DE102004061947A1

DE102004061947A1 - Verfahren zum Einfrieren und Lagern von Zellen

Info

Publication number: DE102004061947A1
Application number: DE102004061947A
Authority: DE
Inventors: Alexander Dr. Loa
Original assignee: CCS Cell Culture Service GmbH
Current assignee: CCS Cell Culture Service GmbH
Priority date: 2004-12-22
Filing date: 2004-12-22
Publication date: 2006-07-06
Also published as: US20080092560A1; WO2006072335A1; US20110097796A1; EP1827094A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Einfrieren und Lagern von Zellen in einem Gefäß mit den Schritten a) Einfrieren der Zellen auf eine Lagertemperatur und b) Lagern bei dieser Lagertemperatur, dadurch gekennzeichnet, dass das Lagern unter gasdichtem Abschluss und/oder unter gegenüber dem Atmosphärendruck vermindertem Sauerstoffpartialdruck erfolgt. DOLLAR A Die Erfindung betrifft weiterhin eingefrorene Zellen in Einfriermedium in einem Gefäß unter gasdichtem Abschluss und/oder unter gegenüber dem Atmosphärendruck vermindertem Sauerstoffpartialdruck.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Einfrieren und Lagern von Zellen in einem Gefäß.
Ferner betrifft die Erfindung eingefrorene Zellen in Einfriermedium in einem Gefäß.

Das Einfrieren von Zellen ist ein gängiges Verfahren in zellbiologisch arbeitenden Laboratorien (Parkes A. S., Proc.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci. 147(929): 424–426, 1957). Um die schädlichen Einflüsse des Einfrierens, die vorwiegend durch die Bildung von Eiskristallen hervorgerufen werden, zu verhindern, werden üblicherweise dem Einfriermedium kryoprotektive Substanzen wie Glyzerin oder DMSO zugesetzt (Pomerat C.M. und P.S. Moorhead, Tex.Rep.Biol.Med. 14(2): 237–253, 1956; Bouroncle B.A., Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 119(4):958–961,1965; Murthy S.S., Cryobiology 36(2): 84–96, 1998). Die in Einfriermedium suspendierten Zellen werden in Kryoröhrchen langsam mit einer Abkühlrate von ca. 1°C pro Minute bis auf –80°C eingefroren. Das langsame Abkühlen wird durch eine individuelle Isolierung der Kryoröhrchen, z.B. durch eine Polystyrolbox mit geeigneter Wandstärke, erreicht. So eingefrorene Zellen sind nur für einen kurzen Zeitraum von ca. 2 bis 4 Monaten haltbar.

Für eine Langzeitkonservierung bei Tiefsttemperaturen muß die Überführung der Proben in flüssigen Stickstoff (–196°C) oder in dessen Gasphase (–150°C bis –160°C) erfolgen, wo theoretisch eine unbegrenzte Haltbarkeit der eingefrorenen Zellen gegeben ist (Lindl T., Zell- und Gewebekultur, Spektrum Akademischer Verlag GmbH, 4: 110–113, 2000).

Tierische und menschliche Zellen finden in zellbasierten Assays im Hochdurchsatzscreening („high throughput screening", HTS) Anwendung. Hierfür ist nach dem Stand der Technik eine kontinuierliche Anzucht der Zellen erforderlich, so dass regelmäßig ausreichend Zellen in gleichbleibender Qualität zur Verfügung stehen und in die für die Assays verwendeten Gefäße, in der Regel Multiwellplatten, ausgesät werden können. Es ist jedoch bisher nicht möglich, Zellen in den Gefäßen vorzubereiten, in dieser Form bei –80°C langfristig zu lagern und so in beliebiger Menge für den Assay vorzuhalten. Die Haltbarkeit von Zellen, die bei –80°C eingefroren sind, ist auf 2 bis 4 Monate beschränkt. Auch ist die Lagerung von Multiwellplatten und anderen Gefäßen in flüssigem Stickstoff technisch nur schwierig und mit hohem Platzbedarf zu realisieren. Darüber hinaus erschwert die Notwendigkeit, ein wie oben beschriebenes langsames Einfrieren der Zellen herbeizuführen, die Verarbeitung einer großen Anzahl von Gefäßen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu schaffen, das es ermöglicht, Zellen für den Einsatz in zellbasierten Assays in den entsprechenden Gefäßen in ausreichender Anzahl und gleichbleibender Qualität zur Verfügung zu stellen und langfristig vorzuhalten.

