CN114698628A - 一种组织库标本冷冻保存液及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种组织库标本冷冻保存液及其应用，属于生物医学技术领域。本发明通过不同盐溶液的混合，模拟人体正常细胞微环境，模拟细胞外液，保持正常细胞渗透压，避免组织细胞水肿或脱水，给予生物大分子最基本的生存空间；本发明通过加入硫氰酸胍、硫氰酸铵，降低RNAse(RNA水解酶)活性，改善RNA链生存状态，保护相较于蛋白质、DNA而言更易降解的RNA；本发明通过加入甘油成分，维持组织表面张力，保持标本光泽度，防止腐败，提高折光率，保证保存液的流动性。
Description
技术领域
本发明涉及一种组织库标本冷冻保存液及其应用，属于生物医学技术领域。
背景技术
在医院、医学院、科研单位等为了医治、教学和科研任务，常建立有人体组织库，包括器官及多种人体组织细胞库。组织库以样本为中心，将患者信息、随访数据等宏观数据与DNA、RNA及蛋白质等微观数据进行信息化整合，为未来科学研究提供高水平的样本支撑。目前近80％医院的生物样本由相对应的科室及病理科保存与应用，以-80℃超低温冰箱、-196℃液氮罐为主要保存容器，较多以自来水为标本的保存液，参与标本采集、运输、储存、实验的过程。冷冻标本DNA和RNA通常具有高分子量且没有交联，适用于全基因组扩增、全基因组测序和cDNA微阵列分析等多种用途，也可以保持完整的酶活性，便于蛋白质组学分析。
保存完好的冷冻生物样本是评估基因组、转录组和蛋白质组的理想选择。但在实际操作中，由于人体组织自临床采集至前期处理完毕存在时间差，会造成一定程度的组织缺血和降解；继发于血液和氧气供应损失，基因表达和蛋白质磷酸化模式也会受到人为的影响；且标本经历多次超低温-常温处理反复冻融的循环，不可避免地导致会对要分析的大分子和细胞造成损伤。标本存在自融细胞，RNA完整性被破坏，干扰下游功能性免疫学分析，为信息库的数据搭建造成一定程度的阻碍和不便。目前现有机构的组织库大多通过标本的前期处理及冷冻、冷藏等手段来保持标本的新鲜程度，防止标本的降解。标本保存通常分为生物保存及低温保存。生物保存是指标本的常规方法包括化学固定(如10％福尔马林，乙醇)或者常温下借助基质进行干燥保存。组织的冷冻保存有两种不同的低温保存方法：(1)冷冻保存(已知的速冻或超速冻)或者程序降温(慢速可程序化)；(2)非结晶状态的类似玻璃状的玻璃化保存。通常具体流程如下：标本置于含有湿冷(2-8℃)的清洁或无菌容器中，以便从手术室转移到病理科或储存库。无法立即固定的标本真空保存，自来水浸泡，根据标本部位与后续处理的需求进行低温或超低温分块储存。在此后需求的基础节点，取出融解，进行下一部科研需求所需的步骤。
组织库以样本为中心，将患者信息、随访数据等宏观数据与DNA、RNA及蛋白质等微观数据进行信息化整合，同时应用数字化手段对样本的病理及影像图像等进行整理，生物样本库搭建信息化及数字化共享平台，为未来科学研究提供高水平的样本支撑。因此，组织库数据的搭建需要力求准确性与严谨性。组织库生物标本数据获取的准确性、完备性基于标本中相关标志物的完整性、可检出性及低降解性，有赖于生物大分子中多种蛋白质、遗传物质DNA、RNA的稳定性，这是数据库建立的关键与核心，也是依据数据库进行分析、监测、健康筛查和诊断的基石。但在实际操作中，反复冻融冷冻状态和反复冷却复温玻璃化状态的样本，将会对要分析的大分子和细胞造成损伤，反复冻融的过程将会导致热力学自由能降低以及蛋白质冰晶相互作用，这样反而加速了生物标本降解；生物标本冷藏运输所使用的冷链价格昂贵，而且容易出故障，需承担一定的风险。这样，会面临生物下游分子及各级标志物数量与活体相较不准确、模拟人体存在较大偏倚，进行科学研究则会造成一定程度的不可信性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种组织库标本冷冻保存液及其应用，本发明的组织库标本冷冻保存液目的在于延长新鲜人体标本采集时间，保持基因组、转录组、蛋白组的完整性，以解决现组织库标本保存所存在的问题。