CN103269580B - 细胞冷冻方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种多层细胞冷冻瓶及其获取方法。所述获取方法是一种细胞冷冻和解冻过程，所述过程无需向解冻细胞掺入新的新鲜培养基以稀释低温保护剂。其通过以下方式实现：在含所述低温保护剂的冷冻细胞溶液上，提前冷冻一层额外的培养基或稀释剂。解冻时，所述培养基和细胞溶液自行混合，使所述低温保护剂浓度变为非毒性稀释度且从活细胞中有效排除低温保护剂。

Description

细胞冷冻方法
技术领域
本发明公开一种多层细胞冷冻瓶及其获取方法。本发明方法后冷冻细胞的活力和耐久性提高。其有助于在生物技术和药物领域中用于基础研究、诊断和药物开发应用的基于细胞的试验。
背景技术
体外培养细胞，包括哺乳动物细胞，广泛用于细胞生物研究。直到80年代中期，细胞培养技术是劳动密集型且规模达不到高细胞数。如今，在药物和生物技术工业以及基础研究中广泛接受并普遍应用使用高通量筛选（HTS）的细胞实验。
HTS筛选在微孔板中进行。可修饰这些微孔板表面以用于细胞培养应用，通常使用更易于细胞附着的等离子体放电。这些细胞培养微孔板使较大规模的细胞培养变得简单，对药物开发和制造产生巨大影响。对于药物开发，基于细胞的试验日益被用于使用高含量分析的有效性研究以及体外ADMET（药物吸收、分布、代谢、消除和毒性）的药物靶向检验。在细胞中进行这些研究的原因是相对简单的分子试验，其提供更具代表性的药物响应，而比起动物更易于以高通量形式操作。
低温保护是长期储存培养细胞的金标准方法。因为低温保护可能对细胞活力和功能带来负面影响，已开发了冷冻方法和解冻方法以保存培养细胞的正确结构、功能、行为和生物学性状。在早期，添加包括甘油和二甲亚砜（DMSO）的低温保护剂被用于肿瘤细胞保存以及健康造血原代细胞保存。总之，现行标准表明长期冷冻的细胞是在-130℃或更低温度下或于液氮气相中储存以确保最高存活水平。对于通常用于运输目的的短期时间，冷冻细胞可在-70℃至-80℃间储存。
冷冻细胞可包含在吸管中或更常包含在1ml-5ml的安瓿瓶中，所述安瓿瓶也称为冷冻小瓶（cryovial）或冷冻瓶（cryotube），其中含有10％低温保护剂。
本领域已建立了对细胞恢复有益的基础解冻条件。这些解冻条件已作为现行标准实验方案，包括解冻温度优化、通过加入细胞培养基和血清来稀释低温保护溶液，或通过离心完成对低温保护剂的去除。这些标准解冻实验方案（例如，ATCC实验方案）表明必需通过将冷冻瓶置于37℃水浴中并持续振荡直至其内含物完全解冻，从而使其快速解冻。然后对所述安瓿瓶去污并立即转移所述内含物至培养容器中，所述培养容器一般含有达10体积的合适培养基。该稀释逐滴进行以使可能发生的渗透压冲击降到最小。其可使低温保护剂浓度（通常为DMSO）降低至对大多数细胞而言其不需要立即完全移除的水平。整个解冻操作必需尽可能快速进行，使低温保护剂对细胞的毒性作用最小化。一旦细胞粘附，通常在接下来的24小时中在37℃、5%CO2的环境下孵育24小时，放置新鲜培养基且其加快低温保护剂的去除。对于对低温保护剂较敏感的细胞类型，必需在接种前离心以使毒性试剂完全去除。
细胞培养物通常体外扩增，且在80％或更高汇合时收集。多种方法用于收集细胞培养物领域，包括使用胰蛋白酶和EDTA进行酶消化、使用细胞刮棒机械移取，或温度响应表面，即来自纽恩克公司（Nunc）的UpCellTM。收集细胞后，通常对细胞离心、稀释、使用血球计数器或自动细胞计数器计数，再接种或悬于正确浓度的低温保护剂中。
细胞在常规细胞培养容器（也称为烧瓶）中接种，体外生长数日，然后在需要高通量应用的情况下再接种到微孔板中。该组织培养过程仍然是高通量形式接种细胞的现行标准，是一种需要合适细胞培养设备和合格技术人员的费劲又耗时的方法。所得物由于涉及多个操作步骤易受到微生物污染及细胞交叉污染。