Die Erfindung löst diese Aufgabe dadurch, dass sie ein Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Verfügung stellt, das folgende Schritte aufweist:

a) Einfrieren der Zellen auf eine Lagertemperatur
b) Lagern bei dieser Lagertemperatur,

wobei das Lagern unter gasdichtem Abschluss und/oder unter gegenüber dem Atmosphärendruck verminderten Sauerstoffpartialdruck erfolgt.

Zunächst seien einige der im Rahmen der Erfindung verwendeten Begriffe erläutert.

Der Begriff „Zelle" kann erfindungsgemäß eine eukaryotische Zelle bezeichnen, also eine Zelle mit echtem Zellkern, sowie einer Reihe charakteristischer Differenzierungen des Zytoplasmas. Eine solche eukaryotische Zelle kann im Rahmen der Erfindung tierischen oder menschlichen Ursprungs sein.

Wenn im Rahmen der Erfindung der Begriff „Gefäß" verwendet wird, dann kann ein solches Gefäß ein „Well" (Kavität) einer Multiwellplatte sein, oder auch die Gesamtheit der Platte meinen. Ebenso werden unter dem Begriff „Gefäß" aber auch andere in der Zellkultur üblichen Gefäße, wie beispielsweise Zellkulturschalen oder Zellkulturflaschen einer Reihe von Größen verstanden, die für die Kultivierung von Zellen geeignet sind.

Der Begriff „Lagertemperatur" meint erfindungsgemäß die Temperatur, bei der die Zellen, vorzugsweise in einem Tiefkühlschrank, gelagert werden. Die Zellen können bei dieser Lagertemperatur für mindestens einen Monat bis mehr als 12 Monate gelagert werden.

Unter dem Begriff „gasdichter Abschluss" wird im Rahmen der Erfindung ein Verschluß des Gefäßes verstanden, in dem die Zellen eingefroren werden, der einen gegenüber dem Atmosphärendruck verminderten Sauerstoffpartialdruck in dem Gefäß aufrecht erhalten kann, oder Schutzgas in dem Gefäß halten kann.

Unter dem Begriff „Atmosphärendruck" wird im Rahmen der Erfindung der Gesamtluftdruck der umgebenden Atmosphäre bestehend aus Luft verstanden, der 1 bar beträgt.

Der „Sauerstoffpartialdruck" ist erfindungsgemäß der Teildruck des Sauerstoffs in gasförmiger Form an einem Gesamtdruck einer Atmosphäre bestehend aus Luft. In einer Atmosphäre aus Luft, die einen Druck von 1 bar aufweist, beträgt der Sauerstoffpartialdruck 0,21 bar.

Unter dem Begriff „Multiwellplatte" wird erfindungsgemäß eine Platte aus einem geeigneten Material verstanden, etwa Polystyren, die mehrere „Wells" (Kavitäten) zur Aufnahme der Zellen in Kulturmedium aufweisen kann. Eine solche Platte kann 6, 12, 24, 48, 96, 384 oder auch 1 536 solcher Wells aufweisen.

Im Rahmen der Erfindung wird der Begriff „Wärmeleitfähigkeit" gemäß seiner bekannten physikalischen Definition verstanden. Ein Maß für die Wärmeleitfähigkeit eines Stoffes ist die Wärmeleitzahl. Metalle haben eine hohe Wärmeleitfähigkeit verglichen mit z.B. Glas. Die Wärmeleitung verläuft immer von Bereichen höherer Temperatur zu denen niedrigerer Temperatur.

Der Begriff „Hochdurchsatzscreening" („high throughput screening", HTS) meint ein Testen einer Vielzahl von Stoffen, Zellen oder dergleichen in einem relativ kurzen Zeitraum. Dabei kann beispielsweise in einem zellbasierten Assay der Effekt von Stoffen, Zellen oder dergleichen auf Zellen in den Wells eines geeigneten Gefäßes, vorzugsweise einer Multiwellplatte, getestet werden. Dies kann vorzugsweise mit einer Vielzahl von Stoffen oder Zellen oder dergleichen mit einer hohen Durchsatzrate geschehen.

Der Begriff „Einfriermedium" umfasst Lösungen, die geeignet sind, lebende Zellen während des Einfriervorgangs vor Gefrierschaden zu schützen. Solche Lösungen können Kulturmedium und kryoprotektive Substanzen („Kryoprotektiva") enthalten, die Lösungsmittel wie Dimethylsulfoxid (DMSO) oder Glyzerin sein können.

