CN104010654B - 金属离子稳定的依那西普制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了适用于依那西普的长期储存的稳定的水性药物依那西普组合物，这些组合物的制备方法，给药方法，和含有这些组合物的试剂盒。

Description

金属离子稳定的依那西普制剂
发明领域
本发明涉及为了长期储存依那西普而使用金属离子稳定的依那西普的水性药物组合物，制备所述组合物的方法，其给药方法，和含有所述组合物的试剂盒。本发明包括不需要精氨酸用于稳定的依那西普制剂。
发明背景
多肽在使用前必须经常被储存。当储存一段时间，多肽在溶液中经常是不稳定的(Manning等人,1989,Pharm.Res.6:903-918)。为了延长其保存期限，开发了其他的工艺步骤，比如干燥，例如冻干法。然而，冻干的药物组合物比较不便于使用。
改进多态稳定性的典型实践可通过改变制剂中组分浓度，或通过加入赋形剂修饰制剂解决(参见，例如，美国专利号5,580,856和6,171,586)。然而，添加剂的使用仍可导致不活跃的多肽。此外，冻干法的情况下，再水合步骤可通过，例如聚集或变形导致多肽的失活(Hora等人,1992,Pharm.Res.,9:33-36；Liu等人,1991,Biotechnol.Bioeng.,37:177-184)。多肽的聚集是不期望的，因为它可导致免疫原性(Cleland等人,1993,Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Systems,10:307-377；和Robbins等人，1987,Diabetes,36:838-845)。
另一种改进多态稳定性的途径是在特定浓度使用L-精氨酸(美国专利号7,648,702)。
在使用前可储存达到两年的多肽之一是依那西普(Immunex公司)，它是二聚融合多肽，其包括连接到人免疫球蛋白G的Fc部分的人类75千道尔顿(p75)肿瘤坏死因子受体(TNFR)的细胞外配体结合部分。其含有934个氨基酸并具有大约150千道尔顿的表观分子量(美国药典，2002,Medical Economics股份有限公司)。依那西普的Fc部分包括重链恒定区2(CH2)恒定区，重链恒定区3(CH3)和铰链区，但是不包括人免疫球蛋白G的重链恒定区1(CH1)。Fc区可包括一个或所有的上述区。依那西普通常通过重组DNA技术在中国仓鼠卵巢(CHO)哺乳动物细胞表达系统中生成。
本发明提供可长期储存的新的稳定的依那西普液体制剂。
发明简述
本发明是水性药物组合物，其包含依那西普和用以抑制依那西普不稳定性、聚集、错折叠和/或碎裂的稳定剂，其中所述稳定剂包含稳定金属离子。
下面讨论中使用的各种技术术语在题为“定义”的章节中规定如下并贯穿说明书的其余部分。
本发明稳定的依那西普制剂带来的长期储存稳定性特征为以下至少之一：(1)在M3或T2或T4的SEC分析：单体含量大于大约90％；聚集体含量小于大约3wt％；及碎片3的量小于大约5wt％；和(2)在M3或T2或T4的HIC分析，其中由HIC色谱图中峰1代表的组分的量小于大约3wt％；由HIC色谱图中峰2代表的组分的量大于80wt％；由HIC色谱图中峰3代表的组分的量小于大约20wt％。
在一个相关方面，包括金属离子的依那西普制剂带来的长期储存稳定性特征为：(1)在M3或T2或T4的SEC分析单体含量大于大约90wt％；聚集体含量小于大约3wt％；及碎片3的量小于大约5wt％；和(2)在M3或T2或T4的HIC分析，其中由HIC色谱图中峰1代表的组分的量小于大约3wt％；由HIC色谱图中峰2代表的组分的量大于80wt％；及由HIC色谱图中峰3代表的组分的量小于大约20wt％。
稳定的制剂的优选方面，所述制剂带来的长期稳定性特征为：在M3或T2或T4的HIC分析，其中由HIC色谱图中峰2代表的组分的量大于或等于大约95wt％；并且其中，如果峰3出现在HIC色谱图上，则由峰3代表的组分的量小于或等于大约3wt％。
总结上面的，稳定的依那西普制剂可选地且优选地，不含精氨酸，或基本上无精氨酸。
经过在5℃下储存一个、两个或三个月后，通过SEC(体积排阻色谱)和HIC(疏水作用色谱)分析确定本发明的制剂具有极好的稳定性。这些制剂与市售的其中精氨酸是必须组份的依那西普制剂相当或更好。因此，本发明还指向使用金属离子稳定的依那西普制剂，其不含精氨酸，或基本上无精氨酸，且其中组合物，在M3或T2或T4，带来满足下面的一个或两个标准的长期储存稳定性：(A)与市售的商标为的依那西普稳定性相当或更好，其通过以下测量：(i)组合物中的聚集体、单体和碎片3的量的SEC分析(如说明书中规定)和(ii)HIC色谱图中相应于峰1、2和3的组合物中的材料的量的HIC分析(如说明书中规定)；和(B)HIC色谱图，其中(i)峰3没有，或基本上没有且(ii)峰2代表大于大约95wt％的组合物；SEC色谱图基本上不含有相应于聚集体的峰；且SEC色谱图其中单体含量代表至少大约95wt％的组合物。本发明的制剂在不需要精氨酸作为稳定剂时能满足前述标准。
在本发明的一个实施方式中，其中稳定剂为氯化钙，其中氯化钙为不超过5mM氯化钙的量，且组合物还包含：可选地大约0.5至6wt.％蔗糖或海藻糖；可选地大约0至100mMNaCl；可选地多至大约10mM木糖醇；大约1至大约30mM磷酸钠；其中组合物具有大约6.0至6.6的pH；并且其中，可选地，组合物不包括精氨酸或基本上无精氨酸。
再一实施方式中，氯化钙稳定的组合物包含大约50mg/ml的依那西普；大约2mM氯化钙；大约10-30mM磷酸钠；小于大约150mM氯化钠；和小于大约4wt.％蔗糖；其中制剂具有大约6.3至6.5的pH。
再一实施方式中，氯化钙稳定的组合物包含大约50mg/ml的依那西普；大约2mM氯化钙；大约10-30mM磷酸钠；小于大约10wt.％蔗糖；其中制剂具有大约6.3至6.5的pH。
再一实施方式中，氯化钙稳定的组合物包含大约50mg/ml的依那西普；大约2mM氯化钙；大约10-30mM磷酸钠；小于大约100mM氯化钠；和小于大约5wt.％蔗糖；其中制剂具有大约6.3至6.5的pH。
再一实施方式中，氯化钙稳定的组合物包含大约50mg/ml的依那西普；大约1mM氯化钙；大约10-30mM磷酸钠；大约50mM氯化钠；和小于大约8wt.％海藻糖；其中制剂具有大约6.3至6.5的pH。
再一实施方式中，其中稳定剂为氯化镁，稳定的依那西普组合物包含大约1mM至大约20mM氯化镁；可选地多至大约6wt.％蔗糖；大约25至150mM NaCl；大约1至大约30mM磷酸钠；其中组合物具有大约6.0至6.6的pH；并且其中，可选地，组合物不包括精氨酸或基本上无精氨酸。
再一实施方式中，其中稳定剂为氯化镁，稳定的依那西普组合物包含大约50mg/ml的依那西普；大约10mM氯化镁；大约10-30mM磷酸钠；小于大约150mM氯化钠；和小于大约3wt.％蔗糖；并且具有大约6.3至6.5的pH。
再一实施方式中，其中稳定剂为氯化镁，稳定的依那西普组合物包含大约50mg/ml的依那西普；大约5mM氯化镁；大约10-30mM磷酸钠；小于大约100mM氯化钠；和小于大约4wt.％蔗糖；并且具有大约6.3至6.5的pH。
再一实施方式中，其中稳定剂为氯化镁，稳定的依那西普组合物包含大约50mg/ml的依那西普；大约4mM氯化镁；大约10-30mM磷酸钠；大约100mM氯化钠；和大约2.5wt.％蔗糖；并且具有大约6.3至6.5的pH。
再一实施方式中，其中稳定剂为氯化镁，稳定的依那西普组合物包含大约50mg/ml的依那西普；大约10mM氯化镁；大约10-30mM磷酸钠；小于大约100mM氯化钠；和小于大约5wt.％蔗糖；并且具有大约6.3至6.5的pH。
本发明的依那西普组合物还能够提供包括可接受水平的显微镜下可见的颗粒的制剂。因此，本发明还指向金属离子稳定的依那西普制剂，其在M3或T2或T4每mL平均具有不超过大约10,000个尺寸大于5μm的显微镜下可见的颗粒。
