR Green Master）购自瑞士Roche公司。 

（二）、引物设计与合成： 

以BIM基因的部分序列为模板，使用Primer Premier5软件分析设计引物，并由生工生物合成。 

检测用引物： 

BIM基因缺失检测上游引物序列： 

5’-ATACCATCCAGCTCTGTCTTCATAG-3’(SEQ ID NO 2) 

BIM基因缺失检测下游引物1序列：5’-CCCAACCTCTGACAAGTGACC’(SEQ ID NO 3)。 

BIM基因缺失检测下游引物2序列：5’-TTGGTGGGAATGTAAAATGGC-3’(SEQ ID NO 4)。 

（三）、样本检测： 

实验共检测30例肺癌病例和30例正常对照人群，每例收集血样标本约2mL，用浓盐法抽提基因组DNA，抽提结果用Nanodrop（Thermo公司）检测， 

按如下体系进行荧光PCR扩增，后用480II荧光定量系统进行溶解曲线分析： 

成分	体积
		FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)	10μL
上游引物、下游引物1、下游引物2（1μM）	2μL
		步骤1制备的DNA样本或对照样本（5ng/μL左右）	1μL
反应终体积	20μL

（四）、检测结果 

基因组DNA抽提的检测结果如表1所示： 

所有用本的基因组DNA附和检测要求（260/280>1.8，浓度>10ng/ul）。 

表1 

。 

实施例2 

用普通PCR方法检测BIM基因第三、第四外显子之间的内含子上2903bp缺失情况，挑选上述病例样本10例，对照样本10例进行测序判断BIM缺失情况。 

（一）、实验方法 

PCR测序引物任采用上述荧光PCR所用引物，扩增产物跑琼脂糖电泳，电泳仪是美国BidRad公司的，电泳完成后在复日A201紫外成像系统下分析。 

（二）、实验结果 

结果截图如图4所示， 

最终，X例的电泳结果与480II荧光PCR的分析结果完全一致。 

（三）、BIM基因2903bp缺失和肺癌易感的关联分析 

BIM基因2903bp缺失在肺癌病人和对照中分布的比较采用RxCχ2检验.用SPSS软件进行统计分析，检测结果的SPSS软件分析结果如表2所示： 

表2 

。 

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用做参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 

  SEQUENCE LISTING

 

<110>  上海市胸科医院

 

<120>  用于细胞凋亡调解子基因(BIM)缺失突变的检测方法及其检测试剂盒

 

<160>  6    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  4511

<212>  DNA

<213>  homo sapiens

 

<400>  1

aaccatgaaa atggtttgtt ttctgcctaa attcctcttt gtgcttattg ctcagagggt     60

 

ttggacatag tactaatcag attaggttgt aggtttttat ttcagggatt aaaggcagta    120

 

gtagggtttg aaccaagagt ggctaacata aataccacag aggcccacag caaaatcatg    180

 

gaaggaactg acctggtgga gactggtaaa ttggagagta tttgcccctt ctatgtttgg    240

 

gccacaccta attgtggctg tgagggcatg tggtctcagg gtgggttttc ctatattgca    300

 

agataaccta ggaatgcaaa attgatgcca gataccctgt ttcaacattg acagctgatt    360

 

cagattttga aaacattgta caagctgaaa agaaacatct gcagacttga tttggccctt    420

 

gaacctacag catgtgactt tgggtacata ctttgggtaa ccttggtgag gggctgagtc    480

 

tgtgttgatc gacttgctgt tccccaccaa tggaaaaggt tcatgtcttg atcagtagtc    540

 

aatcacattg accatttgtc cagattagct tgccatacat gaacaagata gaagtaagtt    600

 

ggtagagtta tcaattagga aacccagtac agagtctatt ataatttaga ttgtacctca    660

 

tgatgaaggc taactcaaca aacccatcag aacagacact ggaacaaaat gacatttcta    720

 

aataccatcc agctctgtct tcataggctt cagtgaggta aatcaggcag gcctttgccc    780

 

atgttataga attggaaaga acctcagagt ggtggtcact tgtcagaggt tgggcacacc    840

 

tgtgaggtgg tggggagaaa tgacagacat cccagcagct acacatgctg gctgcacgtc    900

 

tcttgccaaa tgccaggagg taatttttta gggtccctcc ttagggaaag gggctggaag    960

 

ttttattatt gctgttacta ctgctcgtga actcatttca gccttagaag ttcttggctt   1020

 