Unter dem Begriff „zellbasierter Assay" wird im Rahmen der Erfindung ein Versuch („Assay") verstanden, in dem lebende Zellen eingesetzt werden können. Diese Zellen können nach dem Auftauen in den Wells des geeigneten Gefäßes direkt in diesem Versuch verwendet werden. Damit kann der zellbasierte Assay in den Wells dieses Gefäßes durchgeführt werden.

Der Begriff „Vitalität" meint erfindungsgemäß den prozentualen Anteil an lebenden Zellen eines zu testenden Gefäßes, beispielsweise einer Multiwellplatte, im Vergleich zu Zellen eines nicht eingefrorenen Gefäßes, dem „Kontrollgefäß", beispielsweise eine Multiwellplatte, als Referenz. Hierbei kann die Bestimmung des Anteils an lebenden Zellen entweder durch eine Färbung des Zellkerns erfolgen (Farbausschlusstest, Thumm W., Z.Krebsforsch. 60(1): 91–93, 1954), oder durch einen Test auf metabolische Aktivität (Glass R.H., S.A. Ericsson et al., Fertil.Sterit. 56(4): 743–746, 1991).

Die Erfindung hat gezeigt, dass ein Verfahren der eingangs genannten Art ganz besonders dazu geeignet ist, Zellen für den Einsatz in zellbasierten Assays in den entsprechenden Gefäßen in ausreichender Anzahl und gleichbleibender Qualität zur Verfügung zu stellen und langfristig vorzuhalten.

Im folgenden sei die Erfindung genauer beschrieben.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Einfrieren und Lagern von Zellen in einem Gefäß mit den Schritten

dadurch gekennzeichnet, dass das Lagern unter gasdichtem Abschluss und/oder unter gegenüber dem Atmosphärendruck verminderten Sauerstoffpartialdruck erfolgt.

Zum Einfrieren der Zellen werden vorzugsweise Zellen aus einer Zellkultur in exponentieller Wachstumsphase verwendet. Vor dem Ernten sind vorzugsweise gerade soviel Zellen in dem Gefäß, dass der Boden des Gefäßes gleichmäßig bedeckt ist. Bei einem Well einer 96-well Platte sind dies vorzugsweise 80 bis 200 μl, bevorzugt 85 bis 190 μl, besonders bevorzugt 93 bis 188 μl Kulturmedium mit Zellen pro cm² Oberfläche.

Nach dem Ernten können die Zellen mit einer Zelldichte von vorzugsweise 0,05–10 × 10⁶ Zellen, besonders bevorzugt 0,1–5 × 10⁶ Zellen pro ml in Einfriermedium resuspendiert werden. Das Einfriermedium kann Kulturmedium, sowie ein Kryoprotektivum enthalten. Das Kryoprotektivum kann Glyzerin oder Dimethylsulfoxid (DMSO) sein. Die Endkonzentration des Kryoprotektivums kann 1 bis 20 Vol.%, bevorzugt 2 bis 15 Vol.%, besonders bevorzugt 4 bis 10 Vol.% betragen. Beispiele für geeignete Einfriermedien sind eine Mischung aus 95% DMEM (Dulbecco's Modified Eagels Medium) Komplettmedium, 5% Glyzerin, sowie aus 95% DMEM Komplettmedium, 5% DMSO, wobei Komplettmedium aus DMEM, 4 mM L-Glutamin, 2 mM Natriumpyruvat und 10% fötalem Kälberserum (FCS) bestehen kann.

Das im Einfriermedium verwendete Kulturmedium kann auch ein anderes Medium als DMEM sein. Es kann auch jedes andere in der Zellkultur übliche Medium verwendet werden, wie beispielsweise RPMI oder auch Neurobasalmedium. Anstelle eines Zellkulturmediums kann in dem Einfriermedium auch eine Salzlösung verwendet werden, wie beispielsweise HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) oder andere übliche Salzlösungen.

Die in Einfriermedium resuspendierten Zellen können höchstens 60 min, bevorzugt höchstens 45 min, besonders bevorzugt höchstens 30 min nach dem Resuspendieren eingefroren werden.

Die Verminderung des Sauerstoffpartialdrucks kann durch Verminderung des Drucks und/oder durch Begasung mit einem Schutzgas erfolgen.

