ES2576733T3

ES2576733T3 - Método de congelación de células

Info

Publication number: ES2576733T3
Application number: ES10016179.3T
Authority: ES
Inventors: Roberto Hernán Izquierdo; Natalia Gallot Escobal; Antonio Cruz Pacheco
Original assignee: Cellulis SL
Current assignee: Cellulis SL
Priority date: 2010-12-30
Filing date: 2010-12-30
Publication date: 2016-07-11
Anticipated expiration: 2030-12-30
Also published as: MX2013007510A; CN103269580B; US9642354B2; IL227121A; JP2014502610A; CA2821998A1; EP2471359A1; AU2011351883A1; AU2011351883B2; EP2471359B1; US20140004500A1; BR112013016341A2; WO2012089337A1; MX346168B; CN103269580A

Abstract

Método de congelación de células o materiales de tipo células, concretamente orgánulos celulares, membranas celulares o liposomas, o embriones no humanos, comprendiendo dicho método las etapas de: a) congelar una capa de medio de cultivo celular completo en un recipiente; b) añadir sobre dicho medio de cultivo celular completo congelado una capa de dichas células o materiales de tipo células o embriones no humanos en forma de una disolución, comprendiendo el medio de dicha disolución al menos un agente crioprotector en concentración adecuada; y c) congelar el resultado de la etapa anterior para obtener un cuerpo congelado de doble capa con la disolución de células o materiales de tipo células o embriones no humanos congelados en la parte superior; o a) congelar una capa de células o materiales de tipo células o embriones no humanos en forma de una disolución, comprendiendo el medio de dicha disolución al menos un agente crioprotector en concentración adecuada, en un recipiente; b) añadir sobre dicha disolución congelada una capa de medio de cultivo celular completo; y c) congelar el resultado de la etapa anterior para obtener un cuerpo congelado de doble capa con el medio congelado en la parte superior; en el que el volumen de dicha capa de disolución de células o materiales de tipo células o embriones no humanos es igual o inferior al volumen de dicha capa de medio de cultivo celular completo.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

descripcion

Metodo de congelacion de celulas Campo de la invencion

La invencion da a conocer un vial de congelacion de celulas de multiples capas y un metodo de obtencion del mismo. La disponibilidad y durabilidad de las celulas congeladas se aumentan segun el metodo de la invencion. Resulta util en ensayos basados en celulas para aplicaciones de investigacion basica, diagnostico y desarrollo de farmacos en el sector biotecnologico y farmaceutico.

Tecnica anterior

Celulas cultivadas in vitro, incluyendo celulas de mamnfero, se usan ampliamente en estudios de biologfa celular. Hasta mediados de la decada de los 80, las tecnicas de cultivo celular requenan mucho trabajo y no produdan una escala de altos numeros de celula. Actualmente, existe una amplia aceptacion y aplicacion universal de seleccion de alto rendimiento (HTS) usando ensayos basados en celulas en la industria farmaceutica y biotecnologica as^ como en investigacion basica.

La seleccion de tipo HTS se realiza en microplacas. La superficie de estas microplacas puede modificarse para aplicaciones de cultivo celular, normalmente usando una descarga de plasma para una adhesion celular mas facil. Estas microplacas de cultivo celular han facilitado el cultivo a mayor escala de celulas teniendo un impacto tanto sobre el desarrollo como sobre la fabricacion de farmacos. Con respecto al descubrimiento de farmacos, estan usandose cada vez mas ensayos basados en celulas para la validacion de dianas farmacologicas en estudios de eficacia usando analisis de alto contenido, y tambien ADMET (absorcion de farmaco, distribucion, metabolismo, eliminacion y toxicidad) in vitro. Estos estudios se realizan con celulas ya que proporcionan respuestas mas representativas a los farmacos que simples ensayos moleculares, y son mas faciles de usar en un formato de alto rendimiento que animales.

La crioconservacion es el metodo de referenda para el almacenamiento a largo plazo de celulas cultivadas. Dado que la crioconservacion puede afectar adversamente a la disponibilidad y funcion de celulas, se han desarrollado procedimientos de congelacion y descongelacion metodologicos con el fin de conservar la estructura, funcion, comportamiento y biolog^a correctos de celulas en cultivo. En los primeros anos, la adicion de agentes crioprotectores incluyendo glicerol y dimetilsulfoxido (DMSO) ya se usaba tanto para la conservacion de celulas tumorales como tambien para celulas primarias hematopoyeticas sanas. En general, las normas actuales indican que las celulas congeladas a largo plazo se almacenan a -1304oC o menos en fase de vapor de nitrogeno Kquido para garantizar el mayor nivel de viabilidad. Para periodos de tiempo mas cortos comunmente usados para fines de transporte (habitualmente desde 1 hasta 3 dfas), pueden almacenarse celulas congeladas a entre -70oc y -80oc.

Pueden contenerse celulas congeladas en pipetas tipo pajita o, mas comunmente, en ampollas de 1 ml a 5 ml tambien conocidas como crioviales o criotubos, con un 10% de crioconservante.

