CN1829739A - 结晶肿瘤坏死因子受体2多肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及结晶多肽并涉及其制造方法；涉及包含结晶多肽的医药组合物；并涉及此类多肽及组合物的治疗用途。

Description

结晶肿瘤坏死因子受体2多肽

本申请案主张2003年8月1日所提交的美国临时申请案序列号第60/491,827的权利，所述申请案全文以引用的方式并入本文。

技术领域

无

背景技术

许多治疗分子是多肽，其中一些倾向于变性、降解及/或聚集。多肽聚集是非所需的，因为其可能导致免疫原性(Cleland等人，1993，Crit Rev Therapeutic Drug Carrier Systems，10：307-377；及Robbins等人，1987，Diabetes，36：838-845)。多肽也通过其所施用的生物体的自然生物过程经受催化作用或转变至无活性形式。此外，治疗多肽可以制成因糖基化程度或其三维构象的其它方面不同形式的异源混合物。

治疗多肽的结晶在产生此类多肽的稳定和均质配方中提供优点。晶体的某些优点包括在制备医药产物中更易处理治疗化合物；减少降解、变性及/或聚集；产生治疗多肽的持续释放形式以减少剂量频率的潜能；及使用结晶治疗多肽形成具有极高浓度治疗多肽的医药组合物的能力。此外，结晶方法可以在配方中产生多肽的更均质群体，因为当限量变体结构的多肽已经并入晶体晶格中时，仅添加相似构造的多肽分子参与晶体的持续生长中，所导致的晶体结构弱点将阻止其进一步生长。因为并入结晶形式可确保更大百分比的多肽处于活性形式，所以施用较少量结晶治疗多肽可以产生与施用较大量更异源多肽配方等同的治疗效应。

因此，需要治疗多肽的结晶配方。

发明内容

本发明提供TNFR2多肽的结晶形式，其包括结晶TNFR2：Fc多肽与结晶依那西普(etanercept)。本发明的一个实施例是依那西普的晶体；在某些实施例中依那西普晶体为棒状形式及/或具有介于0.5毫米与1.5毫米或介于0.05毫米与0.3毫米之间的最大长度。

本发明也提供制造诸如TNFR2-Ig融合多肽或依那西普的TNFR2多肽晶体的方法。在某些实施例中，TNFR2多肽为单体；在另外的实施例中，TNFR2多肽为多聚体，诸如二体、三体或寡聚体。在另外的实施例中，TNFR2多肽与SEQ ID NO：1的氨基酸39至162的长度间享有至少90％的氨基酸一致性。

本发明也涉及诸如结晶TNFR2：Fc多肽与结晶依那西普的所揭示结晶TNFR2多肽在制造用于预防或治疗性治疗本文所揭示的各种医学病症的药物中的用途。

附图说明

图1是进一步在下文实例1中所描述的从每毫升含有50.96mg依那西普的多肽溶液形成的依那西普晶体的照片。结晶库缓冲液为0.1M HEPES pH7.0，30％PEG 6000，0.7M氯化铝；在周围室温下7天后，人工收集晶体，在上述库缓冲液中广泛洗涤且拍照。将来自此组的晶体用于N-末端氨基酸序列分析。

具体实施方式

本发明针对结晶形式的TNFR2多肽，并针对制造及使用此类结晶TNFR2多肽的方法。由于在广泛的储存与操作条件下结晶多肽可以比非结晶形式的多肽储存更长的时间并且可以显示更高的物理稳定性及生物活性保持性，所以此类多肽晶体是有利的。

定义

“多肽”在本文定义为通常具有10个以上氨基酸的天然、合成及重组蛋白或肽。“多肽连接器”可以是由一连串氨基酸所形成的长度可短至1个氨基酸的多肽。

本文所使用的“分离的”是指已经离开其天然发生的环境的多肽或其它分子。

本文所使用的“大体上纯化的”是指大体上不含存在于其天然发生环境或其制造环境中的其它多肽的多肽；大体上纯化的多肽制剂含有至少90重量％(或按重量计至少95％、至少98％或至少99％)的所述多肽，其中多肽的重量包括任何糖类、脂质或其它共价附着于所述多肽的残留物。大体上纯化的多肽制剂可在制剂内的多肽分子中含有关于糖基化或其它翻译后修饰的程度与类型或关于多聚化构象或程度的变化。

本文所使用的“经纯化多肽”是指基本上均质的多肽制剂；然而，基本上均质的多肽制剂可以在制剂内的多肽分子中含有关于糖基化或其它翻译后修饰的程度与类型或关于多聚化构象或程度的变化。

“全长”多肽是具有最初翻译的多肽的完全初级氨基酸序列的多肽；例如，人类TNFR2的全长形式如SEQ ID NO：1所示。多肽的“成熟形式”是指经历了诸如剪切信号序列或蛋白水解剪切去除前域(prodomain)的翻译后处理步骤的多肽。例如通过在多位点剪切信号序列，或通过对剪切多肽的蛋白酶的差异性调控可以产生特定全长多肽的多样成熟形式。通过合适哺乳动物细胞或其它宿主细胞内编码全长多肽的核酸分子的表达可以获得所述多肽的成熟形式。从全长形式的氨基酸序列，通过鉴别其信号序列或蛋白酶剪切位点也可以确定多肽成熟形式的序列。在某些实施例中，成熟形式的人类TNFR2多肽具有选自由SEQ ID NO：1的氨基酸23、27及28所组成的群组的N-末端氨基酸残基，或选自由SEQ ID NO：1的介于氨基酸1与氨基酸39间的各氨基酸所组成群组的N-末端氨基酸。

两个氨基序列的“一致性百分比”可以通过目测检查与数学计算确定，也可以通过使用计算机程序比较序列信息而完成比较。确定一致性百分比的第一步是比对氨基酸序列从而最大化重叠与一致性，同时最小化比对中的间隙(gap)。确定一致性百分比的第二步是计算经比对序列间的一致性数值除以比对中氨基酸总数值的商。当确定氨基酸序列具有目标氨基酸序列“全长”的一致性百分比时，目标氨基酸序列的长度是比对中总碱基数的最小值。例如，当确定50个氨基酸的第一氨基酸序列与SEQ ID NO：X的第二氨基酸序列的氨基酸1至氨基酸100的“全长”的一致性百分比时，如果第一氨基酸序列与SEQ ID NO：X的氨基酸1至氨基酸50一致时，那么一致性百分比应为50％；50个氨基酸一致性除以比对(100个氨基酸)的总长度。用于比对氨基酸序列与计算一致性百分比的一个例示性计算机程序为经由国家医学图书馆(National Library of Medicine)网站ncbi.nlm.nih.gov/gorf/wblast2.cgi可用的BLASTP程序，或UW-BLAST 2.0算法。UW-BLAST 2.0标准默认参数设定在以下国际互联网网站中描述：sapiens.wustl.edu/blast/blast/README.html。此外，BLAST算法使用BLOSUM62氨基酸计分矩阵，且可以使用的可选参数如下：(A)包括一过滤器以掩蔽具有低组成复杂性的查询序列的节段(如通过Wootton与Federhen的SEG程序确定(Computers and Chemistry，1993)；也参看Wootton与Federhen，1996，Analysis of compositionally biased regions insequence databases，Methods Enzymol.266：554-71)或者由短周期性内部重复组成的节段(通过Claverie与States的XNU程序确定(Computers and Chemistry，1993))，及(B)用于报告与数据库序列匹配的统计显著极限值，或E-值(仅碰巧发现的预期匹配可能性，根据Karlin与Altschul(1990)的随机模型；如果归因于匹配的统计显著性大于此E-值极限，那么将不会报告匹配)；E-值极限为0.5、0.25、0.1、0.05、0.01、0.001、0.0001、1e-5、1e-10、1e-15、1e-20、1e-25、1e-30、1e-40、1e-50、1e-75或1e-100。序列比较领域的技术人员所使用的其它程序也可用于比对氨基酸序列，诸如遗传计算机组(GeneticsComputer Group)(GCG；Madison，WI)Wisconsin程序包版本10.0程序，‘GAP’(Devereux等人，1984，Nucl.Acids Res.12：387)。‘GAP’程序默认参数包括：(1)核苷的一元比较矩阵(含有值1为一致性及值0为非一致性)的GCG执行，及Schwartz与Dayhoff编著的Atlas of Polypeptide Sequence and Structure，国家生物医学研究基金会(NationalBiomedical Research Foundation)，第353-358页，1979所描述的Gribskov与Burgess，Nucl.Acids Res.14：6745，1986的加权氨基酸比较矩阵；或其它可比较的比较矩阵；(2)每个间隙罚30分且氨基酸序列每个间隙中每个符号加罚1分，或每个间隙罚50分且核苷序列每个间隙中每个符号加罚3分；(3)末端间隙不罚分；及(4)长间隙无最大罚分。

本发明的TNFR2多肽的“可溶性形式”包含此类多肽的某些片段或域。可溶性多肽为可以从其表达的细胞中分泌的多肽。通过从培养基上分离表达所需多肽的完整细胞(例如，通过离心)及测定培养基(上清液)所需多肽的存在，可以鉴别(并从其不溶性膜结合对应物中辨别)所分泌的可溶性多肽。培养基中所需多肽的存在说明所述多肽从细胞中分泌且因此是可溶性形式的多肽。本发明细胞因子可溶性形式的用途对于许多应用是有利的。因为细胞分泌出可溶性多肽，因此易于从重组宿主细胞纯化多肽。此外，可溶性多肽通常较膜结合形式更适合非经肠施用及许多酶促过程。在本发明某些实施例中，成熟可溶性形式的TNFR2多肽不含有诸如SEQ ID NO：1的氨基酸258至87的跨膜域或膜锚定域，或含有不足部分的所述域(例如10个氨基酸或更少)以导致所述多肽保持膜结合形式。

“基本由氨基酸序列组成的经分离多肽”意谓除所述氨基酸之外，所述多肽还可以视情况具有共价连接于多肽一端或两端的额外材料，所述额外材料具有共价连接于多肽的一端或两端的介于1与10,000个之间的额外氨基酸；或者共价连接于多肽的一端或两端的介于1与1,000个之间的额外氨基酸；或者共价连接于多肽的一端或两端的介于1与100个之间的额外氨基酸。额外氨基酸共价连接于根据本发明的多肽的一端或两端导致产生非天然发生的组合氨基酸序列。

用于结晶的TNFR2多肽

TNFR2多肽为包含至少一部分TNFR2(肿瘤坏死因子受体2)多肽或至少其部分变体的多肽。TNFR2多肽包括TNFR2融合多肽，诸如下文所描述的TNFR2-Ig融合多肽，及TNFR2：Fc多肽、依那西普及其变体、单体或多聚体形式、经修饰形式及共扼体。

TNFR2多肽也称为TNFRSF1B(肿瘤坏死因子受体超家族成员1B)、p75及CD120b；TNFR2多肽的全长氨基酸序列显示于SEQ ID NO：1(也参看Swiss-Prot数据库登录号P20333)中。另一种相关但却截然不同的肿瘤坏死因子受体为TNFR1，也称为TNFRSF1A与p55(也参看Swiss-Prot数据库登录号P19438)。已知TNFR2与TNFR1结合与炎症有关的多效性细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α或简称“TNF”)。除了结合TNF-α之外，TNFR2与TNFR1多肽介导TNF-β同源三聚体(更普遍地称为“淋巴毒素-α”，或LT-α)与细胞的结合，其是另一种与炎症相关的细胞因子并与TNF-α享有相似的结构(例如，参看Cosman，Blood Cell Biochem 7：51-77，1996)。如本文所使用，“TNFR”或“TNFR多肽”是指可以结合TNF-α或LT-α的多肽；TNFR多肽的具体实例为TNFR2与TNFR1。如本文所使用，“结合”或“配体结合”或“具有配体结合活性”意谓当为单体形式时，以至少1×10⁷M的亲和力(意即抑制常数或K_i)，或者在另外的实施例中，当为单体形式时以至少1×10⁸M^-1的亲和力，或当为诸如二体或三体的多聚体形式时以至少1×10⁹M^-1的亲和力，或当为诸如二体或三体的多聚体形式时以至少8×10⁹M^-1的亲和力结合诸如TNF-α或LT-α的配体。使用例如下文实例6所描述的结合测定(也参看Mohler等人，1993，JInmunol 151：1548-1561及Peppel等人，1991，《实验医学杂志》174：1483-1489)，可以确定TNFR2多肽或其变体的TNF-α结合亲和力(抑制常数)。相似地，类似测定可以用于确定TNFR2多肽或其变体的LT-α或其它潜在配体的结合亲和力。如本文所使用，“TNFR相关”是指氨基酸序列相似性或三维结构相似性与TNFR多肽相关的多肽，但是其不必结合TNF-α或LT-α。TNFR相关多肽的实例为CD40(Swiss-Prot数据库登录号P25942)与OX40(Swiss-Prot数据库登录号P43489)多肽。

已经确定TNFR1与一些TNFR相关多肽的三维结构；例如已经将p55 TNFR1的胞外域结晶并提交至蛋白数据库(Protein Data Bank，PDB，www.rcsb.org/pdb/)，登录号为1EXT，且与其配体LT-α结合的p55 TNFR1多肽已经提交至PDB，登录号为1TNR。同样，在蛋白资源结构分类(Structural Classification of Proteins resource，SCOP，scop.berkeley.edu)中，由于共享具有至少三个富二硫化物域的胞外域，定义SCOP TNF受体样蛋白折叠的TNFR和TNFR在结构上相关。例如，如SEQ ID NO：1所示的TNFR2具有四个这样的域，大部分N-末端的三个域共享涉及二硫键形成的保守半胱氨酸残基的特征模式。四个富二硫化物域在SEQ ID NO：1的氨基酸39至76处、氨基酸77至118处、氨基酸119至162处及氨基酸163至201处。在以下氨基酸位置处的半胱氨酸残基对之间形成二硫键：40与53、54与67、57与75、78与93、96与110、100与118、120与126、134与143、137与161及(在第四域中)164与179；第四个二硫键域也在SEQ ID NO：1氨基酸184与200处含有另一对半胱氨酸残基。

通过使用计算机程序，如GeneFold(Tripos，Inc.，St.Louis，MO；Jaroszewski等人，1998，Prot Sci 7：1431-1440)可以分析TNFR2多肽及其变体与结构特征化的TNFR多肽与TNFR相关多肽的三维相似性，所述程序为将查询蛋白序列覆盖在蛋白数据库(PDB)内的结构代表上的蛋白穿线程序(protein threading program)(Berman等人，2000，Nucleic Acids Res 28：235-242)。为使用GeneFold评估TNFR2多肽及其变体的结构，在程序中输入所述多肽序列，其分配一个反映其在GeneFold数据库中存在的已知蛋白结构(“模板”结构)上折叠有多充分的可能性分值。对于打分，GeneFold依赖初级氨基酸序列相似性、残基的埋藏模式、局部互作及次级结构比较。GeneFold程序折叠(或穿线)氨基酸序列于蛋白折叠数据库中所有模板结构上，其包括若干人类TNFR多肽已解决的结构，例如p55TNFR1(模板“ltnrR”)及TNFR相关多肽CD40(模板“lcdf_”)。对于每个比较，基于(i)仅序列；(ii)序列加局部优选构象加埋藏条件；及(iii)序列加局部优选构象加埋藏条件加次级结构，分别计算三个不同分值。在每个实例中，程序确定最佳比对，计算此比对程度碰巧发生的可能性(P-值)并报告此P-值的倒数作为分值。这些分值因此反映查询多肽序列与诸如TNFR多肽结构的多种参考结构的匹配程度。当使用GeneFold比较TNFR2多肽或其变体(查询多肽)与其它TNFR或TNFR相关多肽时，将查询多肽以作为三个得分分类之一中的最高命中率与lcdf_、ltnrR或另一个TNFR或TNFR相关模板匹配，及/或以至少500，或至少700，或至少990或999.9(最大分值)的任何分值与TNFR模板匹配。另一种分析TNFR2多肽或其变体的方法是经由同源模拟的熟知方法将所述查询多肽的结构与TNFR或TNFR相关蛋白的结构进行比对。一种可以用于同源模拟的有用软件程序是可购自Pharmacopeia Inc.的子公司Accelrys(Princeton，NJ)的‘Modeler’程序。

用于结晶的TNFR2多肽包含SEQ ID NO：1的TNFR2多肽的至少一部分胞外区或其变体。在某些实施例中，TNFR2多肽的完整胞外区包括于TNFR2多肽中。如某些实例，TNFR2多肽可以包含SEQ ID NO：1的氨基酸28至257，或氨基酸27至257，或氨基酸23至257。在另外的实施例中，截断TNFR2多肽的胞外区以删除至少一个潜在N-连接糖基化位点(例如，SEQ ID NO：1的氨基酸171与193)及/或富脯氨酸区(例如，SEQ IDNO：1的氨基酸24至36或SEQ ID NO：1的氨基酸217至261)，而同时留下完整的具有分子内二硫键的三个大部分N-末端域。例如，在一个实施例中，TNFR2多肽包含SEQ IDNO：1的氨基酸39至162，或SEQ ID NO：1的氨基酸39至179，或SEQ ID NO：1的氨基酸39至200，或任何前述多肽的变体。

根据本发明用于结晶的TNFR2多肽包括具有SEQ ID NO：1的TNFR2多肽长度的至少20％(或至少25％，或至少30％，或至少35％，或至少40％，或至少50％)氨基酸序列长度的多肽，并具有与TNFR2多肽至少60％的序列一致性(或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少97.5％，或至少99％，或至少99.5％)。本发明也包括含有包含SEQ ID NO：1的至少80，或至少90，或至少100，或至少110，或至少120，或至少130个连续氨基酸的节段的TNFR2多肽及多肽片段或者其变体。这些多肽与多肽片段也可能含有与SEQ ID NO：1的TNFR2多肽分享至少70％序列一致性(或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少97.5％，或至少99％，或至少99.5％)的节段。

当使TNFR2多肽的这些变体结晶时，可以考虑若干方面以引导所属技术领域的技术人员制造保留诸如TNF-α结合活性的生物活性的变体。在某些实施例中，希望保留上述SEQ ID NO：1的TNFR2多肽的至少三个N-末端二硫键区或所有四个二硫键区。另外，可扩大围绕N-末端三个二硫键区的部分TNFR2胞外域以包括所有或一部分第四二硫键区，且在特定实施例中，不包括第四二硫键区的半胱氨酸，或包括包括第一对半胱氨酸(SEQ ID NO：1的氨基酸164与179)在内的第四二硫键区的区域，及/或包括包括第二对半胱氨酸(SEQ ID NO：1的氨基酸185与200)在内的第四二硫键区的区域。因此，本发明范畴涵盖的的变体保留涉及形成这些域的二硫键的半胱氨酸残基，并且也保留介于这些半胱氨酸间的近似空间(意即初级氨基酸序列的残基数目)。例如，不插入或删除5个以上在半胱氨酸对之间形成二硫键的氨基酸的变体如不插入或删除4个以上在所述半胱氨酸之间形成二硫键的氨基酸的变体，和不插入或删除3个以上在所述半胱氨酸之间形成二硫键的氨基酸的变体，和不插入或删除2个以上在所述半胱氨酸之间形成二硫键的氨基酸的变体及不插入或删除1个以上在所述半胱氨酸之间形成二硫键的氨基酸的变体一样在本发明范畴内。