Die Verminderung des Sauerstoffpartialdrucks kann bevorzugt vor dem Einfrieren erfolgen.

Der Sauerstoffpartialdruck in dem Gefäß kann auf 52,5 mbar bis 0,21 mbar, bevorzugt auf 26 mbar bis 0,21 mbar, besonders bevorzugt auf 13 mbar bis 0,21 mbar vermindert werden.

Erfindungsgemäß kann der gasdichte Abschluss des Gefäßes durch Einschweißen in einem gasdichten Folienschlauch oder durch Aufbringen einer gasdichten Klebefolie erfolgen.

Dabei kann ein geeignetes Gefäß mit einem Deckel verschlossen werden und in einer Schlauchfolie, vorzugsweise aus Polyethylen, vakuumverschweißt werden. Hierfür kann das Gefäß vorsichtig in den Schlauch geschoben werden, der dann an einer Seite verschlossen werden kann. Mit einem handelsüblichen Einschweißgerät kann nun der verbleibende Luftsauerstoff aus der Folienverpackung weitestgehend abgesogen und die Folie verschweißt werden. Ein solches Einschweißgerät kann beispielsweise ein Folio Vakuum-Einschweißgerät sein. Zum Vergleich können geeignete Gefäße unter denselben Bedingungen eingefroren werden, jedoch ohne unter gegenüber dem Atmosphärendruck verminderten Sauerstoffpartialdruck.

Nach gasdichtem Abschluss des Gefäßes kann ein Restvolumen an Luft bezogen auf Atmosphärendruck in dem Gefäß verbleiben, welches besonders bevorzugt bis zu dem 17,5-fachen, bevorzugt bis zu dem 15-fachen, weiterhin bevorzugt bis zu dem 7-fachen, weiterhin bevorzugt gleich dem Volumen der Zellsuspension in dem Gefäß sein kann. Beispielsweise kann ein solches Gefäß eine Multiwellplatte sein, bevorzugt eine 96-well Platte. In einer solchen 96-well Platte kann bei einem Volumen von 25 μl Zellsuspension pro Well nach gasdichtem Abschluss ein Restvolumen an Luft bezogen auf den Atmosphärendruck in der 96-well Platte verblei ben, welches besonders bevorzugt bis zu dem 17,5-fachen des Volumens der Zellsuspension sein kann.

Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das verwendete Schutzgas ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Stickstoff, Helium und Argon.

Die Zellen, die mit dem Verfahren der Erfindung eingefroren werden, können eukaryotische Zellen sein. Erfindungsgemäß können die Zellen, die mit dem Verfahren eingefroren werden, tierischen oder menschlichen Ursprungs sein. Beispielsweise könne diese Zellen murine Zellen, Hamsterzellen, Affenzellen oder auch Schweinezellen sein. Die Zellen, die mit dem Verfahren eingefroren werden, können weiterhin etablierte Zellinien, aber auch primäre oder sekundäre Zellen sein. Die Zellen, die mit dem Verfahren eingefroren werden, können weiterhin adhärente Zellen sein, oder auch Zellen sein, die in Suspension wachsen. Die Zellen, die mit dem Verfahren eingefroren werden, können weiterhin eine Vielzahl von Zelltypen beinhalten. Diese Zelltypen können ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Zellen ektodermalen Ursprungs, mesodermalen Ursprungs, endodermalen Ursprungs und Keimzellen. Diese Zelltypen können weiterhin ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Fibroblasten, Epithelzellen, hämatopoetischen und neuronalen Zellen. Beispielsweise können diese Zellen L-292 Mausfibroblasten, HeLa Zellen oder HCT-116 Zellen sein.

Erfindungsgemäß können die Zellen mit einer Abkühlrate auf die Lagertemperatur eingefroren werden, die mindestens 20°C pro Minute, bevorzugt mindestens 40°C pro Minute, besonders bevorzugt mindestens 64,5°C pro Minute, weiterhin bevorzugt mindestens 80°C pro Minute betragen kann. Die Abkühlrate gemäß der Erfindung erlaubt ein im Vergleich zum Stand der Technik schnelles Abkühlen und Unterschreiten des Gefrierpunktes der in den Gefäßen befindlichen Zellsuspension. In Verbindung mit dem Medium kann es so gelingen, die Kristallbildung im System zu unterdrücken und die Lösung in dem glasartigen Zustand zu halten, der für die zerstörungsfreie Tieftemperaturlagerung von Zellen notwendig ist. Erfindungsgemäß kann eine besonders bevorzugte Abkühlrate 64,5°C pro Minute sein.