JP2002253205A已试图通过直接冷冻粘附于平板的细胞来解决该问题。US2002012901A1描述了同样涉及粘附冷冻细胞的解冻方法。然而，已熟知单层冷冻细胞相比悬液中的那些更易冻伤。已报道这可能由于存在易于在相邻细胞间传播冰的间隙连接（Armitage等，Cryobiology2003；Liu等，Cryo letters2003，Acker JP等，2001）。JP2069200A和CA2689946A1描述了平板上的粘附冷冻细胞且仅聚焦在揭示胞内寄生物和病毒的诊断测试上。这些方法中无任何方法描述关于本发明的多层冷冻瓶。
WO2006072335A1和EP1869976被认为是最接近的现有技术公开物，其描述了冷冻细胞时，在低于大气压的氧分压下将悬浮细胞冷冻在多孔板中。这两个公开物中没有任何关于更高效多层冷冻瓶的描述，且这些方法实际上需要加入培养基进行稀释以在任何基于细胞的试验进行前解冻细胞，以避免低温保护剂的毒性作用，这与本发明不同。然而，为寻求相似的保存期效果，本发明一个优选实施方式描述了最下层的低含氧量培养基。
本领域技术问题是提供一种冷冻方法，其可产生更高的解冻后细胞存活率，实施测试时节省时间且减少污染风险。本发明提供的方案是一种产生双层或三层主体的容器的连续冷冻方法，所述容器包括至少一个新鲜稀释剂层。该方法使解冻步骤简化成一个单独步骤，将解冻效率提高了至少15％，且避免了将活细胞换至另一容器中，因此减少了污染风险。
发明详述
本发明是一种细胞冷冻和解冻方法，所述方法不需要向解冻细胞引入新的新鲜培养基来稀释低温保护剂。其通过以下方式实现：除了含所述低温保护剂的冷冻细胞溶液外，提前冷冻一层额外的培养基或稀释剂。解冻时，稀释剂和细胞溶液自体混合，使低温保护剂浓度达到非致病性稀释度，实现所述低温保护剂从活细胞中有效分离，是否使其流到所得溶液底部或是浮于表面取决于所述试剂的分子量，且由于其逐渐混合使细胞与溶质的渗透压冲击降到最低。这是本发明的一般发明构思。
本发明构思中至少包含两种可能性：1)冷冻细胞溶液置于冷冻稀释剂上方。包括冷低温保护剂的活细胞层以每分钟1℃或更快的温度率立即冷冻。该情况下，低温保护剂分子量应大于稀释剂；例如DMSO或甘油。以及2)冷冻细胞溶液置于冷冻稀释剂下方，所选低温保护剂分子量小于稀释剂；例如甲醇。解冻时，低温保护剂将流向混合物上方，从而与活细胞分离，后者将以更大的百分比存活。发明构思还包括：解冻时，新鲜稀释液和细胞溶液混合物稀释低温保护剂。因此避免了本技术领域一般方法后紧接细胞解冻的细胞扩增阶段，从而本发明节省了任何试验实施中的大量时间。
于是，本发明第一个实施方式是一种细胞或细胞样物质或非人胚胎的冷冻方法，所述方法包括以下步骤：在容器中冷冻一层生物学可接受的液体稀释剂；在所述冷冻稀释剂上加一层溶液形式的所述细胞或细胞样物质或非人胚胎液，所述溶液的培养基包括合适浓度的至少一种低温保护剂；并冷冻前步骤所得物以获得含顶部冷冻细胞或细胞样物质或非人胚胎的双层冷冻体；或：在容器中冷冻一层溶液形式的所述细胞或细胞样物质或非人胚胎，所述溶液的培养基包括合适浓度的至少一种低温保护剂；在所述冷冻溶液上加入一层生物学可接受的液体稀释剂；冷冻先前步骤所得物以获得冷冻稀释剂在顶部的双层冷冻体。
本申请范围中，表述“冷冻”意为将液体稀释剂即或细胞溶液温度减低至低于玻璃态转化温度以下以形成冷冻体。
本申请范围中，所述术语“细胞样物质”指细胞器、细胞膜或脂质体。
本发明范围中，所述术语“生物学可接受液体稀释剂”指与健康存活于体外条件的细胞相容的任何液体稀释剂。
本发明另一实施方式是重复任何这些冷冻系列以获得多层冷冻体。只要所述容器包括公开的层顺序，多体容器也是本发明的优选实施方式。
本发明的分层结构能降低低温保护剂的细胞毒性作用并降低解冻过程中对细胞的渗透压冲击。关键是含有所述细胞的那层不能大于稀释层体积的一半，以确保合适的稀释。因此，本发明冷冻细胞或细胞样物质或非人胚胎方法的具体实施方式是所述细胞或细胞样物质或非人胚胎溶液层的体积等于或少于稀释层，更优选等于或少于所述液体稀释层体积的一半。
