CN104490727A - 一种干细胞与玻尿酸的组合物与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及美容医学技术领域，尤其涉及一种医用组合物与应用。本发明提供医用组合物中包括间充质干细胞和玻尿酸。该组合物不但能够在注射后立即生效，且持续时间长。实验证明：30天后，注射了本发明提供的组合物的裸鼠体内制剂体积和湿重显著(P<0.05)高于玻尿酸组和干细胞组。表明本发明提供的组合物，在注射初期即能达到立即生效的作用，而在注射一段时间后，仍能保持良好的效果。能够同时兼具起效快、持续时间长的特点。
Description
技术领域
本发明涉及美容医学技术领域，尤其涉及一种医用组合物与应用。
背景技术
玻尿酸是由双糖单位(葡萄醛酸-N-乙硫氨基葡糖)组成的直链高分子多醣，是一种组织中自然存在的物质。自然界中广泛地存在于脊椎动物的结缔组织、粘液组织、眼球之晶状体及某些细菌的夹膜中，在组织结构上整体的保养或是细胞之间的运送都具有很重要的功能。特别是在人类皮肤的真皮层中扮演了基质的重要角色，负责保留皮肤的水分。但是，随着年龄的增加，玻尿酸在体内的存量减少，皮肤就会出现皱纹、松弛、缺乏弹性的问题。利用玻尿酸填补受损的胶原纤维，可将肌肤填满撑起，皮肤进而有往上拉提的作用，从而使皮肤滋润光滑、柔软而富有弹性，让肌龄年轻，延缓衰老。天然玻尿酸与人体内玻尿酸的结构一致，可被人体完全分解不会残留体内对人体造成毒副作用，安全性高，因此，玻尿酸作为整形、除皱材料目前被广泛的应用于美容行业中。但是，玻尿酸很容易被机体吸收，注射玻尿酸所维持的效果约在6～9个月之间，为了能够长期维持塑形的效果需要多次注射，增大了感染或排异反应出现的风险，且造成了更多的痛苦。
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。充质干细胞能够产生胶原蛋白，胶原蛋白的主要功能是提供具有高抗张强度的纤维，增强肌肤锁水的作用，改善肌肤的内质结构，提高肌肤弹性与紧致性，并可以达到局部生长塑形。因此，利用间充质干细胞分化成为自身的组织，永久的存在，可起到长期塑形作用。但是，间充质干细胞作为美容整形材料，需要一段在体内分化的时间，不能如玻尿酸般起到立竿见影的效果。
因此，进一步研究能够快速起效且长期塑性的美容整形材料十分必要。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种医用组合物与应用，本发明提供的组合物作为美容、整形或除皱的制剂能够快速起效且能够达到长期塑性的效果。
本发明提供给的医用组合物包括：间充质干细胞和玻尿酸。
在一些实施例中，玻尿酸的体积分数为80％～90％。
在另一些实施例中，玻尿酸的体积分数为85％。
在一些实施例中，间充质干细胞的浓度为1.0×104个/mL～1.0×107个/mL。
在另一些实施例中，间充质干细胞的浓度为1.0×105个/mL。
在另一些实施例中，间充质干细胞的浓度为1.0×106个/mL。
脂肪干细胞具有很好的自我复制能力，并且可以分化成脂肪细胞，成为皮肤组织的一部分，另外脂肪干细胞分泌出很多细胞因子，有利于皮肤保持良好的弹性，但是，脂肪干细胞在体内的分化需要时间，因此，注射后需一段时间才能起效。玻尿酸作为注射用的组织填充物，用于改善面部皱纹，面部微整形，以及矫正外伤或青春痘留下真皮层的疤痕，注射后立刻起效，但在人体内可以被降解、吸收，持续时间短，一般只能维持3个月～4个月。而本发明提供的组合物注射后可以同时具备玻尿酸的快速起效和干细胞持续时间长的优点。
在一些实施例中，间充质干细胞为脂肪干细胞。
本发明提供的组合物中的间充质干细胞可为自制也可为市场购得，本发明对此不作限定，但其实施皆在本发明的保护范围之内。
在一些实施例中，脂肪干细胞的制备方法为：将脂肪组织经Ⅰ型胶原酶消化后，培养至80％融合，经胰酶消化后继代培养，获得脂肪干细胞。
在另一些实施例中，Ⅰ型胶原酶占所述脂肪组织的质量分数为0.25％。