Im Rahmen der Erfindung kann die Lagertemperatur nicht niedriger als –85°C, besonders bevorzugt nicht niedriger als –65°C, weiterhin bevorzugt nicht niedriger als –60°C, weiterhin bevorzugt nicht niedriger als –50°C sein. Erfindungsgemäß kann die Lagertemperatur in einem Tiefkühlschrank aufrecht erhalten werden. Im Rahmen der Erfindung kann eine besonders bevorzugte Lagertemperatur nicht niedriger als –65°C sein.

Das Einfrieren kann durch Kontakt wenigstens einer Fläche des Gefäßes mit einem Material geeigneter (hoher) Wärmeleitfähigkeit erreicht werden, das auf eine geeignete Temperatur vorgekühlt wurde. Das Material geeigneter Wärmeleitfähigkeit kann ein Metall sein. Die geeignete Temperatur kann zwischen –90°C und –50°C, bevorzugt zwischen –85°C und –65°C liegen.

Erfindungsgemäß kann das Lagern der Zellen ohne die Verwendung von flüssigem Stickstoff erfolgen. Vorzugsweise kann das Lagern in einem Tiefkühlschrank erfolgen.

Das Gefäß kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Multiwellplatte, Zellkulturschale und Zellkulturflasche.

Die Multiwellplatte kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus 6-well, 12-well, 24-well, 48-well, 96-well, 384-well und 1 536-well Platte.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin eingefrorene Zellen in Einfriermedium in einem Gefäß unter gasdichtem Abschluss und/oder unter gegenüber dem Atmosphärendruck vermindertem Sauerstoffpartialdruck.

Der Sauerstoffpartialdruck in dem Gefäß kann 52,5 mbar bis 0,21 mbar, bevorzugt 26 mbar bis 0,21 mbar, besonders bevorzugt 13 mbar bis 0,21 mbar betragen.

Erfindungsgemäß können die eingefrorenen Zellen direkt nach Auftauen in Einfriermedium in dem Gefäß ohne Passagieren für einen zellbasierten Assay verwendet werden. Dies kann geschehen, ohne, dass ein Waschen, Kultivieren oder Passagieren der Zellen in ein anderes Kulturgefäß durchgeführt wird. Etwa 1 bis 8 Stunden nach dem Auftauen bei 37°C, vorzugsweise in einem entsprechend temperierten Zellinkubator mit geeigneter CO₂-Atmosphäre, kann Kulturmedium zu den Zellen in den Wells des Gefäßes hinzugegeben werden. Dabei wird das die Zellen umgebende Einfriermedium verdünnt. Vorzugsweise kann dies eine 1:1 Verdünnung sein. Nach der Zugabe von Kulturmedium können die Zellen direkt in dem Gefäß für einen zellbasierten Assay verwendet werden. Dies kann geschehen, ohne, dass ein Waschen, Kultivieren oder Passagieren der Zellen in ein anderes Gefäß durchgeführt wird. In dem anschließenden zellbasierten Assay können Kontrollen mit und ohne des als Kryprotektivum verwendeten Lösungsmittels in dem entsprechenden prozentualen Anteil durchgeführt werden, um einen etwaigen Einfluß des Lösungsmittels auf den Assay zu erkennen.

Der zellbasierte Assay kann in Form eines Hochdurchsatzscreenings (HTS) durchgeführt werden. Dabei kann beispielsweise der Effekt von Stoffen, Zellen oder dergleichen auf Zellen in den Wells eines Gefäßes, vorzugsweise Multiwellplatte, getestet werden. Dies geschieht vorzugsweise mit einer Vielzahl von Stoffen oder Zellen mit einer vorzugsweise hohen Durchsatzrate. Die getesteten Stoffe können vorzugsweise pharmakologisch aktive Stoffe sein. Die getesteten Stoffe können weiterhin bevorzugt Liganden für zelluläre Rezeptoren sein. Die getesteten Stoffe können besonders bevorzugt die Genexpression der Zellen in den Wells beeinflussen. Die getesteten Zellen können einen Effekt auf die Zellen in den Wells bewirken. Es können ein oder mehrere Stoffe oder Zellen pro Well getestet werden.