引导所属技术领域的技术人员制造TNFR2多肽变体的另一个考虑是所产生的氨基酸置换的性质；所述置换可以为保守性的，其意谓存在于变体内特定位置处的氨基酸具有与未改变TNFR2多肽内对应位置处的氨基酸相同的化学及/或大小特性。表2总结了认为具有相似特性的氨基酸组，因此表2中相同行的任何氨基酸与另一个氨基酸的置换应为保守性置换。在某些实施例中，TNFR2多肽变体具有SEQ ID NO：1的氨基酸39至162的全长，或SEQ ID NO：1的氨基酸39至179的全长，或SEQ ID NO：1的氨基酸39至200的全长的20％或更少的氨基酸置换(或者15％或更少，或者10％或更少，或者7.5％或更少，或者5％或更少，或者2.5％或更少，或者1％或更少)。在某些实施例中，TNFR2多肽变体具有SEQ ID NO：1的氨基酸39至162的全长，或SEQ ID NO：1的氨基酸39至179的全长，或SEQ ID NO：1的氨基酸39至200的全长的20％或更少的保守性氨基酸置换(或者15％或更少，或者10％或更少，或者7.5％或更少，或者5％或更少，或者2.5％或更少，或者1％或更少)。

在某些实施例中，待结晶的TNFR2多肽或其变体具有TNF-α结合活性及/或LT-α结合活性。

                    表2

              保守性氨基酸置换

碱性：	精氨酸、赖氨酸、组氨酸
		酸性：	谷氨酸、天冬氨酸
极性：	谷氨酰胺、天冬酰胺
		疏水性：	亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸
芳族：	苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸
		小：	甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨

TNFR2融合蛋白

在某些实施例中，待用于本发明的结晶方法的TNFR2多肽包括与一部分Ig(免疫球蛋白)多肽或其变体融合的TNFR2多肽，视情况在TNFR2-Ig融合多肽的TNFR2部分与Ig部分间具有一个多肽连接器。(当存在于TNFR2融合多肽中时，可选多肽连接器长度可以短至一个氨基酸。)免疫球蛋白(1g)多肽因为氨基酸序列且也因为三维结构而相关。如SCOP所定义的多肽Ig超家族是一个具有蛋白折叠“免疫球蛋白样β-夹层”的蛋白子集，尽管一些折叠成员具有额外链，但是其描述为通常在两层折叠片内排列有7条链。Ig超家族细分为四个蛋白域家族：V组域(抗体可变域样)、C1组域(抗体恒定域样)、C2组域及I组域。

TNFR2-Ig融合多肽包含至少一部分Ig多肽，例如Ig多肽恒定区的至少10个连续氨基酸，或者与Ig多肽恒定区的至少20个连续氨基酸享有至少70％的氨基酸一致性的长度为至少14个氨基酸的多肽。本发明的TNFR2-Ig融合多肽可以优选地包含至少一个重链恒定区，且在某些实施例中，包含至少一个轻链恒定区。

在某些实施例中，Ig多肽包含IgG类重链的恒定区或其片段及/或变体，并且在其它实施例中，其它免疫球蛋白同型的恒定区可以用于产生这些TNFR2-Ig融合。例如，包含IgM类重链的恒定区或其片段及/或变体的TNFR2-Ig融合多肽可以用于产生十价形式的TNFR2-Ig融合多肽。以SEQ ID NO：2所提供的人类IgG1类重链恒定区为特定实例，免疫球蛋白重链恒定区包含CH1域(SEQ ID NO：2的氨基酸1至98)、铰链区(SEQID NO：2的氨基酸99至110)、CH2域(SEQ ID NO：2的氨基酸111至223)及CH3域(SEQ ID NO：2的氨基酸224至330)。SEQ ID NO：3提供IgG1类重链恒定区变体的特定实例，其中进行了两个氨基酸置换(在位置239处Glu置换Asp，及在位置241处Met置换Leu)。本发明的某些实施例包括包含融合于所有或一部分SEQ ID NO：2或SEQID NO：3的所有或一部分TNFR2多肽的胞外域(SEQ ID NO：1)，视情况在TNFR2-Ig融合多肽的TNFR2部分与Ig部分间具有连接器。在本发明另外的实施例中，包含至少一部分CH1的重链恒定区是TNFR2-Ig融合多肽的Ig部分。某些实施例也可以包括例如铰链区C-末端的一半以在重链间提供二硫键。在本发明某些实施例中，TNFR2多肽视情况通过多肽连接器共价连接于重链恒定区的CH₁区的至少一部分的N-末端以形成TNFR2-Ig融合多肽。

在某些额外实施例中，至少一部分铰链区连接于CH₁区。如一个实例，分子中存在CH₁与CH₂，并且也存在完整的铰链区。如另一个实例，CH₁与铰链最先的七个氨基酸(SEQ ID NO：2或3的氨基酸99至105)一起存在。所属技术领域的技术人员应了解本发明的TNFR2-Ig融合多肽可以是例如单体或二体，并且如果需要二体TNFR2-Ig融合蛋白，包括涉及重链间二硫键形成的部分铰链区是重要的(例如，包括SEQ ID NO：2或3氨基酸109的SEQ ID NO：2或3的氨基酸99至110部分)。在本发明另外的实施例中，TNFR2-Ig融合多肽可以包含不包括C-末端赖氨酸残基(SEQ ID NO：2或3的氨基酸330)的部分CH3域，因为已经观察到此残基在Ig重链多肽的翻译后处理中被去除。

Fc域

如本文所使用，Fc域可以含有上述重链CH1、铰链、CH2及CH3域中的一个或所有，或者其片段或变体，并且可以是如由包含Fc域的TNFR2-Ig融合多肽的组分所确定的单体、二体或多聚体。

根据本发明用于结晶的特别涵盖的某些多肽包括包含至少一部分Fc域的TNFR2-Ig融合多肽。适合治疗人类及其它哺乳动物疾病的优选TNFR2多肽是TNFR2:Fc，其用于本文以表示融合至免疫球蛋白多肽Fc部分的所有或部分TNFR2多肽或其变体的胞外域，视情况具有介于TNFR2:Fc多肽的TNFR2部分与Fc部分间的多肽连接子。

其它多聚域

本发明的多聚体包括用于结晶的TNFR2多肽，其中所述TNFR2多肽是二体、三体、四体或其它多聚体形式。另一个制备本发明的多聚体的方法涉及使用亮氨酸拉链。亮氨酸拉链域是在其所发现处促进多肽寡聚化的肽。亮氨酸拉链最初在若干DNA结合多肽中鉴别出(Landschulz等人，Science 240：1759，1988)，并且迄今已经在多种不同的多肽中发现。已知亮氨酸拉链中为天然发生肽及其二聚化或三聚化衍生物。拉链域(本文也称为多聚化域或多聚体形成域)包含重复性的七体重复，通常具有四个或五个散布于其它氨基酸之间的亮氨酸残基。亮氨酸拉链的用途与使用亮氨酸拉链制备多聚体在所属技术领域是熟知的。其它多聚化域包括在肺表面活性剂D蛋白中发现的三聚化域(Kovacs等人，2002，J Biomol NMR 24：89-102)及其它所属技术领域已知的域。

依那西普

在一个实施例中，结晶的TNFR2多肽是融合于人类IgG1的232氨基酸部分的“依那西普”，其为两个各由源自TNFR2多肽胞外部分的235个氨基酸组成的多肽的二体。依那西普单体组分的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。在此分子的二体形式中，这些融合多肽(或“单体”)中的两个通过形成于两个单体的免疫球蛋白部分间的三个二硫键固定在一起。依那西普二体因此由934个氨基酸组成，并且具有大约150千道尔顿的表观分子量(Physicians Desk Reference，2002，Medical Economics Company Inc.，第1752-1755页)。依那西普目前市售商标命为ENBREL(Amgen Inc.，Thousand Oaks，CA)。

糖基化与共扼

本发明包括具有或不具有相关自然类型糖基化的本发明的TNFR2多肽。在酵母或哺乳动物表达系统(例如，COS-1或CHO细胞)中表达的多肽可以与自然人类多肽的分子量与糖基化类型相似或显著不同，这取决于表达系统的选择。本发明多肽在诸如大肠杆菌(E.coli)的细菌表达系统中的表达提供非糖基化分子。另外，一种给定制剂可以包括多肽的多个不同的糖基化种类。通过常规方法，尤其是利用糖基化酶可以去除糖基化基团。一般来说，本发明的糖基化多肽可以与摩尔过量的糖基化酶(BoehringerMannheim)培育。

本文所描述的用于结晶与用于治疗的TNFR2多肽可以与聚乙二醇接合(聚乙二醇化(pegylate))以延长其血清半衰期或增强蛋白传递。源自TNFR p55的聚乙二醇化TNFR多肽的实例是重组聚乙二醇接合可溶性TNFR p55(PEG-sTNFR类型I)，其含有TNFRp55的胞外域；TNFR2多肽及其片段可以以相似的方式与聚乙二醇接合。用于多肽聚乙二醇化的试剂与方法，例如，均在WO 92/16221、WO 99/102330和美国专利第6,420,339号、第6,433,158号、第6,441,136号、第6,451,986号、第6,548,644号和第6,552,170号中描述，所有均以引用的方式并入本文。

本发明也涵盖与细胞毒素或发光物质接合的TNFR2多肽的结晶形式。这些物质包括：美登素衍生物(诸如DM1)、肠毒素(诸如葡萄球菌肠毒素)、其它毒性蛋白与化合物(诸如蓖麻毒素-A、假单胞菌毒素、白喉毒素、道诺霉素、阿霉素、甲氨蝶呤及丝裂霉素C)、碘同位素(诸如碘-125)、锝同位素(诸如Tc-99m)、其它同位素(²¹²Bi、¹³¹I、¹⁸⁶Re与⁹⁰Y)、氰蓝荧光染料(诸如Cy5.5.18)及核糖体失活多肽(诸如bouganin、gelonin或saporin-S6)。

产生与纯化用于结晶的多肽

表达多肽的生活宿主细胞可以产生TNFR2多肽，诸如已经经遗传工程改造以产生多肽的宿主细胞。遗传工程改造细胞以产生多肽的方法所属技术领域是熟知的。参看，例如，Ausubel等人，编著(1990)，Current Protocols in Molecular Biology(Wiley，NewYork)。这些方法包括将编码并且允许多肽表达的核酸导入活的宿主细胞内。这些宿主细胞可以是培养生长的细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞或动物细胞。细菌宿主细胞包括(但不限于)大肠杆菌细胞。合适大肠杆菌菌株的实例包括：HB101、DH5α、GM2929、JM109、KW251、NM538、NM539及任何不能剪切外源DNA的大肠杆菌菌株。可以使用的真菌宿主细胞包括(但不限于)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、甲醇酵母(Pichiapastoris)与黑曲霉(Aspergillus)细胞。可以使用的动物细胞系的几个实例是CHO、VERO、BHK、HeLa、Cos、MDCK、293、3T3和WI38。使用所属技术领域的技术人员所熟知的方法(例如通过转化、病毒侵染及/或选择)可以建立新的动物细胞系。多肽可以视情况由宿主细胞分泌至培养基中。

可以通过任何标准方法进行表达TNFR2多肽的纯化。当TNFR2多肽在胞内产生时，例如通过离心或超滤去除微粒碎片。当多肽分泌至培养基中时，可以使用标准多肽浓缩过滤器首先浓缩来自这些表达体系的上清液。也可以加入蛋白酶抑制剂以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素以阻止微生物的生长。TNFR2多肽可以在伴侣或辅助蛋白的存在下产生以获得所需多肽构象，或者可以在产生后使之经历如氧化及/或还原条件的条件以诱导多肽构象的重折叠或改变(参看，例如，WO 02/068455)。

可以使用例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析及任何已知或仍待发现的纯化技术的组合以纯化所述TNFR2多肽。例如，可以用蛋白A纯化基于人类γ1、γ2或γ4重链的TNFR2-Ig多肽(Lindmark等人，1983，J.Immunol.Meth.62：1-13)，其中TNFR2-Ig融合多肽的Ig部分含有涉及结合至蛋白A的恒定域部分。推荐蛋白G用于小鼠同型与人类γ3(Guss等人，1986，EMBO J 5：1567-1575)。根据需要，可以利用其它用于TNFR2多肽纯化的技术，也可以根据需要利用包括(但不限于)离子交换柱分馏、以乙醇或其它醇沉淀、反相HPLC、FPLC、硅胶层析、肝素SEPHAROSET^TM层析、阴离子或阳离子交换树脂层析(例如聚天冬氨酸柱)、疏水互作层析、聚焦层析、SDS-PAGE及硫酸铵沉淀的方法。

产生晶体、晶体配方和组合物：

多肽晶体通过受控多肽结晶作用从水溶液或者从含有有机溶剂或添加剂的水溶液中生长。可以控制的溶液条件包括例如溶剂、有机溶剂或添加剂的蒸发速率、适合共溶质与缓冲液的存在、pH及温度。McPherson，1985，Methods Enzymol 114：112-120已经发表了影响蛋白结晶作用的多种因子的综述。此外，McPherson和Gilliland，1988，J CrystalGrowth，90：51-59已经编辑了已经结晶的多肽的综合清单，以及其结晶的条件。晶体与结晶处方的概略以及溶解蛋白结构的相匹配库由Brookhaven国家图书馆的蛋白数据库保存(www.rcsb.org/pdb/；Bernstein等人，1977，J Mol Biol 112：535-542)。这些参考文献可以在形成适当多肽晶体之前用于确定多肽结晶必需的条件，并且可以指导其它多肽的结晶策略。然而，应注意，在大部分实例中，以上所引用的大部分参考文献所报导的条件都经优化以产生一些大的、衍射质量的晶体。因此，所属技术领域的技术人员应了解需要对这些条件做一定程度的调整以提供多肽晶体大规模生产的高产出方法。

一般来说，通过将待结晶的多肽与适合水溶液或含有诸如盐或有机溶剂或添加剂的适合结晶剂的水溶液合并以产生晶体。将溶剂与多肽合并并且可在一定温度下经历搅动，所述温度为经实验确定为适合诱导结晶并且为保持多肽活性与稳定性可接受的。所述溶剂视情况可以包括共溶质，例如二价阳离子、辅助因子或离液剂(chaotrope)，以及用于控制pH的缓冲物质。用于结晶作用的“共溶质剂”包括可以提供共溶质以利于多肽结晶的化合物。共溶质剂的实例包括乙酸铵、氯化铵、氟化铵、甲酸铵、硝酸铵、磷酸铵、硫酸铵、氯化镉、硫酸镉、乙酸钙、氯化钙、氯化铯、氯化亚钴、CH₃(CH₂)₁₅N(CH₃)₃ ⁺Br^-(CTAB)、柠檬酸二铵、磷酸氢二铵、磷酸二铵、酒石酸二铵、磷酸二钾、磷酸二钠、酒石酸二钠、DL-苹果酸、氯化铁、L-脯氨酸、乙酸锂、氯化锂、硝酸锂、硫酸锂、乙酸镁、氯化镁、甲酸镁、硝酸镁、硫酸镁、氯化镍、乙酸钾、溴化钾、氯化钾、柠檬酸钾、氟化钾、甲酸钾、硝酸钾、磷酸钾、酒石酸钾钠、硫酸钾、硫氰酸钾、乙酸钠、溴化钠、氯化钠、柠檬酸钠、氟化钠、甲酸钠、丙二酸钠、硝酸钠、磷酸钠、硫酸钠、硫氰酸钠、琥珀酸、tacsimate、柠檬酸三铵、柠檬酸三锂、三甲胺N-氧化物、柠檬酸三钾、柠檬酸三钠、乙酸锌、硫酸锌及其它起供给共溶质作用的化合物。“结晶缓冲剂”包括维持溶液pH在一所需范围内以利于多肽结晶的化合物。结晶缓冲剂的实例包括ACES(N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸)、BES(N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸)、Bicine(N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸)、BIS-TRIS(2，2-双-(羟甲基)-2，2′，2”-氮川三乙醇)、硼酸、CAPS(3-[环乙氨基]-1-丙磺酸))、EPPS(HEPPS，4-(2-羟乙基)哌嗪-1-丙磺酸)、Gly-Gly(NH₂CH₂CONHCH₂COOH；甘氨酰基-甘氨酸)、HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)、咪唑、MES(2-吗啉乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉)-丙磺酸)、PIPES(哌嗪-1，4-双(2-乙磺酸))、乙酸钠、碳酸氢钠、单碱式磷酸钠(磷酸二氢钠)、TAPS(N-[三-(羟甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸)、TAPSO(N-[三(羟甲基)甲基]-3-氨基-2-羟基丙磺酸)、TES(N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基丙磺酸)、Tricine(N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸)、Tris-HCl、TRIZMA(2-氨基-2-(羟甲基)-1，3-丙二醇)及其它起维持溶液于或接近特定pH的作用的化合物。

经实验确定共溶质、缓冲液等的需要及其浓度以使之利于结晶。下文实例1、2及3中描述用于多肽的合适结晶条件的一些实例。

在工业规模的方法中，导致结晶的受控沉淀可以通过在批量方法中简单合并多肽、沉淀剂、共溶质及视情况之缓冲剂最佳执行。作为另一个选择，可以通过使用多肽沉淀物作为起始材料(“晶种”)结晶多肽。在此情况下，向结晶溶液中加入多肽沉淀物并培育直至晶体形成。也可以采用替代的实验室结晶方法，诸如透析或蒸发扩散。上文McPherson及上文Gilliland在其结晶文献的回顾中全面包括了一列合适条件。有时在欲将所结晶多肽交联的情况下，预定交联剂与结晶介质间的不相容性可能需要将晶体换至更合适的溶剂体系中。

根据本发明的一个实施例，通过以下方法制备多肽晶体、晶体配方和组合物。首先，结晶多肽。其次，向母液中直接加入本文所描述的赋形剂或成分。或者在去除母液后，将晶体悬浮于赋形剂或其它调配成分的溶液中最少1小时至最多24小时。赋形剂浓度通常介于约0.01至30％WAV之间，其分别对应于99.99至70％WAV的多肽晶体浓度。在一个实施例中，赋形剂浓度介于约0.1至10％之间，其分别对应于99.9至90％WAV的晶体浓度。通过过滤或离心可以从晶体浆中去除母液。然后，在室温或者介于-20℃至25℃之间的温度下，视情况以50％至100％的一种或一种以上诸如(例如)乙醇、甲醇、异丙醇或乙酸乙酯的有机溶剂或添加剂溶液洗涤晶体。通过在晶体上通过氮气、空气或惰性气体流干燥晶体。或者通过风干或通过冻干或通过真空干燥干燥晶体。干燥在洗涤之后进行最少1至最多72小时，直至终产物的湿气含量按重量计低于10％，最优选低于5％。最后若需要可以对晶体进行微粉化。多肽晶体的干燥是借助包括以N₂、空气或惰性气体干燥；真空炉干燥；冻干；用挥发性有机溶剂或添加剂洗涤接着蒸发溶剂；或在通风橱内蒸发以去除水、有机溶剂或添加剂或液体聚合物。通常当晶体变为自由流动的粉末时便达到干燥。可以在潮湿晶体上通过气流进行干燥。所述气体可以选自由：氮气、氩气、氦气、二氧化碳、空气或其组合所组成的群组。本发明的多肽晶体可以通过在合适的磨粉机(例如喷射磨粉机)中微粉化进一步处理以达到所需粒子大小分布，并且所述粒子或粉末配方的组分可以在微粉化之前或之后混合。所达到的粒子直径可以在0.1至100微米的范围内，或在0.2至10微米的范围内，或在10至50微米的范围内，或在0.5至2微米的范围内。为通过吸入以施用配方，在一个实施例中从所述多肽晶体形成的粒子在0.5至1微米的范围内。