本发明的稳定的依那西普组合物的特征还为：(a)在M3或T2或T4的SEC分析为单体含量大于大约90wt％；并且聚集体含量小于大约3wt％；和(b)在M3或T2或T4的HIC分析，其中由HIC色谱图中峰1代表的组分的量小于大约3wt％；由HIC色谱图中峰2代表的组分的量大于80wt％；及由HIC色谱图中峰3代表的组分的量小于大约20wt％，并且其中制剂不包括精氨酸或基本上无精氨酸。
制剂的稳定性的特征还可为组合物表现为在M3或T2或T4的HIC分析，其中由HIC色谱图中峰1代表的组分的量小于大约1wt％；由HIC色谱图中峰2代表的组分的量大于大约95wt％；及由HIC色谱图中峰3代表的组分的量小于大约3wt％。
再一实施方式中，其中稳定剂为氯化钙，依那西普制剂包含包含大约50mg/ml的依那西普；1-5mM氯化钙；大约1-30mM磷酸钠；大约0至100mM NaCl；大约0.5至5％蔗糖或海藻糖或其组合；并且其中制剂具有大约6.0至6.6的pH且特征为：在M3或T2或T4的SEC分析为单体含量大于大约97wt％并且聚集体含量小于大约1wt％；在M3或T2或T4的HIC分析，其中由HIC色谱图中峰1代表的组分的量小于大约4wt％；由HIC色谱图中峰2代表的组分的量大于大约82wt％；及由HIC色谱图中峰3代表的组分的量小于大约15wt％。本发明的制剂使用氯化钙用于稳定在不需要精氨酸作为稳定剂时能满足前述标准。
再一实施方式中，其中稳定剂为氯化镁，稳定的依那西普组合物包含大约1mM至大约20mM氯化镁；可选地多至大约6wt.％蔗糖；大约25至150mM NaCl；大约1至大约30mM磷酸钠；其中组合物具有大约6.0至6.6的pH；并且其中组合物的特征为：在M3或T2或T4的SEC分析为单体含量大于大约97wt％并且聚集体含量小于大约1wt％；及在M3或T2或T4的HIC分析，其中由HIC色谱图中峰1代表的组分的量小于大约4wt％；由HIC色谱图中峰2代表的组分的量大于大约85wt％；及由HIC色谱图中峰3代表的组分的量小于大约14wt％。本发明的制剂使用氯化镁用于稳定在不需要精氨酸作为稳定剂时能满足前述标准。
本发明优选的稳定的组合物表现为在M3或T2或T4的HIC分析，其中由HIC色谱图中峰1代表的组分的量小于大约2wt％且优选小于大约1wt％；由HIC色谱图中峰2代表的组分的量大于大约95wt％且优选大于大约97wt％；由及HIC色谱图中峰3代表的组分的量小于大约3wt％，且优选地0至1％。
本发明提供包含依那西普和用以抑制依那西普不稳定性、聚集、错折叠和/或碎裂的稳定剂的水性药物组合物，其中所述稳定剂包含稳定金属离子。在优选实施方式中，所述金属离子选自由钙、镁、锌、和其组合组成的组。在更优选实施方式中，钙、镁、锌分别以氯化钙、氯化镁和氯化锌的形式提供。氯化钙和氯化镁为依那西普特别优选的稳定剂。
与市售的含有精氨酸制剂提供的依那西普不同，根据美国专利7,648,702我们惊奇地发现，本文描述和例示的金属离子稳定的依那西普制剂不需要精氨酸用于长期稳定，尽管如果需要仍可加入精氨酸。能够提供没有精氨酸的稳定的依那西普制剂对于保健系统代表着潜在的重大益处，其可向患者和卫生保健提供者提供可选择的依那西普制剂，相对于现有需要精氨酸用于稳定的商业依那西普制剂(也即)变得可以更低的成本得到。
此处使用的术语“不稳定性”或类似术语表示储存期间依那西普单体经受各种不期望的转变的趋势。此转变包括形成低聚物和高分子量聚集体(下文中术语“聚集体”)，高分子量聚集体中多个依那西普单体通过各种非共价吸引力(例如静电相互作用)不可逆地相互结合。储存期间不期望的转变还可包括依那西普单体降解成小碎片和/或断开形式。理想地，依那西普制剂应尽可能最大程度地最小化依那西普制剂在储存期间形成依那西普的聚集体、错折叠蛋白质、低聚物和/或碎片的结果的趋势。从减少形成不期望的聚集体或碎片的能力得到的重要的益处是药物的潜在的毒性和/或免疫原性的减小。
金属离子稳定的制剂可选地且优选地无，或基本上无精氨酸。术语“基本上无精氨酸”意思是精氨酸，即使存在，也不有助于所述制剂中依那西普单体的稳定至如此程度以致本领域技术人员将会判断其存在从稳定的角度而言是有利或必要的。
这些和其它方面从下面的各种实施方式的描述中将变得显而易见，尽管其中的改变和变型可受影响，但也不脱离本公开的新的观念的精神和范围。
应当明白，前述的一般描述和下面的详细描述仅为本发明权利要求的示例和解释并不是限制。
发明详述
现在详细描述本发明的各种实施方式。说明书中使用的并贯穿权利要求的“一个(a)”,“一个(an)”,和“此(the)”的意思包括复数引用除非文中另有明确规定。还有，说明书中使用的并贯穿权利要求的“在…中(in)”的意思包括“在…中(in)”和“在…上(on)”除非文中另有明确规定。此外，说明书中使用的一些术语更具体地定义如下。
定义
本说明书中使用的术语一般具有其在本发明文中领域和每个术语使用的语境中的通常含义。用于描述本发明的某些术语讨论如下，或说明书的其他地方，向就本发明说明书的实践者提供其他的指导。提供了某些术语的同义词。一个或多个同义词的陈述不排除其他同义词的使用。本说明书任何地方使用的例子包括此处讨论的任何术语的例子仅是说明的，不以任何方式限制本发明的范围和含义或任何例示术语。本发明不限于本说明书中给出的各种实施方式。
除非另有规定，此处使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的相同含义。在有冲突的情况，本文件，包括定义将约束。
“左右(Around)”“大约(about)”或“近似(approximately)”意味着在给定值或范围的20％之内、10％之内、5、4、3、2或1％之内。给出的数值的量是近似的，意味着术语“左右(Around)”“大约(about)”或“近似地(approximately)”可推测如果没有明确规定。
术语“依那西普”或“依那西普单体”或“单体”是的同义词。指的是多肽，其是二聚融合多肽的多肽，包括连接到人免疫球蛋白G的Fc部分的人类75千道尔顿(p75)肿瘤坏死因子受体(TNFR)的细胞外配体结合部分。其含有934个氨基酸并具有大约150千道尔顿的表观分子量。为了本发明申请的目的，术语“依那西普”还包括在氨基酸结构上具有不影响依那西普的功能、效果，或亲和力的较小变型(包括氨基酸的删除、增加，和/或替代)的依那西普。术语“依那西普”包括的所有形式和制剂，包括但不限于浓缩的制剂、随时可用于可注射的制剂；用水、乙醇，和/或其他材料再造的制剂及其他。
此处使用的术语“单体”意思是上述提及的二聚的依那西普融合蛋白。
术语“糖”指的是单糖、二糖，和多糖。糖的例子包括但不限于蔗糖、海藻糖、右旋糖及其他。
术语“金属离子”指的是具有正电荷或负电荷的金属原子。为了本发明申请的目的，术语“金属离子”还包括金属离子的来源，包括但不限于金属盐。
术语“长期储存”理解为药物组合物可储存三个月或更长，六个月或更长，并且优选地一年或更长。长期储存还可理解为药物组合物作为液体在2-8℃，或冷冻，例如在-20℃或更冷下储存。其还涉及组合物被冷冻并解冻一次或更多。
关于长期储存的术语“稳定的”或“稳定化的”理解为包含在药物组合物中的依那西普的活性相对于组合物储存之初的活性的损失不多于20％，或更优选15％，或进一步优选10％，和最优选5％。
术语“哺乳动物”包括但不限于人类。
术语“药学上可接受载体”指的是无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、封装材料、制剂辅料，或常规剂型的赋形剂。药学上可接受载体在使用剂量和浓度下对受体是无毒的并且与制剂中的其他材料相容。
术语“组合物”指的是通常包括载体，如药学上可接受载体或本领域常规赋形剂的混合物，并且为了治疗、诊断、或预防适合向客体给药。它可包括细胞培养，其中多肽或多肽苷酸出现在细胞或培养基中。例如，用于口服给药的组合物可形成溶液、悬浮液、片、丸、胶囊、缓释制剂、口服灌洗剂或粉末。