Die eingefrorenen Zellen können bei einer Lagertemperatur niedriger oder gleich –65°C für mindestens 1 Monat, bevorzugt mehr als 2 Monate, weiterhin bevorzugt mehr als 4 Monate, besonders bevorzugt mehr als 12 Monate eine Vitalität von über 70%, bevorzugt über 80%, besonders bevorzugt von über 95% der Vitalität von Zellen eines nicht eingefrorenen Kontrollgefäßes aufweisen. Die Vitalität kann bei großen Gefäßen, aus denen die Zellen leicht wieder vollständig entfernt werden können, über einen im Stand der Technik bekannten Farbausschlusstest (Thumm W., Z.Krebsforsch. 60(1): 91–93, 1954) bestimmt werden. In kleinen Gefäßen, aus denen die eingefrorenen Zellen nicht zuverlässig zur Bestimmung entnommen werden können, kann der Vitalitätstest indirekt über die Messung der metabolischen Aktivität der Zellen erfolgen. Ein Substrat, z.B. Resazurin, wird den Zellen zugesetzt und von metabolisch aktiven Zellen reduziert. Das Substrat erfährt durch die Reduktion eine leicht quantifizierbare Änderung in seinem Absorptions- oder Fluoreszenzspektrum (Glass R.H., S.A. Ericsson et al., Fertil.Steril. 56(4): 743–746, 1991). Nach vorheriger Eichung der gemessenen Absorption oder Fluoreszenz anhand von Zellsuspensionen mit bekannter Zellzahl kann eine Quantifizierung der Vitalität vorgenommen werden. Die Messung der metabolischen Aktivität der Zellen kann aber außer mit Resazurin auch mit anderen im Stand der Technik üblichen Farbstoffen durchgeführt werden, wie beispielsweise MTT, XTT oder Neutralrot.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen erläutert.
Beispiel 1
Material und Geräte:

1. L-929 murine Fibroblasten Zellinie der ATCC (American Type Culture Collection), Nr.: CCL-1
2. DMEM Kulturmedium (Dulbecco's Modified Eagels Medium)
3. L-Glutamin
4. Natrium-Pyruvat
5. Fötales Kälberserum (FCS)
6. Glyzerin
7.PBS (Phosphate Buffered Saline) Trypsin/EDTA (Ethylene-diamine-tetraacetic acid), 0,5 g/l und 0,25 g/l
8. Resazurin
9. 96-well Platten
10. Polyethylenschlauchfolie
11. Folio Vakuum-Einschweißgerät
12. Sterilarbeitsbank
13. CO₂ Zellkulturinkubator
14. –80°C Tiefkühlschrank