根据本发明的一个实施例，当制备蛋白晶体时，在结晶期间不加入蛋白晶体配方或组合物、增强剂，例如表面活性剂。在结晶之后向母液中加入赋形剂或成分，其浓度介于约1-10％WAV之间，或者浓度介于约0.1-25％WAV之间，或者浓度介于约0.1-50％WAV之间。这些浓度分别对应于99-90％WAV、99.9-75％WAV和99.9-50％WAV的晶体浓度。赋形剂或成分与晶体在母液中培育约0.1-3hrs，或培育进行0.1-12hrs，或培育进行0.1-24hrs。

在本发明的另一个实施例中，将成分或赋形剂溶解于溶液而非母液，并且将所述蛋白晶体从母液中移除并悬浮于赋形剂或成分溶液中。成分或赋形剂浓度和培养时间与上文所描述的相同。

多肽晶体

如本文所使用的“晶体”或“结晶”是指物质的一种固态形式，其与第二形式-无定形固态相区别。晶体显示的特征特性包括晶格结构、特征外形和光学特性，诸如折射率及双折射率。晶体由以三维周期性重复的模式排列的原子组成(C.S.Barrett，Structure ofMetals，第二版，McGraw-Hill，New York，1952，第1页)。相反，无定形材料是非结晶固态物质，有时称为无定形沉淀物。这些沉淀物不具有结晶固态的分子晶格结构特征并且不显示双折射或其它结晶形式物质的典型光谱特征。

多肽晶体是排列于晶体晶格中的多肽分子。多肽晶体含有三维周期性重复的特定多肽-多肽互作模式。本发明的多肽晶体与诸如那些通过冻干多肽溶液所获得的多肽的无定形固态形式或沉淀物不同。

多肽晶体中，多肽分子形成不对称单元，所述单元一起排列形成对称单元。多肽晶体对称单元的几何结构可以为立方形、六边形、单斜、斜方晶、四边形、三斜或三角形的。整个晶体的整体结构可以是双锥状、立方体、针状、片状、棱柱状、菱形、棒状、球状或其组合形式。“立方形”结构类的晶体可以更特殊的具有十八面体(octadecahedral)或十二面体晶体形式。所述晶体的直径定义为马丁(Martin’s)直径。其测量为平行于目镜标尺的直线长度，其将随机取向的晶体划分为两个相等的投射区域。诸如针状或棒状形式的晶体也具有本文称为晶体长度的最大尺寸。

治疗施用配方

应了解，如本文所使用的“组合物”意谓包含至少两种组分的混合物。具体来说，本发明提供包含结晶TNFR2多肽或使用结晶TNFR2多肽制备的组合物。在本发明的一个实施例中，制备包含结晶TNFR2多肽或由其制备的组合物或配方以使其适于注射及/或施用给所需患者。因为医药目的而施用给患者的组合物大体上无菌并且不含有对受者具有过度毒性或感染性的任何药剂。

在本发明的一个实施例中，诸如结晶依那西普的结晶TNFR2多肽以生理上可接受组合物(本文也称为医药组合物或医药配方)的形式施用，所述组合物包含与一种或一种以上以下物质调配的结晶TNFR2多肽：生理可接受载剂、赋形剂或稀释剂。这些载剂、赋形剂或稀释剂在所应用的剂量与浓度下对受者是无毒性的。制备这些组合物通常需要将结晶TNFR2多肽与一种或一种以上以下物质结合：缓冲剂、抗氧化剂(诸如抗坏血酸)、低分子量多肽(诸如具有少于10个氨基酸的肽)、蛋白、氨基酸、糖类(诸如葡萄糖、蔗糖或糊精)、螯合剂(诸如EDTA)、谷胱甘肽及其它稳定剂与赋形剂。在液体配方中，中性缓冲盐水或混有同种血清白蛋白的盐水是例示性的适合稀释剂。根据适合工业标准，也可以加入防腐剂，诸如苯甲醇。医药配方中可能采用的组合物的其他实例存在于Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Mack Publishing Company，Easton，PA，1980及由美国药物协会(American Pharmaceutical Association)与英国药学会(Pharmaceutical Society of Great Britain)共同出版的Handbook of PharmaceuticalExcipients中。

在一个实施例中，预期将本发明的配方制备为散装配方，并且同样调整医药组合物的组分从而其较施用所需为高，并且在施用前适当稀释。

本发明的多肽晶体可以以适于储存及操作的形式及诸如用于制备气溶胶配方的粉末形式的适于吸入或肺部施用的形式调配成固态结晶或粉末配方。在另一个实施例中，所述多肽晶体可以调配成所述晶体的液态溶液或者调配成所述晶体的浆液。在另一个实施例中，所述多肽晶体用于制备用于治疗施用的诸如水性配方的液态配方。

固态结晶配方

晶体的固态配方理想地适于肺部施用，其对于通过其它施用途经难以传递的生物大分子尤其有用。(参见，例如，PCT专利申请案WO 96/32152，WO 95/24183及WO97/41833)。

多肽晶体的固态配方包括大体上从液态溶液分离或干燥的晶体，并且作为自由晶体或作为粒子以例如粉末的形式存在。在本文中，表述“粉末”是指基本干燥粒子(意即潮湿含量按重量计低于约10％，或按重量计低于约6％，或按重量计低于约4％)的集合。本发明的一个实施例提供将一剂结晶TNFR2多肽雾化的方法，其包含提供作为干燥粉末的结晶TNFR2多肽、在气流中分散一定量的干燥粉末以形成气溶胶及将气溶胶收集在腔室中用于随后的吸入。

多肽晶体或粉末可以视情况与载剂或表面活性剂结合。合适载剂包括1)糖类，例如单糖(诸如果糖、半乳糖、葡萄糖、山梨糖及其类似物)；2)二糖，诸如乳糖、海藻糖及其类似物；3)多糖，诸如棉子糖、麦芽糊精、右旋糖苷及其类似物；4)醛醇，诸如甘露醇、木糖醇及其类似物；5)无机盐，诸如氯化钠及其类似物；及6)有机盐，诸如柠檬酸钠、抗坏血酸钠及其类似物。在某些实施例中，载剂是选自由海藻糖、棉子糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、肌醇、蔗糖、氯化钠和柠檬酸钠所组成的群组。表面活性剂可以选自由脂肪酸盐、胆汁盐或磷脂所组成的群组。脂肪酸盐包括C_10-14脂肪酸盐，诸如癸酸钠、月桂酸钠及肉寇酸钠。胆汁盐包括熊脱氧胆酸盐、牛磺胆酸盐、甘胆酸盐及牛磺二氢梭链孢酸盐(taurodihydrofusidate)。在一个实施例中，所述表面活性剂是诸如牛磺胆酸钠的牛磺胆酸盐。可以用作表面活性剂的磷脂包括溶血卵磷脂。在本发明的粉末配方中结晶多肽与表面活性剂的摩尔比为例如9∶1至1∶9，或介于5∶1至1∶5之间，或介于3∶1至1∶3之间。

存溶液或浆液中的晶体

在一个实施例中，本发明提供致使多肽晶体适于储存在悬浮液中的方法，其包含以非水性溶剂取代结晶缓冲剂(母液)。在另一个实施例中，通过旋转甩出第一溶剂且使用第二有机溶剂或添加剂洗涤剩余结晶固体以去除水接着蒸发非水性溶剂而可以致使结晶浆液变为固体。结晶治疗蛋白的非水性浆液对皮下递送尤具有用。

在一个这样的实施例中，本发明的多肽晶体以稳定所述多肽晶体的目的与液态有机添加剂结合。这样的混合物特征可以在于为包含n％有机添加剂(其中n介于1与99之间)与m％水溶液(m是100-n)的含水-有机混合物。有机添加剂的实例包括酚类化合物，诸如间-甲基苯酚或苯酚或其混合物，以及丙酮、甲醇、甲基异丁酮、氯仿、1-丙醇、异丙醇、2-丙醇、乙氰、1-丁醇、2-丁醇、乙醇、环己烷、二氧杂环乙烷、乙酸乙酯、二甲基甲酰胺、二氯乙烷、己烷、异辛烷、二氯甲烷、叔丁醇、甲苯、四氯化碳或其组合。

液态配方

本发明的一个实施例针对允许医药组合物稳定长期储存的水性配方，其中结晶TNFR2多肽是用于制备医药组合物的活性成分。此配方是有用的，部分是因为患者使用其更为方便，因为此配方不需要任何诸如再水合的额外步骤。如本文所使用的溶液或液态配方意谓含有一种或一种以上溶解于合适溶剂或相互互溶溶剂的混合物中的化学物质的液体制剂。

重建是将多肽晶体或晶体配方或组合物溶解于适当的缓冲液或医药配方中。

医药配方的组分

通过组合除上文所描述的结晶TNFR2多肽之外的下文中列出的一种或一种以上以下类型的许多或全部均可以从供货商购得的成分或赋形剂制备本医药组合物。所属技术领域的一般技术人员应了解待包含于组合物中的多种组分的组合可以以任何适当顺序完成，即可以首先、在中间或最后加入缓冲液，且也可以首先、在中间或最后加入张力调节剂。所属技术领域的一般技术人员也应了解一些此类化学物质可不相容于某些组合，并且因此易于被具有相似特性但是相容于相关混合物的不同化学物质所替代。在所属技术领域具有关于赋形剂及其它成分或材料的多种组合的合适性的知识，所述赋形剂及其它成分或材料存在于例如用于储存医药组合物的容器内及/或用于治疗施用的装置内(参看，例如Akers，2002，JP harm Sci 91：2283-2300)。

酸化剂(“酸化剂”(acidifying means))：乙酸、冰醋酸、柠檬酸、反丁烯二酸、盐酸、稀盐酸、苹果酸、硝酸、磷酸、稀磷酸、硫酸、酒石酸及其它合适的酸。

活性成分：额外活性成分也可以包括于现在所描述的组合物中，例如用以减轻注射位点的不适。这些活性成分包括(但不限于)非甾族抗炎症药物，诸如适合剂量的缓血酸胺(tromethamine)。

气溶推进剂(“推进剂”(propellant means))：丁烷、二氯二氟甲烷、二氯-四氟乙烷、异丁烷、丙烷、三氯单氟甲烷。

聚集抑制剂(“聚集抑制剂”(aggregation inhibiting means))减少多肽结合成不合适的或不希望的三元或四元复合物的趋势。合适的聚集抑制剂包括氨基酸L-精氨酸及/或L-半胱氨酸，其可作用以在例如两年或两年以上的长时期减少含有Fc域多肽的聚集。配方中聚集抑制剂的浓度可以介于约1mM至1M之间，或约10mM至约200mM之间，或约10mM至约100mM之间，或约15mM至约75mM之间，或约25mM。

醇类变性剂(“变性剂”(denaturant means))：苯甲酸变性托宁(denatonium benzoate)、甲基异丁酮、八乙酸蔗糖酯。

碱化剂(“碱化剂”(alkalizing means))：强氨溶液、碳酸铵、二乙醇胺、二异丙醇胺、氢氧化钾、碳酸氢钠、硼酸钠、碳酸钠、氢氧化钠、三乙醇胺。

抗结块剂(“抗结块剂”(anticaking means))：硅酸钙、硅酸镁、胶状二氧化硅、滑石粉。

消泡剂(“消泡剂”(antifoaming means))：二甲基硅油(dimethicone)、二甲基硅油(simethicone)。

抗氧化剂(“抗氧化剂”(antioxdant means))可以包含于本发明配方中。预期用于制备配方的抗氧化剂包括氨基酸(诸如甘氨酸与赖氨酸)、螯合剂(诸如EDTA与DTPA)及自由基清除剂(诸如山梨醇与甘露醇)。其他的抗氧化剂包括抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、次磷酸、单硫代-甘油(monothio-glycerol)、没食子酸丙酯、亚硫酸氢钠、甲醛次硫酸钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、二氧化硫、生育酚及生育酚赋形剂。也预期用于抑制氧化作用的是氮气或二氧化碳罩。在填充过程期间可以将氮气或二氧化碳罩引入小瓶或预先填充的注射器的顶部空间。

缓冲剂(“配方缓冲剂”(formulation buffering means))维持医药配方pH在所需范围内。当设定医药组合物的pH在或接近生理水平时，患者服用后获得最大程度的舒适度。尤其在某些实施例中，医药组合物的pH在约4.0至8.4的pH范围内，或在约5.0至8.0的pH范围内，在约5.8至7.4的pH范围内，在约6.2至7.0的pH范围内。应了解可以根据需要调节pH以最佳化特殊配方中多肽的稳定性与溶解性，并且同样患者仍可忍受的生理范围之外的pH也在本发明范畴以内。适用于本发明医药组合物的多种缓冲剂包括组氨酸、碱金属盐(磷酸钠、磷酸钾或其氢盐或二氢盐)、柠檬酸钠/柠檬酸、乙酸钠/乙酸、柠檬酸钾、顺丁烯二酸、乙酸铵、三-(羟甲基)-氨基甲烷(tris)、多种形式的乙酸盐和二乙醇胺、碳酸铵、磷酸铵、硼酸、乳酸、磷酸、偏磷酸钾、单碱式磷酸钾、乳酸钠溶液和其它所属技术领域已知的医药上可接受的pH缓冲剂。也可以包括诸如盐酸、氢氧化钠或其盐的pH-调节剂以获得所需pH。维持医药组合物在或者接近pH 6.2的一种合适的缓冲剂是磷酸钠。在另一个实例中，乙酸盐在pH 5时较pH 6更为有效，因此在pH5的溶液中比pH 6溶液可以使用较少的乙酸盐。配方中缓冲剂的浓度可以介于约1mM至约1M之间，或者约10mM至约200mM之间。

螯合剂(“螯合剂”(chelating means)，也称为多价螯合剂(sequestering agents))：依地酸二钠(edetate disodium)、乙二胺四乙酸及其盐、依地酸。

包被剂(“包被剂”(coating means))：羧甲基纤维素钠、乙酸纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素、乙基纤维素、明胶、医药釉、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基丙烯酸共聚物、甲基纤维素、聚乙二醇、聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯、虫胶、蔗糖、二氧化钛、巴西棕榈蜡、微晶蜡、玉米醇蛋白。

染料(“着色剂”(coloring means))：焦糖、赤藓红(FD&C红No.3)、FD&C红No.40、FD&C黄No.5、FD&C黄No.6、FD&C蓝No.1、红色颜料、黄色颜料、黑色颜料、蓝色颜料或混合颜料、氧化铁。

络合剂(“络合物-形成剂”(complex-forming means))：乙二胺四乙酸及其盐(EDTA)、依地酸、龙胆酸乙醇胺、氧喹啉硫酸盐。

干燥剂(“干燥剂”(dessicating means))：氯化钙、硫酸钙、二氧化硅。

过滤助剂(“过滤剂”(filtering means))：粉末状纤维素、经纯化的硅质土。

调味剂与香料(“调味剂”(flavoring means))：茴香脑、茴芹精油、苯甲醛、肉桂油、可可粉、乙基香兰素、薄荷醇、水杨酸甲酯、谷氨酸单钠、柑橘花油、柑橘油、薄荷、薄荷油、薄荷精、玫瑰油、浓玫瑰香水、百里酚、吐鲁酊(tolu balsam tincture)、香草、香草酊、香兰素。

保湿剂(“水分保持剂”(moisture-retaining means))：甘油、己二醇、丙二醇、山梨醇。

软膏基质(“软膏剂”(ointment means))：羊毛脂、无水羊毛脂、亲水软膏、白色软膏、黄色软膏、聚乙二醇软膏、凡士林、亲水凡士林、白色凡士林、玫瑰香水凡士林、角鲨烷。

增塑剂(“增塑剂”(plasticizing means))：蓖麻油、二乙酰化单甘油酯、邻苯二甲酸二乙酯、甘油、单-及二-乙酰化单甘油酯、聚乙二醇、丙二醇、乙酸甘油酯、柠檬酸三乙酯。

聚合物膜：乙酸纤维素。

聚合载剂(“载剂”(carrier means))是用于封装多肽晶体以递送多肽的聚合物，所述递送包括生物递送。这些聚合物包括生物相容性和生物可降解性聚合物。所述聚合载剂可以是单一聚合物类型或者其可以由多种聚合物类型的混合物组成。用作聚合载剂的聚合物包括例如聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(氨基酸)、聚(酸酐)、聚(缩酚酸肽)(poly(depsipeptide))、聚(酯)，诸如聚(乳酸)或PLA、聚(乳酸-羟基乙酸共聚物)或PLGA、聚(B-羟基丁酯)、聚(己内酯)和聚(二氧杂环乙酮)(poly(dioxanone))；聚(乙二醇)、聚((羟丙基)甲基丙烯酰胺)、聚[(有机金属)膦腈]、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、顺丁烯二酸酐-烷基乙烯基醚共聚物、聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物多元醇(pluronicpolyol)、白蛋白、天然和合成多肽、藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原蛋白、纤维蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、甘油氨基多糖(glycaminoglycan)、硫酸化多聚糖或任何封装多肽晶体的常规材料。

防腐剂(或“防腐剂”(preserving means))，诸如抗菌防腐剂，预期用于本发明的配方(诸如多剂量配方)内的防腐剂包括氯化苯甲烷铵、氯化苯甲烷铵溶液、苄索氯铵(benzelthonium chloride)、苯甲酸、苯甲醇、对羟基苯甲酸丁酯、氯化十六烷基吡啶、氯代丁醇、氯甲酚、甲酚、去氢乙酸、对羟苯甲酸乙酯、对羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸甲酯钠盐、苯酚、苯乙醇、乙酸苯汞、硝酸苯汞、苯甲酸钾、山梨酸钾、对羟苯甲酸丙酯、对羟苯甲酸丙酯钠盐、苯甲酸钠、去氢乙酸钠、丙酸钠、山梨酸、硫柳汞和百里酚。所包括的防腐剂的量在0％至2％(w/v)的范围内或为约1％(w/v)。