术语“药物组合物”和“制剂”可交换使用。
术语“治疗”指的是任何用于哺乳动物的疾病的给药或治疗且包括抑制疾病、阻止其发展、减轻疾病，例如，复原、恢复或修复损失、缺失，或有缺陷的功能；或刺激低效率的过程。此术语包括获得预期的药理学商和/或生理学上的效果，覆盖哺乳动物中任何病理状态或不适的治疗。所述效果可为预防性的完全或部分阻止其不适或症状和/或治疗性的部分或完全治愈不适和/或由不适带来的不利影响。它包括(1)阻止有患不适倾向但还没症状的客体出现或复发的不适，(2)抑制不适，如阻止其发展，(3)停止或终止不适或至少是其相关症状，以便宿主不再遭受不适或其症状之苦，例如使不适或其症状复原，例如通过恢复或修复损失、缺失，或有缺陷的功能刺激低效率的过程，或(4)减轻、缓解或改善不适，或与其相关的症状，其中改善广义上讲是指在至少参数量级上减少，例如炎症、痛苦和/或肿瘤大小。
术语“疾病”指的是需要医疗干预或医疗干预是令人满意的情况、感染、不适或综合征。此医疗干预可包括治疗、诊断和/或预防。
术语“治疗有效量”指的是当向活体给药，在活体上达到预期效果这样的量。例如，本发明多肽向活体给药的有效量为阻止和/或治疗整合蛋白αvβ3-疾病的量。精确的量取决于治疗的目的，可由本领域技术人员使用已知技术确定。如本领域所示，根据局部递送、年龄、体重、总体健康、性别、饮食、给药时间、药物相互作用和状况的严重程度调节系统的是必要的，并且可由本领域技术人员通过常规实验确定。
术语“T1”指的是依那西普制剂在40℃下已经储存一周的时间点。
术语“T2”指的是依那西普制剂在40℃下已经储存两周的时间点。
术语“T4”指的是依那西普制剂在40℃下已经储存四周的时间点。
术语“M3”共指三个时间点，和特别是依那西普制剂在5℃温度下储存大约一个、大约两个或大约三个月时间后观察到的分析结果。例如，此处提及在M3进行的分析，应理解为该分析在依那西普制剂已经储存选自大约一个、大约两个或大约三个月时间的时间点进行的。因此，如果观察到至少相应于下面储存时间的一个时间点即满足了此处要求的在M3依那西普制剂带来的某一分析值或测量：5℃下储存大约一个月，大约两个月或大约三个月。
此处使用的术语“峰1”、“峰2”和“峰3”与讨论的HIC色谱图结果有关，指的是与美国专利7,294,481中讨论的相同的峰1、2和3。
具体实施方式
当包含依那西普的药物组合物，包括依那西普的水性的和冻干的制剂，长期储存时，依那西普的活性可能由于依那西普单体的不稳定性，通过聚集和/或化学降解包括形成碎片，导致损失或减小。因此，本发明提供允许依那西普的水性制剂稳定地长期储存的数个实施方式，允许依那西普稳定的长期储存，以便依那西普，不管是液体状态还是冻结状态，在储存过程中均是稳定的。所提供的制剂包括但不限于不含精氨酸和不需要如再水合的其他步骤的制剂。
这些实施方式更加详细地解释如下。
依那西普
本发明所有的组合物均包含如本申请的背景部分所述，依那西普是二聚融合多肽，其包括连接到人免疫球蛋白G的Fc部分的人类75千道尔顿(p75)肿瘤坏死因子受体(TNFR)的细胞外配体结合部分。依那西普含有934个氨基酸。依那西普的Fc组份包括人免疫球蛋白G的重链恒定区2(CH2)，重链恒定区3(CH3)和铰链区。Fc区可包括一个或所有的上述区。
本药物组合物中适于储存的依那西普由表达依那西普的活宿细胞主生成，如抗体中的杂交瘤，或在融合多肽或抗体的情况下已由基因工程生成多肽的宿主细胞。基因工程细胞生成多肽的方法在本领域已是众所周知的。参见，例如，Ausubel等人，eds.(1990),Current Protocols in Molecular Biology(Wiley,New York)。此方法包括引入核酸以编码并向活宿主表达多肽。这些活宿主可为细菌细胞、真菌细胞，或优选地，培养中生长的动物细胞。细菌宿主细胞包括但不限于大肠杆菌细胞。合适的大肠杆菌菌株的例子包括：HB101、DH5.α、GM2929、JM109、KW251、NM538、NM539，和任何未能分开外来DNA的大肠杆菌菌株。可使用的真菌宿主包括但不限于，酿酒酵母、毕赤酵母和曲霉属真菌细胞。可使用的动物细胞株的几个例子为CHO、VERO、BHK、HeLa、Cos、MDCK、293、3T3，和W138。新的动物细胞株可由本领域技术人员根据已知方法确定(例如转变、病毒性感染，和/或挑选)。可选地，依那西普可由宿主隐藏到媒介中。
表达的依那西普的纯化可通过任何标准方法进行。当依那西普在细胞内生成时，颗粒碎片通过例如离心分离或超滤去除。当依那西普隐藏到媒介中时，来自表达系统的多肽可首先使用标准多肽浓缩过滤器浓缩。也可加入抑制蛋白质水解的蛋白酶抑制剂和包括阻止微生物生长的抗生素。
依那西普可使用，例如，羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析和亲和色谱法，和已知的或待发现的纯化技术包括但不限于蛋白A色谱法、分馏上的离子交换柱、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱法、肝素上的色谱法、阴离子或阳离子交换树脂层析法(如聚天冬氨酸柱)、层析聚焦、SDS-PAGE、和硫酸铵沉淀的任意组合纯化。
金属离子稳定的依那西普
本发明提供了包含依那西普和用以抑制依那西普不稳定性、聚集、错折叠和/或碎裂的稳定剂的水性药物组合物，其中所述稳定剂包含稳定金属离子。
不囿于本发明的任何特别的理论，我们认为金属离子如钙、镁、和锌作为构象稳定剂以降低依那西普聚集的趋势。聚集上的减少被认为持续了很长时间，如两年或更多。不囿于特别的理论，我们认为金属离子能够稳定含有依那西普的水性药物组合物，因为金属可结合到自然态，此时配体发生右旋几何结构。这样做时，有自然态的纯粹的稳定。一旦蛋白质展开，结合部位失去，变性状态在自由能方面比较不受影响。结果是构象的纯粹的稳定，导致改进的长期储存。此外，金属结核还可提高蛋白质的胶体稳定性，导致聚集减少并且溶解度增加。金属离子的稳定影响可不限于聚集的减少但也可表现为制剂中依那西普单体不稳定的其他方面。
在优选实施方式中，金属离子选自由钙、镁、锌、和其组合组成的组。在更优选实施方式中，钙、镁、锌分别以氯化钙、氯化镁和氯化锌的形式提供。
本发明的药物组合物可通过结合纯化的依那西普和金属离子制备。而且，如果需要可加入缓冲剂、张度改性剂和其他的赋形剂和其他常用的非活性成分。为简单起见，这些在说明书的后面更充分地讨论。本领域的普通技术人员应明白各种组合物中包括的组分的结合可以任何适当的顺序进行。如缓冲剂可以在先、中间或在后加入，张度改性剂也可以在先、中间或在后加入。本领域的普通技术人员还可理解这些化学品中的一些在某些组合中是不相容的，并因此，容易地用具有相同性质但在相关混合物中相容的不同的化学品替代。
在优选实施方式中，提供的制剂中金属离子的浓度优选为大约1mM至0.5M，更优选为大约1mM至大约100mM，更优选为大约2mM至大约20mM，还更优选为大约2mM至10mM。
金属离子的来源可从商业提供者得到。
在一个实施方式中使用氯化钙用于稳定，本发明的依那西普制剂包含大约25至大约50mg/ml的依那西普；达到大约5mM氯化钙；可选地大约0.5至6wt.％蔗糖或海藻糖；可选地大约0至100mM NaCl；可选地达到大约10mM木糖醇；大约1至大约30mM磷酸钠；其中组合物具有大约6.0至大约7.0，更优选大约6.0至大约6.6和最优选大约6.3至大约6.5的pH。
在一个实施方式中使用氯化镁用于稳定，本发明的依那西普制剂包含大约25至大约50mg/ml的依那西普；大约1mM至大约20mM氯化镁；可选地达到大约6wt.％蔗糖；大约25至150mM NaCl；大约1至大约30mM磷酸钠；其中组合物具有大约6.0至大约7.0，更优选大约6.0至大约6.6和最优选大约6.3至大约6.5的pH。
金属离子稳定的组合物优选特征为：在T2的SEC分析为大约80wt％至大约95wt.％单体含量；在T2的SEC分析为小于大约4wt％聚集体含量；及在T2的SEC分析为小于大约8wt％的碎片3的量。