Ya se han establecido en la tecnica condiciones de descongelacion basicas como beneficiosas para la recuperacion de las celulas. Estas condiciones de descongelacion siguen siendo los protocolos convencionales actuales e incluyen optimizacion de la temperatura de descongelacion, dilucion de disolucion crioconservada mediante adicion de medio de cultivo celular con eliminacion de suero o agente crioprotector completo mediante centrifugacion. Estos protocolos de descongelacion convencionales (por ejemplo protocolos de ATCC) indican que el criovial tiene que descongelarse rapidamente colocandolo en un bano de agua a 37oc y se aplica agitacion continua hasta que su contenido se ha descongelado completamente. Despues se descontamina el vial y se transfiere inmediatamente el contenido a un vaso de cultivo que contiene normalmente hasta 10 volumenes de medio de cultivo apropiado. Esta dilucion se realiza gota a gota con el fin de minimizar lo mas posible el choque osmotico. Esto reducira la concentracion del agente crioprotector (comunmente DMSO) hasta un nivel que no necesita su eliminacion completa inmediata para la mayona de las celulas. Toda la operacion de descongelacion debe realizarse lo mas rapido posible con el fin de minimizar los efectos toxicos del agente crioprotector para las celulas. Tras la fijacion de las celulas, comunmente en el plazo de las 24 horas siguientes de incubacion a 37oc en una atmosfera de CO2 al 5%, se remplaza el medio por uno fresco y eso acelera la eliminacion del agente crioprotector. Para tipos de celulas mas sensibles al agente crioprotector, debe realizarse centrifugacion antes de la siembra con el fin de eliminar completamente el agente toxico.

Los cultivos celulares se expanden normalmente in vitro y se recogen a una confluencia del 80% o mas. Se usan varios metodos en la tecnica para recoger cultivos celulares, incluyendo digestion enzimatica usando tripsina y EDTA, levantamiento mecanico usando raspadores celulares, 0 superficies sensibles a la temperatura, es decir, UpCell™ de Nunc. Tras la recogida de las celulas, normalmente se centrifugan las celulas, se diluyen, se cuentan usando un hemocitometro 0 un contador celular automatico y 0 bien se siembran de nuevo 0 bien se suspenden a la concentracion correcta de agente crioprotector.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Se siembran celulas en vasos de cultivo celular habituales tambien denominados frascos, se hacen crecer in vitro durante algunos d^as y despues vuelven a sembrarse en microplacas cuando se requiere el uso de alto rendimiento. Este procedimiento de cultivo tisular todavfa es la norma habitual para sembrar celulas en un formato de alto rendimiento, siendo un metodo laborioso y que requiere mucho tiempo que requiere tecnicos cualificados e instalaciones de cultivo celular apropiadas. El resultado esta expuesto a contaminacion microbiana y contaminacion cruzada de las celulas debido a los numerosos procedimientos de manipulacion implicados.

El documento JP 2002253205 A ha intentado abordar este problema congelando directamente celulas que se adhieren a una placa. El documento US 2002012901 A1 ensena sobre metodos de descongelacion tambien relacionados con celulas congeladas adherentes. Sin embargo, se sabe bien que las celulas congeladas en monocapas son mas propensas a dano por congelacion que aquellas en suspension. Se ha notificado que esto puede deberse a la presencia de uniones comunicantes que facilitan la propagacion de hielo entre celulas vecinas (Armitage et al. Cryobiology 2003; Liu et al. Cryo letters 2003, Acker JP et a/., 2001). Los documentos JP 2069200 A y CA 2689946 Al ensenan sobre celulas congeladas adherentes en placas y se centran simplemente en pruebas de diagnostico para revelar virus y parasitos intracelulares. Ninguno de estos metodos ensena sobre viales congelados de varias capas tal como en la presente invencion.

Se considera que los documentos WO 2006072335 Al y EP 1869976 son las publicaciones de tecnica anterior mas proximas, que ensenan sobre celulas suspendidas congeladas en placas de multiples pocillos a una presion parcial de oxfgeno inferior a la presion atmosferica en el momento de congelacion de las celulas con el fin de prolongar su vida util de almacenamiento. Ninguna de estas dos publicaciones ensena sobre viales congelados de varias capas de alta eficacia, y de hecho estos metodos necesitan dilucion mediante la adicion de medio de cultivo a las celulas descongeladas antes de realizar cualquier ensayo basado en celulas, con el fin de evitar el efecto toxico del agente crioprotector, al contrario que la presente invencion. Sin embargo, buscando un efecto similar sobre la vida util de almacenamiento, una realizacion preferida de la invencion describe una ultima capa de medio hipoxico.

Por tanto, el problema de la tecnica es proporcionar un metodo de congelacion que pueda dar como resultado una mejor viabilidad de las celulas tras la descongelacion, ahorro de tiempo en la realizacion de pruebas y reduccion de los riesgos de contaminacion. La solucion proporcionada por la presente invencion es un metodo de congelacion secuencial que da como resultado un recipiente de cuerpo de doble o triple capa, que incluye al menos una capa de diluyente fresco. Este metodo facilita el procedimiento de descongelacion en una unica etapa, aumenta la eficacia de descongelacion como mmimo en un 15% y evita el intercambio de celulas viables a otro recipiente, reduciendo por tanto los riesgos de contaminacion.

Descripcion de la invencion

La invencion es un metodo de congelacion y descongelacion de celulas que evita la necesidad de incorporar nuevo medio fresco a las celulas descongeladas para la dilucion del agente crioprotector. Esto se logra mediante la congelacion previa de una capa adicional de medio o diluyente ademas de la disolucion de celulas congelada que contiene dicho agente crioprotector. En el momento de la descongelacion, el diluyente y la disolucion de celulas se mezclan entre sf llevando la concentracion del agente crioprotector hasta una dilucion no patogena, logrando la separacion eficaz de dicho agente crioprotector de las celulas vivas tanto si se deja fluir hasta el fondo o hasta la superficie de la disolucion resultante dependiendo del peso molecular de dicho agente, y minimizando el choque osmotico de las celulas con los solutos debido a su mezclado progresivo. Esto es el concepto inventivo comun de la presente invencion.

