CN109609498A - 一种动物组织rna的样品保存液及其保存方法 - Google Patents

一种动物组织rna的样品保存液及其保存方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种动物组织RNA的样品保存液，其包含异硫氰酸胍(5mol/L)，乙醇(体积质量比20％)，甘油(体积质量比2％)，以生理盐水作为溶剂。使用本发明的样品保存液可在室温下短期保存RNA类动物组织样品，避免反复冻融造成RNA的损失；有效抑制RNase活性，避免组织内RNA降解。相较于传统的RNA类动物组织低温保存方法，该样品保存液可明显减少RNA的总量与纯度损失，更加高效、简单、经济，保证了后续RNA检测结果的效率和准确性。

Description

一种动物组织RNA的样品保存液及其保存方法
技术领域
本方法涉及分子生物学试剂领域，更具体地，本发明涉及一种动物组织RNA的样品保存液，及其保存方法。
背景技术
核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)是存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA是以DNA的一条链为模板，以碱基互补配对原则，转录而形成的一条单链，主要功能是作为蛋白翻译的模板也具有转运、调控、组成核糖体的作用。由于RNA为细胞的主要成分之一，参与细胞的各种代谢，是基础与临床研究的重要研究对象，样品中RNA的检测也已成为重要的检测指标之一。后续的RNA检测包括定量RT-PCR，测序，生物芯片等。受时间、实验设备条件的限制，多数新鲜样本从生物体取下后，并不能立刻提取检测，而需进行短期保存。RNA保存过程中的质量和完整性会显著影响检测结果的准确性和可靠性。但含RNA的生物样品一旦从组织内分离，RNA就变得非常不稳定，极易被降解。RNA酶是RNA降解的主要原因，对RNA具有非常强的降解能力。RNA酶耐热、耐酸碱，是一类生物活性非常稳定的酶，广泛存在于生物体内以及环境中，难以去除。除RNA酶外，外界各种物理化学因素，如温度、湿度、pH值、微生物侵染等也会造成RNA的降解。因此，RNA的提取和保存过程需要进行严格的处理，必须避免外源性RNA酶的污染，抑制内源性RNA酶的活性，防止RNA发生降解。
目前实验室常用的RNA类新鲜动物组织的保存方法主要采用添加RNA酶抑制剂的DEPC水作为样品保存液，保存于液氮或低温环境中。但此种方法保存效果差，RNA易降解，且保存后的样本要快速进入液氮或低温保存，其室温保存时间过短，反复冻融极易影响RNA浓度及质量，对RNA类样品保存与后续使用有很大的限制性。因此，开发一种能够降低动物组织内RNA降解、可短期室温保存的样品保存液，具有积极意义。
发明内容
本发明的目的是克服现有的保存RNA类生物样本方法的不足，提供了一种动物组织RNA的样品保存液及其保存方法，能够在常温下(4-25℃)保存生物组织离体RNA的完整性，且从保存条件下取出后可直接使用，不影响后续的实验操作，是一种简单、经济、高效的短期动物组织RNA保存方法。
本发明所采用的技术方案:
本发明提供了一种动物组织RNA的样品保存液，所述样品保存液以生理盐水为溶剂，包含异硫氰酸胍、乙醇、甘油。本发明的样品保存液中添加组分及终浓度如下：
5mol/L异硫氰酸胍
20％乙醇(体积质量比)
2％甘油(体积质量比)
生理盐水为溶剂。
本发明还提供了一种保存RNA类动物组织样品的方法，包括将取得的新鲜离体动物组织切割为大小不超过1×1×1cm的体积，立即浸泡于权利要求1或2所述的样品保存液中立即浸泡于所述的样品保存液中，并于室温下储存。
进一步地，所述样品保存液与组织样品的比为每1g样品对应5-10ml样品保存液。
优选地，储存温度不高于25℃，储存时间不大于一周。
本发明的有益效果：
本发明提供的一种动物组织RNA的样品保存液包含异硫氰酸胍、乙醇、甘油，适用于室温短期保存动物组织RNA。该方法的配方简单、操作简便，将离体的新鲜动物组织浸入样品保存液后，于室温下保存可保存一周。无需超低温设备，保存过程处于非冻状态，取用时可避免RNA样品的反复冻融造成的降解。本发明提供的样品保存液可抑制RNase活性，可有效防止动物组织中RNA的降解，确保动物组织中RNA的完整。适用于野外或临床采集的样品、大批量采集的动物组织样品和不能立即冻存样品的RNA稳定与保存。且本发明提供的保存方法在保存过程中不会影响RNA的特性，保证了后续检测结果的效率和准确性。
具体实施方式
本发明提供了一种动物组织RNA的样品保存液及其保存方法，所述样品保存液以生理盐水为溶剂，包含异硫氰酸胍、乙醇、甘油。本发明的样品保存液中添加组分及终浓度如下：
5mol/L异硫氰酸胍
20％乙醇(体积质量比)
2％甘油(体积质量比)
生理盐水为溶剂。
本发明还提供了一种保存RNA类动物组织样品的方法，包括将取得的新鲜离体动物组织切割为大小不超过1×1×1cm的体积，立即浸泡于权利要求1或2所述的样品保存液中(每1g样品对应5-10ml样品保存液)，并于室温下储存(储存温度不高于25℃)，储存时间不大于一周。