在一个方面，根据本发明所述的含有稳定的金属离子的依那西普制剂，带来稳定性特征为：
(a)在T4的SEC分析为大于大约90,91,92,93,94,95,96,或97wt.％单体含量；和小于大约3,2或1wt.％聚集体含量；及
(b)在T2的HIC分析，其中由HIC色谱图中峰1代表的组分的量小于大约3,2或1wt.％；由HIC色谱图中峰2代表的组分的量大于80,81,82,83,84或85wt.％；和由HIC色谱图中峰3代表的组分的量小于大约20,19,18,17,16,15,14,或13wt.％；及
(c)在T4的HIC分析，其中HIC色谱图中由峰1代表的组分的量小于大约3,2或1wt.％；HIC色谱图中由峰2代表的组分的量大于80,81,82,83,84或85wt.％；和HIC色谱图中由峰3代表的组分的量小于20,19,18,17,16,15,14,或13wt.％。
本发明的含有金属离子用于稳定的依那西普制剂更优选的特征为：在T4或T2的HIC分析，其中由HIC色谱图中峰1代表的组分的量小于大约1wt.％；由HIC色谱图中峰2代表的组分的量大于大约95wt.％；和由HIC色谱图中峰3代表的组分的量小于大约3wt.％。
术语“SEC”,“T2”“T4”“HIC”“单体含量”“聚集体”和“碎片3”“峰1,”“峰2,”和“峰3,”，定义如上和下面的实施例中。
优选的氯化钙稳定的依那西普制剂包含：大约50mg/ml的依那西普；1至5mM氯化钙；大约1至大约30mM磷酸钠；大约0至100mM NaCl；大约0.5至5wt.％蔗糖或海藻糖或其组合；其中组合物具有大约6.0至大约6.6的pH并且特征为：在T4的SEC分析为大于大约97wt.％单体含量和小于大约1wt.％聚集体含量；在T2的HIC分析，其中由HIC色谱图中峰1代表的组分的量小于大约4wt.％；由HIC色谱图中峰2代表的组分的量大于大约82wt.％；和由HIC色谱图中峰3代表的组分的量小于大约15wt.％；和在T4的HIC分析，其中由HIC色谱图中峰1代表的组分的量小于大约2wt.％；由HIC色谱图中峰2代表的组分的量大于大约85wt.％；和由HIC色谱图中峰3代表的组合物的量小于大约13wt.％。
优选的氯化镁稳定的依那西普制剂包含：大约1mM至大约20mM氯化镁；可选地多至大约6wt.％蔗糖；大约25至150mM NaCl；大约1至大约30mM磷酸钠；其中组合物具有大约6.0至大约6.6的pH并且其中组合物的特征为：在T4的SEC分析大于大约97wt.％单体含量和小于大约1wt.％聚集体含量；在T2的HIC分析，其中由HIC色谱图中峰1代表的组合物的量小于大约4wt.％；由HIC色谱图中峰2代表的组合物的量大于大约85wt.％；和HIC由色谱图中峰3代表的组合物的量小于大约14wt.％；和在T4的HIC分析，其中由HIC色谱图中峰1代表的组分的量小于大约2wt.％；由HIC色谱图中峰2代表的组分的量大于大约85wt.％；和由HIC色谱图中峰3代表的组分的量小于大约14wt.％。
本发明特别优选的氯化钙稳定的实施方式中，具有上述分析的性质的稳定的依那西普制剂包含：大约50mg/ml的依那西普；大约2mM氯化钙；大约15mM磷酸钠；大约75mMNaCl；和大约3wt.％蔗糖；其中制剂具有大约6.3至大约6.5的pH。
金属离子稳定的依那西普组合物的再一实施例中，稳定剂为氯化钙或氯化镁，制剂无或基本上无精氨酸，制剂带来的长期储存稳定性特征为：
在M3的SEC分析：单体含量大于大约90wt.％；聚集体含量小于大约3wt.％；和碎片3的量小于大约5wt％；及
在M3的HIC分析，其中由HIC色谱图中峰1代表的组分的量小于大约3wt.％；由HIC色谱图中峰2代表的组分的量大于80wt.％；和由HIC色谱图中峰3代表的组分的量小于大约20wt.％。
再一实施方式中稳定剂为氯化钙和/或氯化镁，稳定的组合物带来的长期储存稳定性特征为：
在M3或T4的SEC分析：单体含量大于大约90wt.％；聚集体含量小于大约3wt.％；和碎片3的量小于大约5wt％；及
在M3或T2的HIC分析，其中由HIC色谱图中峰1代表的组分的量小于大约3wt.％；由HIC色谱图中峰2代表的组分的量大于80wt.％；由和HIC色谱图中峰3代表的组分的量小于大约20wt.％。
本发明使用氯化镁用于稳定的再一优选实施方式中，具有上述分析的性质的稳定的依那西普制剂包含：大约50mg/ml的依那西普；大约10mM氯化镁；大约15mM磷酸钠；大约75mM氯化钠；和大约3wt.％蔗糖；并且具有大约6.3至大约6.5的pH。
在另一优选实施方式中，本发明的氯化钙或氯化镁稳定的依那西普组合物带来的长期储存稳定性的特征为：在M3的HIC分析，其中由HIC色谱图中峰2代表的组分的量大于或等于95wt.％；和由HIC色谱图中峰3代表的组分的量小于或等于大约1wt.％。
金属离子稳定的依那西普制剂，不含精氨酸，发现在5℃下储存经过3个月后的稳定性与目前市场上可得到的含有精氨酸的Enbrel制剂相当或更好。因此本发明还涉及金属离子稳定的依那西普制剂，其不含精氨酸或基本上无精氨酸，并且其中组合物在5℃下储存一、二或三个月后，当在选自下面的时间点：自储存起大约一个月、大约两个月、大约三个月，评估带来的长期储存稳定性符合下面的一个或两个标准：(A)稳定性与市售的商标为的依那西普相当或更好，其通过以下测量：(i)组合物中聚集体，单体和碎片3的量的SEC分析(如说明书中规定)和(ii)HIC色谱图中相应于峰1、2和3的组合物中材料的量的HIC分析(如说明书中规定)；及
(B)HIC色谱图其中(i)峰3没有或基本上和没有(ii)峰2代表大于大约95wt％的组合物；SEC色谱图基本不含相应于聚集体的峰；和SEC色谱图其中组合中代表单体的量至少为大约95wt％。
术语“SEC”,“T2”“T4”“HIC”“单体含量”“聚集体”和“碎片3”“峰1,”“峰2,”和“峰3,”，如上并在下面的实施例中定义。
尽管根据本发明使用金属离子稳定，但是不排除使用精氨酸，根据本发明包含金属离子用于稳定的依那西普制剂优选无或基本上无精氨酸。
提供的药物组合物的其他的组分
本发明的制剂还可包括缓冲剂、张度改性剂、赋形剂、药学上可接受载体和药物组合物其他常用的非活性成分。为简单起见，这些在本申请的后面更充分地讨论。
缓冲剂保持pH在期望的范围。合适的缓冲剂包括组氨酸、磷酸钾、柠檬酸钠或柠檬酸钾、马来酸、醋酸铵、三-(羟甲基)-氨基甲烷(tris)、各种形式的醋酸盐和二乙醇胺。制剂中缓冲剂的浓度优选为大约1mM至大约1M，更优选为大约10mM至大约200mM。缓冲剂在本领域是众所周知的，可由已知方法制得和从商业提供者购买。
合适的缓冲剂的例子为磷酸盐、组氨酸、柠檬酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、醋酸盐、三(羟甲基)氨基甲烷(tris)、碳酸氢盐。
一个优选实施方式中，缓冲剂为；磷酸钠。
优选实施方式中，药物组合物的pH在或接近生理水平。因此，优选地，所提供组合物的pH为大约5.8至大约8.4；和更优选地，大约6.2至大约7.4。本领域普通技术人员应明白在特别制剂中必要时可调节以最大化依那西普的稳定性和溶解度。因此，pH在生理范围之外但患者仍可忍受的依那西普制剂，也在本发明的范围内。
张度改性剂为有助于溶液渗透压的分子。药物组合物的渗透压优选调节至最大化活性组分的稳定性和/或最小化给药时患者的不适感。通常优选药物组合物与血清等压，也即，具有相同或相似的渗透压，这通过加入张度改性剂达到。
在一个优选实施方式中，所提供的制剂的渗透压为大约180至大约420mOsM。然而应当明白，为特殊情况需要渗透压可更高或更低。
适用于调节渗透压的张度改性剂的例子包括但不限于氨基酸(不包括精氨酸)(例如，半胱氨酸、组氨酸和甘氨酸)、盐(例如，氯化钠、氯化钾和柠檬酸钠)和/或糖类(例如，蔗糖、葡萄糖和甘露糖醇)。
优选的张度改性剂为甘氨酸、丙氨酸、氯化钠、氯化钾和硫酸钠。