Dentro de este concepto inventivo estan comprendidas al menos dos posibilidades: 1) disponer la disolucion de celulas congelada sobre el diluyente congelado. La capa de celulas vivas que comprende el agente crioprotector fno se congelara inmediatamente a una velocidad de temperatura de 10C por minuto o mas rapida. En este caso, el agente crioprotector debe tener un peso molecular mayor que el del diluyente; por ejemplo, DMSO o glicerol. Y 2) disponer la disolucion de celulas congelada por debajo del diluyente congelado, teniendo el agente crioprotector elegido un peso molecular menor que el del diluyente; por ejemplo metanol. Cuando se descongela, el agente crioprotector fluira hacia arriba por la mezcla separandose de las celulas vivas, que sobreviviran en un gran porcentaje. El concepto inventivo sigue siendo el mismo: cuando se descongela, la mezcla de diluyente fresco y disolucion de celulas diluye al agente crioprotector. Esto permite evitar la fase de expansion celular que sigue a la descongelacion de las celulas segun los procedimientos generales de la tecnica, llevando la invencion a un ahorro considerable de tiempo en la realizacion de cualquier ensayo.

Por tanto, una primera realizacion de la invencion es un metodo de congelacion de celulas o materiales de tipo celulas, concretamente organulos celulares, membranas celulares o liposomas, o embriones no humanos, comprendiendo dicho metodo las etapas de: congelar una capa de medio de cultivo celular completo en un recipiente; anadir sobre dicho medio de cultivo celular completo congelado una capa de dichas celulas o materiales de tipo celulas o embriones no humanos en forma de una disolucion, comprendiendo el medio de dicha disolucion al menos un agente crioprotector en concentracion adecuada; y congelar el resultado de la etapa anterior para obtener un cuerpo congelado de doble capa con la disolucion de celulas o materiales de tipo celulas o embriones no humanos congelados en la parte superior; o: congelar una capa de celulas o materiales de tipo celulas o embriones

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

no humanos en forma de una disolucion, comprendiendo el medio de dicha disolucion al menos un agente crioprotector en concentracion adecuada, en un recipiente; anadir sobre dicha disolucion congelada una capa medio de cultivo celular completo; y congelar el resultado de la etapa anterior para obtener un cuerpo congelado de doble capa con el medio congelado en la parte superior; en el que el volumen de dicha capa de disolucion de celulas o materiales de tipo celulas o embriones no humanos es igual o inferior al volumen de dicha capa de medio de cultivo celular completo.

En el alcance de la presente solicitud, la expresion “congelar” significa reducir la temperatura del diluyente Kquido o la disolucion de celulas por debajo de su respectiva temperatura de transicion vftrea para formar un cuerpo congelado.

En el alcance de la presente invencion, el termino “materiales de tipo celulas” se refiere a organulos celulares, membranas celulares o liposomas.

En el alcance de la presente invencion, el termino “diluyente Ifquido biologicamente aceptable” se refiere a cualquier diluyente Kquido compatible con celulas que viven en condiciones in vitro saludables.

Otra realizacion de la invencion es repetir cualquiera de estas series de congelacion para obtener un cuerpo congelado de multiples capas. El recipiente de multiples cuerpos tambien es una realizacion preferida de la invencion siempre que dicho recipiente incluya la secuencia de capas dada a conocer.

La estructura en capas de la invencion puede reducir el efecto toxico del agente crioprotector y reducir el choque osmotico para las celulas durante el procedimiento de descongelacion. Resulta clave que la capa que contiene dichas celulas no debe ser mayor que la mitad del volumen de la capa de diluyente, para garantizar una dilucion apropiada. Por tanto, una realizacion particular del metodo de congelacion de celulas o materiales de tipo celulas o embriones no humanos de la invencion es que el volumen de dicha capa de disolucion de celulas o materiales de tipo celulas o embriones no humanos es igual o inferior a la capa de diluyente, mas preferiblemente igual o inferior a la mitad del volumen de dicha capa de diluyente Ifquido.

Otra realizacion preferida es el metodo de congelacion de celulas o materiales de tipo celulas o embriones no humanos de la invencion, que comprende las etapas adicionales de anadir, sobre la disolucion de celulas congeladas o materiales de tipo celulas o embriones no humanos en la parte superior del cuerpo congelado de doble capa, una capa de diluyente Ifquido biologicamente aceptable hipoxico, y congelar el resultado para obtener un cuerpo congelado de triple capa. Preferiblemente, dicho diluyente Ifquido biologicamente aceptable hipoxico es un diluyente Ifquido biologicamente aceptable anoxico. Esta capa hipoxica adicional tambien debe dispensarse uniformemente a una temperatura proxima a 0oC en la parte superior de la capa congelada de disolucion de celulas y congelarse rapidamente a una temperatura de -70oC o menos. La cantidad de Ifquido debe ser suficiente para sellar completamente el recipiente de modo que las celulas congeladas quedan confinadas y rodeadas por el diluyente. Se logra una vida util de almacenamiento mejorada de las celulas congeladas mediante la adicion de esta capa hipoxica, de una manera similar al efecto ensenado por la tecnica de usar una atmosfera hipoxica en el momento de la congelacion. La realizacion de metodo de triple capa aumenta el tiempo de conservacion del recipiente a -80oc hasta 6 meses.

En el alcance de la presente invencion, el termino “hipoxico” se refiere a una condicion en la que la presion parcial del oxfgeno en el diluyente esta por debajo del nivel optimo para el metabolismo celular, normalmente entre 120 y 150 mm de Hg. Un ejemplo valido para una disolucion hipoxica dentro del alcance de la invencion es una presion parcial de oxfgeno de 20 mm de Hg o menos.