本发明冷冻细胞或细胞样物质或非人胚胎方法的另一优选实施方式包括额外步骤：向双层冷冻体顶部细胞或细胞样物质或非人胚胎溶液加入一层低含氧量的生物学可接受的液体稀释剂以及冷冻所得物以获得三层冷冻体。优选地，所述低含氧量生物学可接受液体稀释剂是缺氧生物学可接受液体稀释剂。该额外的低含氧量层也必需在接近0℃的温度下平均分散于细胞溶液冷冻层顶部并在-70℃或更低温度下快速冷冻。所述液体量必需足够完全密封容器以至冷冻细胞被稀释剂限制和包围。通过加入该低含氧量层改善了冷冻细胞的储存期，其与本领域教导的冷冻时使用低含氧量环境的效果类似。三层方法实施方式提高了容器在-80℃下的保存时间，最高至6个月。
本发明范围中，术语“低含氧量”指稀释剂中氧分压低于细胞代谢的最佳水平的情况，通常为120－150mm Hg。本发明范围中一个低含氧量溶液实施例是氧分压为20mm Hg或更低。
本发明范围中，术语“缺氧”指稀释剂中氧分压相当于零的情况。
在本发明方法一个非常优选的实施方式中，所述生物学可接受液体稀释剂是完全细胞培养基，甚至更优选地补充有至少一种抗生素和/或血清。本发明方法另一优选实施方式中，所述低温保护剂选自下组：DMSO、甘油、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇、甲醇、甲基乙酰胺和糖；更优选的是DMSO。
本发明另一实施方式中，所述冷冻细胞是微生物，以及在另一实施方式中，所述冷冻细胞是植物细胞。在一优选的实施方式中，冷冻细胞是动物细胞，更优选的动物细胞选自下组：肿瘤细胞系、永生化细胞系、连续细胞系、遗传修饰细胞系、分裂阻滞细胞、干细胞、诱导的多能干细胞和原代分离细胞。甚至更优选地，所述原代分离细胞选自下组：上皮细胞、内皮细胞、间充质细胞、造血细胞。本发明一个优选实施方式中，所述动物细胞是哺乳动物细胞，更优选地是卵母细胞或精子。
本发明范围中，术语“肿瘤细胞系”指源自体内肿瘤的永久性建立的细胞培养系。
本发明范围中，术语“永生化细胞系”指经遗传工程改造以至无限自身增殖的那些细胞系。
本发明范围中，术语“连续细胞系”指能体外无限增殖的那些细胞系。
本发明范围中，术语“遗传修饰的细胞系”指通常通过遗传工程改造技术其遗传物质被修饰或改变的那些细胞系。
本发明范围中，术语“分裂阻滞细胞”指其细胞周期已被人工阻滞的那些细胞系；就是对于该细胞来说，其分裂能力已变为不可操作。这些主要用于高通量筛选目的。
本发明范围中，术语“干细胞”指具有经过数个细胞分裂周期却维持未分化状态能力，以及同时具有能分化为特殊细胞类型的多能性（除了人胚胎干细胞）的那些细胞。
本发明范围中，术语“诱导的多能干细胞”指衍生自成体的非多能细胞，以及经遗传重新编程以松散其组织特异性品质并变为多能性的那些细胞。
本发明范围中，术语“原代分离细胞”指直接从对象组织中获得的那些细胞。
在本发明另一实施方式中，冷冻细胞或细胞样物质或非人胚胎的方法在多孔板、小瓶、吸管、器皿、烧瓶或培养皿中实施。
另一优选实施方式是本发明的任何双层冷冻体，以及包含所述双层冷冻体的容器。另一实施方式是本发明的三层冷冻体以及含有它的容器。本发明一个优选实施方式是所述容器是96孔微孔板的孔、384孔微孔板的孔或1536孔微孔板的孔。最优选的实施方式之一是包含至少一个本发明的双层和/或三层冷冻体的HTS形式即用型多孔板。
当本发明容器在温暖的温度环境下（通常为37℃的CO2培养箱）解冻时，冷冻层以渐进方式融化以至将渗透压冲击降到最低且细胞与稀释剂均匀混合。该“自身接种”方法避免了进一步细胞操作，并使粘附细胞通过重力沉降并贴在容器或孔（微孔板的情况下）的底部。同时，稀释的低温保护剂将环境变得适于细胞快速恢复。通常，接下来的2小时孵育中，可用37℃的新鲜完整细胞培养基替换各孔中的培养基且微孔板可放回细胞培养箱中，以备实验使用。