gtagtttttg ttgtactcat gaaaatgctc ccccatatat atgatcattc tcgcttacta   1080

 

taacatcctt gcttactaaa tgagttaaca gggctttatg gtgtgtatcg tgaaacacac   1140

 

gtgcattaaa gaccctctgg aaggtattag cttttcacac tttcacaaca aaagcttcac   1200

 

acttgtggtt attaagctat tttctctaac cagttccctt tcaagcaaaa tgcatacatt   1260

 

ggtctctgta ggtgatgggt taatgcatgg aaatagtttc tccttccctg gaactgggaa   1320

 

tagtgggtga gatagtgtat tttttaatgt aaagacaggc acaaatgctt tttttgttga   1380

 

taaatactat tttacaagct aattataagt taagcactgt tacttgagat gaaatataca   1440

 

gggcttcaaa gatcataatc taaataatta tgcacagcta atggttatac ctgtgaagta   1500

 

aagtagtgga tcctgaggtg taattttata gtattagctg catttcagta gatggtgtga   1560

 

tgaagagttt aatgcatagg attaaatgag aagttacgag gagtttgttt aaagttaatg   1620

 

taccgaggta agttttcagt gttaagtttt tgggagattt gttttgggag aggatgagtt   1680

 

ggggttgggg gaggaaagga cttagccaga tgtgagtttc ttaaattgaa gcataaaatt   1740

 

tacaatttat gtagtccata attttctctg gacattctac agtcttagtt catgcctgaa   1800

 

gaccactgaa ataatgctga gttgataagt ggttctcttg actttgttta gtattcttta   1860

 

ctcaacccta tccatgaagt tcttcaatga agcttttgat aatttattgc aaaatacatt   1920

 

ttccacaaag aagtcattat gattggtttg aactagtgga acacaaatgt gaggttataa   1980

 

agaggttcgc cttagccagg ggctccttta gctgcaaagc agttttttgc tcagcaactt   2040

 

ggggtagaga tcagtgtgtc ttgaagtttt gttttgcaaa actttgttct aatgagaaag   2100

 

tcaagtctta ggaggaatgt atagtagttg agtgtttgta ttaacactgt tttcatattt   2160

 

tccttttatg tctctgattt ttctgaagac aagttcaagg aatatatttc tctgtggggc   2220

 

aacagataca gttttttcac ttttcctcaa ttttagtctc cttacactct gggaggatta   2280

 

acttgacaaa tgatacctta gtgaataact gattattttt atcaaaatca ctcacatgtg   2340

 

ttggtttact gagtgccttt ttggatgagt gttttatgcc atatgtgttt ttaatggaaa   2400

 

ttaaagtgta gtcagtacac taaagtgtag tcagtacaat tggaaataag agttgagaaa   2460

 

agtcaggata tggaggaatg ctccctagtg tcatgttagt aaatgtctta aattttatac   2520

 

ttgttccctg gcacattgga attcacagat gggagttaat ggctttcttt tttttttttt   2580

 

ttttttcctc agcgtcttgt gggtacttct cttatagctg gtacttgtct gacccctcct   2640

 

ttagtttgtg agctccctgg gcggggaata atggcctgca gatgctagcg agtgcctgac   2700

 

aaagaggaga agcccaggag atgttgagag tcagtccagc tctgcctgtt agcctttcag   2760

 

acaaataaag ttgaagaagg caggtagcaa gaaaaagatc ctgacctctg ctctgccaaa   2820

 

gtgtttttaa ttacctggat ctagctgtaa ggtttgccac gtagtggtga cagctgaggt   2880

 

ctagctcagc actactcagc agggaagcca cacatgcatt aagcacttga cataggacta   2940

 

gtctgaactg agttgtgctg tcattattga tacacactgg attttgagga gacaaaaaag   3000

 

aatgcaaaat agtttaattg ttttcatatg ggttacatgt tgaaatggtg ttttaaatat   3060

 

ataggttaaa taaaatataa acttgtattg cagttaaaca caaagcgtaa aatttaccat   3120

 

ctgaaccatt tatttctaag tgtactgttc agtagtgtta agtgcactta ttttgttgtg   3180

 

cggccaatct ccagaacttc ttcaccttgc aaaacagaaa ttctgtactc attaaacaac   3240

 

tccccatttc cccctccccc cagcttctga caaccaccat tctattttct gtctattaat   3300

 