En el alcance de la presente invencion, el termino “anoxico” significa una condicion en la que la presion parcial del oxfgeno en el diluyente es equivalente a cero.

En una realizacion muy preferida del metodo de la invencion dicho diluyente Ifquido biologicamente aceptable es medio de cultivo celular completo, incluso mas preferiblemente complementado con al menos un antibiotico y/o suero. En otra realizacion preferida de la invencion dicho agente criogenico se selecciona del grupo de DMSO, glicerol, polivinilpirrolidona, etilenglicol, metanol, metil-acetamida y azucares; mas preferiblemente DMSo.

En otra realizacion de la invencion, las celulas que se congelan son microorganismos, y en otra, las celulas que se congelan son celulas vegetales. En una realizacion preferida, las celulas que se congelan son celulas animales, mas preferiblemente celulas animales seleccionadas del grupo de Imeas de celulas tumorales, Imeas de celulas inmortalizadas, Imeas celulares continuas, Imeas celulares geneticamente modificadas, celulas de division detenida, celulas madre, celulas madre pluripotentes inducidas y celulas aisladas primarias. Incluso mas preferiblemente, dichas celulas aisladas primarias se seleccionan del grupo de celulas epiteliales, celulas endoteliales, celulas mesenquimatosas, celulas hematopoyeticas. En una realizacion preferida de la invencion dichas celulas animales son celulas de mamnfero, mas preferiblemente ovocitos o espermatozoides.

En el alcance de la presente invencion, el termino “Imeas de celulas tumorales” se refiere a Imeas de cultivo celular

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

establecidas de manera permanente originadas a partir de tumores in vivo.

En el alcance de la presente invencion, el termino “Imeas de celulas inmortalizadas” se refiere a aquellas Imeas de celulas modificadas por ingeniena genetica para reproducirse de manera indefinida.

En el alcance de la presente invencion, el termino “Imeas celulares continuas” se refiere a aquellas Imeas de celulas que pueden reproducirse in vitro de manera indefinida.

En el alcance de la presente invencion, el termino “Imeas celulares geneticamente modificadas” se refiere a aquellas Imeas celulares cuyo material genetico se ha modificado alterado, normalmente mediante tecnicas de ingeniena genetica.

En el alcance de la presente invencion, el termino “celulas de division detenida” se refiere a aquellas celulas cuyo ciclo celular se ha detenido artificialmente; es decir, en las que su capacidad de division se ha vuelto inoperable. Se usan principalmente con fines de seleccion de alto rendimiento.

En el alcance de la presente invencion, el termino “celulas madre” se refiere a aquellas celulas que tienen la capacidad para experimentar numerosos ciclos de division celular mientras que mantienen un estado no diferenciado, y al mismo tiempo son pluripotentes pudiendo diferenciarse para dar tipos de celulas especializadas, con la excepcion de celulas madre de embriones humanos.

En el alcance de la presente invencion, el termino “celulas madre pluripotentes inducidas” se refiere a aquellas celulas que se derivan de celulas no pluripotentes somaticas de adulto, y se han reprogramado geneticamente para perder sus cualidades espedficas de tejido y volverse pluripotentes.

En el alcance de la presente invencion, el termino “celulas aisladas primarias” se refiere a aquellas celulas que se obtienen directamente del tejido de un sujeto.

En otra realizacion de la invencion, el metodo de congelacion de celulas o materiales de tipo celulas o embriones no humanos se realiza en una placa de multiples pocillos, un vial, una pipeta tipo pajita, un vaso, un frasco o una caja.

Otra realizacion preferida es cualquiera de los cuerpos congelados de doble capa de la invencion en los que el cuerpo no contiene un embrion, ovocito o espermatozoide de origen humano, y el recipiente que comprende dicho cuerpo congelado de doble capa. Y todav^a otra realizacion es el cuerpo congelado de triple capa de la invencion en el que el cuerpo no contiene un embrion, ovocito o espermatozoide de origen humano y el recipiente que contiene el mismo. Una realizacion muy preferida de la invencion es que dicho recipiente es un pocillo de una microplaca de 96 pocillos. Una de las realizaciones mas preferidas es una placa de multiples pocillos lista para usar en formato HTS que comprende al menos uno de los cuerpos congelados de doble capa y/o triple capa de la invencion en la que el cuerpo no contiene un embrion, ovocito o espermatozoide de origen humano.

Cuando se descongela el recipiente de la invencion en una atmosfera de temperatura caliente, normalmente incubador de CO2 a 370C, las capas congeladas se funden de una manera progresiva de modo que se minimiza el choque osmotico y las celulas se mezclan uniformemente con el diluyente. Este metodo de “auto-sembrado” evita recogida de celulas adicional y permite que las celulas adherentes bajen y se adhieran al fondo del recipiente 0 pocillo en el caso de una microplaca, por gravedad. Al mismo tiempo, el agente crioprotector diluido hace que el entorno se vuelva apropiado para la rapida recuperacion de las celulas. Normalmente, en el plazo de las siguientes 2 horas de incubacion, el medio de cada pocillo puede sustituirse por medio de cultivo celular completo fresco a 37oc y puede colocarse la microplaca de vuelta en un incubador de cultivo celular, listo para su uso experimental.

