DE69815531T2

DE69815531T2 - Zusammensetzung zur quantitativen und reproduzierbaren konservierung von microorganismen und herstellunsverfahren dafür

Info

Publication number: DE69815531T2
Application number: DE69815531T
Authority: DE
Inventors: Jean-François Hernandez; Fabrice Paluszkiewicz; Eric Oudart
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1997-06-25
Filing date: 1998-06-24
Publication date: 2004-04-29
Anticipated expiration: 2018-06-25
Also published as: CA2295927A1; ATE242801T1; DE69815531D1; FR2765239A1; FR2765239B1; JP2002507122A; EP1003837B1; DK1003837T3; WO1999000485A1; EP1003837A1; AU8343598A; US6723526B1

Description

Die vorliegende Anmeldung bezieht sich auf eine Zusammensetzung für die Aufbewahrung von bestimmten und reproduzierbaren Mengen von Mikroorganismen.
Sie bezieht sich außerdem auf linsenförmige Pastillen, welche eine solche Zusammensetzung umfassen.
Sie hat gleichfalls ein Verfahren zur Herstellung dieser Pastillen zum Gegenstand.
Die Anwesenheit von Benzol in Perrier-Mineralwasser, von Listerien in Käsen oder die Epizootie der spongiformen Enzephalopathie beim Rind haben beträchtliche Auswirkungen gehabt. Die Unternehmen auf den Gebieten des Wassers, der Agrarwirtschaft oder der Gesundheit, die in sensiblen Sektoren positioniert sind, haben Kunden, die sehr stark auf die Qualität der Produkte, mit denen sie versorgt werden, achten. Auch ist die Verhütung von Krisensituationen von existenzieller Bedeutung. Tatsächlich kann ein Vorfall, wie eine Verunreinigung oder Kontamination, schwerwiegende Rückwirkungen auf die Gesundheit der Verbraucher und desaströse wirtschaftliche Konsequenzen für die Unternehmen (vergeudete Produktion, Verschlechterung des Ansehens) haben. Aus diesem Grund stellt das Risiko einer Verunreinigung eine Hauptsorge für die Behörden, die immer strengere nationale, europäische oder internationale vorschriftsmäßige Zwänge in Hinblick auf die mikrobiologische Sicherheit einführen, und die Gewerbetreibenden, die Qualitätssicherungspläne einführen, welche insbesondere die Suche nach den kritischen Stellen für eine Verunreinigung oder Kontamination in den Verfahren mit umfassen, dar.
Auch führen überaus zahlreiche öffentliche oder private Laboratorien jedes Jahr mehrere Tausend chemische und mikrobiologische Analysen auf den Gebieten der Agrarwirtschaft, der Umwelt oder der Gesundheit aus.
Unter Beteiligung von mehreren Laboratorien ausgeführte Studien haben klar gezeigt, dass die Laboratorien im allgemeinen mit einer ziemlich guten Präzision arbeiteten, dass aber bedeutende Unterschiede zwischen den durch die verschiedenen Laboratorien erhaltenen Ergebnisse bestanden.
So können zu hoch ausfallende Ergebnisse in Laboratorien, die schlecht regulierte Wärmeschränke aufweisen, beobachtet werden, wohingegen zu niedrig ausfallende Ergebnisse in Laboratorien, die Kulturmedien von schlechter Qualität einsetzen, beobachtet werden.
Diese fehlerhaften Ergebnisse können bedeutende wirtschaftliche Auswirkungen oder bedeutende Auswirkungen auf die öffentliche Gesundheit haben. Die zu hoch ausfallenden Ergebnisse können dazu führen, dass eine Charge von Produkten zu Unrecht zurückgewiesen wird, unnütz Sanierungsarbeiten zur Verbesserung der Qualität eines Strands in die Wege geleitet werden oder ohne Grund bei der Bevölkerung Besorgnis erregt wird, indem der Verbrauch von Leitungswasser untersagt wird.
Im Gegenteil können zu niedrig ausfallende Ergebnisse die Verbraucher einem Risiko aussetzen, indem der Verkauf von verunreinigten oder kontaminierten Produkten, die Versorgung mit schlecht desinfiziertem Wasser oder das Baden in einem verunreinigten Gewässer erlaubt wird.
Um die Zuverlässigkeit der Messungen zu garantieren, wurde von den Kontrolllaboratorien verlangt, sich akkreditieren zu lassen. Anfänglich definierte diese Akkreditierung einzig Pflich ten hinsichtlich der Mittel (qualifiziertes Personal, angepasste Lokationen, Wartung der Messapparaturen, Kontrolle der Ausgangsmaterialien und Aufzeichnung der Analysenprozeduren). Gegenwärtig fordert sie außerdem Pflichten hinsichtlich der Ergebnisse. Diese neue Forderung erfordert die Einrichtung eines Qualitätssystems, welches interne Kontrollen und die Teilnahme an unter Beteiligung von mehreren Laboratorien ausgeführten Versuchen (Inter-Labor-Versuchen) umfasst.
Um die Analysenreihen intern zu kontrollieren, und für die Organisation der unter Beteiligung von mehreren Laboratorien ausgeführten Versuche ist es zwingend erforderlich, über Referenzmaterialien zu verfügen. Diese Referenzmaterialien müssen über die Zeit stabil sein und müssen es erlauben, leicht Kontrollproben zu rekonstituieren, die homogen sind und eine genaue Menge des quantitativ zu bestimmenden Produkts umfassen.
In der Chemie existieren diese Referenzmaterialien seit vielen Jahren. Im Gegenzug ist es auf dem Gebiet der Mikrobiologie besonders schwierig, präzise Mengen von Mikroorganismen aufzubewahren. Tatsächlich kann die Anzahl von Mikroorganismen zunehmen, wenn das Aufbewahrungsmilieu deren Vermehrung im Verlauf der Herstellung, des Transports oder der Lagerung erlaubt, oder abnehmen, wenn sie während der Herstellung, dem Transport, der Lagerung oder im Moment der Rekonstitution der Kontrollprobe vor dem Einsatz sterben.
Verfahren zur Aufbewahrung von Mikroorganismen, wie die Lyophilisation und die Gefriertrocknung (Kryokonservierung), wurden bereits im Stand der Technik beschrieben. Gleichwohl bringen diese Methoden zum Zeitpunkt der Konditionierung bedeutende Mortalitätsraten unter den aufbewahrten Mikroorganismen mit sich und erlauben es folglich nicht, die endgültige Menge von überlebenden Mikroorganismen genau zu beherrschen.
So beschreiben zwei Patente, die sich an ein Verfahren zum brutalen Einfrieren in flüssigem Stickstoff wenden, nicht die Aufbewahrung von Bakterien oder von Mikroorganismen und packen das Problem der quantitativen Bestimmungen nicht an.
Das Patent US-5 364 756 beschreibt ein Verfahren zur Gefriertrocknung (Kryokonservierung) von eukaryotischen Zellen. Eine Suspension von diesen Zellen wird in einem Puffer, welcher als Kälteschutzmittel dienende Agentien umfasst, hergestellt, dann wird die Lösung durch Ultraschall vernebelt, um Mikrotröpfchen zu bilden, die schnell abgekühlt und getrocknet werden.