在另一些实施例中，培养的培养基为含有15％FBS的DMEM-F12培养基；培养的接种浓度为1.0×105个/mL；培养的条件为37℃、5％CO2、饱和湿度。
在另一些实施例中，胰酶的量为5mg。
在另一些实施例中，继代培养的培养基为含有15％FBS的DMEM-F12培养基；培养的接种浓度为5.0×104个/mL；培养的条件为37℃、5％CO2、饱和湿度。
具体的，脂肪干细胞的制备方法包括以下步骤：
步骤1：将脂肪组织与质量分数为0.5％的Ⅰ型胶原酶混合，混合的体积比为1:1，37℃、100rpm消化1h后，加入FBS终止消化；
步骤2：1500rpm离心5min，弃除脂肪组织和含有I型胶原酶的FBS，以PBS清洗后，以培养基重悬后培养至80％融合；重悬的浓度为1.0×105个/mL，培养的条件为37℃、5％CO2、饱和湿度，24h后更新培养基后，每3天更新培养基；
步骤3：弃除培养基，加入质量分数为0.25％的胰酶，37℃、5％CO2消化2min，以培养基终止消化后，弃除培养基；
步骤4：以密度为5×104个/mL接种于培养基，继代培养；
培养基为含有FBS的DMEM-F12培养基，FBS的体积分数为15％。
本发明提供的干细胞与玻尿酸的组合物在制备美容、除皱、整形制剂中的应用。
本发明提供的医用组合物中包括间充质干细胞和玻尿酸。本发明提供的组合物兼具干细胞和玻尿酸在美容、除皱、整形中的优点，不但能够在注射后立即生效，且持续时间长。经实验证实，3天时，注射了本发明提供的组合物的裸鼠和注射了玻尿酸的裸鼠体内制剂体积和重量相差不大，但注射了脂肪干细胞的裸鼠未见新组织产生；10天时，注射玻尿酸的裸鼠体内制剂体积和湿重皆出现降低现象，注射了本发明提供的组合物的裸鼠体内制剂的体积和湿重略有增加，而注射了脂肪干细胞的裸鼠仍未见新组织产生；30天后，注射了本发明提供的组合物的裸鼠体内制剂体积和湿重显著(P<0.05)高于玻尿酸组和干细胞组。表明本发明提供的组合物，在注射初期即能达到立即生效的作用，而在注射一段时间后，仍能保持良好的效果。能够同时兼具起效快、持续时间长的特点。
附图说明
图1示实施例1制备的脂肪干细胞表面抗原检测结果；其中，图1-a示抗原CD44的检测结果；图1-a示抗原CD44的检测结果；图1-b示抗原CD73的检测结果；图1-c示抗原CD90的检测结果；图1-d示抗原CD105的检测结果；图1-e示抗原CD34的检测结果；图1-f示抗原CD45的检测结果；图1-g示抗原HLA-DR的检测结果；
图2示脂肪干细胞成脂诱导21天后分化结果；其中，图2-a示成脂诱导前脂肪干细胞油红O染色结果(10×)；图2-b示成脂诱导后脂肪干细胞油红O染色结果(10×)；
图3示脂肪干细胞成骨诱导28天后分化结果；其中，图3-a示成脂诱导前脂肪干细胞茜素红染色结果(10×)；图3-b示成脂诱导后脂肪干细胞茜素红染色结果(10×)。
具体实施方式
本发明提供了一种医用组合物与应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1脂肪干细胞的制备
将人体脂肪组织分装至50mL离心管中，每管20mL。
每管中加入等体积的0.5％Ⅰ型胶原酶(终浓度为0.25％)，充分混匀，封口，转移至恒温空气摇床中，37℃、100R消化1h。
每管加入4mL的FBS，终止消化，混匀。
离心，1500rpm/min离心5min。
离心后，取2mL的上层血液(中间层)，分装至两个EP管中，分别留样送检。
弃去上两层液体，每管加入40mL PBS重悬，重悬细胞。
离心，1500rpm/min离心5min，弃去上清，获得脂肪干细胞。加入含15％FBS的DMEM-F12培养基重悬细胞，以1×105个/mL接种。
轻轻前后摇动培养皿，使细胞悬液均匀分布于瓶底；将培养瓶做好标记并转移到37℃、5％CO2、饱和湿度为95％的培养箱中培养。
24h后首次换液，弃去悬浮细胞.随后每3天换一次液。
在倒置显微镜下观察脂肪干细胞，若细胞融合达80％，则对脂肪干细胞进行传代处理，具体为：