在一个优选实施方式中，制剂中张度改性剂的浓度优选为大约1mM至大约1M，更优选为大约10mM至大约200mM。张度改性剂在本领域是众所周知的，可由已知方法制得和从商业提供者购买。
赋形剂，还称为化学添加剂、共溶质、或共溶剂，在溶液中(还可在干燥或冻结状态中)稳定多肽还可加入到药物组合物中。赋形剂在本领域是众所周知的，可由已知方法制得和从商业提供者购买。
合适的赋形剂的例子包括但不限于糖/多羟基化合物，如：蔗糖、乳糖、甘油、木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、麦芽糖、肌醇、海藻糖、葡萄糖；聚合物，如：血清白蛋白(牛血清白蛋白(BSA)、人SA或重组HA)、葡聚糖、聚(乙烯醇)(PVA)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、聚乙烯亚胺、明胶、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羟乙基纤维素(HEC)；非水溶剂，例如：多元醇(例如，PEG和甘油)和二甲基甲酰胺(DMF)；氨基酸，如：脯氨酸、L-丝氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸盐酸盐、肌氨酸和γ-氨基丁酸；表面活性剂如：(聚山梨醇酯80)、(聚山梨醇酯20)、SDS、聚山梨醇酯、泊洛沙姆；和混合的赋形剂，如磷酸钾、乙酸钠、硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、三甲胺N-氧化物、甜菜碱、金属离子(如锌、钙、和镁)、CHAPS、单月桂酸酯、2-O-β-甘露甘油酸酯(2-O-beta-mannoglycerate)或上述的任意组合。
优选的赋形剂为蔗糖、乳糖、丙三醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露醇、麦芽糖、肌醇、海藻糖、葡萄糖、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、重组白蛋白、葡聚糖、PVA、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、聚乙烯亚胺、明胶、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羟乙基纤维素(HEC)、聚乙二醇、乙二醇、甘油、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸盐酸盐、肌氨酸、SDS、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、泊咯沙姆188、三甲胺N-氧化物、甜菜碱、锌离子、钙离子、镁离子、CHAPS、蔗糖单月桂酸酯和2-O-β-甘露甘油酸酯(2-O-beta-mannoglycerate)。
本发明制剂中一种或多种赋形剂的浓度优选为大约0.001至5wt％，更优选为大约0.1至2wt％。
治疗方法
在另一实施方式中，本发明提供治疗哺乳动物的方法包含向哺乳动物给药治疗有效剂量的本发明的药物组合物，其中所述哺乳动物患有疾病或不适，其可以从使用依那西普的治疗中获益。
在一个优选实施方式中，依那西普从用组合物治疗的相同种类的哺乳动物中得到。
在一个优选实施方式中，所述哺乳动物为人类。
可使用所提供的组合物治疗的疾病或不适包括但不限于类风湿关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、韦格纳氏病(肉芽肿病)、克罗恩病(或炎症性肠病)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、丙型肝炎、子宫内膜异位症、哮喘、恶病质、牛皮癣和特应性皮炎。其他的可使用本发明组合物治疗的疾病或不适包括WO00/62790、WO 01/62272、美国专利申请号2001/0021380和美国专利7,648,702B2中的描述，其相关部分通过引用的方式并入本文。
所提供的药物组合物如果需要可通过全身注射，如静脉注射向客体给药；或通过向相关部位注射或施用，如手术中部位暴露时，向部位直接注射或直接施用；或通过局部施用。
在一个实施方式中，本发明提供了治疗和/或预防类风湿性关节炎的方法，包括将所提供的依那西普组合物之一，向哺乳动物给药其需要的治疗有效剂量。
所提供组合物中依那西普的治疗有效剂量取决于待治疗的状况，状况的严重程度，先前的治疗，和患者的临床史和对药物的反应。适当的剂量可根据主治医生的判断调整，例如可将其一次或经一系列的给药向患者给药。
在一个实施方式中，每个成年人有效的依那西普量的剂量为大约1-500mg/m2，或为大约1-200mg/m2，或为大约1-40mg/m2，或为大约5-25mg/m2。
或者，以固定剂量给药，其量为2-500mg/剂量，2-100mg/剂量或为大约10-80mg/剂量。
如果每周给药剂量多于一次，示例的剂量范围与前述的剂量范围相同或更低和优选地给药为每周两次，每次25-100mg/剂量的剂量范围。
在另一个实施方式中，通过注射可接受的给药剂量含有80-100mg/剂量，或可选择地含有80mg每剂量。
剂量可每周、两周或隔开数周(例如2-8周)给药。
在一个实施方式中，依那西普以25至75mg/ml通过单次皮下(SC)注射。
在某些情况下，通过每周一到三次，持续至少三周，达到大约100mg的药物组合物的给药剂量得到患者状况的好转。若想有期望程度的好转，长期的治疗是必要的。对于不可治疗的慢性疾病，该疗法可无限期地持续。对于儿科患者(年龄4-17)，适当的疗法可涉及给药0.4mg/kg至5mg/kg剂量的依那西普，每周一次或多次。
在另一个实施方式中，本发明的药物制剂以浓缩制剂制备，如此，药物组合物的组分调整至高于需要的给药量并在给药前适当稀释。
药物组合物可作为唯一治疗剂给药或需要时与其他治疗结合。因此，在一个实施方式中，所提供的治疗和/或预防方法与给药治疗有效量的其他活性剂结合使用。其他活性剂可在给药本发明的药物组合物之前、期间或之后给药。可给药的另一种活性剂既可作为所提供的组合物的一部分，也可作为单独制剂给药。
所提供的药物组合物的给药可通过各种方式完成，包括肠胃外、口服、口腔、舌下、鼻、直肠、腹膜内、皮内、透皮、皮下、静脉内、动脉内、心脏内、心室内、颅内、气管内、鞘内给药、肌内注射、玻璃体内注射和局部施用。
本发明的药物组合物特别有益于肠胃外给药，也即，皮下、肌内、静脉内、腹膜内、脑脊髓内、关节内、滑膜内、玻璃体内、和/或鞘内。肠胃外给药可通过大剂量注射或连续输注。注射用药物组合物可以单位剂型出现，例如在安瓿中或在多剂量容器中，并加入防腐剂。此外，最近的一些药物递送方法已被开发，并且本发明的药物组合物适用于这些新的方法，例如注入， 注射笔如和针装置如和给药。本发明的药物组合物也可以适合于尚未被发现的给药方法。另见Langer,1990,Science,249:1527-1533。
所提供的药物组合物还可配制成长效制剂。这种长效制剂可通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射给药。因此，例如，所述制剂可以用合适的聚合或疏水材料(例如作为在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂，或作为微溶性衍生物，例如，作为微溶盐修饰。
所述的药物组合物可以，如果需要的话，出现在可包含含有活性成分的一个或多个单位剂型的小瓶，包装或分配装置中。在一个实施例中的分配装置可包含具有用于注射的单剂量液体制剂的注射器。注射器可附有给药说明书。
在另一个实施例中，本发明指向含有本发明的水性药物组合物的试剂盒或容器。水性药物组合物中多肽的浓度可在宽范围内变化，但是通常在大约0.05至大约20,000微克每毫升(μg/ml)水性制剂的范围内。试剂盒也可附有使用说明书。