Das Patent US-5 405 616 betrifft die Aufbewahrung von pharmakologisch aktiven Molekülen. Die diese Moleküle umfassenden Teilchen werden hauptsächlich aus einem in Wasser löslichen hydrophilen Makromolekül gebildet, welches ein Gerüst bildet. Es werden verschiedene Proteine, hauptsächlich Proteine pflanzlichen Ursprungs, erwähnt.
Genaue Mengen von Mikroorganismen können ausgehend von natürlicherweise oder künstlich verunreinigten oder kontaminierten Proben erhalten werden. Indessen darf die Aufbewahrung solcher Proben 24 h nicht übersteigen und erfordert eine Temperatur unter 10°C.
Genaue Mengen an verschiedenen Bakterien wurden gleichfalls nach Einfrieren in einem Serum und Inositol enthaltenden Medium (1993 Peterz und Steneryd, J. of Appl. Bacteriol., 74, 143-148) oder in Magermilch (1994, Schrijven, Havellaar und Bahar, Appl. and Environ. Microbiol., 60, 4160–4162) erhalten. Es erweist sich indessen, dass diese eingefrorenen Bakteriensuspensionen nicht über drei Monate hinaus für den ersten Herstellungstyp und nicht über ein Jahr hinaus für den zweiten stabil sind. Außerdem erfordern sie sehr starken Zwängen unterworfene Transportbedingungen (kurze Fristen und Aufbewahrung bei einer Temperatur unter –70°C). Schließlich wurde ihre Stabilität im Falle von aufeinanderfolgendem Auftauen und Wiedereinfrieren nicht gezeigt.
Gegenwärtig gelingt es allein der Zerstäubung, die Zwänge hinsichtlich Aufbewahrung, Stabilität und Transport mit der Forderung, über eine genaue Menge von Mikroorganismen zu verfügen, in Einklang zu bringen.
Suspensionen von Bacillus cereus in Kondensmilch, zerstäubt und in Gelatine verkapselt, wurden als Referenzmaterialien nach einem Transport bei Umgebungstemperatur eingesetzt (Paul H. Int Veld, 1993, Int. J. of Food Microbiol., 20, 23–36).
Indessen ist diese Technik schwierig auszuführen, denn sie erfordert ein Auflösen der Gelatine in einem bei 37°C gehaltenen Rekonstitutionsmedium. Außerdem können bestimmte Spezies, wie Aeromonas hydrophila, Pseudomonas aeruginosa und Campylobacter jejuni, durch Zerstäubung nicht auf stabile Weise aufbewahrt werden. Diese Methode wird für die Aufbewahrung von Pathogenen der Atemwege, welche durch Aerosole übertragbar sind, wie Legionella pneumophila, nicht mehr empfohlen. Schließlich sind die durch Zerstäubung hergestellten Referenzmaterialien teuer.
Aus dem Stand der Technik geht folglich hervor, dass man kein leicht auszuführendes und wenig kostspielies Verfahren kennt, welches erlaubt, genaue Mengen von Mikroorganismen auf stabile Weise aufzubewahren.
Die Anmelderin hat dieses Problem gelöst, indem sie eine spezielle Zusammensetzung gefunden hat, die es erlaubt, die Lebensfähigkeit der Mikroorganismen zu bewahren.
Die Erfindung bezieht sich folglich auf eine Zusammensetzung für die Aufbewahrung von Mikroorganismen in bestimmten und re produzierbaren Mengen, welche in Kombination wirksame Mengen von wenigstens einer Substanz, welche in der Lage ist, das Gerüst von linsenförmigen Pastillen zu bilden, und wenigstens einer sättigenden Substanz sowie der Mikroorganismen umfasst.
Für die Erfindung versteht man unter reproduzierbaren Mengen von Mikroorganismen Schwankungen des Verhältnisses zwischen zwei Messungen, welche in 95% der Fälle zwischen 0,25 und 4 und noch mehr bevorzugt zwischen 0,5 und 2 liegen.
Die Zusammensetzung umfasst zwischen ungefähr 10 und 60% Substanzen, die in der Lage sind, das Gerüst der linsenförmigen Pastillen zu bilden. Man setzt bevorzugt eine Mischung von Albumin und Stärke ein, welche zwischen ungefähr 20 und 40% Abumin und zwischen ungefähr 2 und 5% Stärke (bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung) enthält. Nach Einfrieren und Trocknung bilden diese Moleküle ein stark poröses und zugleich mechanisch stabiles Gerüst, das sich in Wasser schnell auflöst.
Vorteilhafterweise ist das Albumin, das in diese Zusammensetzung Eingang findet, Ovalbumin. Ovalbumin kann insbesondere in Form eines Eiweißpräparats vorliegen. Eiweiß bildet ein steriles und an Schutzproteinen reiches Medium, innerhalb von welchem es möglich ist, die Mikroorganismen auf homogene Weise zu dispergieren. Es kann nichtsdestotrotz ein jegliches anderes Albumin (Rinderserumalbumin) oder ein jegliches Protein, das die gleiche Funktion ausübt, sein.
Die Stärke kann eine jegliche Art von Stärke sein und insbesondere natürliche wie auch modifizierte Stärken, Dextrane, Dextrine und Maltodextin. Sie kann durch ein jegliches anderes hydrophiles Makromolekül, insbesondere pflanzliche Proteine oder deren Hydrolysate, Kollagene, Gelatinen, das Hydrolysat von Elastin oder Mischungen der vorerwähnten Substanzen ersetzt werden.
Die Zusammensetzung umfasst gleichfalls zwischen ungefähr 40 und 90% sättigende Substanz. Das sättigende Material kann aus einem oder mehreren gemischten Salzen oder Zuckern gebildet werden. Diese Salze oder Zucker können in Form von Pulver, von Lake oder von Sirup zugesetzt werden. Indem man Saccharose einsetzt, vorzugsweise zwischen ungefähr 60 und 80%, weist die Zusammensetzung eine Aktivität in Wasser unter 0,9 auf. Aus diesem Grunde sind die Zellschäden, die durch das Einfrieren und die Trocknung verursacht werden, begrenzt und die Vermehrung der Mikroorganismen wird insbesondere während eines etwaigen Transports bei Umgebungstemperatur verhindert.
Gemäß einer Ausführungsweise der Erfindung enthält die Zusammensetzung eine oder mehrere Arten von Mikroorganismen. Diese können strikt anaerobe, aerob-anaerobe oder strikt aerobe Bakterien, psychrophile, mesophile oder thermophile Bakterien, halophile Bakterien, Enterobakterien, Streptokokken, Staphylokokken, pathogene Bakterien (Salmonella, Campylobacter, Yersinia, Listeria, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas, Vibrio u.s.w.), Hefen oder Schimmelpilze oder Pilze, Bakteriophagen oder Viren oder Zysten von Protozoen sein.
Die Zusammensetzung enthält vorteilhafterweise zwischen 10² und 10¹¹ und vorzugsweise zwischen 10² und 10⁹ Mikroorganismen pro Gramm. Eine solche Zusammensetzung kann vorteilhafterweise in die Form von Pastillen und insbesondere von linsenförmigen Pastillen, welche einen Durchmesser zwischen 1 und 10 mm aufweisen, gebracht werden.
Solche Pastillen weisen vorteilhafterweise eine Masse zwischen ungefähr 1 und 250 mg, vorzugsweise zwischen ungefähr 2 und 100 mg und noch mehr bevorzugt zwischen 10 und 25 mg auf.
Die erfindungsgemäßen Pastillen können vorteilhafterweise erhalten werden durch ein Herstellungsverfahren, welches die folgenden Schritte umfasst:

– Einarbeiten der Mikroorganismen in die Gerüstsubstanz;
– Verringerung der Aktivität in Wasser durch fortschreitende Zugabe der sättigenden Substanz;
– Formung der Pastillen und
– Trocknung der Pastillen unter Vakuum und bei einer Temperatur unter ungefähr –10°C.

Das Mischen erfolgt vorzugsweise auf die folgende Weise:

a) Mischen des Albumins und der Mikroorganismen;
b) Zugeben der Stärke, dann
c) Zugeben der Saccharose.

Es können mehrere Trocknungsweisen in Betracht gezogen werden. Vorteilhafterweise erfolgt die Trocknung der Pastillen in einem Exsiccator während zwischen ungefähr 12 h und 10 Tagen.
In Hinblick auf eine optimale Stabilität, d. h. über eine Dauer von mehr als 12 Monaten, können die Pastillen bei –70°C in Gegenwart eines Beutels mit Trocknungsmittel aufbewahrt werden. Sie können nichtsdestoweniger 3 Monate bei –20°C und 4 Tage bei Umgebungstemperatur aufbewahrt werden, was insbesondere ihren Transport erleichtert, denn es sind keinerlei besondere und komplizierte Transportbedingungen erforderlich.
Ein für die Ausführung der Erfindung geeignetes Rekonstitutionsmedium muss den osmotischen Schock im Moment der Auflösung der Pastillen in maximalem Umfang begrenzen. Eine synthetische Meersalzlösung mit 23 g/l wird als Rekonstitutionsmedium empfohlen, denn sie weist ein höheres Rückgewinnungsniveau der Mikroorganismen auf als die in der Mikrobiologie gewöhnlich eingesetzten Verdünnungsmittel, die Ringer-Lösung, Pepton- Kochsalzlösung („peptone-saline") oder destilliertes Wasser sind. Eine solche Lösung kann jene, welche von der Firma Aquarium Systems (MENTOR, OHIO, USA) unter der Bezeichnung Instant Ocean vertrieben wird, oder das Medium DSM, das von der Firma SANOFI PASTEUR (Marnes la Coquette, FRANKREICH) vertrieben wird, sein.
Die Auflösung der Pastillen muss bei Umgebungstemperatur erfolgen. Wenn die Probe nicht in der halben Stunde, die der Rekonstitution folgt, analysiert wird, wird empfohlen, sie auf schmelzendem Eis zu halten, um eine gute Stabilität zu garantieren.
Diese über die Zeit stabile Mikroorganismen enthaltenden, homogenen und auf reproduzierbare Weise in Form einer Suspension rekonstituierbaren Pastillen, d. h. mit Mengen, die von einem Versuch zum anderen nur geringfügig schwanken, bilden wahrhaftige Referenzmaterialien, die insbesondere für die Kontrolle der Zuverlässigkeit der Messungen (interne und externe Qualitätskontrolle) auf den Gebieten der Bakteriologie der Wässer, der Getränke und der Nahrungsmittelerzeugnisse allgemein der Pharmazie, der Kosmetik und der Umwelt angepasst sind.
Dieser Typ von Referenzmaterial kann gleichfalls in vorteilhafter Weise für „challenge tests" auf dem Gebiet der Agrarwirtschaft eingesetzt werden. Für diese spezielle Anwendung enthalten die Pastillen einen oder mehrere Mikroorganismen. Die Pastillen können direkt in das zu untersuchende Produkt (Behälter, Salatbeutel, zubereitetes Gericht u.s.w.) eingebracht werden. Die Produkte werden dann realen Aufbewahrungsbedingungen ausgesetzt und die Entwicklung/Vermehrung der auf quantifizierte Weise eingebrachten Verunreinigung in den Produkten wird gemäß den üblichen Zählungsmethoden verfolgt.
Allgemeiner kann dieser neue Typ von Referenzmaterial für die quantitative mikrobiologische Analyse eingesetzt werden:

– Kontrolle des Vorhandenseins/der Abwesenheit von Mikroorganismen
– Kontrolle der Fertilität von Kulturmedien
– Kontrolle der Wirksamkeit von Antibiotika, von bakteriziden oder bakteriostatischen Substanzen,
– Kontrolle der Sterilisation (UV, Chlorierung, Ozonisierung, Filtration u.s.w.)

Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung können die wenigstens eine Art von Mikroorganismen umfassenden Pastillen vorteilhafterweise in bestimmten Produkten als Startermittel für das Animpfen der Stämme in Hinblick darauf, einen entscheidenden mikrobiologischen Parameter, welcher in ein biotechnologisches Verfahren und insbesondere ein Fermentationsverfahren eingreift, zu beherrschen, eingesetzt werden.
So können Pastillen, die bestimmte Hefen, wie beispielsweise S. cerevisiae, S. calbergensis, S. ellipsoidus, enthalten, für die Herstellung von Brot, von ober- und untergärigem Bier, von Wein und anderen Alkoholika eingesetzt werden.
Die Milchsäurebakterien enthaltenden Pastillen können vorteilhafterweise für die Herstellung von fermentierten Milchprodukten und Joghurt eingesetzt werden wie auch in der pharmazeutischen Industrie für die Herstellung von Produkten, die für das Wiederanimpfen der Darmflora bestimmt sind.
Pastillen, die aktivierte Pilzsporen enthalten, können direkt oder nach Verdünnung auf einen gewünschten Gehalt an Mikroorganismen in der Lebensmittelindustrie, insbesondere in der Käserei oder beim Pökeln/Einsalzen, eingesetzt werden. Diese Zusammensetzungen können beispielsweise in den umzuwandelnden Produkten, wie den Käsen oder den Pökel-/Einsalzungsprodukten, verteilt oder in diese inkorporiert werden.
Beispielsweise können Pastillen, die bestimmte Bakteriengattungen, wie beispielsweise Rhizobium, Pseudomonas, Bacillus, Arthrobacter, Serratia und Azospirillum enthalten, in der Landwirtschaft und in der Umweltindustrie eingesetzt werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, ohne dadurch beschränkt zu werden.
Die folgenden Figuren veranschaulichen die Erfindung außerdem.
Die 1 und 2 veranschaulichen die Rekonstitution von linsenförmigen Pastillen, welche Escherichia coli- bzw. Enterococcus faecalis-Bakterien enthalten, in destilliertem Wasser, RINGER-Medium und DSM-Medium.
Auf der Ordinate sind für die 1 die log (E. coli)-Werte und für die 2 die log (E. faecalis)-Werte aufgetragen.
Die 3 ist eine statistische Analyse der Rekonstitutionsergebnisse, erhalten mit Escherichia coli für jedes der drei Rekonstitutionsmedien. Diese Figur veranschaulicht die Wirkung des Rekonstitutionsmediums mit einer Untersuchung der Ausbeute.
Die 4A bis 4C veranschaulichen die Stabilität von Escherichia coli enthaltenden und bei +4°C, bei –20°C bzw. bei –70°C aufbewahrten linsenförmigen Pastillen. So veranschaulichen die 4A und 4C die Wirkung der Lagerungstemperatur mit einer Untersuchung der Stabilität der Referenzmaterialien, wobei für die 4A E. coli bei +4° aufbewahrt wurde, für die 4B E. coli bei –20°C aufbewahrt wurde und für die 4C E. coli bei –70°C aufbewahrt wurde.
Die 5A und 5B veranschaulichen die Stabilität von Klebsiella planticola enthaltenden und bei +4°C bzw. bei –20°C gelagerten linsenförmigen Pastillen. So veranschaulichen die 5A und 5B die Wirkung der Lagerungstemperatur mit einer Untersuchung der Stabilität der Referenzmaterialien, wobei für die 5A Klebsiella planticola bei +4° aufbewahrt wurde und für die 5B Klebsiella planticola bei –20°C aufbewahrt wurde.
Die 6A bis 6C veranschaulichen die Stabilität von Staphylococcus aureus enthaltenden, bei +4°C, –20°C bzw. –70°C gelagerten linsenförmigen Pastillen. So veranschaulichen die 6A bis 6C die Wirkung der Aufbewahrungstemperatur mit einer Untersuchung der Stabilität der Referenzmaterialien, wobei diese Figur bei +4°C, –20°C und –70°C aufbewahrten Staphylococcus aureus entspricht.
Die 7A bis 7C veranschaulichen die Stabilität von Enterococcus faecalis enthaltenden linsenförmigen Pastillen, welche bei +4°C, –20°C bzw. –70°C aufbewahrt wurden.
Die 8A und 8B stellen Kontrollkarten vom Mittelwert- bzw. Abweichungstyp, erhalten für die Zählung von Escherichia coli über einen Zeitraum von mehr als 30 Tagen, dar.
Die 9A und 9B stellen Kontrollkarten vom Mittelwert- bzw. Abweichungstyp, erhalten für die Zählung von Enterococcus faecalis über einen Zeitraum von mehr als 30 Tagen, dar.
Die 10A und 10B stellen Kontrollkarten vom Mittelwertbzw. Abweichungstyp, erhalten für S. aureus über einen Zeitraum von 30 Wochen, dar.
Die 11A und 11B stellen Kontrollkarten vom Mittelwertbzw. Abweichungstyp, erhalten für Clostridium sporogenes über einen Zeitraum von 30 Wochen, dar.
BEISPIEL 1:
HERSTELLUNG VON LINSENFÖRMIGEN PASTILLEN
1. Herstellung der Pastillen
Bakterien in Form von Kulturbrühen oder von in 0,25 ml DSM-Medium resuspendierten Kolonien werden 3 min in 10 ml Eiweiß (ungefähr 15 g) eingemischt.
Dann werden 1,2 g Stärke zugesetzt und das Ganze wird 30 Sekunden gemischt.
32 g Puderzucker werden nach und nach zugesetzt, wobei das Durchmischen 7 min lang weitergeführt wird.
Schließlich wird das Durchmischen 3 min ohne Zugabe fortgesetzt.
Das Durchmischen wird für diese verschiedenen Schritte in einem auf 700 U/min eingeregelten Mischer ausgeführt.
Die so erhaltene Zusammensetzung wird dann mit Hilfe einer 10 ml-Spritze, die mit einer 1,2 × 40 mm-Nadel ausgestattet ist, in Tropfen auf einer Kunststoffplatte verteilt.
Die Platte wird in einen Exsiccator gelegt, dann wird das Ganze evakuiert und 4 Tage bei –20°C aufgestellt.
Die so erhaltenen linsenförmigen Pastillen oder Linsen werden gewonnen, dann bei +4°C oder –20°C in einer mit einem Trockenmittelbeutel ausgestatteten Flasche gelagert.
2. Bakterienprobe
Die Bakterienprobe kann der Mischung in zwei Formen zugesetzt werden:

– in Form von Brühe
– in Form von auf einer Schale gewonnenen Kolonien.

Die Probe in Form von Brühe wird eingesetzt, wenn die Mortalität nach einer Trocknung während eines ersten Konditionierungsversuchs in Form von Linsen als bedeutend eingestuft worden ist. Tatsächlich erlaubt die Brühe nach einer Zentrifugation eine bedeutende Aufkonzentration von Bakterien, die mit Kolonien schwierig realisierbar ist.
Die Probe in Form von Kolonien hat den Vorteil, dass sie sehr leicht quantifizierbar ist. Sie wird eingesetzt, wenn der Überlebensgrad nach Trocknung als korrekt eingestuft wird. Ihr Einsatz impliziert die Zugabe von 0,25 ml DSM, was die Modifizierung der Mengen gegenüber der Mischung, welche die Brühe einsetzt, vermeidet.
3. Trocknung der Charge von Pastillen
Es wurde ein Trocknungsversuch an ein und derselben Charge von E. coli-Linsen bei unterschiedlichen Temperaturen ausgeführt.
Vorgehensweise:

– 10 Tropfen aus ein und derselben Herstellungscharge werden für eine Trocknung bei +44°C plaziert.
– 10 weitere Tropfen werden für eine Trocknung bei Umgebungstemperatur unter einem Laminarströmungsabzug plaziert.
– die letzten 10 Tropfen werden im Inneren eines Exsiccators, in dem Vakuum realisiert worden ist, bei –20°C plaziert.

Nach 2 Tagen Trocknung werden die Linsen in einem Röhrchen mit 9 ml RINGER-Medium rekonstituiert.
5 ml aus jedem der Röhrchen werden dann mittels eines Tergitol TTC-Mediums (AFNOR T 90-414) filtriert.
Ergebnisse
Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 1 ausgedrückt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Trocknung bei –20°C im Inneren eines Exsiccators unter Vakuum es erlaubt, eine Lebensfähigkeit zu erzielen, die den anderen Trocknungsmethoden überlegen ist.
BEISPIEL 2
REKONSTITUTION VON BAKTERIENLÖSUNGEN AUSGEHEND VON LINSENFÖRMIGEN PASTILLEN
1. Stabilität der bei Umgebungstemperatur rekonstituierten Probe.
a) E. coli (Stamm WR₁, erhältlich bei der Collection Hollandaise RIVM).
Vorgehensweise:

– 4 E. coli-Linsen, erhalten gemäß Beispiel 1, werden in Röhrchen, die die Rekonstitutionsmedien DSM, RINGER bzw. steriles destilliertes Wasser enthalten, gelegt.
– 2 ml von jedem Röhrchen werden dann in unterschiedlichen Zeitabständen (0, 10, 20, 40 Minuten) in einen Kolben (Typ Pasteur microbio), welcher 400 ml Leitungswasser enthält, gegossen.

Die Ergebnisse sind in der 1 zusammengefasst.

– an jedem Kolben werden 2 Filtrationsreplikate ausgeführt (automatische Filtration von 100 ml an einem SARAH-Automaten).

Für E. coli stellt man fest:

– eine Stabilität in jedem der Rekonstitutionsmedien;
– eine viel höhere Anzahl von Kolonien (ungefähr 10-mal mehr) für die in DSM rekonstituierte Linse bezogen auf die beiden anderen, in RINGER bzw. in sterilem destilliertem Wasser rekonstituierten Linsen.

b) Enterococcus faecalis
(Stamm erhältlich bei der Tschechischen Collection CCM unter der Nr. 2541).
Vorgehensweise:

– eine Enterococcus faecalis-Linse, erhalten gemäß Beispiel 1, wird in ein Röhrchen mit jedem Rekonstitutionsmedium (DSM, RINGER, steriles destilliertes Wasser) gelegt;
– 1 ml aus jedem Röhrchen wird dann in unterschiedlichen Zeitabständen (0, 10, 20, 40 min) in einen Kolben (Typ Pasteur microbio), welcher 400 ml Leitungswasser enthält, gegossen;
– an jedem Kolben werden 2 Filtrationsreplikate ausgeführt (automatische Filtration von 100 ml an einem SARAH-Automaten).

Die 2 veranschaulicht die erhaltenen Ergebnisse.
Dementsprechend stellt man für Enterococcus faecalis fest:

– in sterilem destilliertem Wasser einen schnellen Abfall der Anzahl von zurückgewonnenen Kolonien abhängig von der Kontaktzeit der Linse mit dem Rekonstitutionsmedium (Rückgang von 55 auf 0 Kolonien, die nach 20 Minuten zurückgewonnen werden).
– in RINGER einen langsamen Abfall der Anzahl von zurückgewonnenen Kolonien abhängig von der Kontaktzeit der Linse mit dem Rekonstitutionsmedium (Rückgang von 47 auf 15 Kolonien, die nach 40 Minuten zurückgewonnen werden).
– in DSM eine Stabilität der Anzahl von zurückgewonnenen Kolonien abhängig von der Zeit mit einem viel höheren Rückgewinnungsniveau.