增溶剂与稳定剂(“增溶剂”(solubilizing means)或“稳定剂”(stabilizing means)，也称为乳化剂、共溶质或共溶剂)增加多肽溶解性及/或在溶液中(或以干燥或冷冻的形式)的同时稳定多肽，其也可以加至医药组合物中。增溶剂和稳定剂的实例包括(但不限于)糖/多元醇，诸如：蔗糖、乳糖、甘油、木糖醇、山梨醇、甘露醇、麦芽糖、肌醇、海藻糖、葡萄糖；聚合物，诸如：血清白蛋白(牛血清白蛋白(BSA))、人类SA(HSA)或重组HA、右旋糖苷、PVA、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、聚乙烯亚胺、明胶、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羟乙基纤维素(HEC)；非水性溶剂，诸如：多羟基醇(例如，PEG、乙二醇和甘油)、二甲亚砜(DMSO)和二甲基甲酰胺(DMF)；氨基酸，诸如：脯氨酸、L-甲硫氨酸、L-丝氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸盐酸盐、肌氨酸和γ-氨基丁酸；表面活性剂，诸如：Tween-80、Tween-20、SDS、聚山梨醇酯、聚氧化乙烯共聚物；以及各种稳定赋形剂，诸如：磷酸钾、乙酸钠、硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、三甲胺N-氧化物、甜菜碱、金属离子(例如，锌、铜、钙、锰和镁)、CHAPS、单月桂酸酯、2-O-β-甘油酸甘露酯；或任何以下物质：阿拉伯树胶、胆固醇、二乙醇胺(佐剂)、单硬脂酸甘油酯、羊毛醇、卵磷脂、单甘油酯和甘油二酯、单乙醇胺(佐剂)、油酸(佐剂)、油醇(稳定剂)、泊洛沙姆(poloxamer)、聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚氧基35蓖麻油、聚氧基40氢化蓖麻油、聚氧基10油烯基酯、聚氧基20鲸蜡硬脂酸酯、聚氧基40硬脂酸酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、二乙酸丙二酯、单硬脂酸丙二酯、月桂基硫酸钠、硬脂酸钠、单月桂酸山梨酯、单油酸山梨酯、单棕榈酸山梨酯、单硬脂酸山梨酯、硬脂酸、三乙醇胺、乳化蜡；湿化及/或稳定剂，诸如氯化苯甲烷铵、苄索氯铵(benzelthonium chloride)、氯化十六烷基吡啶、多库酯钠(docusatesodium)、壬苯醇醚9、壬苯醇醚10、辛苯聚糖9、聚氧基50硬脂酸酯、泰洛沙泊(tyloxapol)；或任何以上的组合。配方中增溶剂/稳定剂的浓度可以介于约0.001全5重量百分比之间，或者约0.1至2重量百分比之间。在一个实施例中，稳定剂是选自山梨聚糖单-9-十八烯酸酯聚(氧代-1，2-乙二基)的衍生物，其包括(但不限于)聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20。在单独使用或多剂量配方中，用于本实施例的聚山梨醇酯20或80的量是在0.001％至0.1％(w/v)范围内，诸如0.005％(w/v)。在另一个实施例中，在所述配方中包括0.05mM至50mM范围内的游离L-甲硫氨酸：单独使用配方的游离L-甲硫氨酸量是0.05mM至5mM，而多剂量配方的量是1mM至10mM。

溶剂(“溶解剂”)：丙酮、乙醇、稀乙醇、戊烯水合物、苯甲酸苄酯、丁醇、四氯化碳、氯仿、玉米油、棉子油、乙酸乙酯、甘油、己二醇、异丙醇、甲醇、二氯甲烷、甲基异丁酮、矿物油、花生油、聚乙二醇、碳酸丙二酯、丙二醇、芝麻油、注射用水、注射用无菌水、冲洗用无菌水、纯净水。

吸附剂(Sorbents)(也被称为吸附剂(adsorbents)“吸附剂”(adsorbing means))：粉末状纤维素、木炭、纯净硅藻土；和二氧化碳吸附剂：氢氧化钡石灰、苏打石灰。

固化剂(“固化剂”(stiffening means))：氢化蓖麻油、十六十八混合醇、十六醇、十六酯蜡、硬脂、石蜡、聚乙烯赋形剂、硬脂醇、乳化蜡、白蜡、黄蜡。

栓剂基质(“栓剂”(suppository means))：可可油、硬脂、聚乙二醇。

悬浮及/或增粘剂(“增粘剂”(viscosity-increasing means))：阿拉伯树胶、琼脂、褐藻酸、单硬脂酸铝、膨润土、纯化膨润土、岩浆膨润土、卡波姆(carbomer)934p、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙12、角叉胶、微晶和羧甲基纤维素钠纤维素、糊精、明胶、瓜尔胶、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硅酸铝镁、甲基纤维素、果胶、聚氧化乙烯、聚乙烯醇、聚烯吡酮、藻酸丙二酯、二氧化硅、胶质二氧化硅、藻酸钠、黄芪胶、三仙胶。

增甜剂(“增甜剂”(sweetening means))：天冬酰苯丙氨酸甲酯、葡萄糖结合剂、右旋糖、赋形剂右旋糖、果糖、甘露醇、糖精、糖精钙、糖精钠、山梨醇、溶解山梨醇、蔗糖、压缩糖、糕点糖、糖浆。

片剂结合剂(“片剂结合剂”(tablet binding means))：阿拉伯树胶、褐藻酸、羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、糊精、乙基纤维素、明胶、液态葡萄糖、瓜尔胶、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、聚氧化乙烯、聚烯吡酮、膨化淀粉、糖浆。

片剂及/或胶囊稀释剂(“稀释剂”(diluent means))：碳酸钙、二碱式磷酸钙、三碱式磷酸钙、硫酸钙、微晶纤维素、粉末状纤维素、葡萄糖结合剂、糊精、右旋糖赋形剂、果糖、高岭土、乳糖、甘露醇、山梨醇、淀粉、膨化淀粉、蔗糖、压缩糖、糕点糖。

片剂崩解剂(“片剂崩解剂”(tablet disintegrant means))：褐藻酸、微晶纤维素、交联羧甲纤维素钠、交联聚烯吡酮、波拉克林钾(polacrilin potassium)、羟基乙酸淀粉钠、淀粉、膨化淀粉。

片剂及/或胶囊润滑剂(“润滑剂”(lubricating means))：硬脂酸钙、山嵛酸甘油酯、硬脂酸镁、轻矿物油、聚乙二醇、硬脂酰延胡索酸钠、硬脂酸、纯化硬脂酸、滑石粉、氢化植物油、硬脂酸锌。

张力调节剂(“张力调节剂”(tonicity modifying means))应了解其为对溶液渗透度有所贡献的分子。优选地调节医药组合物的渗透度以最大化活性成分的稳定性并且也最小化患者服用后的不适。血清大约300+/-50微渗透压摩尔(milliosmolals)每千克。通常优选医药组合物是与血清等渗的，意即具有系统或相似的渗透度，其通过加入张力调节剂达到，因此预期渗透度从约180至约420微渗透压摩尔(milliosmolals)，然而应了解渗透度可以比特定条件要求高或低。适于调节渗透度的张力调节剂的实例包括(但不限于)氨基酸(例如，精氨酸、半胱氨酸、组氨酸和甘氨酸)、盐(例如，氯化钠、氯化钾和柠檬酸钠)及/或糖类(例如，蔗糖、葡萄糖、右旋糖、甘油和甘露醇)。配方中张力调节剂的浓度可以介于约1mM至1M之间，或者约10mM至约200mM之间。在一个实施例中，张力调节剂是在0mM至200mM浓度范围内的氯化钠。在另一个实施例中，张力调节剂是山梨醇或海藻糖，并且不存在氯化钠。

载体(“载剂”(vehicle means))：调味及/或增甜的(香药酒、化合物苯甲醛酏剂、异醇酏剂、薄荷水、山梨醇溶液、糖浆、吐鲁香油糖浆(tolu balsam syrup))；油质的(杏仁油、玉米油、棉子油、油酸乙酯、肉寇酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、矿物油、轻矿物油、肉蔻醇、辛基十二醇、橄榄油、花生油、桃仁油、芝麻油、大豆油、角鲨烷)；诸如糖球的固态载剂；无菌的(注射用抑菌水、注射用抑菌氯化钠)。

憎水剂(“憎水剂”(water-repelling means))：环甲硅油、二甲基硅油(dimethicone、simethicone)。

在某些实施例中，医药组合物包含选自以下的化合物，或者其任何组合：以下物质的盐类1)氨基酸，诸如甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、脯氨酸；2)糖，例如单糖，诸如葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、核糖；3)二糖，诸如乳糖、海藻糖、麦芽糖、蔗糖；4)多糖，诸如麦芽糊精、糊精、淀粉、糖原；5)醛醇，诸如甘露醇、木糖醇、乳糖醇、山梨醇；6)葡醛酸、半乳糖醛酸；7)环式糊精，诸如甲基环式糊精、羟丙基-B-环式糊精及其类似物；8)无机盐，诸如氯化钠、氯化钾、氯化镁、磷酸钠和磷酸钾、硼酸碳酸铵和磷酸铵；9)有机盐，诸如乙酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、乳酸盐；10)乳化剂或增溶剂，如阿拉伯树胶、二乙醇胺、单硬脂酸甘油酯、卵磷脂、单乙醇胺、油酸、油醇、泊洛沙姆、聚山梨酸盐、月桂基硫酸钠、硬脂酸、单月桂酸山梨酯、单硬脂酸山梨酯及其它山梨聚糖衍生物、聚氧基衍生物、蜡、聚氧乙烯衍生物、山梨聚糖衍生物；11)增粘试剂，如琼脂、褐藻酸及其盐、瓜尔胶、果胶、聚乙烯醇、聚氧化乙烯、纤维素及其衍生物碳酸丙二酯、聚乙二醇、己二醇、泰洛沙泊(tyloxapol)；及12)特殊成分，诸如蔗糖、海藻糖、乳糖、山梨醇、乳糖醇、肌醇、钠盐和钾盐，诸如乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐、甘氨酸盐、精氨酸盐、聚氧化乙烯盐、聚乙烯醇盐、聚乙二醇盐、己二醇盐、甲氧基聚乙二醇盐、果胶盐、羟丙基-B-环式糊精盐。

持续释放形式

在本发明一个优选实施例中，使用结晶TNFR2多肽的持续释放形式(也称为“受控释放”形式)，其包括结晶TNFR2:Fc的持续释放形式；持续或受控形式包含用于延长结晶多肽经所需时间的物理释放或生物可用性的结晶多肽和物质(“持续释放剂”)。适于用于所揭示方法的持续释放形式包括(但不限于)结晶TNFR2多肽，所述TNFR2多肽封装于诸如缓慢溶解生物相容性聚合物(例如，本文所描述的聚合载剂、美国第6,036,978号所描述的藻酸盐微粒或者美国第6,083,534号所描述的乙酸聚乙烯-乙烯酯(polyethylene-vinyl acetate)、聚(乳酸-葡萄糖酸))组合物)的持续释放剂内、与这些聚合物(包括局部应用的水凝胶)混合、及或装入生物相容性半渗透性内植体中。本发明的另外实施例包括诸如聚合微粒的其它持续释放形式，其中活性成分和诸如聚合物(例如PLGA)的持续释放剂的混合物分散于连续相中，并且直接冻干所产生的分散液以去除水和有机溶剂或添加剂，并形成所述微粒(美国专利第6,020,004号)；包含生物可降解阴离子多糖(诸如藻酸酯)、多肽和至少一个结合多价金属离子的可注射凝胶组合物(美国专利第6,432,449号)；具有反向热凝胶化特性和视情况pH响应凝胶化/溶胶化特性的可注射生物可降解聚合基质(美国专利的第6,541,033号和第6,451,346号)；生物可降解多元醇：油悬浮液，诸如其中悬浮液包含约15重量％至约30重量％范围内的多元醇的悬浮液(美国专利第6,245,740号)。这些持续释放形式适于多肽以其中补给库是内植体的补给库的形式施用的连续递送或者可以是可注射微滴、纳米小球或凝胶的形式。上文所列出的美国专利(美国专利第6,036,978号、第6,083,534号、第6,020,004号、第6,432,449号、第6,541,033号、第6,451,346号和第6,245,740号)全文以引用的方式并入本文。此外，本发明结晶多肽的持续或受控形式包含持续释放剂类型，诸如Kim，C，2000，″Controlled Release Dosage Form Design″，Techonomic Publishing Co.，Lancaster PA所描述的类型，其包含以下物质：天然聚合物(明胶、藻酸钠、三仙胶、阿拉伯胶或壳聚糖)、半合成聚合物或纤维素衍生物(甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、乙酸丙酸纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素或羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯)和合成聚合物(离子交换树脂(甲基丙烯酸、磺酸化聚苯乙烯/二乙烯基苯)、聚丙烯酸(卡波姆(Carbopol))、聚(MMA/MAA)、聚(MMA/DEAMA)、聚-(MMA/EA)、聚(邻苯二甲酸乙烯乙酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乳酸)、聚(羟基乙酸)、聚(乳酸/羟基乙酸)、聚乙二醇、聚氧化乙烯、聚-(二甲基硅酮)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(乙烯/乙酸乙烯酯)、聚(乙烯-/乙烯醇)、聚丁二烯、聚(酸酐)、聚(原酸酯)和聚(谷氨酸))。

由于封装于聚合载剂基质内以保持其天然和生物活性三级结构的优点，本发明其它实施例包括封装于至少一种聚合载剂内以形成微小球的TNFR2多肽晶体，如美国专利第6,541,606号所描述，其全文以引用的方式并入本文。将待封装的TNFR2多肽晶体或其配方悬浮于溶解在有机溶剂或添加剂中的诸如PLGA的聚合载剂中。所述封装TNFR2多肽晶体保持TNFR2多肽的生物活性的时间比TNFR2多肽在溶液中储存于可比条件下更长。

说明性实施例

所述配方可以在约pH6.0至约pH7.0下包含约25至约50mg从结晶形式再生的TNFR2多肽或依那西普、约10mM至约100mM L-精氨酸、约10mM至约50mM磷酸钠、约0.75％至约1.25％蔗糖和约50mM至约150mM NaCl。在另一个实施例中，配方中的L-精氨酸可以替代成L-半胱氨酸(约1至约500微摩尔)。在另一个实施例中，pH可以为约pH7.0。在另一个实施例中，医药组合物在pH6.2下包含25mg/mL结晶TNFR2、约25mM L-精氨酸、约25mM磷酸钠、约98mM氯化钠和约1％蔗糖。在另一个实施例中，其中结晶依那西普或从结晶形式再生的依那西普具有比非结晶依那西普制剂高的每单位依那西普生物活性水平，所述配方可以包含约10至约50mg结晶依那西普或从结晶形式再生的依那西普，或者约15至约25mg结晶依那西普或从结晶形式再生的依那西普。

测试配方的多肽稳定性和生物活性

在另一个实施例中，本发明提供用于本发明医药组合物中结晶TNFR2多肽稳定性的加速稳定性测试的方法，其包含以下步骤：测试根据本发明在储存之前，意即时间0配制的多肽的活性；37℃储存组合物一个月并测量多肽的稳定性；和比较从0时至一个月时间点的稳定性。此信息有利于早期消除显示初试具有高稳定性但并不可以长期良好储存的批次或组。

此外，本医药组合物提供经改良的长期储存性从而例如结晶TNFR2多肽的活性成分在液态或冷冻状态下都在储存期间稳定。应了解本文所用的短语“长期”意谓医药组合物可以储存3个月或更长，6个月或更长，且优选地1年或更长。也应了解长期储存意谓医药组合物在液态于2-8℃下储存或者例如-20℃或更冷温度下冷冻储存。也涵盖所述组合物可以冻融一次以上。应了解关于长期储存的术语“稳定”意谓所述医药组合物的活性多肽并不失去20％以上，或更优选地15％，或甚至更优选地10％，以及最优选地5％的其相对于储存开始时组合物的活性。通过包括诸如ELISA测定的配体结合测定的多种测定的任何一种可以测定TNFR2多肽的活性，其中配体结合至固态支持物上，加入TNFR2多肽的测试和对照制剂，以及用针对TNFR2多肽的Ig组分的经标记抗-Ig抗体检测TNFR2多肽与配体的结合。此外，诸如实例6所描述的测定可以用于检测结合TNF的TNFR2多肽的生物活性，或者可以经修改以测试结合其它配体的TNFR2多肽的活性。

施用和剂量

如本文所使用的“结晶TNFR2的施用”或“结晶TNFR2多肽的施用”意谓包含结晶TNFR2多肽或者用结晶TNFR2多肽制备的医药组合物的施用。

可以使用任何有效施用途经以治疗性施用结晶TNFR2。如果注射，那么可通过快速注射或连续灌输经由例如关节内、静脉内、肌肉内、疾病部位内、腹膜内或皮下途经施用结晶TNFR2。其它合适施用方法包括从内植体、补给库(内植的或注射的)持续释放、栓剂、气溶胶吸入、眼药水、包括药丸、糖浆、含片或口香糖的口服制剂以及诸如洗液、凝胶、喷雾、药膏的局部制剂或其它合适技术。当结晶TNFR2与一种或一种以上其它生物活性化合物组合施用时，其可以通过相同或不同的途经施用，且可以同时、单独或相继地施用这些药物。

适合剂量可在标准剂量试验中确定，并且可根据所选施用途经变化。施用的量和频率取决于这些因素：待治疗适应症的性质和严重性、所要反应、患者的年龄和条件等等。在以下给药方案中，应了解所施用的结晶TNFR2量为包含结晶TNFR2的医药组合物的结晶TNFR2的量，或者用结晶TNFR2制备的医药组合物的TNFR2多肽的量。

在本发明的一个实施例中，每周施用结晶TNFR2一次以治疗本文所揭示的医学病症或病情，在另一个实施例中至少每周施用两次，且在另一个实施例中至少每周施用三次。成年患者是年龄在18岁或以上者。如果注射，每个成人剂量的结晶TNFR2的有效量范围为1-20mg/m²人体表面积，并且优选地范围可以是5-100mg/剂量。用于待通过皮下注射施用的平台剂量(flat dose)的例示性剂量范围为5-25mg/剂量、25-50mg/剂量和50-100mg/剂量。在本发明的一个实施例中，下文所描述的多种适应症可通过施用含有或从结晶TNFR2制备的用于注射的可接受制剂治疗，其每剂量含有25毫克TNFR2或者每剂量含有50毫克TNFR2。尤其对于慢性情形，可以重复施用25mg和50mg剂量。如果使用除注射以外的施用途经，那么根据标准医学实践适当调整剂量。在多个实例中，虽然可能需要较长时间的治疗以引起所需改善的程度，但是通过在至少三周的时期每周注射一至三次约25mg结晶TNFR2的剂量或者至少三周每周一或两次的50mg结晶TNFR2的剂量，可以改善患者的病情。对于不能治愈的慢性病情，所述疗法可长期持续，但如果所述患者的医师认为需要可对剂量和频率作出调整。

对于儿科患者(年龄4-17岁)，合适疗法包含通过每周皮下注射一次或一次以上施用而皮下注射0.4mg/kg体重，最高至25mg/剂量的结晶TNFR2。

除了人类患者以外，结晶TNFR2多肽用于治疗本文所描述的折磨诸如宠物(狗、猫、鸟、灵长类等)、家养的饲养动物(马、牛、羊、猪、鸟等)或者任何遭受可比于本文所描述之一病情的动物的非人类动物的病情。在这些实例中，可根据所述动物的体重确定适合剂量。例如，可以使用0.2-1mg/kg的剂量。或者，根据所述动物的表面积确定剂量，例示性剂量范围为0.1-20mg/m²体表面积，或者更优选地5-12mg/m²体表面积。对于诸如狗或猫的小型动物，合适的剂量是0.4mg/kg体重。在另一个实施例中，结晶TNFR2(其中所述TNFR2多肽优选地由源自与患者同种的基因表达)通过注射或其它合适途经每周施用一次或一次以上直至动物病情改善，或者其可以长期施用。