本发明在下面实施例中进行更具体地描述，其仅用于说明，因为其中的许多变型和改变对本领域技术人员是显而易见的。
实施例1
用氯化钙稳定的依那西普
依那西普制剂可使用下面步骤制备：
以给定体积的制剂缓冲剂所需的量称重各固体制剂组分。这些组分结合放到烧杯或能够承载和测量给定体积的制剂缓冲剂的容器中。等于目的给定制剂缓冲剂的近似3/4体积的去离子水加入到烧杯中，然后溶解组分。缓冲液的pH使用1M的氢氧化钠和/或1M的氯化氢的调节到目标制剂的pH。然后通过加入去离子水使最终制剂缓冲剂体积提高到目的体积。依那西普蛋白溶液置于透析材料袋内(例如Thermo Scientific Slide-A-Lyzer MINIDialysis Unit 10,000MWCO)，然后4℃下，将其与期望的制剂缓冲剂接触下放置12小时。制剂缓冲剂的体积与蛋白质溶液的体积比应不小于1000:1。在4℃下透析袋和其包含的蛋白质溶液然后被放置于第二个，等体积的制剂缓冲剂中持续另外的12小时。所得的蛋白质溶液从透析材料袋去除，并用紫外光谱法测定蛋白质浓度。使用离心(如Amicon超10,000MWCO离心式浓缩器)和/或使用制剂缓冲剂稀释，将蛋白质浓度调节到所期望的水平。
组合物可通过体积排阻色谱法(SEC)、变性SEC(DSEC)、疏水作用色谱法(HIC)、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测试长期稳定，和各时间点下的结合和生物活性。生物活性可以通过许多已知实验进行测量。
例如，在Hawe等人,Pharm.Res.2011,28:2302和/或van Marrschalkerweerd等人,Eur.J.Pharm.Biopharm.2011,78:213中描述了体积排阻色谱法的技术。同样地，变性体积排阻色谱法、疏水作用色谱法，和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳对于本领域普通技术人员也是熟知的。
我们认为所述组合物经过两年或更长的时间是稳定的。
(制剂P1:1)
成分 浓度
依那西普(活性成分) 50mg/ml
氯化钙(非活性成分) 2mM
磷酸钠，pH 6.3(非活性) 25mM
(制剂1:11)
(制剂1:18)
成分 浓度
依那西普(活性成分) 50mg/ml
氯化钙(非活性成分) 2mM
磷酸钠，pH 6.3(非活性) 25mM
木糖醇(非活性) 10mM
(制剂3:6)
(制剂3:9)
成分 浓度
依那西普(活性成分) 50mg/ml
氯化钙(非活性成分) 1mM
磷酸钠，pH 6.6(非活性) 10mM
NaCl(非活性) 50mM
海藻糖(非活性) 5％(w/v)
实施例2
用氯化镁稳定的依那西普
使用氯化镁稳定的依那西普制剂可使用与实施例1描述的相似的步骤制备和测试。下面示例的依那西普制剂不含精氨酸。
(制剂P1:2)
(制剂2:15)
成分 浓度
依那西普(活性成分) 50mg/ml
氯化镁(非活性成分) 4mM
磷酸钠，pH 6.4(非活性) 25mM
NaCl(非活性) 100mM
蔗糖(非活性) 2.5％(w/v)
(制剂3:7)
(制剂3:14)
成分 浓度
依那西普(活性成分) 50mg/ml
氯化镁(非活性成分) 10mM
磷酸钠，pH 6.3(非活性) 25mM
NaCl(非活性) 110mM
蔗糖(非活性) 1％(w/v)
(制剂4:2)
成分 浓度
依那西普(活性成分) 50mg/ml
氯化镁(非活性成分) 10mM
磷酸钠，pH 6.5(非活性) 15mM
NaCl(非活性) 75mM
蔗糖(非活性) 3％(w/v)
实施例3
用氯化锌稳定的依那西普
使用氯化锌稳定的依那西普制剂可使用与实施例1描述的相似的步骤制备和测试。
下面示例的依那西普制剂不含精氨酸。
(制剂P1:3)
成分 浓度
依那西普(活性成分) 50mg/ml
氯化锌(非活性成分) 2mM
磷酸钠，pH 6.3(非活性) 25mM
实施例4
依那西普的制备
步骤1.细胞扩增。在本领域内已知的方式中，使用表达依那西普融合蛋白的CHO细胞克隆进行对生成对于生产生物反应器的接种足够的有效数目的细胞必需的细胞扩增。此表达过程的产物(所收获的细胞培养液)是正确折叠的依那西普以及不正确折叠和/或聚集的依那西普连同另外的杂质的混合物。将包含此类蛋白质混合物的所收获的细胞培养液进行清洁剂病毒灭活。
步骤2.亲和色谱法。以已知的方式使用蛋白质A亲和柱，在上述步骤1得到的收获的细胞培养上进行亲和色谱法。产品回收率大约85％。所得产品为复杂的蛋白质混合物，其包含正确折叠的依那西普、不正确折叠的依那西普，和/或正确和/或不正确折叠的依那西普聚集体，或蛋白质碎片。从此蛋白质A亲和柱纯化步骤所得的产品调节至pH为3.5并随后经过病毒灭活步骤。病毒灭活之后产物调节至pH为5.5并随后使用可在市场上购买到的囊式过滤器以已知的方式澄清。
步骤3A.混合模式的阳离子交换层析法。使用31.8L(45cm直径X 20cm床高)填充层GE Healthcare Capto MMC层析柱纯化上述步骤2所得产物。使用前，柱子用2CV的25mMpH5.5的醋酸盐平衡和2CV的0.1N NaOH，1M NaCl消毒和2CV的25mM醋酸盐，0.7M NaCl，pH 5.5中和。柱子随后用8-10CV的25mMpH 5.5的醋酸盐平衡直至流出物的pH 5.5和3.5mS/cm。从上述步骤2出来的蛋白质A池用去离子水稀释至≤6mS/cm并用于柱负载达每圈15g/L媒介。在线速度为200cm/h下操作柱子以给出6分钟的保留时间。负载后，柱子用2CV的25mMpH 5.5的醋酸盐冲洗。产物随后用8.5CV,15％至85％梯度的25mM pH 5.5的醋酸盐至25mM醋酸盐，0.7M NaCl，pH 5.5洗脱。在0.15OD(A280,1.0cm程长)开始收集产物并在最大峰值的50％处结束收集。洗出液的体积为大约5CV。用2CV的10mM Tris,1M NaCl,pH 8.0将残余产物和污染物从柱子中去除并丢弃。从混合模式柱子中得到的产物使用Millipore Opticap XL10，0.22μm Durapore囊式过滤器，(0.69平方米)过滤。从该步骤中得到的产物代表了在步骤2中获得材料蛋白质A的大约70％的回收率。
步骤3B.混合模式的阴离子交换层析法。使用27.0L(45cm直径X 17cm床高)填充层GE Healthcare Capto MMC层析柱纯化上述步骤3A所得产物。使用前，柱子用2CV的25mM的Tris，pH 8.0平衡和2CV的0.1N NaOH，1M NaCl消毒和2CV的25mM Tris，pH 8.0中和和平衡。生成负载前，柱子用3CV的10mM Tris,pH 8.0平衡。从上述步骤3A得到的Capto MMC池用～0.045kg的1M Tris,pH 8.3每kg的池调节至pH 8.1。从上述步骤3A得到的产物用去离子水以1:3.8线性稀释以调节导电率至12.0mS/cm和pH 8.0。所得产物随后用于柱负载达15g/L媒介。在线速度为170cm/h下操作柱子以给出6分钟的保留时间。负载后，柱子用2CV的25mMpH 8.0的Tris冲洗。产物随后用10CV梯度(20％至90％)的25mM Tris,pH 8.0至10mMTris,1M NaCl,pH 8.0洗脱。在0.15OD(A280,1.0cm程长)开始收集产物并在最大峰值的25％处结束收集。洗出液的体积为4-6CV。使用市场上可买到的囊式过滤器过滤洗脱产物并随后以已知方式经过病毒过滤和正切流动过滤步骤。从步骤3B(包括最终的病毒过滤和正切流动过滤步骤)回收的全部产物为大约68％。在过滤步骤之前测量的产物回收率为大约75％。
分析：在此实施例中，由HIC测定发现得到的最终过滤的产物具有大于大约90wt％正确折叠的依那西普；由HIC测定发现小于5wt％不正确折叠的依那西普种类；由HIC分析小于大约3wt％的断开物质被(认为是依那西普碎片，在其中的TNFR部分已被切去)及通过体积排阻色谱法确定正确和不正确折叠的依那西普的组合的量大于95wt％。