本发明包括直接在HTS微孔板中冷冻细胞，如此避免了细胞解冻、细胞接种、烧瓶中细胞扩增、细胞转移和新微孔板中细胞再接种的耗时步骤。本发明冷冻方法的主要优点是大量节省了方法的时间。本领域传统的测试方法后，细胞必需解冻，在烧瓶中生长直至合适细胞数，在96孔板接种，然后等待24小时孵育以备试验，还需要4-5天。用本发明方法，细胞直接在96孔板中解冻，只需一个过夜的解冻后时期。鉴于这些时间上的优势，96孔板上的多层细胞冷冻/解冻方法的实施方式是用于研究细胞毒性或任何其它基于细胞试验的快速、便宜、稳健并且可行的方法。
除了节省时间，本发明因直接使用细胞而避免了培养物的潜在污染并使液体操作最小化。本发明冷冻方法的使用并不基于任何新试剂的加入，因此可预期所述细胞中没有新的未知试剂影响。本发明也能够标准化，因为微孔板可批量生产，各批次包含数个相同冷冻微孔板。另外，提供操作方案用于需要使用各汇合期的粘附细胞或同步在不同细胞周期的细胞的试验。本发明方法还提供了商业优点，因为数种细胞类型可多样混合在相同微孔板中，节省了购买不同单独细胞类型用于单个试验的相关成本。该多样能力对大范围的实验方法而言具有功能上的吸引力，以及有助于预算的大幅度降低。
关于本发明公开的结果，本发明的多层冷冻方法在96孔板中对HT29人肿瘤细胞和NIH3T3成纤维细胞有效。示例中解冻细胞的活力远高于本技术领域标准小瓶方法冷冻和解冻后的细胞。
本领域最优选的实施方式是HTS形式即用型多孔板，其中含有至少一个三层细胞冷冻体，所述三层冷冻体通过包括以下步骤的方法获得：在所述孔中冷冻一层补充有至少一种抗生素和血清的完全培养基；在所述冷冻稀释剂上加入一层溶液形式的细胞，所述溶液的培养基包含合适浓度的DMSO；冷冻先前步骤的所得物以获得双层冷冻体；在所述冷冻细胞上双层冷冻体的顶部加入一层缺氧完全培养基并冷冻所得物以获得所述三层冷冻体。
附图说明
图1.96孔板的一个孔中的两步冷冻过程（图A和B），之后解冻（图C和D），一旦在常规细胞孵育器中解冻平板便产生自动细胞接种机制。
A：第一层完全细胞培养基分散在96孔板的各孔中。然后在-70℃或更低温度冷冻所述平板。
B:在4℃或更低的温度下，在完全培养基冷冻层顶部加入含有低温保护剂第二层细胞或细胞样物质。然后在-70℃或更低温度冷冻所述平板。
C:37℃解冻所述平板使双层混合。点代表悬于稀释低温保护剂的细胞。
D:由于重力作用粘附细胞沉降，在37℃简短孵育后均匀贴于孔底部。
图2.HT29标准曲线f(x)=357415x–30210;R2=0,98。
图3.HT29细胞的存活率。显示多层冷冻/解冻方法相对来自对照瓶的细胞的细胞数存活率有明显增加。低于和高于80,000个细胞/孔的细胞数分别说明细胞死亡率和24小时后的细胞增殖。
图4.NIH3T3标准曲线f(x)=422129x–24554。
图5.NIH3T3细胞的细胞存活率。其显示将多层冷冻/解冻方法与来自对照瓶的细胞比较时，24小时孵育后的细胞存活数略微增加。
图6.5-氟尿嘧啶处理后BALB3T3细胞的浓度依赖性细胞毒性响应。
图7.他莫昔芬处理后BALB3T3细胞的浓度依赖性细胞毒性响应。
图8.5-氟尿嘧啶处理后Smac细胞的浓度依赖性细胞毒性响应。
图9.他莫昔芬处理后Smac细胞的浓度依赖性细胞毒性响应。
具体实施例详述
提供以下示例以说明和进一步说明优选实施方式和本发明的各方面，然而并不理解为限制其范围。
实施例1。HT29结肠癌细胞中的两层细胞冷冻/解冻方法