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种组织库标本冷冻保存液，包括以下组分：钠离子138～142mM/L，钾离子24～28mM/L，氯离子101～105mM/L，磷酸氢根离子29～31mM/L，磷酸二氢根离子4.8～5.2mM/L，右旋糖苷18.5～20.5g/L，葡萄糖10g/L，硫氰酸胍0.2M/L，硫氰酸铵0.4M/L，甘油0.1L/L。目前现有的冷冻保存(已知的速冻或超速冻)或者程序降温(慢速可程序化)及非结晶状态的类似玻璃状的玻璃化保存都依赖于自来水为介质，缺乏活体维持稳态的细胞外液，对RNAse(RNA水解酶)活性未进行化学干预，且未通过技术手段反之腐败，标本色泽晦暗，缺少折光度。本申请发明人经过大量的实验发现，在冷冻保存液中添加硫氰酸胍、硫氰酸铵成分，能够使具有高度不稳定性的RNA维持稳定，降低其裂解程度。本发明通过不同盐溶液的混合，模拟人体正常细胞微环境，模拟细胞外液，保持正常细胞渗透压，避免组织细胞水肿或脱水，给予生物大分子最基本的生存空间。甘油成分的加入，可维持组织表面张力，保持标本光泽度，防止腐败，提高折光率，保证保存液的流动性。
作为本发明所述组织库标本冷冻保存液的优选实施方式，所述组织库标本冷冻保存液包括以下组分：钠离子141mM/L，钾离子26mM/L，氯离子103mM/L，磷酸氢根离子30mM/L，磷酸二氢根离子5mM/L，右旋糖苷20g/L，葡萄糖10g/L，硫氰酸胍0.2M/L，硫氰酸铵0.4M/L，甘油0.1L/L。本申请发明人经过大量的实验发现，当采用上述浓度的组分配制冷冻保存液时，标本能保持新鲜，色泽光亮，标本细胞形态正常。
作为本发明所述组织库标本冷冻保存液的优选实施方式，所述组织库标本冷冻保存液的溶剂为去离子水。
作为本发明所述组织库标本冷冻保存液的优选实施方式，所述钠离子来自氯化钠，磷酸氢二钠和磷酸二氢钠；所述钾离子来自氯化钾；所述氯离子来自氯化钠和氯化钾；所述磷酸氢根离子来自磷酸氢二钠；所述磷酸二氢根离子来自磷酸二氢钠。
作为本发明所述组织库标本冷冻保存液的优选实施方式，所述组织库标本冷冻保存液的PH值为7.35～7.45。
本发明还提供一种组织库标本冷冻保存方法，采用上述组织库标本冷冻保存液对组织库标本进行保存。
作为本发明所述组织库标本冷冻保存方法的优选实施方式，所述方法7.包括以下步骤：
(1)配制组织库标本冷冻保存液，调节PH并置于4℃冰箱内预冷4h；
(2)将采集的标本核对信息后，立即浸没于步骤(1)的冷冻保存液中；
(3)将步骤(2)浸没标本的冷冻保存液置于干冰或冰水混合物上进行取材；
(4)将分装的标本置于螺旋盖塑料管或中小塑料袋中并加入步骤(1)的冷冻保存液浸没标本，储存于-80℃超低温冰箱或-196℃液氮罐中。
本发明还提供所述组织库标本冷冻保存液在冷冻保存生物标本中的应用。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述生物标本包括器官，组织。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供了一种组织库标本冷冻保存液及其应用，本发明通过不同盐溶液的混合，模拟人体正常细胞微环境，模拟细胞外液，保持正常细胞渗透压，避免组织细胞水肿或脱水，给予生物大分子最基本的生存空间；本发明通过加入硫氰酸胍、硫氰酸铵，降低RNAse(RNA水解酶)活性，改善RNA链生存状态，保护相较于蛋白质、DNA而言更易降解的RNA；本发明通过加入甘油成分，维持组织表面张力，保持标本光泽度，防止腐败，提高折光率，保证保存液的流动性。
附图说明
图1为采用自来水冷冻1天的直肠癌癌旁标本高倍镜观察图。
图2为采用自来水冷冻1天的直肠癌标本的高倍镜观察图。
图3为采用实施例1的组织库标本冷冻保存液冷冻1天的直肠癌癌旁标本高倍镜观察图。
图4为采用实施例1的组织库标本冷冻保存液冷冻1天的直肠癌标本的高倍镜观察图。
图5为采用自来水冷冻1天的胃癌癌旁标本高倍镜观察图。
图6为采用自来水冷冻1天的胃癌标本高倍镜观察图。
图7为采用实施例1的组织库标本冷冻保存液冷冻1天的胃癌癌旁标本高倍镜观察图。
图8为采用实施例1的组织库标本冷冻保存液冷冻1天的胃癌标本的高倍镜观察图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明实施例的一种组织库标本冷冻保存液，包括以下组分：氯化钠17.5g，氯化钾19.4g，磷酸氢二钠42.6g，磷酸二氢钠6g，右旋糖苷200g，葡萄糖100g，硫氰酸胍236.3g，硫氰酸铵304.5g，甘油1L。