弃去培养基，加入PBS溶液5mL，轻轻前后摇动培养瓶，弃去PBS溶液(该步骤重复2次)。
每平皿加入2mL 0.25％胰酶,把平皿移入CO2培养箱内消化2min，消化后取出平皿放置于显微镜下观察细胞形态。
80％脂肪干细胞皱缩变圆、漂浮脱落，往平皿中加入5mL 15％FBS的DMEM-F12，终止消化。吸取10uL细胞悬液进行细胞计数，计算出细胞总数。
1500rpm离心5min，取2mL上清分装至两EP管中，每管1mL。
以细胞密度为5×104个/mL，计算出所需的15％FBS的DMEM-F12培养基的体积重悬细胞，并接种至10cm平皿，10mL/平皿。轻轻前后摇动平皿，使细胞悬液均匀分布于瓶底，37℃、5％CO2、饱和湿度为95％的培养箱中培养。
实施例2脂肪干细胞的质量鉴定
取实施例1制备的脂肪干细胞，分别进行表面抗原检测、成脂诱导分化、成骨诱导分化，鉴定实施例1提供的脂肪干细胞的质量。
1、脂肪干细胞的表面抗原检测
检测采用流式细胞仪，分别检测实施例1提供的脂肪干细胞中CD44、CD73、CD90、CD105、CD34、CD45及HLA-DR表达，具体为:
取不同代数的脂肪干细胞，吸去培养基，0.25％胰酶常规消化,制成1×105的细胞悬液，分别取抗人CD44、CD73、CD90、CD105、CD34、CD45及HLA-DR的单克隆抗体各5μL,加入细胞悬液500μL，室温下避光孵育20min，同时设立空白同型对照，1500r/min离心5min，弃上清，用含10％FBS的PBS洗涤2遍，用500μL PBS重悬后上机检测。检测结果如图1所示。结果显示：实施例1制备的干细胞中，CD44、CD73、CD90、CD105的表达量＞99％，而CD34、CD45及HLA-DR的表达量小于1％。证明本发明实施例1制备的脂肪干细胞纯度良好。
2、脂肪干细胞成脂诱导分化
取P3代脂肪干细胞，消化，以106个细胞/孔密度接种于6孔培养板中，24h后，细胞贴壁并伸展，更换成脂分化培养基(含有DMEM-F12培养基、体积分数为10％胎牛血清、10mg/L胰岛素、1μmol/L地塞米松、100μmol/L吲哚美辛、500μmol/L IBMX)，含有10％胎牛血清的完全培养基组作为阴性对照。每3d更换1次培养基，定向分化诱导第21d后即可以使用油红O染色定性观察体外诱导分化的结果。结果如图2所示。结果显示，经21天的诱导分化，干细胞成功的分化出了脂肪粒，表明实施例1制备的脂肪干细胞的活性良好。
3、脂肪干细胞成骨诱导分化
取P3代脂肪干细胞，消化，以106个细胞/孔密度接种于6孔培养板中，24h后，细胞贴壁并仲展，更换成骨诱导培养基(含有DMEM-F12、体积分数为10％FBS、0.1μmol/L地塞米松、50μmol/L抗坏血酸、10mmol/Lβ-甘油磷酸)，含有10％胎牛血清的完全培养基组作为阴性对照。每3d更换1次培养基，定向分化诱导。第28d后即可以使用茜素红染色定性观察体外诱导分化的结果。结果如图3所示。结果显示，经28天的诱导分化，干细胞成功的分化出现了钙结节。表明实施例1制备的脂肪干细胞的活性良好。
实施例3本发明提供的组合物功能鉴定
一、本发明提供的组合物的制备：取实施例1制得的脂肪干细胞和玻尿酸按照表1混合。
表1各组分含量
| 玻尿酸体积分数(％) | 脂肪干细胞浓度(个/mL) | |
| 组合物a | 80 | 1.0×104 |
| 组合物b | 85 | 1.0×105 |
| 组合物c | 90 | 1.0×106 |
| 组合物d | 85 | 1.0×107 |
二、本发明提供的组合物的效果鉴定
1.取表1记载的组合物、玻尿酸和实施例1制备的脂肪干细胞，分别制备成体积为0.5mL/支、各两支的制剂。
2.取裸鼠随机分成6组，每组15只。分别给每组小鼠注入等剂量的表1记载的组合物a～d、玻尿酸和实施例1制备的脂肪干细胞(浓度为1.0×105个/mL)。每种制剂注射两处，注射位置在左腹部和右腹部。