依那西普制剂的分析
A.储存热稳定性
透析和浓缩后，将上述示例的依那西普制剂样品在生物安全柜中无菌过滤。使用无菌吸量管和高压蒸汽处理的吸管端，取样依那西普制剂转移至预先贴标签的并高压蒸汽处理的1mL冻干瓶中。小瓶使用无菌的丁基塞塞住并用铝帽夹住。所有瓶子随后转移至热稳定箱中。样品经过两个热稳定模式：(1)40℃下两周和(2)25℃下四周。贯穿本说明书，这两个温度模式分别用“T2”和T4”表示。
B.体积排阻色谱法(SEC)
此处公开的依那西普制剂使用已知的体积排阻色谱法(SEC)技术分析，高效液相色谱方法中的分析物根据体积分离(参见Rogner,M.(2000).Size ExclusionChromatography.Protein Liquid Chromatography.M.Kastner.Amsterdam,Elsevier.61:89-145.)。为了评估上述依那西普样品的热稳定性，根据文献(van Maarschalkerweerd,A.,G.J.Wolbink,et al.(2011)."Comparison of analytical methods to detectinstability of etanercept during thermal stress testing."European Journal of Pharmaceutics andBiopharmaceutics 78(2):213-221.)由SEC方法检验样品。制备的流动相缓冲液含有50mM的磷酸二氢钠一水合物和150mM的精氨酸。使用1M的HCl将pH调节至6.5。所有的分离使用线性连接到Tosoh TSK-Gel G4000SWxl 7.8mm x 30cm(货号8542)的TosohTSK-Gel SWxl 6mm x 4cm保护住(货号8543)进行。为了进行分离，柱子恢复至室温(23℃)，并且以流动相在0.5mL/min的流速平衡。5微升的50mg/mL依那西普制剂使用自动进样器注射到柱上。在30分钟内以0.5mL/min的流速完成分离。在此期间在280nm的波长处监测柱洗脱液。
C.积分体积排阻色谱法色谱图
所有积分使用Chromeleon软件(Dionex)进行。积分前，不含依那西普的缓冲剂的SEC色谱图从所有色谱图中减去。所有积分在保留时间为12分钟和26分钟之间进行。使用几个参数限定峰。检测峰的最小面积设定为0.05mAu*min。峰检测的二维敏感度设定为0.01mAu和75秒。使用手动积分工具添加峰肩。所有检测到的峰分两步手动调节。首先，峰基线(峰的底边界)调整至水平。其次，峰基线的垂直位置调整至色谱图基线。色谱图基线值规定为没有分析物信号的。不存在分析物的信号被定义为在12分钟保留时间mAu中的吸光度。
D.依那西普制剂的SEC碎片
在上述的依那西普制剂SEC分析中，识别并研究三个SEC色谱图碎片。分析的三个碎片是，以从SEC柱洗脱出的顺序：(1)高分子量部分代表完整的依那西普TNFR:FC融合蛋白的聚集体(下文中聚集体或聚集体含量)，可能是完整的依那西普分子通过非共价静电吸引结合的；(2)单体含量，代表完整的依那西普TNFR:FC融合蛋白(下文中称为单体或单体含量)；(3)可能代表依那西普的一个碎片或大量碎片，其中TNFR:分子融合蛋白的一部分已经从单体分裂；在分子的枢纽区失去融合蛋白的外面部分的壁。由SEC测量的最常见的碎片或断开的形式被称为碎片3。在进行的SEC分析中观察到聚集体首先洗脱出来，随后是单体，随后是碎片3。
下面的表格显示的是由上述SEC分析确定的聚集体、单体和碎片3的相对量。
表1
单体的SEC分析
注释：表I、II和III报道的量均为重量百分比
T0＝将制剂在5℃下保存并于产生24小时内分析。
T1＝制剂在40℃下储存一周
T2＝制剂在40℃下储存两周
表II
聚集体的SEC分析
注释：表I、II和III报道的量均为重量百分比
T0＝将制剂在5℃下保存并于产生24小时内分析。
T1＝制剂在40℃下储存一周
T2＝制剂在40℃下储存两周
表III
碎片3的分析
注释：表I、II和III报道的量均为重量百分比
T0＝将制剂在5℃下保存并于产生24小时内分析。
T1＝制剂在40℃下储存一周
T2＝制剂在40℃下储存两周
表IV
SEC分析的单体含量
(T4＝4周/25℃)
下面的表IV显示的根据本发明制备的依那西普制剂的单体(依那西普)量，当在25℃下储存四周时-用符号T4表示。下面的表中T0代表在样品温度为5℃下，制备的制剂在24小时内进行的SEC测量；和T4代表在25℃下储存4周后，经过SEC分析的依那西普制剂样品。
表V
SEC分析的聚集体含量
(T4＝4周/25℃)
下面的表V显示的根据本发明制备的依那西普制剂在25℃下储存四周后的聚集体含量。下面的表中T0代表在样品温度为5℃下，制备的制剂在24小时内进行的SEC测量；和T4代表在25℃下储存4周后，经过SEC分析的依那西普制剂样品。
依那西普制剂的HIC分析
下面的表(表VI和VII)显示对3:5和3:8样品进行的疏水作用色谱法(“HIC色谱法”)的结果。HIC色谱法以本领域已知的方法进行并在美国专利7,294,481中有一般的描述，通过引用并入本发明。在t0(5℃下制备的24小时内)下评估样品并在25℃下储存两周后(t2)(见表VI)或在25℃下储存四周后(t4)(见表VII)再次评估。HIC色谱法中的峰1被认为是或包括上面SEC数据讨论中所成的“碎片3”，其使用SEC鉴别并定量；峰2为参考上面SEC数据讨论中所称的依那西普单体；及峰3为参考上面SEC数据讨论中所称的“聚集体”。还应当明白，此处使用的术语“峰1”、“峰2”和“峰3”还构成美国专利7,294,481的图4中涉及和公开的HIC峰1、峰2和峰3的引用，通过引用的方式并入本文。
表VI
40℃下储存两周后的HIC数据。(T2)
表VII
25℃下储存4周后的HIC数据(T4)
下表VIII至XVI，包含对制剂3:6和4:2及含有以实施例4(依那西普的制备)一般描述的方式产生的依那西普材料进行的稳定性测试结果。制剂的稳定性使用SEC,HIC和FlowCAM分析显微镜下可见的颗粒，基于在各种温度下，包括5℃下储存一个、两个和三个月。下面是进行这些稳定性实验的方法：
大量依那西普储存：未制剂的大量的依那西普按照包装说明书所示在2-8℃下储存。
UV光谱。UV光谱用于确定各稳定性样品中的蛋白质浓度。大块物质(50mg/mLEnbrel)在280nm的吸收使用0.1mm光程单元确定为0.625，导致1.30mL/mg*cm的消光系数。在本案中使用此值用于所有的计算。
依那西普制剂的透析和浓缩。所有的缓冲液以两个1L体积含有所有的缓冲剂组分制备。在去离子水中冲洗暗盒5分钟后，大块材料装载于Slide-A-Lyzer透析单元(10kD截留1至3mL体积)中。透析样品在1L缓冲液中在2-8℃下经过五小时透析，随后在第二个1L缓冲液中在2-8℃下过夜进行第二透析。当透析依那西普制剂3:5时，使用了两个4L透析过程，因为制剂需要24mL的储备蛋白。
所有样品使用超过滤10K截留离心过滤器(2mL尺寸)浓缩至上述它们的目的值。使用UV确定样品新的浓度，然后使用制剂缓冲剂将其稀释至适当水平。
热稳定性潜伏样品。透析和浓缩后，在生物安全柜中无菌过滤热稳定性样品。使用无菌吸量管和高压蒸汽处理的吸管端，样品被转移至预先贴标签的并高压蒸汽处理的1mL冻干瓶中。小瓶使用灭菌的丁基塞塞住并用铝帽夹住。所有瓶子随后转移至热稳定箱中。
体积排阻色谱法(SEC)。体积排阻色谱法(SEC)使用不同的方法进行。在本文称为“方法2”一种SEC方法中，制备的流动相缓冲液含有50mM的磷酸二氢钠一水合物和150mM的精氨酸HCl。使用1M NaOH将pH调节至6.5。所有的分离使用Phenomonex Yarra 3微米SEC3000，30cm x 4.6mm进行。为了进行分离，柱子恢复至室温(23℃)，并且以流动相在0.5mL/min的流速平衡。一微升的50mg/mL依那西普制剂使用自动进样器注射到柱上。在10分钟内以0.5mL/min的流速完成分离。在此期间在280nm的波长处监测柱洗脱液。