下面结合具体实施例对本发明中获取记忆性T淋巴细胞亚群培养基的配置方法进行说明。
实例1 100ml样品保存液的其制备方法如下，：
a.量取78ml生理盐水。
b.分别加入20ml乙醇与2ml甘油，搅拌混匀。
c.称取59g异硫氰酸胍粉末，缓慢加入并搅拌溶液，混匀至全部溶解。密封后高压灭菌，室温备用。
异硫氰酸胍购于北京化学试剂公司，无水乙醇购于天津大茂化学试剂厂，甘油购于山海国药试剂基团，以上试剂均为分析纯。
下面结合具体实施例对本发明提供的动物组织RNA的样品保存液进行评价。
实例2通过比较传统的保存方法与本发明提供的动物组织RNA的样品保存液在不同温度，不同保存时间下对动物组织内RNA的保存效果作评价。
1.实验方案：
a.组织保存：取大鼠肝脏组织，用DEPC水冲洗表面血剂，切割为0.5x0.5cm的小块，按以下四种方法保存。方法一：离体新鲜组织浸入DEPC水中，置于室温(22℃)；方法二：离体新鲜组织浸入DEPC水中，置于-20℃；方法三：离体新鲜组织浸入DEPC水中，置于-80℃；方法四：离体新鲜组织浸入上述样品保存液中，置于室温。分别于第1，第7天取用保存的组织，提取RNA。
b.Trizol提取RNA：将上述4种不同保存方法保存的动物组织分别提取总RNA：1.将组织在液氮中磨碎成粉末状，每20mg的组织加1ml Trizol试剂，样品的体积不超过Trizol试剂体积的10％，并用匀浆器进行匀浆，直至匀浆液呈无颗粒透明状；2.将细胞裂解液转移至离心管中。在室温下放置5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离；3.12,000xg，4℃离心10分钟，小心吸取上清液，移入新的离心管中；4.向以上得到的裂解液中加入氯仿(每1mlTrizol加0.2ml氯仿)。密封离心管，轻柔震荡15s，得粉色浑浊液，无分层现象，室温静置3分钟。12，000xg，4℃离心15分钟；5.离心后样品分层，即无色的上清水相(水相体积约为所用Trizol的60％)、中间白色层及粉红色的下层有机相，小心吸取无色上清水相至干净离心管；6.向上述取得的上清水相加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，室温静置10min，12,000xg，4℃离心10分钟；7.小心去除上清，缓慢沿壁加入75％的乙醇(每1ml Trizol加1ml 75％乙醇)，轻轻混匀。12,000xg，4℃离心10min；8.小心吸进上清，室温干燥沉淀2-5分钟，加入50μl的DEPC水溶解RNA沉淀。
c.样品检测：紫外分光光度计检测样品：分别取不同保存方法的组织RNA样品，测定其在260nm，280nm的吸光度，并根据OD260/OD280的比值估算RNA纯度，同时根据公式计算RNA浓度：
RNA浓度＝OD260×40mg/L×稀释倍数
2.实验结果：
不同保存方法下RNA质量分析
由上述实验结果可知，所有的小鼠肝脏内RNA在不同温度，不同保存条件下，短期保存后提取RNA测得的OD260/OD280比值均介于1.8～2.0，表明总RNA的纯度较高，没有糖、蛋白质等污染，可用于后续的RNA检测实验。通过计算可知，相同保存温度与保存时间下，用本发明提供的动物组织RNA的样品保存液在室温时，其提取的RNA量明显高于用DEPC水保存的样品提取的RNA量，且纯度更高。同样地，本发明提供的保存液在低温(4℃)的保存下其提取的RNA量略高于在室温(22℃)保存下的样品提取的RNA量，且纯度更高。
上述实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照实施例的最优条件对本发明作了详细说明,所属本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行修改、补充或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围,均应属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种动物组织RNA的样品保存液，其特征在于，所述样品保存液以生理盐水为溶剂，包含异硫氰酸胍、乙醇、甘油。
2.如权利要求1所述的配方，其特征在于，其组分为5mol/L异硫氰酸胍，体积质量比20％的乙醇，体积质量比2％的甘油。
3.一种保存动物组织RNA的方法，其特征在于，包括将取得的新鲜离体动物组织切割为大小不超过1×1×1cm的体积，立即浸泡于权利要求1或2所述的样品保存液中。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述样品保存液与组织样品的比为每1g样品对应5-10ml样品保存液。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，储存温度不高于25℃，储存时间不大于一周。
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