La invencion comprende congelar celulas directamente en microplacas de tipo HTS, evitando de esta manera las etapas que requieren mucho tiempo de descongelar celulas, sembrar celulas, expandir celulas en frascos, levantar celulas y sembrar celulas de nuevo en una nueva microplaca. La principal ventaja del metodo de congelacion de la invencion es el ahorro considerable de tiempo de procedimiento. Segun procedimientos de prueba tradicionales de la tecnica, las celulas deben descongelarse, hacerse crecer en frascos hasta que tienen un numero de celulas apropiado, sembrarse en placas de 96 pocillos, despues esperar 24 horas para que la incubacion este lista para el ensayo, lo que todavfa tardara entre 4 y 5 dfas. Con el metodo de la invencion, se descongelan directamente las celulas en las palcas de 96 pocillos necesitando solo un periodo tras la descongelacion de una noche. A la luz de esta ventaja con respecto al tiempo, la realizacion del metodo de congelacion/descongelacion de celulas de multiples capas con placas de 96 pocillos es un metodo rapido, economico, robusto y viable para estudiar la citotoxicidad 0 para cualquier otro ensayo basado en celulas.

Aparte del ahorro en cuanto al tiempo, la presente invencion evita la posible contaminacion de los cultivos debido al uso directo de las celulas y la minimizacion de manipulacion de Ifquido. El uso del metodo de congelacion de la invencion no se basa en la adicion de ningun nuevo reactivo, por tanto no se espera ningun nuevo efecto desconocido del agente sobre las celulas. La invencion tambien permite la normalizacion ya que pueden producirse microplacas en lotes, comprendiendo cada lote varias microplacas congeladas identicas. Ademas, se proporciona

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

una solucion practica a ensayos que requieren o bien el uso de celulas adherentes en diversas fases de confluencia o bien celulas sincronizadas en diversas fases del ciclo celular. El metodo de la invencion tambien proporciona una ventaja comercial ya que pueden multiplexarse varios tipos de celulas en la misma microplaca, ahorrando costes asociados con adquirir los diferentes tipos de celulas individuales necesarios para un unico ensayo. Esta capacidad de multiplexado es funcionalmente atractiva para una amplia gama de enfoques experimentales as^ como para contribuir a una reduccion considerable del presupuesto.

Segun los resultados dados a conocer en el presente documento, el metodo de congelacion de multiples capas de la invencion es valido en placas de 96 pocillos para celulas tumorales humanas HT29 y celulas de fibroblastos NIH3T3. La viabilidad de las celulas descongeladas en los ejemplos era considerablemente mayor que en la congelacion y descongelacion de las celulas segun el metodo en vial convencional de la tecnica.

La realizacion mas preferida de la invencion es una placa de multiples pocillos lista para usar en formato HTS que contiene al menos un cuerpo congelado de celulas de triple capa en la que el cuerpo no contiene un embrion, ovocito o espermatozoide de origen humano, obteniendose dicho cuerpo congelado de triple capa mediante un metodo que comprende las etapas de: congelar una capa de medio de cultivo completo complementado con al menos un antibiotico y suero en dicho pocillo; anadir sobre dicho diluyente congelado una capa de celulas en forma de una disolucion, comprendiendo el medio de dicha disolucion dMsO en concentracion adecuada; congelar el resultado de la etapa anterior para obtener un cuerpo congelado de doble capa; anadir, sobre dichas celulas congeladas en la parte superior del cuerpo congelado de doble capa, una capa de medio de cultivo completo anoxico y congelar el resultado para obtener dicho cuerpo congelado de triple capa.

Breve descripcion de las figuras

Figura 1.- Procedimiento de congelacion en dos etapas en un pocillo de una placa de 96 pocillos (imagenes A y B) seguido por descongelacion (imagenes C y D), proporcionando un mecanismo de auto-sembrado de celulas una vez que la placa se descongela en un incubador de celulas habitual.

A: Se dispensa una primera capa de medio de cultivo celular completo en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Despues se congela la placa a -70oC o menos.

B: Se anade una segunda capa de celulas o materiales de tipo celulas que contiene un agente crioprotector a 4oc o menos en la parte superior de la capa congelada de medio de cultivo completo. Despues se congela la placa a -70oc o menos.

C: Mezclar las dos capas como resultado de la descongelacion de la microplaca a 37oc. Los puntos representan celulas suspendidas en el agente crioprotector diluido.

D: Las celulas adherentes bajan por gravedad y se unen de manera uniforme al fondo de los pocillos tras un breve tiempo de incubacion a 37oc.

Figura 2: Curva de calibracion de HT29. f(x) = 357415x - 30210; R2 = 0,98.

Figura 3.- Viabilidad celular en celulas HT29. Muestra un claro incremento en la viabilidad del numero de celulas del metodo de congelacion/descongelacion de multiples capas frente a las celulas del vial de control. El numero de celulas por debajo y por encima de 80.000 celulas/pocillo representa respectivamente la mortalidad celular y la proliferacion celular tras una incubacion de 24 horas.

Figura 4.- Curva de calibracion de NIH3T3. f(x) = 422129x - 24554. R2 = 0,96

Figura 5.- Viabilidad celular en celulas NIH3T3. Muestra un ligero incremento en la viabilidad del numero de celulas tras una incubacion de 24 horas en comparacion con el metodo de congelacion/descongelacion de multiples capas frente a las celulas del vial de control.

Figura 6.- Respuesta citotoxica dependiente de la concentracion de celulas BALB3T3 tras tratamientos con 5- fluoracilo.

Figura 7.- Respuesta citotoxica dependiente de la concentracion de celulas BALB3T3 tras tratamientos con tamoxifeno.

Figura 8.- Respuesta citotoxica dependiente de la concentracion de celulas Smac tras tratamientos con 5- fluorouracilo.