2. Ausbeute der verschiedenen Rekonstitutionsmedien
Diese Versuche haben zum Ziel, zu zeigen, dass das DSM-Medium eine bessere Rückgewinnung von Kolonien bezogen auf andere Verdünnungsmittel, wie RINGER oder steriles destilliertes Wasser, erlaubt.
Vorgehensweise:

– 10 E. coli-Tabletten, erhalten gemäß Beispiel 1, werden in jedem der drei Rekonstitutionsmedien (DSM, RINGER, steriles destilliertes Wasser) rekonstituiert.
– Die Gesamtheit der Röhrchen wird bei +4°C (Wasser + Ice Pack^®) aufgestellt, um einen jeglichen Temperatureffekt zu vermeiden.
– Der Inhalt von jedem Röhrchen wird vollständig in einen Kolben mit 400 ml Leitungswasser (Kolben vom Typ Pasteur microbio) ausgekippt.
– Alle Kolben werden dann durch automatische Filtration von 100 ml an einem SARAH-Automaten filtriert.

Ergebnisse
Diese Ergebnisse sind in der 3 zusammengefasst.
Man stellt fest, dass:

– Man bei dem DSM im Mittel ungefähr 22 Kolonien pro Filtration zurückgewinnt.
– Man bei RINGER im Mittel ungefähr 7 Kolonien pro Filtration zurückgewinnt.
– Man bei sterilem destilliertem Wasser im Mittel ungefähr 3 Kolonien pro Filtration zurückgewinnt.

So gewinnt man bei ein und derselben Charge von E. coli-Linsen, wenn DSM als Rekonstitutionsmedium eingesetzt wird, bezogen auf RINGER ungefähr 3-mal mehr Kolonien und bezogen auf steriles destilliertes Wasser ungefähr 7-mal mehr Kolonien zurück.
Diese Ergebnisse (2.1 und 2.2) zeigen folglich, dass das DSM eine bessere Stabilität und eine bessere Ausbeute während der Rekonstitution der Linsen bietet.
Jede der mit Hilfe von Linsen ausgeführten Manipulationen muss bevorzugt in der Kälte (wobei Stabilität für mehr als 40 Minuten garantiert ist) und in DSM-Medium ausgeführt werden.
BEISPIEL 3:
VALIDIERUNG DER LINSEN-CHARGEN
Fünf Stämme von Escherichia coli, Klebsiella planticola (Stamm erhältlich von der ATCC unter der Nr. 33.531), Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus und Clostridium sporogenes wurden in Form von Linsen konditioniert, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Vorgehensweise:
Die Validierung erfolgt, indem man nach der Trocknung 30 Linsen abzählt.
Jede der Linsen wird in ein Röhrchen, welches 9 ml DSM enthält, gelegt.
Die zuvor bei Raumtemperatur befindlichen Röhrchen werden bei +4°C (Wasserbad + Ice Pack^® aufgestellt, sobald die Linse sich in dem DSM aufgelöst hat (Auflösung mittels Vortex^®).
Eine Auflösung wird ausgeführt, wenn die Konzentration der Linse zu bedeutend ist.
Man filtriert dann 5 ml von jeder der Verdünnungen.
Ergebnisse:
Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 2 enthalten. Diese Ergebnisse zeigen, dass für alle untersuchten Keime der Reproduzierbarkeitskoeffizient (SR) in logarithmischen Einheiten unter 0,20 liegt. SR misst die Variabilität der erhaltenen Ergebnisse, wenn die Messungen an unterschiedlichen Pastillen innerhalb von ein und demselben Labor ausgeführt werden.
BEISPIEL 4:
STABILITÄT DER GELAGERTEN CHARGEN
Vorgehensweise:
Die Linsen werden bei +4°C, –20°C oder –70°C in Kolben, die mit einem Trockenmittelbeutel ausgestattet sind, aufbewahrt (eine einzelne Charge wird in zwei gleiche Mengen aufgeteilt, die bei zwei unterschiedlichen Temperaturen gelagert werden).
Jeden Tag werden zwei Linsen getestet, dies für jede Charge und für jede der Aufbewahrungstemperaturen (+4°C, –20°C und –70°C).
Jede Linse wird in ein Röhrchen, welches 10 ml DSM enthält, gelegt, diese wird mittels Vortex® bei Umgebungstemperatur gelöst. Die so rekonstituierten Proben werden vor der Filtration bei 4°C aufgestellt.
Die Filtration erfolgt in zwei Replikaten von 5 ml für jede Linse.
Man erhält so jeden Tag die Summe von vier Zählungen für jede der zwei Aufbewahrungstemperaturen (+4°C, –20°C und –70°C).
Es ist die Fortschreibung dieses Werts, die es erlaubt, die Regressionsgerade zu erstellen, die die Sichtbarmachung der Entwicklung der Charge mit der Zeit erlaubt.
Ergebnisse:
Die Stabilitätsergebnisse sind in Form von Regressionsgeraden dargestellt für:
E. coli (4A, 4B und 4C);
K. planticola (5A, 5B);
S. aureus (6A, 6B und 6C);
E. faecalis (7A, 7B, 7C).
Die Null betragenden Steigungen, die durch lineare Regression erhalten werden, zeigen, dass für die vier untersuchten Keime die Chargen stabil sind für wenigstens:

– 1 Woche bei +4°C;
– 3 Monate bei –20°C;
– 1 Jahr bei –70°C.