将HT29细胞(ATCC、LGC标准)培养在无内毒素的Mc Coy′s5A完全培养基中，其中补充有10%FCS(吉布可公司（Gibco）)、100μg/ml青毒素和100IU/ml链霉素(西格玛-艾尔德里奇公司(Sigma-Aldrich))，所述细胞在烧瓶中生长至80％汇合率后收集。使用含0.05%EDTA的5ml PBS孵育细胞2分钟来收集细胞，并用含0.1%胰蛋白酶和0.05%EDTA的5ml PBS再孵育5分钟实现最终分离。细胞在400xG离心5分钟。然后制备总共4.8ml的4℃溶液，其中含有80,000个HT29细胞/50μl冷冻80％Mc Coy′s、10%FCS、10%DMSO（应用化学公司（AppliChem））培养基（细胞密度通过血球计数器测定），形成所述的冷冻溶液。另外，将100μl完全培养基置于96孔板的各细胞中并冷冻至-80℃。冷冻后，回收该板然后在每孔顶部加入50μl/孔的所述冷冻溶液，所述孔中含有已冷冻的100μl完全培养基。将该板在干冰气氛下维持10分钟，然后移至-80℃的冷冻器内放置5天。作为阴性对照，冷冻低温冷冻小瓶（cryovial）中另一80，000个HT29细胞/50μl的溶液以及96孔板，同样也移至-80℃冷冻器内以用作瓶对照。
5天后，将冷冻96孔板移至37℃的CO2培养箱内。同时在37℃清洁水浴中温和摇动快速解冻对照瓶。在另一个含有100μl/孔温热完全培养基的96孔板上接种50μl/孔瓶对照。解冻一小时后，来自所有平板的培养基换为新鲜的预温热完全培养基。24小时孵育后对所有细胞进行MTT试验（西格玛-艾尔德里奇公司(Sigma-Aldrich)）。MTT试验是测定酶活性的实验室测试和标准比色实验，所述酶将MTT还原至甲产生紫色。黄色MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑，一种四唑）在活细胞中还原为紫色甲制备含有5mg/ml PBS1x的MTT储液。向之前解冻的细胞中加入100μl/孔的MTT工作溶液（培养基中1:100），并在CO2培养箱内孵育。3小时后，吸除平板孔中的MTT并加入200μl/孔DMSO将不溶紫色甲产物转化为有色溶液。用分光光度计（Multiskan Ascent，Thermo实验室系统公司（ThermoLabsystem））在540nm定量分析该溶液吸光度。
建立参考标准曲线（图2）。HT29细胞先在0.05%EDTA中孵育2分钟。用0.1%胰蛋白酶和0.05%EDTA再孵育5分钟实现最终脱离。细胞在400xG离心5分钟。用血球计数器对细胞计数测定细胞密度。在96孔板的孔中形成系列稀释。200μl.体积中细胞数范围是1250至160000个细胞。一旦细胞适当粘附，如上进行MTT试验。
实施例2。NIH3T3鼠成纤维细胞中的两层细胞冷冻/解冻方法
NIH3T3细胞(ATCC，LGC标准品)在无内毒素的DMEM培养基（格玛-艾尔德里奇公司(Sigma-Aldrich)）中培养，其中补充有10%FCS、100μg/ml青毒素和100IU/ml链霉素(西格玛-艾尔德里奇公司)，所述细胞在烧瓶中生长至80％汇合率后收集。使用含0.05%EDTA的5ml PBS孵育细胞2分钟来收集细胞，并用含0.1%胰蛋白酶和0.05%EDTA的5ml PBS再孵育5分钟实现最终分离。细胞在400rpm离心5分钟。然后制备总共4.8ml的4℃溶液，其中含有80,000个NIH3T3细胞/50μl冷冻80％DMEM、10%FCS、10%DMSO（应用化学公司）培养基（细胞密度通过血球计数器测定），形成所述的冷冻溶液。另外，将100μl完全培养基置于96孔板的各细胞中并冷冻至-80℃。冷冻后，回收该板然后在每孔顶部加入50μl/孔的所述冷冻溶液，所述孔中含有已冷冻的100μl完全培养基。将该板在干冰气氛上维持10分钟，然后移至-80℃的冷冻器内放置5天。为阴性对照，冷冻低温冷冻小瓶（cryovial）中另一80，000个HT29细胞/50μl的溶液以及96孔板，同样也移至-80℃冷冻器内以用作瓶对照。