Figura 9.- Respuesta citotoxica dependiente de la concentracion de celulas Smac tras tratamientos con tamoxifeno. Descripcion detallada de realizaciones particulares

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Los siguientes ejemplos se proporcionan con el fin de demostrar e ilustrar adicionalmente determinadas realizaciones preferidas y aspectos de la presente inveneion, sin embargo no deben interpretarse como limitativos del alcance de las mismas.

Ejemplo 1. Metodo de congelacion/descongelacion de celulas de dos capas con celulas de carcinoma de colon HT29

Se hicieron crecer celulas HT29 (ATCC, LGC Standards) cultivadas en medio de cultivo completo 5A de Me Coy libre de endotoxina eomplementado eon FCS al 10% (Gibeo), penieilina 100 |ig/ml y estreptomieina 100 Ul/ml (Sigma-Aldrieh) en frascos hasta que presentaron una eonflueneia del 80%, y despues se reeogieron. La reeogida tuvo lugar mediante ineubaeion de celulas eon 5 ml de PBS que contema EDTA al 0,05% durante 2 min, y se logro un desprendimiento final mediante ineubaeion en 5 ml de PBS eon tripsina al 0,1% y EDTA al 0,05% durante otros 5 min. Se eentrifugaron las celulas a 400xG durante 5 min. Despues, se preparo un total de 4,8 ml de una disolueion a 40C que contema 80.000 celulas HT29/50 |il de medio de eongelaeion de Me Coy al 80%, FCS al 10%, DMSO al 10% (AppliChem) (densidad eelular determinada mediante hemoeitometro), formando la denominada disolueion de eongelaeion. Ademas, se dispusieron 100 |il de medio de cultivo completo en eada eelula de una plaea de 96 poeillos y se eongelo hasta -80oc. Una vez eongelada, se reeupero la plaea y se anadieron 50 |il/pocillo de dieha disolueion de eongelaeion eneima de eada pocillo que contema 100 |il de medio de cultivo completo ya eongelado. Se mantuvo la plaea durante 10 min en una atmosfera de nieve earboniea y a eontinuaeion se paso a un eongelador a -80oc durante 5 dfas. Como control negativo, se eongelo otra disolueion de 80.000 celulas HT29/50 |il en un eriovial junto eon la plaea de 96 poeillos y despues tambien se paso a un eongelador a -80oc para usarse eomo control de vial.

Cineo d^as despues, se paso la plaea de 96 poeillos eongelada a un ineubador de CO2 a 37oc. Al mismo tiempo, se deseongelo rapidamente el control de vial en un bano de agua limpia a 37oc eon agitaeion suave. Se sembraron 50 jj.l/pocillo del control de vial sobre otra plaea de 96 poeillos que contema 100 |il/pocillo de medio de cultivo completo ealiente. Una hora despues de la deseongelaeion, se eambio el medio de todas las plaeas por medio de cultivo completo previamente ealentado fresco. Se realizo un ensayo de MTT (Sigma-Aldrieh) eon todas las celulas tras 24 horas de ineubaeion. El ensayo de MTT es una prueba de laboratorio y un ensayo eolorimetrieo eonveneional para medir la aetividad de enzimas que redueen MTT para dar formazan, dando un color purpura. MTT amarillo (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio, un tetrazol) se reduce para dar formazan purpura en celulas vivas. Se preparo una disolueion madre de MTT eon 5 mg/ml de PBS 1x. Se anadieron 100 |il/pocillo de disolueion de trabajo de MTT (1:100 en medio de cultivo) a las celulas previamente deseongeladas, y se ineubaron en el ineubador de CO2. Tras 3 horas, se retiro el MTT de los poeillos de la plaea mediante aspiraeion y se anadieron 200 jj.l/pocillo de DMSO para eonvertir el produeto de formazan purpura insoluble en una disolueion eoloreada. Se euantifieo la absorbaneia de esta disolueion en un espeetrofotometro (Multiskan Ascent, Thermo Labsystems) a 540 nm.

Se ereo una eurva de ealibraeion de referenda (figura 2). En primer lugar se ineubaron celulas HT29 en EDTA al 0,05% durante 2 min. Se logro un desprendimiento final mediante ineubaeion en tripsina al 0,1% y EDTA al 0,05% durante otros 5 min. Se eentrifugaron las celulas a 400xG durante 5 min. Se determino la densidad eelular eontando las celulas usando un hemoeitometro. Se generaron las series de dilueion en los poeillos de una plaea de 96 poeillos. El numero de celulas oseilo entre 1250 y 160000 celulas en volumenes de 200 |il. En euanto las celulas estuvieron apropiadamente unidas, se realizo el ensayo de MTT tal eomo se meneiono anteriormente.

Ejemplo 2. Metodo de congelacion/descongelacion de celulas de dos capas eon fibroblastos murinos NIH3T3