Diese Stabilitäten sind mit einer industriellen Verwendung ganz und gar verträglich.
BEISPIEL 5:
Verwendung der linsenförmigen Pastillen als Referenzmaterial.
Die Referenzmaterialien können für die Fertilitätskontrolle von Kulturmedien, die statistische Beherrschung von Verfahren und Eignungstests durch Vergleich zwischen Laboratorien eingesetzt werden.
1. Kontrolle der Fertilität von Kulturmedien.
Die Normen AFNOR T90-432 und T90-433 schreiben Qualitätskriterien für die Herstellung von Mikroplatten-Kulturmedien vor.
Die Qualitätskontrolle muss sich auf jede Charge von hergestellten Mikroplatten erstrecken. Die zu untersuchenden Mikroplatten werden auf zufällige oder systematische Weise entnommen, um eine Probe gemäß der Norm AFNOR NFX 06-023 zu bilden, wobei das normale Entnahmeniveau (9 kontrollierte Mikroplatten für eine Chargengröße von 1000 hergestellten Mikroplatten) beachtet wird.
Die Fertilität des Kulturmediums wird durch das Verhältnis zwischen der Anzahl von Mikroorganismen, die bei der Charge von getesten Mikroplatten beobachtet wird, und der Anzahl von Mikroorganismen, die bei einem stabilen Referenzmaterial erwartet werden, (Zielwert) gemessen. Das nach Rekonstitution des Referenzmaterials einzusetzende Konzentrationsniveau muss sich im Bereich des Genauigkeitsmaximums der Methode befinden, nämlich bei ungefähr 500 Keimen/100 ml. Die Akzeptierungsschwellenwerte der Charge von in Untersuchung befindlichen Mikroplatten sind: das 0,66- bis 1,50-fache des Zielwerts (66% < Ausbeute (%) < 150%).
Der für die Norm T90-433 zu testende Stamm ist E. coli WR1.
Die für die Norm T90-432 zu testenden Stämme sind E. faecium WR63, E. faecalis CCM 2541 und E. hirae CCM 2423.
Die Tabellen 3 bis 6 führen für jeden der Stämme die Fertilitätsergebnisse auf, die für die Herstellung von Mikroplatten von 1997 erhalten wurden. Sie zeigen eine perfekte Beherrschung der Herstellung durch den Produzenten. Tatsächlich entsprechen 90% der hergestellten Chargen dem in den Normen festgelegten Fertilitätskriterium.
2. Statistische Beherrschung von Verfahren (interne Qualitätskontrolle)
Vor der Einrichtung der internen Qualitätskontrolle muss das Labor seine Analysenreihe eichen. Um die in den vorangegangenen Beispielen erhaltenen Ergebnisse zu berücksichtigen, wurden dafür die folgenden Protokolle festgelegt:
Protokoll für die Rekonstitution der Referenzmaterialien

– Das oder die Röhrchen aus dem Gefrierschrank nehmen.
– Mit Hilfe einer sterilen Pinzette die erforderliche(n) Pastille(n) für die Kontrolle (wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellte linsenförmige Pastillen) entnehmen.
– Das oder die Röhrchen unverzüglich in den Gefrierschrank zurückstellen.
– Die Pastille(n) 15 min bei Umgebungstemperatur liegenlassen.
– Jede Pastille in einem Röhrchen, welches 18 ml spezielles Pastillenverdünnungsmittel enthält, versenken (Ausgangssuspension).
– 15 min bei Umgebungstemperatur stehenlassen, ohne zu bewegen.
– Das oder die Röhrchen während 30 Sekunden sanft bewegen.
– Wenn die Animpfungen nicht in der Stunde, die der Rekonstitution folgt, ausgeführt werden, das oder die Röhrchen mit Ausgangssuspension in schmelzendem Eis aufbewahren (Garantie einer Stabilität von vier Stunden).

Protokoll der Herstellung des speziellen Pastillenverdünnungsmittels:

– 22,5 g Meersalze (Instant Ocean) in 1 1 destilliertem Wasser lösen,
– die Salinität (20 +/– 3 für 1000) oder die Leitfähigkeit (25000 +/– 4000 uS.cm–1) verifizieren,
– den pH einstellen (7,9 +/– 0,5),
– 18 ml in Röhrchen verteilen,
– bei 120°C 15 min autoklavieren.

Kalibrierungsprotokoll:

– Die Ausgangssuspension einsetzen:
– Die Pastillen 1 und 2: 0,5 ml filtrieren,
– Die Pastillen 3 und 4: 1,0 ml filtrieren,
– Die Pastillen 5 und 6: 2,0 ml filtrieren,
– Die Pastillen 7 und 8: 4,0 ml filtrieren,
– Die Pastillen 9 und 10: 8,0 ml filtrieren.
– Die Linearität der Ergebnisse durch lineare Regression verifizieren. Ausgehend von der Gleichung der Regressionsgerade das für jedes Material zu empfehlende Filtrationsvolumen derart bestimmen, dass 25 Kolonien auf der Membran erhalten werden.

Einmal auf diesen Zielwert von 25 Kolonien festgelegt, muss das Laboratorium seine interne Kontrolle einrichten, um Abweichungen, Dezentrierungen, Wiederholbarkeits- oder Reproduzierbarkeitsprobleme zu enthüllen. Gemäß der Analysenaktivität des Laboratoriums stellt diese interne Kontrolle sicher:

– eine tägliche Absicherung:

Die großen Laboratorien, die etwa hundert Analysen pro Tag ausführen, können jeden Tag 4 Pastillen testen. Die 8A und 8B, 9A und 9B repräsentieren die Kontrollkarten vom Mittelwert- und vom Abweichungstyp, welche im Rahmen der Routine mit erfindungsgemäßen Pastillen, welche E. coli und E. faecalis enthalten, über einen Zeitraum von 30 Tagen erhalten wurden.

– eine wöchentliche Absicherung:

