CN104430303A

CN104430303A - 人外周血干细胞冻存液的配制及使用方法

Info

Publication number: CN104430303A
Application number: CN201410820814.XA
Authority: CN
Inventors: 孙伟红
Original assignee: 孙伟红
Current assignee: Qingdao Central Hospital
Priority date: 2014-12-26
Filing date: 2014-12-26
Publication date: 2015-03-25
Anticipated expiration: 2034-12-26
Also published as: CN104430303B

Abstract

本发明涉及一种人外周血干细胞冻存液的配制及使用方法，主要特征在于由羟乙基淀粉代血浆、复发氨基酸注射液（18AA-IV）、二甲基亚砜和人血清白蛋白组成干细胞冻存液，它们的终体积百分含量分别是48.2%、2%、4.8%、20%。该冻存液具有高复苏活率（>99%）和可直接静脉回输的特点。同时本发明还提供了上述冻存液的制备和使用方法。具体是无菌环境下，冻存液各组分按先后顺序预混好后，加入干细胞悬液并混匀，之后装入冻存袋冷冻保存。加有冻存液的干细胞可直接放入-80℃低温冰箱保存，无需使用程序降温仪，操作简便、使用安全。

Description

人外周血干细胞冻存液的配制及使用方法

技术领域

本发明属于干细胞生物工程领域。具体涉及一种人外周血干细胞冻存液的配制及使用方法。

背景技术

自体外周血造血干细胞移植现已成为治疗恶性血液病、恶性淋巴瘤、实体瘤等疾病根治性方法之一。自体外周血干细胞移植的方法是先用造血干细胞动员剂将造血干细胞动员入外周血中，然后用血细胞分离机分离采集外周血的单个核细胞组分。由于是自体外周血干细胞移植, 患者在动员和分离采集自体外周血干细胞后,需经过1周甚至更长时间的放、化疗等预处理。在这段时间内, 为了保持造血干细胞的活性及造血和免疫重建功能, 采集的细胞必须冷冻保存。所以干细胞的冷冻保存技术是移植成功的关键环节之一。申请号201210552263.4，公开了一种造血干细胞冻存的方法及保护剂，该专利造血干细胞保护剂成分及比例是9-10％DMSO（二甲基亚砜）+5%1640（1640培养基）+5-6%ACD I（血液保存液 I）, 冻存过程是直接放入-80℃低温冰箱中保存。由该专利申请文件的实施例表一可以看出，用该专利方法冻存的干细胞，在不同的冻存时间点（月）复苏，细胞活率与用经典冻存方法(10% DMSO+6％HES（羟乙基淀粉）+4％HAS（人血白蛋白），程序降温、液氮保存)冻存的干细胞相比无明显差异。尽管该冻存技术简单方便，冻存效果也好，但在临床应用上也存在一些问题：1. 细胞活率维持时间短。两种冻存方法的细胞活率由第1个月的92%下降到第12个月的84%左右。特别是用该技术冻存的细胞，细胞活率由第1个月的92.6%下降到第6个月的86.2%，平均每个月下降1%左右；2.因高浓度DMSO对人体有一定的毒副作用，复苏后直接移植进患者体内易使患者产生恶心、呕吐、腹部痉挛及心率减慢、血压升高等症状，所以9-10% 的DMSO浓度不易直接临床输注；3. 因1640培养基其成分与人体环境相差较远，未被批准临床使用，不能直接临床输注。所以由此技术冻存的干细胞，复苏后需经去冻存液处理才可临床输注，这给临床应用带来不便。而经典的冻存方法因使用程序降温仪降温冻存，使得操作繁琐、成本增高也不易在临床大规模使用。

发明内容

为了有助于理解本发明，除非有另外说明，本文中，冻存体系是指含有冻存液和干细胞悬液的体系。

为了克服现有技术中造血干细胞冻存液难以兼顾长时间维持细胞活率和临床直接输注的不足。本发明的目的之一是提供一种既能减少保护剂的使用浓度又能提高复苏后细胞活率而且还可直接临床输注的人外周血干细胞冻存液。该冻存液是由羟乙基淀粉代血浆、复方氨基酸注射液（18AA-IV）、DMSO和人血清白蛋白配制而成，四者在冻存体系中的终体积百分含量分别是48.2%、2%、4.8%、20%。

本发明的另一目的是提供一种上述人外周血干细胞冻存液的配制及使用方法，包括如下步骤：1. 无菌抽取20ml复方氨基酸注射液（18AA－IV）和50ml DMSO，两者充分混匀；2. 把步骤1的混合液注入500ml羟乙基淀粉代血浆中，充分混匀。三者混合液占冻存体系终体积的55%；3. 根据采集的干细胞体积（采集的干细胞悬液占冻存体系终体积的25%）算出冻存体系的总体积，再根据步骤2混合液的终体积百分含量55%算出所需的混合液体积数，无菌抽取并注入无菌容器（如冻存袋）；4. 根据人血清白蛋白终体积百分含量20%，算出所需人血清白蛋白的体积数，无菌抽取并注入步骤3中的无菌容器，充分混匀; 5. 新鲜采集的人外周血干细胞悬液，无菌抽取并注入步骤4中的无菌容器，充分混匀; 6. 抽取步骤5的干细胞和冻存液的混合液，分装入干细胞冻存袋，排净空气，封口并在冻存袋的进液管处留取多段细胞。最后硬纸板固定冻存袋使之平整，放入-80℃冰箱内冻存。