Se hicieron crecer celulas NIH3T3 (ATCC, LGC Standards) cultivadas en medio DMEM libre de endotoxina (Sigma- Aldrieh) eomplementado eon FCS al 10%, penieilina 100 |ig/ml y estreptomieina 100 Ul/ml (Sigma-Aldrieh) en frascos hasta que presentaron una eonflueneia del 80%, y despues se reeogieron. La reeogida tuvo lugar mediante ineubaeion de celulas en 5 ml de PBS eon EDTA al 0,05% durante 2 minutos, y se logro un desprendimiento final mediante ineubaeion en tripsina al 0,1% y EDTA al 0,05% durante otros 5 minutos. Se eentrifugaron las celulas a 400 xG durante 5 minutos. Despues se preparo un total de 4,8 ml de una disolueion a 40c que contema 80.000 celulas NIH3T3/50 |il de medio de eongelaeion de DMEM al 80%, FCS al 10%, DMSO al 10% (AppliChem) (densidad eelular determinada mediante hemoeitometro), formando la denominada disolueion de eongelaeion. Ademas, se dispusieron 100 |il de medio de cultivo completo en eada eelula de una plaea de 96 poeillos y se eongelo hasta -80oc. Una vez eongelada, se reeupero la plaea y se anadieron 50 |il/pocillo de dieha disolueion de eongelaeion eneima de eada pocillo que contema 100 |il de medio de cultivo completo ya eongelado. Se mantuvo la palea durante 10 min en una atmosfera de nieve earboniea y a eontinuaeion se paso a un eongelador a -80oc durante 5 dfas. Como control negativo, se eongelo otra disolueion de 80.000 celulas HT29/50 |il en un eriovial junto eon la plaea de 96 poeillos y despues tambien se paso a un eongelador a -80oc para usarse eomo control de vial.

Cineo dfas despues, se paso la plaea de 96 poeillos eongelada a un ineubador de CO2 a 37oc. Al mismo tiempo se deseongelo rapidamente el control de vial en un bano de agua limpia a 37oc eon agitaeion suave. Se sembraron 50 |il/pocillo del control de vial sobre otra plaea de 96 poeillos que contema 100 |il/pocillo de medio de cultivo completo ealiente. Una hora despues de la deseongelaeion, se eambio el medio de todas las plaeas por medio de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

cultivo completo previamente calentado fresco. Se realizo un ensayo de MTT (Sigma-Aldrich) con todas las celulas tras 24 horas de incubacion. Se preparo una disolucion madre de MTT con 5 mg/ml de PBS 1 x. Se anadieron 100 jj,l/pocillo de disolucion de trabajo de MTT (1:100 en medio de cultivo) a las celulas previamente descongeladas, y se incubaron en el incubador de CO2. Tras 3 horas, se retiro el MTT de los pocillos de la placa mediante aspiracion y se anadieron 200 |il/pocillo de DMSO para convertir el producto de formazan purpura insoluble en una disolucion coloreada. Se cuantifico la absorbancia de esta disolucion en un espectrofotometro (Multiskan Ascent, Thermo Labsystems) a 540 nm.

Se creo una curva de calibracion de referenda (figura 4). En primer lugar se incubaron celulas NIH3T3 en EDTA al 0,05% durante 2 min. Se logro un desprendimiento final mediante incubacion en tripsina al 0,1% y EDTA al 0,05% durante otros 5 min. Se centrifugaron las celulas a 400xG durante 5 min. Se determino la densidad celular contando las celulas usando un hemocitometro. Se generaron las series de dilucion en los pocillos de una placa de 96 pocillos. El numero de celulas oscilo entre 1.250 y 160.000 celulas en volumenes de 200 |il. En cuanto las celulas estuvieron apropiadamente unidas, se realizo el ensayo de MTT tal como se menciono anteriormente.

Ejemplo 3. Prueba citotoxica

Se cultivaron fibroblastos Balb3T3 (ATCC, LGC Standards) y celulas aorticas de musculo liso (SMAC, recien aisladas de ratas Sprague Dawley, Harlan Laboratories), celulas primarias, en medio de cultivo completo que consistfa en DMEM libre de endotoxina (Sigma-Aldrich) complementado con FCS al 10%, penicilina 100 |ig/ml y estreptomicina 100 Ul/ml (Sigma-Aldrich). Se aislaron celulas SMAC de una unica aorta de rata macho: se diseco cuidadosamente la aorta de su origen en el ventnculo izquierdo hacia la bifurcacion i^aca y se aislaron celulas mediante digestion enzimatica del tejido con colagenasa tipo ll (Worthington). Se dejaron crecer las celulas resultantes durante doce d^as antes de la crioconservacion. Se hicieron crecer ambos tipos de celulas en frascos hasta que presentaron una confluencia del 80% y despues se recogieron. La recogida tuvo lugar mediante incubacion de celulas en 5 ml de PBS con EDTA al 0,05% durante 2 minutos, y se logro un desprendimiento final mediante incubacion en tripsina al 0,1% y EDTA al 0,05% durante otros 5 minutos. Se centrifugaron las celulas a 400 xG durante 5 minutos. Despues, se preparo un total de 4,8 ml de una disolucion a 40C que contema 50.000 celulas/50 |il de medio de congelacion de DMEM al 80%, FCS al 10%, DMSO al 10% (AppliChem) (densidad celular determinada mediante hemocitometro), formando la denominada disolucion de congelacion. Ademas, se dispusieron 100 |il de medio de cultivo completo en cada celula de una placa de 96 pocillos y se congelo hasta -80oc. Una vez congelada, se recupero la placa y se anadieron 50 |il/pocillo de dicha disolucion de congelacion encima de cada pocillo que contema 100 |il de medio de cultivo completo ya congelado. Se mantuvo la placa durante 10 min en una atmosfera de nieve carbonica y a continuacion se paso a un congelador a -80oc durante 5 d^as. Cinco d^as despues, se paso la placa de 96 pocillos congelada a un incubador de CO2 a 37oc. Una hora despues de la descongelacion, se cambio el medio de todas las placas por medio de cultivo completo previamente calentado fresco. Veinticuatro horas tras la descongelacion, se incubaron ambos tipos de celulas, celulas Balb3T3 y SMAC, con 20, 40, 80 y 100 |ig/ml de 5-fluorouracilo y 0,62, 1,25, 2,5 y 5 mM de tamoxifeno respectivamente. Las celulas de control recibieron medio basal y las celulas de FBS de control recibieron medio completo. Los experimentos se realizaron por triplicado. Veinticuatro horas despues se realizo un ensayo de MTT y se calculo la citotoxicidad segun los valores de absorbancia.