在另一个实施例中，其中结晶TNFR2多肽或从结晶形式再生的TNFR2多肽具有比非结晶TNFR2多肽制剂更高水平的每单位TNFR2多肽生物活性，根据结晶TNFR2多肽生物活性的增加程度可以适当减少上文给定的剂量。例如，如果结晶作用增加每单位TNFR2多肽的生物活性两倍，那么上述剂量可以减至上述剂量和剂量范围的50％；在其它实施例中，将剂量减至上述剂量的10至95％，或减至上述剂量的25至75％，或减至上述剂量的60％或70％或80％。

本发明另外包括与一种或一种以上其他药物同时施用结晶TNFR2，所述药物与包含结晶TNFR2多肽或用结晶TNFR2多肽制备的医药组合物结合施用至相同患者，各种药物根据适于所述医药的疗法施用。“同时施用”涵盖与组合以及疗法的组分同时或相继处理，在所述组合或疗法中所述药物变更或者其中一种组分长期施用而其它的间歇施用。组分可以相同或单独的组合物且通过相同或不同的施用途经施用。

治疗用途

本发明关于通过施用结晶TNFR2多肽治疗多种医学病症的方法。结晶TNFR2多肽可以本文所描述的(但不限于)组合及/或同时疗法例示的方式与其它生物活性分子一起施用。本发明提供用于治疗经受医学病症的包括人类患者的哺乳动物患者的化合物、组合物和方法。因为本揭示的目的，术语“病”、“疾病”、“医学病情”、“反常病情”及其类似术语和术语“医学病症”交替使用。

根据本发明，对具有医学病症的患者施用治疗有效量的结晶TNFR2多肽。结晶TNFR2多肽可以是TNF-α-结合可溶性TNF-α受体的结晶形式，诸如结晶TNFR2:Fc。如本文所用，短语“施用治疗有效量”的治疗剂意谓以一定量的药剂且历时足以引起至少一种反映所述病症的严重性的指标在基线以上持续改善的时间治疗患者。如果患者在至少两次时期都展示改善时，那么认为所述改善是“持续”的，所述两次时期之间间隔一周或一周以上。根据病征或症状确定改善程度，并且确定也可以采用通过患者填写的问卷完成，诸如生活质量问卷。可以评估反映患者患病程度的多种指标以确定治疗的量和时间是否充分。通过在施用第一剂结晶依那西普或其它结晶TNFR2多肽之前检查患者以建立所选一个或多个指标的基线值。优选地，在约施用第一剂量60天内检查基线。如果施用结晶TNFR2多肽治疗急性症状，诸如(例如)治疗膝盖外伤，那么第一剂量应该在受伤发生后尽可能迅速地施用。

通过施用结晶TNFR2多肽致使病症改善，直至患者显示所选指标的改善超过基线。在治疗慢性病情中，通过在超过至少一个月或一个月以上时期，例如一个月、两个月、三个月或更长、或者长期，重复施用此药物获得此改善程度。一至六周的时期或者甚至单个剂量通常足够治疗急性病情。单个剂量可能足够治疗受伤或急性情形。虽然根据一个或一个以上的指标可能显示治疗后患者疾病的程度有所改善，但是相同水平或者降低剂量或频率的治疗可能仍然长期延续。一旦治疗已经降低或停止，如果症状再次出现，则其随后可能恢复为原始水平。

在一个实施例中，欲用结晶TNFR2多肽治疗的医学病症的特征在于异常或过量的TNF-α水平。已经提出TNF-α的全身性或局部性的过量利于多种医学病症的发展。例如，慢性心力衰竭患者具有高水平的血清TNF-α，其已经显示随疾病发展而增加(参看，例如，Levine等人，N Eng J Med 323：236-241，1990)。多种其它疾病与高水平的TNF-α相关(参看，例如，Feldman等人，Transplantation Proceedings 30：4126-4127，1998)。其暗示抑制TNF-α可能对遭受特征在于TNF-α表达异常或过量的疾病的患者是有益的。然而，虽然发明这些疾病的有效治疗已经取得进步，但是仍然需要改良的治疗医药和方法。

本文提供用于治疗特征在于TNF-α表达异常的多种病症的方法，其通过施用诸如结晶形式的可溶性TNF-α受体(诸如TNFR2：Fc)的结晶TNFR2多肽，历时一段足以致使患者病情持续改善的时间来治疗。本方法包含对患者施用包含结晶TNFR2多肽的组合物或由其制备的配方，所述多肽可以诸如通过阻止TNF-α与其细胞表面受体(TNFR)结合减少有效量的内源生物活性TNF-α，。

心血管病症

心血管病症可用所揭示的结晶TNFR2多肽、其医药组合物及/或组合疗法治疗。可以诸如结晶TNFR2:Fc的结晶TNFR2多肽治疗的心血管病症的实例包括：大动脉瘤；动脉炎；包括脑动脉闭塞的血管闭塞；冠脉搭桥术并发症；缺血/再灌注损伤；心脏病，包括动脉粥样硬化性心脏病、包括慢性自体免疫心肌炎和病毒性心肌炎的心肌炎；心力衰竭，包括慢性心力衰竭(CHF)、心力衰竭恶病质；心肌梗塞；心脏手术后再狭窄；隐匿性心肌缺血；左心室辅助器的植入后并发症；雷诺现象(Raynaud′s phenomena)；血栓静脉炎；包括Kawasaki′s脉管炎的脉管炎；巨细胞动脉炎、韦格纳肉芽肿病(Wegener′sgranulomatosis)和Schoenlein-Henoch紫癜。

此外，本文所揭示的TNFR2:Fc或其它结晶TNFR2多肽可以与用于治疗包括缺血或非缺血起因的心肌症的心血管疾病的骨髓或血管生成干细胞疗法、心肌梗塞后血管生成疗法或者用于周围动脉疾病的治疗组合使用。用于此目的干细胞包括间叶干细胞和内皮前体细胞，诸如在脾、胎儿肝脏、骨髓或循环血液中发现的干细胞(美国专利第5,486,359号；Deisher T，Drugs 3(6)：649-53(2000)；Huss R，Stem Cells 18：1-9(2000)；Huss等人，StemCells 18：252-60(2000))。可以同时给予结晶TNFR2多肽与干细胞转植体以及以增殖或分化的干细胞生长因子处理。

已经暗示TNF-α和IL-8作为动脉硬化性腹部大动脉瘤中的趋化因子(Szekanecz等人，Pathobiol 62：134-139(1994))。通过施用诸如结晶TNFR2:Fc的结晶TNFR2多肽可以治疗人类患者的腹部大动脉瘤，其可以与IL-8抑制剂组合施用，此治疗具有减少与此病情相关的生理性新血管形成的效应。

研究已经显示金属蛋白酶(MMP)是心肌重塑和纤维化中的关键要素。因此，施用结晶TNFR2多肽以抑制TNF-α和与MMP的直接抑制相关的炎症反应将减少、阻止或逆转诸如左心室泵功能障碍的病症。其通过诸如结晶TNFR2:Fc的结晶TNFR2多肽与MMP抑制剂的共同施用完成。或者，左心室泵功能障碍的治疗可能包含施用结晶TNFR2多肽而不同时使用MMP抑制剂。

也可以将任何本文所揭示的结晶TNFR2多肽或本文揭示的组合治疗用以治疗家族性混合型高脂血症(FCH)。FHC是特征为不成熟冠心病的遗传性血脂异常。FCH患者的TNFR II基因具有遗传性缺陷，其体内具有低水平的TNFR II水平，并且表现为对内源TNF-α的有害效应具有高反应性(van Greevenbroek等人，2000，Atherosclerosis 153：1-8)。与FCH相关的冠心病、胰岛素抵抗和肥胖可以通过对FCH患者施用本文诸如结晶TNFR2:Fc或结晶依那西普的所揭示的任何一种结晶TNFR2多肽改善或预防。此外，用于FCH结晶TNFR2多肽治疗可以与减少饮食脂肪和胆固醇及/或与一种或一种以上用以治疗此病情的其它药物并用，所述其它药物包括胆汁酸螯合树脂(消胆胺和考来替泊(colestipol))、烟酸、尼克酸、诸如吉非罗齐(gemfibrozil)或普罗布考(probucol)，或者一种降胆固醇的“斯达汀”(statin)的降胆固醇药物或者诸如洛伐他汀(lovastatin)或普伐他汀(pravastatin)的HMG-CoA还原酶抑制剂。在本发明另一方面，使用结晶TNFR2多肽治疗患者，所述患者具有高血清水平的C-反应蛋白(CRP)并且其因此甚至当其胆固醇可能较低时处于心脏病发作的风险(Ridker等人，2001，New Eng J Med 344：1959-1965)。

感染和损伤

本文所述揭示的结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法用于治疗细菌、病毒或原生生物感染及其所引起的并发症的药物。一种此类疾病是支原体肺炎。此外，本文提供结晶TNFR2多肽治疗AIDS及相关病情的用途，诸如AIDS痴呆复合症、AIDS相关消瘦、抗逆转录病毒疗法引起的脂质体萎缩(lipidistrophy)和卡波西肉瘤(Kaposi′ssarcoma)。本文提供结晶TNFR2多肽治疗包括疟疾(包括脑疟疾)和血吸虫病的原生生物疾病的用途。另外提供结晶TNFR2多肽以治疗麻疯结节性红斑、细菌性或病毒性脑膜炎、包括肺结核的结核以及细菌或病毒感染的继发性肺炎。本文也提供结晶TNFR2多肽制备治疗诸如由回归热螺旋体(Borrelia recurrentis)引起的虱媒回归热的药物的用途。结晶TNFR2多肽也可以用于制备治疗诸如单纯疱疹性角膜基质炎、角膜损害和病毒引起的角膜病症的由疱疹病毒引起的病情的药物。此外，结晶TNFR2多肽可以用于治疗人乳头状瘤病毒感染以及治疗传染性单核细胞增多症。结晶TNFR2多肽也可以用于制备治疗流行性感冒以及治疗关键疾病多神经病和肌病(CIPNM)(偶尔与持续性脓毒性病联合发生的炎性综合症)的药物。本结晶TNFR2多肽也用于治疗传染性海绵状脑病，其被认为是由蛋白病毒(prions)介导。

可以用任何所揭示的结晶TNFR2多肽、其医药组合物及/或组合疗法治疗的另一种病症是与脑髓病(TSP/HAM)相关的热带下肢痉挛性瘫痪/HTLV-1。此疾病由人逆转录酶病毒HTLV-1感染引起。最近的研究暗示TNF-α可在由HTLV-感染细胞所展示的谷氨酸盐的吸收减少中扮演角色(Szymocha等人，2000，J Virol 74：6433-6441)。TSP/HAM是发展缓慢的脊髓病情，其导致腿部的软弱和肌肉坚硬，通常并发脚部失去知觉。此病情的已知治疗方法包括皮质类固醇和血浆除去法。TSP/HAM可以用本文所揭示的任何结晶TNFR2多肽治疗，其中任何可以与皮质类固醇、血浆除去法或者与其全部并用。治疗TSP/HAM的例示性结晶TNPR2多肽是结晶TNFR2:Fc。通过监控患者腿部力量的改善或患者恶化的终止，或者通过患者的医师所认为的任何其他方法确定治疗是否充分。

可由所揭示的结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法治疗的其它病情包括头部或脊髓损伤导致的病情，并且包括头部外伤引起的硬膜下血肿的病情。

神经性病症、疼痛和发热

颈源性头痛是由颈部功能异常引起的一种普通形式的头痛，并且其与高水平的TNF-α相关，TNF-α被认为介导引起患者不适的发炎性病情(Martelletti，Clin ExpRheumatol 18(2Suppl 19)：S33-8(3月-4月，2000))。颈源性头痛可以通过施用本文所揭示的结晶TNFR2多肽治疗，因此减少炎症反应和相关的头痛。

此外，用本结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法治疗慢性疼痛病情，诸如慢性骨盆疼痛，包括慢性前列腺炎/骨盆疼痛综合症。如其它实例，用本发明的结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法治疗疱疹后疼痛。

本发明的结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法用于治疗原发性淀粉样变性病。此外，特征为多种病情的继发性淀粉样变性病也可以用诸如结晶TNFR2:Fc和本文所描述的组合物及/或组合疗法的结晶TNFR2多肽治疗。这些病情包括：阿尔兹海默氏病(Alzheimer′s disease)，继发性反应性淀粉样变性病；唐氏综合征(Down′s syndrome)；和透析相关淀粉样变性病。本发明的结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法也可以治疗遗传周期发热综合症，包括家族性地中海热、高免疫球蛋白D和周期发热综合症以及TNF-受体相关周期综合症(TRAPS)。

所揭示的结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法另外用于治疗以下病症：急性多神经病；神经性厌食症；贝尔氏麻痹(Bell′s palsy)；慢性疲劳综合症；传染性痴呆，包括库贾氏病(Creutzfeld-Jacob disease)；脱髓鞘性神经病；格巴尔氏综合征(Guillain-Barresyndrome)；椎间盘病；海湾战争综合症；重症肌无力；沉默性脑缺血；睡眠病症，包括嗜睡症和睡眠呼吸暂停；慢性神经退化；和包括脑缺血病的中风。

肿瘤和血液病症

本文提供用结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法治疗多种肿瘤和血液病症的方法。例如，用结晶TNFR2多肽治疗多种形式的癌症，包括急性骨髓性白血病、爱-巴(Epstein-Barr)病毒阳性鼻咽癌、胆囊癌、神经胶质瘤、结肠癌、胃癌、前列腺癌、肾细胞癌、子宫颈癌和卵巢癌、肺癌(SCLC和NSCLC)，包括癌症相关恶心、癌症相关恶病质、疲劳、虚弱、恶病质和血钙过多的副瘤综合征。用本结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法可治疗的其它疾病是实体肿瘤，其包括：肉瘤、骨肉瘤和恶性肿瘤，诸如腺癌(例如乳癌)和鳞片状细胞癌。此外，本化合物、组合物及/或组合疗法用于治疗白血病，包括慢性或急性骨髓白血病，慢性或急性淋巴白血病和毛发细胞白血病。包括骨髓瘤的具有侵入转移潜力其它恶性肿瘤可以用本化合物、组合物及/或组合疗法治疗。当用结晶TNFR2多肽治疗肿瘤时，此治疗可以结合针对膜蛋白的抗体施用，所述蛋白在治疗的特定肿瘤上高水平表达。例如，诸如乳癌、卵巢癌和前列腺恶瘤或其它Her2-阳性肿瘤的肿瘤可以施用以结晶TNFR2:Fc或其它结晶TNFR2多肽与Her2/neu的抗体，诸如HERCEPTIN(一般称为“曲妥珠单抗(trastuzumab)”Genentech，Inc.)。例如卵巢癌或前列腺癌的癌症可以并用结晶TNFR2多肽(诸如结晶TNFR2:Fc)和干扰素-γ治疗(Windbichler等人，2000，British J Cancer 82：1138-1144)。

多种淋巴组织增生病症可用所揭示的结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法治疗。其包括(但不限于)自身免疫淋巴组织增生综合症(ALPS)、慢性淋巴白血病、毛细胞白血病、慢性淋巴腺白血病、周围T-细胞淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、伯基特氏(Burkitt′s)淋巴瘤、爱-巴病毒阳性T-细胞淋巴瘤、组织细胞淋巴瘤、霍奇金氏(Hodgkin′s)病、弥漫型聚集淋巴瘤、急性淋巴腺白血病、Tγ淋巴组织增生病、皮肤B细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(意即蕈样肉芽肿)和Sezary综合症。

此外，可以用所揭示的结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法治疗贫血和血液病症，包括慢性贫血病、再生障碍性贫血，包括范可尼氏(Fanconi′s)再生障碍性贫血；特发性血小板减少性紫癜(ITP)；骨髓增生异常综合征(包括难治性贫血、环形铁粒幼细胞性难治性贫血、过量芽细胞难治性贫血、转化中过量芽细胞难治性贫血)；骨髓纤维变性/骨髓组织变性和镰刀细胞血管闭塞危险期。此外，诸如结晶TNFR2:Fc的结晶TNFR2多肽用于治疗慢性先天嗜中性白血球减少症。

可以用结晶TNFR2多肽和一个或一个以上抗血管新生因子的组合治剂实体肿瘤，因此减少滋养肿瘤组织的血管分布。这些组合疗法的合适抗血管新生因子包括IL-8抑制剂、癌细胞血管阻断素、血管内皮抑素、饼环5、血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂、血管生成素-2或血管生成素-1的其它对抗剂、血小板激活因子的对抗剂和碱性纤维母细胞生长因子的对抗剂。血管内皮生长因子的抗体，诸如重组人化抗-VEGF(AVASTIN^TM，一般称为“贝伐单抗(bevacizumab)”Genentech，Inc.)用于与诸如结晶TNFR2:Fc的结晶TNFR2多肽组合治疗。

在本发明的一个实施例中，诸如结晶TNFR2:Fc的结晶TNFR2多肽与蛋白酶体抑制剂对癌症患者组合施用，其包括对遭受血癌或实体肿瘤的患者施用。蛋白酶体控制包含于细胞周期和凋亡的诸如细胞周期蛋白和NF-κB的多种蛋白的稳定性(参看，例如Schenkein，2002，Clin Lymphoma 3：49-55 and Adams，2002，Curr Opin Oncol 14：628-634)。蛋白酶体抑制剂可以诱导凋亡并且因此可以使癌细胞对其它抗癌剂敏感。本化合物的例示性蛋白酶体抑制剂包括，例如，苯氧羰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-leucinal(MG132)、clasto-lactacystinβ-内酯(A.G.Scientific，Inc.)、苯氧羰基-L-异亮氨酰-(γ)-叔丁基-L-谷氨酰-L-丙氨酰-L-leucinal(PSI)、N-乙酰基-leu-leu-norleucinal(ALLN)、MLN519(Millennium Pharmaceuticals)、[(1R)-3-甲基-1-[[(2S)-1-氧代-3-苯基-2-[(吡嗪基羰基)氨基]丙基]-氨基]丁基]硼酸(PS-341，一般称为“保特佐米(bortezomib)”商标名VELCADE；Millennium Pharmaceuticals)和苯氧羰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-norvalinal(MG115；Affiniti Research Products)。例如，多发性骨髓瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳癌、诸如淋巴瘤或白血病的血液恶性肿瘤或者其它肿瘤可以并用诸如PS-341的蛋白媒体抑制剂和诸如结晶TNFR2:Fc或结晶依那西普的结晶TNFR2多肽治疗。