3.分别在3天、10天、在30天时处死各组裸鼠5只，取出注射部位的制剂，进行质量、体积的比较。结果如表2所示：
表2不同制剂注射后质量、体积检测结果
注：*代表与注射玻尿酸的裸鼠相比具有显著差异P<0.01；
#代表与注射干细胞的裸鼠相比具有显著性差异P<0.01
从动物实验的结果可知，玻尿酸和本发明提供的组合物在注射后的吸收情况不一。
玻尿酸在注入裸鼠体内3天，制剂的体积和湿重并没有出现变化；在注入10天后，其湿重和体积均出现降低的现象，说明了玻尿酸正在缓慢的被降解吸收；30天，制剂的总体积下降，重量减少明显。上述结果说明了玻尿酸在注入裸鼠后逐渐被吸收降解，具体表现为制剂的重量和体积下降。
干细胞注射液注入裸鼠体内3天和第10天，由于溶剂为生理盐水，大部分都被裸鼠吸收代谢，且生理盐水不含有任何的营养成分，干细胞成活率低，导致了在第10天，仍不能形成新的组织，因此，在第3天和第10天，干细胞不能有效取出形状明显的组织；30天后，部分的干细胞分化形成新的组织，因此在30天后，肉眼可见沙粒大小的组织块。
本发明提供的组合物在注入裸鼠体内3天，制剂的体积和湿重并没有出现变化；在注入10天后，其湿重和体积均出现增加的现象，与注射了玻尿酸的裸鼠相比具有显著性差异。这说明组合物中的干细胞存活了，并不断形成新的组织；而此时，不论是注射了玻尿酸的裸鼠还是注射了干细胞的裸鼠其体内的制剂体积皆未能达到如此效果。30天后，制剂的体积继续增大，重量增加。该结果说明了干细胞在注入裸鼠后成功存活并分化增殖形成新的组织，从而导致了移植体的重量和体积增加。组合物a和组合物b的实验效果与此相似。
可见，本发明提供的组合物，在注射初期即能达到立即生效的作用，而在注射一段时间后，仍能保持良好的效果。能够同时兼具起效快、持续时间长的特点。
并且，通过数据分析可知，注射本发明提供的组合物后，制剂体积和质量的增长皆显著(P<0.05)优于注射了干细胞和玻尿酸的实验组。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种医用组合物，其特征在于，包括：间充质干细胞和玻尿酸。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述玻尿酸的体积分数为80％～90％。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述间充质干细胞的浓度为1.0×104个/mL～1.0×107个/mL。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述间充质干细胞为脂肪干细胞。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述脂肪干细胞的制备方法为：将脂肪组织经Ⅰ型胶原酶消化后，培养至80％融合，经胰酶消化后继代培养，获得脂肪干细胞。
6.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述Ⅰ型胶原酶占所述脂肪组织的质量分数为0.25％。
7.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述培养的培养基为含有15％FBS的DMEM-F12培养基；培养的接种浓度为1.0×105个/mL；培养的条件为37℃、5％CO2、饱和湿度。
8.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述胰酶的量为5mg。
9.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述继代培养的培养基为含有15％FBS的DMEM-F12培养基；培养的接种浓度为5.0×104个/mL；培养的条件为37℃、5％CO2、饱和湿度。
10.如权利要求1～9任一项所述的医用组合物在制备美容、除皱、整形制剂中的应用。
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