Se preparo una disolucion madre de MTT con 5 mg/ml de PBS 1x. Despues, se anadieron 100 |il/pocillo de disolucion de trabajo de MTT (1:100 en medio de cultivo) a las placas previamente congeladas y se incubaron durante 3 horas en el incubador de CO2. Se retiro el MTT de los pocillos de la placa y se anadieron 200 ^l/pocillo de DMSO para disolver el producto de formazan purpura insoluble para dar una disolucion coloreada. Se cuantifico la absorbancia de esta disolucion midiendo a 540 nm mediante un espectrofotometro (Multiskan Ascent, Thermo Labsystems).

Claims

5

10

15

20

25
2.

30
3.

35

40 4.
5. 45
6.

50 7.
8.

55
9.
10.

60

reivindicaciones

Metodo de congelacion de celulas o materiales de tipo celulas, concretamente organulos celulares, membranas celulares o liposomas, o embriones no humanos, comprendiendo dicho metodo las etapas de:

a) congelar una capa de medio de cultivo celular completo en un recipiente;

b) anadir sobre dicho medio de cultivo celular completo congelado una capa de dichas celulas o materiales de tipo celulas o embriones no humanos en forma de una disolucion, comprendiendo el medio de dicha disolucion al menos un agente crioprotector en concentracion adecuada; y

c) congelar el resultado de la etapa anterior para obtener un cuerpo congelado de doble capa con la disolucion de celulas o materiales de tipo celulas o embriones no humanos congelados en la parte superior; o

a) congelar una capa de celulas o materiales de tipo celulas o embriones no humanos en forma de una disolucion, comprendiendo el medio de dicha disolucion al menos un agente crioprotector en concentracion adecuada, en un recipiente;

b) anadir sobre dicha disolucion congelada una capa de medio de cultivo celular completo; y

c) congelar el resultado de la etapa anterior para obtener un cuerpo congelado de doble capa con el medio congelado en la parte superior;

en el que el volumen de dicha capa de disolucion de celulas o materiales de tipo celulas o embriones no humanos es igual o inferior al volumen de dicha capa de medio de cultivo celular completo.

Metodo segun la reivindicacion 1, caracterizado porque el volumen de dicha capa de disolucion de celulas o materiales de tipo celulas o embriones no humanos es igual o inferior a la mitad del volumen de dicha capa de medio de cultivo celular completo.

Metodo segun las reivindicaciones 1 o 2, que comprende las etapas de:

c) anadir, sobre la disolucion de celulas o materiales de tipo celulas o embriones no humanos congelados en la parte superior del cuerpo congelado de doble capa, una capa de medio de cultivo celular completo hipoxico; y

d) congelar el resultado de la etapa anterior para obtener un cuerpo congelado de triple capa.

Metodo segun la reivindicacion 3, caracterizado porque dicho medio de cultivo celular completo hipoxico es un medio de cultivo celular completo anoxico.

Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque dicho medio de cultivo celular completo se complementa con al menos un antibiotico y/o suero.

Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicho agente criogenico se selecciona del grupo de DMSO, glicerol, polivinilpirrolidona, etilenglicol, metanol, metil-acetamida y azucares.

Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque dichas celulas son microorganismos.

Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque dichas celulas son celulas vegetales.

Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque dichas celulas son celulas animales.

Metodo segun la reivindicacion 9, caracterizado porque dichas celulas animales se seleccionan del grupo de Imeas de celulas tumorales, Imeas de celulas inmortalizadas, Imeas celulares continuas, Imeas celulares geneticamente modificadas, celulas de division detenida, celulas madre, celulas madre pluripotentes inducidas y celulas aisladas primarias.

Metodo segun la reivindicacion 10, caracterizado porque dichas celulas aisladas primarias se seleccionan del grupo de celulas epiteliales, celulas endoteliales, celulas mesenquimatosas, celulas hematopoyeticas.

5

10

15

20

25
12. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 9 all, caracterizado porque dichas celulas animales son celulas de mairnfero.
13. Metodo segun la reivindicacion 12, caracterizado porque dichas celulas animales son ovocitos o espermatozoides.
14. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho recipiente es un pocillo de una placa de multiples pocillos, un vial, una pipeta tipo pajita, un vaso, un frasco o una caja.
15. Cualquiera de los cuerpos congelados de doble capa segun la reivindicacion 1, en el que el cuerpo no contiene un embrion, ovocito o espermatozoide de origen humano.
16. Cuerpo congelado de triple capa segun la reivindicacion 3, en el que el cuerpo no contiene un embrion, ovocito o espermatozoide de origen humano.
17. Recipiente que comprende cualquiera de los cuerpos congelados de doble capa segun la reivindicacion 1, en el que el recipiente no contiene un embrion, ovocito o espermatozoide de origen humano.
18. Recipiente que comprende el cuerpo congelado de triple capa segun la reivindicacion 3, en el que el recipiente no contiene un embrion, ovocito o espermatozoide de origen humano.
19. Recipiente segun las reivindicaciones 17 o 18, siendo dicho recipiente un pocillo de una microplaca de 96 pocillos.
20. Placa de multiples pocillos lista para usar en formato HTS que comprende al menos uno de los cuerpos congelados de doble capa y/o triple capa segun el metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que el cuerpo no contiene un embrion, ovocito o espermatozoide de origen humano.