Die kleinen Laboratorien, die etwa hundert Analysen pro Woche ausführen, können 5 Pastillen jede Woche in einem Umfang von einer Pastille pro Tag testen. Die 10A und 10B und 11A und 11B repräsentieren Kontrollkarten vom Mittelwert- und Abweichungstyp, welche im Rahmen der Routine mit erfindungsgemäßen Pastillen, welche S. aureus und C. sporogenes enthalten, über einen Zeitraum von 30 Wochen erhalten wurden.
Dank dieses Typs von interner Kontrolle verfügen die mikrobiologischen Laboratorien jetzt über ein Warnsystem in Echtzeit (tägliche Absicherung) oder zeitlich verschoben (wöchentliche Absicherung) mit einer Möglichkeit, die Ursachen von Fehlern auszuwählen und die korrigierenden Aktionen zu tätigen.
3. Eignungstests von Laboratorien durch zwischen diesen Institutionen erfolgenden Vergleich (externe Qualitätskontrolle)
Ein Eignungstest besteht darin, zwischen Institutionen erfolgende Vergleiche einzusetzen, um die Leistungsfähigkeit eines Laboratoriums auf dem Gebiet von Untersuchungen oder Messungen zu bestimmen. Die Teilnahme an Eignungstestsystemen liefert den Laboratorien ein objektives Mittel, um die Zuverlässigkeit der Daten, die sie produzieren, auszuwerten und zu zeigen. Die Laboratorien komplettieren so die internen Prozeduren der Qualitätsbeherrschung, indem eine ergänzende externe Messung ihrer Kompetenzen auf dem Gebiet von Untersuchungen bereitgestellt wird.
Die Association Generale des Laboratoires d'Analyse de l'Environnement (A. G. L. A. E.) hat im April 1998 eine unter Beteiligung von mehreren Laboratorien ausgeführte Untersuchung, die eine Gruppe von 55 französischen Laboratorien (Mutterland und überseeische Departements) erfasste, organisiert. Es wurden als Untersuchungsmaterial Pastillen, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt worden waren, eingesetzt.
Die während einer Zählung der Enterokokken an einer Charge von Enterococcus faecalis enthaltenden Pastillen erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 7 zusammengefasst.
In der nachfolgenden Tabelle 7 misst S_u die Variabilität der Ergebnisse, die erhalten werden, wenn die Messungen an der gleichen Pastille innerhalb ein und desselben Laboratoriums ausgeführt werden.
r entspricht der Variabilität der Ergebnisse, die erhalten werden, wenn die Messungen an unterschiedlichen Pastillen innerhalb ein und desselben Laboratoriums ausgeführt werden.
R misst die Variabilität der Ergebnisse, die erhalten werden, wenn die Messungen an unterschiedlichen Pastillen und durch unterschiedliche Laboratorien ausgeführt werden.
Der Wert von 0,10, der für S_u erhalten wird, zeigt, dass die Pastillen sich auf homogene Weise auflösen.
Der Wert von 0,18, der für r erhalten wird, zeigt die gute Homogenität der Charge von Pastillen.
Der Wert von 0,3, der für R erhalten wird, ist ein Wert, der vergleichbar ist mit den Ergebnissen, die gewöhnlich bei diesem Typ von unter Beteiligung von diversen Laboratorien ausgeführten Untersuchungen erhalten werden, und validiert folglich diese Technik (Stabilität der Pastillen während des Transfers und erleichterter Einsatz in den Laboratorien).
Der Vorteil der Erfindung im Rahmen dieser unter Beteiligung von diversen Laboratorien ausgeführten Untersuchungen liegt in der Möglichkeit, die Pastillen sogar bei Umgebungstemperatur aufzubewahren. So erforderten die in den vorangegangenen Jahren ausgeführten Versuche unter Beteiligung von diversen Labo ratorien, jedem Labor eine Probe zu liefern, welche in einem Liter künstlich verunreinigtem Wasser bestand. Diese Probe musste folglich in einigen Stunden in jedem Laboratorium ankommen, um sicher zu sein, dass alle Laboratorien unter den gleichen Bedingungen arbeiteten.
Die erfindungsgemäßen Pastillen erlauben es, dieses Problem zu lösen, und vereinfachen die Organisation dieses Untersuchungstyps.
TABELLE 1
TABELLE 2
TABELLE 3 FERTILITÄT VON MU/EC-MIKROPLATTEN (SANOFI DIAGNOSTICS PASTEUR)
TABELLE 4 FERTILITÄT VON MU/SF-MIKROPLATTEN (SANOFI DIAGNOSTICS PASTEUR)
TABELLE 5 FERTILITÄT VON MU/SF-MIKROPLATTEN (SANOFI DIAGNOSTICS PASTEUR)
TABELLE 6 FERTILITÄT VON MU/SF-MIKROPLATTEN (SANOFI DIAGNOSTICS PASTEUR)
TABELLE 7

Claims

Pastillen für die Aufbewahrung von Mikroorganismen, die erhalten werden können durch Trocknung unter Vakuum bei einer Temperatur unter 10°C einer Zusammensetzung, umfassend: (1) eine Mischung von Albumin und Stärke, die zwischen 20 und 40% Albumin bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung und zwischen 2 und 5% Stärke bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung enthält, (2) zwischen 60 und 80% Saccharose bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung und (3) 100 bis 10¹¹ Mikroorganismen pro Gramm der Zusammensetzung.
Pastillen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Albumin Ovalbumin ist.
Pastillen nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen Bakterien, Viren, Hefen, Protozoen oder Pilze sind.
Pastillen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Masse zwischen 1 und 250 mg, vorzugsweise zwischen 2 und 100 mg und noch mehr bevorzugt zwischen 10 und 25 mg aufweisen.
Pastillen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Durchmesser zwischen 1 und 10 mm haben.
Verfahren zur Herstellung von Pastillen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, welches die folgenden Schritte umfasst: – Einarbeiten der Mikroorganismen in die Mischung von Albumin und Stärke, – Verringerung der Aktivität in Wasser durch fortschreitende Zugabe von Saccharose, – Formung der Pastillen und – Trocknung der Pastillen unter Vakuum und bei einer Temperatur unter ungefähr –10°C.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Trocknung der Pastillen in einem Exsiccator während zwischen 12 h und 10 Tagen bewirkt wird.
Verfahren zur Rekonstitution einer Suspension von Mikroorganismen ausgehend von Pastillen nach Anspruch 1 oder erhalten durch das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Pastillen in einem adäquaten Medium resuspendiert werden.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Pastillen in einem flüssigen Medium, das 23 g/l Meersalz enthält, rekonstituiert werden.
Verwendung von Pastillen nach einem der Ansprüche 1 bis 5 als Referenzmaterial in der Mikrobiologie.
Verwendung von Pastillen nach einem der Ansprüche 1 bis 5 für die Fertilitätskontrolle von Kulturmedien.
Verwendung von Pastillen nach einem der Ansprüche 1 bis 5 als positive Vergleichsproben in „challenge tests".
Verwendung von Pastillen nach einem der Ansprüche 1 bis 5 als Startermittel in Fermentationsverfahren.
Verwendung von Pastillen nach einem der Ansprüche 1 bis 5 als Referenzmaterial auf dem Gebiet der Bakteriologie der Wässer und der Agrarwirtschaft.