上述组织库标本冷冻保存液的制备方法：
按上述质量称取氯化钠，氯化钾，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，右旋糖苷，葡萄糖，硫氰酸胍，硫氰酸铵，甘油，并置于容量瓶中，加入去离子水定容至10L，充分溶解，并调节PH至7.4，得所述组织库标本冷冻保存液。
实施例2
本实施例分别使用实施例1的组织库标本冷冻保存液和自来水对直肠癌标本进行冷冻保存。
具体实验方法：分别将实施例1的组织库标本冷冻保存液和自来水放置4℃冰箱内预冷4h，取相同部分的直肠癌标本分别浸泡于实施例1的组织库标本冷冻保存液和自来水中，并于-80℃超低温冰箱冷冻1天。观察冷冻后的标本的色泽，并于高倍镜下观察标本的细胞状态。
实验结果如图1～图4所示。观察可知，采用自来水浸泡的直肠癌标本色泽晦暗；由图1和图2可知，采用自来水浸泡的直肠癌标本的癌旁标本及癌组织高倍镜下自融细胞增多，凋亡碎片增加。采用实施例1的组织库标本冷冻保存液浸泡的直肠癌标本比较新鲜，色泽光亮；由图3和图4可知，采用实施例1的组织库标本冷冻保存液浸泡的直肠癌标本在高倍镜下细胞形态正常。
实施例3
本实施例分别使用实施例1的组织库标本冷冻保存液和自来水对胃癌标本进行冷冻保存。
具体实验方法：分别将实施例1的组织库标本冷冻保存液和自来水放置4℃冰箱内预冷4h，取相同部分的胃癌标本分别浸泡于实施例1的组织库标本冷冻保存液和自来水中，并于-80℃超低温冰箱冷冻1天。观察冷冻后的标本的色泽，并于高倍镜下观察标本的细胞状态。
实验结果如图5～图8所示。观察可知，采用自来水浸泡的胃癌标本色泽晦暗；由图5和图6可知，采用自来水浸泡的胃癌标本的癌旁标本及癌组织高倍镜下自融细胞增多，凋亡碎片增加。采用实施例1的组织库标本冷冻保存液浸泡的胃癌标本比较新鲜，色泽光亮；由图7和图8可知，采用实施例1的组织库标本冷冻保存液浸泡的胃癌标本在高倍镜下细胞形态正常。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (9)
1.一种组织库标本冷冻保存液，其特征在于，包括以下组分：钠离子138～142mM/L，钾离子24～28mM/L，氯离子101～105mM/L，磷酸氢根离子29～31mM/L，磷酸二氢根离子4.8～5.2mM/L，右旋糖苷18.5～20.5g/L，葡萄糖10g/L，硫氰酸胍0.2M/L，硫氰酸铵0.4M/L，甘油0.1L/L。
2.如权利要求1所述组织库标本冷冻保存液，其特征在于，包括以下组分：钠离子141mM/L，钾离子26mM/L，氯离子103mM/L，磷酸氢根离子30mM/L，磷酸二氢根离子5mM/L，右旋糖苷20g/L，葡萄糖10g/L，硫氰酸胍0.2M/L，硫氰酸铵0.4M/L，甘油0.1L/L。
3.如权利要求1所述组织库标本冷冻保存液，其特征在于，所述组织库标本冷冻保存液的溶剂为去离子水。
4.如权利要求1～2任一项所述组织库标本冷冻保存液，其特征在于，所述钠离子来自氯化钠，磷酸氢二钠和磷酸二氢钠；所述钾离子来自氯化钾；所述氯离子来自氯化钠和氯化钾；所述磷酸氢根离子来自磷酸氢二钠；所述磷酸二氢根离子来自磷酸二氢钠。
5.如权利要求1～2任一项所述组织库标本冷冻保存液，其特征在于，所述组织库标本冷冻保存液的PH值为7.35～7.45。
6.一种组织库标本冷冻保存方法，其特征在于，采用权利要求1～2任一项所述组织库标本冷冻保存液对组织库标本进行保存。
7.如权利要求6所述组织库标本冷冻保存方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)配制组织库标本冷冻保存液，调节PH并置于4℃冰箱内预冷4h；
(2)将采集的标本核对信息后，立即浸没于步骤(1)的冷冻保存液中；
(3)将步骤(2)浸没标本的冷冻保存液置于干冰或冰水混合物上进行取材；
(4)将分装的标本置于螺旋盖塑料管或中小塑料袋中并加入步骤(1)的冷冻保存液浸没标本，储存于-80℃超低温冰箱或-196℃液氮罐中。
8.如权利要求1～2任一项所述组织库标本冷冻保存液在冷冻保存生物标本中的应用。
9.如权利要求8所述应用，其特征在于，所述生物标本包括器官或组织。
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