L-292 Mausfibroblasten wurden nach dem Standardprotokoll der ATCC in DMEM Komplettmedium (DMEM, 4 mM L-Glutamin, 2 mM Natriumpyruvat, 10% FCS kultiviert bis eine ausreichende Zellzahl zum Einfrieren der Zellen zur Verfügung stand. Zur Zellernte sollten die Oberflächen der Gefäße etwa 80 bis 90% konfluent bewachsen sein. Der Kulturüberstand wurde abgegossen und der Zellrasen einmal mit PBS gewaschen. Je 25 cm² Oberfläche wurde 1 ml Trypsin/EDTA auf den Zellrasen gegeben, gleichmäßig verteilt und bei Raumtemperatur (RT) etwa 5 Minuten (min) inkubiert. Die Zahl und Vitalität der abgelösten Zellen wurde bestimmt und diese bei 180 × g für 4 min bei RT pelletiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet mit einer Zelldichte von 6 × 10⁵ Zellen/ml in Einfriermedium resuspendiert (95 DMEM Komplettmedium, 5 × Glyzerin). Je 50 μl der Zellsuspension wurden in jedes Well einer 96-well Platte pipettiert, wobei darauf geachtet wurde, dass die Zellsuspension den Boden des Wells bedeckte. Die 96-well Platten wurden mit dem Deckel verschlossen und einzeln in einer Schlauchfolie aus Polyethylen vakuumverschweißt. Hierfür wurden die Platten vorsichtig in den Schlauch geschoben und dieser an einer Seite verschlossen. Mit einem handelsüblichen Einschweißgerät wurde nun die verbleibende Luft aus dem Folienschlauch weitestgehend abgesogen und die Folie verschweißt. Zum Vergleich wurden 96-well Platten unter denselben Bedingungen eingefroren, jedoch ohne ein Absaugen der Luft. Die eingeschweißten Multiwellplatten wurden direkt auf die metallenen Einlegeböden in einen –80°C Tiefkühlschrank gestellt und in diesem eingefroren und gelagert. Die Platten wurden hierbei nicht gestapelt, und der gesamte Einfriervorgang erfolgte zügig. Von der Zugabe des Einfriermediums bis zum Einleiten des Einfriervorgangs vergingen in diesem Beispiel nicht mehr als 45 min.
Die Zellen konnten unter diesen Bedingungen für 1,5 Jahre gelagert werden und in den 96-well Platten mit einer Vitalität von über 90% wieder aufgetaut werden. Wurden die Zellen ohne Vakuum eingefroren, so beschränkte sich ihre Haltbarkeit auf 2 bis 4 Monate. Die Vitaltätsbestimmung erfolgte direkt in der 96-well Platte mit Hilfe der Reduktion von Resazurin (Glass R.H., S.A. Ericsson et al., Fertil.Steril. 56(4): 743–746, 1991).
Die Zellen konnten unter diesen Bedingungen für 12 Monate gelagert werden und in den 96-well Platten mit einer Vitalität von über 90% einer nicht eingefrorenen Platte aufgetaut werden. Im Gegensatz dazu betrug die Vitalität der nicht mit dem Verfahren behandelten Kontrollplatte nur etwas über 20%.
1 zeigt das Ergebnis des Versuches des Beispiels 1.
Beispiel 2
Die Zellinie HCT-116 wurde nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eingefroren. Zum Vergleich wurden HCT-116 Zellen in Einfriermedium mit DMSO (95% DMEM Komplettmedium, 5% DMSO) und mit Glyzerin (95% DMEM Komplettmedium, 5% Glyzerin) in 96-well Platten eingefroren. Die eingefrorenen Zellen wurden nach 12 Monaten wieder aufgetaut und ihre Zellaktivität durch Reduktion des Farbstoffs Resazurin bestimmt. Die Zellaktivität ist als relative Signalstärke in [U] angegeben.
Zur Beurteilung eines HTS-Assays wird im Stand der Technik der Z-Faktor verwendet. Der Z-Faktor ist eine statistische Größe, die sich aus den Mittelwerten und Standardabweichungen der Meßwerte berechnet. Ein idealer Assay hat einen Z-Faktor, der um 1 liegt. Zwischen 1 und 0,5 sind Assays gut durchführbar. Sinkt der Z-Faktor unter 0,5 ab, so wird der Trennbereich zwischen Kontrolle und Probe zu klein, so dass eine klare Unterscheidung der Zellaktivität nicht mehr möglich ist.
2 zeigt graphisch das Ergebnis des Beispiels 2.
3 zeigt die Rohdaten des Beispiels 2.
Beispiel 3
Um die Funktionalität der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eingefrorenen Zellen zu zeigen, wurden Zellen nach dem Auftauen in einem Zytotoxizitäts-Assay verwendet. HeLa-Zellen wurden in 96-well Platten nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eingefroren, nach 13 Monaten wieder aufgetaut und dann der IC₅₀-Wert von Na₂SeO₃ bestimmt. Hierzu wurde Na₂SeO₃ in zwölf Verdünnungsstufen zu den Zellen gegeben. Die Verdünnungen wurden so gewählt, dass die Konzentration an Na₂SeO₃, die 50% der Zellen abtötet, sich in der Mitte des untersuchten Konzentrationsbereichs befindet. Die aufgetragenen Werte sind die Mittelwerte einer Vierfachbestim mung. Nach einer Inkubation der Testsubstanz von 48 Stunden bei Zellkulturbedingungen (37°C, 5% CO₂ und hoher Luftfeuchtigkeit) wurde die Lebendzellzahl über die metabolische Aktivität der lebenden Zellen bestimmt. Hierfür wurde Resazurin eingesetzt, dass in den Mitochondrien metabolisch aktiver, lebender Zellen reduziert wird und sich dabei in das fluoreszensaktive Resofurin umwandelt. Die Konzentration, bei der nur noch 50% der Zellaktivität nachgewiesen werden kann gibt den IC₅₀-Wert an.
4 zeigt das Ergebnis des Beispiels 3.
Die Beispiele zeigen, dass das erfindungsgemäße Verfahren besonders gut dazu geeignet ist, Zellen für den Einsatz in zellbasierten Assays in den entsprechenden Gefäßen in ausreichender Anzahl und gleichbleibender Qualität zur Verfügung zu stellen und langfristig vorzuhalten.