5天后，将冷冻96孔板移至37℃的CO2培养箱内。同时在37℃清洁水浴中温和摇动快速解冻对照瓶。在另一个含有100μl/孔温热完全培养基的96孔板上接种50μl/孔对照瓶。解冻一小时后，来自所有平板的培养基换为新鲜的预温热完全培养基。24小时孵育后对所有细胞进行MTT试验（西格玛-艾尔德里奇公司）。制备含有5mg/ml PBS1x的MTT储液。在之前解冻的细胞中加入100μl/孔的MTT工业溶液（培养基中1:100），并在CO2培养箱内孵育。3小时后，吸除平板孔中的MTT并加入200μl/孔DMSO将不溶紫色甲产物转化为有色溶液。用分光光度计（Multiskan Ascent，Thermo实验室系统公司（Thermo Labsystem））在540nm定量分析该溶液吸光度。
建立参考标准曲线（图4）。NIH3T3细胞先在0.05%EDTA中孵育2分钟。用0.1%胰蛋白酶和0.05%EDTA再孵育5分钟实现最终脱离。细胞在400xG离心5分钟。用血球计数器对细胞计数测定细胞密度。在96孔板的孔中形成系列稀释。200μl.体积中细胞数范围是1,250至160,000个细胞。一旦细胞适当粘附，如上进行MTT试验。
实施例3。细胞毒性测试
将Balb3T3（ATCC，LGC标准）成纤维细胞和平滑肌主动脉细胞（SMAC，新鲜分离自SD（Sprague Dawley）大鼠，哈伦实验室（Harlan Laboratories））原代细胞在由无内毒素的DMEM（西格玛-艾尔德里奇公司）组成的培养基中培养，所述培养基补充有10%FCS、100μg/ml青毒素和100IU/ml链霉素(西格玛-艾尔德里奇公司)。SMAC细胞分离自单独的雄性大鼠主动脉：从左心室至髂分枝来源小心切除主动脉，通过用II型胶原酶（沃明顿公司（Worthington））酶消化所述组织来分离细胞。使所得细胞在冻存前生长12天。两种细胞类型在烧瓶中生长至80％汇合率后收集。使用含0.05%EDTA的5ml PBS孵育细胞2分钟来收集细胞，并用含0.1%胰蛋白酶和0.05%EDTA的5ml PBS再孵育5分钟实现最终分离。细胞在400rpm离心5分钟。然后制备总共4.8ml的4℃溶液，其中含有50.000个细胞/50μl冷冻80％DMEM、10%FCS、10%DMSO（应用化学公司）培养基（细胞密度通过血球计数器测定），形成所述的冷冻溶液。另外，将100μl完全培养基置于96孔板的各细胞中并冷冻至-80℃。冷冻后，回收该板然后在每孔顶部加入50μl/孔的所述冷冻溶液，所述孔中含有已冷冻的100μl完全培养基。将该板在干冰上维持10分钟，然后移至-80℃的冷冻器内放置5天。5天后，将冷冻96孔板移至37℃的CO2培养箱内。解冻一小时后，来自所有平板的培养基换为新鲜预温热的完全培养基。解冻20小时后，Balb3T3型细胞和SMAC型细胞分别用20、40、80和100μg/ml的5-氟尿嘧啶和0.62、1.25、2.5和5μM的他莫昔芬孵育。对照细胞接受基础培养基，对照FBS细胞也接受完全培养基。实验重复三次。20小时后进行MTT试验并根据吸光度计算细胞毒性。
制备含有5mg/ml PBS1x的MTT储液。然后向之前解冻的平板中加入100μl/孔的MTT工作溶液（培养基中1:100），并在CO2培养箱内孵育3小时。除去平板孔中的MTT并加入200μl/孔DMSO以将不溶紫色甲产物溶解为有色溶液。通过用分光光度计（Multiskan Ascent，Thermo实验室系统公司）在540nm测定以定量分析该溶液吸光度。

Claims (22)

1.冷冻细胞或细胞样物质或非人胚胎的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在容器中冷冻一层生物学可接受的液体稀释剂；
b)在所述冷冻稀释剂上以溶液形式加上一层所述细胞或细胞样物质或非人胚胎，所述溶液含有培养基和分布在培养基内的所述细胞或细胞样物质或非人胚胎，所述溶液中的培养基包括合适浓度的至少一种低温保护剂；以及
c)冷冻先前步骤所得物以获得细胞或细胞样物质或非人胚胎在顶部的双层冷冻体；
或者