在下文中称为“方法3”的另一SEC方法中，使用浓度为100mM,pH 6.3氯化钠作为盐代替精氨酸HCl用于流动相。
在再下文中称为“方法1”的另一SEC方法中，按如下进行SEC分析：制备的流动相缓冲液含有50mM的磷酸二氢钠一水合物和150mM的精氨酸。使用1M HCl将pH调节至6.5。所有的分离使用线性连接到Tosoh TSK-Gel G4000SWxl 7.8mm x 30cm(货号8542)的TosohTSK-Gel SWxl 6mm x 4cm保护住(货号8543)进行。为了进行分离，使柱子至室温(23℃)，并且以流动相在0.5mL/min的流速平衡。5微升的50mg/mL依那西普制剂使用自动进样器注射到柱上。在30分钟内以0.5mL/min的流速完成分离。在此期间在280nm的波长处监测柱洗脱液。
积分体积排阻色谱法色谱图。所有积分使用Chromeleon软件(Dionex)进行。积分前，不含依那西普的缓冲剂的SEC色谱图从所有色谱图中减去。所有积分在保留时间为2分钟和8分钟之间进行。使用几个参数限定峰。检测到峰的最小面积设定为0.05mAu*min。峰检测的二维敏感度设定为0.01mAu和75秒。使用手动积分工具添加峰肩。所有检测到的峰分两步手动调节。首先，峰基线(峰的底边界)调整至水平。其次，峰基线的垂直位置调整至色谱图基线。色谱图基线值规定为没有分析物信号的。在这种情况下，不存在分析物的信号被定义为在2分钟保留时间mAu中的吸光度。
疏水作用色谱(HIC)。未稀释的制剂样品在注射入色谱柱前载入HPLC瓶中。样品由HIC根据下表列出的参数分离。
HIC方法说明
用于测试制剂3:6和4:2的 方法描述。开发方法工作最初于7/10/12进行，使用非抽样程序的Manuel Prime(液液界面)。在流通池中观察到明显的混合效果，从而选择了替代的气隙程序(手动填充样品)用于样品评估。
基线(T0)制剂3:6和4:2得到的样品为冻结的并于-20℃下储存直至在周围环境下解冻。一旦解冻，将制剂在冷藏温度下储存(2-8℃)。包括匹配缓冲剂的Tt0取样方法预处理步骤中设定流通池的条件。装载样品前，0.4mL或更多的制剂缓冲剂流经系统。确定此预处理不需要并且对于t3测试时间点未使用。
在5℃和25℃下经历三个月的热压的制剂3:6和4:2的样品使用FlowCAM分析评估。所有样品在解冻当天分析。一旦解冻，将其在冷藏温度下储存(2-8℃)。
仪器&附件
FlowCAM仪器：模式VS1,串号#551带有索尼SX90照相机和C70泵具有1mL注射器(流体成像技术)
FlowCAM软件：DSP固件版本：54；版本3.0.3
流通池：视野(FOV FC80)具有深度80μm和宽度700μm(流体成像技术)
物镜：10X
文中设定(方法&参数设定)
方法：手动填充样品(气隙)
分析样品：0.200mL体积0.170mL分析
流速：0.100ml/min
自动成像速率：22帧频
效率：38.7％
运行时间：1.7分钟
最远至最近
接近：0微米
闭孔器：5反复
图像：5拼贴图像边界填补
颗粒切割：暗域15.00，光域15.00
可接受区：左边15,右边1255,顶部0,底部959
照相机：快门8
获得：57
自动成像速率：22帧频
闪光延迟：100微秒
闪光时间：18.5微秒
直径(ESD)：最小2.00,最大1000.00微米
进样前，安装流通池和物镜并进行最优化视野和聚焦。系统质化包括多次进样空白水和标准颗粒尺寸。进样前进行清洁程序保证颗粒量在可接受水平尤其是样品中低于1000颗粒/mL或多个样品中样品颗粒/mL小于5％。确定计数水平之前，常规清洁过程在清洁剂和最终冲洗之间使用水(Millipore Direct-Q型式1，0.22μm过滤，18.2MΩ)。一旦颗粒计数达到可接受的每mL颗粒水平，开始样品分析前小心移取样品至样品顶部并装载入流中。
每次运行期间和之后立即测定运行质量，使用VisualSpreadSheet中的一系列的诊断工具包括使用各种颗粒特性(例如尺寸、圆度、长度、长宽比)的x-y捕获图(以显现流型动力学)，对直径尺寸的长宽比图(鉴定阻塞颗粒)，运行期间的图像检测和在运行结束的图像分析。
使用被称为当量球径(ESD)的流体成像技术软件测量技术来测定单个颗粒尺寸。ESD为基于36个样品测量值(每5°进行)的颗粒的平均费里特测量值。费里特测量值为接触该颗粒相对侧的两个平行切线之间的垂直距离。
下面的数据表描述了制剂3:5在各种温度下经过三个月的热应力后的特性。
(注释：在表VIII至XIII中，插入的数指的是被测的制剂。标志“C”是对照样品，其存在根据实施例4制备的50mg/ml的依那西普，制剂中含有25mM磷酸盐缓冲剂，1％蔗糖，100mM氯化钠和25mM精氨酸盐酸盐)。
表VIII
一个、两个和三个月的稳定性
SEC数据
单体含量
(制剂3:6和4:2和对照样品)
1Sec方法1；2SEC方法2.3SEC方法3
表IX
一个、两个和三个月的稳定性
SEC数据—“碎片3”
(制剂3:6和4:2和对照样品)
2SEC方法2.3SEC方法3
表X
两个月稳定性
SEC数据—“聚集体”
(制剂3:6和4:2和对照样品)
2SEC方法2
表XI
HIC峰1
一个、两个和三个月
储存
(制剂3:6和4:2和对照样品)
表XII
HIC峰2
一个、两个和三个月
储存
(制剂3:6和4:2和对照样品)
表XIII
HIC峰3
一个、两个和三个月
储存
(制剂3:6和4:2和对照样品)
使用FlowCam流体成像系统评估制剂4:2的显微镜下可见颗粒。这些仪器设计用于测量显微镜下可见颗粒(SVPs)的水平。在最初时测量(表XIV)和然后5℃(表XV)和25℃(表XVI)下三个月后测量。与上面所示的表明三个月的热应力后，制剂4.2中低水平的聚集或错折材料的SEC与HIC数据一致，制剂4.2表现出低水平的显微镜下可见颗粒(每mL具有少于10000个尺寸大于5μm的颗粒L)。
表XIV
对于制剂4.2由FlowCam测量的不同尺寸的颗粒/mL的初始数
(热应力之前)
制剂4:2 对照样品
2-5μm 14000±7200 7400±8000
5-10μm 3100±1400 1900±1800
10-15μm 530±100 290±260
15-25μm 180±90 100±80
25-40μm 30±40 50±40
40-50μm 0±10 10±10
>50μm 10±10 10±20
>2μm 18000±8800 9700±11000
>5μm 3900±1600 2300±2200
表XV
对于制剂4.2，5℃下储存三个月后由FlowCam测量的
不同尺寸的颗粒/mL的数
表XVI
对于制剂4.2，25℃下储存三个月后由FlowCam测量的
不同尺寸的颗粒/mL的数
上面VIII至XVI展现的数据表明根据本发明金属离子稳定的制剂能够达到的储存稳定性与含有精氨酸作为稳定剂的对照样品制剂的相当或更好。
根据此处公开的本发明的说明书和实践，本发明的其他实施方式对于本领域技术人员是显而易见的。说明书和实施例应被认为仅为例示而本发明的真正范围和精神为权利要求所指出。

Claims (2)

1.一种水性药物组合物，其包含50mg/ml依那西普，10mM氯化镁，15mM磷酸钠，75mMNaCl和3％w/v蔗糖，不含精氨酸；其中所述组合物具有6.0至6.6的pH；并且，其中所述组合物带来的长期储存稳定性的特征为：
在T2的SEC分析：单体含量大于90wt％；聚集体含量小于3wt％。
2.权利要求1所述的组合物，其每mL平均具有不超过10,000个尺寸大于5μm的显微镜下可见的颗粒。
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