Claims

Verfahren zum Einfrieren und Lagern von Zellen in einem Gefäß mit den Schritten a) Einfrieren der Zellen auf eine Lagertemperatur, b) Lagern bei dieser Lagertemperatur, dadurch gekennzeichnet, dass das Lagern unter gasdichtem Abschluss und/oder unter gegenüber dem Atmosphärendruck verminderten Sauerstoffpartialdruck erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Verminderung des Sauerstoffpartialdrucks durch Verminderung des Drucks und/oder durch Begasung mit einem Schutzgas erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Verminderung des Sauerstoffpartialdrucks vor dem Einfrieren erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Sauerstoffpartialdruck in dem Gefäß auf 52,5 mbar bis 0,21 mbar, bevorzugt auf 26 mbar bis 0,21 mbar, besonders bevorzugt auf 13 mbar bis 0,21 mbar vermindert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der gasdichte Abschluss des Gefäßes durch Einschweißen in einem gasdichten Folienschlauch oder durch Aufbringen einer gasdichten Klebefolie erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass nach gasdichtem Abschluss des Gefäßes ein Restvolumen an Luft in dem Gefäß verbleibt, welches beson ders bevorzugt bis zu dem 17,5-fachen, bevorzugt bis zu dem 15-fachen, weiterhin bevorzugt bis zu dem 7-fachen, weiterhin bevorzugt gleich dem Volumen der Zellsuspension in dem Gefäß ist.
Verfahren nach einem der Anspruche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Schutzgas ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Stickstoff, Helium und Argon.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen tierischen oder menschlichen Ursprungs sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen mit einer Abkühlrate auf die Lagertemperatur eingefroren werden, die mindestens 20°C pro Minute, bevorzugt mindestens 40°C pro Minute, besonders bevorzugt mindestens 64,5°C pro Minute, weiterhin bevorzugt mindestens 80°C pro Minute beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Lagertemperatur nicht niedriger als –85°C, besonders bevorzugt nicht niedriger als –65°C, weiterhin bevorzugt nicht niedriger als –60°C, weiterhin bevorzugt nicht niedriger als –50°C ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Einfrieren durch Kontakt wenigstens einer Fläche des Gefäßes mit einem Material geeigneter Wärmeleitfähigkeit erreicht wird, das auf eine geeignete Temperatur vorgekühlt wurde.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Material ein Metall ist.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur zwischen –90°C und –50°C, bevorzugt zwischen –85°C und –65°C liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Lagern der Zellen ohne Verwendung von flüssigem Stickstoff erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Gefäß ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Multiwellplatte, Zellkulturschale und Zellkulturflasche.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Multiwellplatte ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 6-well, 12-well, 24-we11, 48-well, 96-well, 384-well und 1 536-well Platten.
Eingefrorene Zellen in Einfriermedium in einem Gefäß unter gasdichtem Abschluss und/oder unter gegenüber dem Atmosphärendruck vermindertem Sauerstoffpartialdruck.
Eingefrorene Zellen nach Anspruch 17, bei denen der Sauerstoffpartialdruck in dem Gefäß 52,5 mbar bis 0,21 mbar, bevorzugt 26 mbar bis 0,21 mbar, besonders bevorzugt 13 mbar bis 0,21 mbar beträgt.
Eingefrorene Zellen nach Anspruch 17 oder 18, die direkt nach Auftauen in Einfriermedium in dem Gefäß ohne Passagieren für einen zellbasierten Assay verwendet werden können.
Eingefrorene Zellen nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass der zellbasierte Assay in Form eines Hochdurchsatzscreenings (HTS) durchgeführt werden kann.
Eingefrorene Zellen nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die eingefrorenen Zellen bei einer Lagertemperatur niedriger oder gleich –65°C für mindestens 1 Monat, bevorzugt mehr als 2 Monate, weiterhin bevorzugt mehr als 4 Monate, besonders bevorzugt mehr als 12 Monate eine Vitalität von über 70%, bevorzugt über 80%, besonders bevorzugt von über 95% der Vitalität von Zellen eines nicht eingefrorenen Kontrollgefäßes aufweisen.