ttgacaactt cagatacctt atataagtga aatttatata gtatttgctc ttccatgaca   3360

 

ggcttatttc acttagcgta atgtcgtcag ggttcattta tcttgcaaca tgtcagaatt   3420

 

tccttccttt ttaaggctga aggttgttcc agtgtgtgta tatcacatac ttcatttatc   3480

 

cattcatcca tcaggagata cttgggttgc ttccactttt tggctattgt gagtagtgct   3540

 

gctatgaaca tgggtatgca aatatctttt gggggattct gctttgaatt tttttggata   3600

 

tatacttgga agtggaattg ctggatcata tggtaattct atttttaatt ttttggggaa   3660

 

ccatcatgct gttctccata gaggctgtgc cattttacat tcccaccaac agggcacaag   3720

 

ggttccagtt tctccacata cttaccaaca cttttttttt ttttttttta acagtagtca   3780

 

tcctagagga tataggtgat ctttcactgt gctttggatt tatatttact ggcttagatt   3840

 

tgtatggcca ccaccatagt caagatacag aacaactcaa ccacaaggat ttctcatgat   3900

 

acctttttat agccacagcc acctctctcc ctcttccttg agcattttgt catatggtca   3960

 

ttggtgatta aataaaatgt attttaatat tgactttctc tgtttctttc taccttttta   4020

 

aacatggcta ctagaaaaat gcacaattag atttgtggct ggtgttctgt ttcatctaaa   4080

 

caggctggcc tcacagagga gctggagtgt gcagtgctgc tctagcaagc caggcttgac   4140

 

tcttcccact cagggcacat cacttccatg aagcttactc cttgggttgt ttggttgact   4200

 

taggagaatg gaagtgatta gcagaatctt gtaagcattt taaacattaa atgagcattg   4260

 

taaacagcgg cattcttcag gcaaatacag ttttgtttta cctctttaaa ttccatggta   4320

 

tattcggact tcaaaaagta gatggtagag cacatgcttt ctcagcacct tcaggctgcc   4380

 

tggagcctcc caatagaggt gtcttcgagg gagtcccagc tctgtctctg aaaccccaaa   4440

 

gttacttgtt tgacaccaag agaaataagg aaacttttta ggtcctaagt ggggagagaa   4500

 

agtgctagaa g                                                        4511

 

 

<210>  2

<211>  25

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<400>  2

ataccatcca gctctgtctt catag                                           25

 

 

<210>  3

<211>  21

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<400>  3

cccaacctct gacaagtgac c                                               21

 

 

<210>  4

<211>  21

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<400>  4

ttggtgggaa tgtaaaatgg c                                               21

 

 

<210>  5

<211>  113

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<400>  5

ataccatcca gctctgtctt cataggcttc agtgaggtaa atcaggcagg cctttgccca     60

 

tgttatagaa ttggaaagaa cctcagagtg gtggtcactt gtcagaggtt ggg           113

 

 

<210>  6

<211>  85

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<400>  6

ataccatcca gctctgtctt cataggcttc agtgaggtaa atcactgttc tccatagagg     60

 

ctgtgccatt ttacattccc accaa                                           85

 

 

Claims (5)

1.一种用于细胞凋亡调解子基因缺失突变的检测方法，其特征在于，检测BIM基因第三、第四外显子之间内含子上2903bp缺失情况；该方法包括步骤：

（a）抽提样品的基因组DNA，扩增获得BIM基因第三、第四外显子之间的内含子上包含2903bp缺失的区域；

（b）检测步骤（a）产物中BIM基因的缺失情况。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的2903bp缺失位于BIM基因第三、第四外显子之间的内含子上。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特在于，扩增BIM基因第三、第四外显子之间的内含子上包含2903bp缺失的区域的引物序列如SEQ ID NO2、SEQ IDNO3和SEQ ID NO4所示。

4.如权利要求1所述的检测方法，其特在于，该方法中还包括特异性扩增BIM基因第三、第四外显子之间的内含子上包含2903bp缺失区域的引物。

5.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，它含有与BIM基因第三、第四外显子之间的内含子上2903bp缺失区域结合的探针，还包括特异性扩增BIM基因第三、第四外显子之间的内含子上2903bp缺失区域的引物；与特异性扩增BIM基因第三、第四外显子之间的内含子上2903bp缺失区域的引物的序列如SEQID NO 2和SEQ ID NO 3所示。