某些治疗的不希望有的副作用可用诸如结晶TNFR2:Fc的结晶TNFR2多肽治疗。在一些实例中这样的副作用由TNF-α水平升高介导，因此这些患者将从以降低TNF-α水平的药剂治疗中获益。例如，可以施用诸如结晶TNFR2:Fc的结晶TNFR2多肽帮助防止与化学疗法相关的恶心或其它药物诱导的恶心。此外，用结晶TNFR2多肽治疗与脑部肿瘤放射治疗相关的放射诱导脑部损伤。此外，用结晶TNFR2多肽治疗与施用针对存在于特殊种类癌细胞表面的抗原的单克隆抗体相关的毒性。例如，可以用本文所揭示的结晶TNFR2多肽治疗与CAMPATH 1-H(一般称为“阿来组单抗(alemtuzumab)”BerlexLaboratories；也参看EP 0328404A1)灌输相关的毒性，其用于治疗慢性淋巴细胞性白血病。CAMPATH 1-H是对发现于单核细胞B细胞和T细胞上的细胞表面抗原CD52特异性的人化抗体。在本发明另一个实施例中，可以施用所揭示的诸如结晶TNFR2:Fc或结晶依那西普的结晶TNFR2多肽以改善与长期干扰素治疗相关的自身免疫应答病症。

可以对癌症患者施用结晶TNFR2多肽以减少与长期干扰素施用相关的不希望的副作用，其可以包括疲劳、发热、嗜中性白血球减少症、皮疹、头痛、消化病症、肝脏酶不平衡等。例如，已经显示干扰素γ(IFNγ)在卵巢癌中是有活性的，因此卵巢癌患者可以通过同时施用IFNγ和诸如结晶TNFR2:Fc或结晶依那西普的结晶TNFR2多肽治疗。相似地，通常用IFNα治疗黑素瘤、慢性骨髓性白血病、基底细胞癌、毛细胞癌、膀胱癌、婴儿和儿童血管瘤、多发性骨髓瘤、卡波西肉瘤、蕈样肉芽肿、非霍奇金氏淋巴瘤和肾细胞癌，并且可以与诸如结晶TNFR2:Fc的结晶TNFR2多肽并用以减少干扰素诱导副作用。

此外，可以用结晶TNFR2多肽预防对由α-1-酸糖蛋白(AGP)结合的药物抗性的发展或缓解其抗性，AGP是可以结合小分子的蛋白且优选结合碱性分子。AGP是在多种包括慢性炎症、心肌梗塞和癌症的病理条件下增加的急性期蛋白。STI 571(Glivec，一般称为“依曼替尼布(imatinib)；”Novartis)是Bcr-Abl和C-kit激酶活性的活性抑制剂，并且用于治疗慢性骨髓性白血病(CML)。CML的小鼠模型研究已经显示AGP结合依曼替尼布并且使其失活，因此引起其对此药物的抗性(Gambacorti-Passerinietal，2000，J Nail Can Inst 92：1641-1650)。通过施用配妥西菲林(pentoxifylline)可以降低患者的AGP水平(Voisin等人，1998，Am j Physiol 275：R1412-R1419)。本发明提供通过对正在接受依曼替尼布治疗的CML患者并用诸如结晶TNFR2:Fc或结晶依那西普的结晶TNFR2多肽以预防或减少对依曼替尼布的抗性。UCN-01(7-羟基星形孢菌素)(用于胃肠和其它实体肿瘤的治剂)也具有结合AGP的倾向(Senderowicz等人，2000，J NailCancer Inst 92(5)：376-387；Noriaki等人，2000，Biol Pharmac Bull 23(7)：893-895；Fuse等人，1999，Cancer Res 59(5)：1054-1060；Tamura等人，1999，Proc Annu Meet Am Soc ClinOncol 18：A611)。本文提供通过对正在并用UCN-01治疗的胃肠癌患者施用诸如结晶TNFR2:Fc的结晶TNFR2多肽而预防或减少UCN-01结合AGP的方法，因此增强UCN-01治疗的效力。或者，接受依曼替尼布或UCN-01的患者可以并用IL-1抑制剂或结晶TNFR2多肽和IL-1抑制剂(诸如WO 01/87328所描述的IL-1抑制剂之一)进行治疗，WO01/87328全文以引用的方式并入本文。这些方法中可以每周施用结晶TNFR2多肽一次或一次以上，例如，每周一次、两次或三次。一种合适施用结晶TNFR2多肽的方式是通过皮下注射。当患者是成人时，所注射结晶TNFR2多肽的合适剂量包括5-12mg/m²体表面积，或者每剂量25mg或50mg。如果所述患者是儿科患者，那么结晶TNFR2多肽可通过以0.4mg/kg体重的剂量每周皮下注射一次或一次以上施用，最高为每剂量25mg。

肺部病症

多种肺部病症也可以用所揭示的结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法治疗。一种所述病情是成人呼吸窘迫综合症(ARDS)，其与升高的TNF-α相关，并且可以由多种起因引发，包括暴露于毒性化学物质、胰腺炎、外伤或其它起因。所揭示的本发明化合物、组合物及/或组合疗法也用于治疗支气管肺发育不良(BPD)、淋巴管-平滑肌瘤病、肺动脉高压、早产婴儿慢性肺纤维化病和先天性支气管扩张。先天性支气管扩张是其中嗜中性粒细胞介导支气管基质的蛋白多糖成分降解疾病。支气管扩张患者的支气管分泌物中的前发炎介导物，尤其是TNF-α，可能增强这些嗜中性粒细胞的降解作用(Shum等人，Am J Respir Crit Care Med 162：1925-31(2000))。本发明提供用于先天性支气管扩张的治疗，其包含施用诸如结晶TNFR2:Fc的结晶TNFR2多肽。此外，用本发明的化合物、组合物及/或组合疗法治疗职业性肺病，包括石棉沉着病、煤炭工人肺尘病、硅肺病或与长期暴露于微粒子相关的相似病情。在本发明的其它方面中，用所揭示的化合物、组合物及/或组合疗法治疗肺部病症，包括与慢性支气管炎或肺气肿相关的慢性阻塞性肺疾病(COPD)；纤维化肺病，诸如囊肿性纤维化、先天性肺纤维化和放射诱导肺纤维化；肉状瘤病，包括肺肉状瘤病；和过敏，包括过敏性鼻炎、接触性皮炎、遗传过敏性皮炎和哮喘。

囊肿性纤维化是一种遗传病情，其特征主要在于粘稠粘液累积、患者倾向于慢性肺部感染和导致营养吸收障碍和营养不良的胰腺堵塞。可以施用结晶TNFR2多肽治疗囊肿性纤维化。如果需要，以结晶TNFR2多肽治疗可以并用皮质类固醇、黏液稀释剂，诸如吸入性重组脱氧核糖核酸酶I(诸如PULMOZYME^；Genentech，Inc.)或吸入性托普霉素(TOBI^；Pathogenesis，Inc.)。结晶TNFR2多肽也可以与纠正性基因疗法、刺激囊肿性纤维化细胞分泌氯化物的药物、或其它仍待发现的治疗并用。例如，可以通过观察唾液或肺部灌洗液(流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、Stapholococcus aureus和Pseudomonas aeruginosd)中的病原生物体数目的减少，通过监控患者体重的增加，通过检测肺容量的增加或通过任何其它方便的手段评估治疗是否充分。

可以用结晶TNFR2多肽或于细胞因子IFNγ-1b(诸如ACTIMMUNE^；InterMunePharmaceuticals)组合的结晶TNFR2多肽治疗囊肿性纤维化或纤维化肺病，诸如先天性肺纤维化、放射诱导肺纤维化和博莱霉素(bleomycin)诱导肺纤维化。此外，此组合物用于治疗特征在于器官纤维化的其它疾病，其包括全身性硬化症(也被称为“硬皮病”)，其通常涉及肝纤维化。对于治疗囊肿性纤维化，结晶TNFR2多肽和IFNγ-1b可以于PULMOZYME^或TOBI^或囊肿性纤维化的其它治剂组合。单独的结晶TNFR2多肽或者其与IFNγ-1b的组合可以与当前用于治疗纤维化肺病的其它治疗一起施用。这样的其它治疗包括肾上腺糖皮质激素、咪唑硫嘌呤、环磷酰胺、青霉胺、colchisine、补充氧气等等。具有诸如IPF的纤维化肺病的患者通常表现为干咳、进行性呼吸困难并且在肺部功能测试中表现限制性通气类型。胸X光照片显示患者肺中纤维化累积。当根据所揭示的方法治疗纤维化肺病时，通过观察患者咳嗽的减少(当咳嗽存在时)，或通过施用标准肺功能测试以检测肺总容量、必需容量、剩余肺体积的改善，或通过施用测量测试条件下去饱和作用的动脉血液气体测定可以检测治疗是否充分，并且根据一个或一个以上这些量测值，显示患者的肺部功能已经改善。此外，通过胸X光照片结果可以确定患者病情的改善，所述结果显示患者肺中纤维化的发展已经终止或降低。此外，当结晶TNFR2多肽与下调胶原质产物从而抑制纤维化的激素松弛素组合施用时，或者当与阻断TGF-β的纤维发生活性的药剂组合给予时，将结晶TNFR2多肽用于治疗器官纤维化。使用结晶TNFR2多肽和重组人类松弛素的组合疗法用于(例如)治疗全身性硬化症或纤维化肺病，包括囊肿性纤维化、先天性肺纤维化、放射诱导肺纤维化和博莱霉素诱导肺纤维化。

风湿病症和皮肤病症

其它实施例提供用所揭示的结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法治疗多种风湿病症的方法。Moreland，L.W.，1991，J Rheumatol 26 Suppl 57：7-15回顾TNF-α抑制剂治疗类风湿性关节炎的用途，并且Schnarr等人，2002，Clin Exp Rheumatol 20(Suppl.28)：S126-S129和Gorman等人，2002，N Engl J Med 346(18)：1349-1356中分别揭示了TNF-α抑制剂治疗脊柱关节病和僵直性脊椎炎的用途。可以用结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法治疗的病情包括：成人和青少年类风湿性关节炎；系统性红斑狼疮；痛风；骨关节炎；风湿性多肌痛；血清阴性脊柱关节病，包括僵直性脊椎炎和瑞特氏病(Reiter′sdisease)(应性关节炎)。也可以用本结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法治疗银屑病关节炎和慢性莱姆关节炎；TNF-α抑制剂治疗银屑病关节炎的用途在Ruderman，E.M.，2002，Am J Manag Care 8：S171-S180和Salvarani等人，2002，Clin Exp Rheumatol 20(Suppl.28)：S71-S75中描述。也可以这些结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法治疗斯蒂尔氏(Still′s)病和与类风湿性关节炎相关的葡萄膜炎。此外，本发明的结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法用以治疗引起随意肌炎症的病症，其包括皮肌炎和多肌炎。此外，本文所揭示的结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法用于治疗散发性包涵体肌炎，因为TNF-α可能在此肌肉疾病的发展中扮演重要的作用。此外，用本文所揭示的结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法治疗多中心网状组织细胞增生病，其为其中关节破坏和面部与手部的乳突小瘤与多核巨细胞的前炎症细胞因子的过度产生有关的疾病。可以用本发明的结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法抑制肥大伤疤(hypertrophicscarring)，此现象被认为部分由TNF-α过度分泌引起。可以单独施用结晶TNFR2多肽或与诸如TNF-α抑制剂的其它肥大伤疤抑制试剂并用。

涉及皮肤或黏膜的病症也可用所揭示的结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法治疗。这些病症包括棘刺松解病，其包括滤泡角化症、毛囊角化病和寻常性天疱疮。本结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法也可以治疗痤疮；酒糟鼻；斑秃；阿弗他口腔炎；大疱性天疱疮；烧伤；疱疹样皮炎；湿疹；红斑，包括多形红斑和大疱性多形红斑(史蒂文斯-约翰逊(Stevens-Johnson)综合症)；发炎性皮肤病；扁平苔癣；线状IgA大疱性皮肤病(儿童慢性大疱性皮肤病)；皮肤弹性丧失；黏膜表皮溃疡；嗜中性皮炎(斯威特氏(Sweet′s)综合征)；毛发红糠疹；银屑病；坏疽性脓皮病和中毒性表皮坏死松解症。

在另一个实施例中，用所揭示的结晶TNFR2多肽治疗和防止通常发生在腿上的皮下脂肪硬化和慢性静脉溃疡复发。研究已经显示TNF-α可通过激活基质金属蛋白酶2(MMP2)，和通过诱导TGFα与其它细胞因子的产生促进皮下脂肪硬化和慢性静脉溃疡的发病。配妥安西林(Oxpentifylline)和配妥西菲林已经显示在此环境中是有效的。可以单独使用所揭示的包括结晶TNFR2:Fc或结晶依那西普的结晶TNFR2多肽或者与配妥安西林、配妥西菲林、GM-CSF、瘦体素、PDGF、bFGF、EGF、TGF及/或IGF中一种或一种以上的药物组合治疗慢性静脉溃疡。此治剂将加速痊愈并防止复发。可以全身性或局部施用。对于局部施用，结晶TNFR2多肽以软膏、洗液、凝胶或面霜的形式局部应用，或者直接局部(perilesionally)注射至溃疡内或者在具10厘米范围内注射。

其它病症

也提供用结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法治疗内分泌系统多种病症的方法。例如，用结晶TNFR2多肽治疗青少年发病糖尿病(包括自体免疫和胰岛素依赖型的糖尿病)以及治疗成人发病糖尿病(包括非胰岛素依赖和肥胖介导的糖尿病)。此外，用本结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法治疗与糖尿病相关的继发性病情，诸如糖尿病视网膜病变、糖尿病患者的肾转植体排斥、肥胖介导的胰岛素抗性和肾衰竭，其自身可能与蛋白尿和高血压有关。可以用此结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法治疗的其它内分泌病症包括多囊性卵巢疾病、X连锁肾上腺脑白质营养不良、甲状腺机能减退和甲状腺炎，包括桥本氏(Hashimoto′s)甲状腺炎(意即白体免疫甲状腺炎)。

另外用所揭示的诸如结晶TNFR2:Fc的结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法治疗诸如肝炎的肝病，包括急性酒精性肝炎、急性药物诱发或病毒性肝炎、A型、B型和C型肝炎、硬化性胆管炎、自体免疫肝炎、先天性门静脉高压症和未知起因引起的肝脏炎症。诸如结晶TNFR2:Fc的结晶TNFR2多肽可以与其它用于治疗相同病情的药物同时施用与治疗前述肝病。例如，可以用结晶TNFR2多肽治疗同时以干扰素-α(IFNα)治疗的患者的C型肝炎，包括慢性C型肝炎。肝脏中TNF-α的高表达干扰IFNα的作用，因此干扰患者对IFNα治疗的应答(Hong等人，2001，FASEB J 15：1595-1597)。可以与结晶TNFR2多肽并用以治疗C型肝炎的治疗包括聚乙二醇化IFNα、利巴韦林(ribavirin)或利巴韦林和干扰素-α或聚乙二醇化干扰素-α的组合。适于与结晶TNFR2多肽并用的干扰素-α部分包括US20020127203A1所描述的IFNα-2a(诸如ROFERON；Hoffmann-LaRoche)、聚乙二醇化IFNα-2a(诸如PEGASYS；Hoffmann-LaRoche)、聚乙二醇化IFNα-2a或-2b，或者WO 9964016所描述的聚乙二醇化-IFNα共扼体。在另一个实施例中，可通过并用干扰素-α和诸如结晶形式的来那西普(lenercept)或奥那西普(onercept)的结晶TNFR2多肽而非结晶TNFR2:Fc来治疗C型肝炎。

包括腹腔疾病的胃肠系统病情也可用结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法治疗；Ricart等人，2002，Drugs of Today 38(11)：725-744揭示TNF-α抑制剂治疗克隆氏(Crohn′s)症的用途。此外，用本发明的化合物、组合物及/或组合疗法治疗克隆氏症；与胃肠病症或其它系统病症相关的恶心；溃疡性结肠炎；突发性胃轻瘫；胆结石(胆石)；胰腺炎，包括慢性胰腺炎和与急性胰腺炎相关的肺损伤；和溃疡，包括胃溃疡和十二指肠溃疡。

也包括用本结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法治疗诸如肾小球性肾炎的泌尿生殖系统病症的方法，包括自体免疫性肾小球性肾炎、暴露于毒素引起的肾小球性肾炎或者化脓性链球菌或其它感染剂感染引起的肾小球性肾炎。本发明的结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法也可以治疗尿毒综合症及其临床并发症(例如，肾衰竭、贫血和肥厚型心肌病)，包括与暴露在环境毒素、药物或其它起因相关的尿毒综合症。也可以本发明的结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法治疗的其他病情是血液透析并发症；前列腺病情，包括良性前列腺肥大、非细菌性前列腺炎和慢性前列腺炎；和血液透析并发症。

此外，用所揭示的结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法治疗涉及诸如与异常TNF-α表达相关的听觉丧失的多种病症。其中之一是与内耳或耳蜗神经相关的听觉丧失，其被认为由自体免疫过程引起，意即自体免疫听觉丧失。目前此病期以类固醇、甲氨蝶呤及/或环磷酰胺治疗，其可以与结晶TNFR2:Fc或者其它结晶TNFR2多肽并用。也可以用所揭示的结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法治疗的是胆脂瘤，其是通常与听力丧失相关的中耳病症。

此外，本发明提供治疗骨与关节的非关节炎医学病情的结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法。其涵盖导致骨丢失的破骨细胞病症，所述骨丢失为诸如(但不限于)包括绝经期后骨质疏松症、导致牙齿疏松或丢失的牙周炎(periodonritis)和关节替换后的假肢疏松(通常与响应于磨损碎片的炎症相关)的骨质疏松症。此后者病情也称为“整型内植体骨质溶解”。可通过施用诸如结晶TNFR2:Fc的结晶TNFR2多肽治疗的其它病情包括颞颚关节功能异常(TMJ)和癌症血钙过多引起的骨质丢失，包括骨质转移，诸如(例如)可能在肺黑素瘤或恶性肿瘤、乳癌、肺癌、鳞状上皮细胞癌、头部和颈部癌症、肾癌或前列腺癌中发生。

也可用所揭示的结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法治疗与移植相关的病症，诸如移植物抗宿主病和其它由实体器官移植引起的并发症，包括心脏、肝、肺、皮肤、肾、或其它器官的移植。可以施用这些结晶TNFR2多肽(例如)预防或抑制闭塞性细支气管炎的发展，诸如肺移植后的闭塞性细支气管炎和闭塞性细支气管炎伴机化性肺炎。经受周围血液干细胞移植形式的自体同源造血干细胞移植的患者可以逐步患上“植入综合征”或“ES”，其是大约在造血植入时发生的且可导致肺部恶化的不利且通常是自身限定的反应。可以用IL-8或TNF-α抑制剂(诸如结晶TNFR2:Fc或其它结晶TNFR2多肽)治疗ES，或者用这两种细胞因子的抑制剂组合治疗。所揭示的结晶TNFR2多肽也用于治疗或预防移植体衰竭，诸如骨髓移植排斥或者受者接受诸如角膜移植体或诸如肝或其它实体器官移植体的其它类型移植器官失败，其中移植排斥通常伴随高水平的TNF-α和IL-10。移植排斥可用结晶TNFR2多肽和IL-10抑制剂治疗。

也可用所揭示的结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法治疗眼睛病症，包括孔源性视网膜脱离、发炎性眼睛疾病和与烟熏相关的发炎性眼睛疾病以及与烟熏或老化相关的黄斑病变。

本文所描述的诸如结晶TNFR2:Fc的结晶TNFR2多肽、经揭示的组合物及/或组合疗法用于治疗影响女性生殖系统的病症。实例包括(但不限于)多发性内植体衰竭/不育、胎儿丢失综合症或IV胚胎丢失(自然流产)、惊厥前怀孕或惊厥和子宫内膜异位。