a)在容器中冷冻一层溶液形式的细胞或细胞样物质或非人胚胎，所述溶液含有培养基和分布在培养基内的所述细胞或细胞样物质或非人胚胎，所述溶液中的培养基包含合适浓度的至少一种低温保护剂；
b)在所述冷冻溶液上加一层生物学可接受的液体稀释剂；和
c)冷冻先前步骤所得物以获得冷冻稀释剂在顶部的双层冷冻体；
其中
所述生物学可接受的液体稀释剂是完全细胞培养基，
所述细胞样物质是细胞器、细胞膜或脂质体，
所述细胞或细胞样物质或非人胚胎的溶液层的体积等于或者少于所述液体稀释剂层的体积的一半。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：
d)在双层冷冻体顶部的冷冻细胞或细胞样物质或非人胚胎溶液上加入一层低含氧量的生物学可接受液体稀释剂，其中低含氧量指稀释剂中的氧分压低于细胞代谢的最佳水平；且
e)冷冻先前步骤所得物以获得三层冷冻体。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述低含氧量生物学可接受液体稀释剂是缺氧生物学可接受液体稀释剂，其中缺氧指稀释剂中氧分压相当于零。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述完全细胞培养基补充有至少一种抗生素和/或血清。
5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述低温保护剂选自下组：DMSO、甘油、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇、甲醇、甲基乙酰胺和糖。
6.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞是微生物。
7.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞是植物细胞。
8.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞是动物细胞。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述动物细胞选自下组：肿瘤细胞系、永生化细胞系、连续细胞系、遗传修饰细胞系、分裂阻滞细胞、干细胞、诱导的多能干细胞和原代分离细胞。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述原代分离细胞选自下组：上皮细胞、内皮细胞、间充质细胞、造血细胞。
11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述动物细胞是哺乳动物细胞。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述动物细胞是卵母细胞或精子。
13.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述容器是吸管或器皿。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述器皿是多孔板的孔、小瓶、烧瓶或培养皿。
15.如权利要求1所述的任何双层冷冻体。
16.如权利要求2中所述的三层冷冻体。
17.包含如权利要求1所述的任何双层冷冻体的容器。
18.包含如权利要求2中所述的三层冷冻体的容器。
19.如权利要求17或18所述的容器，其特征在于，所述容器是96孔微孔板的孔。
20.如权利要求17或18所述的容器，其特征在于，所述容器是384孔微孔板的孔。
21.如权利要求17或18所述的容器，其特征在于，所述容器是1536孔微孔板的孔。
22.一种HTS形式即用型多孔板，所述多孔板包含至少一个如权利要求1-14中任一项所述方法的双层和/或三层冷冻体。
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