本技术方案的主要特征在于由羟乙基淀粉代血浆、复发氨基酸注射液（18AA-IV）、DMSO和人血清白蛋白组成干细胞冻存液，各组分终体积百分含量分别是48.2%、2%、4.8%、20%。干细胞悬液的终体积含量为25%。干细胞冻存液中的成分除了DMSO外，其余都是临床常见注射用成分，使用安全、获取方便。使用本发明中的冻存液，无需使用程序降温仪，可直接把细胞放入-80℃低温冰箱保存。

本发明的有益效果：1.本发明提供了一种新的外周血干细胞冻存液的配制及使用方法，可有效保存干细胞，在冻存的不同时间点（1、3、6个月）复苏，干细胞台盼蓝拒染率始终保持在99%以上；2.干细胞复苏后可直接临床输注；3.操作简便、使用安全。

具体实施方式

以下结合具体实施方式进一步说明本发明，而非限制本发明。

张XX，非霍奇金淋巴瘤。血细胞分离机采集外周血干细胞悬液100ml，白细胞浓度为245.43×10⁹/L。采集袋置于超净台。根据干细胞悬液占冻存体系终体积的25%，算出冻存终体积为100ml÷25%=400ml；根据复方氨基酸注射液（18AA-IV）、 DMSO和羟乙基淀粉代血浆三者混合液占冻存体系终体积的55%，算出三者混合液体积为400ml×55%=220ml；根据人血清白蛋白终体积百分含量20%，算出所需人血清白蛋白的体积为400 ml×20%=80ml。无菌抽取20ml复方氨基酸注射液（18AA-IV）和50ml DMSO在无菌瓶中充分混匀，接着把混合液全部注入500ml 羟乙基淀粉代血浆中充分混匀。抽取上述三者混合液220ml注入医用干细胞冻存袋中，接着注入80ml人血白蛋白充分混匀。然后把采集袋中的干细胞悬液全部抽取注入上述冻存袋中充分混匀。最后把干细胞混合液，分装入干细胞冻存袋，100ml/袋，共4袋。排净空气，封口并在冻存袋的进液管处留取4段细胞，标签注明采集及冻存时间、患者及冻存者姓名、冻存量、冻存细胞浓度。硬纸板固定冻存袋使之平整，放入-80℃冰箱内冻存。

我们在冻存前及冻存后的第1、3、6个月分别检测干细胞台盼蓝拒染率及每10⁵个细胞中粒细胞巨噬细胞集落生成单位（CFU-GM）的集落数，检测结果如表1、2所示。表1为患者张XX干细胞冻存前后台盼蓝拒染率及CFU-GM集落数。表2为18例患者干细胞冻存前后台盼蓝拒染率及CFU-GM集落数的统计结果。

表1 张XX干细胞冻存前后细胞台盼蓝拒染率及CFU-GM集落数

表2 18例干细胞冻存前后细胞台盼蓝拒染率及CFU-GM集落数

结果表明，本技术方案可有效保存外周血干细胞，在保存的第1、3、6个月时复苏的干细胞，其台盼蓝拒染率、CFU-GM集落数与冻存前相比无统计学差异（P>0.05），特别是台盼蓝拒染率始终保持在99%以上。

Claims

1.一种人外周血干细胞冻存液，其特征在于是由羟乙基淀粉代血浆、复方氨基酸注射液（18AA-IV）、二甲基亚砜和人血清白蛋白组成，各组分在冻存体系中的终体积百分含量分别是48.2%、2%、4.8%、20%。

2.一种如权利要求1所述的人外周血干细胞冻存液的制备方法，其特征在于先把20ml复方氨基酸注射液（18AA-IV）和50ml二甲基亚砜预混好，接着把两者混合液与500ml羟乙基淀粉代血浆预混好，之后根据终体积百分含量抽取三者混合液加入无菌容器，最后加入人血清白蛋白预混好。

3. —种如权利要求1所述的人外周血干细胞冻存液的使用方法，其特征在于采集的人外周血干细胞悬液直接与冻存液混合，其中干细胞悬液在冻存体系中的终体积百分含量为25％。

4.根据权利3所述的冻存液使用方法，干细胞悬液与冻存液充分混匀后分装入干细胞冻存袋，排净空气并用硬纸板固定冻存袋使之平整，放入-80℃冰箱内冻存。

5.—种如权利要求1所述的人外周血干细胞冻存液，其所冻存的干细胞复苏后可直接临床输注。