此外，所揭示的结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法用于治疗肥胖，其包括引起瘦体素形成减少或与使用抗镇静剂药物相关的体重增加的治疗。同样，本发明的化合物、组合物及/或组合疗法也用于治疗神经性疼痛、坐骨神经痛、老化症状、严重的药物反应(例如，I1-2毒性或博莱霉素诱导的肺病和纤维化)，或者抑制强心或其它手术中或者治疗肢体或关节外伤(诸如膝盖外伤)中外异源红血细胞灌输前、灌输中或灌输后的炎症反应。用所揭示的结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法可以治疗的多种其它医学病症包括：多发性硬化症、白塞氏(Behcet′s)病、舍格伦(Sjogren′s)综合征、自身免疫性溶血性贫血、β-地中海型贫血、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(鲁盖瑞氏(LouGehrig′s)症)、帕金森(Parkinson′s)病和未知起因的腱鞘炎以及与遗传缺失相关的多种自体免疫病症或疾病。此外，用本结晶TNFR2多肽、组合物及/或组合疗法治疗遗传性病情，诸如高雪氏(Gaucher′s)病、亨丁顿病、线性IgA病(linear IgA disease)和肌肉萎缩。

在本发明的另一个实施例中，本文所揭示的结晶TNFR2多肽用于治疗泛自闭症障碍和其它广泛性发展障碍。已经显示在一个自闭症患者子集中过度产生包括TNF-α和IL-1的前炎性细胞因子，其说明这些患者具有过度的先天免疫应答及/或T细胞应答调节细胞因子产生异常。因此，本文提供通过施用诸如结晶TNFR2:Fc的结晶TNFR2多肽治疗泛自闭症障碍的方法。

其它组合疗法

用于治疗本文所描述疾病的多种其它药物也可以与包含结晶TNFR2的组合物或用结晶TNFR2制备的组合物并用。这些药物包括：抗病毒素、抗生素、止痛剂、非甾体类抗炎药物(NSAID)、疾病修饰型抗风湿病药物(DMARD)、皮质类固醇、局部类固醇、全身性类固醇(例如，强的松)、细胞因子、炎性细胞因子拮抗剂、T细胞表面蛋白抗体、口服类维生素A、水杨酸和羟基脲。适于所述组合的止痛剂包括：醋氨酚、可待因、萘磺酸右丙氧芬、盐酸羟考酮、重酒石酸二氢可待因酮和曲马多(tramadol)。适于本组合疗法的NSAID包括：水杨酸(阿司匹林)和水杨酸盐衍生物；布洛芬(ibuprofen)；消炎痛(indomethacin)；塞来昔布(celecoxib)(CELEBREX^)；罗非考昔(rofecoxib)(VIOXX^)；伐地考昔(valdecoxib)(BEXTRA^)；克多罗多克(ketorolac)；萘普酮(nambumetone)；吡罗昔康(piroxicam)；拿百疼(naproxen)：奥沙普秦(oxaprozin)；舒林酸(sulindac)；酮洛芬(ketoprofen)；双氯芬酸及其它COX-1和COX-2抑制剂、丙酸衍生物、乙酸衍生物、反丁烯二酸衍生物、羧酸衍生物、丁酸衍生物、昔康类、吡唑类和吡唑啉酮类，包括新近开发的抗炎药。适于所述组合的DMARD包括：硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢霉素、硫酸羟氯喹、甲氨蝶呤、来氟米特片(leflunomide)、二甲胺四环素、青霉胺、柳氮磺吡啶和金化合物，诸如口服金、硫代苹果酸钠金和金硫葡糖。可以与结晶TNFR2组合使用的细胞因子抑制剂的实例包括(例如)IL-6或IL-8的TGFβ的拮抗剂。结晶TNFR2多肽也可以与细胞因子GM-CSF、IL-2及/或蛋白激酶A类型1的抑制剂组合施用以增强正在接受抗逆转录疗法的HIV-感染患者的T细胞繁殖。此外，结晶TNPR2多肽可以与IL-13的抑制剂组合治疗霍奇金氏病。神经生长因子也可以与结晶TNPR2多肽组合治疗某些病情。所述病情包括神经退化性疾病、脊髓损伤和多发性硬化症。其它可以用此组合治疗的病情是青光眼和糖尿病。此外，结晶TNPR2多肽可以与抗疟药或秋水仙碱组合施用。

其它与结晶TNPR2多肽组合适于治疗本文所述疾病的化合物包括小分子，诸如镇静剂或镇静剂类似物、配妥西菲林或基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂或其它小分子。适于此目的的MMP抑制剂包括(例如)美国专利第5,883,131号、第5,863,949号和第5,861,510号中所描述的抑制剂以及美国5,872,146中所描述的巯基烷基肽酰化合物。其他可以减少TNF-α生成的小分子包括(例如)美国专利第5,508,300号、第5,596,013号和第5,563,143号中所描述的分子，其中任何分子都可以与结晶TNFR2多肽组合施用。其他用于与结晶TNFR2多肽组合以治疗本文所述疾病的小分子包括美国5,747,514、美国5,691,382中所描述的MMP抑制剂，以及美国5,821,262中所描述的异羟肟酸衍生物。本文所描述的疾病也可以用包括抑制磷酸二酯酶IV和TNF-α生成的小分子的组合疗法治疗，所述小分子包括诸如经取代的肟衍生物(WO 96/00215)、喹啉磺胺类(美国5,834,485)、芳基呋喃衍生物(WO 99/18095)和杂双环衍生物(WO 96/01825；GB 2291422A)。也用于与结晶TNFR2多肽组合的是抑制TNF-α和IFNγ的噻唑衍生物(WO99/15524)以及抑制TNF-α及其它前炎性细胞因子的黄嘌呤衍生物(参看，例如，美国5,118,500、美国5,096,906和美国5,196,430)。其他用于与结晶TNFR2多肽并用以治疗本文所描述病情的小分子包括在美国5,547,979中所描述的小分子。

此外，结晶TNFR2多肽可以与第二TNF-α拮抗剂组合，其包括抗TNF-α或TNF-α受体的抗体、充当TNF-α竞争性抑制剂的源于TNF-α的肽(诸如美国5,795,859或美国6,107,273中所描述者)、可溶性TNFR而不是Ig融合蛋白或其他降低内源TNF-α水平的分子，诸如抑制TNF-α生成的反义寡核苷酸或核糖酶或者TNF-α转化酶的抑制剂(参看，例如，美国594,106)，或者任何上述小分子或TNF-α抑制剂，其包括配妥西菲林、镇静剂或其衍生物。镇静剂或镇静剂衍生物可以与结晶TNFR2多肽并用以治疗(例如)血液和肿瘤病症。所述病症(其中任何病症可以结晶TNFR2多肽单独治疗)的实例包括：移植物抗宿主病、骨髓增生异常综合征、再生障碍性贫血、细胞血管闭塞临界、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞白血病、恶病质和血钙过多的副瘤综合征、多发性骨髓瘤和POEMS综合症(多神经病、脏器肿大、内分泌病、单克隆免疫球蛋白增多症和皮肤变化)、骨髓纤维变性/骨髓组织变性、卡波西肉瘤、癌症相关恶病质、淀粉样变性病、慢性贫血病、鳞状上皮细胞癌、先天性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性溶血性贫血和β-地中海型贫血。在本发明的一个实施例中，用于与镇静剂组合的结晶TNFR2多肽是结晶TNFR2:Fc或结晶依那西普。

此外，本发明提供治疗需要所述治疗的人类患者的方法，所述方法涉及如美国2001/0021380 A1中所描述的对患者施用治疗有效药量的结晶TNFR2多肽和IL-4抑制剂，所述专利全文以引用的方式并入本文。用结晶TNFR2多肽和IL-4抑制剂的组合可以有效地治疗的病情包括哮喘、慢性阻塞性肺病、肺泡蛋白质沉着症、博莱霉素诱导的肺病和纤维化、放射诱导肺纤维化、囊肿性纤维化、肺中胶原累积、ARDS；多种皮肤病，其包括(但不限于)疱疹样皮炎(Duhring′s病)、遗传过敏性皮炎、接触性皮炎、风疹(包括慢性先天性风疹)和自体免疫起疱病，包括寻常型天疱疮和大疱性类天疱疮：重症肌无力、肉状瘤病，包括肺肉状瘤病、硬皮病、反应性关节炎、高IgE综合症、多发性硬化症和先天性高嗜酸粒细胞综合征；对药物的过敏性反应并且作为过敏免疫疗法的佐剂。在某些实施例中，通过皮下注射或通过气溶胶肺部施用，例如通过喷雾器，每周施用结晶TNFR2多肽和IL-4抑制剂组合物一次或一次以上。

本文所描述的疾病的其它治疗包括并用结晶TNFR2多肽和阻断RANK与RANK-配体结合的化合物，诸如抗RANK或RANK-配体、护骨素或可溶性形式的RANK(包括RANK:Fc)以及不引发RANK的可溶性形式RANK-配体的拮抗抗体。在本发明的一个实施例中，并用特异地结合人类RANKL的抗体和诸如结晶TNFR2:Fc的结晶TNFR2多肽。例如，美国6,017,729中描述适于此组合的可溶性形式RANK。并用结晶TNFR2多肽和RANK:Fc或护骨素用于在以下多种环境下预防骨破坏：包括(但不限于)骨质疏松症、多发性骨髓瘤或其它引起骨退化的恶性肿瘤，或者目的为防止转移至骨或与假肢磨损碎片或牙周炎相关的骨质破坏的抗肿瘤治疗。可用结晶TNFR2多肽和RANK抑制剂的组合治疗的肿瘤包括乳癌、肺癌、黑素瘤、骨癌、鳞片状细胞恶瘤、头部和颈部癌症、肾癌、前列腺癌和与血钙过多相关的癌症。

其它用途

用非病毒性载体转染淋巴细胞可以导致靶细胞通过TNF-α和CD95-介导的途经凋亡(参看，例如，Ebert等人，Cytokines，Cell&Mol Ther 5：165-73(1999))。诸如结晶TNFR2:Fc的结晶TNFR2多肽可以单独使用或者与诸如抗CD95抗体的CD95抑制剂组合以抑制此凋亡。当使用非病毒性载体时，尤其当使用脂质体介导和受体介导的基因转化方法时，此治疗将增加基因转化至淋巴细胞。此治疗将提高外源基因并入靶细胞。

此外，本组合物也可以用于制造一种或一种以上治疗或改善希望以结晶TNFR2多肽治疗的病情的药物。

提供以下实例以更加完全的说明本发明，但不解释为限制其范围。

                 实例1ENRREL(依那西普)的结晶方法

如上文所描述，依那西普多肽由融合于一部分人类免疫球蛋白G1(IgG1)的人类肿瘤坏死因子受体2(TNFR p75)的一部分胞外域组成。依那西普多肽通过在哺乳动物宿主细胞中表达编码依那西普的DNA构建体制备，并且纯化至大体上均质。对于以下结晶实验，将依那西普多肽悬浮于磷酸缓冲液中。

用结晶筛选(PEG/LiCl Grid筛选；Hampton Research，Aliso Viejo，CA)完成依那西普结晶化，其采用已知为‘悬滴’扩散法的大分子结晶方法。将由多肽样品和结晶试剂(“结晶缓冲液”或“母液”)的混合物组成的液滴沉淀至经硅烷化(sialanized)的盖片下面，且然后将盖片上的液滴用油脂密封并且一般放置在24孔VDX盘上，其使得与试剂的液体库蒸汽平衡。为了达到平衡，在液滴和所述盘的孔中的1微升库溶液间交换水蒸汽。因为水离开了液滴，因此多肽样品的相对浓度增加，其最终可导致过饱和。结晶作用发生需要多肽样品的浓度增加。一般所述液滴含有比储器低的试剂浓度，并且一般液滴所含有试剂的浓度为库浓度的一半，因为将等体积的样品和试剂混合以形成液滴。在这些实验中，液滴中起始多肽浓度通常是25.48mg/mL或50.96mg/mL，但是在大约6mg/mL的依那西普多肽浓度时也观察到结晶作用，并且可能在诸如100mg/mL的较高浓度或者诸如大约3mg/mL的较低浓度下产生结晶作用，但是在低浓度下，晶体生长可能需要较长的培育时间，其取决于起始液滴的大小。

在24-孔VDX聚丙烯组织培养盘上进行结晶筛选。VDX盘中各部分都含有1mL试剂库，各孔内试剂库的组合物与其它孔不同，以建立不同结晶缓冲液条件的阵列。向1微升库溶液中加入1微升各种多肽浓度的多肽以形成液滴。在5±3摄氏度或周围室温(20±3摄氏度)下培育盘。一些周围室温下培养的孔中大约48小时后出现晶体，并且继续生长几天。

在初始筛选中，用25.48mg/mL或者50.96mg/mL的依那西普浓度，在以下条件下获得晶体：

1.1.0M氯化锂，0.1M HEPES pH7.0；30％聚乙二醇6000

2.1.0M氯化锂，0.1M Tris-HCl pH8.0；30％聚乙二醇6000

3.1.0M氯化锂，0.1M N-二(羟乙基)甘氨酸pH9.0；30％聚乙二醇6000

4.0.2M硫酸锂，0.1M Tris-HCl pH8.5；30％聚乙二醇4000

5.0.2M硫酸锂，0.1M Tris-HCl pH8.5；25％聚乙二醇3350

6.0.5M硫酸锂，0.1M Tris-HCl pH8.5

在以上前三个条件下形成的依那西普晶体是大约1mm长度的棒或棒簇，并且通常伴随产生无定形沉淀物。在硫酸锂条件下形成的依那西普晶体是大约0.1-0.2mm长度的棒，并且不产生可见于氯化锂条件下的无定形沉淀物。用X光衍射测试一些依那西普晶体，并且其未显示盐样衍射模式，此结果与含有多肽材料的晶体一致。将一些依那西普晶体溶解并且通过7循环的自动Edman降解将其多肽内容物测序；从这些晶体获得3-4pmol的部分氨基酸序列，并且证实其与依那西普序列的N-末端部分匹配(LPAQVAF；参看SEQ ID NO：4氨基酸1至7)。图1是从每毫升含有50.96mg依那西普的多肽溶液形成的依那西普晶体的照片，所述多肽溶液具有0.1M HEPES pH7.0、30％PEG 6000、0.7M氯化锂的结晶库缓冲液；周围室温下7天后人工收集晶体，在上述库缓冲液中广泛洗涤并拍照。将来自此组的晶体提交用于上述N-末端氨基酸序列分析。另一种1M硫酸锂、0.1M Tris-HCl pH8.5、0.01M氯化镍的结晶条件产生晶体；但是，并未确认这些晶体的多肽内容物，并且因此认为在此特殊条件组合下已经形成盐晶体。

根据这些结果，在导致在其它实验盘中的各液滴中形成晶体的其它实验中上述前三个条件中3个参数(LiCl浓度、pH和表示为(重量/体积)％的聚乙二醇(PEG)6000浓度)的各参数都不同。介于0.7与1.2M之间的氯化锂浓度，介于22％与32％之间的PEG 6000浓度和介于6.8与7.3之间的0.1M HEPES pH值都导致在25.48和50.96mg/mL的依那西普浓度下在周围室温下培养大约48小时后成功结晶。其它的实验扩展了成功结晶条件的范围，其包括0.2M至1.2M LiCl和16％至32％PEG 6000，尽管依那西普结晶可能不在包括0.2M LiCl的每个条件组合下发生，及/或当使用0.2M LiCl时可能需要更长的时间形成依那西普晶体。因此，认为所有以下条件的组合都适于依那西普结晶，其包括介于0.3M与1.2M之间的氯化锂浓度、介于16％与32％之间的PEG 6000浓度和介于pH6.8与7.3之间的0.1M HEPES pH值。此外，认为含有介于0.2M与0.5M之间的硫酸锂、大约pH8.5的0.1M Tris-HCl和视情况包括高达30％的在PEG 3350-PEG4000大小范围内的PEG的条件是适于依那西普结晶的条件。

                             实例2

               ENBREL(依那西普)结晶的其它方法

用如上文实例1所描述的“悬滴”结晶方法制备其它依那西普晶体。根据产品说明书，从可购得的ENBREL冻干粉末再生依那西普，所述说明书如下：一管ENBREL冻干粉末含有25mg依那西普、40mg甘露醇、10mg蔗糖和1.2mg缓血酸胺的，其以1mL注射用无菌抑菌水、USP(含有0.9％苯甲醇)再生。用10,000分子量截止透析盒将所再生的依那西普溶液透析至水中，然后用10,000分子量截止离心过滤器浓缩至100mg/mL。如下表所列出，库中各结晶孔含有1.0mL的特殊结晶试剂。通过向1微升所述结晶试剂中加入1微升100mg/mL的依那西普溶液制得液滴。晶体在周围室温下(大约22摄氏度)生长；在一些情况下少至2天，及在其它情况下超过2至4周后在下表所列的所有结晶试剂中形成大约100微米长度的针样依那西普晶体。

盐条件：	缓冲液条件：	2-甲基-2，4-戊二醇(MPD)条件：
			0.09M磷酸铵	0.10M乙酸钠，pH4.5	40.28％MPD
0.10M磷酸铵	0.10M乙酸钠，pH4.0	37.82％MPD
			0.10M磷酸铵	0.10M乙酸钠，pH5.0	35.11％MPD
0.08M磷酸铵	0.10M乙酸钠，pH5.0	41.83％MPD
			0.12M磷酸铵	0.10M乙酸钠，pH4.0	31.30％MPD
0.15M磷酸铵	0.10M乙酸钠，pH5.0	43.82％MPD
			0.11M磷酸铵	0.10M乙酸钠，pH4.0	30.55％MPD
0.04M磷酸铵	0.10M乙酸钠，pH5.0	45.75％MPD
			0.19M磷酸铵	0.10M乙酸钠，pH4.0	30.78％MPD
0.14M磷酸铵	0.10M乙酸钠，pH4.0	37.13％MPD
			0.16M磷酸铵	0.10M乙酸钠，pH4.0	31.27％MPD
0.23M磷酸铵	0.10M乙酸钠，pH4.0	41.87％MPD

0.18M磷酸铵	0.10M乙酸钠，pH4.5	34.10％MPD
			0.09M磷酸铵	0.10M乙酸钠，pH4.0	46.00％MPD
0.09M磷酸铵	0.10M乙酸钠，pH4.5	46.01％MPD
			0.09M磷酸铵	0.10M Hepes.pH7.5	33.92％MPD
0.20M磷酸铵	0.10M Tris.pH8.5	50.0％MPD

在其它结晶实验中，在以下结晶条件下超过2至4周形成大约100微米长度的针样依那西普晶体：

盐条件：	缓冲液条件：	PEG条件：	温度：
				1.0M磷酸氢二铵；0.2M氯化钠	0.1M咪唑，pH8.0	-	大约22摄氏度
1.0M磷酸氢二铵	0.1M咪唑，pH8.0	-	大约22摄氏度
				0.2M氯化钠	0.1M CAPS(3-[环己基氨基]-1-丙磺酸)，pH10.5	20％PEG 8000	2-8摄氏度

                                 实例3

                           结晶条件的其它扩展

蒸汽扩散结晶方法，诸如实例1所描述用于依那西普结晶的“悬滴”法，可以变化以实现诸如TNFR2多肽的多肽结晶。例如，可以将相对于试剂的其它体积的多肽样品混入以改变液滴和库之间的试剂浓度差，并且也改变液滴中起始多肽浓度。将1份试剂与9份多肽样品混合将产生试剂的起始浓度是库的试剂浓度的0.1倍的液滴。在本发明的某些实施例中，液滴中结晶试剂的起始浓度大约是库中结晶试剂浓度的0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.7、0.8、0.85、0.9或0.95倍。液滴中起始多肽浓度可以至少低至大约6mg/mL，并且至少高至100mg/mL，并可能高至120mg/mL；诸如3mg/mL的较低浓度的多肽可能形成晶体，但是在可以检测到晶体之前可能需要较长的培育时间。

如下文所描述，结晶条件的其它扩展可能产生其它适当的获得依那西普或其它TNFR2多肽晶体的条件。例如，组合可由盐条件、pH缓冲液条件、可选PEG条件和可选余因子条件构成，其中各个条件是选自下文所描述的相应条件组。

	值范围：最小(选自以下)至最大(选自以下)
					最小值：	最大值：	特殊值实例：
盐条件：
				氯化锂	0.05M或0.1M	1.5M、2.0M或5.0M	0.5M、0.7M、1.0M、1.2M

硫酸锂	0.05M或0.1M	1.0M、2.0M或5.0M	0.2M、0.35M、0.5M
				氯化钠、氯化钾、磷酸铵、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠、柠檬酸钾、乙酸铵、乙酸钠、硫酸铵、硫酸镁或硫酸钠	0.01M、0.025M、0.05M、0.1M或0.5M	1.0M、1.5M、2.0M、2.5M或5.0M	0.1M、0.2M、0.35M、0.5M、0.75M、1.0M、1.5M
磷酸氢二铵	0.1M、0.5M	1.5M、2.0M	1.0M
				pH缓冲液条件：
0.05M、0.1M或0.15M HEPES	pH4.0、5.0或6.0	pH8.0、8.5或9.0	pH6.5、6.75、6.9、7.0、7.25、7.5、7.75
				0.05M、0.1M或0.15M Tris-HCl	pH5.0、6.0或7.0	pH9.0、9.5或10.0	pH7.25、7.5、7.75、8.0、8.25、8.5、8.75
0.05M、0.1M或0.15M N-二(羟乙基)甘氨酸	pH5.0、6.0或7.0	pH10.0、10.5或11.0	pH8.0、8.25、8.5、8.75、9.0、9.25、9.5
				0.05M、0.1M或0.15M乙酸钠	pH4.0	pH5.0	pH4.0、4.5、5.0
0.05M、0.1M、0.15M咪唑	pH7.5	PH8.5	pH8.0

0.1M CAPS(3-[环己氨基]-1-丙磺酸)、pH10.5	pH9.0、pH9.5	pH11.5、pH12.0	pH10.0、pH10.5、pH11.0
				PEG或2-甲基-2，4-戊二醇(MPD)条件：
聚乙二醇(PEG)200、300、400、600、750、900、1000、1450、3350、4000、4500、6000或8000	0、1、2、3、5或7.5％(液体：v/v；固体：w/v)	32、35、40、45或50％(液体：v/v固体：w/v)	10、12、15、20、25、30％(液体：v/v；固体：w/v)
				2-甲基-2，4-戊二醇(MPD)	0、1、2、3、4、5、6、7或8％(v/v)	40、45、50、60或70％(v/v)	10、12、15、20、25、30、32、35％(v/v)
金属离子(“共因子”)条件：
				氯化镍	0.001M或0.005M	0.02M、0.05M、0.1M或0.2M	0.01M
以下金属的化合物：锌、铜、钙、锰和镁	0.001M、0.002M或0.003M	0.05M、0.1M、0.2M、0.5M、1.0M或2.0M	0.005M、0.01M、0.02M

                                             实例4

                          测试结晶多肽的特性

在多肽晶体形成之后，其可以经多种分析以证实其多肽内容物，并且另外检查其物理结构。例如，如果需要个别晶体可以从结晶溶液中移除且用水性或有机溶剂或添加剂洗涤，然后干燥(例如，通过风干，在晶体上通过惰性气流，冻干或真空)。晶体可以从晶体生长液滴分离、移除并且随后安装用于X光衍射。

如另一个实例，多肽晶体可以从结晶溶液中移除并且洗涤或清洗，或者大部分结晶溶液可以从所述晶体去除并替换成不同的溶液。在此方法中，晶格中用于此结晶程序的特殊盐可以用不同的盐替换。在本发明的一个实施例中，诸如结晶依那西普的结晶TNFR2多肽从结晶缓冲液中分离并置于含有钠盐、钾盐或镁盐(例如，乙酸钠、氯化钠、柠檬酸钠、磷酸钠、硫酸钠、氯化钾、柠檬酸钾或硫酸镁)的溶液中。对于X光衍射，替换溶液可含有用于确定结晶多肽中原子配位的重原子。如其它实施例，TNFR2多肽可以和其配体共结晶，例如依那西普可以与TNF-α共结晶，以确定TNF-配体互作的详细结构。

在另一实例中，多肽晶体可以从结晶溶液中移除并且在适当用于其它测试的缓冲液中溶解，诸如用于由凝胶电泳分析结晶多肽的含SDS缓冲液。通过凝胶电泳分析蛋白的方法是熟知的；并且包括用银或考马斯蓝染料将凝胶染色且将结晶多肽的电泳迁移率与已知分子量的多肽标记的迁移率进行比较。在另一种方法中，通过使用特异性结合多肽的标记抗体在凝胶中将所述多肽显现。已经结晶的多肽也可以溶于适当的缓冲液中，所述缓冲液适于Edman降解法氨基酸测序，适于质谱分析，适于其它光谱散射、折射、衍射或吸收研究，或者适于通过将标记分子附着于多肽以标记所述多肽。

                           实例5

             ENBREL(依那西普)晶体的蛋白含量测定

用如上文实例1所描述的“悬滴”结晶方法制备其它依那西普晶体。各孔在库中含有100微升的结晶试剂；此实验中结晶试剂是0.2M乙酸铵、0.1M Tris pH8.5和45％2-甲基-2，4-戊二醇(MPD)。依那西普放置在含有25mM磷酸钠pH 6.3、100mM NaCl的溶液中，然后浓缩至29-30mg/mL，例如至29.6mg/mL。通过向1微升结晶试剂中加入1微升的所述29mg/mL依那西普溶液制得液滴，依那西普终浓度大约14.5-15mg/mL。发现液滴中依那西普终浓度是达到这些特殊结晶条件下结晶重要因素，在重复实验中大约15mg/mL依那西普终浓度对于结晶是有效的，而小于10mg/mL或大于25mg/mL的终浓度并非有效。在大约1至3周的周围室温(20±3摄氏度)下，允许液滴与库中的试剂蒸发交换。通常每液滴中2至4个独立晶核的晶体形成并且显示为具有许多投射的多枝或树枝状结构或者主结构分枝断开。各个完整分枝的全部尺寸大约是距晶核中心50微米长度，大约30微米宽度以及大约10微米厚或宽。用尼龙环从晶体中移除一个分枝，用上述结晶试剂连续洗涤三次，溶于4×SDS Laemmli缓冲液中，并且随后安置于SDS-聚丙烯酰胺凝胶孔中并进行电泳。电泳之后将凝胶进行银染，并且在泳道中存在从结晶蛋白跑出的清晰可见的银染条带，所述结晶蛋白以如来自用于生成晶体的依那西普制剂制得的蛋白相同的程度迁移。用这些实验中制得的晶体上的其它分枝重复进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并且用考马斯蓝染料也获得可溶结晶材料的染色条带，其与依那西普具有相同的电泳迁移。因此，从依那西普溶液形成的晶体含有明显是依那西普的材料，因为其在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中迁移并且其在凝胶中以与已知的依那西普蛋白的相同方式产生。

                                实例6

                        结晶多肽的生物活性测试

如上文实例所描述，可以从结晶溶液恢复多肽结晶，视情况置于不同溶液中，洗涤及/或干燥以去除结晶缓冲液，并且随后在适当的溶液中溶解以用于其它测定。可以用若干测定方法中的任何方法测试TNFR2多肽的生物活性，例如结合测定以确定先前所结晶TNFR2(意即再生TNFR2多肽)结合其配体的能力。以下实例说明测量结合TNF-α的诸如依那西普的所述TNFR2多肽结合(参看，例如，Mohler等人，1993，J Immunol 151：1548-1561)的生物活性的测定，但是所属技术领域的技术人员将认可所述测定可以经修改以用于测量其它TNFR2多肽的生物活性。

结合竞争测定

将为0.5nM的诸如[¹²⁵I]TNF-α的标记人类TNF-α和连续稀释的竞争结合剂(例如，从结晶形式再生的依那西普，或者从结晶形式再生的另一种TNF-α-结合TNFR2多肽，或者未标记人类TNF-α，或者作为对照的未结晶依那西普)及2×10⁶U937细胞在结合培养基(RPMI 1640，2.5％BSA，50mM HEPES pH7.4，0.4％NaN₃)中于4摄氏度下培育2小时。然后去除重复的等分试样，经邻苯二甲酸油混合物离心以分离游离和结合的配体，并且用γ计数器测量放射性(细胞-结合[¹²⁵I]TNF-α)。通过包括200×摩尔过量的未标记TNF-α确定非特异性结合值，并且从总结合数据中扣除以获得特异性结合值(参看，例如，Park等人，1990，J Exp Med 171：1073-1089)。

LPS-诱导死亡率的拯救

注射致死剂量的LPS(脂多糖)提高小鼠中血清TNF-α水平，如果不同时施用足够量的中和TNF-α效应的试剂时，其导致死亡(参看，例如，Mohler等人，1993，J Immunol151：1548-1561)。将LPS，诸如源自大肠杆菌的细菌性LPS，以10mg/mL重悬于无菌盐水中，，并且以小等分储存于-20摄氏度。将LPS稀释至合适浓度并在注射前超声波处理1分钟。以0.2mL盐水中的LD60至LD100剂量的LPS(300至400微克)静脉内注射诸如BALB/c雌性小鼠的小鼠(18至20g)。LPS单独注射或者与从结晶形式再生的依那西普或已经从结晶形式再生的另一种TNF-α-结合TNFR2多肽或对照蛋白(诸如未结晶依那西普或人类IgG)联合注射。监控小鼠的存活率至少5天。当施用足够量的再生TNF-α-结合TNFR2多肽时，通过LPS-注射小鼠的存活率增加说明活性再生TNF-α-结合TNFR2多肽的存在。

本发明根据已发现或已提出的特殊实施例描述，以包含用于本发明实践的某些方式。所属技术领域的技术人员应了解，按照本揭示，在不悖离本发明的希望范围的前提下，可以在所例示的特殊实施例中进行若干修改和改变。

序列呈现于序列列表中

SEQ ID NO	类型	描述
			SEQ ID NO：1	氨基酸	人类肿瘤坏死因子受体2；(TNFR2，p75，CD120b，TNFRSF1B)；Swiss-Prot数据库登录号P20333
SEQ ID NO：2	氨基酸	人类免疫球蛋白γ-1链恒定区(IgG1；Swiss-Prot数据库登录号P01857)
			SEQ ID NO：3	氨基酸	人类免疫球蛋白γ-1链恒定区变体(SEQ ID NO：2中Asp239-＞Glu；Leu241-＞Met)
SEQ ID NO：4	氨基酸	依那西普

                            序列表

<110>安美基公司

<120>结晶肿瘤坏死因子受体2多肽

<130>A-859

<160>4

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>461

<212>PRT

<213>智人

<400>1

Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu

1               5                   10                  15

Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr

            20                  25                  30

Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln

        35                  40                  45

Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys

    50                  55                  60

Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp

65                  70                  75                  80

Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys

                85                  90                  95

Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg

            100                 105                 110

Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu

        115                 120                 125

Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg

    130                 135                 140

Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val

145                 150                 155                 160

Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr

                165                 170                 175

Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly

            180                 185                 190

Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser

        195                 200                 205

Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser

    210                 215                 220

Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser

225                 230                 235                 240

Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly

                245                 250                 255

Asp Phe Ala Leu Pro Val Gly Leu Ile Val Gly Val Thr Ala Leu Gly

            260                 265                 270

Leu Leu Ile Ile Gly Val Val Asn Cys Val Ile Met Thr Gln Val Lys

        275                 280                 285

Lys Lys Pro Leu Cys Leu Gln Arg Glu Ala Lys Val Pro His Leu Pro

    290                 295                 300

Ala Asp Lys Ala Arg Gly Thr Gln Gly Pro Glu Gln Gln His Leu Leu

305                 310                 315                 320

Ile Thr Ala Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser

                325                 330                 335

Ala Leu Asp Arg Arg Ala Pro Thr Arg Asn Gln Pro Gln Ala Pro Gly

            340                 345                 350

Val Glu Ala Ser Gly Ala Gly Glu Ala Arg Ala Ser Thr Gly Ser Ser

        355                 360                 365

Asp Ser Ser Pro Gly Gly His Gly Thr Gln Val Asn Val Thr Cys Ile

    370                 375                 380

Val Asn Val Cys Ser Ser Ser Asp His Ser Ser Gln Cys Ser Ser Gln

385                 390                 395                 400

Ala Ser Ser Thr Met Gly Asp Thr Asp Ser Ser Pro Ser Glu Ser Pro

                405                 410                 415

Lys Asp Glu Gln Val Pro Phe Ser Lys Glu Glu Cys Ala Phe Arg Ser

            420                 425                 430

Gln Leu Glu Thr Pro Glu Thr Leu Leu Gly Ser Thr Glu Glu Lys Pro

        435                 440                 445

Leu pro Leu Gly Val Pro Asp Ala Gly Met Lys Pro Ser

    450                 455                 460

<210>2

<211>330

<212>PRT

<213>智人

<400>2

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1               5                   10                  15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

            20                  25                  30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

        35                  40                  45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

    50                  55                  60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65                  70                  75                  80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

                85                  90                  95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

            100                 105                 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

        115                 120                 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

    130                 135                 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145                 150                 155                 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

                165                 170                 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

            180                 185                 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

        195                 200                 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

    210                 215                 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225                 230                 235                 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

                245                 250                 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

            260                 265                 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

        275                 280                 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

    290                 295                 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305                 310                 315                 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

                325                 330

<210>3

<211>330

<212>PRT

<213>智人

<400>3

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala pro Ser Ser Lys

1               5                   10                  15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

            20                  25                  30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

        35                  40                  45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

    50                  55                  60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65                  70                  75                  80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

                85                  90                  95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

            100                 105                 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

        115                 120                 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

    130                 135                 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145                 150                 155                 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

                165                 170                 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

            180                 185                 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

        195                 200                 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

    210                 215                 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225                 230                 235                 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

                245                 250                 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

            260                 265                 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

        275                 280                 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

    290                 295                 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305                 310                 315                 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

                325                 330

<210>4

<211>467

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>融合多肽

<400>4

Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser

1                5                  10                  15

Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys

            20                  25                  30

Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr

        35                  40                  45

Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu

    50                  55                  60

Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser

65                  70                  75                  80

Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys

                85                  90                  95

Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys

            100                 105                 110

Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala

        115                 120                 125

Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro

    130                 135                 140

Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His

145                 150                 155                 160

Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Met Asp Ala

                165                 170                 175

Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val

            180                 185                 190

His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr

        195                 200                 205

Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly

    210                 215                 220

Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp Glu Pro Lys Ser Cys

225                 230                 235                 240

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

                245                 250                 255

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

            260                 265                 270

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

        275                 280                 285

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

    290                 295                 300

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

305                 310                 315                 320

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

                325                 330                 335

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

            340                 345                 350

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

        355                 360                 365

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

    370                 375                 380

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

385                 390                 395                 400

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

                405                 410                 415

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

            420                 425                 430

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

        435                 440                 445

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

    450                 455                 460

Pro Gly Lys

465

Claims (27)

1.一种依那西普(etanercept)晶体。

2.根据权利要求1所述的依那西普晶体，其中所述晶体是棒状形式。

3.根据权利要求1所述的依那西普晶体，其中所述晶体具有介于0.5毫米和1.5毫米之间的最大长度。

4.根据权利要求1所述的依那西普晶体，其中所述晶体具有介于0.05毫米和0.3毫米之间的最大长度。

5.根据权利要求1所述的依那西普晶体，其中所述晶体包含选自由乙酸铵、磷酸铵、硫酸铵、磷酸氢二铵、氯化锂、硫酸锂、硫酸镁、氯化钾、柠檬酸钾、磷酸钾、乙酸钠、氯化钠、柠檬酸钠、磷酸钠和硫酸钠所组成群组的盐。

6.根据权利要求1所述的依那西普晶体，其中所述晶体包含选自由乙酸铵、磷酸铵、磷酸氢二铵和氯化钠所组成群组的盐。

7.一种生产依那西普晶体的方法，其中所述方法包含将依那西普多肽溶液与包含盐的结晶缓冲液进行组合。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述组合和结晶缓冲液库处于蒸汽平衡下。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述结晶缓冲液具有介于4.0和10.5之间的pH值。

10.根据权利要求7所述的方法，其中所述盐选自由乙酸铵、磷酸铵、硫酸铵、磷酸氢二铵、氯化锂、硫酸锂、硫酸镁、氯化钾、柠檬酸钾、磷酸钾、乙酸钠、氯化钠、柠檬酸钠、磷酸钠和硫酸钠所组成的群组。

11.根据权利要求7所述的方法，其中所述结晶缓冲液中盐的浓度介于0.04M和1.2M之间。

12.根据权利要求7所述的方法，其中所述结晶缓冲液另外包括2-甲基-2，4-戊二醇(MPD)或聚乙二醇(PEG)。

13.根据权利要求7所述的方法，其还包含在晶体形成后移除至少一部分所述结晶缓冲液。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述部分结晶缓冲液通过离心移除。

15.根据权利要求13所述的方法，其中将所述晶体置于包含有机添加剂的溶液中。

16.根据权利要求13所述的方法，其还包含加入赋形剂。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述赋形剂选自由蔗糖、海藻糖或山梨醇组成的群组。

18.根据权利要求15所述的方法，其中所述有机添加剂是乙醇或异丙醇。

19.根据权利要求7所述的方法，其还包含干燥已经形成的晶体。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述晶体是通过曝露于空气或曝露于真空或曝露于氮气来进行干燥。

21.一种根据权利要求7至20中任一方法所制得的依那西普晶体。

22.一种包含结晶形式的依那西普的组合物。

23.一种通过再生结晶依那西普制得的组合物。

24.一种根据权利要求1-21中任一权利要求所述的依那西普或者根据权利要求22-23中任一权利要求所述的组合物在制备药物中的用途。

25.根据权利要求24所述的用途，其中所述药物用于治疗特征在于过量TNF-α水平的病情。

26.根据权利要求25所述的用途，其中所述药物降低受治疗者血清或组织中的TNF-α水平。

27.根据权利要求25所述的用途，其中所述病情是类风湿性关节炎、银屑病关节炎、银屑病或者僵直性脊椎炎。

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